專利名稱：運(yùn)甲狀腺素蛋白淀粉狀蛋白原纖形成的抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及運(yùn)甲狀腺素蛋白的淀粉狀蛋白原纖形成的抑制劑。更具體地說，本發(fā)明涉及作為運(yùn)甲狀腺素蛋白的淀粉狀蛋白原纖形成的抑制劑的二芳基肟醚。
背景 運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)的淀粉狀蛋白生成(amyloidogenesis)的過程導(dǎo)致了外周神經(jīng)病、器官機(jī)能障礙以及偶爾的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變(Sekijima，Y.；等.Lab.Invest.2003，83，409-417；Hammarstrm，P.；等.Biochemistry，2003，42，6656-6663；Garzuly，F(xiàn).；等.Neurology，1996，47，1562-1567；Ikeda，S.；等.Neurology，2002，58，1001-1007；Westermark，P.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1990，87，2843-2845；Jacobson，D.R.；等.N.Engl.J.Med.1997，336，466-473；Sipe，J.D.Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.1994，31，325-354)。由野生型(WT)TTR沉積所引起的疾病，老年全身性淀粉樣變性(SSA)，是一種晚發(fā)作的心肌病，影響10-25％的年齡80歲以上的人群。(Westermark，P.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1990，87，2843-2845)。其余的與點(diǎn)突變有關(guān)的基于TTR的淀粉樣疾病被分為兩大類家族性淀粉狀蛋白心肌病(FAC)(Jacobson，D.R.；等.N.Engl.J.Med.1997，336，466-473)和家族性淀粉狀蛋白多神經(jīng)病(FAP)(Sipe，J.D.Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.1994，31，325-354)。存在著100以上的引起家族性淀粉樣變性的TTR突變，其發(fā)作的確切年齡、組織選擇性和嚴(yán)重程度取決于特定突變的能量學(xué)、個(gè)體的遺傳背景和可能的環(huán)境因素(White，J.T.；Kelly，J.W.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2001，98，13019-13024；Hammarstrm，P.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2002，99，16427-16432)。
目前用于FAP的唯一治療方法是通過外科手術(shù)更換患者的肝臟(該器官分泌了錯(cuò)折疊入血流中的TTR)介導(dǎo)的基因療法(Herlenius，G.；等.Transplantation 2004，77，64-71)。這種方法的缺點(diǎn)包括對(duì)于捐贈(zèng)人和接受者的侵襲性、對(duì)于終身免疫抑制的需要和由于某些未知因素而對(duì)某些突變的有限效果(Olofsson，B.-O.；等.Transplantation 2002，73，745-751)。目前，沒有有效的與WT-TTR沉積有關(guān)的SSA的治療方法。因此，對(duì)于全部基于TTR的淀粉狀蛋白疾病的可普遍適用的、小分子治療策略將是受歡迎的。
在通過將T119M運(yùn)甲狀腺素蛋白亞單位夾雜到否則包括與疾病相關(guān)的亞單位(V30M)的四聚物中而啟動(dòng)的復(fù)合雜合族中的等位基因間反式抑制(trans-suppression)證實(shí)了TTR的運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定化足以改善FAP(Hammarstrm，P.；等.Science 2003，299，713-716；Coelho，T.；等.J.Rheumatol.1993，20，179；Coelho，T.；等.Neuromusc.Disord.1996，6，27)。反式抑制的功效意味著小分子天然態(tài)的運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定化還應(yīng)當(dāng)改善淀粉樣變性(Sacchettini，J.C.；Kelly，J.W.Nat.Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Cohen，F(xiàn).E.；Kelly，J.W.Nature 2003，426，6968，905-909)。現(xiàn)在已經(jīng)在數(shù)種情況中證實(shí)了用于調(diào)整蛋白質(zhì)的自由能景觀(free energylandscape)以防止與疾病有關(guān)的錯(cuò)折疊的小分子的效用。(Hammarstrm，P.；等.Science 2003，299，713-716；Sacchettini，J.C.；Kelly，J.W.Nat.Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Cohen，F(xiàn).E.；Kelly，J.W.Nature 2003，426，6968，905-909；De Lorenzi，E.；等.Curr.Med.Chem.2004，11，1065-1084；Hardy，J.；等.Science 2002，297，353-356；Ray，S.S.；Lansbury，P.T.，Jr.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2004，101，5701-5702；Miller，S.R.；Sekijima，Y.；Kelly，J.W.Lab.Invest.2004，84，545-552)。
TTR是富含127-殘基β-折疊(β-sheet)的同源四聚體，特征為222個(gè)分子對(duì)稱，具有兩個(gè)甲狀腺素(T4)結(jié)合位點(diǎn)。(Blake，C.C.；等.J.Mol.Biol.1974，88，1-12；Blake，C.C.；等.J.Mol.Biol.1978，121，339-56)。在腦脊髓液(CSF)和血漿中TTR T4結(jié)合量的絕大多數(shù)(＞99％)未被使用，這是因?yàn)門TR的高濃度以及甲狀腺結(jié)合球蛋白(血)和白蛋白(血和CSF)的存在造成的，后者還是T4的載體(Bartalena，L.；Robbins，J.Clin.Lab.Med.1993，13，583-598；Schreiber，G.；Richardson，S.J.Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol.Biol.1997，116，137-160；Stockigt，J.R.Thyroid HormoneBinding and Metabolism.Endocrinology，第4版Degroot，L.J.，Jameson，J.L.，Eds.；W.B.Saunders Co.Philadelphia，2001，第2卷，第94章，1314-1326)。速率受限的四聚物的分解是淀粉狀蛋白生成所需要的(Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry 1992，31，8654-8660；Hammarstrm，P.；等.Science 2001，293，2459-2462；Lai，Z.；Colon，W.；Ke1ly，J.W.Biochemistry 1996，35，6470-6482；Lashuel，H.A.；Lai，Z.；Kelly，J.W.Biochemistry 1998，37，17851-17864)，但這是不充分的(Jiang，X.；等.Biochemistry 2001，40，11442-11452)，因?yàn)?，所得的折疊的單體還必須經(jīng)受部分變性成不正確裝配的(Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry 1992，31，8654-8660；Lai，Z.；Colon，W.；Kelly，J.W.Biochemistry 1996，35，6470-6482；Lashuel，H.A.；Lai，Z.；Kelly，J.W.Biochemistry 1998，37，17851-17864；Jiang，X.；等.Biochemistry 2001，40，11442-11452；Liu，K.；等.Nat.Struct.Biol.2000，7，754-757)。早先的研究證實(shí)了T4結(jié)合抑制了由天然態(tài)的運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定化造成的TTR的聚集。通過相對(duì)于分解過渡狀態(tài)而優(yōu)先穩(wěn)定天然四聚物，增加了分解的活化勢壘。(Hammarstrm，P.；等.Science 2003，299，713-716；Miroy，G.J.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，95，12956-12960)。
篩選、基于結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)以及通過平行合成的先導(dǎo)化合物優(yōu)化已經(jīng)獲得了若干其它結(jié)構(gòu)上不同類別的有效的TTR淀粉狀蛋白生成抑制劑(Hammarstrm，P.；等.Science 2003，299，713-716；Sacchettini，J.C.；Kelly，J.W.Nat.Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Cohen，F(xiàn).E.；Kelly，J.W.Nature 2003，426，6968，905-909；Miller，S.R.；Sekijima，Y.；Kelly，J.W.Lab.Invest.2004，84，545-552；Miroy，G.J.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，95，12956-12960；Petrassi，H.M.；等.J.Am.Chem.Soc.已提交；Purkey，H.E.；等.Chemistry & Biology.付印中；Adamski-Werner，S.L.；等.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Green，N.S.；等.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414；Petrassi，H.M.；等.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；Baures，P.W.；等.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Oza，V.B.；等.Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9，1-6；Baures，P.W.；等.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Klabunde，T.；等.Nat.Struct.Biol.2000，7，312-321；Oza，V.B.；等.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Razavi，H.；等.Angew.Chem.Int.Ed.2003，42，2758-2761)。有效的抑制劑通常具有兩個(gè)芳基，其直接相連或者通過空間群團(tuán)如胺、醚或者亞乙基橋基相連。優(yōu)選的是，一個(gè)芳基通過鹵素或脂族基團(tuán)(一般占據(jù)甲狀腺素結(jié)合位點(diǎn)的內(nèi)腔)官能化，并且另一個(gè)通過羥基和/或羧酸(其可以在外結(jié)合腔的周圍與Lys-15e-NH3+和/或Glu-54羧基進(jìn)行靜電相互作用)官能化(Hammarstrm，P.；等.Science 2003，299，713-716；Sacchettini，J.C.；Kelly，J.W.Nat.Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Cohen，F(xiàn).E.；Kelly，J.W.Nature 2003，426，6968，905-909；Miller，S.R.；Sekijima，Y.；Kelly，J.W.Lab.Invest.2004，84，545-552；Miroy，G.J.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，95，12956-12960；Petrassi，H.M.；等.J.Am.Chem.Soc.已提交；Purkey，H E.；等.Chemistry & Biology.付印中；Adamski-Werner，S.L.；等.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Green，N.S.；等.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414；Petrassi，H.M.；等.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；Baures，P.W.；等.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Oza，V.B.；等.Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9，1-6；Baures，P.W.；等.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Klabunde，T.；等.Nat.Struct.Biol.2000，7，312-321；Oza，V.B.；等.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Razavi，H.；等.Angew.Chem.Int.Ed.2003，42，2758-2761)。兩個(gè)腔具有疏水抑制作用，稱作鹵素結(jié)合袋，其由芳基子結(jié)構(gòu)(substructure)和它們的疏水取代基補(bǔ)充。
在考慮到許多TTR·(抑制劑)2共晶結(jié)構(gòu)中的取代的芳香化合物的取向和位置、合成可達(dá)性以及未來的高處理量動(dòng)態(tài)組合庫分析的可能性以后(Nazarpack-Kandlousy，N.；等.J.Comb.Chem.1999，199-206；Hochgürtel，M.；等.Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.2002，99，3382-3387)，我們選擇研究醛肟醚部分以連接兩個(gè)芳基環(huán)?，F(xiàn)在有若干FDA批準(zhǔn)的含肟醚部分的抗菌劑，其暗示了這種子結(jié)構(gòu)與人體生物學(xué)相容(發(fā)現(xiàn)了FDA批準(zhǔn)的含肟醚部分的抗菌劑，使用來自于MDL信息系統(tǒng)公司的MDL ISIS/Base 2.5，MDDR 2003.2(25.11)數(shù)據(jù)庫，其掃描了包含關(guān)于藥物開發(fā)的數(shù)據(jù)的來自Prous Science Publishers的藥物數(shù)據(jù)報(bào)告)。本研究的目標(biāo)是發(fā)現(xiàn)這樣的二芳基醛肟醚結(jié)構(gòu)，其以高親合力結(jié)合到人血漿中的TTR (Purkey，H.E.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2001，98，5566-5571)并且使天然態(tài)穩(wěn)定以對(duì)抗淀粉狀蛋白生成(Hammarstrm，P.；等.Science 2003，299，713-716；Cohen，F(xiàn).E.；Kelly，J.W.Nature 2003，426，no.6968，905-909)。
概要 通過血漿蛋白質(zhì)運(yùn)甲狀腺素蛋白(TTR)的淀粉狀蛋白原纖的形成，這需要速率有限的四聚物分解和單體錯(cuò)折疊，涉及了多種人類疾病?？梢酝ㄟ^由小分子結(jié)合到TTR主要未被占據(jù)的甲狀腺激素結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)的天然態(tài)穩(wěn)定化來抑制淀粉狀蛋白生成。通過芳基醛和芳氧基胺的容易的縮合，這提供了二芳基醛肟醚庫，在本文中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了新的天然態(tài)穩(wěn)定劑。在該庫的95種化合物中，31種是體外TTR淀粉狀蛋白生成的活性抑制劑。在淀粉狀蛋白生成條件下在分解的過渡狀態(tài)期間，二芳基肟醚選擇性使TTR的天然的四聚物狀態(tài)穩(wěn)定，這導(dǎo)致分解活化勢壘的增加。在過剩(plethora)的其它血漿蛋白質(zhì)的情況下，若干二芳基肟醚選擇性結(jié)合到人血漿中的TTR，這是體內(nèi)發(fā)揮功效所必需的性質(zhì)。雖然二芳基醛肟醚易于通過N-O鍵斷裂而降解，但是這種過程由于它們結(jié)合到TTR而變慢。此外，相對(duì)于血漿TTR的半衰期來說，許多二芳基醛肟醚的降解速率是慢的。對(duì)于開發(fā)出具有優(yōu)良的穩(wěn)定性能的結(jié)構(gòu)上類似的抑制劑，二芳基肟醚庫提供了有價(jià)值的結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的理解，如果證明是必要的話。
本發(fā)明的一個(gè)方面涉及由如下式I代表的二芳基肟醚或者二芳基腙
(式I) 在式I中，R′或者不存在，或者是一個(gè)或多個(gè)選自如下的基團(tuán)-COOH、-OH、-F、-I、-Br、-Cl和CF3；R或者不存在，或者是一個(gè)或多個(gè)選自如下的基團(tuán)-COOH、-F、-Cl和CF3；X是選自-NH-和-O-的二價(jià)基團(tuán)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，X是-O-；在另一種優(yōu)選的實(shí)施方案中，X是-NH-。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，二芳基肟醚或二芳基腙由如下式II代表
(式II) 在式II中，基團(tuán)A選自以下基團(tuán)
在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，二芳基肟醚或二芳基腙由如下式III代表
(式III) 在式III中，基團(tuán)B選自以下基團(tuán)
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白的淀粉狀蛋白原纖的形成的方法。該方法包括如下步驟使運(yùn)甲狀腺素蛋白與抑制濃度的式I、II或III的二芳基肟醚或二芳基腙接觸。
附圖簡述

圖1舉例說明一種方案，其顯示了形成二芳基肟醚(X＝O)和二芳基腙(X＝NH)庫的一般性方法。
圖2舉例說明用于合成二芳基肟醚庫(參見圖1)的芳氧基胺(1-8)和苯甲醛(a-I)組分的結(jié)構(gòu)。
圖3舉例說明用于合成二芳基腙庫的芳基肼(22-29)和苯甲醛(a-I)化合物的結(jié)構(gòu)。
圖4舉例說明了一張表，其顯示了對(duì)抑制原纖形成所測試的96種二芳基腙的活性。
圖5舉例說明肟醚和腙抑制劑的結(jié)構(gòu)。
圖6舉例說明合成所需的芳氧基胺的方案。
圖7舉例說明合成鄰-三氟甲基芳氧基胺的方案。
圖8舉例說明通常所合成并且以mg數(shù)量分離的肟醚的RP-HPLC純度的表。
圖9舉例說明一種方案，其顯示了通過反式-亞胺化(imination)方法來合成二芳基肟醚。
圖10舉例說明了一張表，其總結(jié)了肟醚(7.2mM)抗酸介導(dǎo)(pH值4.4)的TTR(3.6mM)淀粉狀蛋白生成的抑制活性。
圖11舉例說明一張表，其顯示了在酸介導(dǎo)的原纖形成分析(72h)結(jié)束時(shí)剩余的肟醚抑制劑的百分比。
圖12舉例說明一張表，其顯示了在pH值為4.4(72h)下，伯肟醚和腙分解和水解產(chǎn)物(7.2mM)抗WT-TTR(3.6mM)淀粉狀蛋白原纖形成的抑制活性。
圖13舉例說明了在用8f(7.2mM；30min)預(yù)培養(yǎng)的并且在pH值為4.4下、在72h變性應(yīng)激作用后評(píng)價(jià)的TTR(3.6mM)的沉降速度(A)的曲線。
圖14舉例說明了在用8f(7.2mM；30min)預(yù)培養(yǎng)的并且在pH值為4.4下、在72h變性應(yīng)激作用后評(píng)價(jià)的TTR(3.6mM)的平衡超離心研究的曲線。
詳細(xì)說明 類似的二芳基肟醚和二芳基腙的X射線結(jié)晶學(xué)分析表明它們是同構(gòu)的。在95個(gè)成員的所合成的肟醚庫中，基于腙庫活性，幾乎1/3是極好的TTR淀粉狀蛋白生成抑制劑，在濃度為7.2μM的情況下，這為四聚物WT-TTR的兩倍(在72h小時(shí)內(nèi)，在pH值為4.4下，＞90％抑制)。最好的抑制劑具有一個(gè)由羧酸取代的芳環(huán)，而另一個(gè)芳族環(huán)具有鹵素或三氟甲基。從具有甲狀腺素狀取代模式的芳基醛制備的肟醚同樣顯示了極好的活性以及顯著的TTR血漿結(jié)合選擇性一些顯示出超過1.5的結(jié)合化學(xué)計(jì)量(最大為2)。肟醚不僅選擇性地使TTR的天然態(tài)相對(duì)于分離的過渡態(tài)穩(wěn)定，這顯著使四聚物分解和淀粉樣變性變緩，而且由于TTR的結(jié)合，它們的降解顯著地相對(duì)于僅僅緩沖劑的情況變緩，如果二芳基肟醚顯示出不穩(wěn)定性的話。
肟醚庫的設(shè)計(jì)。需要芳氧基胺作為原料以與芳基醛耦合而形成所期望的二芳基肟醚庫(圖1，X＝O)。該反應(yīng)有可能產(chǎn)生兩種關(guān)于亞胺鍵的立體異構(gòu)體(表示為syn和anti，即，醛質(zhì)子可以分別為順式或者反式取向，相對(duì)于由圖1的X代表的苯氧基的氧)；然而，基于如下文獻(xiàn)記載(Karabatsos，G.J.；等.J.Am.Chem.Soc.1962，84，753-755；Lustig，E.J.Phys.Chem.1961，65，491-495；Karabatsos，G.J.；等.J.Am.Chem.Soc.1963，85，2784-2788；Karabatsos，G.J.；Taller，R.A.J.Am.Chem.Soc.1963，85，3624-3629；Sheradsky，T.；Nov，E.J.Chem.Soc.Perkin Trans.I1980，12，2781-2786；Karabatsos，G.J.；His，N.Tetrahedron 1967，23，1079-1095；Rappoport，Z.；Sheradsky，T.J.Chem.Soc.B，Phys.Org.1967，9，898-903)，僅僅syn-異構(gòu)體是預(yù)期的(并且所觀察到的，見下文)。
基于在其它有效的TTR淀粉狀蛋白生成抑制劑中所識(shí)別的結(jié)構(gòu)特征，選擇肟醚的取代基和取代模式(圖2)(Hammarstrm，P.；等.Science2003，299，713-716；Sacchettini，J.C.；Kelly，J.W.Nat.Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Cohen，F(xiàn).E.；Kelly，J.W.Nature 2003，426，6968，905-909；Miller，S.R.；Sekijima，Y.；Kelly，J.W.Lab.Invest.2004，84，545-552；Miroy，G.J.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996，93，15051-15056；Peterson，S.A；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，95，12956-12960；Petrassi，H.M.；等.J.Am.Chem.Soc.已提交；Purkey，H.E.；等.Chemistry & Biology.付印中；Adamski-Werner，S.L.；等.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Green，N.S.；等.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414；Petrassi，H.M.；等.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；Baures，P.W.；等.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Oza，V.B.；等.Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9，1-6；Baures，P.W.；等.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Klabunde，T.；等.Nat.Struct.Biol.2000，7，312-321；Oza，V.B.；等.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Razavi，H.；等.Angew.Chem.Int.Ed.2003，42，2758-2761)。所選擇的芳氧基胺(1-8)具有與芳基醛相同的取代模式，區(qū)別是在芳氧基胺中不存在對(duì)-CF3(i)和甲狀腺素狀的取代模式(e和f)。令人遺憾地，唯一市售可得的芳氧基胺是苯氧基胺；因而制備二芳基肟醚庫所需要的合成芳氧基胺結(jié)構(gòu)單元的方法描述于本文中以及其它文獻(xiàn)中(Abele，E.；Lukevics，E.Org.Prep.Proced.Int.2000，32，235-264；Petrassi，H.M.；Sharpless，K.B.；Kelly，J.W.Org.Lett.2001，3，139-142；Miyazawa，E.；等.Org.Prep.Proced.Int.1997，29，594-600；Choong，I.C.；Ellman，J.A.J.Org.Chem.1999，64，6528-6529)。相反，超過150種芳基肼是市售可得的，以便耦合到可容易獲得的芳基醛以產(chǎn)生二芳基腙庫(圖1，X＝NH)。因?yàn)轭愃频亩蓟棵押投蓟?此后分別稱為肟醚和腙)被設(shè)想是彼此同構(gòu)的，進(jìn)行腙庫(圖3)的快速自動(dòng)合成以查詢這種結(jié)構(gòu)類型的抑制劑是否可能是活性的(圖4)。
肟醚和腙的表征和結(jié)晶學(xué)比較。為證實(shí)所推測的同構(gòu)本性，分別合成了基于支架(scaffold)5b/d(圖2)和26b/d(圖3)的一組類似的肟醚和腙，使其結(jié)晶并且通過X射線衍射確定它們的結(jié)構(gòu)。通過結(jié)晶學(xué)比較肟醚和腙結(jié)構(gòu)揭示了這些類似的化合物幾乎彼此是可疊合的(圖5)。全部四種晶體結(jié)構(gòu)顯示了syn-亞胺鍵，進(jìn)一步支持了這種異構(gòu)體的優(yōu)勢地位(Karabatsos，G.J.；等.J.Am.Chem.Soc.1962，84，753-755；Lustig，E.J.Phys.Chem.1961，65，491-495；Karabatsos，G.J.；等.J.Am.Chem.Soc.1963，85，2784-2788；Karabatsos，G.J.；Taller，R.A.J.Am.Chem.Soc.1963，85，3624-3629；Sheradsky，T.；Nov，E.J.Chem.Soc.Perkin Trans.I1980，12，2781-2786；Karabatsos，G.J.；His，N.Tetrahedron 1967，23，1079-1095；Rappoport，Z.；Sheradsky，T.J.Chem.Soc.B，Phys.Org.1967，9，898-903)。
與腙(＞94％純度)和肟醚(＞95％純度)庫產(chǎn)生有關(guān)的全部粗制的反應(yīng)混合物的HPLC和LC-MS軌跡主要顯示出一個(gè)峰，這暗示了單一異構(gòu)體(syn-亞胺鍵，從現(xiàn)有技術(shù)推斷出的并且由X射線晶體學(xué)支持的)的優(yōu)勢地位。原則上有可能syn-異構(gòu)體和anti-異構(gòu)體共洗脫或者快速互變，并且優(yōu)先以syn-異構(gòu)體的形式結(jié)晶；然而，通過傳統(tǒng)方式合成的腙和肟醚的1H-和13C-NMR譜顯示與單一異構(gòu)體一致的共振態(tài)(現(xiàn)有文獻(xiàn)證實(shí)在室溫下通過NMR，優(yōu)選的syn-異構(gòu)體可與anti-異構(gòu)體區(qū)分)(Karabatsos，G.J.；等.J.Am.Chem.Soc.1962，84，753-755；Lustig，E.J.Phys.Chem.1961，65，491-495；Karabatsos，G.J.；等.J.Am.Chem.Soc.1963，85，2784-2788；Karabatsos，G.J.；Taller，R.A.J.Am.Chem.Soc.1963，85，3624-3629；Sheradsky，T.；Nov，E.J.Chem.Soc.Perkin Trans.I 1980，12，2781-2786；Karabatsos，G.J.；His，N.Tetrahedron 1967，23，1079-1095)。
肟醚庫的合成和活性。因?yàn)殡?全部＞94％純度)顯示出抑制活性，因此設(shè)想等效的肟醚庫也將產(chǎn)生TTR淀粉狀蛋白生成抑制劑。這種設(shè)想在本文中得到證實(shí)。若干二芳基腙顯示出有效的TTR淀粉狀蛋白生成的抑制(圖4)，這證明了類似的肟醚庫的制備和評(píng)價(jià)的正確性。含水的腙的不穩(wěn)定性(主要由于席夫堿的水解)和腙的生物毒性提供了制備二芳基肟醚庫的其它動(dòng)機(jī)。使用兩種合成策略以制備產(chǎn)生二芳基肟醚庫所需的芳氧基胺。在第一種策略中，N-羥基苯鄰二甲酰亞胺(NHP)與芳基硼酸的銅介導(dǎo)的交互耦合提供了肼解后的所期望的芳氧基胺(圖6)(Petrassi，H.M.；Sharpless，K.B.；Kelly，J.W.Org.Lett.2001，3，139-142)。使用這種方法，以優(yōu)良的至中等的總收率來合成，或者以游離堿的形式分離的(3、6和7)或者以其鹽酸鹽的形式沉淀的(1和8)，芳氧基胺。
銅介導(dǎo)的耦合方法看來似乎與芳基硼酸上的鄰位鹵化物或者鄰位CF3取代基不相容(Petrassi，H.M.；Sharpless，K.B.；Kelly，J.W.Org.Lett.2001，3，139-142)。此外，肼解，N-羥基苯鄰二甲酰亞胺中間體的脫保護(hù)所需的，對(duì)于具有鄰位羧基取代基的芳氧基胺來說，是不成功的。在研究若干其它方法后，選擇通過N-羥基亞氨逐乙酸乙酯(acetimidate)的缺電子的氟苯的親核性芳香取代來補(bǔ)充第一種方法(圖7)(Miyazawa，E.；等.Org.Prep.Proced.Int.1997，29，594-600)。N-羥基亞氨逐乙酸乙酯對(duì)2-三氟甲基氟苯的親核攻擊獲得了15的極好的收率(89％)，這在酸性水解時(shí)獲得了芳氧基胺5(96％收率)，以其HCl鹽的形式使用。使用這種方法的變體來制備衍生自2和4的等效物的肟醚(見下文)。
使用芳氧基胺1和5-8以產(chǎn)生一部分肟醚庫(圖2)。在25℃，在24h內(nèi)，在DMSO中，在乙酸(0.08M)存在下，芳基醛(0.1M)和芳氧基胺(0.125M)間的反應(yīng)，以近似定量的收率獲得肟醚(全部的苯氧基胺和肼，由于它們?cè)趲旌铣芍械倪^量使用，作為TTR淀粉狀蛋白抑制劑進(jìn)行測試，沒有顯示出抑制作用)。以每孔一種化合物的形式使用Gilson 215液體處理機(jī)，使五種芳氧基胺(1和5-8)和十二種醛(a-I)以全部可能的組合進(jìn)行縮合而得到60種肟醚。在全部孔中，通過LC-MS來分析反應(yīng)以確定收率(98-100％，基于醛消耗，見實(shí)驗(yàn)部分)和產(chǎn)物純度(＞95％)，全部產(chǎn)物顯示出其預(yù)期的質(zhì)量。在7種情況(1e、5d-f、7e和8e-f)中，其中以常規(guī)方式合成的純化合物并且進(jìn)行全部的表征(參見支持信息實(shí)驗(yàn)部分)，HPLC共洗脫證實(shí)了產(chǎn)品結(jié)構(gòu)和純度。
通過傳統(tǒng)合成方法制備并且以mg數(shù)量分離的肟醚庫的其余成員(參見實(shí)驗(yàn)部分和支持信息，通過RP-HPLC確定的化合物純度的全部特征數(shù)據(jù)和圖8)。在催化HCl存在下O-(3-羧基苯基)羥胺(3)與芳基醛a-1縮合以提供肟醚3a-1，收率為適中-極好。使用N-羥基亞氨逐乙酸乙酯SNAr方法(圖9)，分別制備化合物20和21，總收率為45和51％。芳基亞氨逐乙酸酯沒有水解為相應(yīng)的芳氧基胺2和4，相反，它們與化學(xué)計(jì)量的量的芳基醛在酸性條件下混合而直接提供肟醚2a-1和4a-1，收率為適中-極好(由于不穩(wěn)定性，肟醚2b是不能分離出來的)。
在圖10中總結(jié)了肟醚(7.2μM)抗酸介導(dǎo)(pH值4.4)TTR(3.6μM)淀粉狀蛋白生成的抑制活性。在所合成的95種肟醚中，31種顯示了優(yōu)良的效能，其將TTR淀粉狀蛋白生成減小至在沒有抑制劑的情況下WT-TTR所顯示的值的＜10％(90％抑制，藍(lán)色)，9種顯示了中等活性(11-30％原纖形成，綠色)，和其余55種顯示了差的活性(黃色)。
衍生自苯甲醛與甲狀腺素狀取代模式(圖10，行e和f)的肟醚是高度有效的(全部16種顯示出＞90％抑制)，即使當(dāng)與未被取代的苯氧基胺耦合時(shí)，耦合通常產(chǎn)生差的肟醚抑制劑。這些結(jié)果挑戰(zhàn)了先前的信條，其在兩個(gè)環(huán)上需要合適的取代基以實(shí)現(xiàn)抑制作用。
無論所述環(huán)是否具有羧酸取代基，源于鹵化芳氧基胺與間或?qū)︳然郊兹┑目s合(或者反之亦然)的其它肟醚，產(chǎn)生了有效的抑制劑。這些結(jié)果建議結(jié)合取向可以改變以保持與Lys-15的ε-NH3+基團(tuán)的靜電相互作用。衍生自鄰羧基苯甲醛的肟醚都未產(chǎn)生良好的抑制劑。羧基苯甲醛衍生的肟醚的活性的從好至壞的排序?yàn)殚g位＞對(duì)位＞鄰位，這類似于衍生自羧基苯氧基胺的肟醚間位≈對(duì)位＞鄰位。在兩個(gè)環(huán)帶有羧酸或者鹵素的肟醚(不包括T4狀取代)最多也就顯示出中等活性。
盡管芳基醛和苯氧基胺縮合所用的設(shè)備有助于動(dòng)態(tài)組合庫方法(Nazarpack-Kandlousy，N.；等.J.Comb.Chem.1999，199-206；Hochgürtel，M.；等.Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.2002，99，3382-3387)，但是可能的復(fù)雜情況是先前報(bào)道由于在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)間的變構(gòu)通信，使用兩個(gè)不同的結(jié)合在一起的小分子的話，抑制作用一般是最大的(Green，N.S.；等.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414)。因此，在動(dòng)態(tài)組合庫中所產(chǎn)生的抑制劑的結(jié)合的影響可能使結(jié)構(gòu)活性關(guān)系數(shù)據(jù)復(fù)雜化。
二芳基醛肟醚穩(wěn)定性。雖然許多二芳基醛肟醚是TTR淀粉狀蛋白生成的有效的抑制劑(圖10)，但是它們?cè)谒嵝曰蛘邏A性的含水介質(zhì)中顯示出一定范圍的穩(wěn)定性(在TTR不存在的情況下，一階降解半衰期為數(shù)小時(shí)至數(shù)天)。雖然肟醚，不同于腙，在中性或者堿性條件中對(duì)于席夫堿水解表現(xiàn)出穩(wěn)定性，但是它們?nèi)匀煌ㄟ^斷裂它們的N-O鍵在表觀上以一階動(dòng)力學(xué)的方式緩慢地分解，從而獲得苯酚和芳腈。這種N-O鍵斷裂，雖然在較高溫度下存在先例，但是在所述溫和條件下是未被預(yù)期的(Miller，M.J.；Loudon，G.M.J.Org.Chem.1975，40，126-127；Supsana，P.；Tsouongas，P.G.；Varvounis，G.Tet.Lett.2000，41，1845-1847；Knudsen，R.D.；Snyder，H.R.J.Org.Chem.1974，39，3343-3346；Gómez，V.；Pérez-Medrano，A.J.Org.Chem.1994，59，1219-1221；Cho，B.R.；等.J.Org.Chem.1991，56，5513-5517；Royer，R.E.；等.J.Med.Chem.1986，29，1799-1801；Castellino，A.J.；Rapoport，H.J.Org.Chem.1986，51，1006-1011；Blake，J.A.；等.J.Org.Chem.2004，69，3112-3120)。
從定性方面來說，肟醚相比于類似的腙更加穩(wěn)定，這是根據(jù)它們的表觀降解″半衰期″而言的(當(dāng)降解過程不是一階的時(shí)候，表觀的腙″半衰期″是指50％消失所需的時(shí)間)。給電子基團(tuán)和在任一芳族環(huán)上的鄰位取代基似乎提高了二芳基醛肟醚和二芳基腙的降解速率。
通常，結(jié)合到TTR(3.6μM)的抑制劑(7.2μM)發(fā)揮作用以便在酸介導(dǎo)的原纖形成條件(pH值為4.4、37℃、72h)下使化合物穩(wěn)定而不降解。對(duì)于11種最佳抑制劑(＜10％原纖形成)來說，RP-HPLC分析顯示了在酸介導(dǎo)的原纖形成分析結(jié)束時(shí)，保持了＞74％的最初的肟醚(圖11)。最不穩(wěn)定的抑制劑(1e、1f、2k、3g、5d*)在72h內(nèi)在TTR不存在情況下發(fā)生幾乎完全的降解；然而，它的存在了保持了＞74％的最初的用量。顯著地，抑制劑5e在TTR存在下沒有顯示出分解。這有助于解釋為什么許多不穩(wěn)定的二芳基肟抑制劑經(jīng)證明是極好的TTR淀粉狀蛋白生成的抑制劑不僅抑制劑結(jié)合到TTR的甲狀腺激素結(jié)合位點(diǎn)并且對(duì)TTR四聚物施加了動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性(Hammarstrm，P.；等.Science 2003，299，713-716)，而且，TTR結(jié)合還使得抑制劑穩(wěn)定以對(duì)抗降解。
此外還進(jìn)行了分析以有助于證實(shí)活性主要是由于單獨(dú)的肟醚造成的而不是由于它們的建議的(proposed)降解產(chǎn)物造成的。為確定降解的副產(chǎn)物是否有助于所觀察的抑制劑效能，對(duì)相應(yīng)的酚和腈(就肟醚來說)、苯胺(就腙來說)和醛(就肟醚和腙兩者來說)分析了它們的原纖形成抑制性質(zhì)。在四聚物TTR的兩倍濃度下，3，5-二鹵-4-羥基芐腈和類似的醛降解產(chǎn)物是TTR原纖形成的有效的抑制劑(圖12)。在四聚物TTR(3.6μM)的兩倍濃度(7.2μM)下，3，5-二氯苯酚也抑制了原纖形成達(dá)86％。然而，其它降解產(chǎn)物(腈、苯酚或者苯胺)沒有一種顯示出明顯的活性。因此得到如下結(jié)論是合理的絕大多數(shù)的淀粉狀蛋白生成抑制劑的效能是由于母體二芳基肟醚造成的而不是降解的副產(chǎn)物造成的，這提供了一種動(dòng)機(jī)以理解降解的機(jī)械論需求并且為藥物化學(xué)之目的來使這些或者相關(guān)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
在抑制劑8f存在下在淀粉狀蛋白生成條件下TTR的四元結(jié)構(gòu)的分析超速離心評(píng)估。使用沉降速度和平衡分析超速離心試驗(yàn)來評(píng)估在淀粉狀蛋白生成條件下抑制劑8f對(duì)于TTR的四元結(jié)構(gòu)的影響，所述淀粉狀蛋白生成條件一般使四聚物離解并且使得單體具備不正確裝配的能力(72h、pH值為4.4、37℃)。在這些條件下，在50,000rpm下，對(duì)結(jié)合到WT-TTR(3.6μM)的肟醚8f(7.2μM)進(jìn)行沉降速度分析(圖13)，顯示了TTR保持為四聚的，以單種物質(zhì)的形式沉降，S值為3.7，相應(yīng)于分子量48.4±0.2kDa。在缺乏抑制劑的相同試驗(yàn)中，四聚物TTR是不可檢測到的，僅僅觀察到高分子量的TTR聚集體，這與淀粉狀蛋白生成過程一致。通過沉降平衡分析(17,000rpm)的進(jìn)一步研究顯示適于單一理想物質(zhì)模型(圖14；52.1±0.2kDa)的數(shù)據(jù)與四聚物WT-TTR·(8f)2的計(jì)算分子量(56，374Da)非常相符。作為濃度函數(shù)的、跨越細(xì)胞的分子量分布的分析還指出了分子量略高于50kDa的單一物質(zhì)。
結(jié)合到人血漿中TTR的肟醚的選擇性。為在臨床研究中使用小分子以檢測淀粉狀蛋白假設(shè)(這樣的想法，淀粉狀蛋白生成過程導(dǎo)致神經(jīng)毒性或者組織損傷)，它們必須在其它血漿蛋白質(zhì)存在下選擇性地結(jié)合到血漿中的TTR。使用先前所報(bào)道的抗體捕獲/HPLC方法(Purkey，H.E.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2001，98，5566-5571)，評(píng)估最具活性的肟醚對(duì)人血漿中TTR的結(jié)合化學(xué)計(jì)量。簡要地，在10.8μM濃度(大約為TTR的血漿濃度的2-3倍)下將檢測化合物溶解在人血漿中。在培養(yǎng)24h(37℃)后，使用共價(jià)連接到瓊脂糖樹脂的多克隆TTR抗體來免疫沉淀TTR和任何與其結(jié)合的小分子。洗滌樹脂，在高pH值下使TTR·(小分子)n＜2絡(luò)合物離解，然后通過反相分析HPLC使用標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定與TTR結(jié)合的小分子的化學(xué)計(jì)量，以便量化抑制劑和TTR的相對(duì)量(由于TTR的兩個(gè)甲狀腺素結(jié)合位點(diǎn)，最大抑制劑化學(xué)計(jì)量是2)。因?yàn)樵诳贵w捕獲后的必需的洗滌步驟中，一些抑制劑可能受到損失，所以這種方法確定了抑制劑結(jié)合化學(xué)計(jì)量的下限。
圖15中展示的是，二芳基肟醚的結(jié)合化學(xué)計(jì)量的下限顯示出對(duì)血漿TTR的＞90％淀粉狀蛋白抑制(7.2μM)。在31種被測的化合物中，11種顯示了TTR結(jié)合化學(xué)計(jì)量超過1.0，其中3種顯示了大于1.5的結(jié)合當(dāng)量。顯示出最高結(jié)合化學(xué)計(jì)量的肟醚衍生自這樣的醛，其中一個(gè)芳族環(huán)具有甲狀腺素狀(例如，3，5-二鹵-4-羥基)的取代模式。這種結(jié)果是非常重要的，因?yàn)槠湟馕吨?，5-二鹵-4-羥基取代的芳基環(huán)的結(jié)合，在大部分其它血漿蛋白質(zhì)，包括甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白白蛋白(其濃度為TTR的大約150倍)在內(nèi)，賦予了TTR血漿結(jié)合選擇性。(Stockigt，J.R.ThyroidHormone Binding and Metabolism.Endocrinology，第4版Degroot，L.J.，Jameson，J.L.，Eds.；W.B.Saunders Co.Philadelphia，2001，第2卷，第94章，1314-1326；Petitpas，I.；等.Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.2003，100，6440-6445)。然而，這些結(jié)果沒有說明這些化合物結(jié)合到血液中主要的甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，TBG的可能性，其濃度為TTR的約1/10。因此，TBG結(jié)合容量的飽和將對(duì)TTR結(jié)合選擇性結(jié)果具有很小的影響(Stockigt，J.R.Thyroid Hormone Binding and Metabolism.Endocrinology，第4版Degroot，L.J.，Jameson，J.L.，Eds.；W.B.Saunders Co.Philadelphia，2001，第2卷，第94章，1314-1326)。數(shù)種經(jīng)由自動(dòng)過程合成的肟醚，其顯示出超過0.5的結(jié)合化學(xué)計(jì)量(1e、5d-f、7e和8e-f)，此外也通過常規(guī)方法以mg數(shù)量進(jìn)行了合成，分離并且再評(píng)估了它們的結(jié)合化學(xué)計(jì)量。在所有情況下，獲得了相同的結(jié)果，說明了經(jīng)由自動(dòng)過程制備的肟醚和通過傳統(tǒng)方法制備的那些是吻合的。
WT-TTR·(5d)2的晶體結(jié)構(gòu)。為了闡明二芳基肟醚的淀粉狀蛋白抑制的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，獲得了顯示出有效的聚集抑制和血漿選擇性的數(shù)種化合物的共晶結(jié)構(gòu)。WT-TTR·(5d)2復(fù)合物提供了最佳的共晶結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，具有1.53分辨率，并且在本文中進(jìn)行了展示(圖16和圖17)。雖然有高分辨率數(shù)據(jù)，三氟甲基-取代的芳族環(huán)僅在電子密度省略圖的小于1σ輪廓的條件下是可見的，這說明在那些區(qū)域中的較高的柔性。然而，側(cè)鏈取向和搖擺的″n″個(gè)翹曲度省略圖(Reddy，V.；等.Acta Crystallogr.，Sect.D，Biol.Crystallogr.2003，59，2200-2210)產(chǎn)生了在蛋白質(zhì)中心通道(在每個(gè)甲狀腺激素結(jié)合袋中的通道)中結(jié)合的兩個(gè)分子的最終的取向和位置，大致處于其最低能量構(gòu)型中。每個(gè)激素位點(diǎn)包含兩個(gè)對(duì)稱等價(jià)的結(jié)合構(gòu)型，這是由于兩次折疊的對(duì)稱軸二等分結(jié)合通道造成的。
抑制劑5d以“向前”結(jié)合方式存在于TTR中，這是指那些具有羧酸取代的芳族環(huán)的抑制劑被置于外腔中，使得有利于與Lys-15的靜電相互作用(Klabunde，T.；等.Nat.Struct.Biol.2000，7，312-321)。羧基與Thr-106(2.73)和Lys-15殘基形成氫鍵；Lys-15側(cè)鏈有助于與抑制劑發(fā)生疏水(ε-CH2)和靜電(ε-NH3+-3.3)相互作用。此外當(dāng)抑制劑在Leu-17、Leu-17′、Ala-108、Ala-108′、Leu-110、Leu-110′、Thr-119、Thr-119′、Val-121和Val-121′的疏水側(cè)鏈間堆疊時(shí)，通過疏水和范德華相互作用來使結(jié)合穩(wěn)定。三氟甲基取代基占據(jù)了內(nèi)腔中的鹵素結(jié)合袋3(HBP-3)的一部分。內(nèi)腔Ser-117羥基遠(yuǎn)離抑制劑取向，這有助于經(jīng)由其β-CH2子結(jié)構(gòu)的另外的疏水相互作用。連接基氧和氮看起來沒有與TTR發(fā)生靜電相互作用，因此未必對(duì)其結(jié)合和活性具有大的作用，這與肟醚和腙所顯示出的類似活性以及早先有關(guān)均二苯乙烯、二芳基胺和二芳基醚全部是活性的報(bào)道一致(Hammarstrm，P.；等.Science 2003，299，713-716；Sacchettini，J.C.；Kelly，J.W.Nat.Rev.Drug Disc.2002，1，267-275；Cohen，F(xiàn).E.；Kelly，J.W.Nature 2003，426，6968，905-909；Miller，S.R.；Sekijima，Y.；Kelly，J.W.Lab.Invest.2004，84，545-552；Miroy，G.J.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996，93，15051-15056；Peterson，S.A.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1998，95，12956-12960；Petrassi，H.M.；等.J.Am.Chem.Soc.已提交；Purkey，H.E.；等.Chemistry & Biology.付印中；Adamski-Werner，S.L.；等.J.Med.Chem.2004，47，355-374；Green，N.S.；等.J.Am.Chem.Soc.2003，125，13404-13414；Petrassi，H.M.；等.J.Am.Chem.Soc.2000，122，2178-2192；Baures，P.W.；等.Bioorg.Med.Chem.1998，6，1389-1401；Oza，V.B.；等.Bioorg.Med.Chem.Lett.1999，9，1-6；Baures，P.W.；等.Bioorg.Med.Chem.1999，7，1339-1347；Klabunde，T.；等.Nat.Struct.Biol.2000，7，312-321；Oza，V.B.；等.J.Med.Chem.2002，45，321-332；Razavi，H.；等.Angew.Chem.Int.Ed.2003，42，2758-2761)。然而，連接基所采取的構(gòu)型對(duì)于兩個(gè)芳族環(huán)的取向看起來是關(guān)鍵的。
實(shí)驗(yàn)部分 一般性合成法。
除非另有說明，全部化學(xué)品購自商業(yè)供應(yīng)商并且未經(jīng)進(jìn)一步提純而被使用。反應(yīng)進(jìn)程是通過在涂覆有硅膠60 F254的玻璃板(EM Sciences)上薄層色譜法和/或通過分析RP-HPLC來監(jiān)控。使用230-400目的硅膠60(EM Sciences)，進(jìn)行全部的快速色譜法。NMR譜在Bruker 300、400、500或者600MHz的光譜儀上記錄。對(duì)于CDCl3溶液，化學(xué)位移是相對(duì)于內(nèi)標(biāo)Me4Si(0.0ppm)以ppm低磁場報(bào)道的，或者在13C-NMR中看不見Me4Si的情況中，在溶劑峰(CDCl3，77.16ppm)上進(jìn)行校準(zhǔn)。對(duì)于d6-DMSO、d6-丙酮或者CD3OD中的樣品來說，就1H-NMR而言，分別對(duì)3.49、2.05、以及3.31ppm處的溶劑峰進(jìn)行校準(zhǔn)，就13C-NMR而言，分別對(duì)39.52、29.84以及49.00ppm處的溶劑峰進(jìn)行校準(zhǔn)。反相高效液相色譜法(RP-HPLC)是在Waters 600E多溶劑輸送系統(tǒng)上，使用Waters 486可調(diào)吸光率檢測器以及Waters 717自動(dòng)取樣器進(jìn)行的。ThermoHypersil-Keystone Betabasic-18柱用于分析反相HPLC分析(型號(hào)71503-034630，150孔徑，3μM粒徑)，Vydac C18柱用于制備HPLC(型號(hào)218TP1022，300孔徑，5μM粒徑，22mm內(nèi)徑×250mm)。溶劑系統(tǒng)A是含有0.25％三氟乙酸(TFA)的95∶5的H2O∶CH3CN和溶劑B是含有0.25％TFA的5∶95的H2O∶CH3CN線性梯度從0∶100、80∶20或者60∶40A∶B運(yùn)行到0∶100A∶B。高效液相色譜質(zhì)譜(HPLC-MS)在HewlettPackard HPLC-MS上進(jìn)行，其裝備有Zorbax SB-C18(5mm，2.1×50mm)柱溶劑輸送是使用Gilson 215液體處理機(jī)進(jìn)行的。全部質(zhì)譜數(shù)據(jù)在theScripps Research Institute Center for Mass Spectrometry處收集。
用于制備苯氧基胺的銅介導(dǎo)的苯基硼酸和N-羥基苯鄰二甲酰亞胺的耦合的典型過程(方法1)9的合成。
向20mL閃爍管(scintillation vial)填裝N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(163mg，1.0mmol)、氯化亞銅(I)(99mg，1.0mmol)、新活化的4分子篩(約250mg)和苯基硼酸(244mg，2.0mmol)。添加1，2-二氯乙烷(5ml)，隨后添加吡啶(90μL，1.1mmol)，得到淺棕色懸浮液。將蓋子松松地施加，使得反應(yīng)懸浮液敞開于空氣中，并且在室溫下攪拌直到完成為止，如分析RP-HPLC所檢測的(隨著反應(yīng)進(jìn)行，混合物顏色從褐色變?yōu)榇渚G色)。在完成(約48小時(shí))后，將混合物吸附到硅膠上并且濃縮成粉末。在二氧化硅(25％EtOAc/己烷)上的快速色譜提純提供了N-苯氧基鄰苯二甲酰亞胺9，為白色固體(216mg，90％)；表征數(shù)據(jù)參見下文。
N-苯氧基鄰苯二甲酰亞胺(9)。
9的制備如以上的典型過程(方法1)所述。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.12-7.20(m，3H)，7.32-7.38(m，2H)，7.80-7.84(m，2H)，7.90-7.94(m，2H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ114.4，124.0，128.8，129.7，134.9，158.9，162.9；MALDI-FTMS(DHB)240.0656m/z[MH]+，C14H10NO3，要求值240.0655。
N-(3-三氟甲基苯氧基)鄰苯二甲酰亞胺(10)。
如上面所概述的(方法1)，借助N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(NHP)，使3-三氟甲基苯基硼酸(380mg，2.0mmol)進(jìn)行典型的耦合過程。在二氧化硅(40％EtOAc/己烷)上的快速色譜提純提供了10，為白色固體(270mg，88％)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ7.34-7.38(m，1H)，7.40-7.45(m，2H)，7.47(m，J＝0.9，8.1Hz，1H)，7.82-7.87(m，2H)，7.92-7.97(m，2H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ111.6，117.8，118.1，121.4，122.3，124.2，128.8，130.5，132.2，135.1，159.0，162.8；LC-MS 309 m/z[MH]+，C15H9F3NO3需要值309。
N-(3，5-二氯苯氧基)鄰苯二甲酰亞胺(11)。
如上面所概述的(方法1)，借助NHP，使3，5-二氯苯基硼酸(382mg，2.0mmol)進(jìn)行典型的耦合過程。在二氧化硅(50％CH2Cl2/己烷)上的快速色譜提純提供了11，為白色固體(139mg，45％)。
1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ7.07(m，2H)，7.13-7.16(m，1H)，7.81-7.86(m，2H)，7.71-7.96(m，2H)；13C-NMR(150MHz，CDCl3).113.7，124.2，125.0，128.8，135.2，135.9，159.7，162.5；LC-MS 276 m/z[MH]+，C14H8Cl2NO3需要值276。
N-(3，5-二氟苯氧基)鄰苯二甲酰亞胺(12)。
如上面所概述的(方法1)，借助NHP，使3，5-二氟苯基硼酸(316mg，2.0mmol)進(jìn)行典型的耦合過程。在二氧化硅(10％CH2Cl2/甲苯)上的快速色譜提純提供了12，為白色固體(197mg，72％)。
1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ6.58-6.63(m，1H)，6.68-6.73(m，2H)，7.82-7.87(m，2H)，7.92-7.97(m，2H)；13C-NMR(150MHz，CDCl3)δ98.5(m)，100.3(t，JC-F＝25.3Hz)，124.4，128.7，135.4，160.5(t，JC-F＝13.8Hz)，162.6，163.6(dd，JC-F＝13.8，249Hz)；MALDI-FTMS(DHB)276.0456m/z[MH]+，C14H8F2NO3需要值276.0467。
N-(3-甲氧羰基苯氧基)鄰苯二甲酰亞胺(13)。
如上面所概述的(方法1)，借助NHP，使3-甲氧羰基苯基硼酸進(jìn)行類似的耦合過程。向100ml圓底燒瓶中填裝N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(2.19g，13.4mmol)、氯化亞銅(I)(1.34g，13.5mmol)、新活化的4分子篩(約5g)和3-甲氧羰基苯基硼酸(4.79g，26.6mmol)。添加1，2-二氯乙烷(60ml)，隨后添加吡啶(1.20mL，14.8mmol)，在室溫下在空氣氣氛中攪拌反應(yīng)懸浮液。4天后，將混合物吸附到硅膠上并且濃縮成粉末。在二氧化硅(33-50％梯度，EtOAc/己烷)上的快速色譜提純提供了13，為白色固體(1.85g，46％)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ3.90(s，3H)，7.38-7.41(ddd，J＝1.0，2.5，8.3Hz，1H)，7.44(t，J＝8.3Hz，1H)，7.78(dd，J＝1.0，2.5Hz，1H)，7.82-7.86(m，3H)，7.92-7.96(m，2H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ52.5，115.0，119.3，124.3，125.9，129.0，130.0，132.1，135.2，159.0，163.0，166.2；ESI-MS298 m/z[MH]+，C16H12NO5需要值298。
用于將N-芳氧基鄰苯二甲酰亞胺肼解為相應(yīng)的O-芳基羥基胺的典型過程(方法1A)合成化合物1。
將一水合肼(0.401mL，8.2mmol)緩慢地添加到10％MeOH/CHCl3(25ml)中的N-苯氧基鄰苯二甲酰亞胺9(652mg，2.73mmol)溶液中，并且在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物。當(dāng)完成(TLC監(jiān)控，12小時(shí))后，在無色反應(yīng)溶液中出現(xiàn)白色沉淀物(酞嗪)。使反應(yīng)混合物通過硅膠填料，用30％EtOAc/己烷洗滌。去除EtOAc/己烷得到了略淺黃色的油，其在由K2CO3(＜10mg)的Kugelrohr蒸餾后，得到了純的苯氧基胺1，為無色透明油(238mg，80％)；表征數(shù)據(jù)參見下文?；蛘撸谌コ鼸tOAc/己烷后，將所述黃色油溶解在Et2O中并且冷卻至0℃。在0℃10分鐘后，滴加4N HCl/二烷，直到pH值為3。過濾所得的白色固體并且用Et2O(2×10ml)洗滌，得到1，為純的HCl鹽(306mg，77％)。
O-苯胲鹽酸鹽(1)。
1的制備如以上的典型過程(方法1A)所述。
1H-NMR(400MHz，CD3OD)δ6.84-6.89(m，1H)，7.03-7.09(m，2H)，7.19-7.25(m，2H)；13C-NMR(100MHz，CD3OD)δ114.1，121.6，130.3，163.1；LC-MS 110m/z[MH]+，C6H8NO需要值110。
O-(3-三氟甲基苯基)羥胺(6)。
使N-(3-三氟甲基苯氧基)鄰苯二甲酰亞胺10(1.12g，3.65mmol)經(jīng)受如上所述的典型的肼解反應(yīng)(方法1A)。蒸餾(85℃/6mm)提供了純的6，為無色透明液體(582mg，90％)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ6.00(s，2H)，7.19-7.21(m，1H)，7.30(dd，J＝8.4，2.6Hz，1H)，7.38(t，J＝8.1Hz，1H)，7.45-7.47(m，1H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ110.4，117.2，117.9，130.9，162.1；LC-MS 178m/z[MH]+，C7H7F3NO需要值178。
O-(3，5-二氯苯基)羥胺(7)。
使N-(3，5-二氯苯氧基)鄰苯二甲酰亞胺11(711mg，2.31mmol)經(jīng)受如上所述的典型的肼解反應(yīng)(方法1A)。通過硅膠填料洗脫反應(yīng)混合物，使得固化游離堿7，為白色固體(378mg，92％)。
1H-NMR(600MHz，CDCl3)δ5.91(s，2H)，6.91-6.93(m，1H).7.06-7.09(m，2H)；13C-NMR(150MHz，CDCl3)δ112.9，121.9，135.9，163.2；LC-MS 179m/z[MH]+，C6H6Cl2NO需要值179。
O-(3，5-二氟苯基)羥胺鹽酸鹽(8)。
使N-(3，5-二氟苯氧基)鄰苯二甲酰亞胺12(1.74g，6.31mmol)經(jīng)受如上所述的典型的肼解反應(yīng)(方法1A)。沉淀HCl鹽，得到8，為白色固體(980mg，86％)。
1H-NMR(600MHz，CD3OD)δ6.83-6.90(m，3H)；13C-NMR(150MHz，CD3OD)δ99.3(dd，JC-F＝8.0，24.9Hz)，101.1(t，JC-F＝26.4Hz)，160.0，165.8(dd，JC-F＝15，248Hz)；LC-MS 146m/z[MH]+，C6H6F2NO需要值146。
O-(3-甲氧羰基苯基)羥胺(14)。
使N-(3-甲氧羰基苯氧基)鄰苯二甲酰亞胺13(271mg，0.912mmol)經(jīng)受如上所述的典型的肼解反應(yīng)(方法1A)，而得到14，為淺黃色糊漿(146mg，96％)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ3.91(s，3H)，5.92(s，2H)，7.29-7.32(m，1H)，7.33(t，J＝6.9Hz，1H)，7.63(dt，J＝1.8，6.9Hz，1H)，7.82-7.84(m，1H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ52.3，114.2，118.1，122.5，129.3，131.4，161.4，167.1；GC-MS 167m/z[M]+，C8H9NO3需要值167，152m/z[M-NH]+，C8H8O3需要值152. O-(3-羧基苯基)羥胺(3)。
LiOH·H2O(91.0mg，2.17mmol)被添加到在THF/MeOH/H2O的3/1/1mL混合物中的O-(3-甲氧羰基-苯基)羥胺14(90.4mg，0.541mmol)的溶液，并且在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物。24h后，反應(yīng)物用H2O(50ml)稀釋，借助0.5N HCl將其酸化至pH值約為3-4，并且用EtOAc(3×25mL)萃取。用H2O(25mL)和鹽水(25mL)洗滌合并的有機(jī)物，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮，得到3，為白色固體(78.7mg，95％)。
1H-NMR(500MHz，d6-DMSO)δ7.01(s，2H)，7.24(ddd，J＝1.4，2.8，8.3Hz，1H)，7.34(t，J＝7.8Hz，1H)，7.46(dt，J＝1.4，7.3Hz，1H)，7.68(dd，J＝1.4，2.8Hz，1H)；13C-NMR(125MHz，d6-DMSO)δ113.5，117.8，121.3，129.2，131.8，161.7，167.3；ESI-MS 162m/z[M-H+]-，C7H6NO3需要值162。
乙基-N-(2-三氟甲基苯氧基)亞氨逐乙酸酯(15)。
使用從Miyazawa等(Miyazawa，E.；等.Org.Prep.Proced.Int.1997，29，594-600)改編的過程來制備，在Ar氣氛下，在0℃，將tBuOK(0.78g，6.7mmol)添加到攪拌的N-羥基亞氨逐乙酸乙酯(1.00g，6.06mmol)/無水DMF(6mL)的溶液中。在tBuOK添加完成后，在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物。30分鐘后，添加2-氟代苯并三氟化物(1.29mL，6.06mmol)，在80℃加熱反應(yīng)物達(dá)2小時(shí)。在冷卻后，用冰水(100ml)稀釋反應(yīng)混合物并且用EtOAc(3×40mL)萃取。用鹽水(2×50mL)洗滌合并的有機(jī)層，用MgSO4干燥，濃縮，得到深色的油。在二氧化硅(10％EtOAc/己烷)上的快速色譜提純提供了15，為澄清液體(1.33g，89％)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ1.36(t，J＝7.1Hz，3H)，2.15(s，3H)，4.20(q，J＝7.1Hz，2H)，6.99(表觀t，J＝7.5Hz，1H)，7.47(表觀dt，J＝7.9Hz，1H)，7.52-7.57(m，2H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ14.3，14.5，63.2，114.2，116.2(q，JC-F＝31Hz)，120.3，123.7(q，JC-F＝272Hz)，126.4(q，JC-F＝4.8Hz)，133.2，157.2(q，JC-F＝1.9Hz)，167.1；LC-MS 248m/z[MH]+，C11H13F3NO2需要值248。
O-(2-三氟甲基苯基)羥胺鹽酸鹽(5)。
使用從Miyazawa等(Miyazawa，E.；等.Org.Prep.Proced.Int.1997，29，594-600)改編的過程來制備，在0℃，將70％HClO4(12mL)滴加到15(4.14g，16.7mmol)/1，4-二烷(19mL)的溶液中，然后在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物過夜。然后將反應(yīng)混合物傾倒入冰水(150ml)中并且借助固體NaOH顆粒將其調(diào)節(jié)至pH值為13。用EtOAc(3×150mL)萃取水層，用鹽水(2×75mL)洗滌合并的有機(jī)物，用MgSO4干燥，濃縮，得到深色的殘余物。如上對(duì)于其它芳氧基胺所述的，在二氧化硅(15％EtOAc/己烷)上進(jìn)行快速色譜提純，隨后沉淀該HCl鹽，得到5，為白色固體(3.42g，96％)。
1H-NMR(600MHz，CD3OD)δ7.37-7.41(m，1H)，7.48-7.51(m，1H)，7.76-7.79(m，2H)；13C-NMR(150MHz，CD3OD)δ114.6，125.0，126.3，127.6(q，JC-F＝5.7Hz)，128.3 134.5；LC-MS 178m/z[MH]+，C7H7F3NO需要值178。
基于芳氧基胺1和5-8的肟醚的庫合成。
制備庫，其格式為單一化合物/孔。在DMSO中制備全部醛(0.5M)和芳氧基胺(0.4M)的儲(chǔ)備溶液。使用Gilson 215液體處理機(jī)，其裝備有1mL的注射器、1.1mL的管和內(nèi)徑13mm的探針，來將全部溶液分布到96孔(體積2ml)的聚丙烯板中，速率為0.3毫升/分。為制備0.5mL的每種肟醚的0.1M溶液，將100μL(0.05mmol，1當(dāng)量)的醛、156μL(0.63mmol，1.25當(dāng)量)的芳氧基胺和244μL的0.164M乙酸分配到板的各個(gè)孔中。蓋上該板，使用雙重作用搖動(dòng)器在室溫下攪拌24小時(shí)。在DMSO中將反應(yīng)稀釋到720μM，通過LC-MS進(jìn)行分析，確定收率、純度和身份。在合成后，存儲(chǔ)化合物，在-20℃冷凍。
使用保留在反應(yīng)混合物中的醛的積分值，確定反應(yīng)收率。制備所有的醛的標(biāo)定曲線，并且計(jì)算各個(gè)肟醚的收率，假定全部反應(yīng)的醛定量地形成肟醚，即，如果反應(yīng)混合物中保留了5％的醛，那么肟醚的收率將為95％。收率為98-100％，并且在全部孔中，純度為＞95％。
將O-(3-羧基苯基)羥胺3耦合到芳基醛a-1的典型過程(方法2)。
向攪拌的O-(3-羧基苯基)羥胺3(約0.2mmol，1當(dāng)量)/1，4-二烷(3.0mL)的溶液中，添加醛(1當(dāng)量)，隨后1滴0.5N HCl，然后在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物。當(dāng)完成后，如通過反相HPLC(3-18小時(shí))確定的，用H2O(15mL)稀釋反應(yīng)物，過濾沉淀物，用H2O洗滌，收集，在真空中干燥。參考特定的合成詳述的支持信息和抑制劑3b-1的表征數(shù)據(jù)，其類似于以下3a所報(bào)道的那些。
苯甲醛-O-(3-羧基苯基)肟(3a)。
借助于3(31.8mg，0.208mmol)，使苯甲醛(21.0μL，0.207mmol)進(jìn)行典型的耦合過程，如以上所概述的(方法2)，獲得3a，為白色固體(29.0mg，58％)。
1H-NMR(500MHz，1∶1 CD3OD∶d6-DMSO)δ7.39-7.45(m，5H)，7.59-7.64(m，1H)，7.71-7.78(m，3H)，8.58(s，1H)；13C-NMR(125 MHz，d6-DMSO)δ114.5，118.8，123.3，127.7，129.1，129.3，130.8，131.1，132.3，153.3，158.9，166.9；MALDI-FTMS(DHB)242.0812 m/z[MH]+，C14H12NO3需要值242.0812。RP-HPLC98％純。
2-氟代苯甲酸芐基酯(16)。
在Ar氣氛下，在室溫下，將苯甲醇(2.60mL，25.1mmol)緩慢添加到攪拌的2-氟苯甲酸(2.92g，20.8mmol)、4-(二甲基氨基)吡啶(251mg，2.05mmol)和1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(5.16g，25.0mmol)/無水CH2Cl2的溶液中。18小時(shí)后，濾出沉淀物，用CH2Cl2洗滌，借助二氧化硅濃縮濾液，得到粉末。在二氧化硅(10％-20％梯度，EtOAc/己烷)上的快速色譜提純提供了16，為無色透明液體(4.20g，88％)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ5.39(s，2H)，7.14(ddd，J＝1.1，8.4，9.5Hz，1H)，7.20(dt，J＝1.1，7.7Hz，1H)，7.31-7.36(m，1H)，7.37-7.41(m，2H)，7.44-7.48(m，2H)，7.49-7.55(m，1H)，7.96(dt，J＝1.8，7.3Hz)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ 66.93，117.0(d，JC-F＝22.1Hz)，118.7(d，JC-F＝9.6Hz)，124.0(d，JC-F＝3.8Hz)，128.1，128.2，128.6，132.2，134.6(d，JC-F＝9.6Hz)，135.7，162.1(d，JC-F＝260Hz)，164.2(d，JC-F＝3.8Hz)；GC-MS 230m/z[M]+，C14H11FO2需要值230。
4-氟代苯甲酸芐基酯(17)。
在氬氣氣氛下，在室溫下，將苯甲醇(4.05mL，39.1mmol)緩慢添加到攪拌的4-氟苯甲酸(5.00g，35.7mmol)、4-(二甲基氨基)吡啶(432mg，3.53mmol)和1，3-二環(huán)己基碳二亞胺(8.15g，39.5mmol)/無水CH2Cl2的溶液中。18小時(shí)后，根據(jù)對(duì)于16的合成所概述的過程，對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行后處理。在二氧化硅(10％EtOAc/己烷)上的快速色譜提純提供了17，為無色透明液體(7.75g，94％)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ 5.35(s，2H)，7.06-14(m，2H)，7.32-7.41(m，3H)，7.41-7.47(m，2H)，8.06-8.12(m，2H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ66.84，115.5(d，JC-F＝22.0Hz)，126.4(d，JC-F＝2.9Hz)，128.2，128.3，128.6，132.3(d，JC-F＝9.6Hz)，135.9，165.5，165.8(d，JC-F＝253Hz)；GC-MS 230m/z[M]+，C14H11FO2需要值230。
乙基-N-(2-芐氧基羰基苯氧基)亞氨逐乙酸酯(18)。
向在Ar下攪拌的N-羥基亞氨逐乙酸乙酯(2.06g，20.0mmol)/無水DMF(60ml)的溶液中，一次性添加tBuOK(2.21g，19.7mmol)。30分鐘后，添加2-氟代苯甲酸芐基酯16(4.13g，17.9mmol)/DMF(20ml)的溶液，并且在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物。3小時(shí)后，用H2O(400mL)稀釋反應(yīng)，用EtOAc(3×100mL)萃取，將合并有機(jī)物用H2O(3×50mL)和鹽水(50ml)洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮。在二氧化硅(5％-10％梯度，EtOAc/己烷)上的快速色譜提純提供了18，為透明糊漿(3.61g，64％)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ1.34(t，J＝7.0Hz，3H)，2.00(s，3H)，4.18(q，J＝7.0Hz，2H)，5.34(s，2H)，6.96(dt，J＝1.1，7.7Hz，1H)，7.30-7.35(m，1H)，7.35-7.39(m，2H)，7.42-7.48(m，3H)，7.55(dd，J＝1.1，8.4Hz，1H)，7.90(dd，J＝1.8，7.7Hz，1H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ14.4，14.5，63.1，66.6，114.5，117.0，120.4，128.2，128.4，128.5，131.7，133.8，136.1，159.5，165.8，166.7；GC-MS 313 m/z[M]+，C18H19NO4需要值313，228m/z[M-85]+，2-羥基苯甲酸芐基酯C14H12O3需要值228。
乙基-N-(4-芐氧基羰基苯氧基)亞氨逐乙酸酯(19)。
向在Ar下攪拌的N-羥基亞氨逐乙酸乙酯(3.79g，36.8mmol)/無水DMF(150ml)的溶液中，一次性添加tBuOK(4.09g，36.4mmol)。40分鐘后，添加4-氟代苯甲酸芐基酯17(7.63g，17.9mmol)并且在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物。4小時(shí)后，用H2O(500ml)稀釋反應(yīng)，用EtOAc(4×100mL)萃取，將合并有機(jī)物用H2O(2×100mL)洗滌，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮。在二氧化硅(5％-10％梯度，EtOAc/己烷)上的快速色譜提純提供了19，為透明糊漿(6.02g，58％)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ1.36(t，J＝7.0Hz，3H)，2.12(s，3H)，4.20(q，J＝7.0Hz，2H)，5.34(s，2H)，7.15-7.19(m，2H)，7.31-7.35(m，2H)，7.36-7.41(m，2H)，7.42-7.36(m，2H)，8.00-8.14(m，2H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ14.3，14.4，63.1，66.4，1134，122.9，128.1，128.1，128.6，131.5，136.3，163.5，166.3，166.4；GC-MS 228m/z[M-85]+，4-羥基苯甲酸芐基酯C14H12O3需要值228。
乙基-N-(2-羧基苯氧基)亞氨逐乙酸酯(20)。
LiOH·H2O(431mg，10.3mmol)被添加到在THF/MeOH/H2O的9/3/3mL混合物中的乙基-N-(2-芐氧基羰基苯氧基)亞氨逐乙酸酯18(802mg，2.56mmol)的溶液，并且在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物。6小時(shí)后，反應(yīng)物用H2O(100ml)稀釋，用CH2Cl2(4×30mL)洗滌，借助0.5N HCl將其酸化至pH值約為5.0-5.5，并且用EtOAc(4×30mL)萃取。用H2O(30ml)和鹽水(30ml)洗滌合并的有機(jī)物，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮，得到20，為白色固體(459mg，80％)。
1H-NMR(500MHz，d6-丙酮)δ1.34(t，J＝6.9Hz，3H)，2.18(s，3H)，4.20(q，J＝6.9Hz，2H)，7.02(ddd，J＝0.9，7.3，7.8Hz，1H)，7.51(ddd，J＝1.8，7.3，8.7Hz，1H)，7.60(dd，J＝0.9，8.7Hz，1H)7.86(dd，J＝1.8，7.8Hz，1H)；13C-NMR(125MHz，d6-丙酮).δ14.6，14.7，63.8，115.2，118.5，121.3，132.4，134.5，160.2，166.8，167.4；ESI-MS 224 m/z[MH]+，C11H14NO4需要值224。
N-(4-羧基苯氧基)亞氨逐乙酸乙酯(21)。
LiOH·H2O(550mg，13.1mmol)被添加到在THF/MeOH/H2O的9/3/3mL混合物中的乙基-N-(4-芐氧基羰基苯氧基)亞氨逐乙酸酯19(1.04g，3.32mmol)的溶液中，并且在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物。24小時(shí)后，反應(yīng)物用H2O(100ml)稀釋，用CH2Cl2(4×30mL)洗滌，借助0.5N HCl將其酸化至pH值約為5.0-5.5，并且用EtOAc(3×30mL)萃取。用H2O(30ml)和鹽水(30ml)洗滌合并的有機(jī)物，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮，得到21，為白色結(jié)晶固體(698mg，94％)。
1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ1.37(t，J＝6.9Hz，3H)，2.14(s，3H)，4.22(q，J＝6.9Hz，2H)，7.18-7.22(m，2H)，8.04-8.08(m，2H)；13C-NMR(125MHz，CDCl3)δ 14.5，14.6，63.3，113.7，122.1，132.3，164.2，166.7，172.0；ESI-MS 224 m/z[MH]+，C11H14NO4需要值224。
用于將乙基-N-(2-羧基苯氧基)-亞氨逐乙酸酯20或者N-(4-羧基苯氧基)亞氨逐乙酸乙酯21耦合到芳基醛a-1，分別獲得肟醚2a-1和4a-1的典型過程(方法3)。
向亞氨逐乙酸酯20或者21(約0.1-0.3mmol，1當(dāng)量)和醛(約0.1-0.3mmol，1當(dāng)量)/1，4-二烷(2.0mL)的溶液中，添加70％HClO4(0.9當(dāng)量)并且在室溫?cái)嚢璺磻?yīng)物。當(dāng)完成后，如通過反相HPLC(2-6小時(shí))確定的，用H2O(20ml)稀釋反應(yīng)物，過濾沉淀物，用H2O洗滌，收集，在真空中干燥。參考特定的合成詳述的支持信息和抑制劑2c-1和4b-1的表征數(shù)據(jù)，其類似于以下2a所報(bào)道的那些。
苯甲醛-O-(2-羧基苯基)肟(2a)。
將70％HClO4(14.0μL，0.163mmol)、苯甲醛(18.0mL，0.177mmol)和20(39.0mg，0.175mmol)進(jìn)行典型的耦合過程，如上述概述的(方法3)，獲得2a，為白色固體(26.1mg，62％)。
1H-NMR(500MHz，d6-丙酮).δ7.15(dt，J＝0.9，7.8Hz，1H)，7.48-7.55(m，3H)，7.59(dt，J＝1.8，7.8Hz，1H)，7.71(d，J＝8.2Hz，1H)，7.83-7.89(m，3H)，8.66(s，1H)，10.8-11.5(寬s，1H)；13C-NMR(125MHz，d6-DMSO).δ115.7，119.7，122.1，127.8，129.0，130.8，130.9，131.1，133.1，153.4，157.7，166.8；MALDI-FTMS(DHB)242.0811m/z[MH]+，C14H12NO3需要值242.0812。RP-HPLC＞99％純。
原纖形成分析。
從大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中提純野生型TTR，如前所述(Lashuel，H.A.；等.Biochemistry 1999，38，13560-13573)。向一次性小杯(Fisher#14 385938)填裝495μL的0.4mg/ml的TTR(7.2μM)原液在10mM磷酸鹽(pH值7.2)、100mM KCl、1mM EDTA和0.2％NaN3中的溶液。將5μL抑制劑/DMSO(1.44mM)添加到TTR溶液中，在37℃培養(yǎng)樣品30分鐘。然后，通過向各個(gè)小杯中添加0.5mL的200mM乙酸鹽緩沖劑(pH值4.2，100mM KCl，1mM EDTA，0.2％NaN3)，將pH值降低到4.4。將小杯在37℃靜置72小時(shí)，然后使其旋轉(zhuǎn)以便在整個(gè)樣品中均勻分布任何沉淀物。在Hewlett Packard 8453型UV-Vis光譜儀上在350和400或500nm處測量濁度。一式兩份或者一式三份測量全部樣品，所報(bào)道的結(jié)果是至少三次分析的典型的實(shí)例。
將肟醚抑制劑分配到人血漿中的TTR。
關(guān)于用于評(píng)估抑制劑對(duì)人血漿中的TTR的結(jié)合化學(xué)計(jì)量的抗體捕獲方法的過程已經(jīng)在其它文獻(xiàn)中進(jìn)行了詳細(xì)描述(Purkey，H.E.；等.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2001，98，5566-5571)。簡而言之，將人血漿(1.5mL)添加到2ml的微量離心管中，隨后添加7.5μL的2.16mM DMSO的檢測化合物的溶液。在37℃，該溶液被培養(yǎng)24小時(shí)，此刻為在10mM Tris、(pH值8.0)、140mM NaCl、0.025％NaN3(TSA)中的未官能化的瓊脂糖樹脂的1∶1(v∶v)漿液。其再在4℃被培養(yǎng)1小時(shí)，然后離心。上層清液被分成400μL的三等份，每一等份被添加到結(jié)合到TSA中的抗TTR抗體的瓊脂糖樹脂的200μL的1∶1漿液。在4℃，溫和攪拌20分鐘后，使樣品離心，去除上層清液，在4℃用1mL TSA/0.05％皂角苷(3×10分鐘)，然后用1mL TSA(2×10分鐘)洗滌抗TTR樹脂。離心并且去除上層清液后，添加155μL的100mM的三乙胺(pH值11.5)以便使樹脂-結(jié)合的抗體與TTR和被結(jié)合的檢測化合物離解。30分鐘后，使懸浮液離心并且去除145μL的上層清液，后者含TTR和檢測化合物。然后將上層清液(135μl)注射到HPLC上，以便確定結(jié)合到TTR的小分子的化學(xué)計(jì)量。在HPLC條件下，檢測化合物-TTR復(fù)合物離解并且小分子和蛋白質(zhì)可以被分離。HPLC條件關(guān)鍵，3cm C18反相柱，在8分鐘內(nèi)使用20-100％或者40-100％溶劑B梯度(溶劑A95∶5 H2O∶CH3CN，0.25％TFA；溶劑B5∶95 H2O∶CH3CN、0.25％TFA)?？梢酝ㄟ^比較相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)曲線的色譜峰面積積分來實(shí)現(xiàn)檢測化合物和TTR的定量化；檢測化合物與TTR的數(shù)量比值獲得了結(jié)合化學(xué)計(jì)量(Purkey，H.E.；等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2001，98，5566-5571)。
分析超速離心在基于肟醚抑制劑的存在下，在原纖形成條件下，TTR的沉降速度曲線分析。
在pH值為4.4的條件下，對(duì)先前原纖形成分析(參見上面)中所用的樣品進(jìn)行沉降分析。在裝備有An60Ti轉(zhuǎn)子和光電掃描儀的溫度控制的Beckman XL-I分析超速離心機(jī)上，在肟醚抑制劑8f存在或者不存在的條件下，分析重組體WT-TTR溶液的沉降性質(zhì)。在20℃，以連續(xù)方式在3,000和50,000rpm的速度下收集數(shù)據(jù)，使用步長為0.001厘米，其中在280nm下檢測。
應(yīng)用直接邊界擬合方法來評(píng)估沉降速度數(shù)據(jù)，其獲自在pH值為4.4的條件下借助7.2μM的8f培養(yǎng)的3.6μM TTR溶液。使用程序Svedberg來同時(shí)擬合多個(gè)濃縮-徑向位置數(shù)據(jù)組(ridial position date set)，而得到Lamm方程的近似解(Schuster，T.M.；Laue，T.M.；Editors ModernAnalytical UltracentrifugationAcquisition and Interpretation of Data forBiological and Synthetic Polymer Systems；BirkhauserBoston，1994)。該擬合算法得到了沉降系數(shù)和擴(kuò)散系數(shù)，使用以下方程式從而得到分子量(Schuster，T.M.；Laue，T.M.；Editors Modern AnalyticalUltracentrifugationAcquisition and Interpretation of Data for Biologicaland Synthetic Polymer Systems；BirkhauserBoston，1994) 其中MW是分子量(Da)，s是沉降系數(shù)(單位為斯維德貝格(Svedbergs)，10-13s)，R是普適氣體常數(shù)(8.314×107erg/mol)，v是微分比容(cm3/g)，和ρ是溶劑密度(g/cm3)。緩沖劑密度D(1.00848g/cm3)是由表列數(shù)據(jù)計(jì)算的，WT-TTR的偏微分比容(0.7346cm3/g)是由其氨基酸組成計(jì)算的。
分析超速離心在基于肟醚抑制劑的存在下，在原纖形成條件下，TTR的沉降平衡分析。
在pH值為4.4的條件下，對(duì)先前原纖形成分析(參見上面)中所用的樣品進(jìn)行沉降分析。沉降平衡測量值這樣獲得，將120-140μL的TTR(3.6μM)和肟醚8f(7.2mM)的溶液裝入扇形雙池(double sector cell)中，所述扇形雙池裝備有12-mm環(huán)氧樹脂中心件和藍(lán)寶石或者石英窗。最初在轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速3,000rpm下收集數(shù)據(jù)以便確保不存在大分子量的低聚物，所述大分子量的低聚物將首先沉積出來，然后在17,000rpm下收集數(shù)據(jù)，從而建立池的平衡。沉降曲線，每間隔3小時(shí)，在285和290nm之間進(jìn)行監(jiān)控，被疊加以便確定已經(jīng)達(dá)到了平衡。使用由Beckman提供的Origin軟件包中的非線性最小平方分析進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過若干不同的模型，包括單一理想物質(zhì)和數(shù)種多重物質(zhì)模型來擬合數(shù)據(jù)，以便確認(rèn)對(duì)數(shù)據(jù)最佳擬合的最簡化的模型。以下方程式，相應(yīng)于單一理想物質(zhì)模型，基于理論數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(如上)間的小的差異，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了最佳擬合 其中Ar是在半徑x處的吸光率， Ao是在參考半徑xo處(通常新月形)的吸光率， v是蛋白質(zhì)的偏微分比容， r是溶劑的密度(g/cm3)， ω是轉(zhuǎn)子的角速度(弧度/秒)， E是基準(zhǔn)誤差校正因子， M是分子量，和 R是普適氣體常數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn)和擬合數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的差異(殘余數(shù))是隨機(jī)分布的并且當(dāng)數(shù)據(jù)擬合為單一理想物質(zhì)模型時(shí)(TTR四聚物)時(shí)，數(shù)值小。如由遍及池的殘余數(shù)的非隨機(jī)分布所看出的，其它模型沒有很好地?cái)M合數(shù)據(jù)。
WT-TTR·(5d)2結(jié)晶和X射線數(shù)據(jù)收集。
WT-TTR晶體獲自7mg/ml蛋白質(zhì)溶液(100mM KCl，1mM EDTA，10mM磷酸鈉，pH值7.0，0.35-0.50M硫酸銨)，其在懸滴試驗(yàn)中相對(duì)于2M硫酸銨平衡。TTR·(5d)2復(fù)合物是由WT-TTR晶體制備的，借助10倍摩爾過量的抑制劑5d，所述WT-TTR晶體被浸漬3周以上。所述晶體被置于作為冰凍保護(hù)劑的巴拉通油中并且被冷卻到100K。借助14-BM-C，BIOCARS，Advance Photon Source的單色高能量源，使用Quantum-4檢測器進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。TTR·(5d)2的晶體是異質(zhì)同晶的，具有apo-TTR晶形，其中晶胞大小接近于a＝43、b＝85和c＝66(空間群P21212，在不對(duì)稱單元中具有兩個(gè)單體)。使用DENZO和SCALEPAC來簡化數(shù)據(jù)(Otwinowski，Z.；Minor，W.Macromolecular Crystallography，Part A.In Methods in Enzymology，276Macromolecular Crystallography，Part A；C.W.Carter，Jr.and R.M.Sweet，Eds.；Academic Press，1997，307-326)。
WT-TTR·(5d)2晶體結(jié)構(gòu)測定和精修(refinement)。
相對(duì)于TTR·(5d)2的1.53數(shù)據(jù)組，通過CNS的分子動(dòng)力學(xué)和能量最低化協(xié)議(energy minimization protocol)來精修獲自蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(登錄號(hào)1BMZ)的apo-TTR的蛋白質(zhì)原子坐標(biāo)(Brunger，A.T.；等ActaCrystallogr.，Sect.D，Biol.Crystallogr.1998，54，905-921)。所得的差值傅里葉圖顯示了在外結(jié)合腔中的較大的電子密度；但是，在內(nèi)腔中的抑制劑的電子密度僅僅當(dāng)?shù)陀?s繪制電子密度圖時(shí)是可見的，大概是由于該區(qū)域中的柔性造成的。盡管連接基密度很小，配位體仍可以被明確地放置(因?yàn)樵谕饨Y(jié)合腔處的電子密度造成的)并且被歸入晶體學(xué)精修中。由于兩次折疊的晶體學(xué)對(duì)稱軸二等分結(jié)合通道，應(yīng)用了統(tǒng)計(jì)病癥模型，使得每種四聚物TTR產(chǎn)生了兩種配體結(jié)合方式。在模擬退火和隨后的位置與溫度因子精修的多次循環(huán)后，將水分子置于差值傅里葉圖中。使用通過搖擺/翹曲偏差去除協(xié)議計(jì)算的無偏差的加權(quán)電子密度圖，進(jìn)行最終的圖擬合循環(huán)。(Reddy，V.；等.Acta Crystallogr.，Sect.D，Biol.Crystallogr.2003，59，2200-2210)。各個(gè)結(jié)合袋中的配位體的對(duì)稱相關(guān)的結(jié)合構(gòu)型與在抑制劑不存在條件下定相的無偏差的退火省略圖以及搖晃/翹曲無偏差的加權(quán)圖保持一致。通過使用CCP4-Refmac的最大相似法，進(jìn)行精修的最終循環(huán)。(Bailey，S.Acta Crystallogr.，Sect.D，Biol.Crystallogr.1994，50，760-763；Murshudov，G.N.；等Acta Crystallogr.，Sect.D，Biol.Crystallogr.1997，53，240-255)。9種N-末端和3種C-末端殘基沒有包括在最終的模型中，因?yàn)樵谧罱K的圖中缺乏可解釋的電子密度。結(jié)晶分析數(shù)據(jù)的總結(jié)示于表S4中。
附圖的詳細(xì)說明 圖1是一種方案，其顯示了形成二芳基肟醚(X＝O)和二芳基腙(X＝NH)庫的一般性方法。該反應(yīng)有可能產(chǎn)生兩種關(guān)于亞胺鍵的立體異構(gòu)體(表示為syn和anti，即，相對(duì)于由X代表的苯氧基的氧，醛質(zhì)子可以分別順式或者反式取向)；然而，基于現(xiàn)有文獻(xiàn)，僅僅syn-異構(gòu)體是預(yù)期的(并且所觀察到的，見正文)。
圖2顯示了用于合成二芳基肟醚庫(參見圖1)的芳氧基胺(1-8)和苯甲醛(a-I)組分的結(jié)構(gòu)。所選擇的芳氧基胺(1-8)具有與芳基醛相同的取代模式，區(qū)別是在芳氧基胺中不存在對(duì)-CF3(i)和甲狀腺素狀的取代模式(e和f)。令人遺憾地，唯一市售可得的芳氧基胺是苯氧基胺；因而制備二芳基肟醚庫所需要的合成芳氧基胺結(jié)構(gòu)單元的方法在本文中被揭露和公開。
圖3顯示了用于合成二芳基腙庫的芳基肼(22-29)和苯甲醛(a-I)化合物的結(jié)構(gòu)。類似的二芳基肟醚和二芳基腙(此后分別被稱為肟醚和腙)被設(shè)想是彼此結(jié)構(gòu)同型的，這正是另外合成這一類別的原因。
圖4舉例說明了一張表，其顯示了對(duì)抑制原纖形成所測試的96種二芳基腙的活性。在pH值為4.4的條件下二芳基腙活性(7.2μM)對(duì)抗WT-TTR(3.6μM)淀粉狀蛋白原纖形成(72h)。值表示了原纖形成的范圍以及因而在沒有抑制劑的條件下相對(duì)于WT-TTR原纖形成的抑制劑效能(被指定為100％)完全抑制相當(dāng)于0％原纖形成。測量誤差是±5％。借助于所觀察到的預(yù)期的質(zhì)量，通過RP-LCMS，全部經(jīng)由高處理量自動(dòng)化作業(yè)合成的抑制劑顯示出＞95％純度。
圖5顯示了肟醚和腙抑制劑的結(jié)構(gòu)。通過結(jié)晶學(xué)肟醚和腙結(jié)構(gòu)的比較揭示了這些類似的化合物幾乎彼此是可疊合的。全部四種晶體結(jié)構(gòu)顯示了syn-亞胺鍵，進(jìn)一步支持了這種異構(gòu)體的優(yōu)勢地位。
圖6是合成所需的芳氧基胺的方案。N-羥基鄰苯二甲酰亞胺(NHP)與芳基硼酸的銅介導(dǎo)的交互耦合提供了肼解后的所期望的芳氧基胺(Petrassi，H.M.；Sharpless，K.B.；Kelly，J.W.Org.Lett.2001，3，139-142)。N-羥基鄰苯二甲酰亞胺與芳基硼酸的銅介導(dǎo)的交叉耦合a)CuCl，吡啶，4分子篩，1，2-二氯乙烷；b)H2NNH2·H2O，10％MeOH/CHCl3；c)LiOH·H2O，THF/MeOH/H2O。
圖7是合成鄰-三氟甲基芳氧基胺的方案。該合成需要通過N-羥基亞氨逐乙酸乙酯的缺電子氟苯的親核性芳香取代(Miyazawa，E.；等Org.Prep.Proced.Int.1997，29，594-600)。N-羥基亞氨逐乙酸乙酯對(duì)2-三氟甲基氟苯的親核攻擊獲得了15的極好的收率(89％)，其在酸性水解時(shí)獲得了芳氧基胺5(96％收率)，以其HCl鹽的形式使用。使用這種方法的變體來制備來源于2和4的等效物的肟醚(見下文)。通過N-羥基亞氨逐乙酸乙酯的缺電子氟苯的親核性芳香取代d)tBuOK，DMF，80℃；e)HClO4，1，4-二烷。
圖8是一張通常所合成并且分離(以mg量)的肟醚的RP-HPLC純度的表。參考全部結(jié)構(gòu)表征數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)部分，包括高分辨率的MS和1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)。借助于所觀察到的預(yù)期的質(zhì)量，通過RP-LCMS，全部經(jīng)由高處理量自動(dòng)化作業(yè)合成的抑制劑顯示出＞95％純度。
圖9是一種方案，其顯示了通過反式-亞胺化(imination)方法來合成二芳基肟醚a(bǔ))苯甲醇，DCC，cat.DMAP，CH2Cl2；b)N-羥基亞氨逐乙酸乙酯，tBuOK，DMF；c)LiOH·H2O，THF/MeOH/H2O；d)R′-苯甲醛(a-I)，70％HClO4，1，4-二烷。芳基亞氨逐乙酸酯沒有水解為相應(yīng)的芳氧基胺2和4，相反，它們與化學(xué)計(jì)量的量的芳基醛在酸性條件下混合而直接提供肟醚2a-1和4a-1，收率為適中-極好(由于不穩(wěn)定性，肟醚2b是不能分離的)。
圖10是一張表，其總結(jié)了肟醚(7.2μM)抗酸介導(dǎo)(pH值4.4)的TTR(3.6mM)淀粉狀蛋白生成的抑制活性。在所合成的95種肟醚中，31種顯示了優(yōu)良的效果，其將TTR淀粉狀蛋白生成減小至在沒有抑制劑的情況下WT-TTR所顯示的值的＜10％(90％抑制，藍(lán)色)，9種顯示了中等活性(11-30％原纖形成，綠色)，和其余55種顯示了差的活性(黃色)。來源于苯甲醛與甲狀腺素狀取代模式(行e和f)的肟醚是高度有效的(全部16種顯示出＞90％抑制)，即使當(dāng)與未被取代的苯氧基胺耦合時(shí)也是如此(耦合通常產(chǎn)生差的肟醚抑制劑)。這些結(jié)果挑戰(zhàn)了先前的信條，其在兩個(gè)環(huán)上需要合適的取代基以實(shí)現(xiàn)抑制作用。
圖11是一張表，其顯示了在酸介導(dǎo)的原纖形成分析(72h)結(jié)束時(shí)剩余的肟醚抑制劑的百分比。在沒有3.6μM WT-TTR存在下以及在3.6μMWT-TTR存在下在暗處培養(yǎng)抑制劑(7.2μM)(pH值4.4，37℃)。5d*數(shù)據(jù)的輸入是在除緩沖劑被維持在pH值為7.2以外的相同條件下進(jìn)行。通過比較在分析結(jié)束時(shí)抑制劑分析RP-HPLC峰面積與分析開始時(shí)所獲得的那些來確定各個(gè)值。測量誤差是±4％。最不穩(wěn)定的抑制劑(1e、1f、2k、3g、5d*)在72h內(nèi)在TTR不存在情況下經(jīng)受了幾乎完全的降解；然而，其的存在保持了＞74％的最初的用量。顯著地，抑制劑5e在TTR存在下沒有顯示出分解。這有助于解釋為什么許多不穩(wěn)定的二芳基肟抑制劑經(jīng)證明是極好的TTR淀粉狀蛋白生成的抑制劑不僅抑制劑結(jié)合到TTR的甲狀腺激素結(jié)合位點(diǎn)并且對(duì)TTR四聚物施加了動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性(Hammarstrm，P.；et al.Science 2003，299，713-716)，而且，TTR結(jié)合還使得抑制劑穩(wěn)定以對(duì)抗降解。
圖12是一張表，其顯示了在pH值為4.4(72h)下，伯肟醚和腙分解和水解產(chǎn)物(7.2μM)抗WT-TTR(3.6μM)淀粉狀蛋白原纖形成的抑制活性。值表示了原纖形成的范圍以及因而在沒有抑制劑的條件下相對(duì)于WT-TTR原纖形成的抑制劑效果(被指定為100％)完全抑制相當(dāng)于0％原纖形成。測量誤差是±5％。
圖13是在用8f(7.2μM；30min)預(yù)培養(yǎng)的并且在pH值為4.4下72h變性應(yīng)激作用后評(píng)價(jià)的TTR(3.6μM)的沉降速度(A)的曲線。A.速度分析-分別地在50,000rpm下大約15分鐘所取的數(shù)據(jù)組的疊加。數(shù)據(jù)(標(biāo)記)擬合為單一理想物質(zhì)模型(實(shí)線)，MW為48.4+0.2kDa。
圖14是在用8f(7.2μM；30min)預(yù)培養(yǎng)的并且在pH值為4.4下、在72h變性應(yīng)激作用后評(píng)價(jià)的TTR(3.6mM)的平衡超離心研究的曲線。平衡分析-在以17,000rpm速度的24小時(shí)后所觀察的平衡濃度梯度。數(shù)據(jù)(○)擬合為單一理想物質(zhì)模型(實(shí)線)，MW為52.1±0.2kDa。殘差，實(shí)驗(yàn)部分的數(shù)據(jù)和擬合的數(shù)據(jù)之間的差異示于插圖中。
圖15是一幅表，其顯示了二芳基肟醚結(jié)合化學(xué)計(jì)量的下限，顯示出對(duì)于血漿TTR的大于90％的淀粉狀蛋白抑制(7.2μM)。對(duì)人血漿中的TTR的二芳基肟醚結(jié)合化學(xué)計(jì)量。用各種肟醚(10.8μM)處理TTR，并且通過抗體捕獲/HPLC方法來確定化學(xué)計(jì)量，由于洗滌相關(guān)的損失，這提供了最小結(jié)合化學(xué)計(jì)量(Purkey，H.E.；等Chemistry & Biology.付印中；Purkey，H.E.；等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2001，98，5566-5571)。在31種被測的化合物中，11種顯示了TTR結(jié)合化學(xué)計(jì)量超過1.0，其中3種顯示了大于1.5的結(jié)合當(dāng)量。顯示出最高結(jié)合化學(xué)計(jì)量的肟醚衍生自這樣的醛，其中一個(gè)芳族環(huán)具有甲狀腺素狀(例如，3，5-二鹵-4-羥基)的取代模式。這種結(jié)果是非常重要的，因?yàn)槠湟馕吨?，5-二鹵-4-羥基取代的芳基環(huán)的結(jié)合，在大部分其它血漿蛋白質(zhì)，包括甲狀腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白白蛋白(其濃度為TTR的大約150倍)在內(nèi)，賦予了TTR血漿結(jié)合選擇性。(Stockigt，J.R.Thyroid Hormone Binding and Metabolism.Endocrinology，第4版Degroot，L.J.，Jameson，J.L.，Eds.；W.B.Saunders Co.Philadelphia，2001，第2卷，第94章，1314-1326；Petitpas，I.；等Proc.Nat.Acad.Sci.，U.S.A.2003，100，6440-6445)。
圖16顯示了一幅帶狀圖，其描述了與兩個(gè)WT-TTR甲狀腺素結(jié)合腔(白箱)結(jié)合的二芳基肟醚5d，基于X射線晶體學(xué)數(shù)據(jù)。位點(diǎn)(頂部)中的一個(gè)的擴(kuò)展以兩種其對(duì)稱相關(guān)的結(jié)合方式(綠色和白色)顯示了5d，其中TTR結(jié)合位點(diǎn)表面以灰色所示。對(duì)關(guān)鍵的殘基和鹵素結(jié)合袋(HBPs)作了標(biāo)記；已接觸抗原的(primed)殘基和未接觸抗原的(unprimed)殘基或者HBPs是指兩種相鄰對(duì)稱性相關(guān)的單體，其包括T4位點(diǎn)?？磥?，外結(jié)合袋中的羧酸根取代基與Lys-15ε-NH3+基團(tuán)正發(fā)生著靜電相互作用。
圖17顯示了用肟醚5d浸漬的WT-TTR的X射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種由下式I代表的二芳基肟醚或者二芳基腙
其中
R′不存在或者是一個(gè)或多個(gè)選自如下的基團(tuán)-COOH、-OH、-F、-I、-Br、-Cl和CF3；
R不存在或者是一個(gè)或多個(gè)選自如下的基團(tuán)-COOH、-F、-Cl和CF3；和
X是選自-NH-和-O-的二價(jià)基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的二芳基肟醚，其中X是-O-。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的二芳基腙，其中X是-NH-。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3的二芳基肟醚或二芳基腙，其由式II表示
其中基團(tuán)A選自以下基團(tuán)
5.根據(jù)權(quán)利要求4的二芳基肟醚，其中X是-O-。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的二芳基腙，其中X是-NH-。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的二芳基肟醚或者二芳基腙，其由式III表示
其中基團(tuán)B選自以下基團(tuán)
8.根據(jù)權(quán)利要求7的二芳基肟醚，其中X是-O-。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的二芳基腙，其中X是-NH-。
10.一種抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白的淀粉狀蛋白原纖的形成的方法，該方法包括如下步驟使運(yùn)甲狀腺素蛋白與抑制濃度的權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的二芳基肟醚或二芳基腙接觸。
全文摘要
所示的二芳基肟醚和二芳基腙有效地用于抑制運(yùn)甲狀腺素蛋白的淀粉狀蛋白原纖的形成。
文檔編號(hào)C07C257/00GK101115712SQ200680004387
公開日2008年1月30日 申請(qǐng)日期2006年2月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月8日
發(fā)明者J·W·凱利, S·M·約翰遜, H·M·佩特拉西 申請(qǐng)人:斯克里普斯研究學(xué)院