專利名稱：：血管生成抑制因子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種血管生成抑制因子的制備方法，具體地講是一種從赤魟魚軟骨中制備有抑制血管生成作用的蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
：原發(fā)性腫瘤的生長、入侵與轉(zhuǎn)移都依賴于腫瘤的血管生成，抑制血管生長、把腫瘤血管作為治療癌癥的新靶點(diǎn)，就有可能有效地控制腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移。許多研究者已發(fā)現(xiàn)有分子量不等的抑制腫瘤生長的活性因子存在，都具有一定的血管生成抑制活性，其中絕大部分來自于鯊魚軟骨。如中國發(fā)明專利98111074.6"鯊魚軟骨血管生成抑制因子及其分離純化方法"即提出了一種鯊魚軟骨血管生成抑制因子，該因子"由鯊魚軟骨經(jīng)分離純化制得，其SDS—PAGE電泳銀染顯示一條帶，其分子量為18000。"該因子的分離純化方法是"將鯊魚軟骨經(jīng)鹽酸胍溶液抽提45—50小時，800rpm離心25—35分鐘，用45—65%的丙酮有機(jī)溶劑分級沉淀；用ResourceQ離子交換層析，得到3個洗脫峰，其中，bufferA:20mMTris-Cl，pH8.5，BufferB:1MNaCI，20mMTris-Cl，pH7.6，收集第3峰，濃縮后進(jìn)行SephacrylS-300分子篩層析，得到3個洗脫峰，收集第3峰，濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE制備電泳，洗脫得到4個峰，再收集第3峰，濃縮干凍，即得白色粉末狀物質(zhì)SCAIF-I。"雖然赤魟亦屬軟骨魚類，其軟骨資源總量遠(yuǎn)高于鯊魚，更有利于用來制備軟骨血管生成抑制因子。但由于赤魟與鯊魚軟骨中的活性蛋白成分及結(jié)構(gòu)差異較多，導(dǎo)致目前尚未形成赤魟軟骨血管生成抑制因子的制備方法
發(fā)明內(nèi)容針對上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是建立一條從赤魟軟骨中提取軟骨血管生成抑制因子的工藝，以提出一種有效的、最優(yōu)化的赤魟軟骨血管生成抑制因子的制備方法。本發(fā)明提供的血管生成抑制因子的制備方法，先將赤魟軟骨粉碎，再經(jīng)抽提、粗分、純化，最后脫鹽，冷凍干燥，獲得赤魟軟骨血管生成抑制因子，其英文縮寫名記為DCAIF-I，射抽提是先將粉碎的赤魟軟骨按1:4一6(g:mL)的比例放置于抽提液中，抽提液中含0.05—0.11^011的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、0.02%的(重量/體積百分比)乙二胺四乙酸(EDTA)和1.0—2.0mol/L的鹽酸胍，隨后將pH值調(diào)至5.4—6.2，于15—30°C下振蕩72h，再于4。C下，10000r/min離心，棄殘?jiān)?，得上清液為赤魟軟骨抽提液；粗分是先將赤魟軟骨抽提液?jīng)超濾獲取分子量在3—200KD的赤魟軟骨血管生成抑制因子粗提液，再將赤魟軟骨血管生成抑制因子粗提液用丙酮作分級沉淀，獲得的沉淀以pH值為7.0—7.6、濃度為0.02mol/L的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)緩沖溶液進(jìn)行透析，再經(jīng)冷凍干燥獲得赤魟軟骨血管生成抑制因子粗制品；純化是取血管生成抑制因子粗制品先用Hitrap26/10Desalting柱進(jìn)行脫鹽，再用HitrapDEAEFF離子交換柱進(jìn)行層析，獲得10個明顯的分離峰，收集第1峰；再用Superdex7510/300GL柱進(jìn)行層析，獲得4個明顯的分離峰，收集第1峰；再用Shim-packVP-ODSHPLC柱進(jìn)行層析，獲得3個明顯的分離峰，收集第1峰。本發(fā)明提供的血管生成抑制因子的制備方法，其中在抽提時，所說的于4'C下，以10000r/min離心，棄殘?jiān)譃閮刹剑词窍仍?'C下，以10000r/min離心25mm，棄殘?jiān)僖陨锨逡豪^續(xù)在4'C下，以10000r/min離心25min，再棄殘?jiān)?。本發(fā)明提供的血管生成抑制因子的制備方法，其中在粗分時，所說的用丙酮作分級沉淀是用一級濃度在20%—80%之間的不同濃度的丙酮溶液對赤魟軟骨血管生成抑制因子粗提液進(jìn)行分級沉淀，并將所有沉淀進(jìn)行合并后作透析。本發(fā)明提供的血管生成抑制因子的制備方法，其中在純化是時，用HitmpDEAEFF離子交換柱層析的洗脫速度為3—6ml/min;用Superdex7510/300GL柱層析的洗脫速度為0.5—1.2ml/min;用Shim-packVP-ODSHPLC柱層析的洗脫流速為0.5—1.2ml/min,其中流動相為35%50%乙腈+0.05%三氟乙酸(TFA)。本發(fā)明提供的血管生成抑制因子的制備方法，所得的DCAIF-I經(jīng)12%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳-考馬斯亮藍(lán)(Coomassieblue)染色法顯示為--條帶，分子量為62KD，等電點(diǎn)約為4.0-5.4。本發(fā)明提供的血管生成抑制因子的制備方法，所得DCAIF-I作抑制雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成的測定，測定方法參考賀國安、羅進(jìn)賢、張?zhí)碓?改進(jìn)的雞胚絨毛尿囊膜技術(shù)一無氣室孵育法"[記載于《中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》，2003年第2冊(第42巻)第126-128頁],測定時濾紙片大小為3mmx3mm;加樣前孵化時間為4天；加樣量DCAIF-I分別為0.1g/L、0.4g/L、0.8g/L;0.01mol/LpH7.6的磷酸鹽緩沖液(PBS)為陰性對照；0.4g/L的硫酸軟骨素(CS)為陽性對照，加樣量為10pL。加樣后繼續(xù)孵化24h,以給藥點(diǎn)為中心，以半徑間隔5mm將CAM劃分為3個區(qū)域，計(jì)數(shù)各區(qū)域的血管數(shù)，其統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見下表<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>比較各劑量組與對照組之間的差異，結(jié)果表明，PBS陰性對照組血管生長良好，血管數(shù)量多而密，與之相比CS陽性對照組血管生長大量減少，管徑較細(xì)且分支少，DCAIF-I處理組與CS陽性對照組呈現(xiàn)相似的結(jié)果，3個記數(shù)區(qū)域內(nèi)的血管數(shù)量均顯著減少，且隨著加樣量的增加血管數(shù)量減少得更加明顯。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)DCAIF-I處理組的血管生成抑制活性較強(qiáng)，DCAIF-I處理組抑制血管生成的效果明顯，CAM上的血管發(fā)生大面積褪色，分枝發(fā)生斷裂，血管密度減少。隨著DCAIF-1量的增加，CAM上血管的數(shù)量減少更加明顯。0.1g/L的DCAIF-I對CAM的抑制率達(dá)56%，與0.4g/L的CS的血管生成抑制效果相當(dāng)。表明DCAIF-I能顯著抑制CAM新生血管生成，DCAIF-I血管抑制活性較現(xiàn)有的血管生成抑制素CS強(qiáng)，并且抑制效果具有一定的濃度依賴性。本發(fā)明所提供的血管生成抑制因子的制備方法，提出了一條從赤魟軟骨中提取血管生成抑制因子的方法，且所制得的DCAIF-I經(jīng)試驗(yàn)?zāi)苡行б种蒲苌?，且有一定的濃度依賴性。該制備方法是一種有效、優(yōu)化、簡約的從赤魟軟骨中提取血管生成抑制因子的方法。圖l、用HitmpDEAEFF離子交換柱進(jìn)行離子交換時所獲得的分離峰圖，其中橫軸為洗脫時間(min)，縱向軸是吸光度值(mAU)，曲線A2801為洗脫曲線；圖2、用Superdex7510/300GL柱進(jìn)行層析時所獲得的分離峰圖，其中橫軸為洗脫時間(min)，縱向軸是吸光度值(mAU)，曲線A2802為洗脫曲線；圖3、用Shim-packVP-ODSHPLC柱進(jìn)行層析時所獲得的分離峰圖，其中橫軸為洗脫時間(min)，縱向軸是吸光度值(V)，曲線A2803為洗脫曲線；圖4、用SDS-PAGE電泳-考馬斯亮藍(lán)染色法顯示圖，縱軸為分子量(KD)，其中泳道1(1)為DCAIF-I電泳條帶，泳道2(2)為標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)；圖5、作抑制CAM血管生成的測定的結(jié)果比較圖，其中3為PBS陰性對照組中一例的照片，4為CS陽性對照組中一例的照片，5為1.0g/LDCAIF-I試驗(yàn)組中一例的照片，6為4.0g/LDCAIF-I試驗(yàn)組中一例的照片，7為8.0g/LDCAIF-I試驗(yàn)組中一例的照片。具體實(shí)施方式本實(shí)施例提供的血管生成抑制因子的制備方法，其過程為1、粉碎赤魟軟骨。2、赤魟軟骨有碎粒1000g和1000mL抽提液混和，抽提液中有8molMES、20gEDTA160mol鹽酸胍，隨后將該混和物的pH值調(diào)至6，于2(TC下振蕩72h，再于4'C、10000r/min轉(zhuǎn)速下離心25min，棄殘?jiān)?，再以所得上清液繼續(xù)在4°C、10000r/min轉(zhuǎn)速下離心25min，再棄殘?jiān)玫缴锨逡骸?、將第2步所得上清液經(jīng)超濾獲取分子量在3—200KD的赤魟軟骨血管生成抑制因子粗提液，依次用25%，35%，40%，50%，60%,70%，80%(重量/體積百分比)的丙酮對所得赤魟軟骨粗提液進(jìn)行分級沉淀，將所得的沉淀混合后，以pH值為7.3、濃度為0.02mol/L的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行透析，再經(jīng)冷凍干燥獲得DCAIF-I粗制品；4、取DCAIF-I粗制品4.1、用Hitrap26/10Desalting柱進(jìn)行脫鹽；4.2、用HitmpDEAEFF離子交換柱進(jìn)行層析，洗脫速度為5ml/min，獲得10個明顯的分離峰，收集第1峰；4.3、用Superdex7510/300GL柱進(jìn)行層析，洗脫速度為0.9ml/min，獲得4個明顯分離峰，收集第1峰；4.4、用Shim-packVP-ODSHPLC柱進(jìn)行層析，洗脫流速為0.9ml/min，其中流動相為40%乙腈+0.05。/。TFA,獲得3個明顯分離峰，收集第1峰。5、用Hitmp26/10Desalting柱進(jìn)行脫鹽。6、冷凍干燥，獲得DCAIF-I晶體。所得的DCAIF-I經(jīng)12%的SDS-PAGE電泳-考馬斯亮藍(lán)染色法顯示為一條帶，分子量為62KD。權(quán)利要求1、一種血管生成抑制因子的制備方法，其特征是先將赤魟軟骨粉碎，再經(jīng)抽提、粗分、純化，最后脫鹽，冷凍干燥，獲得赤魟軟骨血管生成抑制因子，其英文縮寫名記為DCAIF-I，其中抽提是先將粉碎的赤魟軟骨按1∶4-6的比例放置于抽提液中，該比例為重量與體積比，單位是g∶mL，所說抽提液中含0.05-0.1mol/L的MES、重量/體積百分比為0.02％的EDTA和1.0-2.0mol/L的鹽酸胍，隨后將pH值調(diào)至5.4-6.2，于15-30℃下振蕩72h，再于4℃下，10000r/min離心，棄殘?jiān)?，得上清液為赤魟軟骨抽提液；粗分是先將赤魟軟骨抽提液?jīng)超濾獲取分子量在3-200KD的赤魟軟骨血管生成抑制因子粗提液，再將赤魟軟骨血管生成抑制因子粗提液用丙酮作分級沉淀，獲得的沉淀以pH值為7.0-7.6、濃度為0.02mol/L的Tris-HCl緩沖溶液進(jìn)行透析，再經(jīng)冷凍干燥獲得赤魟軟骨血管生成抑制因子粗制品；純化是取血管生成抑制因子粗制品先用Hitrap26/10Desalting柱進(jìn)行脫鹽，再用HitrapDEAEFF離子交換柱進(jìn)行層析，獲得10個明顯的分離峰，收集第1峰；再用Superdex7510/300GL柱進(jìn)行層析，獲得4個明顯的分離峰，收集第1峰；再用Shim-packVP-ODSHPLC柱進(jìn)行層析，獲得3個明顯的分離峰，收集第1峰。2、如權(quán)利要求1所述的血管生成抑制因子的制備方法，其特征是在抽提時，所說的于4℃下，以10000r/min離心，棄殘?jiān)譃閮刹?，即是先?℃下，以10000r/min離心25min，棄殘?jiān)?，再以上清液繼續(xù)在4℃下，以10000r/min離心25min，再棄殘?jiān)?、如權(quán)利要求1所述的血管生成抑制因子的制備方法，其特征在粗分時，所說的用丙酮作分級沉淀是用一級濃度在20﹪—80﹪之間的不同濃度的丙酮溶液對赤魟軟骨血管生成抑制因子粗提液進(jìn)行分級沉淀，并將所有沉淀進(jìn)行合并后作透析。4、如權(quán)利要求1所述的血管生成抑制因子的制備方法，其特征在純化是時，用HitmpDEAEFF離子交換柱層析的洗脫速度為3—6ml/min;用Superdex7510/300GL柱層析的洗脫速度為0.5—1.2ml/min;用Shim-packVP-ODSHPLC柱層析的洗脫流速為0.5—1.2ml/min，其中流動相為35﹪50﹪乙腈+0.05﹪TFA。全文摘要本發(fā)明提供的血管生成抑制因子的制備方法，先將赤魟軟骨粉碎，再經(jīng)抽提、粗分、純化，最后脫鹽，冷凍干燥，獲得赤魟軟骨血管生成抑制因子，簡寫為DCAIF-I其中純化采用HitrapDEAEFF離子交換柱層析、Superdex7510/300GL柱層析、Shim-packVP-ODSHPLC柱層析。本發(fā)明所提供的血管生成抑制因子的制備方法，提出了一條從赤魟軟骨中提取血管生成抑制因子的方法，且所制得的DCAIF-I經(jīng)試驗(yàn)?zāi)苡行б种蒲苌?，且有一定的濃度依賴性。該制備方法是一種有效、優(yōu)化的從赤魟軟骨中提取血管生成抑制因子的方法。文檔編號C07K14/475GK101200496SQ20061015525公開日2008年6月18日申請日期2006年12月12日優(yōu)先權(quán)日2006年12月12日發(fā)明者余新威,羅紅宇申請人:浙江海洋學(xué)院