專利名稱：海鞘素743的代謝物的制作方法
本申請是申請日為1999年5月11日，申請?zhí)枮?00510054418.1發(fā)明名稱為“海鞘素743的代謝物”的發(fā)明專利申請的分案申請。
本發(fā)明的背景海鞘素(ecteinascidin本發(fā)明縮寫為Et或Et′s)是從海洋被囊動(dòng)物Ecteinascidia turbinata分離出來的具有很強(qiáng)抗腫瘤作用的藥物。特別是，Et′s729，743和722已證明具有值得開發(fā)的體內(nèi)抗腫瘤作用，包括對P388鼠白血病，B16黑素瘤，Lewis肺癌以及幾種人腫瘤外移植物的小鼠模型的抗腫瘤作用。
美國專利號5,089,273中講述天然的Et743的分離和特性，在此引入作為參考。美國專利號5,721,362中講述合成的Et743的制備，在此引入作為參考。
海鞘素化合物，特別是Et′s729的抗腫瘤作用，在科學(xué)文獻(xiàn)得到充分證明。例如，見Goldwasser等，美國腫瘤研究協(xié)會會報(bào)(Proceeding of American for Cancer Research)39598(1998)；Kuffel等，美國腫瘤研究協(xié)會會報(bào)(Proceeding of American forCancer Research)38596(1997)；Moore等，美國腫瘤研究協(xié)會會報(bào)(Proceeding of American for Cancer Research)38314(1997)；Mirsalis等，美國腫瘤研究協(xié)會會報(bào)(Proceeding of American forCancer Research)38309(1997)；Reid等，腫瘤化療和藥理學(xué)(Cancer Chemotherapy and pharmacology)38329-334(1996)；Faircloth等，歐洲腫瘤雜志(European Journal ofCancer)，32A，Supp.1，pp.S5(1996)；Eckhardt等，美國腫瘤研究協(xié)會會報(bào)(Proceeding of American for Cancer Research)37409(1996)；Henddriks等，美國腫瘤研究協(xié)會會報(bào)(Proceedingof American for Cancer Research)37389(1996)；以上文獻(xiàn)報(bào)道的公開內(nèi)容在此引入作為參考。
海鞘素743(Et743)具有下面的結(jié)構(gòu)
鑒于這類化合物的令人注目的抗腫瘤作用，尋找可能具有相等或更高抗腫瘤作用的相關(guān)結(jié)構(gòu)的化合物的研究一直在繼續(xù)。致力于Et743的天然代謝物分離和特性研究的本發(fā)明就是這些連續(xù)研究的結(jié)果。
本發(fā)明概述完成了由人細(xì)胞色素CYP3A4代謝的幾種Et743代謝產(chǎn)物的純化和結(jié)構(gòu)說明。本專利中這些化合物縮寫為ETM，緊接著標(biāo)注數(shù)字，數(shù)字表示該化合物的近似分子量。
例如，ETM305和ETM775是由西班牙PhamaMar公司分析化學(xué)部所進(jìn)行的生化研究中所獲得的代謝混合物中分離出來的。由MayoClinic公司進(jìn)行的類似代謝研究促成了ETM204的鑒定。這些海鞘素代謝物的結(jié)構(gòu)如下
圖的簡要說明通過參考后面的圖以及這個(gè)說明，可以更好理解本發(fā)明，其中

圖1是在CDCI3中ETM-SiOH-1(非極性不純物)的1H NMR波譜圖(500MHz)；圖2是ETM-SiOH-4(ETM775)的HPLC色譜圖；圖3是ETM-SiOH-3(ETM305)的HPLC色譜圖；圖4是ETM-SiOH-2(痕量代謝物)的HPLC色譜圖；圖5是在M.B.(magic bullet[4])中ETM305的LRFAB質(zhì)譜圖；圖6是ETM305的ESI質(zhì)譜圖；圖7是在CD3OD中ETM305的1H NMR波譜圖(750MHz)；圖8是ETM305的FAB/MS/MS譜圖；圖9是ETM305的紫外光譜圖；圖10是ETM的紫外光譜圖；圖11是在M.B.(magic bullet[4])中ETM775的LRFAB質(zhì)譜圖；圖12是ETM775的ESI質(zhì)譜圖(正性模型)；圖13是ETM775的ESI質(zhì)譜圖(負(fù)性模型)；圖14是ETM775的FAB/MS/MS譜圖(M/Z1 38-302)；圖15是ETM775的FAB/MS/MS譜圖(M/Z 440-620)；圖16是在CD3OD中ETM775的1H NMR波譜圖(750MHz)；圖17是ETM775的紫外光譜圖；圖18是ETM305的HPLC色譜圖；圖19是ETM305的紫外光譜圖；圖20是ETM305的ESI質(zhì)譜圖；圖21是ETM204的ESI質(zhì)譜圖；圖22是在CD3OD中ETM204的1H NMR波譜圖(500MHz)；以及圖23是ETM204的ESI/MS/MS譜圖。
本發(fā)明的詳細(xì)說明I.Et743的代謝研究A.代謝混合物ETM的制備將Et743(50μM)與配制在含NADPH生成系統(tǒng)(0.4mMNADP+，25mM6-磷酸葡萄糖，0.5U/ml6-磷酸葡萄糖脫氫酶和3.3mM氯化鎂)的0.1Mtris-HCI緩沖液中的濃度為0.4mg/ml的人成淋巴細(xì)胞表達(dá)的CYP3A4同種型一起孵育。在37℃孵育4小時(shí)后，加入冰冷乙腈中止反應(yīng)，離心(12000g，4min)棄去固狀物，上清液作HPLC分析。
B.ETM305和ETM775的純化2.6mg ETM(按前面A中方法制備)溶于少量CHCI3中，加到硅膠柱(8×100mm玻璃柱，填充硅膠/CHCI3漿)。硅膠柱先用CHCI3洗脫，接著用CHCI3/MeOH混合液(98，96，94，92和90％)洗脫。共收集10個(gè)試管(每管3ml)，并根據(jù)簿板色譜(TLC)結(jié)果作合并處理，產(chǎn)生四個(gè)級分(表1)。如1H NMR譜圖(圖1)所示，極性較小和非細(xì)胞毒級分(ETM-SiOH-1，2mg)由結(jié)構(gòu)上與Et743不相關(guān)的脂組成。
剩下的細(xì)胞毒級分用HPLC(PhenomenexUtracarb，ODS，10um，10×150mm，3∶1MeOH/H2O0.02M NaCI，1ml/min，Da檢測210，220，254和280nm)作進(jìn)一步純化。極性最大的級分(ETM-SiOH-4，0.2mg)產(chǎn)生0.1mg ETM775(圖2)。ETM-SiOH-3產(chǎn)生0.3mg ETM305(圖3)。ETM-SiOH-2由幾種微量代謝物組成(圖4)。
表1.ETM-SiOH級分Rf，重量和細(xì)胞毒性
a硅膠TLC采用CHCI3/MeOH作為流動(dòng)相。b在250ng/mg濃度下的生長抑止率為30％。
C.ETM305的結(jié)構(gòu)用HRFAB/MS分析顯示ETM305(對L1210細(xì)胞株的IC50為0.2ug/ml)一分子離子峰在306.0977處(圖5)。該數(shù)據(jù)與其分子式C15H16NO6(Δ0.1mmu)一致。ESI/MS分析證實(shí)了ETM305的該分子量(圖6)；在m/z306處觀察到分子離子與其鈉加合物在一起。ETM305的1HNMR波譜圖(圖7)對于確定其結(jié)構(gòu)是非常重要的。在δ2.04，2.28和6.09處的共振現(xiàn)象分別與Et743中Me-6(δ 2.03)，-OCOCH3(δ2.29)和二氧-甲叉質(zhì)子δ6.11，δ6.01)幾乎相同。
此外，還觀察到與一個(gè)-CH＝CH-NHCHO單位(δ7.09，d，1H，J＝15Hz；δ6.19，d，1H，J＝15Hz；δ8.04，s，1H)和一個(gè)附加甲基(δ2.52，s，3H)相對應(yīng)的共振現(xiàn)象。該甲基的化學(xué)位移和乙酰苯3(δ2.55)的位移十分匹配。我們饒有興趣地注意到ETM305的1HNMR波譜由于構(gòu)象異構(gòu)體圍繞-NH-CHO鍵旋轉(zhuǎn)，由二部分共振組成(4∶1比例)。正如示意圖1所示，1H NMR數(shù)據(jù)連同MS數(shù)據(jù)提示，ETM305具有與一個(gè)乙烯基-甲酰胺單位和一個(gè)甲基酮相連接的Et743B-單位芳香環(huán)系統(tǒng)，F(xiàn)AB/MS/MS分析(m/z 306)支持該所提出的結(jié)構(gòu)(圖8)。
示意圖1 D.ETM775的結(jié)構(gòu)用HRFAB/MS分析顯示ETM775(對L1210細(xì)胞株的IC50為0.2ug/ml)一分子離子峰在776.2489處(圖5)。該數(shù)據(jù)與其分子式C39H42N3O12S(Δ0.1mmu)一致(圖11)，表明ETM775是Et743的氧化產(chǎn)物。正模和負(fù)模ESI/MS譜圖都證實(shí)了ETM775的這一分子量(圖12和圖13)。因?yàn)镋TM775的量有限，主要根據(jù)其質(zhì)譜資料作其結(jié)構(gòu)測定。對ETM775的M+H(m/z 776)的FAB/MS/MS分析，在確定該額外氧——正如由m/z 276和260(276-氧)處的峰所顯示的，該額外氧以N-氧化物的形式位于N-2上——的位置方面，是重要的。在Et743中末觀察到的m/z 232處的級分離子提示該甲醇胺氧被氧化為酰胺(示意圖2)。正如在m/z 204(A-單位)以及m/z 224和250(C-單位)處的峰所顯示的，ETM775中的A-單位和C-單位保持完整。[1]ETM775的750750Mhz1H NMR譜圖(圖16)和紫外光譜圖(圖17)都與Et743的相似。
示意圖2 II.Et743-Mayo代謝研究A.M1代謝物(ETM305)ETM樣品通過C18 sep-pack柱過濾，其洗脫液(3∶1 MeOH/H2O)在氮?dú)饬飨录右詽饪s。所得樣品經(jīng)HPLC純化(與前述的條件相同)證明有一種與ETM305相同保留時(shí)間的化合物存在(圖18)。M1的紫外光譜圖(圖19)和ESI/MS譜圖(圖20)都與ETM305的相同。由此得出結(jié)論，M1代謝物具有像ETM305相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
B.M2代謝物(ETM204)所提供的樣品通過C18 sep-pack柱過濾，其洗脫液(3∶1 MeOH/H2O)在氮?dú)饬飨录右詽饪s。所得樣品用FAB/MS，ESI/MS和1H NMR作分析。
C.ETM204(M2)的結(jié)構(gòu)用HRFAB/MS分析表明ETM204的分子離子峰為204.1024。該數(shù)據(jù)與其分子式C12H14NO2(Δ0.0mmu)一致。ESI/MS分析證實(shí)其分子量為204(圖21)。該分子式與Et743中的A-單位的分子式相似。據(jù)此推論，ETM204的化學(xué)結(jié)構(gòu)是示意圖3中所示的芳香胺鹽衍生物。
示意圖3 ETM204的1H NMR譜圖(圖22)顯示支持所提出的結(jié)構(gòu)的共振現(xiàn)象4種芳香族信號(δ9.2，s；δ7.8，d，J＝5Hz，以及δ6.8，s)和3個(gè)甲基單峰(δ4.2，δ3.9和δ2.4)。ETM204的ESI/MS/MS分析(圖23)證明，與N-甲基(204-CH3)明顯丟失相對應(yīng)，其主峰離子為189。ETM305和ETM775的生物學(xué)研究采用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)方案，試驗(yàn)了化合物ETM305和ETM775對下列腫瘤細(xì)胞株的抗腫瘤作用P388(鼠白血病)；A-549(人肺癌)；HT-29(人結(jié)腸腺癌)以及MEL-28(人惡性黑素瘤)。例如，見Bergeron等。生物化學(xué)和生物理研究通訊(Biochem Biophys resComm)1984，121(3)848-854和Schroeder等。醫(yī)用化學(xué)雜志(J MedChem)，1981，24 1078-1083。這些結(jié)果在下面的表2中列出
表2.腫瘤細(xì)胞株和抗腫瘤活性IC50(ug/ml)
治療方法本發(fā)明包括具有生物活性的化合物，因此，本發(fā)明的實(shí)施方案是以利用這樣的化合物的治療方法為目標(biāo)的。如上所述，本發(fā)明的化合物體內(nèi)外對腫瘤細(xì)胞株具有細(xì)胞毒作用?？梢灶A(yù)料，體內(nèi)外的這些抗腫瘤活性擴(kuò)大到體內(nèi)應(yīng)用，同樣是有效的。
這些化合物已經(jīng)以基本上純化的形式，即是在足以呈現(xiàn)其物理學(xué)和生物學(xué)特性的純化水平上，被分離出來。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，這些化合物具有特異的抗腫瘤活性，由于這種作用，它們作為哺乳動(dòng)物尤其是人的醫(yī)藥劑，可能是有用的。這樣，本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及含有本發(fā)明所鑒定的這些活性化合物的藥物組合物以及施用這些藥物組合物的治療方法。
如上所述，本發(fā)明的這些活性化合物具有抗腫瘤活性。因此，本發(fā)明也為患對這些化合物敏感的惡性腫瘤的任何哺乳動(dòng)物提供了一種治療方法。這種治療方法包括給患病個(gè)體施用有治療作用劑量的單一活性化合物，或各活性化合物的混合物，或其藥物組合物。本發(fā)明也與藥劑制備有關(guān)，后者包括一種或多種本發(fā)明的活性化合物作為活性成份，以及其制備方法。
藥物組合物的舉例包括含有適當(dāng)成份的，作口服、局部施用或非腸道施用的任何固體(片劑，丸劑，膠囊劑，顆粒等)或液體(溶液，乳劑混懸液)，這些藥物組合物可以含有單純的本發(fā)明的化合物，或與其他藥理學(xué)活性化合物載體聯(lián)合應(yīng)用。這些藥物組合物非腸道施用時(shí)，可能需要是無菌的。
作為與本發(fā)明有關(guān)的術(shù)語″單位劑量″，系指適合作為動(dòng)物單次劑量的物理學(xué)上獨(dú)立的單位。每一單位含有經(jīng)過計(jì)算能產(chǎn)生所需要的抗腫瘤活性而確定的活性化合物劑量，它與所需要的稀釋劑即載體或賦形劑聯(lián)用。本發(fā)明新穎的單位劑量的技術(shù)規(guī)格由下列條件確定，或直接取決于下列條件(a)該活性化合物的獨(dú)特特性和所要達(dá)到的特定抗腫瘤活性，(b)調(diào)配供動(dòng)物抗腫瘤應(yīng)用的這樣的活性化合物，在技術(shù)上存在的內(nèi)在限制。
單位劑量形式一般通過把凍干的或干燥的活性化合物(或其鹽)分散在生理上可接受的稀釋劑或賦形劑(如水、生理鹽水或磷酸鹽緩沖的生理鹽水)中，形成水性組合物而制成。這樣的稀釋劑為本專業(yè)技術(shù)人員所熟知，例如，在Remington氏藥劑學(xué)(Remington′sPhaarmaceutical sciences，16版，Mack Publishing公司，Easton，PA，1980，p1465-1467)一書中對此作了討論。
單位劑量形式也可以包含一種賦形劑作為稀釋劑的一部分。像弗氏(Freund′s)完全佐劑、弗氏(Freund′s)不完全佐劑和明礬都是本專業(yè)技術(shù)人員所熟知的材料，可以從幾種商業(yè)途徑購得。
待施用的活性化合物的量尤其取決于待處理的動(dòng)物種類、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的大小、腫瘤的大小(如果知道的話)、存在的腫瘤類型(例如實(shí)體)以及受試者利用該活性化合物的能力。需要施用的活性化合物的準(zhǔn)確劑量取決于專業(yè)人員的判斷，而且給每個(gè)個(gè)體確定一個(gè)準(zhǔn)確的施用劑量，尤其在人作為被治療的動(dòng)物的場合。但是，可以根據(jù)治療有效的血藥濃度確定劑量范圍，劑量范圍可從約0.01μM至約100μM，優(yōu)選的劑量范圍從約0.1μM至約10μM。
初次給藥和增強(qiáng)注射的適當(dāng)給藥方式也是可變化的。但是，有代表性的給藥方式是首次給藥后，以1小時(shí)或1小時(shí)以上的間隔，通過連續(xù)的注射或其他給藥方式，重復(fù)給予劑量。作為替代，能足以維持治療有效的血藥濃度的連續(xù)靜脈灌注方式也是值得考慮的。
參考文獻(xiàn)提供下面的背景參考文獻(xiàn)，以協(xié)助讀者了介本發(fā)明。其內(nèi)容依所需程度，在此引入作為參考。
1.A)Rinehard等。有機(jī)化學(xué)雜志(J Org Chem)1990，55，4512.B)Rinehard等。美國化學(xué)雜志(J Am Chem)1996，118，9017。
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4.Rinehard等。生物化學(xué)研究通訊(Biochem Res Cmmun)，1984，124，350。
已詳細(xì)闡述了本發(fā)明，包括其優(yōu)化的實(shí)施方案。但是，會得到這的評價(jià)本專業(yè)技術(shù)人員基于對本發(fā)明公開內(nèi)容的理解，可以對本發(fā)明作修改和/或改進(jìn)，而這仍然在本發(fā)明的范圍和精神內(nèi)。
權(quán)利要求
1.基本上純化的，具有如下結(jié)構(gòu)的ETM20全文摘要
完成了由人細(xì)胞色素CYP3A4代謝的幾種Et743代謝產(chǎn)物的純化和結(jié)構(gòu)說明。本專利中這些化合物縮寫為ETM，緊接著標(biāo)注數(shù)字，數(shù)字表示該化合物的近似分子量。迄今為止三個(gè)化合物已經(jīng)鑒定，分別命名為ETM305，ETM775和ETM204。這些代謝物的結(jié)構(gòu)如ETM305，ETM204和ETM775所示。
文檔編號C07D411/14GK1896064SQ200610094478
公開日2007年1月17日 申請日期1999年5月11日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月11日
發(fā)明者K·L·萊恩哈特, J·J·莫拉勒斯, J·賴德, I·雷孟多, P·弗洛里亞諾, L·加西亞格拉瓦洛斯 申請人:法馬馬有限公司