專(zhuān)利名稱(chēng)：人工合成長(zhǎng)鏈dna新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及核苷酸合成方法，具體涉及人工合成長(zhǎng)鏈DNA新方法。
技術(shù)背景-核苷酸在生物技術(shù)上有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，目前合成短鏈DNA方法與原理主 要有下列方法① 人工合成用于拼接成整條雙鏈DNA所需的所有短寡核苷酸引物(30-40 mer).寡核苷酸引物設(shè)計(jì)依據(jù)Tm值和應(yīng)用現(xiàn)在的電腦軟件，然后對(duì)寡核苷酸引物進(jìn)行磷酸化，純化，拼接。② 用兩歩PCR進(jìn)行合成反應(yīng)或者另一種合成方法在此步前多用連接酶進(jìn)行 一次連接反應(yīng)，然后再進(jìn)一步PCR擴(kuò)增，最后獲得全基因序列。但上述兩種合成方法都有一定的局限性 合成的寡核苷酸引物條數(shù)很多,每條長(zhǎng)度<40核苷酸，例如700 bps的DNA 雙鏈則需要合成至少37條引物，另外引物的設(shè)計(jì)必須要在一定Tm值范圍內(nèi), 否則上下兩條鏈的互補(bǔ)區(qū)就很難配對(duì)，造成非特異性結(jié)合導(dǎo)致合成失敗。② 合成的成本較高。③ 合成步驟復(fù)雜，純化要求較高。
兩步PCR必然會(huì)引起較高的突變率。 ⑤成功率基于引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)和總數(shù)、受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計(jì)步驟簡(jiǎn)單，成 本低、收率高的合成長(zhǎng)鏈DNA的方法。本發(fā)明提供了一種合成長(zhǎng)鏈DNA新方法，本發(fā)明人也稱(chēng)其為橋式基囡合成法。 本發(fā)明方法的基本原理為
依據(jù)PCR反應(yīng)所需的DNA模板可以是單鏈的原理，先合成單鏈DNA 摸板鏈。首先選澤設(shè)計(jì)符合要求的特殊結(jié)構(gòu)的DNA引物用于第一步合成 DNA單鏈摸板的反應(yīng)，采用最后一步PCR的方法來(lái)擴(kuò)增目的片斷。本發(fā)明的方法包括下列步驟(1) 合成基因序列的獲得以常規(guī)方法獲得需要合成的基因序列；(2) 引物l選澤依據(jù)計(jì)算機(jī)軟件分析DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，選出具有頭尾同 時(shí)游離特性的DNA序列作為引物1;(3) 引物2的選澤依據(jù)計(jì)算機(jī)軟件分析DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，選出頭尾序列 同時(shí)具有游離大于2bp而且二級(jí)結(jié)構(gòu)極其簡(jiǎn)單特性的DNA序列作為 引物2;(4) 用DNA合成儀合成引物1和引物2;(5) 按照同等比例混合所有的引物1和引物2;(6) 高溫變性在94-95。C條件下維持2-30分鐘；(7) 配制高溫連接酶反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)94-95'C， 2-30分鐘后逐步降至45X: 以下；或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；或T4連接酶連接反應(yīng)配制高溫連接酶反 應(yīng)體系；(8) 取出1/50的連接酶反應(yīng)產(chǎn)物，加入雙鏈擴(kuò)增的兩條引物，配制PCR 反應(yīng)體系；(9) 按常規(guī)的PCR反應(yīng)條件，合成雙鏈DNA;柳取出2-50ul PCR反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶， 利用DNA膠純化試劑盒純化目的基因片段。 上述方法中，引物1為用于單鏈模板合成的引物；它為5'和3'具有極其 簡(jiǎn)單的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并同時(shí)具有2個(gè)或以上的堿基游離，從而形成"豆芽瓣式"結(jié) 構(gòu)。引物2為用于使引物1按順序連接成單鏈的另一條鏈上的引物，它為5'端和 3'端必須有1個(gè)以上游離堿基,并形成豆芽瓣式結(jié)構(gòu)，但是5'、 3'端與互補(bǔ)鏈必須 至少有10-15個(gè)堿基配對(duì)。
用本發(fā)明方法合成YFP (黃色熒光蛋白)的基因序列如下ATGGCCAGTA GTGAGGACGT CATAAAGGAG TTCATGCGGT TTAAGGTGCG CATGGAGGGG 60 AGCGTGAACG GACACGAGTT CGAAATCGAG GGAGAGGGCG AGGGCAGGCC TTACGAGGGA 120 ACCCAGACAG CCAAACTGAA GGTCACAAAA GGAGGACCCC TGCCCTTCGC GTGGGATATA 180 CTGTCCCCTC AATTTATGTG GGGAAGCAAA GCCTATGTCA AGCACCCCGC CGACATTCCT 240 GACTATCTCA AACTCTCCTT CCCAGAGGGC TTCAAGTGGG AGCGCGTCAT GAACTTCGAG 300 GACGGCGGAG TGGTCACCGT CACACAGGAC TCAAGTCTCC AAGACGGGGA GTTTATTTAC 360 AAAGTCAAAC TCAGAGGCAC AAATTTCCCC TCCGACGGAC CCGTTATGCA AAAGAAAACC 420 ATGGGCTGGG CCGCTACCAC CGAAAGGATG TATCCTGAAG ATGGCGCTCT CAAGGGGGAG 480 ATAAAGATGC GGCTGMGCT CAAGGATGGG GGCCACTACG ATGCCGAAGT GAAAACTACA 540 TATATGGCCA AAAAACCCGT CCAACTCCCC GGTGCCTACA AAATTGACGG AAAACTCGAC 600 ATCACAAGCC ACAACGAGGA CTACACCATT GTGGAACAAT ACGAGAGAGC CGAAGGCAGA 660 CATTCTACTG GTGCCTAA 678本發(fā)明方法具有下列特點(diǎn)1、 合成單鏈的方法不是用合成PCR (Assembly PCR又名兩步PCR法) 的方法，而是采用了逐步降溫連接法或者連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(高溫連接酶循環(huán) 反應(yīng))或者T4連接酶反應(yīng)代替其中的第一步PCR的步驟，從而降低了 PCR 所引起的基因突變率。2、 本方法主要技術(shù)是依據(jù)DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)來(lái)設(shè)計(jì)單鏈寡核苷酸引物(長(zhǎng)度依據(jù)結(jié)構(gòu)定)，讓引物具有結(jié)構(gòu)的靈活性。3、通過(guò)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或T4連接酶連接反應(yīng)，或逐步降溫連接反應(yīng)使 位于同一條鏈上的各條引物與另一條鏈上的"橋"式單鏈寡核苷酸引物配對(duì) 而按照特定的順序連接起來(lái)，經(jīng)過(guò)逐步降溫連接或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或4-16度 T4連接酶反應(yīng)后得到大量的單鏈DNA片斷，然后再經(jīng)過(guò)最后的PCR反應(yīng)擴(kuò) 增出所需的DNA雙鏈。本發(fā)明方法與已有技術(shù)相比較有下列優(yōu)點(diǎn)① 單鏈寡核苷酸的設(shè)計(jì)更加靈活，不會(huì)基于tm值而設(shè)計(jì)，只要單鏈寡 核苷酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)符合一定的要求即可，單鏈寡核苷酸引物的長(zhǎng)度可在60 〈20bps之間。② 單鏈寡核苷酸引物的數(shù)量大減，而且經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。③ 方法上的改進(jìn)，使原來(lái)的兩步PCR縮短成一步PCR即可得到目的片 斷，使堿基突變率降低，在PCR前就已經(jīng)存在一條目的雙鏈DNA的一條模板 鏈。 附圖1中藍(lán)色的單鏈寡核苷酸引物為引物2，這個(gè)設(shè)計(jì)是本方法的關(guān) 鍵，其二級(jí)結(jié)構(gòu)特殊，引物兩端必須游離出來(lái)形成"豆芽瓣式"結(jié)構(gòu)。只要形 成該結(jié)構(gòu)便無(wú)所謂該引物其它地方的二級(jí)結(jié)構(gòu)和配對(duì)的情況。⑤合成時(shí)間縮短(該合成反應(yīng)時(shí)間不依賴(lài)于目的DNA的長(zhǎng)度)，精確 率提高(一步PCR)，錯(cuò)配幾率降低(第一歩是互補(bǔ)配對(duì)連接反應(yīng))。


-圖1人工合成長(zhǎng)鏈DNA新方法原理示意圖1連接反應(yīng)2 PCR反應(yīng) 圖2-圖16分別為以下各條引物序列的二級(jí)結(jié)果圖 (Y為引物1 , YP為引物2) Y1 Atggccagtagtgaggacgtcataaaggagttcatgcggtttaaggtgcgcatggaggggag Y2cgtgaacggacacgagttcgaaatcgagggagagggcgagggcaggccttacgagggaacccagacagY3ccctgcccttcgcgtgggatatactgtcccctcaatttatgtggggaagcaaagcctatgtcaagcaccccgccg3C3ttCCtg3CtatCtC333CtCtCY4cttcccagagggcttca3gtgggagcgcgtcatgaacttcgaggacggcggagtggtcaccgtcacacagg actcaagtY5ctcca3gacggggagtttatttacaaagtcaaactcagaggcacaaatttcccctccg3cggacccgttatgc3333g3333CC3tgY6ggctgggccgctaccaccgaaaggatgtatcctgaagatggcgctctcaagggggagataaagatgcggct gaagctcaaggatgggggccactacgatgY了ccg33gtga333ctac3tatatggcc333333cccgtcc33ctccccggtgcctac3333ttg3cgg3333ctcg3C3tC3C33gCC3C33Y8cgaggactacaccattgtggaacaatacgagagagccgaaggcagacattctactgg YP1:TCGTGTCCGTTCACGCTCCCCTCCATGCGC YP2 : TCCCACGCGAAGGGCAGGGGTCCTCCTTTTGTGACC YP3 : ACTTGAAGCCCTCTGGGAAGGAGAGTTTGAGATAG YP4 : AAATAAACTCCCCGTCTTGGAGACTTGAGTCCTGTGT YP5 : TTTCGGTGGTAGCGGCCCAGCCCATGGTTTTCTTTTG YP6 : TAGTTTTCACTTCGGCATCGTAGTGGCCCCCAT YP7 : ATGGTGTAGTCCTCGTTGTGGCTTGTGATG圖17為合成過(guò)程中各步驟產(chǎn)物的瓊脂糖電泳結(jié)果 數(shù)字相對(duì)應(yīng)于圖中數(shù)字1 LCR前的oligos混合物lul2 LCR后的產(chǎn)物5ul 3 YFP正鏈和反鏈引物濃度與"橋"引物一樣，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物5ul 4沒(méi)有加入YFP正鏈和反鏈引物的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ul5 YFP正鏈和反鏈引物濃度是Patch 5倍，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物5 ul6 LCR產(chǎn)物5ul做模板，lO隱ol YFP引物，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物5ul 7逐漸降溫連接法的oligos混合物5ul8逐漸降溫連接法后的產(chǎn)物5ul9逐漸降溫連接法后的產(chǎn)物5ul做模板，lOnraol YFP引物，PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物5ul 圖18為合成過(guò)程中各步驟產(chǎn)物的電泳結(jié)果1 LCR產(chǎn)物后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ul2逐漸降溫連接法后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5ul3 LCR產(chǎn)物5ul4逐漸連接法產(chǎn)物5ul圖19目的基因接入T載體后酶切鑒定電泳結(jié)果接入PGEMTEasy VECTOR中并用Ncol酶切鑒定結(jié)果Line 1 PGEMTeasy vector用NC01消化Line 2 PGEMTeasy vector連接Synthetic YFP PCR產(chǎn)物后，挑取白斑，提質(zhì)粒 后用NC01酶切鑒定.圖20、 21lug合成樣品DNA的測(cè)序結(jié)果圖
具體實(shí)施例方式實(shí)例l:合成密碼子優(yōu)化的YFP黃色熒光蛋白基因全序列，在NCBI的基因庫(kù)中下載了 YFP的全基因序列，和蛋白質(zhì)序列.依據(jù)蛋白質(zhì)序列,通過(guò)基因島網(wǎng)站的網(wǎng)頁(yè)服務(wù)獲得YFP的人偏愛(ài)密碼子優(yōu)化的基因序列。1，引物l Oligos和引物2 oligo的設(shè)計(jì)選澤方法及要求根據(jù)本發(fā)明方法，oligos必須具體一定的特殊結(jié)構(gòu)才能完成連接單鏈階段.每 條oligo的二級(jí)結(jié)構(gòu)多強(qiáng)，tm值多高，只要滿(mǎn)足的條件是5'端和3'端必須有1 個(gè)以上游離堿基，并形成豆芽瓣式結(jié)構(gòu)，而且游離的堿基數(shù)越多成功率越高.
另對(duì)于引物2要求也是同樣，但是5，、 3'端與互補(bǔ)鏈必須至少有10-15個(gè)堿基 配對(duì)。將引物序列輸入到RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件里(如primer5.0)得到二 級(jí)結(jié)構(gòu)圖，尋找符合要求的引物設(shè)計(jì)。2，分析基因全序列(附序列表)，設(shè)計(jì)選澤所需的引物(各引物二級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖 2-圖16),引物的5'磷酸化反應(yīng)體系Oligo 0.1 nmol ， 10*PNK buffer 3ul ， T4 polynucleotide kidnase 2ul， ATPlmM lul，H20 23ul，37度水浴30分鐘。磷酸化結(jié)束后加入另外70ul H20 ， 總體積至100ul3 ， LCR反應(yīng)或者過(guò)夜高溫連接或者T4連接酶過(guò)夜連接或者逐漸降溫連接法 連接酶反應(yīng)體系:取各磷酸化后的產(chǎn)物lul， 10*Taq ligase buffer(Biolab) 2.5ul, Taqligase lul， H20 19.5ul。LCR反應(yīng)的條件為95度10分鐘，(95度30秒，55度7分鐘)40個(gè)循環(huán)，50度30分鐘。T4連接酶16度過(guò)夜連接。逐歩降溫連接法，是用LCR的反應(yīng)體系，95度10分鐘，然后自行冷卻至常 溫。其它的連接酶依據(jù)各自的特性配制反應(yīng)體系，設(shè)定連接條件。4，取各連接反應(yīng)產(chǎn)物lul和5ul分別建立PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系連接反應(yīng)物lul， DNTP 20mM 2.5ul，擴(kuò)增用的兩條引物各lul， 10 *Taq polymarase buffer 5ul,Taq高溫聚合酶2ul，去離子水38.5，總反應(yīng)體系50ul。5，取20ul反應(yīng)產(chǎn)物電泳，純化。6，合成結(jié)果見(jiàn)附留17-21所示圖17表明3、 5、 6、 9對(duì)應(yīng)的方法得到了正確大小的目的基因片段
圖18表明1、 2對(duì)應(yīng)的方法也得到了正確大小的目的基因片段圖19結(jié)果表明用目的基因中的一個(gè)酶消化片段，切出符合大小的片段，說(shuō)明該合成的目的基因含有該酶切位點(diǎn)。 圖20-21結(jié)果表明目的基因合成的序列與設(shè)計(jì)的YFP基因序列一致 總結(jié)人工合成目的基因測(cè)序結(jié)果正確，通過(guò)電泳結(jié)果可以知道合成的目的基因 片段準(zhǔn)確大小圖，通過(guò)酶切圖譜可以得到目的基因的序列相對(duì)準(zhǔn)確性，另外，做 了 DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明與合成的基因序列100%匹配。 通過(guò)以上結(jié)果證明此方法已成功地合成了通過(guò)密碼子優(yōu)化的合成YFP。
權(quán)利要求
1.一種合成長(zhǎng)鏈DNA新方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)合成基因序列的獲得以常規(guī)方法獲得需要合成基因的序列；(2)引物1的選澤依據(jù)計(jì)算機(jī)軟件分析DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，選出具有頭尾同時(shí)游離特性的DNA序列作為引物1；(3)引物2的選澤依據(jù)計(jì)算機(jī)軟件分析DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，選出頭尾序列同時(shí)具有游離大于2bp而且二級(jí)結(jié)構(gòu)極其簡(jiǎn)單特性的DNA序列作為引物2；(4)用DNA合成儀合成引物1和引物2；(5)按照同等比例混合所有的引物1和引物2；(6)高溫變性在94-95℃條件下維持2-30分鐘；(7)配制高溫連接酶反應(yīng)體系經(jīng)過(guò)94-95℃，2-30分鐘后逐步降至45℃以下；連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；或T4連接酶連接反應(yīng)配制高溫連接酶反應(yīng)體系；(8)取出1/50的連接酶反應(yīng)產(chǎn)物，加入雙鏈擴(kuò)增引物配制PCR反應(yīng)體系；(9)按常規(guī)的PCR反應(yīng)條件，合成雙鏈DNA；(10)取出2-50ulPCR反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，利用DNA膠純化試劑盒純化目的基因片段。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種合成長(zhǎng)鏈DNA新方法，其特征在于所述步驟(2) 引物1為用于單鏈模板合成的引物；它為5'和3'具有極其簡(jiǎn)單的二級(jí)結(jié)構(gòu)， 并同時(shí)具有2個(gè)或以上的堿基游離，從而形成"豆芽瓣式"結(jié)構(gòu)。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種合成長(zhǎng)鏈DNA新方法，其特征在于所述步驟(2) 引物2為用于使引物1按順序連接成單鏈的另一條鏈上的引物，它為5'端和 3，端必須有1個(gè)以上游離堿基，并形成豆芽瓣式結(jié)構(gòu)，但是5'、 3'端與互補(bǔ)鏈 必須至少有10-15個(gè)堿基配對(duì)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人工合成長(zhǎng)鏈DNA新方法，本發(fā)明方法核心技術(shù)在于將DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的特性引入到引物設(shè)計(jì)中，并結(jié)合新的逐步降溫連接法(同時(shí)可采用連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或者T4連接酶反應(yīng))使位于同一條鏈上的各條引物與另一條鏈上的“橋”式單鏈寡核苷酸引物配對(duì)而按照特定的順序連接起來(lái)，經(jīng)過(guò)逐步降溫連接反應(yīng)(或40個(gè)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)或4-16度T4連接酶反應(yīng))后得到大量的單鏈DNA模板，然后再經(jīng)過(guò)最后的PCR反應(yīng)擴(kuò)增出所需的DNA雙鏈。本發(fā)明方法成本低、步驟簡(jiǎn)單、速度快，突變率低，有較大應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07H21/00GK101210038SQ200610148058
公開(kāi)日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2006年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月27日
發(fā)明者楊光華 申請(qǐng)人:楊光華