專利名稱：葡萄酒中dna的簡(jiǎn)單快速提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于提取葡萄酒中DNA的技術(shù)，具體就是提取葡萄酒DNA以用于鑒 別葡萄酒真假的DNA分析技術(shù)。
技術(shù)背景眾所周知，葡萄酒是一種世界通暢性的酒種，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和保健 作用。葡萄酒發(fā)酵理論的奠基人，法國大科學(xué)家路易.巴斯德(L. Pasteur)曾說 "葡萄酒是最健康的飲料"。醫(yī)學(xué)研究表明，葡萄酒中含有大約600種對(duì)人體 有益的成份，其中的白藜蘆醇(resveratrol)具有預(yù)防癌癥、降低膽固醇的效果 (Jang et al. 1997)。目前，飲用葡萄酒的人越來越多，名優(yōu)紅(白)葡萄酒尤 其為世人所青睞。在許多發(fā)達(dá)國家，喝葡萄酒已經(jīng)成為一種生活時(shí)尚。長(zhǎng)期以來，市場(chǎng)上各種葡萄酒的質(zhì)量參次不齊，價(jià)格從2美元到200美元 不等，并且還存在用酒精、糖精、葡萄香精、色素等按一定比例勾兌而成的假 葡萄酒。葡萄酒的品質(zhì)主要由經(jīng)驗(yàn)豐富的品酒師的感官辨別，而普通的經(jīng)銷商 和消費(fèi)者很難辨別名優(yōu)葡萄酒與假冒偽劣產(chǎn)品的區(qū)別。近年來，國際上一些著 名的葡萄酒公司及有關(guān)研究機(jī)構(gòu)試圖通過DNA分析技術(shù)鑒定葡萄酒的品種，以 保護(hù)其名貴葡萄酒品種，贏得消費(fèi)者的信賴。例如，澳大利亞Handrr公司將DNA 防偽標(biāo)簽標(biāo)用于他們的陳年葡萄酒上。然而，通過DNA分析鑒定葡萄酒品種的 技術(shù)，在很大程度上取決于從葡萄酒中提取的DNA的質(zhì)和量。由卩列文獻(xiàn)可知，(Jang M， Cai L， Udeani GO et al. (1997) Cancer chemopreventive activity of resveratrol， a natural product from grapes. 6'cie/ ce 275: 218-220)、 (Rogstad SH. (2003) Plant DNA extraction using Silica, /^3/7i /fep. 21: 463a_ 463g)、 (Siret R， Gigaud 0 et al.(2002) Analysis of grape Zi"5' w'"i/、e2;3 L. DNA in must mixtures and experimental mixed wines using microsatellite markers. /. Foc^ de瓜50 (13)， 3822 -3827)、 (Garcia-Be呵tez E， Moreno-Arribas MV et al. (2002) Application of a DNA analysis method for the cultivar identification of grape musts and experimental and commercial wines of K/tis (///^//'era L. using microsatellite markers. Aoc^ C力e瓜 50(21), 6090 -6096)和(Siret R, Boursiquot JM et al. (2000) Toward the authentication of varietal wines by the analysis of grape (Fit/s KJ'ai/era L ) residual DNA in must and wine using microsatellite markers. y^r/c. /^x/C力e瓜48 (10)，5035 -5040)，目前從紅(白)葡萄酒中提取DNA的方法，均 是通過異丙醇沉淀(Siret R et al. 2000， 2002; Garcia-Beneytez et al. 2002)。從新葡萄酒(must)或未經(jīng)過澄清處理的葡萄酒中提取DNA相對(duì)容易，因 為其中可能包含破碎的葡萄組織，從離心收集的沉淀中可以提取相當(dāng)量的DNA。 對(duì)于商業(yè)零售的瓶裝葡萄酒，由于經(jīng)過發(fā)酵、澄清等多種工序，來源于葡萄組織的DNA被破壞殆盡，瓶裝葡萄酒中殘留的痕量咖A片段必然很小。因此，從 零售的瓶裝葡萄酒中提取DNA需要大體積(500-1000 ml)的葡萄酒，常規(guī)的異丙 醇沉淀法不僅操作不便，且DNA產(chǎn)率低，重復(fù)性差。因此，建立一種簡(jiǎn)便快速 的從葡萄酒中提取DNA的技術(shù)勢(shì)在必行，以滿足日益增長(zhǎng)的利用DNA分析技術(shù) 鑒定葡萄酒品質(zhì)的需要。從葡萄酒中提取DNA的主要難點(diǎn)包括(1)葡萄酒中DNA含量甚微；(2)葡 萄酒中存在大量的多酚類(單寧)、多糖、有機(jī)酸等，它們嚴(yán)重干擾DNA提取及 下游利用DNA的分子實(shí)驗(yàn)(如PCR); (3)常規(guī)的異丙醇沉淀法用于大體的葡萄灑 操作不便；(4) DNA提取之前通過透析除去多酚等污染物，或利用冷凍干燥及離 心技術(shù)濃縮葡萄酒等費(fèi)時(shí)，且需要額外的儀器設(shè)備；(5)葡萄酒呈弱酸性，其 pH —般在3. 4-4. 2之間，這也限制了常規(guī)DNA提取方法的應(yīng)用。 發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是建立一種簡(jiǎn)便、快速、可靠的從 葡萄酒中提取DNA的方法，并將提純DNA用于基于PCR技術(shù)的葡萄酒品種鑒定， 以便為商業(yè)上名貴葡萄酒的防偽提供DNA分子標(biāo)簽。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，葡萄酒中DNA的簡(jiǎn)單快速提取方法，包括以下步驟 A用純水將5 g的Silica清洗千凈，加入5 ml水懸浮Silica沉淀，混勻，置 4"C備用；B建立最佳吸附條件的葡萄酒在磁力攪拌器上緩慢加入下列制劑調(diào)節(jié)葡萄酒1) 加入IO N的NaOH溶液調(diào)節(jié)葡萄酒的pH為8. 0左右；2) 加入CTAB至1% (w/v);3) 加入NaCl至1.0 M ;4) 加入巰基乙醇至0.2% (v/v); C葡萄酒DNA的吸附及回收(1) 向上述葡萄酒混合液中加入Si 1 ica懸浮液；(2) 4。C下保育l-2小時(shí)，不斷搖晃、振蕩；(3) 離心，5000 g， 5 m丄n， 4。C;(4) 棄上清液，用含O. 1 M Tris-HC1， pH 8.0， 1% CTAB, 1 M NaCl的沖洗 液短暫沖洗Silica沉淀1-2次；(5) 離心，5000 g， 5 min,收集Silica沉淀;(6) 向上述Silica沉淀加入等量的純水，搖勻，于65°C保溫5-10 rnin 熱洗脫DNA;(7) 離心(10000 g， 5 min)收集含有DNA的上清液；(8) 等體積氯仿抽提步驟(7)的上清液，離心10000g， 3 min，收集含有
DNA匕相；(9)用異丙醇沉淀法回收、濃縮上清液中DNA;回收的葡萄酒DNA溶于50ul TE (10 mM Tris-HCl， pH 8.0)緩沖液。所述用純水將5g的Silica清洗干凈，是指5 g干燥的Silica與5 ml純 水充分混合，室溫沉降5-10小時(shí)，吸去上清液，再加入5 ml純水充分混合，室 溫沉降5-10小時(shí)，吸去上清液。所述向上述葡萄酒混合液中加入Silica懸浮液；是指按5ml Silica/1000 ml的量加入Silica懸浮液。所述等體積氯仿抽提步驟(7)的上清液,是指重復(fù)氯仿抽提步驟。所述氯仿抽提步驟(7)的上清液，是指增加苯酚抽提。本發(fā)明可以將以下方法同時(shí)使用；所述用純水將5 g的Silica清洗干凈，是指5 g干燥的Silica與5 ml純 水充分混合，室溫沉降5-10小時(shí)，吸去上清液，再加入5 ml純水充分混合，室 溫沉降5-10小時(shí)，吸去上清液；所述所述向上述葡萄酒混合液中加入Silica懸浮液；是指按5 ml Si]ica/1000 ml的量加入Silica懸浮液；所述等體積氯仿抽提步驟(7)的上清液，是指重復(fù)氯仿抽提步驟；所述氯仿抽提步驟(7)的上清液，是指增加苯酚抽提。本發(fā)明的原理是利用Silica (硅石，silicon dioxide)可以選擇性地可逆 吸附DNA片段的特性。非特異性吸附到Silica顆粒上的蛋白質(zhì)、多糖、多酚等 干擾化合物可通過沖洗除去，而Silica吸附的DNA需要在加熱時(shí)才可以解吸 附。在本發(fā)明確定的立最佳條件下，Silica可以高效地與紅(白)葡萄酒中痕量 的DNA結(jié)合，然后通過離心收集結(jié)合DNA的Silica顆粒，從而避免了異丙醇沉 淀法操作大量液體的不便以及重復(fù)性差、DNA產(chǎn)率低的弊端。盡管有一些利用 Si 1 ica從植物葉片中提取DNA的例子(如Rogstad 2003),但葡萄酒中痕量的DNA 與植物葉片中DNA不同，國內(nèi)外目前尚無利用Silica從葡萄酒中提取DNA的報(bào) 道。本發(fā)明建立的方法簡(jiǎn)便、快速、容易操作，且不需要任何試劑盒；獲得的 DNA純度高(A260/280為1.8-2.0),且產(chǎn)率高，重復(fù)性高。所采用的Silica, 價(jià)格低廉，無毒副作用。該發(fā)明面向國內(nèi)外葡萄酒廠及從事葡萄、葡萄酒研究 的高等院校和研究所，適用于依靠DNA分析的葡萄酒品質(zhì)鑒定及名貴葡萄酒的 DNA分子標(biāo)簽技術(shù)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值及經(jīng)濟(jì)效益。
具體實(shí)施方式
lSilica的預(yù)處理 Silica購買自Sigma-Aldrich公司(產(chǎn)品代號(hào)S5631; 2006 年12 >j 2日查詢的價(jià)格為509 RMB/100g) 。 5 g千燥的Silica與5 ml純水充 分混合，室溫沉降5-10小時(shí)，吸去上清液。重復(fù)上述洗滌過程1次，最后加入5 mi 水懸浮Silica沉淀，混勻，置4°C備用。 2最佳吸附條件的建立(1) 葡萄酒pH的調(diào)節(jié)利用10 N的NaOH溶液調(diào)節(jié)葡萄酒的pH為8. 0左 厶，此時(shí)其顏色剛開始變藍(lán)。顏色變化歸因于來源于葡萄果皮的花色素苷 (anthocynin);(2) 加入CTAB至10/0 (w/v) (10 g飾0 ml終體積);(3) NaCl至1. 0 M (58. 44 g細(xì)0 ml終體積);(4) 加入巰基乙醇至O. 2% (v/v) (2 ml/1000 ml終體積)。以上操作應(yīng)在磁力攪拌器上緩慢進(jìn)行。 3葡萄酒DNA的吸附及回收(1) 向上述葡萄酒混合液中加入Silica懸浮液(5 ml Silica/1000 ml ):(2) 4。C下保育1-2小時(shí)，不斷搖晃、振蕩；(3) 離心，5000 g， 5 min， 4°C (最好用離心管500 ml在制備型離心機(jī)上進(jìn)行)；(4) 棄上清液，用沖洗液(含0. 1 M Tris-HC1, pH 8. 0， 1% CTAB， 1 M NaC].) 短暫沖洗Silica沉淀1-2次，以去除非DNA類物質(zhì)(該步驟可用30-50 ml的離心管)；(5) 離心，5000 g， 5 min，收集Silica沉淀；(6) 向上述Silica沉淀加入等量的純水，搖勻，于65°C保溫5-10 min 熱洗脫DNA;(7) 離心(IOOOO g， 5 min)收集含有DNA的上清液；(8) 等體積氯仿抽提步驟(7)的上清液,進(jìn)一步去除污染物；離心10000g: 3min，收集上相(含有DNA)(必要時(shí)可重復(fù)氯仿抽提步驟，并增加苯 酚抽提)；(9) 上清液中DNA采用常規(guī)的異丙醇沉淀法回收、濃縮；(10) 回收的葡萄酒DNA溶于50ul TE (lOmMTris-HC1， pH 8. 0)緩沖液， 并進(jìn)行定量、定性檢測(cè)。4 DNA檢測(cè)提純的葡萄酒DNA可利用紫外分光光度法檢測(cè)定量，或者通過瓊脂糖凝膠 電泳、溴化乙錠染色定性分析(靈敏性的染色可采用SYBR Green 1， Gel Red and Ge丄Green等)。分子檢測(cè)主要利用
權(quán)利要求
1.葡萄酒中DNA的簡(jiǎn)單快速提取方法，包括以下步驟A用純水將5g的Silica清洗干凈，加入5ml水懸浮Silica沉淀，混勻，置4℃?zhèn)溆?；B建立最佳吸附條件的葡萄酒在磁力攪拌器上緩慢加入下列制劑調(diào)節(jié)葡萄酒1)加入10N的NaOH溶液調(diào)節(jié)葡萄酒的pH為8.0左右；2)加入CTAB至1％(w/v)；3)加入NaCl至1.0M；4)加入巰基乙醇至0.2％(v/v)；C葡萄酒DNA的吸附及回收(1)向上述葡萄酒混合液中加入Silica懸浮液；(2)4℃下保育1-2小時(shí)，不斷搖晃、振蕩；(3)離心，5000g，5min，4℃；(4)棄上清液，用含0.1M Tris-HCl，pH 8.0，1％CTAB，1M NaCl的沖洗液短暫沖洗Silica沉淀1-2次；(5)離心，5000g，5min，收集Silica沉淀；(6)向上述Silica沉淀加入等量的純水，搖勻，于65℃保溫5-10min熱洗脫DNA；(7)離心(10000g，5min)收集含有DNA的上清液；(8)等體積氯仿抽提步驟(7)的上清液，離心10000g，3min，收集含有DNA上相；(9)用異丙醇沉淀法回收、濃縮上清液中DNA；(10)回收的葡萄酒DNA溶于50μl TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0)緩沖液。
2、 如權(quán)利要求1所述的葡萄酒中DNA的簡(jiǎn)單快速提取方法，其特征在于 所述用純水將5 g的Silica清洗干凈，是指5 g干燥的Silica與5 ml純水 充分混合，室溫沉降5-10小時(shí)，吸去上清液，再加入5 ml純水充分混合，室溫沉降5-10小時(shí)，吸去上清液。
3、 如權(quán)利要求1所述的葡萄酒中DNA的簡(jiǎn)單快速提取方法，其特征在于 所述向匕述葡萄酒混合液中加入Silica懸浮液；是指按5ml Silica/1000 ml的 量加入Silica懸浮液。
4、 如權(quán)利要求1所述的葡萄酒中DNA的簡(jiǎn)單快速提取方法，其特征在于 所述等體積氯仿抽提步驟(7)的上清液,是指重復(fù)氯仿抽提步驟。
5、 如權(quán)利要求1所述的葡萄酒中DNA的簡(jiǎn)單快速提取方法，其特征在于 所述氯仿抽提步驟(7)的上清液，是指增加苯酚抽提。
6、如權(quán)利要求1所述的葡萄酒中DNA的簡(jiǎn)單快速提取方法，其特征在于 本發(fā)明可以將以下方法同時(shí)使用a所述用純水將5 g的Silica清洗干凈，是指5 g千燥的Silica與5 ml 純水充分混合，室溫沉降5-10小時(shí)，吸去上清液，再加入5 ml純水充分混合， 室溫沉降5-10小時(shí)，吸去上清液；b所述所述向上述葡萄酒混合液中加入Silica懸浮液；是指按5 m丄 Si]ica細(xì)0 ml的量加入Silica懸浮液；c所述等體積氯仿抽提歩驟(7)的上清液，是指重復(fù)氯仿抽提步驟；d所述氯仿抽提步驟(7)的上清液，是指增加苯酚抽提。
全文摘要
葡萄酒中DNA的簡(jiǎn)單快速提取方法，包括以下步驟A用純水將5g的Silica清洗干凈，加入5ml水懸浮Silica沉淀，混勻，置4℃?zhèn)溆?；B建立最佳吸附條件的葡萄酒；C葡萄酒DNA的吸附及回收(1)向上述葡萄酒混合液中加入Silica懸浮液；(2)4℃下保育1-2小時(shí)，不斷搖晃、振蕩；(3)離心，5000g，5min，4℃；(4)棄上清液，用含0.1M Tris-HCl，pH 8.0，1％CTAB，1M NaCl的沖洗液短暫沖洗Silica沉淀1-2次；(5)離心，5000g，5min，收集Silica沉淀；(6)向上述Silica沉淀加入等量的純水，搖勻，于65℃保溫5-10min熱洗脫DNA；(7)離心(10000g，5min)收集含有DNA的上清液；(8)等體積氯仿抽提步驟(7)的上清液，離心10000g，3min，收集含有DNA上相；(9)用異內(nèi)醇沉淀法回收、濃縮上清液中DNA；(10)回收的葡萄酒DNA溶于50μl TE(10mM Tris-HCl，pH 8.0)緩沖液。
文檔編號(hào)C07H1/00GK101210032SQ20061012846
公開日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2006年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日
發(fā)明者葉永忠, 李春奇, 偉 王 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)