專利名稱：：特異性抗凝血物質(zhì)的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一類抗凝血物質(zhì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其制備方法和在防治血栓相關(guān)性疾病中的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及抗凝血物質(zhì)與能被某一凝血因子(包括凝血酶、凝血因子Xa等)識(shí)別并裂解的氨基酸序列連接而成的新物質(zhì)，或抗凝血物質(zhì)與其它物質(zhì)通過能被某一凝血因子識(shí)別并裂解的氨基酸序列連接而成的新物質(zhì)，以及這些新物質(zhì)的醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
：心血管疾病是近年來威脅人類健康和生命的頭號(hào)殺手，血栓形成是許多心血管疾病的重要誘因，抗凝劑是防治血栓形成的重要藥物。目前臨床上廣泛應(yīng)用的抗凝劑主要是肝素，其作用是通過與抗凝血酶III(antithrombinIII)結(jié)合來抑制凝血酶(thrombin)的活性，因而可能引起抗凝血酶III的減少，肝素的一個(gè)重要缺點(diǎn)是引發(fā)血小板減少癥(thrombocytopenia)。現(xiàn)在又發(fā)展的低分子量肝素可以減輕肝素應(yīng)用中的風(fēng)險(xiǎn)程度，但不能根本克服它的缺點(diǎn)。水蛭素是近年來歐洲已經(jīng)上市的一個(gè)新型抗凝藥物，它是凝血酶的直接抑制劑，但它對(duì)凝血酶的強(qiáng)抑制作用，可導(dǎo)致凝血相關(guān)參數(shù)，如APTT、TT等急劇升高，從而伴有全身或系統(tǒng)性出血風(fēng)險(xiǎn)?，F(xiàn)有抗凝藥物存在的上迷問題已經(jīng)越來越多的受到人們的關(guān)注，作為一個(gè)理想的抗凝藥物，在全身用藥條件下，應(yīng)當(dāng)具有明確的抗凝抗栓效果，但又不引起出血副作用，使臨床用藥安全性提高。為此，本發(fā)明思想的指導(dǎo)原則的關(guān)鍵是使抗凝刑活性進(jìn)行特異性釋放，即在正常條件下，該類物質(zhì)無抗凝活性，而當(dāng)凝血系統(tǒng)被激活，有血栓形成可能時(shí)，該類物質(zhì)的抗凝活性才在血栓局部釋放，營(yíng)造不易形成血栓的微環(huán)境(即在可能發(fā)生血栓的局部出現(xiàn)抗凝活性)，甚至溶解已形成的微小栓子以達(dá)到防治血栓形成的功能。這就克服了肝素、水蛭素等抗凝劑用藥引起系統(tǒng)性出血的風(fēng)險(xiǎn)。例如水蛭素是由65~66個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽。其氨基端可以與凝血酶催化活性位點(diǎn)結(jié)合，具有抗凝活性，羧基端與凝血酶的底物識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，對(duì)凝血酶有很強(qiáng)的特異性親和作用。本文設(shè)計(jì)了一個(gè)封閉水蛭素氨基末端的措施，以達(dá)到降低水蛭素的抗凝活性的目的。當(dāng)體內(nèi)凝血系統(tǒng)被激活發(fā)生血栓時(shí)，利用血栓發(fā)生過程中引發(fā)的生物化學(xué)變化的特點(diǎn)，使氨基末端被封閉的水蛭素重新回復(fù)為水蛭素原形，在可能發(fā)生或已發(fā)生的血栓的局部發(fā)揮特異性抗凝作用，從而降低出血副作用，成為一類新型的、安全的、有效的抗凝劑。在上述發(fā)明思想的指導(dǎo)下，本文對(duì)水蛭素進(jìn)行了如下修飾在水蛭素的氨基末端連接上可被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽。該水蛭素衍生物在體內(nèi)正常情況下不具有抗凝活性，一旦體內(nèi)凝血系統(tǒng)被激活，則在凝血酶或凝血因子Xa的作用下，釋放水蛭素的抗凝活性，起到抗栓作用。如果在上述水蛭素衍生物的氨基末端再連接上一惰性多肽(如白蛋白)，則可使上述抗凝劑的藥效時(shí)間延長(zhǎng)，成為一個(gè)長(zhǎng)效抗凝劑。當(dāng)然，上述物質(zhì)對(duì)于體內(nèi)不存在血栓的部位，則無抗凝活性。因此，它不同于水蛭素、肝素等抗凝劑，是一類安全、有效的防栓劑。從而，此類特異抗凝劑對(duì)于防治血栓形成的應(yīng)用具有重要意義。發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供無抗凝活性而可以防治血栓形成的物質(zhì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，利用凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別序列連接抗凝血蛋白可實(shí)現(xiàn)對(duì)抗凝血蛋白抗凝活性的封閉。衍生的抗凝血蛋白具有如下的特征抗凝血蛋白如水蛭素的氨基末端被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別序列封閉后，在體外和血液系統(tǒng)非血栓部位沒有抗凝活性，從而避免或減小了因抗凝血蛋白如水蛭素引起的系統(tǒng)出血的副作用；衍生的抗凝血蛋白只有在血栓發(fā)生時(shí)，在特有的凝血酶或凝血因子Xa的作用下才釋放出游離的抗凝血蛋白，發(fā)揮特異性抗凝活性。本發(fā)明基于上述特征的發(fā)現(xiàn)現(xiàn)已完成。因此，本發(fā)明第一方面涉及含有被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白。本發(fā)明再一方面涉及制備含有被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白的方法，其包括將凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別序列對(duì)應(yīng)的堿基序列與抗凝血蛋白基因進(jìn)行連接，另外，將含有被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白基因上接入惰性多肽的基因，然后這些基因構(gòu)建至適合表達(dá)的載體，如pBV220，pPIC9，pPIC9K等，這些含有目的基因的重組栽體在適宜的宿主中表達(dá)，例如在大腸桿菌，酵母或動(dòng)物細(xì)胞體系中表達(dá)而得到新的抗凝血蛋白。本發(fā)明再一方面涉及含有上述抗凝血蛋白及藥用栽體或賦形劑的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"抗凝蛋白"或"抗凝血蛋白"是指能夠抗凝血的蛋白，如水蛭素、抗凝血酶III、蛇毒等，或它們的突變體。優(yōu)選水蛭素或其突變體。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)"凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別的連接肽"或"凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別的寡肽"是指四肽序列IEGR(IleGluGlyArg)或含有IEGR的肽段，或四肽序列LGPR(LeuGlyProArg)或含有LGPR的肽段。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的含有被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白優(yōu)選在水蛭素氨基末端連接上IEGR或LGPR;人白蛋白與水蛭素通過連接肽EFIEGR連接而成的融合蛋白AFH(HSA-EFIEGR-HV2)或人白蛋白與水蛭素通過連接肽EFLGPR連接而成的融合蛋白ATH(HSA-EFLGPR-HV2)。根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的含有被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白可在適宜的宿主系統(tǒng)中表達(dá)，優(yōu)選在大腸桿菌或酵母中表達(dá)。附圖概述圖1顯示FH和TH的核苷酸序列。下面的實(shí)施例用來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不意味著對(duì)發(fā)明的任何限制。實(shí)施例1IEGR-HV2(FH)和LGPR-HV2(TH)的制備及其防治血栓形成功能1.FH和TH蛋白的獲取通過PCR將限制性酶切位點(diǎn)XhoI和凝血因子Xa識(shí)別序列IEGR或凝血酶識(shí)別序列LGPR對(duì)應(yīng)的堿基序列引入HV2基因的上游，在HV2基因下游引入EcoRI酶切位點(diǎn)，將該基因連接到相同酶切的pPIC9質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒pPIC9-FH和pPIC9-TH。將pPIC9-FH和pPIC9-TH和pPIC9K用BamHI和SalI雙酶切后進(jìn)行連接，得到pPIC9K-FH和pPIC9K-TH。將兩個(gè)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化重組到酵母基因組，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)分離純化得到蛋白FH和TH。注在該方法中使用的TH和FH的核苷酸序列為SEQIDNO:1和SEQIDNO:2。2.FH和TH的抗栓作用和出血副作用分析CDFH和TH在Carrageenin誘發(fā)的小鼠尾部血栓模型中的抗栓作用，結(jié)果見表l。___表1FH和TH對(duì)小鼠尾部血栓長(zhǎng)度的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>#P<0.05，與NS組相比每組動(dòng)物15只，結(jié)果以又士S表示。上表說明FH和TH在體內(nèi)具有明確的抗栓功能。②FH和TH在小鼠割尾出血模型中的出血副作用分析，結(jié)果見表2。表2FH和TH對(duì)小鼠割尾后出血時(shí)間的影響組別HV2FH1.,5mg/kg1.5mg/kg6.0mg/kg出血時(shí)間Cs)156.14±125.081532,5±420.74A264.08±209.74569.14±430,1*組別HV2THMb1,,5mg/kg1.5mg/kg6mg/kg出血時(shí)間(s)156.14±125.081532.5±420.74fl241.42±194.49397.31士286.12*每組動(dòng)物15只，結(jié)果以5土S表示。*P<0.05,與NS組相比；△P<0.01,HV2組與其它各組相比從表2可看出，F(xiàn)H和TH大劑量組(6mg/kg)的出血時(shí)間明顯小于HV2的小劑量組(1.5mg/kg)，說明FH和TH的出血副作用明顯低于HV2。實(shí)施例2HSA-EFLGPR-HV2融合蛋白(ATH)和HSA-EFIEGR-HV2融合蛋白(AFH)的制備及其抗栓和抗凝活性在人白蛋白HSA基因上下游分別加上XhoI和EcoRI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建不帶終止密碼子的HSA基因到pPIC9栽體，用BamHI和EcoRI雙酶切上述載體和pPIC9K載體，將HSA連接至pPIC9K栽體上；用PCR方法在水蛭素基因上游加上EcoRI酶切位點(diǎn)和凝血酶/凝血因子Xa識(shí)別序列的編碼堿基，在水蛭素下游引入NotI酶切位點(diǎn)；用EcoRI和NotI雙酶切帶凝血酶/凝血因子Xa識(shí)別序列的水蛭素基因并連接到上述構(gòu)建的帶HSA基因的pPIC9K載體的HSA下游，構(gòu)成融合基因ATH/AFH，得質(zhì)粒pPIC9K-ATH/AFH。線性化pPIC9K-ATH/AFH質(zhì)粒，經(jīng)電轉(zhuǎn)化重組到酵母基因組，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，得到融合蛋白ATH和AFH，融合蛋白含HSA氨基酸序列、凝血酶/凝血因子Xa識(shí)別序列、水蛭素氨基酸序列三個(gè)功能區(qū)。ATH防治大鼠下腔靜脈結(jié)扎所致血栓的作用，見表3和表4。表3ATH對(duì)大鼠下腔靜脈血栓形成的作用組另寸血栓濕重(mg)生理鹽水9.957±4.033HV25.771±2.366*ATH5.667±2.63^#P<0.05,與生理鹽水組相比每組動(dòng)物12只，試驗(yàn)結(jié)果以又土S表示，表4ATH對(duì)大鼠外周血凝血酶時(shí)間(TT)的影響組另'J不同給藥時(shí)間的TT(s)0h0.5hlh1.5h2h3h生理鹽水32±6.033±6.531±6.534±6.032±5.033±5.5HV233±6.5123±43*88士21*65±16*40±8.(T34±6.5ATH32±6.034±6.535±7.034±6.033±6.534±5.5#P<0.05，與給藥前相比表3~4結(jié)果說明HV2及ATH均有抗栓活性，但HV2可引起出血副作用，而ATH無明顯的出血傾向，安全性得到提高。序列農(nóng)〈110〉軍爭(zhēng)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)硏究所〈120〉特異性抗凝血物質(zhì)的制備及其應(yīng)MJ<160>2<210>1<2U>222<212〉隱<213〉TH序列<400>1CTCGAGAAAAGATTGGGTCCAAGAATTACTTACACTGATTGTACAGAATCGGGTCAAAATTTGTGCCTCTGCGAGGGAAGCAATGTTTGCGGTAAAGGCAATAAGTGCATATTGGGTTCTAATGGAAAGGGCAACCAATGTGTCACTGGCGAAGGTACACCGAAGCCTGAAAGCCATAACAACGGCGATTTCGAAGAAATTCCAGAAGAATATTTACAATAA222<210〉2<211>222<212>飄〈213〉FH序列<400>2CTCGAGAAAAGAATCGAAGGTCGTATTACTTACACTGATTGTACAGAATCGGGTCAAAATTTGTGCCTCTGCGAGGGAAGCAATGTTTGCGGTAAAGGCAATAAGTGCATATTGGGTTCTAATGGAAAGGGCAACCAATGTGTCACTGGCGAAGGTACACCGAAGCCTGAAAGCCATAACAACGGCGATTTCGAAGAAATTCCAGAAGAATATTTACAATAA22權(quán)利要求1.含有被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白。2.沖又利要求1的抗凝血蛋白，包含水蛭素、抗凝血酶III、蛇毒等，或它們的突變體。3.權(quán)利要求2的抗凝血蛋白，包含水蛭素或其突變體。4.權(quán)利要求1的含有被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白，其中寡肽為能被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別的氨基酸序列，或含有能被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別序列的氨基酸序列。5.權(quán)利要求4的含有被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白，其中寡肽為能被凝血因子Xa識(shí)別的氨基酸序列IEGR或含有IEGR的肽段，或?yàn)槟鼙荒缸R(shí)別的氨基酸序列LGPR或含有LGPR的肽段。6.權(quán)利要求1的含有被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白，其為在水蛭素N末端連接IEGR或LGPR的抗凝血蛋白FH和TH;人白蛋白與水蛭素通過寡肽EFIEGR連接而成的融合蛋白AFH(HSA-EFIEGR-HV2)或人白蛋白與水蛭素通過寡肽EFLGPR連接而成的融合蛋白ATH(HSA-EFLGPR-HV2)。7.制備含有被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白的方法，其包括將編碼IEGR或LGPR的堿基序列引入抗凝血蛋白基因的上游，通過EFIEGR或EFLGPR序列對(duì)應(yīng)堿基將人白蛋白基因與水蛭素基因連接而成融合蛋白基因，然后這些基因在大腸桿菌，酵母或動(dòng)物細(xì)胞體系中表達(dá)。8.含有被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白及藥用載體或賦形劑的藥物組合物。全文摘要本發(fā)明涉及含有被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的寡肽的抗凝血蛋白，更具體地說，本發(fā)明涉及抗凝血物質(zhì)與能被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的氨基酸序列連接而成的新的抗凝血物質(zhì)，或抗凝血物質(zhì)與其他物質(zhì)通過能被凝血酶或凝血因子Xa識(shí)別并裂解的氨基酸序列作為寡肽連接而成的新物質(zhì)，以及這些新的抗凝血物質(zhì)的醫(yī)藥學(xué)用途。文檔編號(hào)C07K14/81GK101190945SQ20061016315公開日2008年6月4日申請(qǐng)日期2006年11月29日優(yōu)先權(quán)日2006年11月29日發(fā)明者于愛平,吳祖澤,張傳領(lǐng)申請(qǐng)人:中國(guó)人民解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