專利名稱:Cyp3a4基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及的是基因技術(shù)領(lǐng)域的核酸及其引物和檢測方法,具體地講是一種分離核酸、一種等位基因特異性的核酸引物和CYP3A4基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法。
背景技術(shù):
CYP3A是人類最主要的CYP亞家族,主要分步在肝臟和小腸上皮,體內(nèi)許多藥物由其介導(dǎo)進(jìn)行I相代謝。它共有4個同工酶CYP3A4、CYP3A5、CYP3A7和CYP3A43,其中CYP3A4是最主要的同工酶。CYP3A4主要分布在肝臟、空腸和大腸,為體內(nèi)最重要的藥物代謝酶。CYP3A4有廣泛的底物,臨床上大約有45%-60%以上的藥物由CYP3A4代謝。另外,CYP3A4還參與了機(jī)體許多重要的代謝過程,與許多疾病特別是腫瘤存在著密切的關(guān)系。此外,CYP3A還可能參與酒精性肝炎肝細(xì)胞的自身免疫損傷。自然人群中CYP3A4酶活性常存在明顯的個體差異,很多藥物是CYP3A4的誘導(dǎo)劑與抑制劑,在藥物聯(lián)合使用時,常使CYP3A4酶活性的個體差異得到放大,以至于影響到藥物的安全性和有效性。CYP3A4的活性受到遺傳因素及環(huán)境因素的影響,但遺傳因素是最主要的原因。多數(shù)CYP3A4的單核苷酸突變可以影響基因的后續(xù)轉(zhuǎn)錄和表達(dá),進(jìn)而改變了酶的結(jié)構(gòu)和活性,這是造成個體差異的主要原因。CYP3A4酶活性的個體差異可能是不同人存在腫瘤易感性差異的主要原因之一,如現(xiàn)有研究證明肝癌、前列腺癌、白血病等的發(fā)生都與CYP3A4活性改變有關(guān),CYP3A4在藥物代謝中的地位以及其酶活性存在明顯種族差異,因此對解決CYP3A4基因多態(tài)性的檢測和相關(guān)問題是現(xiàn)有技術(shù)急需解決的技術(shù)難題。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索發(fā)現(xiàn),Lamba等在《Pharmacogenetics》(藥物基因組學(xué))2002,12121-132上發(fā)表的Common allelic variants of cytochromeP450 3A4 and their prevalence in different populations.(細(xì)胞色素P4503A4基因多態(tài)性及種族差異),該文中提出采用PCR直接測序的方法在CYP3A4基因第一(T44C)、六、七、十一號外顯子及3’UTR區(qū)均有發(fā)現(xiàn)SNP。其不足在于未有本發(fā)明的CYP3A4基因第一號外顯子(G27A)SNP相關(guān)的報道。Lamba等發(fā)現(xiàn)的SNP的改變并未引起CYP3A4酶蛋白活性改變,而且他們的樣品中中國人群只有10個樣品。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足,提供一種CYP3A4基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法,同時涉及一種分離核酸、一種等位基因特異性的核酸引物。本發(fā)明擴(kuò)大了樣本量(60個樣品),并在中國人群不同民族(漢、畬和侗族)之間進(jìn)行比較,找到了CYP3A4基因第一號外顯子新的SNP存在。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的,本發(fā)明第一方面,提供了一種檢測人CYP3A4基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法,它包括步驟(a)確定在人CYP3A4基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第27位的核苷酸;(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
在優(yōu)選例中,所述的單核苷酸多態(tài)性是在第27位存在。
在本發(fā)明的第二方面,提供了一種分離核酸,它具有SEQ ID NO1所示的序列,且第27位為A。
在本發(fā)明的第三方面,提供了一種等位基因特異性的核酸引物,其長度為15-50bp,且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人CYP3A4基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第27位的單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
所說的“分離出的或純化的”是指在基因組DNA水平上,利用引物對來擴(kuò)增每個多態(tài)性位點的基因序列和利用純化試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行提純。
一種分離出的或純化的CYP3A4基因第一號外顯子及其多態(tài)性位點的基因序列。
本發(fā)明采用的樣品包括漢族(20例,男女各10例,平均年齡40.35±11.4歲)、畬族(30例,男13例,女17例,平均年齡48.77±18.05歲)和侗族(10例,男4例,女6例,平均年齡36.7±2.91歲),均為正常人。其中漢族和畬族樣品來自安徽,侗族來自湖南。全體參與者均在正式的知情同意書上同意簽字。
在上述的基礎(chǔ)上,本發(fā)明采用常規(guī)的PCR擴(kuò)增候選基因DNA和DNA測序分析技術(shù)對CYP3A4基因的第一號外顯子以及外顯子與內(nèi)含子接合部位的SNP位點及其頻率分布情況進(jìn)行了檢測。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了CYP3A4基因第一號外顯子第27位G→A多態(tài)性,即其所編碼的蛋白質(zhì)序列中第10位氨基酸Glu(E)→Lys(K)多態(tài)。
具體方法如下對所取樣品進(jìn)行CYP3A4基因測序,根據(jù)對所取樣品CYP3A4基因測序結(jié)果,在畬族中發(fā)現(xiàn)了4個樣品含有CYP3A4基因第一號外顯子SNP(即第27位G→A多態(tài)性),頻率為0.04。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),該SNP導(dǎo)致第10位氨基酸由Glu(E)→Lys(K)。由于這是不同性質(zhì)氨基酸的置換,因此,會導(dǎo)致CYP3A4基因第一號外顯子所編碼的蛋白活性發(fā)生改變。
CYP3A4基因第一號外顯子的cDNA序列列于SEQ ID NO1,其中開放閱讀框為第1-1512位,其所編碼的氨基酸序列列于SEQ ID NO2。CYP3A4基因第一號外顯子的基因組序列可以從GenBank中獲得。
本發(fā)明有大量的分析技術(shù)可用于檢測CYP3A4基因第一號外顯子中所述位點是否存在單核苷酸多態(tài)性。這些技術(shù)包括(但并不限于)DNA測序、雜交測序;酶促錯配切割、異源雙鏈分析、點雜交、寡核苷酸陣列(DNA芯片)、Mini-sequencing、Taqman技術(shù)、分子信標(biāo)等,變性高效液相色譜法(DHPLC)。另一方面,本發(fā)明的檢測方法被用于評估個體患CYP3A4基因第一號外顯子相關(guān)疾病的易感性。用于本發(fā)明的測試樣品沒有特別限制,對于檢測SNP而言,可以是從血液、組織等樣品中抽提出的DNA或mRNA。對于CYP3A4基因第一號外顯子活性而言,可以任何含有CYP3A4基因第一號外顯子的樣品,如血液等。
本發(fā)明為研究我國人群中CYP3A4基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關(guān)系奠定了基礎(chǔ),為臨床用藥個體化提供理論基礎(chǔ),同時也為基于藥物基因組學(xué)理念的新藥研發(fā)提供指導(dǎo)依據(jù)。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例,進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解,這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法,通常照常規(guī)條件,例如Sambrook等人,分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1一種核酸的分離和測序引物設(shè)計采用Primer 5.0軟件,以GenBank數(shù)據(jù)庫CYP3A4基因(AF280107)第一號外顯子以及外顯子與內(nèi)含子接合部位序列為模板設(shè)計一對引物,由Invitrogen公司合成。
引物信息擴(kuò)增CYP3A4基因第一號外顯子SNP位點的DNA序列引物信息正向引物5’ACAATCCAACAGCCTCAC 3’反向引物5’CCAAAGTGCTGGGATTACA 3’PCR擴(kuò)增條件(體系各項試劑除DNA外均由Bio-Asia公司提供)反應(yīng)體系總體積為15ul,其中ddH2O 15.4ul 滅菌雙蒸水10X Buffer 1.5ul 聚合反應(yīng)緩沖液包含KCl Tris-HCl溶液25mM MgCl2 0.5ul 25mM MgCl2溶液2mM dNTP 1ul 2mM dNTP溶液10pM正反向引物各0.4ul5U Taq 0.2ul DNA合成多聚酶10ng DNA 1.0ul 10ng人體DNA擴(kuò)增摸板PCR反應(yīng)條件94℃ 3min,35X(94℃ 30seconds,55℃ 30seconds,72℃ 60seconds),72℃ 10mins。
測序反應(yīng)均作正反向,條件如下擴(kuò)增產(chǎn)物酶純化法PCR產(chǎn)物7ul加入1.5ul純化酶系內(nèi)含SAP(Shrimpalkaline phosphatase,堿性磷酸酶)0.15u和Exo-nuclease I(核酸外切酶I)0.75u/ul,37℃ 60mins,80℃ 10mins,4℃保存?zhèn)溆谩?br>
測序采用ABI Prism BigDye terminator(BDT)cycle sequencing reactionkit(PE Applied Biosystems),測序總體積為5ul,其中純化后的PCR產(chǎn)物3.5ul,BDT 1.0ul,正向或反向引物1.0ul。反應(yīng)條件是96℃ 2mins,40X(96℃ 30seconds,50℃ 30seconds,60℃ 1min),4℃保存?zhèn)溆谩?br>
上樣前純化5ul測序產(chǎn)物中加入50ul無水乙醇和3.0mol/L醋酸鈉混合液(V∶V=25∶1),室溫、避光、靜置15min,4000rpm/min 35mins,400rpm/min5seconds棄上清;4X(75%Alcohol 25ul,4000rpm/min 5mins,400rpm/min5seconds棄上清);室溫、避光、靜置、風(fēng)干20mins;上樣10ul于3100測序儀進(jìn)行測序。
實施例2SNP的獲得對CYP3A4基因進(jìn)行直接測序。將測定的各樣本序列與GenBank數(shù)據(jù)庫CYP3A4基因序列(AF280107)進(jìn)行比較,從而得出序列的差異。在畬族中發(fā)現(xiàn)了4個樣品含有CYP3A4基因第一號外顯子SNP(即第27位G→A多態(tài)性),而其它樣品的基因型均為GG,只有這4個樣品的基因型為GA,基因頻率為0.04。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),該SNP導(dǎo)致第10位氨基酸由Glu(E)→Lys(K)。由于這是不同性質(zhì)氨基酸的置換,因此,會導(dǎo)致CYP3A4基因第一號外顯子所編碼的蛋白活性發(fā)生改變。
CYP3A4基因CDS及其多態(tài)性位點的CDS序列如SEQ NO.1所示<110>上海交通大學(xué)<120>CYP3A4基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法<160>3<210>1<211>1512<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<221>misc_feature<222>(27)<223>n=g或a<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1512)<400>1atggctctca tcccagactt ggccatagaa acctggcttc tcctggctgt cagcctggtg 60ctcctctatc tatatggaac ccattcacat ggacttttta agaagcttgg aattccaggg 120cccacacctc tgcctttttt gggaaatatt ttgtcctacc ataagggctt ttgtatgttt 180gacatggaat gtcataaaaa gtatggaaaa gtgtggggct tttatgatgg tcaacagcct 240gtgctggcta tcacagatcc tgacatgatc aaaacagtgc tagtgaaaga atgttattct 300gtcttcacaa accggaggcc ttttggtcca gtgggattta tgaaaagtgc catctctata 360gctgaggatg aagaatggaa gagattacga tcattgctgt ctccaacctt caccagtgga 420aaactcaagg agatggtccc tatcattgcc cagtatggag atgtgttggt gagaaatctg 480aggcgggaag cagagacagg caagcctgtc accttgaaag acgtctttgg ggcctacagc 540atggatgtga tcactagcac atcatttgga gtgaacatcg actctctcaa caatccacaa 600gacccctttg tggaaaacac caagaagctt ttaagatttg attttttgga tccattcttt 660ctctcaataa cagtctttcc attcctcatc ccaattcttg aagtattaaa tatctgtgtg 720tttccaagag aagttacaaa ttttttaaga aaatctgtaa aaaggatgaa agaaagtcgc 780ctcgaagata cacaaaagca ccgagtggat ttccttcagc tgatgattga ctctcagaat 840tcaaaagaaa ctgagtccca caaagctctg tccgatctgg agctcgtggc ccaatcaatt 900atctttattt ttgctggcta tgaaaccacg agcagtgttc tctccttcat tatgtatgaa 960ctggccactc accctgatgt ccagcagaaa ctgcaggagg aaattgatgc agttttaccc 1020aataaggcac cacccaccta tgatactgtg ctacagatgg agtatcttga catggtggtg 1080aatgaaacgc tcagattatt cccaattgct atgagacttg agagggtctg caaaaaagat 1140gttgagatca atgggatgtt cattcccaaa ggggtggtgg tgatgattcc aagctatgct 1200cttcaccgtg acccaaagta ctggacagag cctgagaagt tcctccctga aagattcagc 1260aagaagaaca aggacaacat agatccttac atatacacac cctttggaag tggacccaga 1320aactgcattg gcatgaggtt tgctctcatg aacatgaaac ttgctctaat cagagtcctt 1380cagaacttct ccttcaaacc ttgtaaagaa acacagatcc ccctgaaatt aagcttagga 1440ggacttcttc aaccagaaaa acccgttgtt ctaaaggttg agtcaaggga tggcaccgta 1500agtggagcct ga 1512
CYP3A4基因CDS及其多態(tài)性位點的氨基酸序列如SEQ NO.2所示SEQ ID NO.2氨基酸序列描述如下<210>2<211>503<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>2malipdlamk twlllavslv llylygthsh glfkklgipg ptplpflgni lsyhkgfcmf 60dmechkkygk vwgfydgqqp vlaitdpdmi ktvlvkecys vftnrrpfgp vgfmksaisi 120aedeewkrlr sllsptftsg klkemvpiia qygdvlvrnl rreaetgkpv tlkdvfgays 180mdvitstsfg vnidslnnpq dpfventkkl lrfdfldpff lsitvfpfli pilevlnicv 240fprevtnflr ksvkrmkesr ledtqkhrvd flqlmidsqn sketeshkal sdlelvaqsi 300ififagyett ssvlsfimye lathpdvqqk lqeeidavlp nkapptydtv lqmeyldmvv 360netlrlfpia mrlervckkd veingmfipk gvvvmipsya lhrdpkywte pekflperfs 420kknkdnidpy iytpfgsgpr ncigmrfalm nmklalirvl qnfsfkpcke tqiplklslg 480gllqpekpvv lkvesrdgtv sga*503本發(fā)明的實質(zhì)性特點和顯著進(jìn)步表現(xiàn)在是一項原創(chuàng)性的發(fā)明。本發(fā)明的內(nèi)容涉及一種分離出的或純化的CYP3A4基因第一號外顯子多態(tài)性位點的基因序列,所說的“分離出的或純化的”是指在基因組DNA水平上,利用引物對來擴(kuò)增多態(tài)性位點的基因序列和利用純化試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行提純。通過對所取樣品CYP3A4基因測序結(jié)果,在畬族中發(fā)現(xiàn)了4個樣品含有CYP3A4基因第一號外顯子SNP(即第27位G→A多態(tài)性),頻率為0.04。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),該SNP導(dǎo)致第10位氨基酸由Glu(E)→Lys(K)。由于這是不同性質(zhì)氨基酸的置換,因此,會導(dǎo)致CYP3A4基因第一號外顯子所編碼的蛋白活性發(fā)生改變,從而引起酶活性發(fā)生改變,進(jìn)一步影響CYP3A4酶代謝的藥物。本發(fā)明為研究我國人群中CYP3A4基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關(guān)系奠定了基礎(chǔ),為藥物設(shè)計和臨床用藥個體化提供了基因?qū)W理論根據(jù),同時也為基于藥物基因組學(xué)理念的新藥研發(fā)提供指導(dǎo)依據(jù),具有重大的理論意義和潛在的實用價值。
權(quán)利要求
1.一種檢測人CYP3A4基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的方法,其特征在于,它包括步驟(a)確定在人CYP3A4基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第27位的核苷酸;(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。
2.如權(quán)力要求書所述的方法,其特征在于,所述的單核苷酸多態(tài)性是在第27位存在A。
3.一種分離核酸,其特征在于,它具有SEQ ID NO1所示的序列,且第27位為A。
4.一種等位基因特異性的核酸引物,其特征在于,其長度為15-50bp,且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人CYP3A4基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第27位的單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明涉及的是基因技術(shù)領(lǐng)域的一種CYP3A4基因第一號外顯子的單核苷酸多態(tài)性的檢測方法,同時涉及一種分離核酸、一種等位基因特異性的核酸引物。它包括步驟(a)確定在人CYP3A4基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第27位的核苷酸;(b)檢測在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性;一種分離核酸,具有SEQ ID NO1所示的序列,且第27位為A;一種等位基因特異性的核酸引物,其長度為15-50bp,且特異性地雜交并擴(kuò)增出含人CYP3A4基因第一號外顯子的SEQ ID NO1所示序列的第27位的單核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明為研究我國人群中CYP3A4基因多態(tài)性與臨床用藥安全的關(guān)系奠定了基礎(chǔ),為臨床用藥個體化提供理論基礎(chǔ),同時也為基于藥物基因組學(xué)理念的新藥研發(fā)提供指導(dǎo)依據(jù)。
文檔編號C07H21/00GK1966720SQ200610116310
公開日2007年5月23日 申請日期2006年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月21日
發(fā)明者賀林, 杜晶, 邢清和, 張愛萍, 馮國鄞 申請人:上海交通大學(xué)