專利名稱：一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，涉及一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物及制備方法。
背景技術(shù)：
心腦血管類疾病是危害人類健康的三大疑難疾病之一，其發(fā)病率及死亡率在某些國家已上升到第1位。因此研制心血管類藥物是廣大醫(yī)藥工作者面臨的重大課題之一。目前開發(fā)成功的很多心血管類藥物，雖然治療效果較好，但是由于藥物本身的毒副作用太強(qiáng)，導(dǎo)致臨床應(yīng)用受到限制。因此，目前心血管類藥物的研究重點(diǎn)，是尋找毒副作用小的預(yù)防和治療藥物。
刺五加是五加屬五加科植物，為長白山地區(qū)特產(chǎn)中藥材之一，長期以全草及莖為原料。由于刺五加的生長周期較長，必將導(dǎo)致藥用資源的匱乏。近年來的研究表明，刺五加葉中含有豐富的具有廣泛藥理活性的黃酮、有機(jī)酸(統(tǒng)稱為酚性成分)和皂甙類化合物，可以進(jìn)一步開發(fā)利用。并且將葉子作為藥材，具有保護(hù)藥用資源，環(huán)境友好的特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物及制備方法。
一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物，它由槲皮素、槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷、綠原酸、二咖啡酰奎寧酸組成，其成分結(jié)構(gòu)式如下
式中，R為OH是槲皮素(MW＝302)，R為 是槲皮苷(MW＝448)，R為 是金絲桃苷(MW＝464)，R為 是蘆丁(MW＝610)綠原酸(MW＝354)的結(jié)構(gòu)式為 二咖啡?？鼘幩?MW＝516)的結(jié)構(gòu)式為 一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物的制備方法，其步驟和條件為將刺五加葉經(jīng)除雜，碎斷，置提取罐中，加40％-95％乙醇(v/v)回流提取三次，每次1-3小時(shí)，每次加乙醇的體積量L∶五加葉重量kg為6-12∶1，濾過，合并濾液，濃縮，取上清液過濾，上已處理好的聚酰胺柱上，以水洗脫至流出液近無色，再以10％-30％乙醇(v/v)洗脫至流出液淡黃色，棄去上述洗脫液，再以40％-70％乙醇(v/v)洗脫，收集洗脫液至流出液淡黃色，回收乙醇并濃縮，噴霧干燥，即得本發(fā)明的一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物。
取50mg刺五加葉提取物，精確稱取，置于50ml容量瓶中，加乙醇定容后即為酚性成分含量測定用樣品，取金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0.2mg/ml)0μl-50μl及25μl樣品溶液分別置于25ml容量瓶中，分別加入5％亞硝酸鈉1.0ml，搖勻，靜止5min，加入10％硝酸鋁溶液1ml，，搖勻，放置5min，再加入4％氫氧化鈉溶液5ml，加70％乙醇至刻度，放置15min，在490-510nm波長下首先測定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收，作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測得樣品中酚性成分的含量。
本發(fā)明的制備方法得到的刺五加葉提取物，利用分光光度法測定，以金絲桃苷計(jì)，酚性成分含量不低于50％。利用負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜分析，在質(zhì)荷比(m/z)50-800的范圍內(nèi)，存在m/z515(二咖啡?；鼘幩峒捌洚悩?gòu)體，分子量為516)，m/z463(金絲桃苷及其異構(gòu)體、分子量為464)，m/z447(槲皮苷，分子量為448)，m/z609(蘆丁，分子量為610)、m/z353(綠原酸，分子量為354)，m/z301(槲皮素，分子量為302)及等主要離子峰(見圖1)。
本發(fā)明的制備方法得到的刺五加葉提取物，可以用現(xiàn)有的中藥制備技術(shù)和工藝方法制成包括膠囊劑、片劑、散劑、注射劑或丸劑等多種劑型的藥物。
用本發(fā)明的制備方法得到的刺五加葉提取物制成的藥物，可以以口服或注射途徑給藥。注射給藥可以為靜脈注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射；口服制劑可以為片劑、膠囊劑、丸劑、顆粒劑、滴丸、軟膠囊、懸浮液、溶液、糖漿；注射用制劑可以為凍干粉針、注射用靜脈乳劑、注射液、輸液。口服制劑優(yōu)選為軟膠囊、滴丸、片劑、膠囊劑、顆粒劑；注射用制劑優(yōu)選凍干粉針、注射液、輸液。
本發(fā)明經(jīng)過中試實(shí)踐，并制定了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和生產(chǎn)工藝，取得了滿意的效果。
本發(fā)明對(duì)刺五加葉中的有效分進(jìn)行分離提取，使得發(fā)明所得到產(chǎn)品有效成分明確，以金絲桃苷計(jì)，該提取物中酚性成分含量不低于50％。經(jīng)過藥理試驗(yàn)證實(shí)刺五加葉酚性成分提取物能明顯延長小鼠凝血時(shí)間，降低腦血管通透性，腦梗死面積，以及血小板黏附率。在預(yù)防或治療心腦血管方面有著明確的療效和作用，毒副作用小，使用安全等特點(diǎn)。


圖1是刺五加葉提取物的負(fù)離子電噴霧質(zhì)譜圖。圖中，儀器條件噴霧電壓4.5kV，金屬毛細(xì)管溫度200℃。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1將刺五加葉經(jīng)除雜，碎斷，置提取罐中，加40％乙醇回流提取三次，每次3小時(shí)，每次每次加乙醇的體積量L∶刺五加葉重量kg為6∶1，濾過，合并濾液，濃縮，取上清液通過板框過濾機(jī)濾過，上已處理好的聚酰胺柱上，以水洗脫至流出液近無色，再以10％乙醇(v/v)洗脫至流出液淡黃色，棄去上述洗脫液，再以50％乙醇(v/v)洗脫，收集洗脫液至流出液淡黃色，回收乙醇并濃縮，噴霧干燥，即得本發(fā)明的一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物。以金絲桃苷計(jì)，酚性成分含量為58.6％。
實(shí)施例2將刺五加葉經(jīng)除雜，予碎斷，置提取罐中，加50％乙醇(v/v)回流提取三次，每次2小時(shí)，每次加乙醇的體積量L∶刺五加葉重量kg為11∶1，濾過，合并濾液，濃縮，取上清液通過板框過濾機(jī)濾過，上已處理好的聚酰胺柱上，以水洗脫至流出液近無色，再以20％乙醇(v/v)洗脫至流出液淡黃色，棄去上述洗脫液，再以60％乙醇(v/v)洗脫，收集洗脫液至流出液淡黃色，回收乙醇并濃縮，噴霧干燥，即得本發(fā)明的一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物。以金絲桃苷計(jì)，酚性成分含量為61.3％。
實(shí)施例3將刺五加葉經(jīng)除雜，碎斷，置提取罐中，加80％乙醇(v/v)回流提取三次，每次1小時(shí)，每次加乙醇的體積量L∶刺五加葉重量kg為12∶1，濾過，合并濾液，濃縮，取上清液通過板框過濾機(jī)濾過，上已處理好的聚酰胺柱上，以水洗脫至流出液近無色，再以30％乙醇(v/v)洗脫至流出液淡黃色，棄去上述洗脫液，再以70％乙醇(v/v)洗脫，收集洗脫液至流出液淡黃色，回收乙醇并濃縮，噴霧干燥，即得本發(fā)明的一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物物。以金絲桃苷計(jì)，酚性成分含量為65.1％。
實(shí)施例4將刺五加葉經(jīng)除雜，碎斷，置提取罐中，加60％乙醇(v/v)回流提取三次，每次1.5小時(shí)，每次加乙醇的體積量L∶刺五加葉重量kg為9∶1，濾過，合并濾液，濃縮，取上清液通過板框過濾機(jī)濾過，上已處理好的大孔樹脂DM130柱上，以水洗脫至流出液近無色，棄去上述洗脫液，再以50％乙醇(v/v)洗脫，收集洗脫液至流出液淡黃色，回收乙醇并濃縮，噴霧干燥，即得本發(fā)明的一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物。以金絲桃苷計(jì)，酚性成分含量為58.1％。
實(shí)施例5將刺五加葉經(jīng)除雜，碎斷，置提取罐中，加70％乙醇(v/v)回流提取三次，每次2.5小時(shí)，每次加乙醇的體積量L∶刺五加葉重量kg為10∶1，濾過，合并濾液，濃縮，取上清液通過板框過濾機(jī)濾過，上已處理好的聚酰胺柱上，以水洗脫至流出液近無色，再以10％，30％乙醇(v/v)洗脫至流出液淡黃色，棄去上述洗脫液，再以55％乙醇(v/v)洗脫，收集洗脫液至流出液淡黃色，回收乙醇并濃縮，噴霧干燥，即得本發(fā)明的一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物。以金絲桃苷計(jì)，酚性成分含量為82.1％。
實(shí)施例6刺五加葉經(jīng)除雜，碎斷，置提取罐中，加95％乙醇(v/v)回流提取2次，每次3小時(shí)，每次加乙醇的體積量L∶刺五加葉重量kg為6∶1，濾過，合并濾液，濃縮，取上清液通過板框過濾機(jī)濾過，上已處理好的聚酰胺柱上，以水洗脫至流出液近無色，再以25％乙醇(v/v)洗脫至流出液淡黃色，棄去上述洗脫液，再以70％乙醇(v/v)洗脫，收集洗脫液至流出液淡黃色，回收乙醇并濃縮，噴霧干燥，即得本發(fā)明的一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物。以金絲桃苷計(jì)，酚性成分含量為75.2％。
藥效實(shí)例藥效試驗(yàn)例1刺五加葉提取物對(duì)大鼠不完全性腦缺血的影響方法將70只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、腦缺血模型組及刺五加葉提取物小、中、大劑量組，正常對(duì)照組每組10只，其余每組12只。刺五加葉提取物小、中、大劑量組，分別舌下靜脈注射刺五加葉提取物7、14、28mg/kg，陽性對(duì)照組舌下注射刺五加注射液90mg/kg(相當(dāng)于臨床日用藥500mg/70kg的2倍)，正常對(duì)照組及腦缺血模型組注射同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥3天，于第3天制作不完全性腦缺血模型水合氯醛0.4g/kg腹腔注射麻醉大鼠，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈，在結(jié)扎頸總動(dòng)脈前10min給藥，在結(jié)扎頸總動(dòng)脈前5分鐘舌下注射伊文思蘭50mg/kg，正常對(duì)照組不結(jié)扎。頸總動(dòng)脈結(jié)扎3小時(shí)后，斷頭取腦、稱重，將腦浸泡于甲酰胺溶液中，在45℃恒溫箱中溫育72小時(shí)，取浸泡液用722-2型分光光度計(jì)進(jìn)行比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出腦內(nèi)伊文思蘭含量，以微克/克腦濕重表示。
結(jié)果與正常對(duì)照組比較，腦缺血模型組腦組織伊文思蘭滲出量顯著升高(p＜0.01＝；與腦缺血模型組比較，刺五加葉葉提取物7、14、28mg/kg組腦組織伊文思蘭滲出量顯著降低(p＜0.05或p＜0.01＝，提示刺五加葉葉提取物可明顯降低腦血管通透性，陽性對(duì)照組腦組織伊文思蘭滲出量顯著降低(p＜0.05)，結(jié)果見表1。
表1.刺五加葉提取物對(duì)不完全性腦缺血大鼠腦血管通透性的影響(x±s)

與腦缺血模型組比較*p＜0.05，**p＜0.01藥效試驗(yàn)例2刺五加葉提取物對(duì)小鼠斷頭完全性腦缺血的影響試驗(yàn)方法 將60只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、陽性對(duì)照組及刺五加葉提取物小、中及大劑量組，每組12只。陽性對(duì)照組給注射用刺五加注射液130mg/kg(相當(dāng)于臨床日用藥500mg/70kg的2倍)，刺五加葉總黃酮小、中及大劑量組給刺五加葉提取物10、20、40mg/kg，正常對(duì)照組給同體積的生理鹽水，尾靜脈給藥，連續(xù)給藥3天，于第3天藥后10min，利用快速斷頭方法制作完全性腦缺血模型。記錄小鼠從斷頭至喘息停止的時(shí)間及喘息次數(shù)。斷頭同時(shí)用毛細(xì)血管法及玻片法測定凝血時(shí)間。
試驗(yàn)結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，刺五加葉提取物10、20、40mg/kg小鼠斷頭后的喘息時(shí)間明顯增加(p＜0.05或p＜0.01)，小鼠斷頭后的喘息次數(shù)明顯增加(p＜0.05或p＜0.01)；刺五加葉提取物20、40mg/kg組小鼠凝血時(shí)間明顯延長(玻片法與毛細(xì)血管法)(p＜0.05或p＜0.01)陽性對(duì)照組小鼠斷頭后喘息時(shí)間明顯延長(p＜0.05)，喘息次數(shù)顯著增加(p＜0.01)，小鼠凝血時(shí)間(玻片法與毛細(xì)血管法)明顯延長(p＜0.05)，見表2、3。
表2.刺五加葉提取物對(duì)小鼠斷頭完全性腦缺血的影響(n＝12，x±s)

與正常對(duì)照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01表3.刺五加葉提取物對(duì)小鼠斷頭完全性腦缺血凝血時(shí)間影響(n＝12，x±s)

與正常對(duì)照組比較，*p＜0.05，*p＜0.01藥效試驗(yàn)例3刺五加葉提取物對(duì)大鼠局部性腦缺血的影響試驗(yàn)方法水合氯醛0.4g/kg腹腔注射麻醉大鼠，按文獻(xiàn)方法制作局部性腦缺血模型[4、5]將大鼠仰位固定，沿頸中作約2cm長皮膚切口，分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈后，分離、結(jié)扎頸外動(dòng)脈，在已分離的頸總動(dòng)脈近心端用動(dòng)脈夾阻斷血流，將一端加熱成圓珠狀(直徑0.3～0.35mm)尼龍線棒插入頸總動(dòng)脈，經(jīng)頸內(nèi)動(dòng)脈推入至前腦動(dòng)脈(自頸內(nèi)、外動(dòng)脈分叉處算起20mm)，再往回拉約2mm，使尼龍線棒的圓球塞在大腦中動(dòng)脈口，取下動(dòng)脈夾，縫合肌肉與皮膚。將72大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、腦缺血模型組、陽性對(duì)照組及刺五加葉提取物小、中及大劑量組，正常對(duì)照組每組10只，其余每組12只。術(shù)后立即給藥，連續(xù)給藥4天。刺五加葉提取物小、中及大劑量組分別舌下靜脈注射刺五加葉提取物7、14、28mg/kg，陽性對(duì)照組注射刺五加注射液90mg/kg(相當(dāng)于臨床日用藥500mg/70kg的2倍)，正常對(duì)照組及模型組注射同體積的生理鹽水。手術(shù)96小時(shí)后斷頭，取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干，冠狀切4刀，共5片，用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色，采用圖象分析系統(tǒng)測定腦梗死面積占切片總面積的百分比，然后將腦片于福爾馬林中固定7天后做病理。在取腦前，腹主動(dòng)脈取血測定血小板黏附率。按文獻(xiàn)方法測定血小板黏附率[2]，取血2.7ml置于含有3.13％枸櫞酸鈉溶液0.3ml的硅化試管中，輕輕混勻，隨后取1.5ml抗凝血加入容量為12ml的球形玻璃瓶中，將球形瓶固定在血小板黏附儀的轉(zhuǎn)動(dòng)裝置上，以3轉(zhuǎn)/min的速度轉(zhuǎn)15min，使血液與瓶壁充分接觸，旋轉(zhuǎn)后從球形瓶(黏附后)中及試管(黏附前)中各取1ml血液分別加入到盛有3.13％枸櫞酸鈉溶液19ml的大試管中，反復(fù)傾倒3次，使其均勻，在室溫下靜止2h，取試管上清液體進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，計(jì)算血小板黏附率。血小板黏附率＝[(黏附前血小板數(shù)-黏附后血小板數(shù))/黏附前血小板數(shù)]×100％。
試驗(yàn)結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，腦缺血模型組腦梗死面積明顯增大(p＜0.01)，血小板黏附率明顯增高(p＜0.05)；與腦缺血模型組比較，刺五加葉提取物7、14、28mg/kg組腦梗死面積明顯降低(p＜0.05或p＜0.01)，血小板黏附率明顯降低(p＜0.05或p＜0.01)，作用呈劑量相關(guān)性；陽性對(duì)照組腦梗死面積明顯縮小(p＜0.01)，血小板黏附率明顯降低(p＜0.05)。
表4.刺五加葉提取物對(duì)局限性腦缺血大鼠腦梗死面積及血小板黏附率的影響(x±s)

與腦缺血模型組比較，*p＜0.05，**p＜0.0權(quán)利要求
1.一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物，其特征在于，它由槲皮素、槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷、綠原酸、二咖啡酰奎寧酸組成，其成分結(jié)構(gòu)式如下 式中，R為OH是槲皮素(MW＝302)，R為 是槲皮苷(MW＝448)，R為 是金絲桃苷(MW＝464)，R為 是蘆丁(MW＝610)；綠原酸(MW＝354)的結(jié)構(gòu)式為 二咖啡?？鼘幩?MW＝516)的結(jié)構(gòu)式為
2.如權(quán)利要求1所述的一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物的制法，其特征在于，其步驟和條件為將刺五加葉經(jīng)除雜，碎斷，置提取罐中，加40％-95％乙醇(v/v)回流提取三次，每次1-3小時(shí)，每次加乙醇的體積量L五加葉重量kg為6-12∶1，濾過，合并濾液，濃縮，取上清液過濾，上已處理好的聚酰胺柱上，以水洗脫至流出液近無色，再以10％-30％乙醇(v/v)洗脫至流出液淡黃色，棄去上述洗脫液，再以40％-70％乙醇(v/v)洗脫，收集洗脫液至流出液淡黃色，回收乙醇并濃縮，噴霧干燥，即得本發(fā)明的一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療和預(yù)防心腦血管疾病的藥物刺五加葉提取物及制備方法，屬于中藥領(lǐng)域。該刺五加葉提取物由槲皮素、槲皮苷、蘆丁、金絲桃苷、綠原酸、二咖啡?？鼘幩峤M成。本發(fā)明對(duì)刺五加葉中的有效成分進(jìn)行分離提取，使得發(fā)明所得到產(chǎn)品有效成分明確，以金絲桃苷計(jì)，該提取物中酚性成分含量不低于50％。經(jīng)過藥理試驗(yàn)證實(shí)刺五加葉酚性成分提取物能明顯延長小鼠凝血時(shí)間，降低腦血管通透性，腦梗死面積，以及血小板黏附率。在預(yù)防或治療心腦血管方面有著明確的療效和作用，毒副作用小，使用安全等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07D311/00GK1969903SQ200610131698
公開日2007年5月30日 申請日期2006年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年11月30日
發(fā)明者劉志強(qiáng), 宋鳳瑞, 劉淑瑩 申請人:中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所