專利名稱：：新木欖二硫醇、其衍生物及其制備方法和在制備治療糖尿病藥物中的應用的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，更具體而言，涉及一種從紅樹林植物木欖(&wgM&ragywwo^r/^a)中分離得到的化合物新木欖二硫醇(bruguiesulfbrol)及其衍生物，本發(fā)明還涉及該化合物及其衍生物的制備方法，以及經(jīng)過生物活性測試可作為蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制劑和胰島素增敏劑，從而它們可用于制備治療n-型糖尿病、肥胖癥及其它由此引起的并發(fā)癥的藥物。
背景技術：
：糖尿病(diabetesmellitus)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的臨床綜合癥，因胰島素分泌絕對或相對不足以及耙組織細胞對胰島素敏感性降低，引起糖、蛋白、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂。臨床以高血糖為主要共同標志，久病可引起多個系統(tǒng)損害，病情嚴重時可發(fā)生急性代謝紊亂如酮癥酸中毒等。在糖尿病人中發(fā)生冠心病、缺鐵性或出血性腦血管病、失明、肢端壞疽等嚴重并發(fā)癥均明顯高于非糖尿病人群。因此，糖尿病及其并發(fā)癥已成為嚴重威脅人類健康的世界性公共衛(wèi)生問題。目前一般將糖尿病分為兩類，I型糖尿病(胰島素依賴型糖尿病，IDDM)與II型糖尿病(非胰島素依賴型糖尿病，NIDDM)。糖尿病中90%以上是11型糖尿病。WHO預計，由于人口老齡化、肥胖、不健康的飲食以及缺乏運動的生活方式，到2025年，糖尿病患者的數(shù)目將由1995年的1.35億上升為3億。I型糖尿病人由于第6對染色體短臂上的HLA-D基因決定了遺傳易感性，對環(huán)境因素，特別是病毒感染或化學毒性物質(zhì)刺激的反應異常，直接或間接通過自身免疫反應，引起胰島B細胞破壞，以致胰島素不足。臨床特點是引起病急、多食、多尿、多飲、體重減輕等癥狀較明顯，有發(fā)生酮癥中毒的傾向，必須依賴胰島素治療維持生命。II型糖尿病也有很強的遺傳性和環(huán)境因素，并呈顯著的異質(zhì)性，發(fā)病機制多樣而復雜，各病人間存在較大差異?？偟膩碚f可概括為胰島素分泌的相對不足和胰島素抵抗。對II型糖尿病人，尤其是肥胖性糖尿病患者的一系列研究證實，胰島素抵抗是II型糖尿病發(fā)生、發(fā)展過程中的關鍵因素。在研究脂肪細胞和肌肉細胞內(nèi)胰島素信號傳導途徑的基礎上，設計開發(fā)胰島素增敏劑，以改善胰島素抵抗狀態(tài)，是目前II型糖尿病新藥研究的重點，也是其主要方向之一。II型糖尿病的特點是胰島素敏感組織如骨骼肌、肝、脂肪組織對胰島素作用的抵抗。雖然其具體機制尚不清楚，但胰島素信號在其傳導通路中的減弱甚至阻斷必定是直接因素。胰島素通過與其受體胞外a亞單位結合激活受體胞內(nèi)f3亞單位內(nèi)在的酪氨酸激酶活性，導致調(diào)節(jié)結構域中關鍵的酪氨酸殘基自身磷酸化，從而完全激活胰島素受體酪氨酸激酶活性，'胰島素受體酪氨酸激酶再通過磷酸化其底物將信號傳遞下去。隨著對細胞內(nèi)胰島素作用通路中可逆性酪氨酸磷酸化認識的加深，蛋白酪氨酸磷酸酯酶(PTPases)在平衡該通路中相關蛋白酪氨酸磷酸化水平中的作用越來越受到重視。PTPases可能作用于該通路中多個環(huán)節(jié)，例如將自身磷酸化活化的胰島素受體(IR)去磷酸化，從而降低受體激酶活性；或?qū)⒅T如胰島素受體底物l(IRS-1)、胰島素受體底物2(IRS-2)、Shc等胰島素受體的底物中蛋白酪氨酸殘基致病磷酸化，從而負調(diào)控胰島素作用受體后通路。特定PTPases和胰島素通路中酪氨酸激酶間酶活性的不平衡可能是引起II型糖尿病胰島素抵抗的原因。因此，通過尋找選擇性作用于該通路中PTPases的抑制劑抑制其活性，加強和延長胰島素信號，成為越來越受重視的治療II型糖尿病的新途徑。PTPases包括一大族跨膜(受體型)和胞內(nèi)(非受體型)酶，參與調(diào)控一系列重要生命過程。雖然多種PTPases在胰島素敏感的組織中有表達，如跨膜的CD45和LAR-PTPase等；胞內(nèi)的SHPTP-1、SHPTP-2、PTP1B、PTP1C等，但只有幾種PTPases可能在胰島素通路中受體或受體后環(huán)節(jié)影響正常胰島素作用。目前的研究主要集中在LAR-PTPase、SHPTP-2、PTP1:B。PTP1B是最早被純化和確定生物學特性的PTPase，全長大約50KD。早期研究證明能在體外有效地將胰島素受體去磷酸化；將來源于人胎盤的PTP1B顯微注射入非洲蟾蜍卵母細胞中，將減少胰島素誘導的卵母細胞成熟及S6肽磷酸化水平。隨后發(fā)現(xiàn)PTP1B在所有胰島素敏感組織中高表達；用滲透休克的方法給予PTP1B抗體后，小鼠KRC-7肝細胞經(jīng)胰島素刺激時DNA合成和PI3激酶活性水平顯著升高，IR自身磷酸化水平、IR激酶活性水平和IRS-1酪氨酸磷酸化水平也顯著升高。最近有研究表明，PTP1B直接與激活狀態(tài)的IR相互作用；在體外實驗中也對IRS-1顯示最高的選擇性活性；大鼠成纖維細胞中PTP1B的高表達能明顯降低配體誘導的IR磷酸化水平；用腺病毒介導基因轉(zhuǎn)染的方法，在胰島素靶向組織骨骼肌和肝組織的模型細胞L6肌細胞和Fao細胞中高表達PTP1B,明顯抑制胰島素誘導的IR和IRS-1的酪氨酸磷酸化，并從而顯著抑制IRS-1和PI3激酶P85亞單位復合物的形成以及Akt、MAPK的磷酸化水平，而且胰島素誘導的糖原合成也被抑制[EgawaK.etal.J.Biol.Chem.276(13):10207-10211]。用同樣的方法在另一胰島素靶向組織脂肪組織的模型細胞3T3-L1細胞中高表達PTP1B，同樣明顯抑制胰島素誘導的IR、IRS-1和PI3激酶的酪氨酸石粦酸4匕，P42和P44MAPK^舞酸化水平也明顯降4氐，而Akt^粦酸化水平和活性不受影響[VenableC.L.etal.J.Biol.Chem.275(24):18318-18326]。PTP1B的高表達對基本的、中等的及最大量胰島素誘導的葡萄糖轉(zhuǎn)運無影響，對轉(zhuǎn)運的ECs。胰島素濃度無影響。這些研究證明PTP1B能夠負調(diào)控胰島素信號轉(zhuǎn)導通路并主要作用于胰島素受體。更重要的實驗證據(jù)來自PTP1B基因敲除小鼠。Elchebly等報道，運用同源重組的方法產(chǎn)生的PTP1B基因敲除的小鼠生長正常，有生殖力，對胰島素敏感性顯著增強，而且這一增強作用與肝臟和骨骼肌中胰島素受體及胰島素受體底物l磷酸化水平的增強相關[ElcheblyM.，etal.Science,283,1544-1548]。令人驚奇的是，PTP1B基因敲除的小鼠對食物誘導的體重增加和胰島素抵抗也有抵抗作用。Klaman等運用大致相同的方法產(chǎn)生的PTP1B基因敲除的小鼠也得到同樣的結果，而且發(fā)現(xiàn)PTP1B基因敲除的小鼠之所以對食物誘導的體重增加有抵抗作用，是由于脂肪細胞體積的減少，而脂肪細胞的數(shù)量并不改變。PTP1B基因敲除的小鼠基本代謝水平和總體能量消耗升高[KlamanL.D.,etal.MolecularandCellularBiology,20(15):5479-5489]。這些實驗更加有力地證明了PTPIB在胰島素敏感性、能量消耗和脂肪儲存方面的重要作用，從而更加明確了它是治療II型糖尿病和肥胖癥的一個潛在藥物作用靶點。PTP1B選擇性抑制劑的研究取得了一定的進展，但大多局限于一些肽類或非肽類化合物，例如基于PTP1B去磷酸化的底物序列設計的抑制劑EEDE(F2PMP)M(Ki=7.2nM)、Glu-F2PMP-F2PMP(IC50=40nM),雖然這些肽類抑制劑具有較強的抑制活性及較高的選擇性，但它們是肽類磷酸化合物的事實使其很難成為藥物候選化合物。最近，一系列非肽類非磷酸化合物類PTPIB抑制劑被報道，它們具有一定的選擇性，更重要的是，其中一些化合物對降低ob/ob小鼠血漿中葡萄糖和胰島素水平有顯著作用。這是第一例藥理學的直接證據(jù)，證明PTPIB抑制劑具有抗糖尿病活性[Malamas,M.S.，etal.J.Med.Chem.,2000,43，1293-1310]。這些無疑為我們尋找新的小分子非肽類有機化合物作為高效、高選擇性PTPIB抑制劑提供了機遇。本發(fā)明是從紅樹林植物木欖(萬n/gw/eragyw"oWw'za)中分離得到化合物新木欖二硫醇并合成了其衍生物，經(jīng)多次藥理試驗研究表明，該化合物及其衍生物具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶IB的顯著活性及明顯增敏胰島素通路信號分子和GLUT4對胰島素信號的響應，經(jīng)文獻檢索，未見該類化合物此方面活性的報道。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的目的是提供一種從紅樹林植物木欖中分離得到的化合物新木欖二硫醇及其衍生物。本發(fā)明的另一目的是提供上述新木欖二硫醇及其衍生物的制備方法。本發(fā)明的還一目的是提供上述新木欖二硫醇及其衍生物在制備治療n-型糖尿病、肥胖癥及其它由此引起的并發(fā)癥的藥物中應用。本發(fā)明所述的化合物新木欖二硫醇及其衍生物具有如下的化學結構式其中，R為氫、C1C6的烷基或C2C6的烷?；划擱為氫時，所述化合物即為新木欖二^e克醇；上述C1C6的烷基是指含有1~6個碳原子的直鏈或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基等；優(yōu)選含有1~4個碳原子的直鏈或支鏈的烷基，更優(yōu)選曱基。上述烷?；侵负?6個碳原子的直鏈或支鏈的烷?；缫阴；⒈；蚨□；?；優(yōu)選含有24個碳原子的直鏈或支鏈的烷酰基；更優(yōu)選乙酰基。新木欖二硫醇或其衍生物中4位碳的絕對構型可以是R型、S型或R和S的混合構型。本發(fā)明提供了新木欖二硫醇及其衍生物的制備方法，步驟如下1)紅樹林植物木欖，取其莖葉陰干后粉碎，用醇滲漉提取，得到提取浸膏；其中，所述的醇為甲醇或乙醇；2)將提取浸膏分散于水，水的混懸液依次以石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取部位；3)對乙酸乙酯萃取部位經(jīng)100~200目硅膠柱層析，以石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮或氯仿/甲醇梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層層析檢測，展開劑氯仿/曱醇卯:IO，將Rf值在0.4-0.6間的洗脫液合并濃縮即得I組分；4)步驟3)中的I組分再經(jīng)200~300目硅膠柱層析，以石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮或氯仿/曱醇梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層層析檢測，展開劑石油醚/丙酮50:50,將Rf值在0.40.6間的洗脫液合并、減壓濃縮即得II組分；5)步驟4)中的II組分再經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，用氯仿/甲醇或MeOH洗脫，洗脫液經(jīng)薄層層析檢測，展開劑石油醚/丙酮50:50，將Rf值在0.5的洗脫液合并、減壓濃縮，即得到本發(fā)明化合物新木欖二碌u醇；進一步的，該化合物通過烷基化反應、?；磻?、酯化反應、或成醚反應，得到其相應的衍生物。本發(fā)明化合物經(jīng)過生物活性測試，其對蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的抑制具有顯著的活性，其ICso值為17.16|iM,可作為蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制劑和胰島素增敏劑，可用于治療II-型糖尿病、肥胖癥及其它由此引起的并發(fā)癥。圖1不同濃度下新木欖二硫醇對PTP1B抑制曲線；圖2新木欖二硫醇對AKT活性的影響；(GADPH代表Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,三磷酸甘油搭脫氫酶，作為westernblot的內(nèi)參。)圖3A沒有胰島素刺激前的GLUT4上膜(左圖是細胞核染料染出的細胞核的圖，右圖是GLUT4上膜的情況)；圖3B加入胰島素刺激的GLUT4上膜(左圖是細胞核染料染出的細胞核的圖，右圖是GLUT4上膜的情況)；圖3C加入胰島素刺激的新木欖二硫醇10濃度下的GLUT4上膜(左圖是細胞核染料染出的細胞核的圖，右圖是GLUT4上膜的情況)；圖4為新木欖二硫醇對GLUT4活性的影響。具體實施方式下面結合實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明不限此。NMR用Bruker-AMX400核磁共振儀測定；EI-MS及HR-EI-MS用Finnigan-MAT-95質(zhì)譜儀測定；柱層析硅膠(100200目，200300目)、薄層硅膠板均為青島海洋化工有限公司或煙臺化工研究所實驗廠生產(chǎn)；SephadexLH-20為E.Merk公司生產(chǎn)；所使用的試劑均為上海振興化工一廠產(chǎn)品。含hPTPlB的催化區(qū)cDNA的質(zhì)粒來自于Chernoff和E.coliBL21(DE3),購自Novagen公司;DMSO購自Fisher公司;SephacylS-200HighResolution和DEAESepharoseFastFlow樹脂購自AmershamBioscience公司；緩沖液IxPBS(140mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HP04,1.8mMKH2P04，pH7.4)、NaCl、KCl、Na2HP04、KH2P04均購自中國醫(yī)藥(集團)上海化學試劑公司；pNPP購自Sigma公司。透明和黑色96孔板購自Corning公司；microplatespectrophotometer購自BIO-RAD公司；待測化合物新木欖二硫醇；溶解對硝基苯磷酸的緩沖液0.1M甘氨酸，pH9.8，內(nèi)含有1mMMgCl2和1mMZnCl2，MgCl2、ZnCl2、NaOH、Tween20和甘氨酸購自中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司。GLUT4質(zhì)粒來自Dr.YousukeEbina,UniversityofTokushima,Japan;F-12HammediumwithGlutamax和FBS購自Gibco乂>司；Penicillin-Streptomycin和Geneticin購自Sigma乂^司；Lipofectamine2000購自Invitrogen公司；CHO細胞系購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；PVDF膜購自Invitrogen公司；Anti-phospho-AKT(Ser473)，anti-myc，anti隱HRP抗體購自CellSignaling公司；INCellAnalyzer1000購自GE公司。如無特殊說明，以下實施例中涉及到的液/液之間比值均為體積百分比。實施例1:新木欖二硫醇的提取與分離紅樹林植物木欖1.4Kg，取其莖葉陰干后粉碎，以工業(yè)曱醇滲漉提取，得到提取浸膏129.0g。將提取浸膏分散于水，水的混懸液依次以石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取部位。乙酸乙酯萃取部位8.7g經(jīng)200目硅膠柱層析，以石油醚/乙酸乙酯100:0—90:10—70:30—50:50—30:70—0:100及氯仿/曱醇90:10—70:30—50:50—0:100梯度洗脫，250ml/份，共得50份，薄層層析檢測，展開劑氯仿/甲醇90:10,其中第2331份Rf值在0.40.6之間，合并后減壓濃縮，即為I組分；I組分l.Og又經(jīng)300目硅膠柱層析，以石油醚/丙酮90:10—80:20—70:30—60:40—50:50梯度洗脫，10ml/份，共100份，薄層層析檢測，展開劑石油醚/丙酮50:50,其中第3751份Rf值在0.4~0.6之間，合并后減壓濃縮，即為II組分；II組分860mg經(jīng)SephadexLH-20柱層析，用MeOH洗脫，5ml/份，共30份，薄層層析檢測，展開劑石油醚/丙酮50:50,其中第2224份Rf值在0.5,合并后減壓濃縮，即得本發(fā)明化合物新木欖二硫醇20mg。EI-MSw/z:154[M]+;HREI-MSm/z:153.9780[Mf(C3H6S203,理論值153.9758)。'HNMR(CD3OD，400MHz)5(ppm):4.82(m，H-4)，3.90(dd，/=4.2，11.7Hz，H-3)，3.76(dd，J-6.0，12.9Hz，H畫5)，3.62(dd，J=0.9,5.7，12.0Hz，H-3),3.42(dd，J-0.6，4.5,12.9Hz,H-5)，氫譜中的CD3OD標準峰在53.29。l3CNMR(CD3OD,75MHz)5(ppm):70.3(C-4)，66.2(C-5)，45.6(C-3),碳譜中CD30D標準峰在549.5。實施例2:新木欖二硫醇衍生物的制備1、新木欖二硫醇甲基化物(R為曱基)的制備稱取新木欖二硫醇樣品5.0mg于10mL圓底燒瓶中，加入溶有3mgCH2N2的乙醚溶液2mL,室溫反應18h，減壓除去乙醚和CH2N2，得新木欖二硫醇的甲基化物(R=CH3)。2、新木欖二硫醇乙?；?R為乙酰基)的制備稱取新木欖二石克醇樣品5.0mg于25mL圓底燒弁瓦中，加入無水吡啶和乙酸酐各1.5mL，室溫反應18h，減壓除去吡啶和乙酸酐，得新木欖二硫醇的乙?；?R-Ac:)。試—險性實施例1:新木攬二硫醇對蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B抑制活性實驗1、試劑的準備1.1溶解pNPP的緩沖液0.1M甘氨酸，pH9.8,內(nèi)含有1mMMgCl2和1mMZnCl2。用無菌的超純凈雙蒸水配制。1.2配制終止反應的Stop-buffer:3MNaOH，用無菌的超純凈雙蒸水配制。1.310xhPTPlB(人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B)催化區(qū)酶蛋白(24.7一)純化得到的人源蛋白酪氨酸磷酸酶1B催化區(qū)酶蛋白經(jīng)透析、濃縮后12000rpm離心10min，用Bradford法測定濃度為24.7fiM。1.4hPTPlB酶反應用緩沖液MOmMNaCl,2.7mMKCl，10mMNa2HPO4，1.8mMKH2P04，調(diào)pH到7.4。用無菌的超純凈雙蒸水配制。1.510xpNPP(26852685iLiMpNPP，用pNPP的溶解緩沖液配制。2、實驗設計:終點法<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>flL2.1化合物新木欖二碌u醇活性測定實驗測試原理對硝基苯磷酸(p-Nitrophenylphosphate,pNPP)是堿性磷酸酶的可溶性底物，在人源蛋白酪氨酸磷酸酶IB(hPTPlB)的催化下，它脫去一個磷酸根，生成黃色可溶產(chǎn)物對硝基苯酚(p-Nitrophenol),該產(chǎn)物在405nM處有光吸收，通過^r測405nM處光吸收的增加可以-險測-粦酸酶的活性。hPTPlB酶反應緩沖液79pL、10xpNPP(2685)10^L、化合物新木欖二硫醇1JUL和10xhPTPlB(24.7)10|tiL在室溫混勻，在30。C反應1小時后加入50|nL終止反應的Stop-buffer終止反應，然后測其在405nM的光吸收。2.2對照實驗酶反應(不加DMSO):hPTPlB酶反應緩沖液80|iL、10xpNPP(2685pM)10pL和lOxhPTPlB(24.7)10iiiL在室溫混勻,在30。C反應1小時后加入50終止反應的Stop-buffer終止反應，然后測其在405nM的光吸收。不加酶反應hPTPlB酶反應緩沖液90pL和10xpNPP(2685|iM)10|iL在室溫混勻，在30。C反應1小時后加入50終止反應的Stop-buffer終止反應，然后測其在405nM的光吸收。酶反應(力。DMSO):hPTPlB酶反應緩沖液79^L、IO化PTPIB(24.7)10pL、DMSO1和10xpNPP(2685)10在室溫混勻，在30。C反應1小時后加入50終止反應的Stop-buffer終止反應，然后測其在405nM的光吸收。2.3ICso值測定實驗將待檢測化合物新木欖二硫醇稀釋成不同濃度，依2.1進行反應所有實驗均設置復孔。結杲示于下列表1及圖1中。表1中第1歹'J(樣品及化合物濃度)為對照實驗和測定的化合物新木欖二硫醇的濃度；第2、3列(A4。5值l，A柳值2)為反應所測得的A柳值(復孔)；第4列(平均值)為2、3列A4Q5值所得平均值；第5列(扣除本底)是由第4列平均值減去"不加酶反應"的A柳平均值所得；第6列(抑制率(未扣除DMSO影響))是將扣除本底后加化合物的A405值除以酶反應的A405值后得到相對的酶活比，以"酶反應，，作為100%的酶活，則用1減去這個相對的酶活比得到抑制率；第7列(抑制率(扣除DMSO影響)是將扣除本底后加化合物的八4()5值除以DMSO對照的A4Q5值后得到相對的酶活比，以"DMSO對照，，作為100%的酶活，則用1減去這個相對的酶活比得到扣除DMSO影響的抑制率。根據(jù)在化合物反應體系中的濃度及其對應的A柳值(扣除DMSO影響)作S型曲線圖1,據(jù)圖1求得其ICso值(使用數(shù)據(jù)處理軟件Origin6,1)。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>結果表明，新木欖二硫醇具有抑制蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B的顯著活性，其IC5o值為17.16nM。試驗性實施例2:細胞水平上的新木欖二硫醇的活性測試測試原理胰島素和細胞膜上的胰島素受體結合后，胰島素受體發(fā)生自磷酸化，啟動下游信號傳導。在信號傳遞過程中，AKT被磷酸化后活化，從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜上，然后再回到細胞質(zhì)，磷酸化下游信號分子。最后，信號傳到了GLUT4(葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4)，GLUT4被活化?；罨腉LUT4進行葡萄糖的轉(zhuǎn)運，從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜上。通過^r測細胞膜上的磷酸化的AKT量和GLUT4上膜的量的變化可以評價化合物在細胞內(nèi)的活性及對細胞內(nèi)胰島素通路的影響。1、試劑的準備所有的試劑都用Milli-Q水配置并過濾(0.22pm)滅菌。F-12HammediumwithGlutamax用Milli-Q水配置，加入1.8mg/L的NaHC03,再調(diào)pH為7.5。SDS-laoding緩沖液(1L):62.5mMTris-HCl(pH6.8)，2%w/vSDS,10%甘油，50mMDTT,0.01%考馬斯亮藍。TBST:2.42gTrisbase,8gNaCl，pH7.6，0.1%v/vTween20。封閉液5g脫脂奶粉加入100mLTBST中。2、實驗過程2.1檢測AKT的活性檢測AKT的活性時使用的一抗是鼠源anti-phospho-AKT(Ser473)抗體，2抗是兔抗鼠的anti-HRP抗體。CHO細胞培養(yǎng)在12孔板里，培養(yǎng)液是F12無血清培養(yǎng)基，內(nèi)加入終濃度為10%的FBS和50U/ml的Penicillin-Streptomycin,培養(yǎng)條件為37°C,5%C02。當細胞長到80%鋪層時加入化合物新木欖二硫醇，使終濃度為10|xmol/L和50pmol/L。化合物新木欖二硫醇和細胞孵育過夜。然后吸去培養(yǎng)基，用PBS洗3遍細胞(0.5mL/孔)，再加入F12無血清培養(yǎng)基，讓細胞進行胰島素饑餓1小時。吸去培養(yǎng)基，用PBS洗細胞3遍(0.5mL/孔)。吸去PBS，加入配在無血清F12培養(yǎng)基中終濃度為1)ug/L的胰島素刺激細胞5分鐘，吸走月夷島素，用PBS洗3遍(0.5mL/孔)，加入SDS-loading緩沖液(50pg/孔)裂解細胞，在冰上迅速刮下細胞，將裂解的細胞放入1.5mL的EP管中，98度加熱10分鐘，再在冰上冷卻。細胞裂解物在4度12000rpm離心10分鐘，吸上清進行蛋白SDS-PAGE(10%SDS-PAGE)電泳，每孔上樣15pL。電泳完后，在4度進行電轉(zhuǎn)膜(轉(zhuǎn)到PVDF膜上)，電轉(zhuǎn)1小時。電轉(zhuǎn)好的PVDF膜在封閉液中室溫封閉1小時，再和相應的一'抗(anti-phospho-AKT(Ser473)，1:1000稀釋度)在4度反應過夜。然后，用TBST緩沖液洗膜，每次在室溫洗15mL，5分鐘，洗3次。吸去TBST，再將PVDF膜和2抗(1:8000稀釋度)在室溫反應1小時。接著用TBST緩沖液洗PVDF膜，每次在室溫洗15mL,5分鐘，洗3次。顯影用的底物是ECL-PLUS.2.2檢測GLUT4上膜穩(wěn)轉(zhuǎn)Pegfpnl-GLUT4-myc的CHO細胞系培養(yǎng)在黑色96孔板里，培養(yǎng)液是F培養(yǎng)液是F12無血清培養(yǎng)基，內(nèi)加入終濃度為10%的FBS和50U/ml的Penicillin-Streptomycin,培養(yǎng)條件為37°C，50/。CO2。當細胞長到80%鋪層時吸去培養(yǎng)基。加入溶解在F12無血清培養(yǎng)基中的化合物新木欖二硫醇(100pL/孔，終濃度為10|iimol/L)?；衔镄履緳於虼己图毎跤^夜。吸去培養(yǎng)基，用配在F12無血清培養(yǎng)基中的胰島素(80nm/L,100iuL/孔)刺激5分鐘。吸去培養(yǎng)基，用PBS洗3遍細胞(100nL/孔，5min/次)。用曱醛(3.7%)室溫固定15分鐘。吸去曱醛，用PBS洗細胞3遍(100iliL/孔，5min/次)。加入一抗，抗c-myc的抗體(1:1000稀釋度)，50^L/孔，4度反應過夜。吸去一抗，用PBS洗細胞3遍(100fiL/孔，5min/次)。加入Cy5-conjugated二抗(10pg/ml)室溫反應1小時，80pL/孔。吸去二抗，用PBS洗細胞3遍(100nL/孔，5min/次)。組后每孔中剩下100inLPBS。上膜的GLUT4的量通過用INCellAnalyzer1000儀器定量Cy5的熒光強度得到(575nm激發(fā)光，620nm吸收光)。2.3對照實馬全檢測AKT的活性時使用的同樣處理的CHO細胞，不加待測化合物新木欖二硫醇。檢測GLUT4上膜時使用的同樣處理的穩(wěn)轉(zhuǎn)GFP-GLUT4的CHO細胞，不加待測化合物新木欖二石克醇。所有實驗均設置復孔。3、實驗結果3.1檢測AKT的活性其結果示于圖2中。結果表明，新木欖二硫醇明顯增敏細胞內(nèi)的胰島素通路信號分子對胰島素信號的響應。根據(jù)westernblot的結果，發(fā)現(xiàn)在胰島素刺激后，細胞中磷酸化的AKT量明顯比未加化合物的對照組細胞增加。3.2檢測GLUT4上膜其結果示于圖3A、3B、3C和圖4中。結果表明，新木欖二硫醇明顯增敏GLUT4對胰島素信號的響應。根據(jù)westernblot的結果，發(fā)現(xiàn)在胰島素刺激后，細胞膜上磷酸化的GLUT4(細胞膜上紅色熒光所表示的)的量明顯比未加化合物的對照纟且細月包i曾力口。權利要求1.一種化學結構式如下的新木欖二硫醇或其衍生物id="icf0001"file="A2006101483490002C1.gif"wi="42"he="24"top="42"left="80"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中，R為氫、C1～C6的烷基或C2～C6的烷?；?、根據(jù)權利要求1所述的新木欖二硫醇或其衍生物，其特征在于，R為氬、C1C4的烷基或C24的烷?；?。3、根據(jù)權利要求1或2所述的新木欖二硫醇或其衍生物，其特征在于，R為氫、曱基或乙酰基-4、根據(jù)權利要求1所述的新木欖二硫醇或其衍生物，其特征在于，其4位碳的絕對構型為R型、S型或R和S的混合構型。5、一種權利要求1所述的新木欖二硫醇或其衍生物的制備方法，該方法包括如下步驟1)紅樹林植物木欖，取其莖葉陰干后粉碎，用醇滲漉提取，得到提取浸膏；其中，所述的醇為甲醇或乙醇；2)將提取浸膏分散于水，水的混懸液依次以石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取，得到石油醚、乙酸乙酯及正丁醇萃取部位；3)對乙酸乙酯萃取部位經(jīng)100200目硅膠柱層析，以石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮或氯仿/曱醇梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層層析檢測，展開劑氯仿/曱醇按體積比90:10，將Rf值在0.40.6間的洗脫液合并濃縮即得I組分；4)步驟3)中的I組分再經(jīng)200~300目硅膠柱層析，以石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮或氯仿Z曱醇梯度洗脫，洗脫液經(jīng)薄層層析檢測，展開劑石油醚/丙酮4姿體積比50:50，將Rf值在0.40.6間的洗脫液合并、減壓濃縮即得n組分；5)步驟4)中的II組分再經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱層析，用氯仿/曱醇或MeOH洗脫，洗脫液經(jīng)薄層層析;險測，展開劑石油醚/丙酮按體積比50:50，將Rf值在0.5的洗脫液合并、減壓濃縮，即得到化合物新木欖二碌u醇；6)化合物新木欖二硫醇通過烷基化反應、?；磻Ⅴセ磻?、或成醚反應，得到其相應的衍生物。6、根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的新木欖二硫醇與CH2N2反應，得到新木欖二硫醇的曱基化物。7、根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述的新木欖二硫醇與乙酸酐反應，得到新木欖二硫醇的乙?；铩?、權利要求1至4任意一項所述新木欖二硫醇及其衍生物在制備治療II-型糖尿病、肥胖癥及其它由此引起的并發(fā)癥的藥物中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術領域：
，涉及一種從紅樹林植物木欖中分離得到的化合物新木欖二硫醇(bruguiesulfurol)、其衍生物及其制備方法和在制備治療II型糖尿病藥物中的應用。本發(fā)明的新木欖二硫醇、其衍生物結構式如下所示，當R為氫時，即為新木欖二硫醇。該化合物及其衍生物經(jīng)過生物活性測試可作為蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B(PTP1B)抑制劑和胰島素增敏劑，它們可用于制備治療II-型糖尿病、肥胖癥及其它由此引起的并發(fā)癥的藥物。文檔編號C07D339/04GK101210009SQ200610148349公開日2008年7月2日申請日期2006年12月29日優(yōu)先權日2006年12月29日發(fā)明者劉海利,旭沈,棋王,郭躍偉申請人:中國科學院上海藥物研究所