專利名稱：：用于血管生成治療的小肽及其應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及小肽及其應用，具體地，涉及可用于治療血管生成性疾病的小肽，還涉及編碼這些小肽的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體和細胞，以及利用這些肽、多核苷酸、載體或細胞來治療血管生成性疾病的方法和藥物組合物。
背景技術：
：腫瘤是危害人類健康的頑癥之一，目前治療腫瘤的方法有多種，基于血管生成與腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的關系而發(fā)展起來的抗血管生成療法是一種較為看好的方法，成為治療癌癥的新希望。早在20世紀70年代，F(xiàn)olkman就提出血管生成是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化、生長和轉(zhuǎn)移的生物基礎與重要環(huán)節(jié)，并提出血管發(fā)生的抑制劑可能會成為一種新型的、有價值的腫瘤治療手段。沒有新生血管生成的惡性腫瘤往往處于半休眠狀態(tài)，局限于原發(fā)部位，生長緩慢且不會太大。體積超過2mm33mm3的腫瘤不僅需要新生血管維持營養(yǎng)供給和排泄代謝產(chǎn)物，還需要其提供有利于轉(zhuǎn)移的通道。隨著腫瘤細胞的不斷增殖，瘤塊體積的不斷擴大，瘤體的微循環(huán)改變，刺激腫瘤細胞和宿主細胞產(chǎn)生刺激血管生成的因子，并下調(diào)抑制血管生成的因子的產(chǎn)生，打破二者在腫瘤組織局部的平衡，啟動血管生成，構成腫瘤迅速增殖的前提條件。一旦新生血管形成，腫瘤會呈對數(shù)般地生長，同時大量腫瘤細胞借助脈管向遠處轉(zhuǎn)移，對患者的病情及預后極為不利。有證據(jù)表明，運用藥物抑制腫瘤及腫瘤邊緣新生血管的生成可明顯提高患者的五年生存率。根據(jù)對腫瘤血管生成的多年研究，O'Reilly與Folkman等認為在腫瘤患者或荷瘤動物血清中必然同時存在著刺激血管生成的因子與抑制血管生成的因子。這些內(nèi)源性血管生成刺激因子和抑制因子通過自分泌或旁分泌等方式直接作用于血管內(nèi)皮細胞，影響其增殖、遷移和形成管狀結(jié)構，二者間的平衡直接決定了腫瘤血管的啟動和發(fā)展方向，因此是調(diào)節(jié)腫瘤血管的最重要的因素。其中內(nèi)源性腫瘤血管生成抑制因子是人體內(nèi)源性蛋白的一部分，在控制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的作用，有著較好的抗癌前景。與其他抗腫瘤藥物相比，內(nèi)源性腫瘤血管生成抑制因子作為藥物具有許多優(yōu)勢(1)治療發(fā)生時，血管形成已被啟動，故內(nèi)源性腫瘤血管生成抑制因子治療具有良好的特異性；(2)實體瘤生長和轉(zhuǎn)移均需依賴血管生成，因而具有廣譜性；(3)血管內(nèi)皮細胞暴露于血流中，藥物能直接發(fā)揮作用，故劑量小、療效高；(4)內(nèi)皮細胞基因表達相對穩(wěn)定，不易產(chǎn)生耐藥性；(5)反復用藥不會引起耐藥性，無細胞毒藥物的巨大毒副作用。如內(nèi)源性抗血管生成物質(zhì)(endostatin)在我國也己成功上市。許多內(nèi)源性抗血管生成制劑如angiostatin等也已處于不同的臨床試驗中?？梢娖渥鳛楹蜻x腫瘤治療藥物具有較好的前景。但是上述內(nèi)源性抗血管生成蛋白，因其分子量較大，活性低，合成不方便，通過純化得到的制劑存在較弱的免疫原性，長時間用藥可引起耐藥反應。近年來內(nèi)源性抗腫瘤小肽藥物的研究發(fā)展迅猛。內(nèi)源性抗腫瘤小肽藥物較傳統(tǒng)抗腫瘤藥物具有明顯的優(yōu)勢，其作為信使分子針對腫瘤細胞生長發(fā)育的不同環(huán)節(jié)特異性殺傷或抑制腫瘤細胞，另外小肽分子小，活性高，易于合成，而且無免疫源性，結(jié)構簡單，功能明確而特異，毒副作用小，作為藥物較為安全。因此，近年來，以內(nèi)源性小肽為對象的抗腫瘤藥物研制與開發(fā)愈來愈受到重視。由此可見，內(nèi)源性抗腫瘤血管生成抑制小肽作為候選藥物用于治療腫瘤以及預防腫瘤術后復發(fā)及轉(zhuǎn)移具有極大的發(fā)展?jié)摿Α?br/>發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個目的在于提供一種小肽或其藥學上可接受的鹽。本發(fā)明的另一目的是提供含有本發(fā)明的小肽的肽或其藥學上可接受的鹽在制備治療血管生成性疾病的藥物中的應用。本發(fā)明的另一目的是提供一種融合蛋白，其含有本發(fā)明的小肽。本發(fā)明的另一目的是提供編碼本發(fā)明的小肽的多核苷酸。本發(fā)明的目的是提供一種藥物組合物，其含有本發(fā)明的小肽或其藥學上可接受的鹽；或本發(fā)明的融合蛋白；或本發(fā)明的多核苷酸；以及藥物可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的另一目的是提供含有本發(fā)明的多核苷酸的質(zhì)?；虿《据d體。本發(fā)明的另一目的是提供含有本發(fā)明的多核苷酸或載體的細胞。本發(fā)明的另一目的是提供一種治療血管生成性疾病的方法?！矫?，本發(fā)明提供一種小肽或其藥學上可接受的鹽，所述小肽為與表2中SEQIDNO:1所示的序列(文中稱為FpAT小肽)具有至少40%同源性且與SEQIDNO:l具有相同的功能的序列。優(yōu)選本發(fā)明的小肽與SEQIDNO:l所示的序列具有至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、至少99.5%同源性的序列。在本發(fā)明的一個實施方式中，提供一種如下(a)或(b)的小肽或其藥學上可接受的鹽，其中所述小肽為(a)SEQIDNO:1所示序列組成的小肽；(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有治療血管生成性疾病作用的由(a)衍生的小肽。由于本發(fā)明SEQIDNO:1所示的序列為僅有15個氨基酸序列的小肽，所以本領域的普通技術人員可以很容易對SEQIDNO:1的氨基酸序列進行本領域常規(guī)的改變而不改變其功能，所述改變例如進行常規(guī)取代、缺失或添加等操作，尤其是進行非極性氨基酸間或是極性氨基酸間(特別是不帶電荷的極性氨基酸間或帶相同電荷(帶正電荷或負電荷)的極性氨基酸間)的取代。例如，本領域技術人員可以利用表1顯示的常見氨基酸序列的分類進行非極性氨基酸間或是極性氨基酸間的取代，例如Asp與Glu之間的互換。表l氨基酸分類非極性氨基酸Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro共八種極性不帶電荷Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr共七種帶正電荷Arg、Lys、His帶負電荷Asp、Glu本發(fā)明人禾IJ用分析程序(http:〃www.ebi.ac.uk/Tools/SequenceAnalysis-ClustalW)，按照默認參數(shù)對FpAT與VEGF(血管內(nèi)皮細胞生長因子)的同源性進行序列比對分析，結(jié)果得出Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly這六個氨基酸，至少是Ala-Glu-Gly-Gly-Gly這五個氨基酸是該小肽的作用核心序列(實施例3);其結(jié)果與在FpAT及其截短小肽對昆明鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制中的結(jié)論基本一致，在截短小肽的實驗中，發(fā)明人以大量實驗證明Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly連續(xù)六個氨基酸為本發(fā)明小肽的作用核心序列。綜合上述結(jié)果，本發(fā)明人認為本發(fā)明的Ala-Glu-Gly-Gly,尤其Ala-Glu-Gly連續(xù)氨基酸序列是本發(fā)明的小肽的作用核心序列。在此基礎上，本領域技術人員理解，對本發(fā)明小肽的核心序列之外的序列進行取代、缺失或添加而基本不會改變本發(fā)明的小肽的功能。所述同源性也可根據(jù)本領域的普通技術人員已知的方法計算。例如，UWGCG包提供了BESTFIT程序，其可用于計算同源性(Devereux等(1984)Wwc/e/cZc化ie^arc/z12,第387395頁)。BLAST算法也可用于計算同源性或排列序列，例如，5/o/215:403410中所述。本發(fā)明化合物可以以藥物可接受的鹽形式使用。"藥物可接受的鹽"指適于與人或動物的組織接觸，而無過多的毒性、刺激、變態(tài)反應等。藥物可接受的鹽是本領域熟知的。這種鹽可以在本發(fā)明肽的最終分離和純化的過程中制備，也可以將游離的堿或酸與適當?shù)挠袡C或無機酸或堿反應單獨制備。代表性酸加成鹽包括但不限于乙酸鹽、二己酸鹽、藻酸鹽、檸檬酸鹽、天冬氨酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、富馬酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳酸鹽、馬來酸鹽、甲磺酸鹽、煙酸鹽、2-萘磺酸鹽、草酸鹽、3-苯基丙酸鹽、丙酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、磷酸鹽、谷氨酸鹽、碳酸氫鹽、對甲苯磺酸鹽和十一烷酸鹽。能用于形成藥物可接受鹽的優(yōu)選的酸是鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、草酸、馬來酸、琥珀酸和檸檬酸。藥物可接受的堿加成鹽中的陽離子包括但不限于堿金屬或堿土金屬離子如鋰、鈉、鉀、鈣、鎂和鋁等，以及非毒性季銨陽離子如銨、四甲基銨、四乙基銨、甲基胺、二甲基胺、三甲基胺、三乙基胺、二乙基胺、乙基胺、二乙胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。優(yōu)選的堿加成鹽包括磷酸鹽、Tris和乙酸鹽。本發(fā)明的小肽也可以為SEQIDNO:1所示的序列的截短小肽，優(yōu)選至少4個連續(xù)氨基酸序列，更優(yōu)選5、6、7、8、9、10、11、12、13、14個連續(xù)氨基酸的序歹ij;所述連續(xù)氨基酸優(yōu)選為Ala-Glu-Gly、更優(yōu)選Ala-Glu-Gly-Gly、進一步優(yōu)選為Leu-Ala-Glu-Gly-Gly或Leu-Ala-Glu曙Gly-Gly-Gly或Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly。所述截短小肽可以為SEQIDNO:1所示的序列的N末端至少6、7、8、9、10、11、12、13、14個氨基酸的序列或C末端至少6、7、8、9、10、11、12、13、14個氨基酸的序列，優(yōu)選小肽為表2中SEQIDNO:1所示的序列的C末端至少9個，更優(yōu)選C末端至少12個氨基酸的序列；或相對于表2中SEQIDNO:1所示的序列N端^5個和C端少4個氨基酸的中間段序列。具體地本發(fā)明的小肽可以為表2所示。表2已進行動物抑瘤實驗的各種小肽序列FpATAsp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe"Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgSEQE)NO:1FpAT-N3dGlu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgSE(3IDNO:2FpAT-編Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgSE(JIDNO:3FpAT-N9dGlu-Gly-Gly-Gly-Val-ArgSEQIDNO:4FpAT-C3dAsp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-GlySEQIDNO:5FpAT-C6dAsp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-AlaSEQIDNO:6FpAT-C9dAsp-Ser-Gly-Glu-Gly-AspSEQIDNO:7FpAT-N5d-C4dAsp-Phe-Leu-Ala-Glu-GlySEQIDNO:8在本發(fā)明的一個實施方式中，本發(fā)明的小肽為SEQIDNO:l所示的序列經(jīng)l個或幾個氨基酸的取代、缺失和/或添加而得到的。所述取代、缺失和/或添加優(yōu)選為上述極性氨基酸之間發(fā)生或非極性氨基酸之間發(fā)生的取代、缺失和/或添加，尤其是可以對本發(fā)明的小肽的核心序列(Ala-Glu-Gly)之外，優(yōu)選Ala-Glu-Gly-Gly、Leu-Ala-Glu-Gly-Gly、Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly或Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly之外的序列進行極性氨基酸之間、或非極性氨基酸之間的取代、缺失和/或添加。本發(fā)明的小肽可以按本領域技術人員已知的常規(guī)固相合成方法合成。例如本發(fā)明小月太可以按StewardandYoung(Steward,J.M.andYoung,J.D.,SolidPhaseP印tideSynthesis,2ndEd"PierceChemicalCompany,Rockford,111.,(1984))描述的方法用AppliedBiosystem合成儀或Pioneer肽合成儀按固相化學技術合成。對于固相肽合成，在Steward,J.M.andYoung,J.D.,SolidPhasePeptideSynthesis,W.H.FreemanCo.(SanFrancisco),1963禾卩J.Meienhofer，HormonalProteinsandPeptides,vol.2,p.46,AcademicPress(NewYork),1973中可以找到許多技術的介紹。一般，這些方法包括向成長的肽鏈上依次添加一個或多個氨基酸或適當保護的氨基酸。一般，第一個氨基酸的氨基或羧基用適當?shù)谋Ｗo基保護，然后將保護的氨基酸連在惰性固相載體上,隨后在適于形成酰胺鍵的條件下加入相應氨基或羧基被適當保護的序列中的下一個氨基酸。然后從新加入的氨基酸殘基上除去保護基，再加入必要時適當保護的下一個氨基酸，如此重復操作。當所有氨基酸以正確的順序連接后，相繼或同時除去任何剩余的保護基和固相支持物，得到最終的多肽。通過簡單修改此一般程序，可能一次向成長鏈添加一個以上的氨基酸。制備本發(fā)明的較短的肽，例如FpAT小肽或其截短小肽優(yōu)選的方法是固相肽合成，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，使用Pioneer肽自動合成儀制備本發(fā)明的小肽。其中使用a氨基被酸或堿敏感性基團保護的氨基酸。這種保護基應該在肽鍵形成條件下穩(wěn)定，又容易除去而不破壞成長的肽鏈、不會引起其中的任何手性中心外消旋。適當?shù)谋Ｗo基有9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、叔丁氧羰基(Boc)、芐氧羰基(Cbz)、2-氰基叔丁氧羰基等。9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)是合成本發(fā)明肽特別優(yōu)選的。制備本發(fā)明的較長的多肽為本領域已知的，可以使用戊二醛交聯(lián)的方法，也可以使用基因表達的方式獲得。發(fā)明人所在研究組新近利用表面增強激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜技術發(fā)現(xiàn)其中有一個低分子量差異蛋白特異地存在于胃癌病人血清中，經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)該低分子量蛋白是一個含有15個氨基酸的小肽，相當于纖維蛋白肽A(fibrinopeptideA，F(xiàn)pA)的氨基端15個氨基酸(實施例1)，因此發(fā)明人將其命名為FpAT(fibrinopeptideAtruncated)。為了進一步了解其生物學活性，發(fā)明人化學合成了這個小肽(實施例2),發(fā)現(xiàn)對荷瘤小鼠進行靜脈注射，出現(xiàn)顯著的抑制腫瘤生長(實施例4和5)。該效果在重復實驗及不同小鼠腫瘤模型中均得到了驗證。進而，在對荷瘤小鼠瘤塊進行組織化學分析時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)靜脈注射小肽的荷瘤小鼠，瘤塊中微血管密度明顯減少；使用第Vffl因子抗體標記微血管內(nèi)皮細胞進行免疫組織化學分析，發(fā)現(xiàn)給小肽組瘤塊微血管密度較對照組明顯減少(PO.05)(實施例6)。為了進一步研究FpAT小肽的生物學功能，在經(jīng)多次重復實驗反復證實該小肽具抗腫瘤生長活性的基礎上，發(fā)明人用MTT實驗初步探討了FpAT小肽在體外對不同細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)該小肽對腫瘤細胞(如D2F2細胞)的生長無抑制作用(實施例7)，但對原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)和豬主動脈內(nèi)皮細胞(PAEC)的生長表現(xiàn)出一定的抑制作用(實施例8)。在雞胚絨毛尿囊膜血管增殖抑制模型中，可以發(fā)現(xiàn)FpAT可明顯地抑制新生血管的生成，還能引起血管的分布紊亂及原有血管的萎縮(實施例9)。上述無疑證明了FpAT小肽的通過抗血管生成從而對腫瘤生長有顯著的抑制作用。尤其值得一提的是，本發(fā)明的FpAT及其截短小肽能不同程度的抑制鼠肝癌H22細胞在昆明鼠體內(nèi)的生長，延緩腫瘤生長速度(實施例IO)。從而，本發(fā)明的另一方面是提供含有本發(fā)明的小肽的肽或其藥學上可接受的鹽在制備治療血管生成性疾病的藥物中的應用。所述的血管生成疾病的具體例子1)因正常血細胞生產(chǎn)或成熟功能失?；蛘系K而導致的疾病千細胞高度分裂所致異常；再生障礙性貧血；中性粒細胞減少；細胞減少；貧血；各類血細胞減少；粒細胞缺乏；血小板減少；紅細胞發(fā)育不良；由于藥物，放射性或感染引起的布一戴(Blackfan-Diamond)綜合征；2)血液的惡性腫瘤包括但不限于以下血液惡性腫瘤急性淋巴母細胞(淋巴細胞)白血?。宦粤馨图毎籽?；急性骨髓性粒細胞白血病；慢性骨髓性粒細胞白血病；急性惡性骨髓硬化癥；多發(fā)性骨髄瘤；真性紅細胞增多癥；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥；何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤；3)惡性或?qū)嶓w瘤包括但不僅限于如下器官的原發(fā)或轉(zhuǎn)移實體瘤和癌乳腺、結(jié)腸、直腸、肺、口咽、喉咽、食管、胃、胰腺、肝、膽囊、膽管、小腸；尿道包括腎、膀胱和泌尿道上皮；女性生殖道，包括宮頸、子宮、卵巢、絨毛膜癌和妊娠營養(yǎng)層?。荒行陨车?，包括前列腺、精囊和睪丸；內(nèi)分泌腺體，包括甲狀腺、腎上腺和垂體；皮膚，包括血管生成性瘤、黑素瘤、從骨或軟組織發(fā)生的肉瘤和卡波濟肉瘤；腦、神經(jīng)、眼和腦膜的腫瘤，包括星形細胞瘤、膠質(zhì)細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、神經(jīng)瘤、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤和神經(jīng)膜瘤；肝癌；骨肉瘤。但優(yōu)選為肝癌、骨肉瘤、胃癌、結(jié)腸癌；4)自身免疫性疾病類風濕性關節(jié)炎；I型糖尿??；慢性肝炎；多發(fā)性硬化癥；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；5)遺傳性(先天性)異常貧血；家族性再生障礙性貧血；范康尼綜合征；布盧姆綜合征；單純性紅細胞再生障礙性貧血(PRCA);先天性角化不良(dyskeratosiscongenita)綜合征；布一戴(Blackfan-Diamond)綜合征；先天性紅細胞再生缺陷綜合征I-IV;Chwachmann-Diamond綜合征；二氫葉酸還原酶缺乏；formamino轉(zhuǎn)移酶缺乏；累-奈(Lesch-Nyhan)綜合征；先天性球形紅細胞癥；先天性橢圓形細胞增多癥；先天性裂口紅細胞癥；先天性Rhnull??；陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶變體l，2，3;丙酮酸激酶缺乏；先天性促紅細胞生成素反應低下；鐮刀細胞病和特征；地中海貧血a，p，y;高鐵血紅蛋白血癥(met-hemoglobinemia);先天性免疫缺陷；重度聯(lián)合免疫缺陷病(SCID);淋巴細胞缺乏癥(barelymphocytesyndrome);離子載體反應性聯(lián)合免疫缺陷(ionophore-responsivecombinedimmunodeficiency);具有帽化異常的聯(lián)合免疫缺陷(combinedimmunodeficiencywithacappingabnormality);核苷磷酸化酶缺陷；粒細胞肌動蛋白缺陷；嬰兒粒細胞缺乏；高歇??；腺苷脫氨酶缺陷；科斯特曼綜合征；網(wǎng)狀細胞發(fā)育不全；先天性白細胞功能不良綜合征；6)其它疾病骨硬化?。还撬栌不Y；獲得性溶血性貧血；獲得性免疫缺陷；感染性疾病所致原發(fā)或繼發(fā)性免疫缺陷；細菌性感染(如普魯氏菌病，李斯特菌病，結(jié)核病，麻瘋病)；寄生蟲感染(如瘧疾，利氏曼病)；真菌感染；由于老化嗜菌細胞功能不良所致淋巴細胞比例失調(diào)引起的免疫功能不良；科斯特曼粒性白細胞缺乏；慢性肉芽腫性疾?。磺?東綜合征；Willams-Beuren綜合征；中性粒細胞肌動蛋白缺陷；中性粒細胞膜GP-180缺陷；粘多糖貯積病；粘脂貯積??；混和性免疫缺陷；威-奧綜合征；al-抗胰蛋白酶缺乏癥。本發(fā)明的肽及其藥學上可接受的鹽通過抑制腫瘤內(nèi)皮細胞進一步抑制腫瘤的生長，從而能夠治療腫瘤以及預防腫瘤術后復發(fā)及轉(zhuǎn)移。所以優(yōu)選本發(fā)明的肽及其藥學上可接受的鹽用于腫瘤治療以及預防腫瘤術后復發(fā)及轉(zhuǎn)移。所述腫瘤可以為實體瘤，也可以為血液腫瘤(例如上述急性淋巴母細胞(淋巴細胞)白血??；慢性淋巴細胞白血??；急性骨髓性粒細胞白血病；慢性骨髓性粒細胞白血病；急性惡性骨髓硬化癥；多發(fā)性骨髓瘤；真性紅細胞增多癥；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥；何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤)，但優(yōu)選為實體瘤。所述的實體瘤可以為但不僅限于包括發(fā)生在下述器官的原發(fā)或轉(zhuǎn)移實體瘤和癌乳腺、結(jié)腸、直腸、肺、口咽、喉咽、食管、胃、胰腺、肝、膽囊、膽管、小腸；尿道包括腎、膀胱和泌尿道上皮；女性生殖道，包括宮頸、子宮、卵巢、絨毛膜癌和妊娠營養(yǎng)層?。荒行陨车?，包括前列腺、精囊和睪丸；內(nèi)分泌腺體，包括甲狀腺、腎上腺和垂體；皮膚，包括血管生成性瘤、黑素瘤、從骨或軟組織發(fā)生的肉瘤和卡波濟肉瘤；腦、神經(jīng)、眼和腦膜的腫瘤，包括星形細胞瘤、膠質(zhì)細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、神經(jīng)瘤、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤和神經(jīng)膜瘤；肝癌；骨肉瘤。但優(yōu)選為肝癌、骨肉瘤、胃癌、結(jié)腸癌。本發(fā)明的另一方面是提供一種融合蛋白，其含有本發(fā)明所述的小肽，所述小肽可以是相同或不同的序列，在相鄰的序列之間任選有適當?shù)慕宇^。換句話說，本發(fā)明的小肽可以任選通過適當?shù)慕宇^相互連接，形成同聚、或異聚的多聚體?？梢栽O想將該小肽與其他功能性肽或蛋白融合，形成不同形式的多功能融合蛋白。例如可以將本發(fā)明小肽與下列多肽或蛋白組合成融合蛋白1)各類細胞因子，例如IL-2、IL-12、IL-4、IL-24、GM-CSF-1、IFN-a、IFN國y、MIP-1、PEDF、TSP-1、TIMP-1、TIMP-2、VEGI和IL-8中的一種或一種以上的細胞因子，以在抑制腫瘤的生長同時發(fā)揮細胞因子的作用；2)可溶性受體KDR或Flt-l，以抑制腫瘤的生長的同時發(fā)揮可溶性受體結(jié)合VEGF的雙重功能；3)特異性抗體或其片段，如腫瘤血管內(nèi)皮特異性抗體或其片段，從而使本發(fā)明小肽在體內(nèi)的分布具有靶向性；4)B7等分子，以便抑制腫瘤的生長的同時在腫瘤局部活化淋巴細胞；5)其他任何能與本發(fā)明小肽相容并在功能上互補或協(xié)同的肽或蛋白，如endostatin、angiostatin、vasostatin、PEX、PF4等。本發(fā)明的融合蛋白可以利用本領域已知的重組方法產(chǎn)生。本發(fā)明的另一方面提供一種編碼本發(fā)明所述的小肽的多核苷酸。本領域普通技術人員已知，可以根據(jù)不同氨基酸對應的密碼子，確定編碼如SEQIDNO:l所示小肽的多肽的多核苷酸，當然，由于密碼子的簡并性，所述的多核苷酸可以有不同的形式，優(yōu)選根據(jù)不同生物密碼子的使用頻率，選擇相應的密碼子。本發(fā)明的多肽的多核苷酸序列可以是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因組DNA以及合成的DNA，DNA可以是雙鏈或是單鏈形式，單鏈DNA可以是編碼鏈或是非編碼鏈(反義鏈)。本發(fā)明提供了編碼本發(fā)明SEQIDNO:l所示小肽的多核苷酸序列，其如SEQIDNO:9所示，在該序列中，位于第6、9、15、24、27、33、36、39和42位核苷酸位置的n可以是a、c、g或t中的任意一個；位于第3、18和21位核苷酸位置的y為t或c;位于第12、30或45位核苷酸位置的r為g或a。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明SEQIDNO:l所示小肽的優(yōu)選多核苷酸序列，其如SEQIDNO:10所示。在此基礎上，本領域技術人員可以很容易確定編碼其余小肽的多核苷酸序列。本發(fā)明的另一方面在于提供含有本發(fā)明的多核苷酸的質(zhì)?；虿《据d體。在基因工程中，常用人工構建的質(zhì)粒作為載體。人工構建的質(zhì)?？梢约喾N有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。包含本發(fā)明的多核苷酸的人工質(zhì)粒運載體例如pBR322、pSC101等。病毒載體技術是將治療基因及其表達元件包裝到特定的病毒顆粒中形成重組病毒，并大量生產(chǎn)和純化的系列技術。這樣的重組病毒可以有效地將治療基因?qū)爰毎衅鸬窖a償、代替、修復有缺陷的基因功能或殺滅異常細胞如腫瘤細胞等的作用?？梢杂米鞅景l(fā)明的多核苷酸的載體的病毒主要包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、單純皰疹病毒、痘病毒等。本發(fā)明的另一方面在于提供含有本發(fā)明的多核苷酸或載體的細胞。該細胞包括但不限于原核宿主細胞，諸如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬等；真核宿主細胞，諸如酵母屬、曲霉屬、昆蟲細胞，諸如果蠅S2和草地夜蛾Sf9;動物細胞，女口CHO、COS(猴腎成纖維細胞系，Gluzman(Cell23:175,1981))及其它的能表達相容載體的細胞系。本領域技術人員周知將含有本發(fā)明的多核苷酸的質(zhì)?；蜉d體導入上述宿主細胞的方法，包括但不限于氯化鈣介導的轉(zhuǎn)化、磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、粒子轟擊法或基因槍方法。在適當?shù)呐囵B(yǎng)條件與培養(yǎng)基中培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主菌株或細胞，使其生長到恰當?shù)募毎芏戎?，用適當?shù)姆椒?例如溫度轉(zhuǎn)變或化學藥品誘導)誘導所選擇的啟動子，并將細胞再培養(yǎng)一段時間。針對不同的宿主菌株或細胞以及所表達的目的多肽的性質(zhì)，選擇相應的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基在本領域技術人員知識范圍之內(nèi)。尤其重要的是，所述細胞也可以是來自待治療的患者自身的細胞，用本發(fā)明的小肽常規(guī)方法轉(zhuǎn)染該細胞后，可將該經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞回輸給該患者，以治療血管生成性疾病并減少與免疫相關的癥狀。本發(fā)明的另一方面是提供一種藥物組合物，其含本發(fā)明的小肽或其藥學上可接受的鹽和必要時的藥物可接受的載體或賦形劑。藥學上可接受的載體或賦形劑指無毒固態(tài)、半固態(tài)或液態(tài)填充劑、稀釋劑、包囊材料或其他制劑輔料?？梢愿鶕?jù)治療目的、給藥途徑的需要將藥物組合物制成各種劑型，例如溶液劑、脂質(zhì)體包裹劑、微膠囊劑及其他緩釋制劑。載體或賦形劑的例子包括生理鹽水、等滲葡萄糖溶液、緩沖鹽水、甘油、乙醇及上述溶液的組合?？筛鶕?jù)需要在組合物中添加輔助成份，例如與本發(fā)明小肽有協(xié)同作用的化合物；人血清白蛋白、低分子量肽、氨基酸和金屬陽離子等蛋白保護劑；等等。本發(fā)明的藥物組合物中還可以進一步含有1)各類細胞因子，例如IL-2、IL-12、IL-4、IL-24、GM-CSF-1、IFN-a、IFN汀、MIP-1、PEDF、TSP-1、TIMP-1、TIMP-2、VEGI和IL-8中的一種或一種以上的細胞因子，以在抑制腫瘤的生長同時發(fā)揮細胞因子的作用；2)可溶性受體KDR或Flt-l，以抑制腫瘤的生長的同時發(fā)揮可溶性受體結(jié)合VEGF的雙重功能；3)特異性抗體或其片段，如腫瘤血管內(nèi)皮特異性抗體或其片段，從而使本發(fā)明小肽在體內(nèi)的分布具有靶向性；4)B7等分子，以便抑制腫瘤的生長的同時在腫瘤局部活化淋巴細胞；5)其他任何能與本發(fā)明小肽相容并在功能上互補或協(xié)同的肽或蛋白，如endostatin、angiostatin、vasostatin、PEX、PF4等。本發(fā)明的另一方面在于提供一種治療血管生成性疾病的方法，包括給予需此治療的患者治療有效量的本發(fā)明包含所述的小肽(FpAT及其同源序列以及其截短小肽)的肽或其藥學上可接受的鹽、融合蛋白、藥物組合物、多核苷酸、質(zhì)?；虿《据d體和/或細胞。本發(fā)明的治療方法特別適用于治療腫瘤以及腫瘤術后復發(fā)及轉(zhuǎn)移。所述腫瘤可以為實體瘤，也可以為血液腫瘤(例如上述急性淋巴母細胞(淋巴細胞)白血?。宦粤馨图毎籽。患毙怨撬栊粤＜毎籽?；慢性骨髓性粒細胞白血病；急性惡性骨髓硬化癥；多發(fā)性骨髓瘤；真性紅細胞增多癥；瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥；何杰金淋巴瘤；非何杰金淋巴瘤)，但優(yōu)選是實體瘤。本發(fā)明的肽可用于治療例如下列器官的原發(fā)或轉(zhuǎn)移的實體瘤和癌乳腺、結(jié)腸、直腸、肺、口咽、喉咽、食管、胃、胰腺、肝、膽囊、膽管、小腸；尿道包括腎、膀胱和泌尿道上皮；女性生殖道，包括宮頸、子宮、卵巢、絨毛膜癌和妊娠營養(yǎng)層病；男性生殖道，包括前列腺、精囊和睪丸；內(nèi)分泌腺體，包括甲狀腺、腎上腺和垂體；皮膚，包括血管生成性瘤、黑素瘤、從骨或軟組織發(fā)生的肉瘤和卡波濟肉瘤；腦、神經(jīng)、眼和腦膜的腫瘤，包括星形細胞瘤、膠質(zhì)細胞瘤、成膠質(zhì)細胞瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、神經(jīng)瘤、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)鞘瘤和神經(jīng)膜瘤；肝癌；骨肉瘤；但優(yōu)選為肝癌、骨肉瘤、胃癌、結(jié)直腸癌。本發(fā)明所述的小肽或其或其藥學上可接受的鹽、融合蛋白、藥物組合物、多核苷酸、質(zhì)粒或病毒載體和/或細胞適于胃腸外、舌下、腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、頰內(nèi)、腫瘤內(nèi)或表皮給藥。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、皮下、關節(jié)內(nèi)注射和輸注。表皮給藥包括在皮膚、黏膜上、以及在肺和眼的表面給藥。在適于吸入的組合物中，本發(fā)明肽被壓縮或含于壓縮氣體如氮氣或液化氣體推進劑中。優(yōu)選地，本發(fā)明肽不溶于液化推進介質(zhì)中。直腸或陰道給藥的組合物優(yōu)選為栓劑，它可以通過將本發(fā)明的肽與適宜的非刺激性賦形劑或載體如可可脂、聚乙二醇或栓劑蠟混合制備，所述賦形劑或載體在室溫為固態(tài)，在體溫下為液態(tài)，因此在直腸或陰道腔內(nèi)熔化并釋放出活性化合物。當以上述或其他方式進行治療時，治療有效量的本發(fā)明肽可以是本發(fā)明肽的純凈形式、藥物可接受的鹽形式，使用或不使用藥物可接受的賦形劑。治療有效量指以適宜的治療量對治療血管生成性疾病有效的本發(fā)明肽的量。對任何特定患者的具體治療有效劑量取決于許多因素，包括所治療的疾病和其嚴重程度；所用具體化合物的活性；所用的特定組合物；患者的年齡、體重、性別、飲食和一般健康狀況；給藥時間；給藥途徑；具體化合物的排泄速度；治療的持續(xù)時間聯(lián)合或同時服用的其他藥物等。如果需要，日劑量可以分成多次給藥。因此，組合物的單一劑量形式可以含有構成日劑量的全部或其一部分的量。經(jīng)大量實驗驗證，本發(fā)明的小肽可以有效治療血管生成性疾病(具體參見實施例4實施例10)，從而為治療血管生成性疾病提供了一條新的有效途徑，這對于腫瘤治療以及預防腫瘤術后復發(fā)及轉(zhuǎn)移具有重要意義。本發(fā)明的小肽不但具有內(nèi)源性腫瘤血管生成抑制因子的許多優(yōu)點，而且還具有分子小、活性高、易于合成等諸多優(yōu)點。圖IA與圖1B顯示FpAT序列的測定，其中，圖1A顯示FpAT(1468Da)在胃癌與正常對照血清中分布情況；圖1B顯示SELDI-TOF-MS-MS對1468Da小肽測序結(jié)果。圖2A與圖2B顯示FpAT對昆明鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制，其中，圖2A為昆明鼠肝癌H22細胞荷瘤小鼠模型；圖2B為昆明鼠骨肉瘤S180細胞荷瘤小鼠模型。圖3A與圖3B顯示FpAT對裸鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制，其中，圖3A為裸鼠人胃癌823細胞荷瘤小鼠模型；圖3B為裸鼠人結(jié)腸癌HT-29細胞荷瘤小鼠模型。圖4顯示FpAT對小鼠體內(nèi)腫瘤為血管密度的影響。圖5顯示FpAT不能抑制D2F2細胞的增殖。圖6A與圖6B顯示FpAT特異性抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖，其中，圖6A顯示FpAT特異性抑制PAEC細胞(豬動脈內(nèi)皮細胞)的增殖；圖6B顯示FpAT特異性抑制HUVEC細胞(人臍靜脈內(nèi)皮細胞)的增殖。圖7顯示FpAT抑制雞胚絨毛尿囊膜血管的增生。圖8顯示FpAT及其截短小肽對昆明鼠腫瘤(肝癌H22)體內(nèi)生長的抑制。具體實施例方式下面將參考附圖對本發(fā)明進行詳細解釋，但本發(fā)明并不限于這些具體實施例。實施例l.FpAT序列的測定利用表面增強激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜(Surface-EnhancedLaserDesorption/IonizationandTime-of-FlightMassSpectrometry,SELDI-TOF-MS)技術，對胃癌病人(127例)及配對正常人(100例)血清進行分析，獲得胃癌和非胃癌的血清蛋白質(zhì)表達質(zhì)譜圖，通過基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡建立的模型分析，篩選出三個能有效鑒別胃癌及正常血清的低分子量差異蛋白，將該三個低分子量差異蛋白同時作為一組胃癌特異性標志物診斷胃癌時，在模型組中敏感性和特異性分別為95.6%和92.0%，準確率為93.7%;在盲篩組中敏感性和特異性分別為85.3%和88%,準確率為86.4%。其中有一個低分子量差異蛋白特異地存在于胃癌病人血清，使用該低分子量差異蛋白單獨進行診斷，在模型組中其敏感性和特異性分別為73.3%和92.0%，準確率為83.2%;在盲篩組中敏感性和特異性分別為67.1%和100%,準確率為79.5%,可見該分子量差異蛋白為分析模型具有很好的特異性提供了較大的貢獻。進一步對其在各期胃癌患者血清中的差異進行分析，發(fā)現(xiàn)其在iv期胃癌患者血清較im胃癌患者血清中的含量存在明顯差異(PO.05)，可見在IV期胃癌患者血清中該低分子量蛋白明顯減少。IV期以遠端轉(zhuǎn)移為主要特點，因此其特異性減少也可從另一側(cè)面證明其功能與腫瘤的轉(zhuǎn)移擴散相關。因此發(fā)明人初步推測FpAT可能具有血管生成抑制活性，為內(nèi)源性腫瘤血管生成抑制因子，其主要通過抑制新血管生成機制來抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。采用QStar/Pulsarmassspectrometer(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)和CiphergenPCI-1000ProteinChipInterface對特征蛋白峰進行鑒定。按照SELDI常規(guī)的分析步驟，將取自同一例胃癌患者的血清分別點于同一張SAX2芯片的'8個點上，其中一個點使用SELDI進行常規(guī)分析以證明待鑒定峰的存在，其余各點釆用串聯(lián)質(zhì)譜技術進行分析，1468Da在MS-MS通過碰撞誘導裂解變?yōu)檩^小的分子離子，并將碎片峰數(shù)據(jù)提交Mascotproteinsearchengine(MatrixScience,Boston,MA,USA)在已知的蛋白質(zhì)和肽數(shù)據(jù)庫中搜索最匹配的結(jié)果。結(jié)果如圖1A與圖1B所示，圖1A表示1468Da小肽在胃癌與正常人對照不同人群的血清中不同的分布情況，該小肽在胃癌患者中含量較正常人對照明顯增高；圖IB表示1468Da在MS-MS通過碰撞誘導裂解變?yōu)檩^小的分子離子，進行質(zhì)譜分析的碎片峰。結(jié)合參閱下表3所示，表示碎片峰數(shù)據(jù)提交Mascotproteinsearchengine(MatrixScience,Boston,MA，USA)在己知的蛋白質(zhì)和肽數(shù)據(jù)庫中搜索最匹配的結(jié)果，序列結(jié)果為DSGEGDFLAEGGGVR,數(shù)據(jù)庫進行搜索，結(jié)果為血纖維蛋白肽A片段(fibrinopeptideA，F(xiàn)pAtruncated)。表3串聯(lián)質(zhì)譜分析得出1468Da小肽序列<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例2.FpAT小肽及截短小肽(各具體序列參見表2)的化學合成-COOH)的化學合成將裝填4-(2',4'-二甲氧基苯基-Fmoc-氨基甲基)苯氧基乙酰氨基乙基樹脂的肽合成柱置于Pioneer肽合成儀中，并按如下順序在氮氣下進行肽的合成1.將樹脂在DMF中溶劑化5分鐘；2.用DMF中20%哌啶處理樹脂約15分鐘，除去樹脂接枝基團上(或樹脂結(jié)合的氨基酸cc-氨基上)的保護基Fmoc;3.用DMF洗滌樹脂約分鐘；4.用HBTU和HOBT在DMSO-NMP(N-甲基吡咯垸酮)中的0.2M溶液和DMSO-NMP中的0.4M二異丙基乙基胺溶液活化C末端第一個氨基酸Arg的a-羧基；5.將在步驟4獲得的活化的氨基酸在DMF中與步驟2的樹脂(或樹脂結(jié)合的氨基酸)偶聯(lián)約30分鐘；6.用DMF洗滌樹脂5分鐘；7.用下列氨基酸重復步驟26;Fmoc-Val、Fmoc-Gly、Fmoc-Gly、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(Y-OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-Leu、Fmoc-Phe、Fmoc-Asp(P-OtBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(Y-0tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Asp(P-OtBu);8.用THF洗滌樹脂約5分鐘；9.將樹脂與新制備的混合切割試劑硫代茴香醚水二巰基乙垸三氟乙酸(2:1:1:36,體積比)0'C攪拌1015分鐘，然后在室溫攪拌2小時；10.過濾并將濾液在冷乙醚中離心，倒出上清并重復冷乙醚離心直到肽完全沉淀，將所得肽粗品在制備性C18硅膠柱層析純化，用乙腈/(7K，0.1%TFA)梯度洗脫，收集含目標肽的個洗脫流分并冷凍干燥，得到50mgFpAT肽。的化學合成按照與上述相同的方式從C端到N端合成的FpAT-N3d小肽(12肽，相當于FpAT小肽N端有3個氨基酸缺失)；FpAT-N6d小肽(H2N-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg-COOH)的化學合成按照與上述相同的方式從C端到N端合成FpAT-N6d小肽(9肽，相當于FpAT小肽N端有6個氨基酸缺失)；FpAT-N9d小肽(H2N-Glu-Gly-Gly-Gly-Val-Arg-COOH)的化學合成按照與上述相同的方式從C端到N端合成FpAT-N9d小肽(6肽，相當于FpAT小肽N端有9個氨基酸缺失)的化學合成按照與上述相同的方式從C端到N端合成FpAT-C3d小肽(12肽，相當于FpAT小肽C端有3個氨基酸缺失)；FpAT-C6d小肽(H2N-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-Phe-Leu-Ala-COOH)的化學合成按照與上述相同的方式從C端到N端合成FpAT-C6d小肽(9肽，相當于FpAT小肽C端有6個氨基酸缺失)；FpAT-C9d小肽(H2N-Asp-Ser-Gly-Glu-Gly-Asp-COOH)的化學合成按照與上述相同的方式從C端到N端合成FpAT-C9d小肽(6肽，相當于FpAT小肽C端有9個氨基酸缺失)；FpAT-N6d-C3d小肽(H2N-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-COOH)的化學合成，按照與上述相同的方式從C端到N端合成FpAT-N6d-C3d小肽(6肽，相當于FpAT小肽N端有6個氨基酸缺失、C端有3個氨基酸缺失的)；FpAT-N7d-C3d小肽(H2N-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-COOH)的化學合成，按照與上述相同的方式從C端到N端合成FpAT-N7d-C3d小肽(5肽，相當于FpAT小肽N端有7個氨基酸缺失、C端有3個氨基酸缺失)；FpAT-N7d-C2d小肽(H2N-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-COOH)的化學合成，按照與上述相同的方式從C端到N端合成FpAT-N7d-C2d小肽(6肽，相當于FpAT小肽N端有7個氨基酸缺失、C端有2個氨基酸缺失)；FpAT-N5d-C4d小肽(H2N-Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly-COOH)的化學合成，按照與上述相同的方式從C端到N端合成FpAT-N5d-C4d小肽(6肽，相當于FpAT小肽N端有5個氨基酸缺失、C端有4個氨基酸缺失)。實施例3.FpAT與VEGF的同源性分析利用分析程序(http:〃www.ebi.ac.uk/Tools/SequenceAnalysis-ClustalW)，按照默認參數(shù)對FpAT與VEGF的同源性進行序列比對分析，分析結(jié)果如下-----DSG-------------EG--------DFL----------------8FpATRRGAEESGPPHSPSKRGSASRAGFGRASETMHFLISWVOTSIMXLYLHH200VEGF---------AEGGG------VI----------------------------ISACTSQMPMEGGGQNHHEWKFMDVYQRSYCHPIETLVDIFQEYPDEIE2S0******:可見其中Leu-Ala-Glu-Gly-Gly-Gly這六個氨基酸，至少是Ala-Glu-Gly-Gly-Gly這五個氨基酸是該小肽的重要序列。實施例4.FpAT對昆明鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制為了證實FpAT在小鼠體內(nèi)對鼠源性腫瘤生長的生物學效應，本實施例利用昆明鼠肝癌H22細胞荷瘤小鼠模型和昆明鼠骨肉瘤S180細胞荷瘤小鼠模型腫瘤抑制實驗。從中國醫(yī)學科學院動物中心購買的5周齡昆明鼠40只，在前肢皮下接種鼠肝癌H22細胞(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)(5xl0Vl0(Hil/只)或骨肉瘤S180細胞(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)(5xl0"100nl/只)。接種后次日，每種接種細胞隨機分成2組，每組10只。眼內(nèi)呲靜脈注射FpAT(50|ig/10(HilPBS/次)或小肽溶劑對照(PBS:10(HU/次)，每日給藥，共7次。停藥后次日斷頸處死小鼠，取瘤稱重進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果如圖2A與圖2B所示，F(xiàn)pAT能抑制鼠肝癌H22細胞和骨肉瘤S180細胞在昆明鼠體內(nèi)的生長，延緩腫瘤生長速度統(tǒng)計學分析(采用t雙樣本檢驗)表明，給藥組瘤塊普遍較小，與PBS對照組有顯著差異(PO.05)。實施例5.FpAT對裸鼠體內(nèi)腫瘤生長的抑制為了證實FpAT在裸鼠體內(nèi)對人源性腫瘤生長的生物學效應，本實施例利用人胃癌BGC-823細胞荷瘤裸鼠模型和人結(jié)腸癌HT-29細胞荷瘤裸鼠模型腫瘤抑制實驗。從中國醫(yī)學科學院動物中心購買的5周齡Balb/c裸鼠20只，在前肢皮下接種人胃癌BGC-823細胞(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)(5><106/10(^1/只)或人結(jié)腸癌HT-29細胞(ATCCNumber:HTB-38)(5xl()6/10(^l/只)。接種后次日，每種接種細胞隨機分成2組，每組5只。眼內(nèi)呲靜脈注射FpAT(50pg/10(^lPBS/次或小肽溶劑對照(PBS:10(Hll/次)，隔日給藥，共10次。停藥后繼續(xù)觀察20天，此間每隔2天用游標卡尺量瘤的長短徑，并按公式1/2x長徑x短徑H十算瘤塊的體積。停藥20天后，斷頸處死裸鼠，取瘤稱重進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果如圖3A與圖3B所示，F(xiàn)pAT能抑制人胃癌BGC-823細胞和人結(jié)腸癌HT-29細胞在裸鼠體內(nèi)的生長，延緩腫瘤生長速度統(tǒng)計學分析(釆用t雙樣本檢驗)表明，給藥組瘤塊普遍較小，與小肽溶劑對照組有顯著差異(P<0.05)。實施例6.FpAT對小鼠體內(nèi)腫瘤為血管密度的影響為了證實FpAT在小鼠體內(nèi)腫瘤生長抑制作用是通過抑制血管生成途徑作用，本實施例利用對實施例4和實施例5中的腫瘤瘤塊進行腫瘤內(nèi)微血管密度分析。瘤塊標本經(jīng)甲醛固定后，行3pm連續(xù)切片，將石蠟切片脫蠟至水，3%11202室溫孵育10min,滴加兔抗人第VIfl因子多克隆抗體抗體(DAKO公司)，4。C過液，滴加l:200生物素標記的羊抗兔IgG(北京中山生物工程公司)，37'C孵育30min，DAB(北京中山生物工程公司)顯色5min。以兔IgG代替一抗作為空白對照，以血管瘤為陽性對照。首先在低倍視野下檢査微血管染色情況，以避開壞死和炎癥部位，以新生血管內(nèi)皮染為棕黃色為陽性判定標準，取癌巢間質(zhì)血管最多的視野，在400倍視野下，按雙盲法由3位觀察者分別計數(shù)3個視野，觀察染成棕色的單個細胞和細胞叢，并以此作為一個血管，血管腔和腔內(nèi)的紅細胞不作為計數(shù)，如有肌層的血管或管腔〉50nm者應排除，取3人計數(shù)的平均值作為該例的MVD(微血管密度)結(jié)果，進行統(tǒng)計學分析，見表4。表4FpAT對小鼠體內(nèi)腫瘤為血管密度的影響微血管數(shù)/視野#PBS組FpAT組雨D6.42.6#:共觀察20個視野結(jié)果如圖4所示，F(xiàn)pAT明顯抑制腫瘤組織內(nèi)微血管的生長統(tǒng)計學分析(釆用t雙樣本檢測)標明，給藥組瘤塊內(nèi)微血管密度明顯較少，與PBS對照組有顯著差異(P<0.05)。實施例7.FpAT不能抑制小鼠乳癌細胞D2F2細胞的增殖為研究FpAT在體外對腫瘤細胞的直接作用，本實施例采用MTT檢測了FpAT對D2F2細胞(Balb/c鼠源性乳腺癌細胞)的增殖的影響。D2F2細胞(DepartmentofImmunologyandMicrobiologyandKarmanosCancerInstitute,WayneStateUniversity,Detroit贈送)常規(guī)培養(yǎng)。將培養(yǎng)的D2F2細胞用0.04%胰蛋白酶-EDTA消化，按3><103細胞/孔接種96孔板，培養(yǎng)24小時后，分別單獨加入PBS和FpAT(25pg/ml)，每組設4個平行孔。于96小時后每孔加入質(zhì)量濃度為5mg/ml的2(HdMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，棄原有培養(yǎng)液，每孔加入DMSO200pl，震蕩15min，搖勻后酶標儀檢測各孔OD值(檢測波長570nm)，并以下列公式計算細胞抑制率細胞抑制率=(空白對照組平均OD值-處理組平均OD值)/空白對照組平均OD值x100。/0。結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明FpAT不能抑制D2F2細胞，說明FpAT不能抑制腫瘤細胞增殖活性。實施例8.FpAT特異性抑制血管內(nèi)皮細胞的增殖為進一步研究FpAT對各種血管內(nèi)皮細胞殖的影響，本實施例采用MTT方法進行細胞增殖抑制實驗。豬主動脈內(nèi)皮細胞系(PAEC)(theSchepensEyeResearchInstituteandDepartmentofOphthalmologyandHarvardMedicalSchool,Boston贈送)常規(guī)培養(yǎng)。人臍帶標本(取自北京婦產(chǎn)醫(yī)院)用0.1%膠原酶I(來源于GIBCOBRL公司)消化后，離心(1000rpm，10分鐘)收集人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)，用20y。FCS/RPMI1640懸浮后，移入塑料瓶中培養(yǎng)，置于C02孵箱中培養(yǎng)(37°C，5%C02)。12小時后換液棄去未貼壁細胞，后每三日換液，常規(guī)培養(yǎng)。將培養(yǎng)的HUVEC和PAEC用0.04%胰蛋白酶-EDTA消化，按3><103細胞/孔接種96孔板，培養(yǎng)24小時后，分別單獨加入PBS和FpAT(25jag/ml),每組設4個平行孔。于24、48、72、96小時每孔加入質(zhì)量濃度為5mg/ml的20plMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，棄原有培養(yǎng)液，每孔加入DMSO200p1,震蕩15min，搖勻后酶標儀檢測各孔OD值(檢測波長570nm)，并以下列公式計算細胞抑制率細胞抑制率=(空白對照組平均OD值-處理組平均OD值)/空白對照組平均OD值xl00。/。。結(jié)果如圖6A和圖6B所示，結(jié)果表明FpAT能特異性抑制血管內(nèi)皮細胞(人臍靜脈內(nèi)皮細胞和豬主動脈內(nèi)皮細胞)的增殖作用，抑制率分別為40.1%和29.7%。實施例9.FpAT抑制雞胚絨毛尿囊膜血管的增生本實施例用雞胚絨毛尿囊膜血管的增生實驗檢測FpAT對血管生成的抑制作用。參照文獻"付生法，陸應麟，張朝山等，'待測血管生長因子作用的雞胚絨毛尿囊膜技術，《軍事醫(yī)學科學院院刊》1993，17:294-97"中描述的方法操作。把新鮮的授精后雞蛋在38'C、0.1%新潔爾滅溶液中浸泡2分鐘后，放入37.5°C、60-70%濕度的孵箱中孵化3天。然后去掉雞蛋外殼移入平皿培養(yǎng)。待尿囊膜長至約2ci^時分組加藥，每組5個雞胚。將FpAT(lpg/^L)、PBS(陰性對照)1(HU滴于(D4mm的玻璃纖維濾膜上，并將其置于絨毛尿囊膜的遠心端。培養(yǎng)24小時。觀察結(jié)果并攝影記錄。重復試驗2次。結(jié)果如圖7所示，結(jié)果表明，F(xiàn)pAT能明顯抑制血管形成外，還能引起血管的分布紊亂及原有血管的萎縮。這說明FpAT有抑制血管生成的生物學活性(箭頭所示部位為玻璃纖維濾膜給藥部位，PBS組對血管生長無抑制作用，F(xiàn)pAT能明顯抑制血管形成外，還能引起血管的分布紊亂及原有血管的萎縮)。實施例10.FpAT及其截短小肽對昆明鼠體內(nèi)腫癯生長的抑制為了證實FpAT及其不同截短小肽在小鼠體內(nèi)對鼠源性腫瘤生長的生物學效應，本實施例利用昆明鼠肝癌H22細胞荷瘤小鼠模型腫瘤抑制實驗。從中國醫(yī)學科學院動物中心購買的5周齡昆明鼠90只，在前肢皮下接種鼠肝癌H22細胞(衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所)(5xlO"10(Hil/只)。接種后次日，每種接種細胞隨機分成9組，每組10只。眼內(nèi)呲靜脈注射FpAT(50^/10(^1PBS欣)及其六種截短小肽FpAT-N3d(去處N端3個氨基酸，保留C端12個氨基酸，名稱意義依次類推)(50ng/100nlPBS/次)，F(xiàn)pAT-N6d(50iag/100iilPBS/次)，F(xiàn)pAT-N9d(50|ag/100|alPBS/次)，F(xiàn)pAT-C3d(50(ag/10(^1PBS/次)，F(xiàn)pAT-C6d(50pg/10(VlPBS/次)，F(xiàn)pAT-C9d(50lig/100nlPBS/次)，F(xiàn)pAT-N5d-C4d(50昭/100(ilPBS/次)或小肽溶劑對照(PBS:100pl/次)，以CTX(環(huán)磷酰胺)(80mg/KG)為陽性對照，每日給藥，共7次。停藥后次日斷頸處死小鼠，取瘤稱重進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果如圖8所示，F(xiàn)pAT及其截短小肽能不同程度的抑制鼠肝癌H22細胞在昆明鼠體內(nèi)的生長，延緩腫瘤生長速度統(tǒng)計學分析(釆用t雙樣本檢驗)表明，給藥組瘤塊普遍較小，與小肽溶劑對照組有顯著差異(PO.05)。此外，依抑瘤率大小進行排序，排序后結(jié)果如下表5:表5依抑瘤率大小排序后結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>由上述結(jié)果可見，含有Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly連續(xù)六個氨基酸的小肽與不含這連續(xù)六個氨基酸的小肽抑瘤率有顯著差異(PO.05)，因此，發(fā)明人初步認為Asp-Phe-Leu-Ala-Glu-Gly連續(xù)六個氨基酸為本發(fā)明小肽的重要序列。序列表〈110〉北京市腫瘤防治研究所〈120〉用于血管生成治療的小肽及其應用〈130〉GBI06CN0594<160>10<170>Patentlnversion3.3〈210〉1<211>15〈212>PRT<213〉智人(Homosapiens)〈400〉1AspSerGlyGluGlyAspPheLeuAlaGluGlyGlyGlyValArg151015〈210〉2〈211〉12〈212〉PRT<213>智人〈400〉2GluGlyAspPheLeuAlaGluGlyGlyGlyValArg1510〈210〉3〈211〉9〈212>PRT〈213〉智人<400〉3PheLeuAlaGluGlyGlyGlyValArg15〈210〉4〈211〉6<212〉PRT〈213〉智人<400〉4GluGlyGlyGlyValArg15<210〉5<211〉12<212>PRT<213>智人〈400〉5AspSerGlyGluGlyAspPheLeuAlaGluGlyGly1510〈210〉6〈211〉9〈212〉PRT〈213〉智人<400>6AspSerGlyGluGlyAspPheLeuAla<210〉7<211>6〈212〉PRT〈213>智人<400>7AspSerGlyGluGlyAsp15〈210〉8〈211〉6〈212〉PRT〈213〉智人〈400〉8AspPheLeuAlaGluGly15〈210〉9<211>45〈212〉腿<213〉智人〈220〉<221>misc一feature〈222〉(6,9,15,24'27,33,36,39，42)<223〉n是a、c、g或t<400〉9gayagnggngarggngayttyctngcngarggnggnggngtncgr45〈210〉10〈211〉45<212>DNA〈213〉智人<400>10gataigtggtgaaggtgactttctagctgaaggaggaggcgtgcgt4權利要求1.如下(a)或(b)的小肽或其藥學上可接受的鹽，其中所述小肽為(a)SEQIDNO1所示序列組成的小肽；(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且具有治療血管生成性疾病作用的由(a)衍生的小肽。2.如權利要求1所述的小肽或其藥學上可接受的鹽，其中所述衍生的小肽至少包含連續(xù)氨基酸Ala-Glu-Gly。3.如權利要求2所述的小肽或其藥學上可接受的鹽，其中所述衍生的小肽至少包含連續(xù)氨基酸Ala-Glu-Gly-Gly。4.如權利要求3所述的小肽或其藥學上可接受的鹽，其中所述小肽為SEQIDNO:1所示的序列的C末端至少9個氨基酸的序列。5.如權利要求1所述的小肽或其藥學上可接受的鹽，其中所述衍生的小肽為SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8所示的序列。6.包含權利要求15任一項所述的小肽的肽或其藥學上可接受的鹽在制備治療血管生成性疾病的藥物中的應用。7.如權利要求6所述的應用，其中所述的藥物用于腫瘤治療以及預防腫瘤術后復發(fā)及轉(zhuǎn)移。8.如權利要求7所述的應用，其中所述的腫瘤為實體瘤。9.一種融合蛋白，其含有至少一個權利要求15任一項所述的小肽。10.如權利要求9所述的融合蛋白，該融合蛋白還含有與權利要求15任一項所述的小肽不同的小肽或多肽，該不同的小肽或多肽選自細胞因子、免疫增強促進分子或抗腫瘤物質(zhì)。11.編碼權利要求15任一項所述的小肽的多核苷酸。12.含有權利要求ll所述的多核苷酸的質(zhì)?；虿《据d體。13.含有權利要求11的多核苷酸或權利要求12所述的載體的細胞。14.一種藥物組合物，其含有權利要求15任一項的小肽或其藥學上可接受的鹽或權利要求9或IO所述的融合蛋白或權利要求11所述的多核苷酸；以及藥物可接受的載體或賦形劑。15.如權利要求14所述的藥物組合物，該藥物組合物還含有細胞因子、免疫增強促進分子或抗腫瘤物質(zhì)。全文摘要本發(fā)明涉及可用于治療血管生成性疾病的小肽，還涉及編碼這些小肽的多核苷酸、含有該多核苷酸的載體和細胞，以及利用這些肽、多核苷酸、載體或細胞來治療血管生成性疾病的方法和藥物組合物。文檔編號C07K7/04GK101153054SQ200610113568公開日2008年4月2日申請日期2006年9月30日優(yōu)先權日2006年9月30日發(fā)明者壽成超,蘇亞輝申請人:北京市腫瘤防治研究所