專利名稱：分離純化綠僵菌素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離純化的方法，特別涉及一種分離純化綠僵菌素的方法。
背景技術(shù)：
綠僵菌素(destruxin)是真菌毒素，是一類環(huán)縮羧肽類化合物，主要由綠僵菌(Metarhizium)產(chǎn)生，其它真菌如殼座孢(Aschersonia)、鏈格孢(Altemaria)、單端孢(Trichothecium)及盤蛇孢(Ophiosphaerella)等也能形成不同種類的綠僵菌素。綠僵菌素有殺蟲、抗病毒和抗癌等生物活性，經(jīng)濟(jì)價值很高。自從1961年，Kodaira首次分離出綠僵菌素A和B至今，35種綠僵菌素已經(jīng)被分析鑒定。從Kodaira(1961)、Susuki(1970)到Pail等(1981)都是采用傳統(tǒng)經(jīng)典方法分離綠僵菌素。其方法第一步是萃取，將綠僵菌的發(fā)酵液離心或過濾去渣，然后調(diào)節(jié)其pH值到酸性，按其體積比溶劑∶發(fā)酵液＝1∶1的比例加入乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿等溶劑萃取，將該過程重復(fù)多次，然后分離有機(jī)相和水相分離，保留有機(jī)相并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器或真空干燥器濃縮干燥，獲得綠僵菌素的粗提物。第二步是層析，采用硅膠柱層析或氧化鋁柱層析，用苯、丙酮、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷等溶劑，以不同濃度配比梯度洗脫，最后從不同餾份中可分離到不同的綠僵菌素，其中主要是綠僵菌素A、B和E，因為它們的含量較高，約占總綠僵菌素的85％左右。研究發(fā)展至今，雖然鑒定出多種綠僵菌素，但大多集中在結(jié)構(gòu)分析和物理化學(xué)性質(zhì)判定上，至于分離制備方法則仍然局限在繁雜的流程之中，整個過程需要使用大量的高毒溶劑，持續(xù)很長時間，制備成本非常高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分離純化綠僵菌素的方法，此法克服了常規(guī)方法的上述問題，應(yīng)用此種方法可以達(dá)到快速、環(huán)保、節(jié)省和高效分離純化綠僵菌素的目的。
在達(dá)到上述目的中，根據(jù)本發(fā)明提供的一種分離純化綠僵菌素的方法，此法包括下列步驟(1)真菌發(fā)酵液經(jīng)過離心或真空抽濾去除固體殘渣，所得發(fā)酵液采用吸附法處理，除去其中的部分雜質(zhì)，然后離心除去吸附劑，得發(fā)酵液清液；(2)在超聲波作用下用萃取劑對所得發(fā)酵液清液進(jìn)行萃取，然后經(jīng)分液漏斗分離有機(jī)相和水相，保存有機(jī)相并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮得綠僵菌素粗提物；(3)對所得綠僵菌素粗提物進(jìn)行減壓層析，所得餾份通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮干燥，再溶解并過濾；(4)制備色譜，上述減壓所得粗提物在高效液相色譜儀中進(jìn)一步分離純化，得到各種高純度綠僵菌素。
吸附法預(yù)處理發(fā)酵液是通過吸附法除去發(fā)酵液中的雜質(zhì)。真菌發(fā)酵液的組成非常復(fù)雜，從殘余的培養(yǎng)基、菌組織，到蛋白質(zhì)、色素和各種各樣的代謝物質(zhì)等。綠僵菌素的極性較低，且光吸收峰在波長200～220nm之間，當(dāng)其溶于有機(jī)溶劑時呈無色透明液體，因此發(fā)酵液中吸收峰大于280nm的物質(zhì)都可視為雜質(zhì)，它們實際上是使發(fā)酵液顏色加深的物質(zhì)。我們發(fā)現(xiàn)，利用吸附法預(yù)處理發(fā)酵液，能達(dá)到理想的去雜效果。其吸附法預(yù)處理發(fā)酵液的步驟是在下列條件下進(jìn)行用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至3.0～6.0；吸附劑為高嶺土、硅藻土、膨潤土，或它們其中一種或兩種的混合物；吸附劑用量吸附劑重量/發(fā)酵液體積＝1～5％；溫度15～35℃；振蕩轉(zhuǎn)速100～200轉(zhuǎn)/分；吸附處理0.5～2小時。而較好的吸附預(yù)處理條件是用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至4.0；吸附劑為高嶺土或硅藻土；吸附劑用量吸附劑重量/發(fā)酵液體積＝2％；在24℃下，150轉(zhuǎn)/分振蕩吸附處理1小時。然后離心除去吸附劑。
由于超聲波是一種縱波，它在液體中的傳播會造成液體的壓力變化而產(chǎn)生無數(shù)的微小真空泡，當(dāng)這些真空泡受壓爆破時，會形成強(qiáng)大的沖擊，稱為空穴效應(yīng)，從而使萃取體系中分子增加碰撞機(jī)會，達(dá)到促進(jìn)萃取效果的作用。因此，利用超聲波促進(jìn)萃取，能夠減少溶劑用量、縮短萃取時間和降低萃取體系的溫度以便減少目標(biāo)物的損失。其超聲波促進(jìn)萃取綠僵菌素的條件是用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至3.0～6.0；萃取溶劑為以下體積比的混合液∶乙酸乙酯∶二氯甲烷＝40～100∶60～0；萃取溶劑與發(fā)酵液的體積比為萃取溶劑∶發(fā)酵液＝30～70∶70～30；超聲波頻率30～50kHz；溫度-5～40℃；萃取時間0.5～2小時；而較好的條件是用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至4.0；萃取溶劑為以下體積比的混合液乙酸乙酯∶二氯甲烷＝1∶1；萃取溶劑與發(fā)酵液的體積比為50∶50；超聲波頻率40 kHz；溫度-5～10℃；萃取時間1小時。
經(jīng)過萃取后濃縮而成的綠僵菌素粗提物是一個混合體系，既含各種綠僵菌素，又含許多雜質(zhì)。因此，該粗提物直接采用制備色譜分離純化綠僵菌素時，由于雜質(zhì)含量高，耗時很長。減壓層析可以進(jìn)一步除去雜質(zhì)和分離不同的綠僵菌素組分，經(jīng)減壓層析后再用制備色譜，則不光縮短了時間，提高了效率，也減少了溶劑用量，降低了制備成本。減壓層析裝置由砂芯漏斗、玻璃抽濾瓶和真空泵組合而成。其減壓層析條件是硅膠H填柱；用二氯甲烷洗脫5～10個柱體積，或用以下體積比的混合液二氯甲烷∶甲醇＝100～90∶0～10梯度洗脫5～10個柱體積。
經(jīng)過減壓層析所得濃縮物進(jìn)一步在制備色譜儀上分離純化。其色譜分離純化在以下條件下進(jìn)行反相色譜柱；用以下體積比乙腈∶水＝50∶50洗脫，或用以下體積比乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脫；柱溫0～35℃；檢測波長200～220nm；而較好的檢測波長215nm，柱溫4℃。收集各餾份后，濃縮干燥，再作HPLC分析，與標(biāo)準(zhǔn)對照，確定綠僵菌素種類。
在本說明書中所用的“真菌發(fā)酵液”一詞是指從主要由綠僵菌(Metarhizium)產(chǎn)生，或其它真菌如殼座孢(Aschersonia)、鏈格孢(Alternaria)、單端孢(Trichothecium)及盤蛇孢(Ophiosphaerella)等獲得的包括不同種類的綠僵菌素的液體。
使用本發(fā)明的分離純化綠僵菌素的方法的有益效果是由于在萃取過程中采用了超聲波促進(jìn)萃取，從而省去了常規(guī)方法萃取過程需重復(fù)多次的繁雜，即節(jié)省了時間，又減少了溶劑用量，降低了制備成本；在層析過程中采用減壓層析，即避免了使用苯等有毒溶劑，又為下一步驟制備色譜分離純化除去了大量雜質(zhì)，從而為制備色譜分離純化省去了大量時間，也減少了溶劑用量，降低成本，達(dá)到了快速、環(huán)保、節(jié)省和高效分離純化綠僵菌素的目的。


圖1表示分離純化綠僵菌素的方法流程圖；圖2表示吸附法預(yù)處理發(fā)酵液流程圖；圖3表示超聲波促進(jìn)萃取流程圖；圖4表示減壓層析流程圖；圖5表示減壓層析裝置示意圖；圖6表示減壓層析后制備色譜分離純化綠僵菌素的HPLC圖譜；圖7表示超聲波促進(jìn)萃取后制備色譜分離純化綠僵菌素的HPLC圖譜。
1.砂芯漏斗2.樣品層(其上蓋濾紙)3.硅膠H層4.磨口套接或密封膠塞5.真空泵接口6.玻璃抽濾瓶具體實施方式
用本發(fā)明的分離純化綠僵菌素的方法基本流程是如圖1所示，(1)吸附法預(yù)處理發(fā)酵液真菌發(fā)酵液經(jīng)過離心或真空抽濾去除固體殘渣，所得發(fā)酵液采用吸附法處理，除去其中的部分雜質(zhì)，然后離心除去吸附劑，得發(fā)酵液清液；(2)超聲波促進(jìn)萃取在超聲波作用下用萃取劑對所得發(fā)酵液清液進(jìn)行萃取，然后經(jīng)分液漏斗分離有機(jī)相和水相，保存有機(jī)相并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮得綠僵菌素粗提物；(3)減壓層析對所得綠僵菌素粗提物進(jìn)行減壓層析，所得餾份通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮干燥，再溶解并過濾；(4)制備色譜分離純化制備色譜，上述減壓所得粗提物在高效液相色譜儀中進(jìn)一步分離純化，得到各種高純度綠僵菌素。
下列實施例將進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不僅限于實施例。
實施例1將從金龜子綠僵菌小孢變種(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)產(chǎn)生的液體經(jīng)發(fā)酵后，用5000～8000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)離心10～15分鐘，去渣；或真空抽濾去渣；用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至4.0，用高嶺土或硅藻土作吸附劑，并按吸附劑重量/發(fā)酵液體積＝2％加入到發(fā)酵液中，在24℃下，150轉(zhuǎn)/分振蕩吸附處現(xiàn)1小時；然后用5000～8000轉(zhuǎn)/分的離心機(jī)離心10～15分鐘，去除吸附劑，保留發(fā)酵液，如圖2所示；用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至4.0，萃取溶劑為以下體積比的混合液乙酸乙酯∶二氯甲烷＝1∶1；萃取溶劑與發(fā)酵液的體積比為50∶50；用頻率為40kHz的超聲波在溫度-5～10℃的范圍中萃取1小時，然后經(jīng)分液漏斗分離有機(jī)相和水相，保存有機(jī)相并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，得到綠僵菌素粗提物，對綠僵菌素A和B的萃取效率達(dá)到95％以上，流程如圖3所示；然后減壓層析硅膠H填柱；用二氯甲烷洗脫5～10個柱體積，或用以下體積比的混合液二氯甲烷∶甲醇＝100～90∶0～10梯度洗脫5～10個柱體積，得餾分1或餾分2，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮餾分去除溶劑，從餾分1中得到綠僵菌素A和B粗提物，或從餾分2中得到綠僵菌素C、D和E粗提物，對綠僵菌素A和B的回收率達(dá)到95％以上，其流程如圖4所示，裝置如圖5所示。將各餾份濃縮干燥，再溶解并過濾后制備色譜分離純化反相色譜柱；用以下體積比乙腈∶水＝50∶50洗脫，或用以下體積比乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脫；并用215nm波長紫外光在柱溫4℃檢測綠僵菌素。各餾份濃縮干燥，再作HPLC分析，與標(biāo)準(zhǔn)對照，確定綠僵菌素種類。
實施例2按所述的相同步驟重復(fù)進(jìn)行實施例1，但是吸附法預(yù)處理發(fā)酵液、超聲波促進(jìn)萃取、制備色譜分離純化過程的條件分別改為(1)吸附法預(yù)處理發(fā)酵液的條件用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至3.0～6.0；吸附劑為高嶺土、硅藻土、膨潤土，或它們其中一種或兩種的混合物；吸附劑用量吸附劑重量/發(fā)酵液體積＝1～5％；溫度15～35℃；振蕩轉(zhuǎn)速100～200轉(zhuǎn)/分；吸附處理0.5～2小時。
(2)超聲波促進(jìn)萃取的條件用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至3.0～6.0；萃取溶劑為以下體積比的混合液乙酸乙酯∶二氯甲烷＝40～100∶60～0；萃取溶劑與發(fā)酵液的體積比為萃取溶劑∶發(fā)酵液＝30～70∶70～30；超聲波頻率30～50kHz；溫度-5～40℃；萃取時間03～2小時。
(3)制備色譜分離純化的條件反相色譜柱；用以下體積比乙腈∶水＝50∶50洗脫，或用以下體積比乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脫；柱溫0～35℃；檢測波長200～220nm對比例1按實施例1所述的相同條件重復(fù)進(jìn)行實施例1，但省去其中間(3)減壓層析這一步驟，而直接將超聲波促進(jìn)萃取后得到的綠僵菌素粗提物，用高效液相色譜儀中進(jìn)一步分離純化。在HPLC圖譜中，實施例1減壓層析后制備色譜分離純化，其測定綠僵菌素A在用時8分鐘左右時測定峰面積達(dá)到最大值，綠僵菌素B在用時12分鐘左右時測定峰面積達(dá)到最大值。而本實施例超聲波促進(jìn)萃取后制備色譜分離純化中，其測定綠僵菌素A在用時50分鐘左右時測定峰面積達(dá)到最大值，綠僵菌素B在用時60分鐘左右時測定峰面積達(dá)到最大值，其具體分離純化綠僵菌素的HPLC圖譜情況如圖6、圖7所示。
權(quán)利要求
1.一種分離純化綠僵菌素的方法，該方法包括下列步驟(1)將真菌發(fā)酵液采用吸附法處理，除去其中的部分雜質(zhì)，然后離心除去吸附劑，得發(fā)酵液清液；(2)在超聲波作用下用萃取劑對所得發(fā)酵液清液進(jìn)行萃取，然后經(jīng)分液漏斗分離有機(jī)相和水相，保存有機(jī)相并濃縮得綠僵菌素粗提物；(3)對所得綠僵菌素粗提物進(jìn)行減壓層析，所得餾份濃縮干燥，再溶解并過濾；(4)制備色譜，上述減壓所得粗提物在高效液相色譜儀中進(jìn)一步分離純化，得到各種高純度綠僵菌素。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(1)中吸附法的條件是用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至3.0～6.0；吸附劑為高嶺土、硅藻土、膨潤土，或它們其中一種或兩種的混合物；吸附劑用量吸附劑重量/發(fā)酵液體積＝1～5％；溫度15～35℃；振蕩轉(zhuǎn)速100～200轉(zhuǎn)/分；吸附處理0.5～2小時。
3.按照權(quán)利要求2的方法，其中所述步驟(1)中吸附法的條件是用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至4.0；吸附劑為高嶺土或硅藻上；吸附劑用量吸附劑重量/發(fā)酵液體積＝2％；在24℃下，150轉(zhuǎn)/分振蕩吸附處理1小時。
4.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(2)中用超聲波促進(jìn)萃取的條件是用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至3.0～6.0；萃取溶劑為以下體積比的混合液乙酸乙酯∶二氯甲烷＝40～100∶60～0；萃取溶劑與發(fā)酵液的體積比為萃取溶劑∶發(fā)酵液＝30～70∶70～30；超聲波頻率30～50kHz；溫度-5～40℃；萃取時間0.5～2小時。
5.按照權(quán)利要求4的方法，其中所述步驟(2)中用超聲波促進(jìn)萃取的條件是用10％的鹽酸溶液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至4.0；萃取溶劑為以下體積比的混合液乙酸乙酯∶二氯甲烷＝1∶1；萃取溶劑與發(fā)酵液的體積比為50∶50；超聲波頻率40kHz；溫度-5～10℃；萃取時間1小時。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(3)中減壓層析的條件是硅膠H填柱；用二氯甲烷洗脫5～10個柱體積，或用以下體積比的混合液二氯甲烷∶甲醇＝100～90∶0～10梯度洗脫5～10個柱體積。
7.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(4)中制備色譜的條件是反相色譜柱；用以下體積比乙腈∶水＝50∶50洗脫，或用以下體積比乙腈∶水＝0～60∶100～40梯度洗脫；柱溫0～35℃；檢測波長200～220nm。
8.按照權(quán)利要求7的方法，其中所述步驟(4)中制備色譜的條件是柱溫4℃；檢測波長215nm。
9.按照權(quán)利要求1的方法，其中所述真菌來自半知菌亞門絲孢綱，其種類包括綠僵菌、殼座孢、鏈格孢、單端孢及盤蛇孢。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種分離純化綠僵菌素的方法，此法包括下列步驟(1)將真菌發(fā)酵液采用吸附法處理，除去其中的部分雜質(zhì)，然后離心除去吸附劑，得發(fā)酵液清液；(2)在超聲波作用下用萃取劑對所得發(fā)酵液清液進(jìn)行萃取，然后經(jīng)分液漏斗分離有機(jī)相和水相，保存有機(jī)相并濃縮得綠僵菌素粗提物；(3)對所得綠僵菌素粗提物進(jìn)行減壓層析，所得餾份濃縮干燥，再溶解并過濾；(4)制備色譜，上述減壓所得粗提物在高效液相色譜儀中進(jìn)一步分離純化，得到各種高純度綠僵菌素。此種方法可以快速、環(huán)保、節(jié)省和高效地分離純化綠僵菌素，具有良好的社會經(jīng)濟(jì)價值。
文檔編號C07K14/37GK101016331SQ200610132318
公開日2007年8月15日 申請日期2006年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日
發(fā)明者胡瓊波, 任順祥 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)