專利名稱：阿徹瑞克酸的分離、阿徹瑞克酸衍生物的合成以及阿徹瑞克酸及其衍生物用于治療良性 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從生物材料中分離阿徹瑞克酸，阿徹瑞克酸衍生物及其化學(xué)合成，以及阿徹瑞克酸和其衍生物用于治療良性前列腺增生和/或前列腺癌(特別是抵抗治療性前列腺癌(therapy-resistant prostatecarcinoma))以及脊延髓肌萎縮癥的治療或者藥物制備的用途。本發(fā)明尤其涉及，在用于治療良性前列腺增生和/或前列腺癌，特別是對(duì)于抵抗治療性前列腺癌和脊延髓萎縮癥的治療或者藥物制備的新型活性物質(zhì)的開發(fā)中，阿徹瑞克酸及其衍生物作為先導(dǎo)物質(zhì)(lead substance)的用途。

背景技術(shù)：
良性前列腺增生(BPH)是前列腺移行帶中的結(jié)締組織和平滑肌腺上皮的良性增生。50％的60歲以上男性受BPH的困擾，在75歲以上的男性中，這個(gè)百分比超過了75％。因此，BPH是形成男性膀胱功能障礙的最常見類型的原因。
BPH的癥狀包括障礙性和刺激性不適。障礙性癥狀包括尿流減小、排尿時(shí)間延長(zhǎng)、尿液滴漏和殘留，而刺激性癥狀表現(xiàn)為排尿頻率增加、排尿疼痛和急迫性失禁。關(guān)于BPH的病因?qū)W，存在各種目前正在被討論的假說。
前列腺癌是困擾西方男性的最常見的癌癥，并且被稱為排在肺癌之后的第二大最常見的癌癥死亡原因。雖然，在病因?qū)W中，前列腺癌與BPH不直接相關(guān)，但是患有嚴(yán)重的BPH的患者顯示出與前列腺癌癥患者非常相似的基因異常。雖然BPH首先影響前列腺的移行帶，但是癌癥更適宜發(fā)生在外周帶。
發(fā)生前列腺癌的原因是可能由于家族因素(引起的)多種基因缺陷。因此，雄激素受體的多種突變發(fā)生于患有前列腺癌的人中。但是，5α-還原酶II型活性的降低減小了發(fā)生癌癥的危險(xiǎn)。而且，不同的腫瘤抑制基因，例如在染色體13q上的Rb基因，會(huì)受突變的影響，并且因此能使其變得失去活性。另一方面，致癌基因的機(jī)能亢進(jìn)促進(jìn)腫瘤的形成。另外，通過重要的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)和解毒基因的甲基化作用而起到了顯著的作用，因此上述基因變得不起作用而易得癌癥。根據(jù)科學(xué)的最新情況，引起腫瘤前或者腫瘤損傷的炎癥過程有較大貢獻(xiàn)。
治療前列腺癌的最初療法通常是以根治性前列腺切除術(shù)摘除前列腺，或者以放射療法除去退化細(xì)胞。晚期轉(zhuǎn)移性前列腺癌可以通過緩和性激素療法治療。如今所應(yīng)用的全部雄激素阻斷包括手術(shù)和化學(xué)閹割的結(jié)合。純的抗雄激素劑必卡他胺(bicalutamide)(Casodex)、氟他胺(flutamide)(Fugerel)和尼魯米特(nilutamide)(Anandron)選擇性地作用于靶器官的雄激素受體，而環(huán)丙氯地孕酮(Androcur)也占據(jù)黃體酮受體和糖皮質(zhì)激素受體。但是，激素療法不能醫(yī)治晚期前列腺癌。最初的治療引起腫瘤的生長(zhǎng)抗雄激素依賴性抑制。但是，平均兩年以后，發(fā)生對(duì)該治療的抵抗力。首先，多種輔激活物的高效表達(dá)能夠通過非雄激素類固醇使雄激素受體活化。稍后，即使例如活性氟他胺代謝物、2-羥基氟他胺的抗雄激素能夠活化雄激素受體，而腫瘤也會(huì)變得對(duì)雄激素?zé)o依賴。
因此，本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)一種用于治療BPH和/或前列腺癌的新型活性物質(zhì)，特別是這種活性物質(zhì)可抑制雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。
脊延髓肌萎縮癥(SBMA)是神經(jīng)變性疾病或者與遺傳的神經(jīng)性肌肉障礙，其與肌肉萎縮有關(guān)并且只困擾男性。位于脊髓中并且其作用延伸至肌肉的外周運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(脊柱前角細(xì)胞)的死亡導(dǎo)致了肌肉的萎縮、肌無力(局部麻痹)、不隨意肌抽搐(自發(fā)性收縮)和顫抖(顫動(dòng))。肌無力最初影響近側(cè)區(qū)(上臂、大腿)。如果位于腦干(延髓)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，更確切地說，大腦皮層的神經(jīng)細(xì)胞與脊髓的連接受到影響，發(fā)聲肌、咀嚼肌和吞咽肌也會(huì)虛弱。另外，中樞運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)障礙導(dǎo)致肌肉緊張度增加(痙攣性麻痹)。
脊延髓肌萎縮癥的遺傳原因被認(rèn)為是位于決定性別的染色體X上的雄激素受體基因外顯子1中的CAG堿基三聯(lián)體(base triplet)數(shù)量增加。這導(dǎo)致雄激素受體中聚谷氨酰胺區(qū)域的擴(kuò)張。這種病理改變的雄激素受體長(zhǎng)期聚集，在細(xì)胞核中形成內(nèi)含物，并且可能導(dǎo)致神經(jīng)元的死亡。
細(xì)胞核中病理改變的雄激素受體的配體依賴性聚集是脊延髓肌萎縮癥的發(fā)病原因。具有增加數(shù)量的CAG堿基三聯(lián)體的人雄激素受體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠顯現(xiàn)出明顯不同于雄性實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)損傷。與SBMA(癥狀)類似的這些大鼠的(神經(jīng)肌肉)損傷可以通過閹割減輕痛苦，或者通過睪酮的給藥而惡化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果導(dǎo)致了SBMA患者的雄激素受體的失活可以減輕該疾病的發(fā)展的假設(shè)。用雄激素和雄激素拮抗劑也可檢查其雄激素受體的集合體的配體結(jié)合的重要性用睪酮刺激。表達(dá)病理改變的雄激素受體的細(xì)胞的睪丸酮刺激作用導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中特征性的內(nèi)含物。相反，當(dāng)用部分雄激素拮抗劑環(huán)丙孕酮酯治療這些細(xì)胞時(shí)，只觀察到少量?jī)?nèi)含物，并且當(dāng)用氟他胺治療這些細(xì)胞時(shí)，沒有內(nèi)含物。這些觀察支持了雄激素拮抗劑能夠防止形成雄激素聚集體的假設(shè)。但是，迄今為止，沒有證據(jù)表明，雄激素受體聚集體的形成是脊延髓肌萎縮癥形成的原因。
因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的是尋找用于治療脊延髓肌萎縮癥的新型活性物質(zhì)。
本發(fā)明的目的是通過從非洲李樹非洲臀果木(P.africana)的樹皮中分離出具有抗產(chǎn)雄性征的活性物質(zhì)而實(shí)現(xiàn)。
令人驚奇的是，這種物質(zhì)阿徹瑞克酸是從非洲臀果木(P.africana)的樹皮或者生長(zhǎng)在非洲臀果木(P.africana)的樹皮上的地衣中分離出來的，并且發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)具有高的抗產(chǎn)雄性征的活性。阿徹瑞克酸甚至能夠抑制對(duì)羥基氟他胺治療沒有作用的前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。另外，可以證實(shí)，阿徹瑞克酸對(duì)兩種雌激素受體(雌激素受體α(ERα)和雌激素受體β(ERβ))具有拮抗作用。
除了例如多沙唑嗪(doxazosin)(Cardura)的α腎上腺素受體阻斷劑和例如非那司提(finasteride)(Propecia)的5α還原酶抑制劑之外，存在很多用于BPH的藥物治療的市售可得的植物藥物。Debat公司的制劑太得恩(Tadenan)包含從非洲臀果木(Prunus africana(Hook.f.)Kalkm.(非洲刺李(Pygeum Africana))的氯仿提取物。自1969年以來，法國(guó)已批準(zhǔn)用于治療良性前列腺增生，并且同時(shí)在意大利和美國(guó)也已經(jīng)變得普遍。但是，在德國(guó)還沒有批準(zhǔn)這種氯仿提取物。在那些國(guó)家，已經(jīng)批準(zhǔn)來自美國(guó)沙巴棕(American saw palmetto(Sabal serrulata＝Serenoa repens，Permixon))的果實(shí)、來自大蕁麻(stinging mettle(Urtica dioica))的根、來自南瓜(Cucurbita pepo)子、黑麥(Secale cereale)花粉以及來自非洲百合(Hypoxis rooperi)的根的提取物和制劑用于BPH的治療。
具有過時(shí)的植物分類學(xué)名稱非洲刺李(Pygeum africana(Hook.f.)的非洲臀果木(Prunus africana(Hook.f.)Kalkm.)是薔薇科(Rosaceae)中梅亞科(Prunoideae)的成員。梅亞科包含具有核果的木本植物。梅屬(Prunus)是這個(gè)亞科中最廣泛的屬；其包括例如甜櫻桃(Prunus aviumL.)、桃(Prunus persica L.)、歐洲李(Prunus domestica L.)和扁桃(Prunusdulcis(Mill.)D.A.Webb)。非洲李樹非洲臀果木是在非洲大陸上發(fā)現(xiàn)的該屬的唯一種，并且因此在其成分上應(yīng)該不同于同一亞科的其它成員。
因?yàn)閮H當(dāng)所有活性物質(zhì)已知，包括其確切作用強(qiáng)度時(shí)，能夠使包含大量成分的提取物標(biāo)準(zhǔn)化，并且因?yàn)檫@種提取物對(duì)生物體引起較大的應(yīng)激反應(yīng)，所以本研究的目的是從非洲臀果木的樹皮中分離出抗產(chǎn)雄性征活性的天然物質(zhì)。進(jìn)一步目的是在從非洲臀果木分離出的抗產(chǎn)雄性征的活性的物質(zhì)的基礎(chǔ)上，制備新型抗產(chǎn)雄性征的活性的物質(zhì)。



圖1顯示了來自非洲臀果木的不同提取物在螢光素酶測(cè)定法中對(duì)雄激素活性的抑制作用。
圖2顯示了來自非洲臀果木的選擇性二氯甲烷提取物的各級(jí)分的抗產(chǎn)雄性征的作用。
圖3圖示了從選擇性二氯甲烷提取物的F8級(jí)分分離出的化合物的抗產(chǎn)雄性征的作用。
圖4圖示了阿徹瑞克酸對(duì)人前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。
圖5為阿徹瑞克酸(AA)和阿徹瑞克酸衍生物(A1～A6)的結(jié)構(gòu)式的表示。
圖6顯示了以10-6M濃度的阿徹瑞克酸(AA)的合成結(jié)構(gòu)變體的螢光素酶測(cè)定法結(jié)果。
圖7圖示了具有與阿徹瑞克酸結(jié)構(gòu)相似性的化合物的抗產(chǎn)雄性征的作用。
圖8圖示了在雌激素受體β上阿徹瑞克酸的拮抗作用。
圖9圖示了在雌激素受體α上阿徹瑞克酸的拮抗作用。

具體實(shí)施例方式 首先，比較不同的刺李(Pygeum)提取物的抗產(chǎn)雄性征的效力。接著用活性度引導(dǎo)的分級(jí)的方式分離活性化合物。對(duì)于非洲臀果木樹皮材料的選擇性分級(jí)，首先制備選擇性提取物。
通常，植物藥品的成分的特征在于，在大量最多樣化的化合物中表現(xiàn)出高度的生物多樣性。然而，為了獲得具有易處理數(shù)目的成分的提取物，根據(jù)在極性遞增的溶劑中的溶解度，證明進(jìn)行預(yù)分級(jí)是有益的。由于在極性范圍的限定和較低濃度物質(zhì)的濃縮，生成的選擇性提取物較易于色譜分析處理，因此隨后的進(jìn)一步分離，最終能夠分離活性成分。
在本研究中，進(jìn)行兩次選擇性提取的步驟。篩分已經(jīng)被弄成小片的植物原料，接著使用Ultra-Turrax在正己烷中進(jìn)一步減小尺寸，最后填充在兩側(cè)用鋼釉料閉合的不銹鋼柱(40×10cm和80×10cm)內(nèi)。用HPLC泵，根據(jù)增大的極性(正己烷、二氯甲烷、甲醇、甲醇/水(50/50)和水)使溶劑流經(jīng)填充柱。在各情況下，進(jìn)行提取以抽空，然后制得的提取物在減壓下收縮至干燥。這種提取法是非常緩和的，以便防止溫度應(yīng)力和氧與光度對(duì)藥物的直接作用。但是，重要的是，根據(jù)極性在有序提取物中對(duì)成分進(jìn)行預(yù)分類，并且因此能夠更容易地對(duì)成分進(jìn)行色層分離。
考慮到提取物總量中選擇性提取物的質(zhì)量比，清楚的是，植物原料主要包括甲醇可溶成分。正己烷和二氯甲烷中的親脂性提取物的量不顯著。通常，己烷提取物中包含的樹脂、油脂、脂肪或者脂肪類物質(zhì)。因此，在這些提取物中發(fā)現(xiàn)來自非洲臀果木的長(zhǎng)鏈醇和脂肪酸。可以假設(shè)二氯甲烷提取物包含植物甾醇和五環(huán)三萜。但是，例如氨基酸、無機(jī)鹽或者糖類的高極性植物成分只能以甲醇/水或者水提取。
除了選擇性提取物之外，也制備了非洲臀果木樹皮的乙醇完全提取物。為了這一目的，對(duì)300g在無水乙醇中的篩分植物材料使用Ultra-Turrax進(jìn)一步進(jìn)行減小尺寸，并且以總量5l乙醇在各部份中提取。然后，過濾提取物并且最終在減壓下收縮至干燥。
用在以下被命名為螢光素酶測(cè)定法的雄激素依賴性受體MMTV-luc報(bào)道基因測(cè)定法測(cè)定制得的提取物的潛在抗產(chǎn)雄性征的效力。
在這種測(cè)試法中，螢光素酶起報(bào)道基因的作用。螢光素酶是北美螢火蟲Photinus pyralis中的氧化還原酶，其在大氣氧氣ATP和Mg2+離子存在下使底物蟲螢光素脫水成氧化螢光素。在該過程中發(fā)出的能量以光(的形式)放出。
報(bào)道基因螢光素酶位于質(zhì)粒pMMTV-luc(MMTV＝小鼠乳癌病毒)中，其也位于雄激素反應(yīng)性元素(ARE)中。將質(zhì)粒pMMTV-luc與雄激素受體表達(dá)載體一起轉(zhuǎn)染猴腎成纖維細(xì)胞。如果向其中加入雄激素，那么這種雄激素將在與雄激素受體復(fù)合物中的雄激素反應(yīng)性元素結(jié)合。隨后，這一過程起始下列基因的轉(zhuǎn)錄，換句話說，螢光素酶報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)添加蟲螢火素時(shí)，表達(dá)螢光素酶的量與釋放的光的量成正比，并且可以通過測(cè)量λ＝562nm處的發(fā)射，對(duì)光的量定量。如果除了雄激素之外，還存在抗產(chǎn)雄性征的物質(zhì)或者抗產(chǎn)雄性征的提取物，通過雄激素反應(yīng)性元素的螢光素酶報(bào)道基因的反式激活作用會(huì)被抑制，隨后，當(dāng)加入底物時(shí)，釋放出相對(duì)較少量的光能。因?yàn)楣饬康臏p少與抗雄激素的抑制作用成正比，這種測(cè)定法非常適用于新型抗產(chǎn)雄性征先導(dǎo)物質(zhì)的尋找。
隨后采用螢光素酶測(cè)定法在兩種濃度(300μg/ml和600μg/ml)下測(cè)定提取物的抗產(chǎn)雄性征的生物活性。為了評(píng)估，抗產(chǎn)雄性征的作用計(jì)算為其中僅加入純?nèi)軇┑膶?duì)照的抑制作用百分?jǐn)?shù)。隨后對(duì)最有效的提取物進(jìn)行進(jìn)一步活性引導(dǎo)分級(jí)。
圖1顯示了來自非洲臀果木的選擇性己烷提取物具有弱的抗產(chǎn)雄性征的活性，這大概是由于高含量的游離和酯化脂肪酸以及長(zhǎng)鏈醇引起的。
來自非洲臀果木的選擇性二氯甲烷提取物在測(cè)定中顯示出最高的抗產(chǎn)雄性征的作用；因此，選擇這種提取物用于進(jìn)一步的活性引導(dǎo)分級(jí)。
隨著選擇性刺李提取物的親水性的增大，抗產(chǎn)雄性征的活性顯著降低。
另一方面，來自非洲臀果木的乙醇完全提取物顯示出強(qiáng)的作用。這表明用乙醇提取出與選擇性二氯甲烷提取物提取的相同的抗產(chǎn)雄性征的物質(zhì)。因?yàn)樵谶@種提取物中能夠成功地完成具有活性物質(zhì)的濃縮，所以后者甚至更有效力。
在多種物質(zhì)的復(fù)雜混合物中的活性化合物的尋找中，已證實(shí)活性引導(dǎo)分級(jí)方法是有用的。為了這一目的，首先測(cè)試植物提取物的生物活性。當(dāng)發(fā)生作用時(shí)，通過色層分離的方式分離該樣品，并且再次測(cè)試所有級(jí)分的活性。通常，活性不會(huì)分布于所有級(jí)分，但是可以在少數(shù)清楚確定的級(jí)分找到，因?yàn)樵谶@些級(jí)分中已經(jīng)發(fā)生了活性物質(zhì)的聚集。然后，選擇活性級(jí)分，并且用其它分離方法進(jìn)一步分級(jí)。用逐漸增加地特定分離方法重復(fù)這一過程直到最終已經(jīng)分離出該活性物質(zhì)。不同分離方法(選擇性提取法、通過搖出的提取法(extraction by shakingout)、正相色層分離法和反向色層分離法)的結(jié)合減少了分級(jí)步驟的數(shù)目，并且因此減少了所需的時(shí)間。然后使用多種分析方法對(duì)分離的物質(zhì)(單獨(dú)物質(zhì)以及所有化合物的混合物)進(jìn)行鑒定和定量，并且最終測(cè)定它們作為單獨(dú)的物質(zhì)和所有活性化合物的混合物的效力。如果在參考物質(zhì)和從提取物中分離的化合物之間存在對(duì)應(yīng)性，認(rèn)為證實(shí)了鑒定物質(zhì)。
這種方法也應(yīng)用于本研究中。首先，選擇顯示出最高效力的提取物。這是非洲臀果木的選擇性二氯甲烷提取物，其已根據(jù)由于選擇性提取的方法進(jìn)行了預(yù)分級(jí)。通過梯度提取色譜法-正相色層分離法對(duì)提取物進(jìn)行進(jìn)一步分級(jí)。
為了原油蒸餾殘?jiān)姆旨?jí)，開發(fā)出提取色譜的方法。其可用于分離復(fù)雜混合物，其成分包含了寬范圍的極性。以粗糙的不連續(xù)梯度將該復(fù)雜混合物分離為易處理數(shù)目的級(jí)分，各級(jí)分具有比前一級(jí)分更小范圍的極性。這致使在各自的級(jí)分中確定極性的物質(zhì)的聚集。為了分離植物提取物，通過將樣品區(qū)域特別減小至幾厘米，改進(jìn)了這種方法。這樣，可能在相對(duì)短的時(shí)間周期內(nèi)分級(jí)大量的提取物。
在提取色譜法中，首先將提取物溶解于適當(dāng)?shù)娜軇⑶乙源蠹s5倍的粗硅膠的量進(jìn)行吸附。為了這一目的，將硅膠與澄清的提取物溶液相結(jié)合，用超聲處理該混合物，此后以緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)的活塞在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中除去溶劑，直到殘留干燥的可流動(dòng)物質(zhì)。這一過程致使在硅膠上對(duì)樣品分子預(yù)分類。最初，硅膠的最大極性的硅烷醇基在其表面上吸附最高極性的樣品分子。這一極性化合物的新表面從提取物中依次吸附極性稍微小一些的物質(zhì)。這致使在硅膠孔中數(shù)層極性減小的樣品分子。這樣，最無極性的物質(zhì)位于新的孔表面。從此不可避免地導(dǎo)致溶解的提取物的量必定位于單一部分的硅膠中，而不是若干個(gè)部分，因?yàn)榉駝t，對(duì)于每個(gè)部分，在收回溶劑之后，該物質(zhì)的全部極性將再次吸附于其中。將含有吸附的提取物的硅膠填充入在精制硅膠(Macherey-Nagel Si60，15-25μm)的色譜床的前面的分離柱。如果隨后用親脂性洗脫液使溶劑梯度發(fā)生，那么最初將只有親脂性物質(zhì)溶解在表面，并且流至色層分離床。在該梯度過程中，提高洗脫液的極性以便此刻色層分離可獲得極性遞增的物質(zhì)。這樣，硅膠上樣品分子的預(yù)分類能夠使大量物質(zhì)分級(jí)。由于樣品分子不會(huì)突然進(jìn)入分離床，而是逐漸地在不同極性的基團(tuán)中分類，所以應(yīng)防止分離床的超負(fù)荷。
用不同梯度以一系列預(yù)試驗(yàn)的方式確定最適于選擇性二氯甲烷提取物的溶劑梯度。如在選擇性提取中，選擇正己烷作為最親脂性的溶劑組分。在進(jìn)一步的梯度過程中，由于畢竟用該溶劑制備的提取物的分離用二氯甲烷是最成功的，應(yīng)該緩慢并均勻地?fù)胶隙燃淄?。隨后，在相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)加入甲醇的摻合物和最終的水摻合物，這是由于幾乎不能假設(shè)，在二氯甲烷提取物中會(huì)發(fā)現(xiàn)這一極性的化合物。為了防止酸性化合物的離解，向所有洗脫液中加入0.1％三氟乙酸。
以來自非洲臀果木的選擇性二氯甲烷提取物進(jìn)行兩次制備規(guī)模的色譜提取(提取色譜1＝E1和提取色譜2＝E2)。升高到大規(guī)模需要調(diào)節(jié)柱尺寸和洗脫液流速。使用硅膠填充的不銹鋼柱(Merck Prepbar40×10cm)作為柱。該柱的裝填借助于壓入工具和可變動(dòng)柱頂端壓緊。包含吸附提取物的樣品區(qū)位于色層分離管的較低部分。為了防止起泡，用HPLC泵以120ml/min的流速從底部至頂部抽出洗脫液。
用HPLC分析測(cè)試從制備梯度提取色譜中制得的35個(gè)級(jí)分(表1)的成分，并互相比較級(jí)分以及與未分級(jí)的選擇性二氯甲烷提取物比較。在這一過程中，以相同的量對(duì)所有級(jí)分進(jìn)行色層分離，以便能夠在UV吸收和色譜表面的基礎(chǔ)上，可以進(jìn)行單獨(dú)級(jí)分中的相同化合物的濃度的直接比較。
當(dāng)將提取色譜級(jí)分的色層分離譜與色層分離總分析(chromatographic overview)相比較時(shí)，可以清楚的看到，提取色譜在完成從其它級(jí)分成分的物質(zhì)分離是成功的。一些物質(zhì)在相應(yīng)的級(jí)分中有效地聚集。
對(duì)35個(gè)級(jí)分進(jìn)行螢光素酶測(cè)定以測(cè)定其抗產(chǎn)雄性征的活性。以30μg/ml和60μg/ml的濃度測(cè)定所有級(jí)分。正如圖2所示，在35個(gè)級(jí)分中的三個(gè)被證實(shí)是非常有效的，即相鄰的級(jí)分F6、F7和F8。
比較級(jí)分F6、F7和F8的HPLC色層分離譜相比較，觀察到三個(gè)級(jí)分都具有非常相似的成分特征。與未分級(jí)的選擇性二氯甲烷提取物比較，峰數(shù)明顯減少。在39分鐘的保留時(shí)間處雙峰特別突出，沒有發(fā)現(xiàn)任何其它的32個(gè)級(jí)分。這一事實(shí)導(dǎo)致一種假設(shè)，由雙峰表示的兩種物質(zhì)中的一種或者它們兩者可能是非洲臀果木的活性成分。
為了獲得抗產(chǎn)雄性征的活性物質(zhì)，必須進(jìn)行最后分離階段，即從抗產(chǎn)雄性征的活性提取色譜級(jí)分中進(jìn)一步分離。
選擇三個(gè)級(jí)分F6、F7和F8中的足量的級(jí)分F8進(jìn)行進(jìn)一步制備分離。通過適應(yīng)柱尺寸和流速，縮短分析分離法并且將其轉(zhuǎn)化為制備級(jí)。在數(shù)個(gè)分離之后，可以獲得用于螢光素酶測(cè)定的足量的物質(zhì)P3、P5、P7、P9和P10。
以螢光素酶測(cè)定法的方式，測(cè)試分離物質(zhì)P3、P5、P7、P9和P10的抗產(chǎn)雄性征的作用。結(jié)果示于圖3。
從圖3可以清楚地看出，物質(zhì)P9和P10是非洲臀果木的抗產(chǎn)雄性征的活性化合物。在螢光素酶測(cè)定法中，化合物P5顯示出適中的抗產(chǎn)雄性征的活性，P3被證實(shí)產(chǎn)雄性征弱，而P7沒有被觀察到顯著的作用。
在F8的制備分離之前，級(jí)分被溶解于色層分離初始條件(20％乙腈(ACN)，80％水)的溶劑混合物。剩下的殘余物可以被過濾掉，并且也可以通過將其溶解于乙醇/DMSO進(jìn)行測(cè)試。在螢光素酶測(cè)定中，該殘余物未顯示出作用。
使用1H-NMR、13C-NMR、UV、IR和EI-MS光譜的圖像表征物質(zhì)P9的結(jié)構(gòu)。P9被鑒定為甲基-2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸酯，其也可被命名為甲基-β-苔黑酚羧酸酯，俗稱阿徹瑞克酸?！八帷钡拿行┱`導(dǎo)，因?yàn)榘厝鹂怂岬聂人峁δ芪匆云溆坞x形式存在，而是以甲醇酯化。然而，由于(具有)兩個(gè)酚羥基和苯羰基，阿徹瑞克酸的確具有酸的性質(zhì)。阿徹瑞克酸(AA)的結(jié)構(gòu)式示于圖5。
阿徹瑞克酸從級(jí)分F8中分離為無色針狀結(jié)晶。該物質(zhì)具有特殊的木頭般氣味。除了甲氧基羰基的吸收帶之外，氯仿中的阿徹瑞克酸溶液的IR光譜顯示出兩個(gè)羥基譜帶。在vmax＝3040cm-1處的OH化學(xué)價(jià)振動(dòng)表明在C-2位置處的羥基和羰基之間的分子形成的分子內(nèi)氫橋的存在。當(dāng)稀釋該溶液時(shí)，該譜帶保持在相同的位置。但是稀釋樣品時(shí)，在vmax＝3400cm-1處的OH化學(xué)價(jià)的振動(dòng)吸收帶移向更大的波數(shù)，這表明分子間氫橋的存在。稀釋造成在C-4處的羥基和第二分子的羰基之間的分子間氫橋斷開，引起OH基鍵合強(qiáng)度增大以致需要更高的能量以激發(fā)該化學(xué)價(jià)振動(dòng)。
在1H-NMR光譜中，分子內(nèi)氫橋也是可見的。包含在分子間氫橋內(nèi)的C-2處的羥基的質(zhì)子信號(hào)通常是尖銳的，并且向深度場(chǎng)(δ＝11.98ppm)強(qiáng)烈移動(dòng)。在HD交換的情況下，這一質(zhì)子不會(huì)以與C-4處其它羥基的質(zhì)子的情況相同的程度被氘所代替。這一事實(shí)顯示，與分子間橋相比，分子間橋必須非常強(qiáng)。在1983年阿徹瑞克酸的結(jié)晶結(jié)構(gòu)的圖像被成功記錄。
阿徹瑞克酸的1H-NMR光譜顯示6個(gè)單峰。甲基信號(hào)位于δ＝2.03ppm和δ＝2.39ppm位移。在位移的具有三個(gè)質(zhì)子的信號(hào)強(qiáng)度的單峰表明了在δ＝51.8ppm和δ＝172.6ppm處，由13C-NMR光譜中的信號(hào)所確定的甲氧基羰基。13C-NMR光譜顯示出在δ＝7.6ppm C-3處甲基信號(hào)的極高場(chǎng)位移，這能夠被相鄰C原子上的兩個(gè)羥基的強(qiáng)電子吸引作用所解釋。可以用HMBC實(shí)驗(yàn)(HMBC＝異核多鍵相關(guān)(Heteronuclear Multiple Bond Correlation))確定甲基的這一位置，這顯示出在其光譜中，對(duì)于在具有C-2和C-4的C-3甲基質(zhì)子之間的3J(C，H)偶合的交叉信號(hào)。
通過HMQC光譜(HMQC＝異核多量子相關(guān)(Heteronuclear MultipleQuantum Coherence))的記錄實(shí)現(xiàn)相應(yīng)碳原子的所有質(zhì)子的分配。
阿徹瑞克酸的EI質(zhì)譜在m/z 196產(chǎn)生分子離子峰。通過質(zhì)量的精細(xì)鑒定可以確定化學(xué)式C10H13O4。該光譜也顯示出阿徹瑞克酸的兩個(gè)特征片段離子峰。通過甲醇的分離在m/z 164形成片斷離子，其中甲氧基羰基的甲基形成具有在C-2的羥基的質(zhì)子的甲醇，然后其作為所述的甲醇分離。這對(duì)于水楊酸甲酯局部結(jié)構(gòu)是特有的。進(jìn)一步分裂引起一氧化碳的分離，以致在m/z 136形成第二片斷離子峰。
阿徹瑞克酸的UV光譜在λ＝217、245和307nm顯示最大數(shù)。強(qiáng)堿條件導(dǎo)致溶液呈黃色，從而在UV光譜中最大數(shù)向紅移動(dòng)(紅移)。
為了得到單斜晶，可能從丙酮中重結(jié)晶阿徹瑞克酸。另外，由于水楊酸酯部分結(jié)構(gòu)，阿徹瑞克酸與離子(III)氯化物溶液一起顯現(xiàn)紫色。所有分析數(shù)據(jù)與出現(xiàn)在文獻(xiàn)中的值(呈現(xiàn))良好的一致(性)。
對(duì)于來自非洲臀果木的選擇性二氯甲烷提取物中的阿徹瑞克酸的定量分析，以純度大于99％的阿徹瑞克酸的參考物質(zhì)建立校準(zhǔn)線。這導(dǎo)致在選擇性二氯甲烷提取物中0.16％(m/m)含量的阿徹瑞克酸。
在螢光素酶測(cè)定中，阿徹瑞克酸顯示出明顯的抗產(chǎn)雄性征的活性。因此，本發(fā)明涉及阿徹瑞克酸的用于治療良性前列腺增生以及制備用于治療良性前列腺增生的藥物的用途。
已經(jīng)從多種高等植物例如Newbouldia laevis、毛葉油丹(Alseodaphne andersonii)、毛果槭(Acer nikoense)、Xylosma velutina和Ekebergia pterophylla的樹皮材料中分離到阿徹瑞克酸。
但是，阿徹瑞克酸也被認(rèn)為是地衣物質(zhì)。地衣是附生植物，也就是包括真菌(地衣共生菌)和藻類(共生光合生物)的共生有機(jī)體。阿徹瑞克酸可在地衣中以游離形式存在，其也可作縮酚羧酸和縮酚酸環(huán)醚的成分用。例如，眾所周知的地衣物質(zhì)黑茶漬素是阿徹瑞克酸和海德米克酸(hemtommic acid)的縮酚羧酸，并且其以多種地衣類通過聚酮化合物代謝作用合成。
這一事實(shí)引發(fā)的問題是，是否阿徹瑞克酸確實(shí)是非洲臀果木的次級(jí)代謝產(chǎn)物，或者是否通過乙酸-聚丙二酸酯合成的路徑，作為聚酮化合物的樹的樹皮已經(jīng)被產(chǎn)生阿徹瑞克酸的地衣移植。
在顯微鏡下觀察非洲刺李的樹皮藥物，短絲(hyphens)是清楚可見的，這證實(shí)了存在地衣。這表明阿徹瑞克酸從地衣的聚酮化合物代謝作用產(chǎn)生，而不是非洲刺李次生植物代謝產(chǎn)物。
阿徹瑞克酸屬于地衣酸，它是聚乙酸酯，并且其生源說通過菌體植物的真菌成分產(chǎn)生。就像其它地衣酸，阿徹瑞克酸被認(rèn)為是抗菌劑和殺線蟲劑。
阿徹瑞克酸也可以同時(shí)完全由3-甲基-4-亞甲基-2-氧雜環(huán)丁烷和乙酸甲酯合成制備。
前列腺細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)最初依靠雄激素。為了測(cè)試是否阿徹瑞克酸的雄激素拮抗作用也影響細(xì)胞生長(zhǎng)，使用已知顯示雄激素依賴性生長(zhǎng)的人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP在10μM阿徹瑞克酸存在下培養(yǎng)LNCaP細(xì)胞。圖4顯示了用10μM阿徹瑞克酸處理的細(xì)胞已經(jīng)在處理的第8天表現(xiàn)出比未處理的細(xì)胞明顯慢的生長(zhǎng)。這種作用到處理第18天時(shí)甚至更顯著。在10μM阿徹瑞克酸存在下，LNCaP細(xì)胞顯示出生長(zhǎng)減少，而用OH-F(羥基氟他胺)不會(huì)導(dǎo)致任何生長(zhǎng)的減少。后者可能是由于在人雄激素受體的配體結(jié)合域中具有點(diǎn)突變的LNCaP細(xì)胞防止了OH-F在這些細(xì)胞中起抗雄激素物質(zhì)的作用。
這些數(shù)據(jù)顯示阿徹瑞克酸的雄激素拮抗作用在突變的人類雄激素受體的情況下也是有效的。因此，阿徹瑞克酸能夠抑制LNCaP細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)果，阿徹瑞克酸也可以用于治療對(duì)已知的抗產(chǎn)雄性征的活性劑(例如，羥基氟他胺)有抵抗力的前列腺癌。
此外，本發(fā)明也涉及阿徹瑞克酸的用于治療前列腺癌和用于制備治療前列腺癌的藥物的用途，特別是，對(duì)用已知的雄激素拮抗劑(例如必卡他胺、氟他胺、羥基氟他胺、尼魯米特或者環(huán)丙氯地孕酮)治療有抵抗力的前列腺癌的用途。
而且，阿徹瑞克酸能夠在用于治療良性前列腺增生和/或者前列腺癌(特別是抵抗治療性前列腺癌)的新型活性物質(zhì)的開發(fā)中用作先導(dǎo)物質(zhì)。
本發(fā)明潛在的任務(wù)是提供用于治療BPH和/或前列腺癌，或者用于制備用于治療BPH和/或前列腺癌的藥物的新型抗產(chǎn)雄性征的活性物質(zhì)。
這一任務(wù)也是通過提供許多阿徹瑞克酸的化學(xué)合成衍生物而解決的，其中苯環(huán)的側(cè)鏈或者酯的側(cè)鏈已經(jīng)被取代。為了優(yōu)化阿徹瑞克酸的結(jié)構(gòu)，合成許多與阿徹瑞克酸的酯基不同的物質(zhì)。為了這一目的，最初嘗試以多種脂肪族伯醇對(duì)2，4-二羥基-3，5-二甲基苯甲酸進(jìn)行酸催化酯化作用。由于低羰基活性，羧酸通常僅與醇緩慢地反應(yīng)。例如硫酸的強(qiáng)無機(jī)酸的加入和幾小時(shí)的回流可以顯著地增大反應(yīng)速度。但是，因?yàn)橛捎谒畻钏狨ソY(jié)構(gòu)，在升高溫度時(shí)，2，4-二羥基-3，5-二甲基苯甲酸與無機(jī)酸脫羧，所以2，4-二羥基-3，5-二甲基苯甲酸與伯醇(例如乙醇)的反應(yīng)不會(huì)生成所需的酯。
然而，阿徹瑞克酸與伯醇的堿催化再酯化產(chǎn)生所需的酯。為了這一目的，在相應(yīng)的脂肪族伯醇或者苯磺酰胺溶液中，由于阿徹瑞克酸與一些比等摩爾量略大的量的氫氧化鉀進(jìn)行隔夜攪拌。當(dāng)這一再酯化作用不定量地發(fā)生，所以必須通過制備HPLC使反應(yīng)產(chǎn)物從混合物中分離。
以這種方式，成功地進(jìn)行了下列阿徹瑞克酸衍生物(阿徹瑞克酸酯)的合成，其結(jié)構(gòu)式示于圖5中 A1＝乙基-2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸酯；阿徹瑞克酸乙酯 A2＝丙基-2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸酯；阿徹瑞克酸丙酯 A3＝丁基-2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸酯；阿徹瑞克酸丁酯 A4＝2-[(苯磺酰)氨基]乙基-2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸酯 A5＝(2E)-3，7-二甲基辛-2，6-二烯-1-基-2，4-二羥基-3，5-二甲基苯甲酸酯；香葉基-2，4-二羥基-3，5-二甲基苯甲酸酯；香葉基阿徹瑞克酸酯 A6＝異丙基-2，4-二羥基-3，5-二甲基苯甲酸酯；阿徹瑞克酸異丙酯 另外，測(cè)試了下列顯示出與阿徹瑞克酸相似的結(jié)構(gòu)的市售可得化合物的抗產(chǎn)雄性征的作用 R0＝乙基-2，4-二羥基-6-甲基苯甲酸酯 R1＝甲基-3，5-二溴-2，4-二羥基-6-甲基苯甲酸酯 R2＝甲基-2-羥基-3-甲基苯甲酸酯 R3＝甲基-2，4-二羥基苯甲酸酯 R4＝甲基-2，4-二羥基-3-甲基苯甲酸酯 R5＝甲基-2，6-二羥基-3，5-二甲基苯甲酸酯 R6＝2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸 X＝1-(2-羥基-4，6-二甲氧基苯基)-乙酮；花椒素 化合物A4是阿徹瑞克酸與N-丁基苯磺酰胺的嵌合體，但是正如圖6和7所示，其沒有顯示出抗產(chǎn)雄性征的作用。這導(dǎo)致一種假設(shè)在阿徹瑞克酸衍生物中，例如酯的大側(cè)鏈不會(huì)導(dǎo)致抗產(chǎn)雄性征的活性分子。這一假設(shè)與以大的更疏水的香葉基(化合物A5)取代異丙基(化合物A)不會(huì)導(dǎo)致抗產(chǎn)雄性征的活性物質(zhì)的事實(shí)一致。
化合物R4和A6在10μM濃度下顯示出幾乎完全抑制雄激素受體介導(dǎo)的反式激活(圖7)的強(qiáng)抗產(chǎn)雄性征的活性。即使在濃度僅為1μM時(shí)，R4和A6化合物均仍能使雄激素受體介導(dǎo)的反式激活。
螢光素酶測(cè)定的結(jié)果表明，鄰位上的甲基對(duì)于抗產(chǎn)雄性征的活性不需要的(正如通過比較阿徹瑞克酸與R4的相應(yīng)基團(tuán)作用)，而位于間位上的甲基對(duì)于抗產(chǎn)雄性征的活性是重要的(見R0的活性)。與此符合，從苯環(huán)中除去兩個(gè)甲基會(huì)導(dǎo)致抗產(chǎn)雄性征的活性的完全消滅。而且，所述甲基不能被溴化物原子所取代而不會(huì)導(dǎo)致抗產(chǎn)雄性征的活性的喪失，正如化合物R1的活性所揭示的。此外，具有被發(fā)現(xiàn)在阿徹瑞克酸中具有所有苯環(huán)取代基單在不同位置的化合物R5導(dǎo)致抗產(chǎn)雄性征的活性的喪失。因?yàn)槌ピ摷谆鶗?huì)消除抗產(chǎn)雄性征的活性，所以正如R6的活性所示，酯的甲基似乎也對(duì)抗產(chǎn)雄性征的活性是重要的。
雄激素對(duì)于前列腺的正常發(fā)育、正常生長(zhǎng)和正常分泌活性是必不可少的。與其相反，通常認(rèn)為雌激素是前列腺生長(zhǎng)的抑制劑。但是，由于可顯示ERβ的活性具有對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，這一雌激素的總評(píng)估(general assessment)可能是錯(cuò)誤的。而且，ERβ的失活導(dǎo)致小鼠的前列腺增生。
在本發(fā)明的研究構(gòu)架中，也顯示出阿徹瑞克酸不但具有抗產(chǎn)雄性征的作用，而且對(duì)抗ERβ。這一發(fā)現(xiàn)不僅導(dǎo)致了阿徹瑞克酸對(duì)前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用不是專有地由于其抗產(chǎn)雄性征的作用的假說，而且導(dǎo)致其ERβ激動(dòng)。當(dāng)然，患有例如神經(jīng)變性紊亂的其它疾病的患者也可以從具有ERβ拮抗作用的阿徹瑞克酸或者的阿徹瑞克酸衍生物的治療中受益。
因此，本發(fā)明的目的是下列通式2，4-二羥基-3-甲基苯甲酸酯的用于治療良性前列腺增生和/或者前列腺癌(特別是對(duì)雄激素治療有抵抗力的前列腺癌)的治療和藥物制備的用途
其中，R1表示C1～C4烷基，并且R2為氫或者甲基、乙基或者丙基殘基。
此外，發(fā)明的目的為下列通式2，4-二羥基-3-甲基苯甲酸酯的用于治療脊延肌萎縮癥的治療和藥物制備的用途
其中，R1表示C1～C4烷基，并且R2為氫或者甲基、乙基或者丙基殘基。
發(fā)明進(jìn)一步涉及將前述2，4-二羥基-3-甲基苯甲酸酯作為用于開發(fā)治療良性前列腺增生、前列腺癌和脊延髓肌萎縮癥的進(jìn)一步或者新的活性物質(zhì)的先導(dǎo)物質(zhì)的用途。
發(fā)明進(jìn)一步涉及用于治療良性前列腺增生和/或者前列腺癌，特別是對(duì)于雄激素拮抗劑治療有抵抗力的前列腺癌，以及脊延髓肌萎縮癥的藥物，該藥物的特征在于，它們至少包含一種下列通式2，4-二羥基-3-甲基苯甲酸酯
其中，R1表示C1～C4烷基，并且R2為氫或者甲基、乙基或者丙基殘基。
而且，發(fā)明涉及從生物材料中分離阿徹瑞克酸的方法，其包括如下步驟 a.將生物材料粉碎； b.用選自包括一價(jià)C1～C4的醇和易揮發(fā)的(局部)鹵代C1碳?xì)浠衔锏慕M的溶劑提取所述生物材料； c.分級(jí)提取物； d.從包含阿徹瑞克酸的級(jí)分中分離阿徹瑞克酸。
所述的生物材料可以是非洲李樹非洲臀果木的樹皮或者可生長(zhǎng)于非洲臀果木樹皮上的地衣。優(yōu)選地，通過采用一系列極性遞增的連續(xù)溶劑進(jìn)行提取作為選擇提取，并且隨著增加洗脫液極性，以梯度提取色譜的方式進(jìn)行提取物的分級(jí)。特別優(yōu)選以制備HPLC的方式，從含有阿徹瑞克酸的級(jí)分中進(jìn)行阿徹瑞克酸的分離。
發(fā)明的進(jìn)一步目的是合成阿徹瑞克酸衍生物(阿徹瑞克酸酯)的過程，其特征在于，在脂肪族伯醇的溶液中將阿徹瑞克酸與等摩爾量的堿金屬氫氧化物或者堿土金屬氫氧化物一起攪拌，這僅導(dǎo)致再酯化作用；以及優(yōu)選以制備HPLC的方式從反應(yīng)混合物中對(duì)阿徹瑞克酸衍生物進(jìn)行后續(xù)分離。
所述堿金屬氫氧化物優(yōu)選使用氫氧化鉀，并且特別優(yōu)選脂族所述伯醇優(yōu)先選自包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇和丁醇的組。
發(fā)明的進(jìn)一步的目的為包括下列通式的2，4-二羥基苯甲酸酯的阿徹瑞克酸衍生物
其中，R2為氫或者甲基、乙基或者丙基殘基，其特征在于，R1為選自包括異丙基、香葉基和乙基苯磺酰胺殘基的組。
實(shí)施例1植物材料的提取 將干燥的非洲李樹(非洲臀果木)的樹皮制成粉末狀，并且使用Ultra Turrax使1.73kg粉末狀的樹皮均化于1L正己烷中，并用冰冷卻。將植物材料填充進(jìn)柱(Merck Prepbar400×100mm)中，并且在室溫下用25.0 l正己烷、26.0 l二氯甲烷、25.0 l甲醇(MeOH)和12.5 l水連續(xù)地進(jìn)行選擇提取。在40℃真空中蒸發(fā)生成的提取物的溶劑。生成了4.8g選擇性己烷提取物、11.03g選擇性二氯甲烷提取物、116.81g選擇性甲醇提取物和7.00g選擇性水提取物。
為了制備乙醇提取物，將300g非洲臀果木的樹皮材料制成粉末，并且進(jìn)行3次提取，每次使用5.0 l乙醇(EOH)。以0.7μm孔徑尺寸的濾紙過濾提取物之后，使用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器在40℃下從整個(gè)提取物中除去溶劑。生成的提取物的干物質(zhì)為16.02g。
實(shí)施例2二氯甲烷提取物的分級(jí) 用硅膠(Macherey-Nagel Si60，15-25μm)對(duì)非洲臀果木的選擇性二氯甲烷提取物進(jìn)行分級(jí)。為了這一目的，將提取物溶解于2000mlCH2Cl2中，并且用0.7μm孔徑尺寸的濾紙(Schleicher & Schüll)過濾。向提取物加入25g硅膠(Merck Si60，0.063-0.2mm)并且在40℃真空中蒸發(fā)溶劑。將這樣涂敷的硅膠置于干填充硅膠柱(Merck Prepbar400×100mm)的頂部，并且以120ml·min-1的流速，以0min己烷(100∶0)、50min己烷(100∶0)、350min CH2Cl2(100∶0)、500min CH2Cl2(100∶0)、700min CH2Cl2-MeOH(80∶20)、750min MeOH(100∶0)、800minMeOH(100∶0)、850min H2O(100∶0)、885min H2O的線性梯度進(jìn)行洗脫。色層分離得到35種級(jí)分，以245nm波長(zhǎng)的UV光對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)(表1)。
表1來自非洲臀果木的選擇性二氯甲烷提取物的分級(jí) 實(shí)施例3阿徹瑞克酸的分離 以制備HPLC從級(jí)分F8中分離阿徹瑞克酸(250×21mm，100-5C18 HD Macherey-Nagel，22ml·min-2，在220nm進(jìn)行UV檢測(cè)，Gradient0min ACN-H2O(加入0.1％TFA)((20∶80)，40min ACN-H2O(80∶20)，45min ACN(乙腈)(100∶0))。從23分鐘至25分鐘收集阿徹瑞克酸。在1H NMR和13C NMR、EI-MS、HR-EI-MS、IR以及UV光譜的基礎(chǔ)上說明其結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例4細(xì)胞培養(yǎng)和螢光素酶測(cè)定 在37℃和5％CO2下，將缺乏內(nèi)源性雄激素受體的猴腎細(xì)胞系CV1培養(yǎng)在補(bǔ)充有10％(v/v)胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100IU/ml)的Dulbecco′s modified Eagle′s medium(DMEM)中。
對(duì)于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，以每孔1.2×105個(gè)細(xì)胞的密度，將細(xì)胞接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Nunc，Roskilde，丹麥)上，并且使其在補(bǔ)充有10％(v/v)的涂敷葡聚糖的活性炭處理的血清(dextran-coated activated charcoalstripped serum)的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。接種6小時(shí)之后，通過使用Ca3(PO4)2的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。人雄激素受體(hAR)表達(dá)載體(0.2μg)與1μg報(bào)道質(zhì)粒MMTV-luc進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，并且以0.2μg細(xì)胞巨化病毒(CMV)-驅(qū)動(dòng)的β-半乳糖苷酶表達(dá)病毒作為轉(zhuǎn)染率的內(nèi)參照。在14小時(shí)之后，更換不加入(圖1～3中的白條)或者與所指的提取(圖1)、二氯甲烷提取物的級(jí)分(圖2)或者單獨(dú)的分離化合物(圖3)一起加入17-羥基-17-甲基-雌-4，9，11-三烯-3-酮(R1881，3×10-10M終濃度；圖1～3的黑條)的培養(yǎng)基。再過48小時(shí)后，收獲細(xì)胞并用于螢光素酶和β-半乳糖苷酶活性測(cè)定。
通過注入螢光素和在562nm測(cè)定的光發(fā)射確定螢光素酶的活性，并且使用用于校準(zhǔn)螢光素酶活性的β-半乳糖苷酶活性值的相對(duì)光單位(RLU)表示。所示的所有轉(zhuǎn)染測(cè)定以一式兩份進(jìn)行，并且至少重復(fù)兩次。
為了確定來自非洲臀果木的樹皮的多種提取物中的抗產(chǎn)生雄激素的活性，在300μg/ml的濃度下使用所述提取物。結(jié)果示于圖1中。
為了確定選擇性二氯甲烷提取物的級(jí)分中的抗產(chǎn)雄性征的活性， 相對(duì)30μg/ml的終濃度使用2μl的各級(jí)分。相對(duì)60μg/ml的終濃度，用4μl另外測(cè)試級(jí)分F6～F10?；钚约?jí)分F7和F8用于進(jìn)一步測(cè)試。結(jié)果部分示于圖2。
從選擇性二氯甲烷提取物的級(jí)分F8分離的物質(zhì)的抑制作用以雄激素活性的抑制作用百分?jǐn)?shù)表示在圖3中。所述物質(zhì)各自以30μg/ml的濃度使用。
實(shí)施例5阿徹瑞克酸對(duì)人類前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 將人前列腺癌細(xì)胞(細(xì)胞系LNCaP)培養(yǎng)在補(bǔ)充有10％(v/v)胎牛血清、青霉素(100IU/ml)和鏈霉素(100IU/ml)、2mM谷氨酰胺和1mM丙酮酸鈉的RPMI-1640培養(yǎng)基中。
對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)測(cè)定，將LNCaP細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度，接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，并且在包含5％的胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。在第2天，更換原培養(yǎng)基，并且加入乙醇/DMSO(對(duì)照)，阿徹瑞克酸(1μM和10μM)或者已知的抗雄激素物質(zhì)羥基氟他胺(OH-F)(0.1μM)以處理細(xì)胞。每?jī)商?，用新鮮的培養(yǎng)基和新加入的化合物更換原培養(yǎng)基。將細(xì)胞用胰蛋白酶消化，并且在指定的天數(shù)上，用計(jì)數(shù)細(xì)胞室(counting cell chamber)進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果示于圖5中。
實(shí)施例6甲基苯磺酰胺(＝S1)的合成 化學(xué)式C11H14O4(MW＝210.09) IUPAC乙基-2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸酯 外觀白色粉末 合成 在10ml乙醇中將392mg阿徹瑞克酸(2mmol)與118mg氫氧化鉀(2.1mmol)一起攪拌過夜，然后中和。在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中抽出溶劑并且將殘余物質(zhì)溶解于色層分離初始條件的溶劑混合物中。隨后，根據(jù)下列方法B4通過制備HPLC分離反應(yīng)產(chǎn)物 保留時(shí)間13min 收率42mg(10％) 熔點(diǎn)(℃)127 UV(MeOH)λmax nm217，265，308 IR(KBr)vmax cm-13450，3100，1620，1310，1280，800 1H-NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm) 12.05(1H，s，C-2-OH) 6.14(1H，s，C-5-H) 5.02(1H，s，C-4-OH) 4.32(2H，q，3J＝7.0Hz，C-1′-H) 2.41(3H，s，C-6-Me) 2.03(3H，s，C-3-Me) 1.34(3H，t，3J＝7.0Hz，C-2′-H) 13C-NMR(125MHz，CDCl3)，δ(ppm) 172.1(C-7) 108.5(C-3)7.6(C-3-Me) 163.2(C-2) 105.4(C-1) 157.9(C-4) 61.2(C-1′) 140.2(C-6)24.6(C-6-Me) 110.5(C-5)14.2(C-2′) EI-MS(70eV)m/z(rel.int.) 210[M]+(50)，164(100)，136(60) 高精度質(zhì)量檢測(cè)(HR-EI-MS) 計(jì)算值對(duì)于[M+]210.0892 實(shí)測(cè)值210.0889 實(shí)施例7阿徹瑞克酸丙酯(A2)的合成 化學(xué)式C12H16O4(MW＝224.10) IUPAC丙基-2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸酯 外觀白色粉末 合成 在10ml丙醇中，將392mg阿徹瑞克酸(2)(2mmol)與118mg氫氧化鉀(2.1mmol)一起攪拌過夜，然后中和。在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中抽出溶劑，并且將殘余物溶解在色層分離的初始條件的溶劑混合物中。隨后，根據(jù)下列方法B5，以制備HPLC分離反應(yīng)產(chǎn)物 保留時(shí)間10Min. 收率31mg(7％) 熔點(diǎn)(℃)134 UV(MeOH)λmax nm217，262，307 IR(KBr)vmax cm-13450，3000，1650，1310，1200，800 1H-NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm) 12.09(1H，s，C-2-OH) 6.14(1H，s，C-5-H) 5.02(1H，s，C-4-OH) 4.23(2H，t，3J＝6.7Hz，C-1′-H) 2.41(3H，s，C-6-Me) 2.04(3H，s，C-3-Me) 1.73(2H，m，3J＝7.0Hz，C-2′-H) 0.97(3H，t，3J＝7.2Hz，C-3′-H) 13C-NMR(125MHz，CDCl3)，δ(ppm) 173.3(C-7)108.5(C-3)10.8(C-3′) 163.2(C-2)105.4(C-1)7.6(C-3-Me) 157.9(C-4)67.0(C-1′) 140.1(C-6)24.2(C-6-Me) 110.5(C-5)22.0(C-2′) EI-MS(70eV)m/z(rel.int.) 224[M]+(31)，164(100)，136(44) 高精度質(zhì)量檢測(cè)(HR-EI-MS) 計(jì)算值對(duì)于[M+]224.1049 實(shí)測(cè)值224.1051 實(shí)施例8阿徹瑞克酸丁酯(A3)的合成 化學(xué)式C13H18O4(MW＝238,12) IUPAC丁基-2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸酯 外觀白色粉末 合成 在10ml丁醇中，將392mg阿徹瑞克酸(2)(2mmol)與118mg氫氧化鉀(2.1mmol)一起攪拌過夜，然后中和。在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中抽出溶劑，并且將殘余物溶解于色層分離初始條件的溶劑混合物中。隨后，根據(jù)B7方法，以制備HPLC將反應(yīng)產(chǎn)物分離
保留時(shí)間13Min. 收率51mg(11％) 熔點(diǎn)(℃)117 UV(MeOH)λmax nm217，265，308 IR(KBr) vmax cm-13440，3000，1700，1310，1200，800 1H-NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm) 12.09(1H，s，C-2-OH) 6.20(1H，s，C-5-H) 4.97(1H，s，C-4-OH) 4.32(2H，t，3J＝7.0Hz，C-1′-H) 2.41(3H，s，C-6-Me) 2.04(3H，s，C-3-Me) 1.69(2H，m，3J＝7.3Hz，C-2′-H) 1.42(2H，m，3J＝7.3Hz，C-3′-H) 0.90(3H，t，3J＝7.3Hz，C-4′-H) 13C-NMR(125 MHz，CDCl3)，δ(ppm) 167.9(C-7)108.6(C-3)19.3(C-3′) 163.1(C-2)105.5(C-1)13.5(C-4′) 157.8(C-4)66.3(C-1′)7.5(C-3-Me) 140.1(C-6)24.1(C-6-Me) 110.5(C-5)30.5(C-2′) EI-MS(70eV)m/z(rel.int.) 238[M]+(31)，164(100)，136(30) 高精度質(zhì)量檢測(cè)(HR-EI-MS) 計(jì)算值對(duì)于[M+]238.1226 實(shí)測(cè)值238.1226 實(shí)施例9阿徹瑞克酸和N-丁基苯磺酰胺的雜化物(A4)的合成 化學(xué)式C17H19O6NS(MW＝365.09) IUPAC2-[(苯基磺?；?氨基]乙基-2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸酯 外觀淺黃色粉末 合成 在加入0.05g濃硫酸的30ml鄰甲苯中，對(duì)1.822g 2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸(0.01mol)和3.522g N-(2-羥基乙基)苯磺酰胺進(jìn)行5小時(shí)回流。在中和之后，在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中抽出溶劑，并且將殘余物溶解于色層分離的初始條件的溶劑混合物中。隨后，根據(jù)下列方法B9以制備HPLC分離反應(yīng)產(chǎn)物 保留時(shí)間14min 收率30mg(4％) 熔點(diǎn)(℃)151 UV(MeOH)λmax nm220，270，305 IR(KBr)λmax cm-13450，3310，2930，1640，1310，1280，1160，1100 1H-NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm) 11.69(1H，s，C-2-OH) 7.79(2H，d，3J＝7.0Hz，C-2″-H和C-6″-H) 7.48(1H，t，3J＝7.0Hz，C-4″-H) 7.41(2H，t，3J＝7.0Hz，C-3″-H和C-5″-H) 6.13(1H，s，C-5-H) 5.05(1H，s，C-4-OH) 4.68(1H，s，N-H) 4.31(2H，t，3J＝5.5Hz，C-1′-H) 3.32(2H，t，3J＝5.5Hz，C-2′-H) 2.31(3H，s，C-6-Me) 2.03(3H，s，C-3-Me) 13C-NMR(125MHz，CDCl3)，δ(ppm) 167.0(C-7)133.6(C-4″) 104.2(C-1) 163.0(C-2)130.2(C-3″和C-5″) 64.5(C-1′) 153.1(C-4)127.8(C-2″和C-6″) 43.0(C-2′) 142.0(C-6)111.6(C-5) 24.6(C-6-Me) 141.4(C-1″) 109.9(C-3) 7.5(C-3-Me) EI-MS(70eV)m/z(rel.int.) 365[M]+(23)，170(26)，164(100)，141(26)，136(24)，77(27) 高精度質(zhì)量檢測(cè)(HR-EI-MS) 計(jì)算值對(duì)于[M+]365.0933 實(shí)測(cè)值365.0933 實(shí)施例10香葉基阿徹瑞克酸酯(A5)的合成 化學(xué)式C19H26O4(MW＝318.18) IUPAC(2E)-3，7-二甲基辛-2，6-二烯-1-基-2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸酯 外觀淺黃色粉末 合成 在10ml香葉醇中，將392mg阿徹瑞克酸(2)(2mmol)與118mg氫氧化鉀(2.1mmol)攪拌過夜，然后中和。在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中抽出溶劑，并且將殘余物溶解于色層分離的初始條件的溶劑混合物中。隨后，根據(jù)下列方法B8以制備HPLC分離反應(yīng)產(chǎn)物 保留時(shí)間27Min. 收率44mg(7％) UV(ACN)λmax nm220，270，310 IR(KBr)vmax cm-13410，2930，1640，1440，1270 1H-NMR(500MHz，MeOH-d4)，δ(ppm) 6.20(1H，s，C-5-H) 2.45(3H，s，C-6-Me) 5.34(1H，t，3J＝6.7Hz，C-2′-H) 5.10(1H，t，3J＝6.7Hz，C-6′-H) 4.07(2H，d，3J＝6.5Hz，C-1′-H) 2.10(2H，q，3J＝8.3Hz，C-5′-H) 2.01(2H，t，3J＝8.3Hz，C-4′-H) 1.99(3H，s，C-3 Me) 1.65(3H，s，C-3′-Me) 1.64(3H，s，C-7′-Me) 1.59(3H，s，C-8′) 13C-NMR(125MHz，MeOH-d4)，δ(ppm) 175.6(C-7)132.4(C-7′)104.9(C-1)24.3(C-6-Me) 164.8(C-2)125.1(C-2′)59.4(C-1′) 17.7(C-5′) 161.3(C-4)124.9(C-6′)40.7(C-4′) 16.2(C-3′-Me) 141.5(C-3′) 111.3(C-5) 27.5(C-8′) 7.9(C-3-Me) 139.4(C-6)109.7(C-3) 25.8(C-7′-Me) EI-MS(70eV)m/z(rel.int.) 318[M]+(24)，164(100)，136(38) 高精度質(zhì)量檢測(cè)(HR-EI-MS) 計(jì)算值對(duì)于[M+]318.1834 實(shí)測(cè)值318.1829 實(shí)施例11阿徹瑞克酸異丙酯(A6)的合成 化學(xué)式C12H16O4(MW＝224.10) IUPAC異丙基-2，4-二羥基-3，6-二甲基苯甲酸酯 外觀白色粉末 合成 在10ml異丙醇中，將392mg阿徹瑞克酸(2)(2mmol)與118mg氫氧化鉀(2.1mmol)一起攪拌過夜，然后中和。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中抽出溶劑，并且將殘余物溶解于色層分離的初始條件的溶劑混合物中。隨后，根據(jù)下列方法B6以制備HPLC分離反應(yīng)產(chǎn)物 保留時(shí)間12Min. 收率38mg(8％) 熔點(diǎn)(℃)90 UV(MeOH)λmax nm217，265，300 IR(KBr)vmax cm-13400，3000，1650，1310，1200，800 1H-NMR(500MHz，CDCl3)，δ(ppm) 12.11(1H，s，C-2-OH) 6.13(1H，s，C-5-H) 5.22(1H，m，3J＝6.3Hz，C-1′-H) 2.40(3H，s，C-6-Me) 2.03(3H，s，C-3-Me) 1.31(6H，d，3J＝6.2Hz，C-1′-Me) 13C-NMR(125MHz，CDCl3)，δ(ppm) 171.6(C-7)108.5(C-3)7.6(C-3-Me) 163.2(C-2)105.7(C-1) 157.8(C-4)69.2(C-1′) 140.1(C-6)24.3(C-6-Me) 110.4(C-5)22.0(C-1′-Me) EI-MS(70eV)m/z(rel.int.) 224[M]+(35)，164(100)，136(39) 高精度質(zhì)量檢測(cè)(HR-EI-MS) 計(jì)算值對(duì)于[M+]224.1049 實(shí)驗(yàn)值224.1051 實(shí)施例12阿徹瑞克酸作為雌激素受體激動(dòng)劑 用編碼螢光素酶基因作為報(bào)道基因的表達(dá)質(zhì)粒(p2ERE-TATA-luc)和編碼人ERα和ERβ的表達(dá)質(zhì)粒功能測(cè)定，共轉(zhuǎn)染不顯示顯著量的功能雌激素受體的CV1細(xì)胞用于功能測(cè)定。對(duì)于用雌激素受體的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，將10％(v/v)的預(yù)先已用涂敷葡聚糖的活性炭處理的血清、1％(v/v)谷氨酰胺、1％(v/v)丙酮酸鈉和1％(v/v)青霉素鏈霉素添加到無酚紅DMEM培養(yǎng)基(invitrogen)。7天之后，以每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞的密度將細(xì)胞接種到6孔板(Nunc，Roskilde，丹麥)。24小時(shí)以后，用2μg編碼報(bào)道基因的表達(dá)質(zhì)粒、0.2μg編碼ERα或者編碼ERβ的表達(dá)質(zhì)粒用硫酸鈣方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。為了標(biāo)準(zhǔn)化原因，用0.2μg細(xì)胞巨化病毒-驅(qū)動(dòng)的β-半乳糖苷酶轉(zhuǎn)然細(xì)胞。14小時(shí)之后，用具有或者不具有雌二醇但在任何情況下向其加入了對(duì)應(yīng)量的阿徹瑞克酸的新鮮培養(yǎng)基更換原培養(yǎng)基，在48小時(shí)之后，收獲細(xì)胞，并且用于螢光素酶和β-半乳糖苷酶的活性測(cè)試。所有轉(zhuǎn)染測(cè)試以一式兩份進(jìn)行，并且至少重復(fù)兩次。
結(jié)果圖解表示于圖8和9。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿徹瑞克酸影響兩種雌激素受體的活性。令人驚奇的是，阿徹瑞克酸不影響兩種雌激素受體的激素介導(dǎo)的反式激活。但是，正如從測(cè)試的螢光素酶的活性所顯現(xiàn)出來的，如果不存在雌二醇，以10μM或者100μM存在時(shí)，報(bào)道基因的雌激素反應(yīng)性表達(dá)以劑量依賴性方式活化。因此，高濃度阿徹瑞克酸是兩種雌激素受體的激動(dòng)劑。
權(quán)利要求
1.如下通式的2，4-二羥基-3-甲基苯甲酸酯用于治療良性前列腺增生、前列腺癌或者脊延髓肌萎縮癥的用途
其中，R1表示C1～C4烷基，并且R2為氫或者甲基、乙基或者丙基殘基。
2.如下通式的2，4-二羥基-3-甲基苯甲酸酯用于制備用作治療良性前列腺增生、前列腺癌或者脊延髓肌萎縮癥的藥物的用途
其中，R1表示C1～C4烷基，并且R2為氫或者甲基、乙基或者丙基殘基。
3.如下通式的2，4-二羥基-3-甲基苯甲酸酯作為先導(dǎo)物質(zhì)用于開發(fā)治療良性前列腺增生、前列腺癌或者脊延髓肌萎縮癥的活性物質(zhì)的用途
其中，R1表示C1～C4烷基，并且R2為氫或者甲基、乙基或者丙基殘基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述前列腺癌對(duì)雄激素拮抗劑的治療具有抗性。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述雄激素拮抗劑選自包括必卡他胺、氟他胺、羥基氟他胺、尼魯米特和環(huán)丙氯地孕酮的組。
6.用于治療良性前列腺增生、前列腺癌或者脊延髓肌萎縮癥的藥物，其特征在于，其包含至少一種如下通式的2，4-二羥基-3-甲基苯甲酸酯
其中，R1表示C1～C4烷基，并且R2為氫或者甲基、乙基或者丙基殘基。
7.如下通式的2，4-二羥基-3-甲基苯甲酸酯
其中，R2為氫或者甲基、乙基或者丙基殘基，其特征在于，R1選自包括異丙基、香葉基和乙基苯磺酰胺殘基的組。
8.從生物材料中分離阿徹瑞克酸的方法，該方法包括下列步驟
a.將生物材料粉碎；
b.用選自包括一價(jià)C1～C4的醇和易揮發(fā)的(部分)鹵代C1碳?xì)浠衔锏慕M的溶劑對(duì)該生物材料進(jìn)行提取；
c.對(duì)提取物進(jìn)行分級(jí)；
d.從包含阿徹瑞克酸的級(jí)分中分離出阿徹瑞克酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的生物材料為非洲李樹非洲臀果木的樹皮或者可生長(zhǎng)于非洲臀果木的樹皮上的地衣。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述提取為采用一系列極性遞增的連續(xù)溶劑的選擇性提取。
11.根據(jù)權(quán)利要求8至10中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述提取物的分級(jí)是采用極性遞增的洗脫液的梯度提取色譜法進(jìn)行的。
12.根據(jù)權(quán)利要求8至11中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，從所述級(jí)分中分離出阿徹瑞克酸是采用制備HPLC進(jìn)行的。
13.阿徹瑞克酸衍生物的合成方法，其特征在于，在脂肪族伯醇的溶液中將阿徹瑞克酸與等摩爾量的堿金屬氫氧化物或者堿土金屬氫氧化物一起攪拌，然后從反應(yīng)混合物中分離出阿徹瑞克酸衍生物。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述的堿金屬氫氧化物為氫氧化鉀。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或者14所述的方法，其特征在于，所述的醇選自包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇和丁醇的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述的阿徹瑞克酸衍生物采用制備HPLC進(jìn)行分離。
全文摘要
本發(fā)明涉及從生物材料中分離阿徹瑞克酸的方法，阿徹瑞克酸衍生物及其化學(xué)合成，以及阿徹瑞克酸和其衍生物用于治療良性前列腺增生、前列腺癌或者脊延髓肌萎縮癥的治療或者藥物制備的用途，和作為基礎(chǔ)物質(zhì)開發(fā)用于治療良性前列腺增生、前列腺癌或者脊延髓肌萎縮癥的其它制劑的用途。
文檔編號(hào)C07C311/17GK101115488SQ200680004175
公開日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2006年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月5日
發(fā)明者漢斯來納·霍夫曼, 魯多弗·馬土許, 阿里亞·巴尼亞馬達(dá) 申請(qǐng)人:Lts羅曼治療方法有限公司