專利名稱：雙(3,5-二溴水楊基)延胡索酸脂修飾人臍帶血血紅蛋白α鏈的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及修飾人臍帶血血紅蛋白的方法，尤其是一種雙(3,5 — 二溴水楊基)延胡索酸脂修飾人臍帶血血紅蛋白a鏈的工藝。
(二)
背景技術(shù)：
在外科手術(shù)中，輸入全血仍然是非常重要的醫(yī)療手段。全血輸入 存在著很大的局限性來源有限，儲(chǔ)存困難，應(yīng)用時(shí)須交叉配型，同 時(shí)可能引起血液類疾病的傳播。因此，研制安全有效的血液替代品引 起了科研工作者的廣泛興趣。基于血紅蛋白(Hb)類的載氧體，被認(rèn) 為是潛在的理想血液替代品。目前，基于Hb類的血液替代品，得到了
廣泛的研究，已有多種產(chǎn)品進(jìn)入臨床階段，例如Oxyglobin(Bi叩ure)和 PolyHeme (Northfield)。但是，原料Hb來源主要為人血和動(dòng)物血。隨 著全血輸入需求量的增加，人血是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。采用動(dòng)物血研制血液 替代品也同樣存在一定的局限性。楊成民等首先采用人臍帶血為原料 提取Hb，為血液替代品研究奠定了基礎(chǔ)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo):在中國每年的新 生兒超過2000萬，以每個(gè)胎盤可以采血量150ml計(jì)算，來源十分可觀， 同時(shí)又避免了采用動(dòng)物血所造成的潛在問題。
無基質(zhì)血紅蛋白(SFHb)雖然具有很好的攜氧能力，卻并不能直接 應(yīng)用于臨床，這主要是因?yàn)镾FHb四聚體在紅細(xì)胞外不穩(wěn)定，易解聚 為二聚體，經(jīng)腎臟排出體外，形成血尿；SFHb具有高的親氧性(低 P50),很難向組織有效地釋氧。因此以血紅蛋白為基礎(chǔ)的血液代用品 的研究工作都主要集中于降低氧親和力、穩(wěn)定四聚體結(jié)構(gòu)和延長其循 環(huán)半衰期。
目前，血液來源主要來源為成人血和動(dòng)物血(主要為牛和豬)。這 類血紅蛋白在結(jié)構(gòu)上由四個(gè)亞基(aloc2(3ip2)組成。而人臍帶血血紅 蛋白在結(jié)構(gòu)上與其存在很大差異，它是由80%四亞基(cda2ylY2)和 20%四亞基(ala2plp2)組成。結(jié)構(gòu)上的差異主要在Y鏈上區(qū)別于|3 鏈的結(jié)構(gòu)部分。而這些結(jié)構(gòu)上的差異就決定了物質(zhì)性質(zhì)上的差別。1988 年，Biopure公司的戊二醛聚合牛血紅蛋白產(chǎn)品HemopureTM(HBOC-201) 經(jīng)FDA的批準(zhǔn)開始進(jìn)行III期臨床試驗(yàn)。牛血血紅蛋白不存在2,3-DPG，
其親氧性主要受溶液中cr離子濃度的調(diào)控，無需進(jìn)行化學(xué)修飾。而其
他血紅蛋白受2，3-DPG調(diào)控，由于2,3-DPG極易流失，親氧性明顯增 加，不能向組織有效供氧。因此，需要進(jìn)行化學(xué)修飾提高P5o，增強(qiáng)向 組織釋氧的能力。目前，廣泛應(yīng)用的修飾劑為吡哆醛一5—磷酸(PLP)、兩 個(gè)吡哆醛的雙醛基衍生物NFPLP(2-nor-2-formylpyridoxal 5'-phosphate) NFPLP。 PLP、 NFPLP均可修飾Hb的(3鏈提高P50。 Northfield公司(US Patent No.6，552，173) —直從事戊二醛聚合磷酸吡眵醛化人血紅蛋白方 面的研究。目前，他們的主要產(chǎn)品Polyheme，該產(chǎn)品正在進(jìn)行III期臨 床試驗(yàn)。磷酸吡哆醛PLP由于是單醛基結(jié)構(gòu)，并不能使血紅蛋白形成 穩(wěn)定的四聚體結(jié)構(gòu)，Greebburg等發(fā)現(xiàn)，在循環(huán)過程中PLP-Hb并不穩(wěn) 定，容易離解為二聚體被代謝掉，從而影響到輸氧功能。人臍帶血血紅 蛋白Y鏈與HbA的(3鏈在結(jié)構(gòu)上存在一定差別，修飾PHb的Y鏈?zhǔn)欠?達(dá)到修飾HbA的(3鏈的效果，需要進(jìn)行試驗(yàn)研究。
DBBF具有雙醛基功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)，在血紅蛋白不同氧合狀態(tài)下可以 發(fā)生兩個(gè)不同反應(yīng)。在脫氧條件下，DBBF能夠特異地分子內(nèi)交聯(lián)otl99 位Lys和a299位Lys，產(chǎn)物P50得到提高，親氧性明顯降低；在氧 合條件下，可以特異地分子內(nèi)交聯(lián)(3182位Lys和(3282位Lys，產(chǎn)物 的親氧性反而降低。Baxter公司對(duì)這類交聯(lián)劑進(jìn)行了廣泛的研究，并 將其產(chǎn)品稱為HemAssit ,又稱為雙阿司匹林交聯(lián)血紅蛋白(DCLHb) (United States Patent 4,600,531)。 1985年美國軍方與公司合作開始 DCLHb的研究，由于Hb經(jīng)過分子內(nèi)交聯(lián)，穩(wěn)定性大大增加，使交聯(lián) 后產(chǎn)品可以直接用加熱方式滅毒。雖然DCLHb成為第一例被FDA批 準(zhǔn)進(jìn)行期臨床試驗(yàn)的紅細(xì)胞代用品，但是在動(dòng)物試驗(yàn)和對(duì)失血性休克 病人復(fù)蘇的試驗(yàn)中，均表現(xiàn)出明顯的臨床副作用，主要是四聚體Hb對(duì) NO的吞噬作用造成了血管的強(qiáng)烈收縮和血壓的升高以及明顯的胃腸 反應(yīng)。1998年Baxter宣布終止有關(guān)的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種雙(3,5 — 二溴水楊基)延胡索酸脂 修飾人臍帶血血紅蛋白a鏈的工藝，它是一種能夠降低人臍帶血血紅 蛋白親氧性，使血紅蛋白溶液具有合適P;o的修飾方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案為--種雙(3，5 — 二溴水楊基)延胡索酸脂修 飾人臍帶血血紅蛋白a鏈的工藝，其特征在于它包括以下步驟
(1) 取一定體積具有適當(dāng)濃度的純化血紅蛋白，加入一定濃度的
有機(jī)磷酸鹽，加入一定濃度具有緩沖能力的物質(zhì)，調(diào)節(jié)其PH為4.5-8.0;
(2) 在低溫下0。C一2(TC，對(duì)血紅蛋白溶液反復(fù)通氮?dú)?、抽真?br> 的方法，進(jìn)行較徹底脫氧；
(3) 按一定物質(zhì)的量比加入DBBF， DBBF: Hb為1 4: 1,在通 氮條件下，反應(yīng)溫度為10。C 45。C， PH值為4.5 8.0，反應(yīng)時(shí)間1~4小 時(shí)，血紅蛋白溶液濃度為1 100mg/ml;
(4) 用氨基酸中止反應(yīng)，氨基酸與DBBF的摩爾比為2 10:1，同 樣條件下，反應(yīng)時(shí)間1~3小時(shí)。
h述所說的步驟(1)中加入的有機(jī)磷酸鹽為2、 3—DPG類似物， 可以預(yù)先用NaOH調(diào)節(jié)好，pH值為4.5 8.0的植酸，在血紅蛋白溶液 中的濃度范圍為1 10mM/L。
上述所說的步驟(1)中選用的血紅蛋白為人臍帶血血紅蛋白。 上述所說的步驟(1)中加入一定濃度具有緩沖能力的物質(zhì)為Bis Tris或Tris HCl。
上述所說的步驟(2)中脫氧方法為每間隔10 20min，通N2，抽
真空，通小流量N2維持體系脫氧態(tài)。
上述所說的步驟(4)中氨基酸可以是甘氨酸或賴氨酸。 本發(fā)明的優(yōu)越性在于(1) DBBF替代PLP對(duì)人臍帶血血紅蛋白 進(jìn)行修飾，提高四聚體的穩(wěn)定性;(2 )DBBF能夠特異地分子內(nèi)交聯(lián)a,99 位Lys和01299位Lys，親氧性明顯降低，根據(jù)這一點(diǎn)首次從修飾劑的 角度考察DBBF與人臍帶血血紅蛋白的反應(yīng)，結(jié)合人臍帶血血紅蛋白 的自身特點(diǎn)優(yōu)化反應(yīng)條件，為最終血液替代品具有合適的親氧性奠定 -，石出。
(四)


圖1為本發(fā)明所涉一種雙(3,5 — 二溴水楊基)延胡索酸脂修飾人 臍帶血血紅蛋白a鏈的工藝中純化PHb HPLC圖譜；
圖2為本發(fā)明所涉一種雙(3， 5 — 二溴水楊基)延胡索酸脂修飾人 臍帶血血紅蛋白a鏈的工藝中圖2 DBBF-a PHb HPLC圖譜；
圖3為本發(fā)明所涉一種雙(3，5 — 二溴水楊基)延胡索酸脂修飾人 臍帶血血紅蛋白a鏈的工藝中DBBF-a PHb氧合曲線。
(五)
具體實(shí)施例方式一種雙(3,5 — 二溴水楊基)延胡索酸脂修飾人臍帶血血紅蛋白a
鏈的工藝，其特征在于它包括以下步驟
(1) 取一定體積具有適當(dāng)濃度的純化血紅蛋白，加入一定濃度的
有機(jī)磷酸鹽，加入一定濃度具有緩沖能力的物質(zhì)，調(diào)節(jié)其PH為6.0-8.0;
(2) 在低溫下0。C一1(TC，對(duì)血紅蛋白溶液反復(fù)通氮?dú)狻⒊檎婵?的方法，進(jìn)行較徹底脫氧；
(3) 按-一定物質(zhì)的量比加入DBBF， DBBF: Hb為2.5: 1，在通 氮條件下，反應(yīng)溫度為35。C 4(TC, PH值為6.() 8.0，反應(yīng)時(shí)間2.5小 時(shí)，血紅蛋白溶液濃度為50mg/mi;
(4) 用氨基酸中止反應(yīng)，氨基酸與DBBF的摩爾比為2:1，同樣 條件下，反應(yīng)時(shí)間2小時(shí)。
上述所說的步驟(1)中加入的有機(jī)磷酸鹽為2、 3—DPG類似物， 可以預(yù)先用NaOH調(diào)節(jié)好，pH值為6.0 8.0的植酸，在血紅蛋白溶液 中的濃度為8mM/L。
上述所說的步驟(1)中選用的血紅蛋白為人臍帶血血紅蛋白。
上述所說的步驟(1)中加入一定濃度具有緩沖能力的物質(zhì)為 Tris HCl。
上述所說的步驟(2)中脫氧方法為每間隔15min，通隊(duì)，抽真空，
通小流量^維持體系脫氧態(tài)。
上述所說的步驟(4)中氨基酸是賴氨酸。
DBBF交聯(lián)人臍帶血血紅蛋白的a鏈99位賴氨酸上的氨基發(fā)生反
應(yīng)
<formula>formula see original document page 6</formula>
本發(fā)明試驗(yàn)效果如圖1 3。
權(quán)利要求
1、一種雙(3，5一二溴水楊基)延胡索酸脂修飾人臍帶血血紅蛋白α鏈的工藝，其特征在于它包括以下步驟(1)取一定體積具有適當(dāng)濃度的純化血紅蛋白，加入一定濃度的有機(jī)磷酸鹽，加入一定濃度具有緩沖能力的物質(zhì)，調(diào)節(jié)其PH為4.5-8.0；(2)在低溫下0℃-20℃，對(duì)血紅蛋白溶液反復(fù)通氮?dú)?、抽真空的方法，進(jìn)行較徹底脫氧；(3)按一定物質(zhì)的量比加入DBBF，DBBF∶Hb為1～4∶1，在通氮條件下，反應(yīng)溫度為10℃～45℃，PH值為4.5～8.0，反應(yīng)時(shí)間1～4小時(shí)，血紅蛋白溶液濃度為1～100mg/ml；(4)用氨基酸中止反應(yīng)，氨基酸與DBBF的摩爾比為2～10∶1，同樣條件下，反應(yīng)時(shí)間1～3小時(shí)。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種雙(3，5—二溴水楊基)延胡索酸 脂修飾人臍帶血血紅蛋白a鏈的工藝，其特征在于所說的步驟(1)中 加入的有機(jī)磷酸鹽為2、 3 —DPG類似物，可以預(yù)先用NaOH調(diào)節(jié)好， pH值為4.5 8.0的植酸，在血紅蛋白溶液中的濃度范圍為1 10mM/L。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種雙(3，5 — 二溴水楊基)延胡索酸 脂修飾人臍帶血血紅蛋白a鏈的工藝，其特征在于所說的步驟(1)中 選用的血紅蛋白為人臍帶血血紅蛋白。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種雙(3，5 — 二溴水楊基)延胡索酸 脂修飾人臍帶血血紅蛋白a鏈的工藝，其特征在于所說的步驟(O中 加入一定濃度具有緩沖能力的物質(zhì)為Bis Tris或Tris HCl。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種雙(3,5 —二溴水楊基)延胡索酸 脂修飾人臍帶血血紅蛋白a鏈的工藝，其特征在于所說的步驟(2)中 脫氧方法為每間隔10 20min，通N2，抽真空，通小流量&維持體系脫氧態(tài)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所說的一種雙(3,5 — 二溴水楊基)延胡索酸 脂修飾人臍帶血血紅蛋白a鏈的工藝，其特征在于所說的步驟(4)中 氨基酸可以是甘氨酸或賴氨酸。
全文摘要
一種雙(3，5-二溴水楊基)延胡索酸脂修飾人臍帶血血紅蛋白α鏈的工藝，其特征在于它包括以下步驟(1)取一定體積具有適當(dāng)濃度的純化血紅蛋白，加入一定濃度的有機(jī)磷酸鹽，加入一定濃度具有緩沖能力的物質(zhì)，調(diào)節(jié)其pH；(2)在低溫下，對(duì)血紅蛋白溶液進(jìn)行較徹底脫氧；(3)按一定物質(zhì)的量比加入DBBF；(4)用氨基酸中止反應(yīng)。其優(yōu)越性在于(1)DBBF替代PLP對(duì)人臍帶血血紅蛋白進(jìn)行修飾，提高四聚體的穩(wěn)定性；(2)DBBF能夠特異地分子內(nèi)交聯(lián)α₁99位Lys和α₂99位Lys，親氧性明顯降低。
文檔編號(hào)C07K14/795GK101200501SQ20061013036
公開日2008年6月18日 申請(qǐng)日期2006年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月15日
發(fā)明者張鴻輝, 燊 李, 楊成民, 翔 王, 磊 黃 申請(qǐng)人:天津協(xié)和生物科技發(fā)展有限公司