分子及其嵌合分子的制作方法

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導(dǎo)航： X技術(shù)> 最新專利>有機化學(xué)裝置的制造及其處理,應(yīng)用技術(shù)

專利名稱：分子及其嵌合分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明概括地涉及蛋白質(zhì)學(xué)、診斷學(xué)、治療學(xué)和營養(yǎng)學(xué)。尤其是，本發(fā)明提供了屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族或與之相關(guān)的分離的蛋白質(zhì)分子和包含該蛋白質(zhì)分子的至少一部分的嵌合分子，所述的分離的蛋白質(zhì)，比如TNF-a、淋巴毒素-a(LT-a)、TNFRI、TNFRII、OX40、BAFF、NGFR、Fas配體；所述包含該蛋白質(zhì)分子的至少一部分的嵌合分子，比如TNF-a-Fc、LT-a-Fc，TNFRI-Fc、TNFRII-Fc、OX40-Fc、BAFF-Fc、NGFR-Fc、Fas配體-Fc。其中該蛋白質(zhì)或其嵌合分子具有可測量的參數(shù)特征，其中該特征表示、關(guān)聯(lián)于一個或多個藥理學(xué)特性或形成一個或多個藥理學(xué)特性的基礎(chǔ)。本發(fā)明進一步設(shè)想將分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子用于診斷、預(yù)防、治療、營養(yǎng)和/或研究應(yīng)用范圍內(nèi)。

背景技術(shù)：
本說明書中涉及的任何現(xiàn)有技術(shù)不被，也不應(yīng)該被理解為是對現(xiàn)有技術(shù)形成普遍的常識的一部分的一種認(rèn)可或任何形式的提示。
TNF超家族與細(xì)胞生長、存活、凋亡、壞死以及免疫反應(yīng)相關(guān)。TNF分子對腫瘤細(xì)胞具備顯著的選擇性細(xì)胞毒作用，也誘導(dǎo)非癌細(xì)胞凋亡。TNF超家族中的受體在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含富半胱氨酸重復(fù)。TNF超家族的成員包括TNF-a、LT-a、TNFRI、TNFRII、OX40、BAFF、NGFR、Fas配體。
TNF-a(TNF-alpha，腫瘤壞死因子配體超家族成員2，TNFSF2)是一個含233個氨基酸的跨膜蛋白，形成一個具有生物活性的同型三聚體。與其結(jié)構(gòu)相關(guān)的分子，淋巴細(xì)胞毒素-α(LT-α，TNF-β，TNFSF2)是一個含205個氨基酸的肽，包括一段含34個氨基酸的信號序列，其不同于其它TNF超家族配體，指導(dǎo)其成熟肽的分泌。
TNF-α和LT-α介導(dǎo)細(xì)胞尤其是變異細(xì)胞的壞死或者凋亡，同時誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的釋放以及T和B淋巴細(xì)胞的激活。此外，TNF-α和LT-α局部低水平的表達參與組織重塑和熱休克反應(yīng)，包括破壞病毒感染的細(xì)胞以及增強粒細(xì)胞的抗菌作用。此外，已經(jīng)證明，在胚胎發(fā)育過程中，TNF-α和LT-α是一個重要的組分，來促進外周淋巴系統(tǒng)的器官發(fā)生，如淋巴結(jié)、脾臟以及Peyer斑。TNF-α和LT-α的表達失控在自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，以及炎性腸疾病如Crohn病和多發(fā)性硬化癥(MS)的發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用。
TNF-α和LT-α通過TNF受體、腫瘤壞死因子受體I(TNFRI)和腫瘤壞死因子受體II(TNFRII)的介導(dǎo)而發(fā)揮作用。兩種TNF受體與TNF-α和LT-α的結(jié)合都具有高親和力，并且兩種受體存在于除血紅細(xì)胞以外的所有細(xì)胞類型中。TNFRI的C端胞內(nèi)區(qū)的缺失分析已經(jīng)表明其存在一個死亡結(jié)構(gòu)域，參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡。TNFRI的死亡結(jié)構(gòu)域可以與其它多種信號轉(zhuǎn)接分子作用，包括TRADD和RIP。TNFRII更多地存在于內(nèi)皮細(xì)胞和造血細(xì)胞系的細(xì)胞中。TNFRII的可溶性形式已經(jīng)在人尿中得到鑒定，為30kDa和45kDa的蛋白。這些可溶性TNF受體蛋白來自膜結(jié)合受體的溶蛋白性裂解，表現(xiàn)了TNF的抑制性。值得注意的是，許多誘導(dǎo)TNF-α表達的刺激物也誘導(dǎo)可溶性TNF受體的表達，這表明可溶性受體在調(diào)節(jié)TNF活性中可能發(fā)揮了作用。尤其是，TNFRI和TNFRII在治療具有TNF-α過量特征的患者的疾病如牛皮癬時可能發(fā)揮作用。目前，牛皮癬在全世界的感染率為2-3％左右(Nickoloff et al.J Clin Invest.1131664-1675，2004)。牛皮癬患者不僅存在搔癢和面容受損之類的皮膚病變，而且10-30％的患者還存在牛皮癬關(guān)節(jié)炎伴隨指甲營養(yǎng)不良。因此，牛皮癬不僅是一種皮膚病，同時它還影響許多日常生活，例如手的使用、走路、睡覺以及性生活。據(jù)報道，事實上，至少30％的牛皮癬患者打算自殺(Nickoloff et al.，supra，2004)。其它具有TNF-α水平過高特征的皮膚炎癥包括貝切特病、大皰性皮炎、濕疹、霉菌感染、麻風(fēng)病、嗜中性皮炎、糠疹(或玫瑰糠疹)、黑糠疹(或黑色小孢子菌病)、毛發(fā)紅糠疹、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性多血管以及中毒性表皮壞死溶解(Evereklioglu Expert Opin Pharmacother5(2)317-28，2004；Lipozecic et al.Acta Dermatovenerol Croat12(1)35-41，2004；Mche et al..Ann Dermatol Venereol 129(12)1374-9，2002；Teo et al..Microbes Infect4(11)1193-202，2002)。此外，TNF-α水平過高可能由使用其它治療引起。例如，使用Aldara乳膏(咪喹莫特)的患者可能形成以下皮膚反應(yīng)，包括紅斑、腐蝕、潰瘍、剝落、魚鱗、干燥、形成疙瘩、結(jié)硬皮、皮膚滲出液。
人OX40(腫瘤壞死因子受體超家族成員4，TNFSF4)是一個50kDa的跨膜蛋白，主要表達于活化的CD4+T細(xì)胞表面。OX40是一個輔助刺激因子，參與T細(xì)胞依賴的免疫反應(yīng)，即T細(xì)胞的活化和增殖，通過效應(yīng)器T細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生，以及在體內(nèi)阻礙外周T細(xì)胞的耐受。OX40在啟動CD28信號后數(shù)小時或數(shù)天內(nèi)誘導(dǎo)表達。據(jù)報道，無論是在免疫反應(yīng)的高度，還是在產(chǎn)生記憶T細(xì)胞上，OX40同它的配體的相互作用在擴增T細(xì)胞數(shù)目上都發(fā)揮了作用。在缺失CD28時，OX40-OX40L相互作用也介導(dǎo)T細(xì)胞的增殖和IL-2的產(chǎn)生。但是活化的OX40缺失T細(xì)胞對凋亡高度敏感，即使IL-2的產(chǎn)生、細(xì)胞分裂和擴張都相對正常。已經(jīng)有報道指出，在免疫應(yīng)答過程中處理OX40的水平或者OX40-OX40L的相互作用對有利于于治療T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病，尤其是過敏性、炎性以及自身免疫性疾病。最近，幾個研究小組已經(jīng)通過阻斷OX40-OX40L的相互作用降低了自身免疫性疾病動物模型的臨床體癥。
BAFF(也是已知的腫瘤壞死因子配體超家族成員13B，TNFSF13B)是一個含285個氨基酸的II型膜糖蛋白。BAFF由B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹狀突細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達。BAFF是一個B細(xì)胞存活因子，主要促進活化B細(xì)胞的增殖，免疫球蛋白與IgD+B細(xì)胞的連接，以及免疫球蛋白分泌型細(xì)胞的存活，并參與B細(xì)胞的成熟。這表明BAFF是體液免疫反應(yīng)中一個重要的調(diào)節(jié)因子。研究表明用BAFF處理B細(xì)胞可以引起原-存活致癌基因包括Bc1-xL，Bc1-2和Mc1-1的表達。由于BAFF是一個B細(xì)胞存活因子，因此它的降解能促進自體反應(yīng)B細(xì)胞的存活和自身免疫性疾病的發(fā)生。此外，在自身免疫性疾病的患者中也檢測到BAFF水平升高，包括在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)中，其滑液的BAFF水平比血清中的水平高。BAFF在調(diào)節(jié)B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹狀突細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞以及中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的生物過程中是有用的，尤其在激活BAFFR上，如增加B淋巴細(xì)胞的增殖、活化和存活。尤其是，BAFF可以用于治療免疫缺陷，例如B淋巴細(xì)胞增殖、活化和存活不充分的患者，或者一般變異免疫缺陷(CVID)，或IgA缺陷的患者。BAFF也能用于在接種疫苗的過程中增加抗體的產(chǎn)生。此外，將BAFF連接于放射性核素可用于靶向治療和殺死B細(xì)胞惡性瘤。
神經(jīng)生長因子受體(NGFR)也是一個腫瘤壞死因子受體超家族成員16即TNFRSF16。NGFR是一個I類型膜蛋白，是由427個氨基酸合成的糖蛋白，含有28個氨基酸的信號肽。NGFR與所有神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合都具有相同的親和力，但是通過TrkA、B、C與NGFR的聯(lián)合可以達到更高的結(jié)合親和力。配體結(jié)合于NGFR可以促進神經(jīng)元的存活或凋亡。神經(jīng)營養(yǎng)因子對細(xì)胞的作用需要一個復(fù)合物作用于NGFR受體和Trk A、B、C受體之間，該復(fù)合物還沒有被完全了解。但是，在NGFR缺陷的神經(jīng)元中，沒有觀察到NGF處理神經(jīng)元引起的凋亡，而Trk A主要抑制NGFR的凋亡活性。更復(fù)雜的是，促凋亡和抗凋亡途經(jīng)都由NGFR信號誘導(dǎo)產(chǎn)生，并依賴于細(xì)胞類型和功能狀態(tài)。NGFR在神經(jīng)障礙上存在多種可能的臨床應(yīng)用，包括Alzheimer病，帕金森病，神經(jīng)肌肉和運動神經(jīng)元障礙，多發(fā)性硬化癥，腦性麻痹，糖尿病性神經(jīng)病以及治療疼痛，因為Trk A和NGFR在感覺神經(jīng)元上的相互作用參與慢性疼痛的發(fā)展?？扇苄訬GFR也能用于抑制乳腺癌和其它腫瘤的生長，這是因為NGF和其它NGFR配體是促有絲分裂劑。
Fas配體(FasL或者TNF配體超家族成員6，TNFSF6)是一個含281個氨基酸的II類型膜蛋白。FasL也作為一個可溶性蛋白存在，由ECD的蛋白水解切割或者選擇性剪接產(chǎn)生。FasL的活性形式是一個同型三聚體。FasL參與調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡(凋亡)，免疫平衡和免疫赦免以及腫瘤細(xì)胞存活。最初的實驗表明活化的CD4+T細(xì)胞在Fas表達的細(xì)胞中誘導(dǎo)溶細(xì)胞活性。此后，克隆了FasL，并表明FasL通過與Fas的相互作用誘導(dǎo)凋亡。FasL結(jié)合于它的受體Fas，引起死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(DISC)的裝配，從而起始凋亡信號級聯(lián)。DISC包括了Fas相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域(FADD)蛋白，募集并激活caspase8和10，從而起始caspase級聯(lián)和細(xì)胞凋亡。FasL在正常的免疫平衡中發(fā)揮了重要的作用，而FasL缺陷的動物模型出現(xiàn)系統(tǒng)性自身免疫性疾病。已經(jīng)表明FasL參與3種類型的凋亡在免疫反應(yīng)結(jié)束時去除活化的T細(xì)胞；通過溶細(xì)胞性T細(xì)胞或自然殺傷細(xì)胞殺死病毒感染的細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞；以及在眼睛和睪丸處，通過非淋巴細(xì)胞殺死炎癥細(xì)胞。此外，F(xiàn)asL的表達通過嗜中性趨化活性也可以促進中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。此外，F(xiàn)asL還參與紅細(xì)胞系統(tǒng)的分化、血管的發(fā)生例如眼睛和皮膚的平衡以及細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)。
生物效應(yīng)因子作用通過蛋白質(zhì)與它們各自的結(jié)合蛋白的相互作用而得以發(fā)揮，這意味著TNF超家族和相關(guān)蛋白以及它們各自的配體或受體具有作為調(diào)節(jié)生理學(xué)過程的治療因子的顯著的潛力。然而，分子的較小的變化例如一級，二級，三級或四級結(jié)構(gòu)和共-或后-翻譯修飾模式可能對蛋白的活性，分泌，抗原性和清除產(chǎn)生顯著的影響。因此，具有特定的一級，二級，三級或四級結(jié)構(gòu)，或共翻譯或翻譯后結(jié)構(gòu)或裝配的可能產(chǎn)生的蛋白，其賦予獨特的或顯著的有用特性。因此，有必要評估在不同產(chǎn)生條件下的蛋白的生理學(xué)特性以確定是否其具有有用的生理學(xué)特征或其他藥理學(xué)特性。
迄今為止，問題在于商業(yè)上可利用的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)是在與人進化遠(yuǎn)緣的種類來源的細(xì)胞中進行的，細(xì)胞例如細(xì)菌，酵母，真菌，和昆蟲。這些細(xì)胞表達蛋白質(zhì)缺乏糖基化作用或呈現(xiàn)不同于人細(xì)胞的糖基化所有組成成分并且其實質(zhì)上影響了它們在臨床上的應(yīng)用。例如，在酵母或真菌系統(tǒng)例如曲霉中表達的蛋白質(zhì)具有高密度甘露糖，造成蛋白在治療上無效(Herscovics et al.FASEB J 7540-550，1993)。
即使在非人哺乳動物表達系統(tǒng)例如中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞，已經(jīng)證明在糖基化模式上與人細(xì)胞相比有顯著差別。例如，大多數(shù)哺乳動物，包括嚙齒類，表達酶(α1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶，其在糖蛋白上產(chǎn)生Gal(α1，3)-Gal(β1，4)-GlcNAc寡糖。然而在人，猿和舊大陸猴中，該酶的表達通過基因的移碼突變滅活。(Larsen et al.J Biol Chem2657055-7061，1990)盡管大多數(shù)CHO細(xì)胞系用于重組蛋白質(zhì)合成，例如Dux-B11，已滅活基因表達(α1，3)半乳糖轉(zhuǎn)移酶，它們?nèi)匀鄙俟δ苄?α2，6)唾液酸轉(zhuǎn)移酶以用于在人類細(xì)胞中存在的(α2，6)-連接末端唾液酸的合成。進一步，表達糖蛋白的CHO細(xì)胞中存在唾液酸基序傾向于被CHO細(xì)胞內(nèi)源的唾液酸酶分解(Gramer et al.Biotechnology13(7)692-8，1995)。
結(jié)果，由這些非人表達系統(tǒng)生產(chǎn)的蛋白表現(xiàn)出與人細(xì)胞衍生蛋白質(zhì)不同的理化和藥理學(xué)特性例如半衰期、抗原性、穩(wěn)定性和功能性效應(yīng)。
最近的干細(xì)胞技術(shù)的進步實質(zhì)上增強了利用干細(xì)胞應(yīng)用于例如移植治療、藥物篩選、毒理學(xué)研究和功能基因組學(xué)的潛力。然而，干細(xì)胞在包括非人蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中常規(guī)維持，由于非人傳染性物質(zhì)污染的可能性，因此不適用于臨床應(yīng)用。進一步，在非人衍生介質(zhì)中的干細(xì)胞培養(yǎng)可能導(dǎo)致引入非人碳水化合物部分因此危害移植應(yīng)用。(Martin et al Nature Medicine 11(2)228-232，2005)。因此，特殊的人衍生蛋白質(zhì)在干細(xì)胞的維持和/或分化中的使用將改善異基因蛋白質(zhì)的引入并增加干細(xì)胞的臨床應(yīng)用。
相應(yīng)地，有必要發(fā)展蛋白質(zhì)和它們的受體，其具有特殊的所期望的理化和藥理學(xué)特征以用于診斷、預(yù)防、治療、營養(yǎng)和/或研究應(yīng)用，并且本發(fā)明提供了屬于TNF超家族和與之相關(guān)的蛋白質(zhì)用于臨床、商業(yè)和研究應(yīng)用。
發(fā)明概述在整個說明書中，除非特別說明，術(shù)語“含有”或其變體例如“具有”或“包含”，將被理解為暗示包括所述要素或全部、或要素的組或整體的組，但是不排除任何其他的要素或全部。
核苷酸和氨基酸序列表示為序列標(biāo)識號(SEQ ID NO)。這些SEQ IDNO在數(shù)字上對應(yīng)序列標(biāo)識號<400>1(SEQ ID NO1)，<400>2(SEQ IDNO2)，依此類推。表1顯示的是序列識別號的摘要信息。序列列表在權(quán)利要求后給出。
本發(fā)明概括地涉及具有理化參數(shù)特征的屬于TNF超家族或與該家族相關(guān)的分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子，其中所述的特征表示、關(guān)聯(lián)于一個或多個特征性的藥理學(xué)特性或形成一個或多個特征性的藥理學(xué)特性的基礎(chǔ)。特別是本發(fā)明提供的分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子選自TNF-α、TNF-α-Fc、LT-α、LT-α-Fc、TNFRI、TNFRI-Fc、TNFRII、TNFRII-Fc、OX40、OX40-Fc、BAFF、BAFF-Fc、NGFR、NGFR-Fc、Fas配體、Fas配體-Fc，其具有包括多個可測量的理化參數(shù)的理化特征{[Px]1、[Px]2、...[Px]n、}，其中Px表示可測量的理化參數(shù)且“n”是≥1的整數(shù)，其中介于并包括在[Px]1到[Px]n之間的參數(shù)各自為不同的可測量的理化參數(shù)，其中任一個或一個以上的可測量的理化特性的值表示、關(guān)聯(lián)于一個特征性的藥理學(xué)特性Ty的基礎(chǔ)或者一系列特征性的藥理學(xué)特性{[Ty]1、[Ty]2、....[Ty]m}或形成一個特征性的藥理學(xué)特性Ty的基礎(chǔ)或者一系列特征性的藥理學(xué)特性{[Ty]1、[Ty]2、....[Ty]m}的基礎(chǔ)，其中Ty表示一個特征性的藥理學(xué)特性且m是≥1的整數(shù)，其中[Ty]1到[Ty]m為不同的藥理學(xué)特征。
這里的術(shù)語“特征性的”涉及蛋白質(zhì)或其嵌合分子的藥理學(xué)特性，在本發(fā)明中是指蛋白質(zhì)或其嵌合分子的一個或者多個區(qū)別于其它特征性的理化特性的藥理學(xué)特性。具體地說，分離蛋白或其嵌合分子的一個或者多個藥理學(xué)特性與在原核細(xì)胞或低等真核細(xì)胞甚至非人的高等真核細(xì)胞產(chǎn)生的相同蛋白的特性不同或有相對區(qū)別。在另外的具體實施方案中，作為目標(biāo)的分離的蛋白或其嵌合分子的藥理學(xué)特征有助于實現(xiàn)某項功能。這里的術(shù)語“可測量的理化參數(shù)”或Px表示分離蛋白或其嵌合分子的一個或多個可測定的特性。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，作為目標(biāo)的分離的蛋白或其嵌合分子的可測量的理化特性或有助于或者產(chǎn)生了藥理學(xué)特性Ty。
本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)或嵌合分子具有理化參數(shù)(Px)，該參數(shù)用于完整地定義蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子或嵌合分子。該理化參數(shù)可以選自表觀分子量(P1)、等電點(pI)(P2)、同工型數(shù)(P3)、不同同工型數(shù)的相對強度(P4)、糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)、N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)、N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)、酸性單糖含量的百分比(P8)、單糖含量(P9)、唾液酸含量(P10)、硫酸鹽和磷酸鹽含量(P11)、Ser/ThrGalNAc比例(P12)、N-連接寡糖的中性百分比(P13)、N-連接寡糖的酸性百分比(P14)、O-連接寡糖的中性百分比(P15)、O-連接寡糖的酸性百分比(P16)、N-連接寡糖的比例(P17)、O-連接寡糖的比例(P18)、N-連接寡糖成分的結(jié)構(gòu)(P19)、O-連接寡糖成分的結(jié)構(gòu)(P20)、N-連接寡糖的位置和構(gòu)成(P21)、O-連接寡糖的位置和構(gòu)成(P22)、共翻譯修飾(P23)、翻譯后修飾(P24)、?；?P25)、乙?；?P26)、酰胺化(P27)、脫酰胺(P28)、生物素?；?P29)、氨甲?；?P30)、羧化(P31)、脫羧(P32)、二硫鍵形成(P33)、脂肪酸?；?P34)、十四烷酰化(P35)、十六烷?；?P36)、十八烷?；?P37)、甲?；?P38)、糖化(P39)、糖基化(P40)、糖磷脂酰肌醇錨定(P41)、羥基化(P42)、硒代半胱氨酸的結(jié)合(P43)、脂質(zhì)(P44)、硫辛酸的加成(P45)、甲基化(P46)、N或C端封閉(P47)、N或C端移除(P48)、硝化(P49)、甲硫氨酸氧化(P50)、磷酸化(P51)、蛋白酶酶切(P52)、異戊烯化(P53)、法尼基化(P54)、牻牛兒基化(P55)、磷酸吡哆醛加成(P56)、唾液酸化(P57)、去唾液酸化(P58)、硫酸鹽化(P59)、泛素化(P6o)、泛素樣分子的加成(P61)、一級結(jié)構(gòu)(P62)、二級結(jié)構(gòu)(P63)、三級結(jié)構(gòu)(P64)、四級結(jié)構(gòu)(P65)、化學(xué)穩(wěn)定性(P66)、熱穩(wěn)定性(P67)。這些參數(shù)的特征在表2中提供。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的TNF-α的特征，其包括 -表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為10-30kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為4-8.5； -約有2到50個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個同工型，在一個具體實施方案中，為10-40個同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為1到99％，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95，96，97，98，99，在一個具體實施方案中，為0-10％； -N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為8到30kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為8到25kDa，在一個具體實施方案中，為10到20kDa； -免疫反應(yīng)特征(T13)區(qū)別于在非人類細(xì)胞系統(tǒng)中表達的人TNF-α，在一個具體實施方案中，當(dāng)用含有非人類細(xì)胞系統(tǒng)中表達的人TNF-α的EL I SA試劑盒測定本發(fā)明TNF-α的蛋白濃度時，本發(fā)明TNF-α的蛋白濃度被低估。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征了本發(fā)明的LT-α的特征 -表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為15到32kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為5到11； -約有2到100個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個同工型，在一個具體實施方案中，為7-33個同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，在一個具體實施方案中，為0到42％； -N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為10到30kDa，在具體實施方案中，為12到25kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為10到25kDa，在一個具體實施方案中，為12到23kDa； -免疫反應(yīng)特征(T13)區(qū)別于在非人類細(xì)胞系統(tǒng)中表達的人LT-α，在一個具體實施方案中，用包含非人類細(xì)胞系統(tǒng)中表達的人LT-α的ELI SA的試劑盒測定本發(fā)明的LT-α的蛋白濃度，本發(fā)明的LT-α的蛋白濃度被低估。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的TNFRI-Fc的特征，其包括 -表觀分子量(P1)約為5到120，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120，在一個具體實施方案中，為45到75kDa； -pI(P2)范圍約為2到12，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，在一個具體實施方案中，為5.5-9.5； -約有2到20個同工型(P3)，例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20個同工型，在一個具體實施方案中，為8-16個同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為10到90％，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90％，在一個具體實施方案中，為0-36％； -N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為35到65kDa，在一個具體實施方案中，為36到60kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為35到65kDa，在一個具體實施方案中，為36到60kDa； -酸性單糖含量的百分比(P8)約為0-50％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50，在一個具體實施方案中，為0-10％； -單糖含量(P9)和唾液酸含量(P10)，用GalNAc作為標(biāo)準(zhǔn)時，為1∶0.1-8的海藻糖，1∶7-27的GlcNAc，1∶1-14的半乳糖，1∶2-17的甘露糖和1∶0-3的NeuNAc，在一個具體實施方案中，為1∶1-4.5的海藻糖，1∶10-18的GlcNAc，1∶3-9的半乳糖，1∶4-11的甘露糖和1∶0.1-2的NeuNAc；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，為3∶0.01-3的海藻糖，3∶0.01-3的GalNAc，3∶1-17的GlcNAc，3∶0.1-5的半乳糖和3∶0-3的NeuNAc，在一個具體實施方案中，為3∶0.1-1.5的海藻糖，3∶0.1-1的GalNAc，3∶3-11的GlcNAc，3∶1-2.5的半乳糖和3∶0-2的NeuNAc； -硫酸鹽含量(P11)，用GalNac作為標(biāo)準(zhǔn)時，為1∶0.1-21的硫酸鹽，在一個具體實施方案中，為1∶1.5-14的硫酸鹽；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，為3∶0.1-6的硫酸鹽，在一個具體實施方案中，為3∶0.5-4的硫酸鹽； -硫酸鹽化(P59)表示為分子中單糖含量的百分?jǐn)?shù)，為0-50％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50，在一個具體實施方案中，為10-16％； -N-連接寡糖的中性百分比(P13)約為30到100％，例如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％，在一個具體實施方案中，為80到100％，在進一步的具體實施方案中，為94到97％； -N-連接寡糖的酸性百分比(P14)約為0到50％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50％，在一個具體實施方案中，為0到20％，在進一步的具體實施方案中，為3到6％； -O-連接寡糖的中性百分比(P15)約為24到67％，例如24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67％，在一個具體實施方案中，為29到62％，在進一步的具體實施方案中，為34到57％； -O-連接寡糖的酸性百分比(P16)約為10到80％，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80％，在一個具體實施方案中，為38到71％，在進一步的具體實施方案中，為43到66％； -N-連接寡糖的位置(P21)包括N-299(從信號序列的起始處進行編號)，給予PNGase后，通過PMF得到鑒定。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的TNFRII-Fc的特征，其包括 -表觀分子量(P1)約為10到150，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150，在一個具體實施方案中，為46到118kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為4到10； -約有2到52個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52，在一個具體實施方案中，為10到40個同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，在一個具體實施方案中，為0到56％； -N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為40到100kDa，在一個具體實施方案中，為46到87kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為40到95kDa，在一個具體實施方案中，為42到80kDa； -酸性單糖含量的百分比(P8)約為0-50％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50，在一個具體實施方案中，為1到10％； -單糖含量(P9)和唾液酸含量(P10)，用GalNAc作為標(biāo)準(zhǔn)時，為1∶0.01-3的海藻糖，1∶0.1-5的GlcNAc，1∶0.1-3的半乳糖，1∶0.1-3的甘露糖和1∶0.01-3的NeuNAc；在一個具體實施方案中，為1∶0.01-2的海藻糖，1∶0.1-3的GlcNAc，1∶0.1-2的半乳糖，1∶0.1-2的甘露糖和1∶0.01-2的NeuNAc；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，為3∶0.01-3的海藻糖，3∶1-17的GalNAc，3∶2-32的GlcNAc，3∶1-9的半乳糖和3∶0.1-3的NeuNAc，在一個具體實施方案中，為3∶0.1-2的海藻糖，3∶3-11的GalNAc，3∶5-21的GlcNAc，3∶3-6的半乳糖和3∶0.1-2的NeuNAc； -硫酸鹽含量(P11)，用GalNac作為標(biāo)準(zhǔn)時，為1∶0.1-6的硫酸鹽，在一個具體實施方案中，為1∶1-4的硫酸鹽；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，為3∶4-29的硫酸鹽，在一個具體實施方案中，為3∶9-19的硫酸鹽； -硫酸鹽化(P59)表示為分子中單糖含量的百分?jǐn)?shù)，為10-90％，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90％，在一個具體實施方案中，為27到41％； -N-連接寡糖的中性百分比(P13)約為10到100％，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％，在一個具體實施方案中，為69到89％，在進一步的具體實施方案中，為74到84％； -N-連接寡糖的酸性百分比(P14)約為0到80％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80％，在一個具體實施方案中，為11到31％，在進一步的具體實施方案中，為16到26％； -O-連接寡糖的中性百分比(P15)約為5到90％，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90，在一個具體實施方案中，為17到54％，在進一步的具體實施方案中，為22到49％； -O-連接寡糖的酸性百分比(P16)約為5到99％，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，在一個具體實施方案中，為46到83％，在進一步的具體實施方案中，為51到78％； -一個或多個N-聚糖的結(jié)構(gòu)列在表37(a)的N-連接寡糖的比例中(P19)； -一個或多個O-聚糖的結(jié)構(gòu)列在表37(b)的O-連接寡糖的比例中(P20)； -生物活性區(qū)別于在非人類細(xì)胞系統(tǒng)中表達的人TNFRII-Fc，在一個具體實施方案中，本發(fā)明TNFRII-Fc在L-929細(xì)胞中中和TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(T30)的能力比E.coli細(xì)胞中表達的人TNFRII-Fc的能力高8-18倍。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的OX40-Fc的特征，其包括 -表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為46到75kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為4到9； -約有2到50個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50同工型，在一個具體實施方案中，為8-16個同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，在一個具體實施方案中，為0到36％； -N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為40到75kDa，在一個具體實施方案中，為44到72kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為38到75kDa，在一個具體實施方案中，為41到70kDa； -N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為46到65kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為46到65kDa； -單糖含量(P9)和唾液酸含量(P10)，用GalNAc作為標(biāo)準(zhǔn)時，為1∶0.01-3的海藻糖，1∶1-4的GlcNAc，1∶0.1-3的半乳糖，1∶0.1-3的甘露糖和1∶0-3的NeuNAc；在一個具體實施方案中，為1∶0.1-1的海藻糖，1∶2-3的GlcNAc，1∶0.5-2的半乳糖，1∶0.5-1的甘露糖和1∶0-2的NeuNAc；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，為3∶0.1-3的海藻糖，3∶1-7的GalNAc，3∶3-15的GlcNAc，3∶2-9的半乳糖和3∶0-3的NeuNAc，在一個具體實施方案中，為3∶0.5-2的海藻糖，3∶3-5的GalNAc，3∶6-10的G l cNAc，3∶4-5的半乳糖和3∶0-2的NeuNAc； -唾液酸含量(P10)表示為分子中單糖含量的百分?jǐn)?shù)，約為0到50％，例如0，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50％，在一個具體實施方案中，為0-10％； -硫酸鹽含量(P11)，用GalNac作為標(biāo)準(zhǔn)時，為1∶0-3的硫酸鹽，在一個具體實施方案中，為1∶0.30-2的硫酸鹽；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，為3∶0.1-7的硫酸鹽，在進一步的具體實施方案中，為3∶1-5的硫酸鹽； -硫酸鹽化(P59)表示為分子中單糖含量的百分?jǐn)?shù)，為0-50％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50，在一個具體實施方案中，為9到15％； -N-連接寡糖的中性百分比(P13)約為69到100％，在一個具體實施方案中，為74到100％，在進一步的具體實施方案中，為79到95％； -N-連接寡糖的酸性百分比(P14)約為0到31％，在一個具體實施方案中，為0到26％，在進一步的具體實施方案中，為5到21％； -O-連接寡糖的中性百分比(P15)約為20到100％，在一個具體實施方案中，為40到90％，在進一步的具體實施方案中，為45到80％； -O-連接寡糖的酸性百分比(P16)約為0到80％，在一個具體實施方案中，為10到60％，在進一步的具體實施方案中，為20到55％； -N-連接寡糖的位置(P21)包括N-160到N-298(從信號序列的起始處進行編號)，給予PNGase后，通過PMF得到鑒定。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的BAFF的特征，其包括 -表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為10到22kDa； -p I(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為4到8； -約有2到50個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50同工型，在一個具體實施方案中，為5到10個同工型。
-糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，在一個具體實施方案中，為0到25％。
-N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為8到22kDa，在一個具體實施方案中，為10到22kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為8到22kDa，在一個具體實施方案中，為10到22kDa； -生物活性區(qū)別于在非人類細(xì)胞系統(tǒng)中表達的人BAFF，在一個具體實施方案中，本發(fā)明BAFF誘導(dǎo)RPMI8226細(xì)胞增殖T32的能力是E.coli細(xì)胞中表達的人BAFF的1.1-2.4倍。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的NGFR-Fc的特征，其包括 -表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為55到105kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為3∶6； -約有2到50個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50同工型，在一個具體實施方案中，為8到16個同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，在一個具體實施方案中，為11到53％。
-N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)為45到100kDa之間，在一個具體實施方案中，為48到90Da； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為45到95kDa，在一個具體實施方案中，為48到85kDa；在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的Fa s配體的特性，其包括 -表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為15到35kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14； -約有2到50個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，在一個具體實施方案中，為0到51％。
-N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)為10到28kDa之間，在一個具體實施方案中，為12到21kDa； -N-連接寡糖的位置(P21)包括N-184(從信號序列的起始處進行編號)，給予PNGase后，通過PMF得到鑒定。
在一個具體實施方式
中，本發(fā)明設(shè)想了TNF超家族或者與其相關(guān)的分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子，其選自TNF-α、TNF-α-Fc、LT-α、LT-α-Fc、TNFRI、TNFRI-Fc、TNFRII、TNFRII-Fc、OX40、OX40-Fc、BAFF、BAFF-Fc、NGFR、NGFR-Fc、Fa s配體、Fas配體-Fc。本發(fā)明的一個分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子包含一系列可測量的藥理學(xué)參數(shù)，選自包含或包括治療效果(T1)、有效治療劑量(TCID50)(T2)、生物利用度(T3)、從給藥到維持治療水平的時間(T4)、吸收速率(T5)、排泄速率(T6)、特殊的活性(T7)、熱穩(wěn)定性(T8)、凍干穩(wěn)定性(T9)、血清/血漿穩(wěn)定性(T10)、血清半衰期(T11)、血流中的溶解度(T12)、免疫反應(yīng)特征(T13)、免疫原性(T14)、中和抗體抑制(T14A)、副作用(T15)、受體/配體親合力(T16)、受體/配體激活作用(T17)、組織或細(xì)胞種類特異性(T18)、生物膜或屏障的穿透能力(例如腸，肺，血腦屏障，皮膚等)(T19)、生成血管的能力(T19A)、組織吸收(T20)、降解的穩(wěn)定性(T21)、凍融穩(wěn)定性(T22)、蛋白酶穩(wěn)定性(T23)、泛素穩(wěn)定性(T24)、給藥減少(T25)、給藥模式(T26)、與其他藥學(xué)輔料或載體的相容性(T27)、在生物體或環(huán)境中的殘留(T28)、保存過程中的穩(wěn)定性(T29)、在生物體或環(huán)境中的毒性等(T30)。
另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子在不同的細(xì)胞種類中可以具有不同的生物效應(yīng)(T31)、包括但不限于人原代細(xì)胞、例如淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)原、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)胚層細(xì)胞、外胚層細(xì)胞、中胚層細(xì)胞、上皮細(xì)胞、腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、真皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、噬中性粒細(xì)胞、粒郎格罕細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、噬酸粒細(xì)胞、噬堿粒細(xì)胞、乳房細(xì)胞、小葉細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、肺細(xì)胞、食管細(xì)胞、胰細(xì)胞、Beta細(xì)胞(胰島素分泌細(xì)胞)、成血管細(xì)胞、肌細(xì)胞、卵圓細(xì)胞(肝細(xì)胞)、間充質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、多種干細(xì)胞包括成體和胚胎干細(xì)胞、多種祖細(xì)胞；和其他人永久、轉(zhuǎn)化的或癌癥細(xì)胞系。
細(xì)胞中的生物效應(yīng)包括增殖效應(yīng)(T32)、分化(T33)、凋亡(T34)、細(xì)胞大小的生長(T35)、細(xì)胞因子粘著(T36)、細(xì)胞粘著(T37)、細(xì)胞擴增(T38)、細(xì)胞運動性(T39)、遷移和侵入(T40)、趨化性(T41)、細(xì)胞吞噬(T42)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(T43)、富集蛋白到受體/配體(T44)、JAK/STAT途徑的激活(T 45)、Ras-erk途徑的激活(T46)、AKT途徑的激活(T47)、PKC途徑的激活(T48)、PKA途徑的激活(T49)、src激活(T50)、fas激活(T51)、TNFR激活(T52)、NFkB激活(T53)、p 38MAPK激活(T54)、c-fos激活(T55)、分泌(T56)、受體內(nèi)陷(T57)、受體交互作用(T58)、表面標(biāo)記的上調(diào)或下調(diào)(T59)、FACS前/旁散射特征的改變(T60)、亞群比值的改變(T61)、差別基因表達(T62)、細(xì)胞壞死(T63)、細(xì)胞凝集(T64)、細(xì)胞排斥(T65)、與硫酸肝素的結(jié)合(T66)、與糖基化結(jié)構(gòu)的結(jié)合(T67)、與硫酸軟骨素的結(jié)合(T68)、與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合(例如膠原、纖維結(jié)合素)(T69)、與人造材料的結(jié)合(例如支架)(T70)、與載體的結(jié)合(T71)、與輔助因子的結(jié)合(T72)、單獨的或在含有其他蛋白質(zhì)的混合物中對干細(xì)胞增殖、分化和/或自我更新的效應(yīng)(T73)等。這些特性的特征在表3中提供。
本發(fā)明進一步提供了包含分離的蛋白或其片斷的嵌合分子，比如一個膜結(jié)合蛋白質(zhì)的胞外功能域通過一個或多個蛋白質(zhì)連接子結(jié)合人免疫球蛋白的不變區(qū)(Fc)或框架區(qū)。這樣的嵌合分子在這里也表示成蛋白-Fc。本發(fā)明設(shè)想了這樣蛋白-Fc嵌合體的例子包括例如包括TNF-α-Fc，LT-α-Fc，TNFRI-Fc，TNFRII-Fc，OX40-Fc，BAFF-Fc，NGFR-Fc，F(xiàn)as配體-Fc。這樣的蛋白質(zhì)-Fc具有可測量的理化參數(shù)的特性，這些特性表示、關(guān)聯(lián)分離的蛋白-Fc的一個或多個特定藥理學(xué)特性。本發(fā)明設(shè)想的其他嵌合分子包括蛋白或蛋白-Fc或它的一個片斷，與一個如多不飽和脂肪酸分子的脂基相連。這里的脂基可以結(jié)合分子骨架中的一個氨基酸殘基或側(cè)鏈中的一個氨基酸殘基。
本發(fā)明進一步提供了包含分離蛋白或其片斷的嵌合分子，比如一個膜結(jié)合蛋白的胞外功能域通過一個或多個蛋白質(zhì)連接子結(jié)合人免疫球蛋白的Fc或框架區(qū)。在其他方面，哺乳動物免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc)或框架區(qū)來源于包含靈長類，包括人類，絨，黑猩猩和大猩猩，家畜(例如牛，羊，豬，馬，驢子)，實驗動物(如小鼠，大鼠，豚鼠，倉鼠，兔)，寵物(如貓，狗)和捕獲的野生動物(如嚙齒類動物，狐貍，鹿，袋鼠)。在另外的實施方案中，F(xiàn)c或框架區(qū)是人免疫球蛋白。在具體實施方案中哺乳動物為人類。這樣的嵌合分子在這里也表示成蛋白-Fc。本發(fā)明設(shè)想了其他嵌合分子包括蛋白或蛋白-Fc或它的一個片斷，與一個如多不飽和脂肪酸分子的脂基相連。這里的脂基可能結(jié)合分子骨架中的一個氨基酸殘基或側(cè)鏈中的一個氨基酸殘基。本發(fā)明中的嵌合分子，包括TNF-α-Fc、LT-α-Fc、TNFRI-Fc、TNFRII-Fc、OX40-Fc、BAFF-Fc、NGFR-Fc、Fas配體-Fc，其具有可測量的理化參數(shù)的特性，這些特性表示、關(guān)聯(lián)分離的蛋白-Fc的一個或多個特定藥理學(xué)特性。
尤其是，在此處使用的術(shù)語“TNFRI-Fc”和“TNFRII-Fc”指的是將含有一個或多個TNFRI或者TNFRII的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域TNFR多肽(如TNFRI或者TNFRII)的片斷，直接地或經(jīng)本領(lǐng)域已知的一個或多個蛋白質(zhì)連接子連接到人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc)或框架區(qū)或其片斷上以此融合形成嵌合蛋白。TNFR(TNFRI或TNFRII)多肽的片斷可以選自SEQ ID NO64、66、68、92、94、96、98中的一個或多個。Fc區(qū)可以選自IgG1(例基本如SEQ ID NO2，SEQ ID NO4)，IgG2(例基本如SEQ ID NO6)，IgG3(例基本如SEQ ID NO8)，IgG4(例基本如SEQ ID NO10)，IgA1(例基本如SEQ ID NO12)，IgA2(例基本如SEQ ID NO14)，IgM(例基本如SEQ ID NO16)，IgE(例基本如SEQ ID NO18)或者IgD(例基本如SEQ ID NO20)的人同工型(isotype)的Fc區(qū)。在具體實施方案中，F(xiàn)c區(qū)的Fc受體結(jié)合區(qū)或補體激活區(qū)可以通過重組進行修飾，與Fc區(qū)的氨基酸序列相比，包括一個或多個氨基酸的插入、缺失或置換。此外，F(xiàn)c區(qū)的受體結(jié)合區(qū)或補體激活區(qū)可以進行化學(xué)修飾，在氨基酸主鏈上或任何相關(guān)的共翻譯或翻譯后產(chǎn)物上，改變它的糖基化形式，增加或去除糖類部分，增加多不飽和脂肪酸部分或其它以脂為基礎(chǔ)的部分。Fc區(qū)也可以以截短的形式存在，這是由包括番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或其它任何位點特異的蛋白酶進行水解得到的。Fc區(qū)可以促進嵌合蛋白自發(fā)形成二聚體、三聚體或更高級別的多聚體，與等量的單體相比，它們結(jié)合TNF-α分子并阻止它結(jié)合于細(xì)胞結(jié)合受體的能力更高。因此，本發(fā)明設(shè)想的“TNFRI-Fc多肽”和“TNFRI I-Fc多肽”是TNF-α活性的拮抗劑。
在此處使用的“TNF”包括涉及TNF-α。
因此，本發(fā)明提供了由核苷酸序列編碼的分離的多肽，所述序列選自SEQ ID NO27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、127、129、131、133、135、137、139、141、143、147、149、151、153、155、157、159、163、165、167、169、171、173、175、177、179、183、185、187、189，或者與上述序列其中任何一個有至少65％一致性的核苷酸序列，或者能夠與上述序列或其互補形式中的任一個在低嚴(yán)格條件下雜交的序列。
本發(fā)明的另一方面提供了分離的多肽，所述多肽由各自對應(yīng)于下述序列各自的mRNA經(jīng)過細(xì)胞加工剪接的序列所編碼，所述序列由SEQ IDNO191，192，193構(gòu)成。
本發(fā)明的另一方面提供了分離的多肽，其包含的氨基酸序列選自SEQ ID NO28、30、32、34、36、38、40、44、46、48、50、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、128、130、132、134、136、138、140、142、144、148、150、152、154、156、158、160、164、166、168、170、172、174、176、178、180、184、186、188、190，或者與上述序列其中任何一個具有至少65％相似性的氨基酸序列。
本發(fā)明進一步設(shè)想了包括至少一部分蛋白質(zhì)或其嵌合體、藥理學(xué)上可接受的載體、輔助因子和/或稀釋劑結(jié)合的藥物組合物。
在一級結(jié)構(gòu)方面，本發(fā)明提供了分離的蛋白質(zhì)或其嵌合體或其片斷，其核苷酸編碼序列選自SEQ ID NO27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、127、129、131、133、135、137、139、141、143、147、149、151、153、155、157、159、163、165、167、169、171、173、175、177、179、183、185、187、189，或者與上述序列其中任何一個有至少60％一致性的核苷酸序列，或者能夠與上述序列或其互補形式中的任一個在低嚴(yán)格條件雜交的序列。
另外，本發(fā)明的其他方面提供了編碼蛋白質(zhì)或其嵌合分子或其功能區(qū)域的分離核苷酸分子，包含與SEQ ID NO27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、127、129、131、133、135、137、139、141、143、147、149、151、153、155、157、159、163、165、167、169、171、173、175、177、179、183、185、187、189具有至少60％的相似性，或最佳比對后和/或能夠與SEQ I D NO27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、127、129、131、133、135、137、139、141、143、147、149、151、153、155、157、159、163、165、167、169、171、173、175、177、179、183、185、187、189或它們的互補形式在低嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明指向分離的核苷酸分子，其具有編碼下述分子的核苷酸序列，所述分子為TNF超家族蛋白或與之相關(guān)的蛋白或其嵌合分子，其選自TNF-α、TNF-α-Fc、LT-α、LT-α-Fc、TNFRI、TNFRI-Fc、TNFRII、TNFRII-Fc、OX40、OX40-Fc、BAFF、BAFF-Fc、NGFR、NGFR-Fc、Fa s配體、Fa s配體-Fc或其片斷，基本上具有SEQ IDNO28、30、32、34、36、38、40、44、46、48、50、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、128、130、132、134、136、138、140、142、144、148、150、152、154、156、158、160、164、166、168、170、172、174、176、178、180、184、186、188、190所示的一個或多個的氨基酸序列，或與SEQ ID NO28、30、32、34、36、38、40、44、46、48、50、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、128、130、132、134、136、138、140、142、144、148、150、152、154、156、158、160、164、166、168、170、172、174、176、178、180、184、186、188、190最佳比對后的一個或多個序列有至少60％相似性的氨基酸序列。
在其他方面，本發(fā)明提供了分離的核苷酸分子，編碼選自屬于TNF超家族或與之相關(guān)的蛋白或其嵌合分子，前述蛋白質(zhì)選自TNF-α-Fc、LT-α-Fc、TNFRI-Fc、TNFRII-Fc、OX40-Fc、BAFF-Fc、NGFR-Fc、Fas配體-Fc或其片斷，包含選自具有SEQ ID NO31、33、35、45、47、49、51、63、65、67、91、93、95、97、129、131、151、153、155、165、167、185、187的核苷酸序列，其直接或者通過一個或多個本領(lǐng)域上熟知的編碼蛋白質(zhì)連接子的核苷酸序列，與編碼人免疫球蛋白的恒定(Fc)或框架區(qū)的核苷酸序列相連，所述的編碼人免疫球蛋白的恒定(Fc)或框架區(qū)的核苷酸序基本上如SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17或19的一個或多個所示。在一個具體實施方案中，編碼蛋白質(zhì)連接子的核苷酸序列選自編碼IP，GSSNT、TRA或VDGIQWIP的核苷酸序列。
在其他方面，本發(fā)明提供了分離的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是屬于TNF超家族或與之相關(guān)的分離的蛋白質(zhì)，其選自TNF-α-Fc、LT-α-Fc、TNFRI-Fc、TNFRII-Fc、OX40-Fc、BAFF-Fc、NGFR-Fc、Fas配體-Fc、或其片斷，其包含選自具有SEQ ID NO32、34、36、46、48、50、52、64、66、68、92、94、96、98、130、132、152、154、156、166、168、186、188的氨基酸序列，其直接或者通過一個或多個本領(lǐng)域上熟知的蛋白質(zhì)連接子，與人免疫球蛋白的恒定(Fc)或框架區(qū)的核苷酸序列相連，所述的編碼人免疫球蛋白的恒定(Fc)或框架區(qū)的核苷酸序列基本上如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18或20的一個或多個所示。
本發(fā)明進一步提供了分離的蛋白或其嵌合分子或編碼它的核苷酸分子在診斷，預(yù)防，治療，營養(yǎng)和/或研究應(yīng)用中的應(yīng)用。尤其應(yīng)該指出，本發(fā)明提供了在被試動物上治療或預(yù)防疾病或緩解疾病癥狀的方法，所說的方法包括向所述被試動物給予有效劑量的分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子。在一個具體實施方案中，本發(fā)明為患有下述病癥的患者提供了治療方法，所述病癥的特征為TNF-α水平過高、病情加劇或其它與TNF-α水平過高相關(guān)，該方法包括給予患者有效治療量的含有TNFRI和/或TNFRII和/或TNFRI或TNFRII的嵌合分子的藥物組合物。在一個具體實施方案中，病癥選自牛皮癬、貝切特病、大皰性皮炎、濕疹、霉菌感染、麻風(fēng)病、嗜中性皮炎、糠疹(或玫瑰糠疹)、黑糠疹(或黑色小孢子菌病)、毛發(fā)紅糠疹、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性多血管以及中毒性表皮壞死溶解。此外，疾癥可以由使用其它藥物引起的，例如，使用Aldara乳膏，包括但不局限于皮膚的紅斑、腐蝕、潰瘍、剝落、魚鱗、干燥、形成疙瘩、結(jié)硬皮、滲出液。
而且，本發(fā)明設(shè)想了用本發(fā)明的蛋白或其嵌合分子來篩選可能具有不同診斷，預(yù)防，治療，營養(yǎng)和/或研究應(yīng)用作用的小分子。
本發(fā)明進一步設(shè)想了可應(yīng)用分離蛋白或其嵌合分子作為免疫原，來產(chǎn)生用于治療和診斷的抗體。
本發(fā)明進一步設(shè)想了可應(yīng)用分離蛋白或其嵌合分子加入用于培養(yǎng)干細(xì)胞或相關(guān)治療方法的培養(yǎng)基。
本發(fā)明也提供了人源蛋白或其嵌合分子用做免疫測定或其試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的用途。本發(fā)明也提供了確定在生物制劑中人細(xì)胞表達人蛋白或其嵌合分子水平的方法。
本發(fā)明也提供了一個蛋白質(zhì)或其嵌合分子以一定的組成用于診斷、預(yù)防、治療、營養(yǎng)和/或研究。尤其是，本發(fā)明提供了適于局部應(yīng)用的制劑，包含TNFRI和/或TNFRII和/或嵌合的TNFRI或TNFRII分子，嵌合的TNFRI或TNFRII分子包括將TNFRI或TNFRII分子由直接地或者通過一個或多個蛋白質(zhì)連接子融合到抗體的Fc區(qū)或它的功能同系物上。在一個具體實施方案中，局部應(yīng)用制劑中含有在此描述的一個或多個TNFRI-Fc或TNFRII-Fc。
表1序列標(biāo)識

本文常用的簡稱的列表提供于表4和表5中。
表4簡稱和別名表5氨基酸簡稱表5(a)-非常規(guī)氨基酸的代碼

表5(b)一氨基酸極性和電荷分組
表6干細(xì)胞列表

圖1是編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的cDNA插入pIRESbleo3或pIRESbleo3-Fc載體的克隆過程的圖示。
圖2(a)表示釋放自本發(fā)明的TNFRII-Fc的N-聚糖的一組LC-MS色譜圖。上圖總離子色譜圖；下圖基峰色譜圖。
圖2(b)表示N-聚糖存在于本發(fā)明的TNFRII-Fc上時的一組MS/MS光譜。(1)[M-H]-1461，Rt 22.0min；(2)[M-2H]2-811，Rt 23.9min；(3)[M-2H]2-892，Rt 24.6min；(4)[M-2H]2-1037，Rt 27.2min。
圖2(c)表示從中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Enbrel)表達的TNFRII-Fc釋放出來的N-聚糖的一組LC-MS。上圖總離子色譜圖；下圖基峰色譜圖。
圖2(d)表示N-聚糖存在于中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Enbrel)表達的TNFRII-Fc上時的一組MS/MS光譜。(1)[M-H]-1462，Rt 22.5min；(2)[M-2H]2-893，Rt 23.6min；(3)[M-2H]2-1038，Rt 26.1min；(4)[M-2H]2-1184，Rt 30.1min；(5)[M-H]-1598，Rt 39.1min；(6)[M-H]-1906，Rt 39.2min。
圖2(e)表示從本發(fā)明的TNFRII-Fc釋放出來的O-聚糖的一組LC-MS。上圖總離子色譜圖；下圖基峰色譜圖。
圖2(f)表示O-聚糖存在于本發(fā)明的TNFRII-Fc上時的一組MS/MS光譜。(1-A和1-B)[M-H]-676，Rt 21.3min；(2-A和2-B)[M-H]-967，Rt 23.2min；(3)[M-H]-749，Rt 24.3min；(4-A和4-B)[M-H]-1041，Rt 28.9min；(5-A和5-B)[M-H]-1332，Rt 33.4min。
圖2(g)表示從中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Enbrel)表達的TNFRII-Fc釋放出來的O-聚糖的一組LC-MS。上圖總離子色譜圖；下圖基峰色譜圖。
圖2(h)表示O-聚糖存在于中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Enbrel)表達的TNFRII-Fc上時的一組MS/MS光譜。(1-A和1-B)[M-H]-676，Rt22.8min；(2-A和2-B)[M-H]-967，Rt 23.2min。
圖3(a)是一名毛發(fā)紅糠疹(pityriasis rubria pilaris)患者的一只手在治療前的圖片。注意紅色的皮膚和開放性損傷(openlesion)。
圖3(b)是圖3(a)所示的同一只手給予2ml本發(fā)明的TNFRII-Fc局部用制劑(250μg/ml TNFRII-Fc；20mg/ml沙立度胺)持續(xù)2周后的圖片。注意紅色減少以及損傷消失。
圖4的圖示表示經(jīng)濃度逐漸升高的本發(fā)明的TNF-α處理的WEHI164細(xì)胞的細(xì)胞死亡。
圖5的圖示表示經(jīng)濃度逐漸升高的本發(fā)明的LT-α處理的WEHI164細(xì)胞的細(xì)胞死亡。
圖6的圖示表示本發(fā)明的TNFRI-Fc對TNF-α在WEHI-164細(xì)胞中介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的中和能力。
圖7的圖表示本發(fā)明的TNFRII-Fc對TNF-α在WEHI-164細(xì)胞中介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的中和能力。
圖8的圖表示比較本發(fā)明的TNFRII-Fc(叉形)和非人細(xì)胞表達的TNFRII-Fc(菱形)對TNF-α在小鼠L-929細(xì)胞中介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制效應(yīng)。
圖9的圖表示比較本發(fā)明的BAFF(實心圓)和非人細(xì)胞表達的BAFF(空心圓)誘導(dǎo)的RPMI 8226細(xì)胞的增殖效應(yīng)。
圖10的圖表示本發(fā)明NGFR-Fc對NGF-β誘導(dǎo)的TF-1細(xì)胞增殖的中和能力。
圖11表示本發(fā)明TNF-α(方形)與大腸桿菌細(xì)胞表達的人TNF-α(水平線，R&D系統(tǒng)；三角形WHO)的免疫反應(yīng)性特征的體外比較。ELISA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線(圓形)。
圖12表示本發(fā)明的LT-α(方形)與大腸桿菌細(xì)胞表達的人LT-α(菱形)的免疫反應(yīng)性特征的體外比較。
圖13的圖示表示在小鼠中經(jīng)皮給予本發(fā)明的TNFRII-Fc局部用制劑后，TNFRII-Fc的生物分布。

具體實施例方式 理解為除非另外指明，本發(fā)明不限于特殊的組成、制備方法、診斷方法、分析實驗設(shè)計、營養(yǎng)實驗記錄、或研究實驗記錄或如此等等的可能的改變。還理解為在此使用的術(shù)語目的只在于描述具體的實施方案并且沒有特意限定。
應(yīng)當(dāng)注意，本說明書使用的，單數(shù)形式的不定冠詞和定冠詞包括復(fù)數(shù)，除非上下文已經(jīng)另外指明。因此，例如，關(guān)于“一種蛋白質(zhì)”、“一種細(xì)胞因子”或“一種嵌合分子”或“一種受體”，包括了單一的參量也包括了兩個或多個所述參量。
術(shù)語“化合物”、“活性因子”、“化學(xué)因子”、“藥理學(xué)活性劑”、“藥劑”、“活性物”和“藥物”在此交換使用，涉及一種化合物并且特別地涉及一種誘導(dǎo)所期望的理化和/或藥理學(xué)效應(yīng)的蛋白質(zhì)或其嵌合分子。該術(shù)語還包括這些活性因子的藥學(xué)可接受的和藥理學(xué)的活性成分，在此特別涉及包括但是不限于鹽、酯類、酰胺類、前體藥物、活性代謝物、類似物等。使用術(shù)語“化合物”、“活性因子”、“化學(xué)因子”、“藥理學(xué)活性劑”、“藥劑”、“活性”和“藥物”時，理解為其包括活性因子本身及藥學(xué)可接受的，藥理學(xué)活性鹽、酯類、酰胺類、前體藥物、活性代謝物、類似物等。
關(guān)于“化合物”、“活性因子”、“化學(xué)因子”、“藥理學(xué)活性劑”、“藥劑”、“活性物”和“藥物”包括兩種或多種活性活性物質(zhì)的組合物，例如兩種或多種細(xì)胞因子?！敖M合物”還包括多部分例如兩部分組合物，其中在配方前，因子被分別提供和給定或分別配制或混合。
例如，多部分藥包(multi-part pharmaceutical pack)可以具有兩個或更多的屬于TNF超家族或與其相關(guān)的蛋白質(zhì)或嵌合分子，其選自各自分開保存的TNF-a、TNF-a-Fc、LT-α、LT-α-Fc、TNFRI、TNFRI-Fc、TNFRII、TNFRII-Fc、OX40、OX40-Fc、BAFF、BAFF-Fc、NGFR、NGFR-Fc、Fas配體、Fas配體-Fc。
在此使用的試劑的術(shù)語“有效量”和“治療有效量”表示蛋白質(zhì)或其嵌合分子單獨地或在有其他試劑的組合物中以提供所期望的治療或生理效應(yīng)或結(jié)果的充分的量。不希望的效應(yīng)，例如副作用，有時證明伴隨所希望的治療效果；因此，醫(yī)生平衡可能的益處與可能的風(fēng)險以決定什么是適當(dāng)?shù)摹坝行Я俊?。根?jù)受試者的物種、年齡和綜合情況、給藥模式等，受試者與受試者之間必需的確切的量會改變。因此，不可能指定一個精確的“有效量”。然而，對任何個體病例的適當(dāng)?shù)摹坝行Я俊笨梢酝ㄟ^本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員使用唯一的例行試驗確定。
使用“藥學(xué)可接受的”載體，賦形劑或稀釋劑表示藥學(xué)載體包含非生物或非不良物質(zhì)，即，物質(zhì)和所選的活性因子一起給藥給受試者而不引起任何副作用或?qū)嵸|(zhì)上的副作用。載體可以包括輔料和其他添加劑，例如稀釋劑、去污劑、著色劑、濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑、防腐劑等。
類似地，在此提供的組合物的“藥學(xué)可接受的”鹽、酯類、酰胺類、前體藥物或衍生物是指非生物或非不良的鹽、酯類、酰胺類、前體藥物或衍生物。
在此使用的術(shù)語“治療”和“療法”涉及被治療疾病的癥狀的嚴(yán)重度和/或頻率的減輕，癥狀和/或潛在原因的消除，疾病和/或它們的潛在原因的癥狀發(fā)生的預(yù)防和伴隨疾病的損害的改善或補救或轉(zhuǎn)好。
“治療”受試者可以包括在易感的個體中的疾病或其他不好的生理結(jié)果的預(yù)防和通過改善疾病的癥狀對臨床癥狀個體的治療。
在此使用的“受試者”涉及動物，在特定的具體實施方案中，哺乳動物，和進一步的具體實施方案中，可以從本發(fā)明的藥物制劑和方法中受益的人。在此對可以從目前描述的藥物制劑和方法中受益的動物的種類沒有限制。受試者不論是人或非人動物可以被稱為個體、患者、動物、宿主或受體。本發(fā)明的化合物和方法應(yīng)用于人類醫(yī)學(xué)，獸醫(yī)學(xué)和一般的，馴養(yǎng)的或野生的動物飼養(yǎng)業(yè)。
上面指出的，在特定的具體實施方案中，動物是人或其他靈長類例如猩猩、大猩猩、猿、家畜動物、實驗室試驗動物、配對動物或被俘的野生動物和禽類。
實驗室試驗動物舉例包括小鼠、鼠、兔、豚鼠和倉鼠。兔和嚙齒目動物，例如鼠和小鼠，提供了方便的試驗系統(tǒng)或動物模型。家畜動物包括綿羊、牛、豬、山羊、馬和驢。非哺乳動物例如禽類、魚、和兩棲動物包括非洲蟾蜍屬、原核細(xì)胞核和非哺乳真核生物。
術(shù)語“細(xì)胞因子”用于它大多數(shù)的普遍的意義并包括任何由細(xì)胞分泌的各種蛋白質(zhì)，其調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，調(diào)節(jié)單個細(xì)胞和/或組織的功能活性，和/或誘導(dǎo)一系列生理反應(yīng)。在此使用的術(shù)語“細(xì)胞因子”應(yīng)該理解為涉及“完整”的細(xì)胞因子和包含一個或多個氨基酸的增加，缺失或替代，而且基本上保持完整細(xì)胞因子的生物學(xué)活性的其片段，衍生物或同系物或嵌合分子。
“細(xì)胞因子受體”是細(xì)胞膜關(guān)聯(lián)的或可溶的蛋白質(zhì)細(xì)胞因子受體，與細(xì)胞因子信號系統(tǒng)或調(diào)節(jié)有關(guān)。在此使用的術(shù)語“細(xì)胞因子受體”應(yīng)該理解為涉及“完整”的細(xì)胞因子受體和包含一個或多個氨基酸的增加，缺失或替代，而且基本上保持完整細(xì)胞因子受體的生物學(xué)活性的其片段、衍生物或同系物或嵌合分子。
術(shù)語“蛋白質(zhì)”用于它大多數(shù)的普遍的意義并且包括細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體。在此使用的，術(shù)語“蛋白質(zhì)”應(yīng)當(dāng)理解為涉及“完整”的蛋白質(zhì)和包含一個或多個氨基酸的增加，缺失或替代，而且基本上保持完整蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的其片段、衍生物或同系物或嵌合分子。
術(shù)語“多肽”涉及氨基酸的聚合體以及它的等價物，但不限制產(chǎn)物的特異性長度，因此，肽、寡肽、多肽和蛋白質(zhì)都包含在“多肽”的定義中。該術(shù)語也包括了多肽的所有共翻譯修飾或翻譯后修飾產(chǎn)物。同時也包括在該定義中的有，例如，含有一個或多個某氨基酸的類似物，如表5(a)給出的非自然產(chǎn)生的氨基酸或具有取代鏈的多肽。
本發(fā)明設(shè)想了分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子，其具有可測量的理化參數(shù)(Px)的特征，其中該特征表示、關(guān)聯(lián)于一個或多個特殊的藥理學(xué)特性(Ty)或形成一個或多個特殊的藥理學(xué)特性(Ty)的基礎(chǔ)。分離的蛋白質(zhì)或嵌合分子是屬于TNF超家族的蛋白質(zhì)或與之相關(guān)的蛋白質(zhì)，選自包含TNF-a、TNF-a-Fc、LT-α、LT-α-Fc、TNFRI、TNFRI-Fc、TNFRII、TNFRII-Fc、OX40、OX40-Fc、BAFF、BAFF-Fc、NGFR、NGFR-Fc、Fas配體、Fas配體-Fc的組。在此使用的TNF-a、TNF-a-Fc、LT-α、LT-α-Fc、TNFRI、TNFRI-Fc、TNFRII、TNFRII-Fc、OX40、OX40-Fc、BAFF、BAFF-Fc、NGFR、NGFR-Fc、Fas配體、Fas配體-Fc包括涉及的整個多肽和其片斷。
更特別地，本發(fā)明提供了一種分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子，其具有包括一系列可測量的理化參數(shù)的理化特征，{[Px]1，[Px]2、··[Px]n、}，其中Px表示可測量的理化參數(shù)并且“n”是≥1的整數(shù)，其中[Px]1至[Px]n各自是一個不同的可測量的理化參數(shù)，其中任何一個或多個可測量的理化特征的數(shù)值表示、關(guān)聯(lián)于一個特征性的藥理學(xué)特性Ty或一系列特征性的藥理學(xué)特性([Ty]1、[Ty]2、....[Ty]m}或形成一個特征性的藥理學(xué)特性Ty或一系列特征性的藥理學(xué)特性([Ty]1、[Ty]2、....[Ty]m}的基礎(chǔ)，其中Ty表示一個特征性的藥理學(xué)特征并且“m”是≥1的整數(shù)，并且[Ty]1至[Ty]m各自是一個不同的藥理學(xué)特性。
在此使用的術(shù)語“可測量的理化參數(shù)”(Px)涉及一個或多個可測量的分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子的特征。代表性的“特殊的可測量的理化參數(shù)”包括，但不限于表觀分子量(P1)、等電點(pI)(P2)、同工型數(shù)(P3)、不同同工型數(shù)的相對強度(P4)、糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)、N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)、N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)、酸性單糖含量的百分比(P8)、單糖含量(P9)、唾液酸含量(P10)、硫酸鹽和磷酸鹽含量(P11)、Ser/ThrGalNAc比例(P12)、N-連接寡糖的中性百分比(P13)、N-連接寡糖的酸性百分比(P14)、O-連接寡糖的中性百分比(P15)、O-連接寡糖的酸性百分比(P16)、N-連接寡糖的比例(P17)、O-連接寡糖的比例(P18)、N-連接寡糖成分的結(jié)構(gòu)(P19)、O-連接寡糖成分的結(jié)構(gòu)(P20)、N-連接寡糖的位置和構(gòu)成(P21)、O-連接寡糖的位置和構(gòu)成(P22)、共翻譯修飾(P23)、翻譯后修飾(P24)、?；?P25)、乙?；?P26)、酰胺化(P27)、脫酰胺(P28)、生物素酰化(P29)、氨甲酰化(P30)、羧化(P31)、脫羧(P32)、二硫鍵形成(P33)、脂肪酸?；?P34)、十四烷?；?P35)、十六烷?；?P36)、十八烷?；?P37)、甲酰化(P38)、糖化(P39)、糖基化(P40)、糖磷脂酰肌醇錨定(P41)、羥基化(P42)、硒代半胱氨酸的結(jié)合(P43)、脂質(zhì)(P44)、硫辛酸的加成(P45)、甲基化(P46)、N或C端封閉(P47)、N或C端移除(P48)、硝化(P49)、甲硫氨酸氧化(P50)、磷酸化(P51)、蛋白酶酶切(P52)、異戊烯化(P53)、法尼基化(P54)、牻牛兒基化(P55)、磷酸吡哆醛加成(P56)、唾液酸化(P57)、去唾液酸化(P58)、硫酸鹽化(P59)、泛素化(P60)、泛素樣分子的加成(P61)、一級結(jié)構(gòu)(P62)、二級結(jié)構(gòu)(P63)、三級結(jié)構(gòu)(P64)、四級結(jié)構(gòu)(P65)、化學(xué)穩(wěn)定性(P66)、熱穩(wěn)定性(P67)。這些參數(shù)的概要在表2中提供。
術(shù)語“特征性的(distinctive)藥理學(xué)特性”已經(jīng)被本領(lǐng)域技術(shù)人員理解為包括本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的任何藥理學(xué)的或臨床相關(guān)的特性。代表性的“藥理學(xué)特性”不僅僅限定為發(fā)明包括的治療效果(T1)、有效治療劑量(TCID50)(T2)、生物利用度(T3)、從給藥到維持治療水平的時間(T4)、吸收速率(T5)、排泄速率(T6)、特殊的活性(T7)、熱穩(wěn)定性(T8)、凍干穩(wěn)定性(T9)、血清/血漿穩(wěn)定性(T10)、血清半衰期(T11)、血流中的溶解度(T12)、免疫反應(yīng)特征(T13)、免疫原性(T14)、中和抗體抑制(T14A)、副作用(T15)、受體/配體親合力(T16)、受體/配體激活作用(T17)、組織或細(xì)胞種類特異性(T18)、生物膜或屏障的穿透能力(例如腸，肺，血腦屏障，皮膚等)(T19)、生成血管的能力(T19A)、組織吸收(T20)、降解的穩(wěn)定性(T21)、凍融穩(wěn)定性(T22)、蛋白酶穩(wěn)定性(T23)、泛素穩(wěn)定性(T24)、給藥減少(T25)、給藥模式(T26)、與其他藥學(xué)輔料或載體的相容性(T27)、在生物體或環(huán)境中的殘留(T28)、保存過程中的穩(wěn)定性(T29)、在生物體或環(huán)境中的毒性等(T30)。
另外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子在不同的細(xì)胞種類中可以具有不同的生物效應(yīng)(T31)、包括但不限于人原代細(xì)胞、例如淋巴細(xì)胞、紅細(xì)胞、視網(wǎng)膜細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)原、角質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)胚層細(xì)胞、外胚層細(xì)胞、中胚層細(xì)胞、上皮細(xì)胞、腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、骨細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、淋巴結(jié)細(xì)胞、真皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、噬中性粒細(xì)胞、粒郎格罕細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、噬酸粒細(xì)胞、噬堿粒細(xì)胞、乳房細(xì)胞、小葉細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、肺細(xì)胞、食管細(xì)胞、胰細(xì)胞、Beta細(xì)胞(胰島素分泌細(xì)胞)、成血管細(xì)胞、肌細(xì)胞、卵圓細(xì)胞(肝細(xì)胞)、間充質(zhì)細(xì)胞、腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、多種干細(xì)胞包括成體和胚胎干細(xì)胞、多種祖細(xì)胞；和其他人永久、轉(zhuǎn)化的或癌癥細(xì)胞系。細(xì)胞中的生物效應(yīng)包括增殖效應(yīng)(T32)、分化(T33)、凋亡(T34)、細(xì)胞大小的生長(T35)、細(xì)胞因子粘著(T36)、細(xì)胞粘著(T37)、細(xì)胞擴散(T38)、細(xì)胞運動性(T39)、遷移和侵入(T40)、趨化性(T41)、細(xì)胞吞噬(T42)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(T43)、募集蛋白到受體/配體(T44)、JAK/STAT途徑的激活(T45)、Ras-erk途徑的激活(T46)、AKT途徑的激活(T47)、PKC途徑的激活(T48)、PKA途徑的激活(T49)、src激活(T50)、fas激活(T51)、TNFR激活(T52)、NFkB激活(T53)、p38MAPK激活(T54)、c-fos激活(T55)、分泌(T56)、受體內(nèi)陷(T57)、受體交互作用(T58)、表面標(biāo)記的上調(diào)或下調(diào)(T59)、FACS前/旁散射特征的改變(T60)、亞群比值的改變(T61)、差別基因表達(T62)、細(xì)胞壞死(T63)、細(xì)胞凝集(T64)、細(xì)胞排斥(T65)、與硫酸肝素的結(jié)合(T66)、與糖基化結(jié)構(gòu)的結(jié)合(T67)、與硫酸軟骨素的結(jié)合(T68)、與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合(例如膠原、纖維結(jié)合素)(T69)、與人造材料的結(jié)合(例如支架)(T70)、與載體的結(jié)合(T71)、與輔助因子的結(jié)合(T72)、單獨的或在含有其他蛋白質(zhì)的混合物中對干細(xì)胞增殖、分化和/或自我更新的效應(yīng)(T73)等。這些特性的概要在表3中提供。
在此使用的術(shù)語“特征性的”與本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的藥理學(xué)特性有關(guān)，涉及一種或多種蛋白質(zhì)或其嵌合分子的藥理學(xué)特性，其對于特殊的理化特征是特征性的。在特定的具體實施方案中，分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子的一個或多個藥理學(xué)特性不同于，或是特殊性的相對于，在原核或低等真核細(xì)胞或甚至高等非人真核細(xì)胞中產(chǎn)生的相同蛋白質(zhì)或嵌合分子的形式。在特殊的具體實施方案中，被實驗的分離蛋白質(zhì)或其嵌合分子的藥理學(xué)特性基本相似于或功能等價于自然生成的蛋白質(zhì)。
在此使用的術(shù)語“原核”涉及任何原核細(xì)胞，其包括任何細(xì)菌細(xì)胞(包括放線菌細(xì)胞)或古細(xì)菌細(xì)胞。在此使用的術(shù)語“非人真核生物”的意思是不證自明的。然而，為了清楚，該術(shù)語特別地包括任何非人真核生物，其包括酵母例如酵母屬或畢赤酵母屬；其他真菌；昆蟲，包括果蠅屬和昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)物；魚，包括鮐屬；兩棲動物，包括非洲蟾蜍屬；植物和植物細(xì)胞培養(yǎng)物。
涉及“干細(xì)胞”包括胚胎或成體干細(xì)胞并且包括在表6中列出的干細(xì)胞。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子可以單獨被使用或以在cocktail中的蛋白質(zhì)被使用，以誘導(dǎo)一種或多種干細(xì)胞增殖、分化或自我更新。
蛋白質(zhì)或其嵌合分子的一級結(jié)構(gòu)可以作為氨基酸序列被測定。二級結(jié)構(gòu)可以作為一個或多個蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的數(shù)量和/或相對位置被測定，例如α-螺旋，平行β-折疊，反平行β-折疊或轉(zhuǎn)角。三級結(jié)構(gòu)描述多肽鏈的折疊，將不同的二級結(jié)構(gòu)元件裝配成特殊的排列。螺旋和折疊是二級結(jié)構(gòu)單元，而結(jié)構(gòu)域是三級結(jié)構(gòu)單元。在多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)中，三級結(jié)構(gòu)包括結(jié)構(gòu)域相互之間的排列。相應(yīng)的，三級結(jié)構(gòu)可以對一個或多個蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的存在，缺失，數(shù)量和/或相對位置進行測定。代表性的結(jié)構(gòu)域不僅僅是本發(fā)明限制的包括單螺旋、螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)域、四螺旋束、DNA結(jié)合域、三螺旋束、希臘鑰匙螺旋束、螺旋-螺旋包裝結(jié)構(gòu)域、β-三明治、β-桶狀、上下反平行β-折疊、希臘鑰匙拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域、果醬卷拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)域、β-螺旋槳、β-三葉草、β-螺旋、Rossman折疊、α/β馬蹄、α/β桶、α+β拓?fù)?、富二硫鍵折疊、絲氨酸蛋白酶抑制結(jié)構(gòu)域、?？舅亟Y(jié)構(gòu)域、EGF樣結(jié)構(gòu)域、補體C-組件結(jié)構(gòu)域、小麥植物毒素結(jié)構(gòu)域、眼鏡蛇(Cobra)神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)域、綠樹眼鏡蛇膽堿酯酶抑制劑結(jié)構(gòu)域、Kringle結(jié)構(gòu)域、粘蛋白樣區(qū)、球形區(qū)、間隔區(qū)。四級結(jié)構(gòu)描述具有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同多肽鏈的排列，每一條鏈具有獨特的一級，二級和三級結(jié)構(gòu)元件。舉例包括同-或雜-低聚物多聚化(例如二聚體形成或三聚體形成)。
對于涉及的一級結(jié)構(gòu)，本發(fā)明提供了分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子，或其片段，由選自序列表的包括SEQ ID NO27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、127、129、131、133、135、137、139、141、143、147、149、151、153、155、157、159、163、165、167、169、171、173、175、177、179、183、185、187、189，或與上面列舉的任一條序列具有至少大約60％同一性的核苷酸序列，或能夠與上述任一條序列或它們的互補形式在低嚴(yán)格度條件下雜交的核苷酸序列所編碼。
本發(fā)明另一方面提供了一種分離的多肽，其由通過細(xì)胞加工的它們各自的mRNA的拼接后的核苷酸序列SEQ ID NO191、192、193編碼。
本發(fā)明還在另一方面提供了一種分離的、編碼蛋白質(zhì)或其嵌合分子或其功能性部分的核苷酸序列分子，所述核苷酸分子包括與選自序列表包括SEQ ID NO27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、127、129、131、133、135、137、139、141、143、147、149、151、153、155、157、159、163、165、167、169、171、173、175、177、179、183、185、187、189中選擇的核苷酸至少有60％的序列相似性，或最佳比對后的和/或能夠與SEQI D No27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、127、129、131、133、135、137、139、141、143、147、149、151、153、155、157、159、163、165、167、169、171、173、175、177、179、183、185、187、189或它們的互補形式的一個或多個在低嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明指向一種分離的核苷酸分子，所述分子包括編碼一種蛋白質(zhì)或其嵌合分子，或其片段的核苷酸序列，其具有基本上如SEQ ID NO28、30、32、34、36、38、40、44、46、48、50、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、128、130、132、134、136、138、140、142、144、148、150、152、154、156、158、160、164、166、168、170、172、174、176、178、180、184、186、188、190的一個所示氨基酸序列或多個，或與SEQ ID NO28、30、32、34、36、38、40、44、46、48、50、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、128、130、132、134、136、138、140、142、144、148、150、152、154、156、158、160、164、166、168、170、172、174、176、178、180、184、186、188、190在最佳比對后的一個或多個具有至少大約60％相似性的氨基酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的核苷酸分子，編碼蛋白質(zhì)分子，或其片段，包括選自SEQ ID NO31、33、35、45、47、49、51、63、65、67、91、93、95、97、129、131、151、153、155、165、167、185、187中的核苷酸序列，其直接地或經(jīng)一個或多個編碼本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)連接子的核苷酸序列與基本如SEQ ID NO1、3、5、7、9、11、13、15、17或19的一個或多個所示的編碼人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc)或框架區(qū)的核苷酸序列連接。在一個具體的實施方案中，編碼蛋白連接子的核苷酸序列選自編碼IP、GSSNT、TRA或VDGIQWIP的核苷酸序列。
另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的蛋白質(zhì)分子或其片段，包括選自SEQ ID NO32、34、36、46、48、50、52、64、66、68、92、94、96、98、130、132、152、154、156、166、168、186、188的氨基酸序列，其直接地或經(jīng)本領(lǐng)域已知的一個或多個蛋白質(zhì)連接子與基本如SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14、16、18或20的一個或多個所示的人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc)或框架區(qū)連接。
本發(fā)明另一方面提供了一種分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子或其片段，包括選自序列表的SEQ ID NO28、30、32、34、36、38、40、44、46、48、50、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、128、130、132、134、136、138、140、142、144、148、150、152、154、156、158、160、164、166、168、170、172、174、176、178、180、184、186、188、190的氨基酸序列，或與上述序列的一個或多個具有至少大約65％相似性的氨基酸序列。
在具體實施方案中，蛋白相似性百分比或核苷酸同一性水平包括至少大約61％、或至少大約62％、或至少大約63％、或至少大約64％、或至少大約65％、或至少大約66％、或至少大約67％、或至少大約68％、或至少大約69％、或至少大約70％、或至少大約71％、或至少大約72％、或至少大約73％、或至少大約74％、或至少大約75％、或至少大約76％、或至少大約77％、或至少大約78％、或至少大約79％、或至少大約80％、或至少大約81％、或至少大約82％、或至少大約83％、或至少大約84％、或至少大約85％、或至少大約86％、或至少大約87％、或至少大約88％、或至少大約89％、或至少大約90％、或至少大約91％、或至少大約92％、或至少大約93％、或至少大約94％、或至少大約95％、或至少大約96％、或至少大約97％、或至少大約98％、或至少大約99％的相似性或同一性。
本發(fā)明的多肽的“衍生物”還包括全長親本多肽的段或部分，其保留親本多肽的部分轉(zhuǎn)錄活性并包括變體。這樣的“生物學(xué)活性片段”包括缺失型突變體和小肽，例如，具有至少10，在具體實施方案中，具有至少20個和在進一步的具體實施方案中至少30個連續(xù)的氨基酸，所述的連續(xù)的氨基酸是展示活性所必需的。這種肽可以通過標(biāo)準(zhǔn)重組核苷酸技術(shù)的應(yīng)用獲得或用常規(guī)的液相或固相合成技術(shù)合成。例如，參照物可以用所述的溶液合成或固相合成制備，例如，包括在由Nicholson編輯由Blackwell Scientific Publications出版的名為“Synthetic Vaccines”的出版物中的第9章由Atherton和Shephard命名為“Peptide Synthesis”?？蛇x的，肽能夠通過用蛋白酶例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8蛋白酶消化本發(fā)明的氨基酸序列產(chǎn)生。消化片段可以被純化，例如，高效液相色譜(HPLC)技術(shù)。任何這樣的片段，與產(chǎn)生的方法無關(guān)，可以被理解為包括在此處所用的術(shù)語“衍生物”中。
因此，術(shù)語“變體”涉及，顯示為基本上序列與參考核苷酸序列的相同的核苷酸序列或在下文中定義的在嚴(yán)格條件下與參考序列雜交的多核苷酸。術(shù)語“核苷酸序列”、“多核苷酸”和“核苷酸分子”在此可以交換使用并包括具有一個或多個核苷酸被添加或缺失，或用不同的核苷酸取代的多核苷酸。在這方面，本領(lǐng)域公知的，一些改變包括可以對參考核苷酸序列進行突變，添加，缺失和替代，由此改變的多核苷酸保持參考多核苷酸或編碼的多肽的生物學(xué)功能或活性。術(shù)語“變體”也包括自然產(chǎn)生的等位基因的變體。
本發(fā)明的核苷酸分子可以為載體或其他核苷酸構(gòu)建體形式。
在一個具體實施方案中，載體是DNA并且包含任意的選擇性標(biāo)記。
選擇性標(biāo)記的例子包括賦予對化合物例如抗生素抗性的基因，賦予在選擇性基質(zhì)中生長的能力的基因，編碼產(chǎn)生可測信號例如熒光的蛋白質(zhì)的基因。多種這樣的基因是已知的而且是可得的，包括，例如抗生素抗性基因例如新霉素抗性基因(neo)和潮霉素抗性基因(hyg)。選擇性標(biāo)記還包括賦予在某些培養(yǎng)基質(zhì)中生長能力的基因例如tk基因(胸苷激酶)或hprt基因(次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)其賦予在HAT培養(yǎng)基中生長的能力(次黃嘌呤、氨喋呤和胸腺嘧啶)；和細(xì)菌gp t基因(鳥嘌呤/黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)，其允許在MAX培養(yǎng)基中生長(霉酚酸，腺嘌呤和黃嘌呤)。其他用于哺乳動物細(xì)胞的選擇性標(biāo)記和攜帶多種選擇性標(biāo)記的質(zhì)粒在Sambrook等分子克隆-實驗手冊，冷泉港，紐約，USA，1990中有描述。
選擇性標(biāo)記可以依靠其自身啟動子表達并且標(biāo)記基因可以從與目的生物體非常不同的生物體獲得(例如用在目的哺乳動物細(xì)胞中的原核標(biāo)記基因)。然而，用受體細(xì)胞中已知功能的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)取代原來的啟動子是有用的。大量的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)對這樣的目的是有用的，例如，金屬硫蛋白啟動子、胸腺嘧啶核苷激酶啟動子、β-肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、SV40啟動子和人巨細(xì)胞病毒啟動子。廣泛使用的例子是pSV2-neo質(zhì)粒，其具有SV40早期啟動子控制下的細(xì)菌新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因并被賦予哺乳動物細(xì)胞抗G418的能力(一種新霉素相關(guān)的抗生素)。大量的其他變種可以用于增強選擇標(biāo)記在動物細(xì)胞中的表達，例如poly(A)序列的添加和合成的翻譯起始序列的添加。組成型和誘導(dǎo)型啟動子都可以使用。
本發(fā)明的遺傳構(gòu)建體還可以包含3’非翻譯序列。3’非翻譯序列涉及基因的部分，包含含有多腺苷酸化信號和任何其他能夠影響mRNA加工或基因表達的調(diào)節(jié)信號的DNA片段。多腺苷酸化信號具有影響多聚腺苷酸鏈添加到mRNA前體3’末端的特征。多聚腺苷酸信號通常通過與5′AATAAA-3′范式的同源性的存在被識別，盡管變異并不少見。
相應(yīng)地，包含本發(fā)明的核苷酸分子的遺傳構(gòu)建體，有效地與啟動子連接，可以克隆到合適的載體中以遞送到調(diào)節(jié)錯誤、功能障礙或缺失的細(xì)胞或組織中，以修復(fù)和/或提供適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)。含有合適的遺傳構(gòu)建體的載體可以通過分子生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的許多不同方法遞送到目的真核細(xì)胞中。
在此使用的術(shù)語“相似性”包括在核苷酸或氨基酸水平比較的序列之間精確的同一性。在核苷酸水平存在非同一性，“相似性”包括序列之間的差異，其導(dǎo)致氨基酸的差異，氨基酸的差異仍然與相互的結(jié)構(gòu)，功能，理化和/或構(gòu)象水平有關(guān)。在氨基酸水平存在非同一性，“相似性”包括與相互的結(jié)構(gòu)，功能，理化和/或構(gòu)象水平仍然有關(guān)的氨基酸。這包括在極性和/或電荷方面等價的“保守”氨基酸殘基。表5(b)列出了在極性和/或電荷上“等價”的氨基酸。在特定的具體實施方案中，核苷酸和序列的比較在同一性水平進行而不是相似性。
用于描述兩個或多個多聚核苷酸或多肽的序列關(guān)系的術(shù)語包括″參照序列″、″比較框″、″序列相似性″、″序列同一性″、″序列相似性百分比″、″序列同一性百分比″、″基本相似″和″基本同一″.″參照序列″為至少具有12個，但經(jīng)常為15至18個和經(jīng)常至少為25或以上的、例如30單體單元、包括核苷酸和氨基酸殘基、在長度上。因為兩條多核苷酸可以都包含(1)在兩條多聚核苷酸之間相似的序列(例如只有完整多核苷酸序列的部分)，和(2)在兩條多聚核苷酸之間不同的序列，兩條(或多條)多聚核苷酸之間序列的比較一般通過兩條多聚核苷酸的序列比較進行，通過“比較框”去識別并且比較序列局部區(qū)域的相似性?！氨容^框”涉及一般12個連續(xù)殘基的概念上的片段，其與參照序列對比。為了兩個序列的最佳比對，比較框可以包含與參照序列(其中含添加或缺失)相比大約20％或更少的添加或缺失(例如gaps)。為了排列比較框，序列的最佳比對可以通過算法的計算機化或通過檢查和通過多種所選的方法任一種產(chǎn)生的最佳比對(例如在整個比較框之間最終得到最高百分比同源性)實現(xiàn)。對照還可以由程序的BLAST族得到，例如由Altschul等公開的(Nucl Acids Res 25389、1997)序列分析的詳細(xì)討論可以在Ausubel等的Unit 19.3中找到(InCurrent Protocolsin Molecular Biology、John Wiley & Sons Inc.1994-1998)。
在此使用的術(shù)語“序列相似性”和“序列同一性”涉及序列在比較框上，在核苷酸比核苷酸基礎(chǔ)上或氨基酸比氨基酸基礎(chǔ)上同一的或功能或結(jié)構(gòu)相似的范圍。因此，例如，“序列同一性的百分比”的計算是通過在比較框中兩個最佳比對的序列進行比較，測定存在于兩個序列中具有相同核苷酸堿基(例如A，T，C，G，I)或相同的氨基酸殘基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位點的數(shù)值，以產(chǎn)生配對位點的數(shù)值，用配對位點的數(shù)值除以比較框中位點的總數(shù)(例如，框的大小)，并且將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性百分比。為了本發(fā)明的目的，“序列同一性”將被理解為表示通過DNASIS計算機程序(Version 2.5 for windows；available from Hitachi SoftwareEngineering Co.、Ltd.、South San Francisco、California、USA)用軟件所附的比較手冊中使用的標(biāo)準(zhǔn)誤差計算的“配對百分比”。相似的解釋應(yīng)用與序列相似性。
在此涉及的低嚴(yán)格度包括和包含從至少0至至少大約15％v/v甲酰胺和從至少1M至至少大約2M鹽用于雜交，和至少大約1M至至少大約2M鹽用于洗滌條件。一般的，低嚴(yán)格度在從大約25-30℃至大約42℃，例如25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41和42℃。溫度可以改變并且較高的溫度用于取代甲酰胺和/或提供可選的嚴(yán)格度條件。可選的嚴(yán)格度條件可以在需要的地方使用，例如中度嚴(yán)格度，其包括和包含從至少16％v/v到至少大約30％v/v甲酰胺，例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30％和從至少大約0.5M至至少大約0.9M鹽，例如0.5、0.6、0.7、0.8或0.9M用于洗滌條件，或高嚴(yán)格度，其包括和包含從至少大約31％v/v至至少大約50％v/v甲酰胺，例如31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49和50％和從至少大約0.01M至至少大約0.15M鹽，例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14和0.15M用于洗滌條件。一般的，洗滌在Tm＝69.3+0.41(G+C)％進行(Marmur and Doty、J Mol Biol 5109、1962)。然而，雙鏈DNA的Tm每遞減1℃錯配堿基對的數(shù)量增加1％(Bonner andLaskey、Eur J Biochem 4683、1974。甲酰胺在這些雜交條件下是可選的。相應(yīng)的，在特殊的具體實施方案中嚴(yán)格水平確定如下低嚴(yán)格度為6×SSC緩沖液，0.1％w/v SDS在25-42℃下；中嚴(yán)格度為2×SSC緩沖液，0.1％w/v SDS在溫度范圍20℃至65℃下；高嚴(yán)格度為0.1×SSC緩沖液，0.1％w/v SDS在至少65℃溫度下。
在此使用的，術(shù)語“共翻譯修飾或翻譯后修飾”涉及在肽鏈翻譯時或翻譯之后發(fā)生共價鍵修飾。共翻譯修飾或翻譯后修飾包括但不限于?；?包括乙?；?、酰胺化或脫酰胺、生物素?；?、氨甲酰化(或氨甲?；?、羧化或脫羧、二硫堿形成、脂肪酸?；?包括十四烷?；⑹轷；褪送轷；?、甲?；?、糖化、糖基化、羥化、硒代半胱氨酸結(jié)合、脂質(zhì)、類脂酸加成、甲基化、N-或C-末端封閉、N-或C-末端移除、硝化、甲硫氨酸氧化、磷酸化、蛋白酶剪切、異戊烯化(包括法尼基化、牻牛兒基化)、磷酸吡哆醛加成、唾液酸化或去唾液酸、硫酸鹽化、泛素化(或泛素化)或泛素樣蛋白質(zhì)加成。
酰化作用包括N-末端起始甲硫氨酸的水解和乙?；Y(jié)合到新的N末端氨基酸。乙?；鵆o-A是酰化作用的乙?；w。
酰胺化是肽的羧基端與酰胺基的共價鍵并且對于生物活性和蛋白的穩(wěn)定性通常是必需的。去酰胺化是酰胺基的水解移除。包含氨基酸殘基的酰胺的去酰胺化是少有的變形，其由生物體完成用以重組3D結(jié)構(gòu)并且改變電荷比率/pI。
生物素酰化作用是一項技術(shù)由此生物素基結(jié)合到分子上，在酶的生物合成過程中通過羧化全酶合成酶催化或在體外進行，趨向于通過用生物素標(biāo)記的探針和抗生素蛋白孵化的可見的特殊底物，或者趨向于連接到受理化分析檢驗的多種物質(zhì)的任一種的抗生蛋白鏈霉素。
氨甲?；饔?或氨甲?；?將氨基甲酰從含有氨甲酰的分子(例如氨甲酰磷酸)轉(zhuǎn)移到受體部分例如氨基。
谷氨酸殘基的羧化作用是維生素K依賴性反應(yīng)其導(dǎo)致γ羧基谷氨酸的形成(Gla殘基)。Gla殘基存在于凝血級聯(lián)的幾種蛋白質(zhì)中，其對于蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能是必需的。羧化作用也可以發(fā)生于天門冬氨酸殘基。
二硫鍵是當(dāng)兩個半胱氨酸的巰基被氧化時形成的二硫化物的共價鍵。許多哺乳動物蛋白質(zhì)包含二硫鍵，且其對于蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生和維持，和這樣的生物學(xué)活性是決定性的。
在細(xì)菌中的蛋白質(zhì)合成包括N-末端甲硫氨酸的甲?；腿ゼ柞；?。這種甲酰化/去甲?；难h(huán)在真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中不發(fā)生并且是細(xì)菌細(xì)胞獨有的特征。除了發(fā)生在甘氨酸殘基的羥基化作為酰胺化過程的一部分以外，羥基化還可以在脯氨酸和賴氨酸羥化酶催化下發(fā)生在脯氨酸和賴氨酸上(Kivirikko et al.FASEB Journal 31609-1617、1989)。
糖化是葡萄糖或其他糖類不受控制的，非酶的結(jié)合到蛋白質(zhì)的氨基酸主鏈。
糖基化是糖單元結(jié)合到多肽主鏈并將進一步在下文中描述。
羥化作用是作為輔助因子的維生素C依賴性的反應(yīng)。羥化作用作為翻譯后修飾的重要性的增加是由于羥化賴氨酸作為糖基化作用的結(jié)合位點。
含硒蛋白質(zhì)是含有稀有元素的硒的蛋白質(zhì)，通過在翻譯過程中加入唯一的氨基酸，硒代半胱氨酸。用于硒代半胱氨酸的tRNA替代絲氨酸并且然后酶硒代以產(chǎn)生硒代半胱氨酸-tRNA。硒代胱氨酸-tRNA的反義密碼子與mRNA(UGA)中的終止密碼子相互影響替代絲氨酸密碼子。含硒蛋白質(zhì)mRNAs的3’非翻譯區(qū)(UTR)中的一個元件決定了UGA讀作終止密碼予還是硒代半胱氨酸密碼子。
脂質(zhì)化是一個包含蛋白質(zhì)上脂質(zhì)的共價結(jié)合的總稱，其包括脂肪酸?；饔煤彤愇煜┗?。
脂肪酸?；饔冒ㄖ舅岬墓矁r連接物例如十四肉豆蔻酸(十四烷?；?，十六碳棕櫚酸(十六烷酰化)和18碳硬脂酸(十八烷?；?。脂肪酸在前-高爾基區(qū)隔中連接到蛋白質(zhì)并且可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)對膜的靶向作用(Blenis and Resh Curr Opin Cell Biol 5(6)984-9，1993)。脂肪酸?；饔靡虼嗽诘鞍踪|(zhì)的功能性活動中是重要的(BernsteinMethods Mol Biol 237195-204，2004)。
異戊烯化包括異戊二烯基，即15碳法尼基或20碳牻牛兒-牻牛兒基與受體蛋白的結(jié)合。類異戊二烯化合物，包括法尼基氯喹或牻牛兒基丙酮氯喹，在膽固醇生物合成途徑中獲得。類異戊二烯基通過硫醚鍵附著到契合序列CAAX中的半胱氨酸殘基上(其中A是除丙氨酸以外的任何脂肪族氨基酸)，定位于蛋白質(zhì)的羧基端。異戊烯化改變蛋白質(zhì)與類脂膜聯(lián)合的能力并且所有已知的GTP-結(jié)合水解蛋白質(zhì)(G蛋白)是以該方法修飾的，使得異戊烯化對信號傳導(dǎo)是決定性的。(RandoBiochim Biophys Acta 1300(1)5-16、1996；Gelbet al.Curr OpinChem Biol 2(1)j40-8、1998)。
類脂酸是維生素樣抗氧化劑，作為清除劑的自由基。硫辛酸賴氨酸形成是通過硫辛酸蛋白連接酶將類脂酸附著到結(jié)合酰胺的賴氨酸上。
蛋白甲基化是一種通常的修飾可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性或產(chǎn)生新的氨基酸種類。蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基從S-腺苷-L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)移到蛋白中的親核的氧，氮或硫原子。甲基化效果分為兩種一般的分類。第一，甲基轉(zhuǎn)移酶和甲基酯酶的相對水平在特殊的羧基上可以控制甲基化程度，其輪流調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性。這種甲基化是可逆的。蛋白質(zhì)甲基化反應(yīng)的第二組包括蛋白質(zhì)中硫或氮原子的不可逆的修飾。這種反應(yīng)產(chǎn)生具有改變的理化特征的新的氨基酸，其改變蛋白質(zhì)的活性(Clarke Curr Opin Cell Biol5977 983、1993)。
蛋白硝化是重要的翻譯后修飾，其在氧化亞氮信號傳導(dǎo)中進行。蛋白質(zhì)的硝化調(diào)節(jié)催化活性，細(xì)胞信號和細(xì)胞骨架組構(gòu)。
磷酸化涉及對蛋白激酶的磷酸基加成。絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸殘基是被磷酸化的氨基酸。磷酸化是一種重要的機制，其調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的生物活性。
大部分蛋白質(zhì)還被蛋白酶剪切修飾。其可以僅包括起始甲硫氨酸的移除。其他蛋白質(zhì)以失活前體形式合成，通過限制性或特異性蛋白酶解而活化。為了分泌或與膜結(jié)合的蛋白(前蛋白)的合成具有12-36個主要疏水氨基酸的信號序列，其在之后經(jīng)過ER膜時被切除。
磷酸吡哆醛是維生素B6的輔酶衍生物并且參加氨基酸側(cè)鏈的氨基轉(zhuǎn)移，脫羧，外消旋作用，和很多修飾。所有的磷酸吡哆醛-需要性酶通過氨基酸與輔酶之間希夫堿的形成起作用。大多數(shù)依賴磷酸吡哆醛基與賴氨酸殘基結(jié)合的酶是自我激活的。
唾液酸化作用涉及通過各種唾液酸轉(zhuǎn)移酶將唾液酸附著于糖蛋白的末端位置；而去唾液酸化涉及唾液酸的切除。唾液酸包括但不限于，N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)和N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)。唾液酸結(jié)構(gòu)由糖蛋白唾液酸化引起，包括唾液酸Lewis結(jié)構(gòu)，例如，唾液酸Lewisa和唾液酸Lewis x，和唾液酸T結(jié)構(gòu)，例如，唾液酸-TF和唾液酸Tn。
硫酸鹽化作用在酪氨酸殘基發(fā)生并通過存在于高爾基外側(cè)網(wǎng)面的酶酪氨酸蛋白硫轉(zhuǎn)移酶催化。已確定由HepG2細(xì)胞分泌的1至20以內(nèi)的蛋白和由成纖維細(xì)胞分泌的1至3以內(nèi)的蛋白至少一個酪氨酸硫酸鹽殘基。硫酸鹽化作用被發(fā)現(xiàn)對蛋白的生物活性有影響。特別感興趣的是CCR5，主要的HIV共受體，發(fā)現(xiàn)被酪氨酸硫酸鹽化并且CCR5的N-末端胞外域中一個或多個酪氨酸殘基的硫酸鹽化對于MIP-1alpha/CCL3、MIP-1 beta/CCL4、和RANTES/CCL5的最佳附著和最佳的HIV共-受體功能是必須的(Moore J Biol Chem 278(27)24243-24246，2003)。硫酸鹽化作用還可以在糖類上發(fā)生。另外，糖蛋白的糖類部分的硫酸鹽化能夠通過糖硫轉(zhuǎn)移酶例如GalNAc(β1-4)GlcNAc(β1-2)Manα4硫轉(zhuǎn)移酶的活性發(fā)生。
翻譯后修飾可以包含蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)鍵合。泛素是一種76氨基酸蛋白質(zhì)，在哺乳動物細(xì)胞中其既可以自身結(jié)合也可以共價附著于其他蛋白質(zhì)。通過泛素的C末端與其他蛋白質(zhì)中的賴氨酸殘基的氨基間的肽鍵附著。泛素分子的鏈與靶蛋白的附著靶定趨于被蛋白酶體蛋白酶解并對于調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定狀態(tài)水平，例如與細(xì)胞周期有關(guān)的蛋白質(zhì)，是一種重要的機制(Wilkinson Annu Rev Nutr 15161-89、1995)。相反，單遍在蛋白化在蛋白質(zhì)功能的直接調(diào)節(jié)中能夠起到重要的作用。泛素樣蛋白質(zhì)還能夠共價附著到蛋白質(zhì)上以影響它們的功能代謝，包括NEDD-8、SUMO-1和Apg12。
糖基化是糖殘基在多肽主鏈上的附著。糖殘基，例如單糖，二糖和寡糖包括但不限于海藻糖(Fuc)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、氨基半乳糖(GalNAc)、葡萄糖胺(GlcNAc)、甘露糖(Man)、N-乙酰氨基乳糖(lacNAc)、N，N’-二乙酰氨基乳糖(lacdiNAc)。這些糖單元可以以至少七種方式附著在多肽主鏈上，即， (1)通過N-糖苷鍵結(jié)合到共同序列Asn-X-Ser；Asn-X-Thr；或Asn-X-Cys中的天冬氨酸殘基的R-基(N-糖基化)。
(2)通過O糖苷鍵結(jié)合到絲氨酸，蘇氨酸，羥基脯氨酸，酪氨酸或羥基賴氨酸的R-基(O-糖基化)。
(3)通過酪氨酸的R-基C-連接甘露糖； (4)糖磷脂酰肌醇錨定用于將一些蛋白質(zhì)固定到細(xì)胞膜； (5)連接到絲氨酸或蘇氨酸的R-基的GlcNAc作為信號單糖。該連接通常為可逆的伴有無機磷酸鹽附著(Yin-o-Yang)； (6)線性多糖對絲氨酸，蘇氨酸或天冬氨酸的附著(蛋白聚糖)； (7)通過S-糖苷鍵連接到半胱氨酸的R-基。
糖基化結(jié)構(gòu)可以包含表7中如下的一個或多個糖抗原決定簇。
表7 糖抗原決定簇列表糖類還可以包含一些觸角結(jié)構(gòu)，包括單，雙，三和四外側(cè)結(jié)構(gòu)。
糖基化可以通過N聯(lián)糖基化，O聯(lián)糖基化，C聯(lián)甘露糖結(jié)構(gòu)，和糖磷脂酰肌醇錨定的存在，缺失或模式；糖類質(zhì)量百分比；Ser/Thr-GalNAc比例；單，二，三和四糖結(jié)構(gòu)的比例或通過凝集素或抗體結(jié)合測定。
蛋白質(zhì)的唾液酸化作用可以通過蛋白質(zhì)與抗一種特定的唾液酸結(jié)構(gòu)的抗體的免疫反應(yīng)性測定。例如，Lewis x特殊抗體與由粒細(xì)胞表達的CEACAM1反應(yīng)但不與293細(xì)胞表達的重組人CEACAM1反應(yīng)(Luckaet al Glycobiology 15(1)87-100、2005)?？蛇x的，唾液酸結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)中的存在可以通過糖苷酶處理的混合物經(jīng)適當(dāng)?shù)臏y量過程例如質(zhì)譜(MS)，高效液相色譜(HPLC)或糖質(zhì)量指紋圖譜(GMF)檢測。
蛋白質(zhì)的表觀分子量包括蛋白復(fù)合物的所有組成部分(輔助因子和非共價鍵域)和所有共翻譯修飾或翻譯后修飾(共價基團對肽的附著或由肽上切除共價基團)。表觀分子量通常受到共翻譯修飾或翻譯后修飾影響。蛋白質(zhì)的表觀分子量可以通過SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)確定，其在它的雙向類似物，2D-PAGE(二維聚丙烯酰胺凝膠電泳)中也是二維的。然而，蛋白質(zhì)的表觀分子量可以通過質(zhì)譜(MS)-可以通過產(chǎn)生改變的電子離子的矩陣-輔助的激光解析電離-飛行時間(MALDI-TOF)MS或產(chǎn)生多個帶電荷的峰的更敏感的電噴霧離子化(ESI)MS更精確的確定。蛋白質(zhì)或其嵌合分子的表觀分子量可以在1至1000kDa范圍內(nèi)。相應(yīng)的，本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)或嵌合分子具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、615、616、617、618、619、620、621、622、623、624、625、626、627、628、629、630、631、632、633、634、635、636、637、638、639、640、641、642、643、644、645、646、647、648、649、650、651、652、653、654、655、656、657、658、659、660、661、662、663、664、665、666、667、668、669、670、671、672、673、674、675、676、677、678、679、680、681、682、683、684、685、686、687、688、689、690、691、692、693、694、695、696、697、698、699、700、701、702、703、704、705、706、707、708、709、710、711、712、713、714、715、716、717、718、719、720、721、722、723、724、725、726、727、728、729、730、731、732、733、734、735、736、737、738、739、740、741、742、743、744、745、746、747、748、749、750、751、752、753、754、755、756、757、758、759、760、761、762、763、764、765、766、767、768、769、770、771、772、773、774、775、776、777、778、779、780、781、782、783、784、785、786、787、788、789、790、791、792、793、794、795、796、797、798、799、800、801、802、803、804、805、806、807、808、809、810、811、812、813、814、815、816、817、818、819、820、821、822、823、824、825、826、827、828、829、830、831、832、833、834、835、836、837、838、839、840、841、842、843、844、845、846、847、848、849、850、851、852、853、854、855、856、857、858、859、860、861、862、863、864、865、866、867、868、869、870、871、872、873、874、875、876、877、878、879、880、881、882、883、884、885、886、887、888、889、890、891、892、893、894、895、896、897、898、899、900、901、902、903、904、905、906、907、908、909、910、911、912、913、914、915、916、917、918、919、920、921、922、923、924、925、926、927、928、929、930、931、932、933、934、935、936、937、938、939、940、941、942、943、944、945、946、947、948、949、950、951、952、953、954、955、956、957、958、959、960、961、962、963、964、965、966、967、968、969、970、971、972、973、974、975、976、977、978、979、980、981、982、983、984、985、986、987、988、989、990、991、992、993、994、995、996、997、998、999、1000kDa的表觀分子量。蛋白質(zhì)的分子量或分子質(zhì)量可以通過任何方便的方法確定，例如電泳，質(zhì)譜，梯度離心。
蛋白質(zhì)的等電點(或pI)是蛋白不攜帶凈電荷時的pH。該屬性可以通過等電聚焦(IEF)測定，其也是2D-PAGE的一維。實驗性的確定pI值受共翻譯修飾或翻譯后修飾的范圍的影響并且因此實驗的pI與理論的pI之間的區(qū)別可以高達5個單位。相應(yīng)的，本發(fā)明的分離的蛋白質(zhì)或嵌合分子可以具有0、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0、10.1、10.2、10.3、10.4、10.5、10.6、10.7、10.8、10.9、11.0、11.1、11.2、11.3、11.4、11.5、11.6、11.7、11.8、11.9、12.0、12.1、12.2、12.3、12.4、12.5、12.6、12.7、12.8、12.9、13.0、13.1、13.2、13.3、13.4、13.5、13.6、13.7、13.8、13.9、或14.0的p I。
在此使用的術(shù)語“同工型”表示一種給定蛋白的多種分子形式，并且包括在下列水平上不同的蛋白質(zhì)(1)一級結(jié)構(gòu)(例如由于變位RNA剪接，或多態(tài)性)；(2)二級結(jié)構(gòu)(例如由于不同的共翻譯修飾或翻譯后修飾)；和/或(3)三級或四級結(jié)構(gòu)(例如由于不同的亞單位相互作用，同-或異-低聚物多聚化)。特殊的，術(shù)語“同工型”包括糖型，其包含具有連續(xù)一級結(jié)構(gòu)但在二級或三級結(jié)構(gòu)，或共翻譯修飾或翻譯后修飾，例如不同糖基化形式，水平上不同的蛋白質(zhì)或其嵌合分子。
蛋白質(zhì)的化學(xué)穩(wěn)定性可以以特殊溶劑或環(huán)境中蛋白質(zhì)的“半衰期”形式被測量。代表性的，具有少于50kDa分子量的蛋白質(zhì)具有大約5至20分鐘的半衰期。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子設(shè)想了具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100小時的半衰期。另一種化學(xué)穩(wěn)定性的特別地方便的測量為蛋白質(zhì)或其抗性分子對蛋白酶消化作用的抗性，例如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化作用。
蛋白質(zhì)或其嵌合分子對它的配體或受體的親合力可以以平衡分離系數(shù)(Kd)或功能等價測量的形式測量。
蛋白質(zhì)的溶解性可以通過溶于給定的溶劑的蛋白總量和/或其中蛋白質(zhì)溶解的比例的測量。進一步，蛋白質(zhì)或其嵌合分子在不同性質(zhì)例如極性，pH，溫度等的溶劑中溶解的比例和或水平還可以提供蛋白質(zhì)或其嵌合分子的可測量的理化特性。
任何“可測量的理化參數(shù)”可以用對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說已知的任何方法確定，測量，量化或限定。下面描述的是可以用于確定，測量，量化或限定一個或多個分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子的可測量的理化參數(shù)的方法學(xué)的范圍。然而，其應(yīng)當(dāng)理解為本發(fā)明決不僅僅限定為所描述的特殊的方法，或限定為使用這些方法是可測量的可測量的理化參數(shù)。
糖蛋白可以被描述為具有兩個相互作用以產(chǎn)生一個作為整體的分子基本組成部分-氨基酸序列和糖類或糖側(cè)鏈。分子的糖類組成部分分別以通過N-或O-鍵附著在Asn氨基側(cè)鏈或Ser/Thr殘基的羥基側(cè)鏈上的單糖或寡糖側(cè)鏈形式存在。單糖是關(guān)于糖類最小單位的術(shù)語，其被認(rèn)為是一個糖，具有(CH2O)n的基本化學(xué)式并且大多數(shù)通常形成5或六元環(huán)狀結(jié)構(gòu)(分別為戊糖和己糖)。寡糖是具有多種復(fù)雜的單糖成型結(jié)構(gòu)的化合物，其可以是線性的或分支的，但通常不具有串聯(lián)重復(fù)單元的長鏈(其是一種多糖的形式)。寡糖含有的分支水平和末端的分支替換明顯地影響作為一個整體的糖蛋白的特征，并且在分子的生物學(xué)功能上起到重要的作用。寡糖是在細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和高爾基體中制備并附著到氨基酸主鏈上的。不同的生物體和細(xì)胞的種類具有不同的糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)切糖苷酶和外切糖苷酶的比值并且因此產(chǎn)生不同的寡糖結(jié)構(gòu)。身體主要的防御機制之一是發(fā)現(xiàn)并破壞異常的同工型，并且同樣的具有正確的糖基化的生物治療劑不僅對于增強療效還對于減少被中和抗體的發(fā)現(xiàn)是重要的。
聚糖鏈通常以分支形式表達，并且即使當(dāng)其為線性時，這樣的鏈通常受到多種修飾。因此，寡糖的全序列很難通過單一的方法完成并且因此需要物理和化學(xué)方法反復(fù)的結(jié)合而最終獲得所研究的結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)。
蛋白質(zhì)的糖基化模式的測定可以通過使用很多不同的方法進行，例如用SDS-PAGE。這種技術(shù)依賴于糖基化蛋白質(zhì)在SDS-PAGE中通常以不同的擴散帶移行的事實。不同的同工型之間的分化的進行是通過用一系列試劑處理蛋白質(zhì)。例如，用肽-N4-(N-乙酰-β-D-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶(PNGase)消化后帶寬的顯著的減少和移行位置的改變來考慮N連接的糖基化的辨別。
為了測定N連接的糖基化的組分，N-糖鏈用從腦膜膿毒性黃桿菌克隆的和在大腸桿菌中表達的PNGase從蛋白質(zhì)中切除。切除的N-糖鏈可以從如Packer et al Glycoconj J 5(8)737-47、1998所述的Alltech Carbograph SPE碳柱(Deerfield、Illinois、USA)回收。然后，樣品可以用具有GP50泵ED50脈沖安培計或電導(dǎo)檢測器和多種pH陰離子交換柱的Dionex系統(tǒng)進行單糖分析，唾液酸分析或硫酸鹽分析。
O-連接糖基化的程度可以通過首先經(jīng)β-消除從目的蛋白質(zhì)切除O-糖鏈來測定。切除的O-糖鏈可以如Packer et al.(1998、如上)所述的從Alltech Carbograph SPE碳柱(Deerfield、Illinois、USA)回收。然后，樣品可以用具有GP50泵ED50脈沖安培計或電導(dǎo)檢測器和多種pH陰離子交換柱的Dionex系統(tǒng)進行單糖分析，唾液酸分析或硫酸鹽分析。
寡糖的單糖亞單位具有可變的酸敏感性并因此可以在輕度三氟乙酸(TFA)條件，中度TFA條件，和強鹽酸(HCl)條件下從目的蛋白中釋放。然后，單糖混合物通過使用多種柱填充介質(zhì)的高pH陰離子交換層析(HPAEC)分離，并用脈沖安培電化學(xué)檢測法(PAD)進行檢測。
高pH陰離子交換層析與脈沖安培檢測法(HPAEC-PAD)已經(jīng)廣泛地用于測定單糖組分。熒光-標(biāo)記方法已經(jīng)被引入并且很多以試劑盒形式使用。熒光方法的明顯的優(yōu)勢是敏感性增強(大約50倍)。一個潛在的不足是偶聯(lián)反應(yīng)時，水解產(chǎn)物中和外標(biāo)混合物中，不同的單糖可以對不同的熒光基團表現(xiàn)出不同的選擇性。然而，敏感性的增強和從實際的糖蛋白的總量的一小部分中鑒別哪些單糖存在的能力，及用激光誘發(fā)的熒光的更強的敏感性的潛力，使得該方法很有吸引力。另外電導(dǎo)檢測器可以用于測定硫酸鹽和磷酸鹽組分。依照使用規(guī)程，峰面積可以計算出存在的每種單糖的總量。這些數(shù)據(jù)可以表示N-和O-連接糖基化的水平，唾液酸化的程度，和化合物中氨基酸組成成分，糖基化重量百分比，酸性糖蛋白重量百分比。
蛋白質(zhì)的少量的單糖組成分析最好在電印記化后用PVDF(PSQ)膜進行，或，較少的量用點印跡法分析。PVDF是糖類分析理想的基質(zhì)，因為一旦經(jīng)過酸或酶水解，單糖和寡糖都不結(jié)合到膜上。
目的分子的寡糖含量的測定通過許多技術(shù)進行。糖首先從氨基酸主鏈上被酶的(例如用PNGase消化)或化學(xué)的(例如用氫氧化物β消除)方法切除。糖可以通過還原穩(wěn)定或用熒光標(biāo)記使易于檢測。然后，生成的游離寡糖被分離，可以通過高pH陰離子交換層析和脈沖安培電化學(xué)檢測法(HPAEC-PAD)，其能夠用于已知的標(biāo)準(zhǔn)以測定多種結(jié)構(gòu)的比值和唾液酸化的水平，或通過熒光輔助糖電泳(FACE)，一種類似于蛋白質(zhì)SDS-PAGE分離的方法。在這個過程中，寡糖用熒光基團標(biāo)記，其影響了電泳遷移率。它們在高百分比的聚丙烯酰胺凝膠中被分離并且獲得的帶型提供了目的分子的寡糖含量的特征。通過使用標(biāo)準(zhǔn)樣品，獲得存在的實際結(jié)構(gòu)的一些信息或條帶可以被切下并用質(zhì)譜進行分析，可以測定它們每一個的結(jié)構(gòu)。
熒光輔助糖電泳(FACE)是一種聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)，設(shè)計用于分離從糖結(jié)合物釋放的單個的寡糖。寡糖通過化學(xué)的或酶方法從樣品蛋白質(zhì)中被切除，以這樣的方式保留了還原端。然后，寡糖被消化為單糖或保持完整，并被熒光標(biāo)記(帶電荷的或不帶電荷的)。高百分比聚丙烯酰胺凝膠和多種緩沖系統(tǒng)用于遷移寡糖/單糖，其相對于它們的大小/組分以與蛋白質(zhì)幾乎相同的方式遷移。糖類通過光密度法可視化并且糖的相對含量可以通過熒光檢測被測定。這個過程與MALDI-TOF MS一致，因此該方法可以用于說明實際結(jié)構(gòu)。
石英晶體微量天平和表面等離子共振(分別為QCM和SPR)是通過分子的理化特性獲得生物信息的兩種方法。兩者通過相互作用導(dǎo)致的預(yù)制芯片的物理特征的改變測量蛋白-蛋白間接相互作用。在QCM中單個的石英晶體片用與目標(biāo)配體相互作用的受體/抗體等處理。這種芯片通過微量天平振動并且芯片的頻率被記錄。目標(biāo)蛋白質(zhì)被允許通過芯片并且與結(jié)合的分子相互作用引起薄片的頻率改變。通過配體與芯片的相互作用的條件的改變，可以測定目的分子的結(jié)合特性。
表觀分子量也是一種理化特征，其可以用于測定本發(fā)明和那些用可選擇地方式產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或嵌合分子之間的相似性。
在此使用的，術(shù)語“分子量”定義為分子中組成原子的原子量的總和，有時也涉及“分子質(zhì)量”(Mr)。分子量理論上可以通過對分子中組成原子的原子質(zhì)量合計來確定。術(shù)語“表觀分子量”定義為通過一種或多種分析技術(shù)例如SDS page或超速離心測定的分子量，并且依賴于分子和檢測系統(tǒng)之間的關(guān)系。蛋白質(zhì)或其嵌合分子的表觀分子量可以用一系列實驗方法的任一種進行測定。用于測定蛋白質(zhì)的分子量的分析方法包括，不限于，排阻色譜(SEC)、凝膠電泳、瑞利光散射、分析超速離心、和，某種程度上，飛行時間質(zhì)譜法。
凝膠電泳是蛋白質(zhì)的一些理化特征(特別是表觀分子量和DI)的測定方法和關(guān)于將分子分離為同工型的雙向電泳，從而提供蛋白產(chǎn)物翻譯后修飾的信息。具體地，電泳是迫使帶電分子(例如蛋白質(zhì)或DNA)移行通過凝膠基質(zhì)(大多數(shù)普通的聚丙烯酰胺或瓊脂糖)的方法，通過穿過膠體的電位的使用。用于蛋白質(zhì)的最普遍的電泳形式為等電聚焦，非變性，和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。在等電聚焦中蛋白質(zhì)置于具有穿過其間的pH梯度的聚丙烯酰胺凝膠中。蛋白將移行到凝膠中的一個位置，在該處蛋白具有為零的凈電荷，從而給出蛋白的等電點。
糖質(zhì)量指紋(GMF)是一種方法，經(jīng)該方法，蛋白質(zhì)或它的同工型之一的寡糖特征通過電泳和隨后的特殊的質(zhì)譜技術(shù)被鑒定。樣品蛋白質(zhì)通過用于總蛋白測定的1D SDS-PAGE或用于特殊同工型特性的2D凝膠電泳被純化。蛋白條帶/斑點從凝膠上切除并脫色以除去污染物。糖類通過化學(xué)或酶法釋放并使用nanoflow LC系統(tǒng)除鹽/分離并且隨后對存在于樣品中的寡糖進行鑒定。LC流可以直接地注射到電子噴霧質(zhì)譜儀(用于測定質(zhì)量并隨后鑒別量存在于樣品中)其提供了每一種同工型的一個特征或指紋，可以結(jié)合定量技術(shù)例如Dionex分析，以測定所測試的分子的總的組分。
一級結(jié)構(gòu)可以通過測定本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的理化特征評估。
蛋白質(zhì)或其嵌合分子的一級結(jié)構(gòu)可以使用一個或多個下列系統(tǒng)進行分析。
蛋白質(zhì)或其嵌合分子的一級結(jié)構(gòu)的信息可以用質(zhì)譜(MS)、DNA測序、氨基酸組成、蛋白質(zhì)測序和肽質(zhì)量指紋的結(jié)合進行測定。
為了測定氨基酸主鏈的序列，N-末端化學(xué)測序、串連質(zhì)譜測序、或兩者的結(jié)合都可以使用。N-末端化學(xué)測序利用Edman化學(xué)(Edman P.″Sequence determination″Mol Biol Biochem Biophys 8211-55、1970)，其中記載蛋白質(zhì)N-末端氨基酸和2位的氨基酸之間的肽鍵比序列中所有其他的肽鍵弱。通過使用中度酸性條件，N-末端氨基酸被切除，衍生為具有熒光基團(FTIC)和測定在反相HPLC柱中的保留時間，并且與標(biāo)準(zhǔn)樣品比較以確定是何種氨基酸。該方法可以測定分子實際的一級結(jié)構(gòu)但不是定量的。任選的，nanoflow液相色譜串連質(zhì)譜可以被使用(LC-MS/MS)。該方法中，使用特異的內(nèi)切蛋白酶將蛋白質(zhì)水解為肽并且測定肽的分子量。然后用高能碰撞氣體例如氮氣或氬斷裂肽鍵并且測量獲得的肽的質(zhì)量。通過計算肽的質(zhì)量的改變，可以測定每一種肽的序列(每種氨基酸具有唯一的質(zhì)量)。然后通過使用不同的蛋白酶，肽可以交疊以測定它們的次序并由此測定蛋白質(zhì)的全序列。
清楚地，酶消化、化學(xué)衍生、液相色譜(LC)/MS和串連MS的結(jié)合提供了一種非常有效的工具，用于AA序列分析。例如，重組可溶性CD4受體的詳細(xì)結(jié)構(gòu)通過方法的結(jié)合被表征，已經(jīng)確定超過95％的該369AA糖蛋白的一級結(jié)構(gòu)并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)N-和C-端的全部特性，多聚糖的附著位置，多聚糖結(jié)構(gòu)和二硫橋鍵的正確配置(Carr et al.J BiolChem 264(35)21286-21295、1989)。
質(zhì)譜(MS)是一種通過真空下帶電環(huán)境中分子的行為的推斷測量分子質(zhì)量的方法。MS在穩(wěn)定性研究和質(zhì)量控制中非常有用。該方法首先要求用蛋白水解酶進行(胰蛋白酶，V8蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，枯草桿菌蛋白酶，和梭菌蛋白酶)的樣品消化(Franks et al.Characterization of proteins、Humana Press、Clifton、NJ、1988；Hearn et al.Methods in Enzymol 104190-212、1984)然后，通過反相色譜法(RPC)的分離消化樣品。用胰蛋白酶消化結(jié)合LC-MS，肽圖譜可以用于探測遺傳穩(wěn)定性，產(chǎn)物批次的同源性，和發(fā)酵，提純，劑型制備和貯存過程中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。
質(zhì)量分析前，一些方式用于將HPLC連接到質(zhì)譜儀1)直接的液體注射；2)超臨界流體；3)傳送帶系統(tǒng)；4)熱噴法。用于Caprioli’s操作的HPLC/MS連接使用熔融石英毛細(xì)管柱將柱中洗脫液輸送到質(zhì)譜儀的離子化室的樣品探針接頭。當(dāng)樣品溶液出現(xiàn)在毛細(xì)管接頭時，用高能的Xe原子連續(xù)轟擊探針接頭，引起樣品溶液濺射。然后質(zhì)量通過儀器分析(Caprioli et al.Biochem Biophys Res Commun146291-299、1987)。
MS/MS和LC/MS連接擴充了MS潛在的應(yīng)用。MS/MS允許25AAs以上的肽全序列的部分、脫酰胺位點和異構(gòu)化的直接鑒別(Carr et alAnal Chem 632802-2824、1991)。RPC或毛細(xì)管電泳(CE)與MS結(jié)合可以進行蛋白質(zhì)的高敏感度分析(Figeys and Aebersold、Electrophoresis 19885-892、1998；Nguyen et al.J ChromatogrA 70521-45、1995)。LC/MS允許在進入MS前分離肽的LC方法，例如與微孔HPLC連接的恒流FAB(Caprioli et al.1987、如上)。后面的“連接”允許來自復(fù)雜混合物的單個的肽的測序所選的肽被第一次MS斷裂，接著經(jīng)過碰撞室的離子云CID(碰撞誘導(dǎo)解離)。碰撞產(chǎn)生片段的特征性集合，由此可以推斷出序列，而不需要知道其他信息，例如cDNA序列。在單獨的MS實驗中，肽的不分級混合物(例如，來自酶消化)注入并且主要離子的質(zhì)量與通過cDNA序列預(yù)計的那些進行比較。重組人白介素-2的序列通過CNBr的快原子轟擊(FAB)-MS分析和蛋白水解已經(jīng)被驗證(Fukuhara et al.J Biol Chem26010487-10494、1985)。
電噴霧離子化MS(ESI-MS)使用溶解蛋白的氣霧劑在高電壓下置入針中，產(chǎn)生一系列具有多種電荷的相同分子的電荷峰。因為每個產(chǎn)生自不同電荷種類的峰產(chǎn)生分子量的估算，這些估算可以結(jié)合以增加分子量估算的總的精確性?；w輔助激光解吸電離MS(MALDI-MS)使用高濃度發(fā)色團。較高強度激光脈沖可以通過基體吸收并且吸收的能量蒸發(fā)部分基體并且?guī)缀跬耆珜⒌鞍踪|(zhì)樣品帶入氣相。然后分析獲得的離子的MS飛行時間。中度的離子化可以增強該方法提供四級結(jié)構(gòu)信息的能力。MALDI-MS可以在15以內(nèi)輕松地運行。它不需要片段化分子并且當(dāng)SDS-PAGE凝膠光密度掃描時，結(jié)果容易解釋，用于質(zhì)量范圍100kDa以上。
可以通過測定編碼蛋白質(zhì)或其嵌合分子的DNA來確定氨基酸序列。不過，偶爾實際上的蛋白質(zhì)序列可能是不同的。通常，DNA測序反應(yīng)與復(fù)制(DNA變性、復(fù)制)DAN的PCR反應(yīng)相似。通過DNA克隆技術(shù)，可以克隆該基因和確定核苷酸序列。
可以使用一種或多種下述的系統(tǒng)分析蛋白質(zhì)或嵌合分子的氨基酸序列。
對蛋白質(zhì)或其嵌合分子的完整序列的描述通常要求描述該產(chǎn)品。氨基酸測序包括在凝膠上進行胰蛋白酶消化，用RPC-HPLC對消化的肽進行級分，通過MALDI-TOF MS篩選具有最對稱吸收特征的肽峰，用埃德曼降解第一肽(N-末端)。埃德曼化學(xué)地衍生出的一級序列數(shù)據(jù)是在分子水平上確定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法?？梢詫ALDI-TOF MS用于N-末端序列分析。不過，所有的用于HPLC的酶消化和肽測序均推薦先經(jīng)過MS或MS/MS蛋白質(zhì)鑒別以減少耗時和降低成本。在經(jīng)過原位胰蛋白酶消化或在基質(zhì)上的Lysyl內(nèi)肽酶消化來自SDS-PAGE分離的蛋白質(zhì)后，用HPLC進行分離可以獲得內(nèi)部的氨基酸序列。
推薦將標(biāo)準(zhǔn)肽的內(nèi)部測序和被分析樣品一起運行來使儀器維持在最高性能。超過80％的真核生物蛋白被報道有封閉氨基酸末端，妨礙直接氨基酸測序。當(dāng)遇到封閉的真核生物蛋白時，內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)的存在能確保儀器操作正常。
可以通過化學(xué)過程采用埃德曼降解法對N端直接測序，所述方法衍生N末端氨基酸來釋放氨基酸，暴露出下一個氨基酸的氨基末端。埃德曼測序包括1).通過微孔HPLC，通過埃德曼化學(xué)循環(huán)反復(fù)進行N末端序列分析，每個埃德曼化學(xué)循環(huán)能夠鑒定一個氨基酸。2).凝膠內(nèi)或PVDF結(jié)合蛋白消化后用HPLC分離消化生成的多肽，通過埃德曼降解化學(xué)法進行內(nèi)部蛋白序列分析。
使用微孔HPLC和毛細(xì)管HPLC并使用RPC-HPLC方法來分析和純化肽混合物。使用不同的柱子純化凝膠內(nèi)樣品和PVDF樣品。HPLC分段分離后可以采用基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)分析進行N末端分析。選擇標(biāo)準(zhǔn)為1)HPLC餾份的表觀純度。2)肽的質(zhì)量和由此估計的長度。肽質(zhì)量信息對確證埃德曼測序氨基酸指定有用，并且對翻譯或翻譯后修飾的可能的檢測有用。
在凝膠上的(In-gel)消化適合于高靈敏度HPLC系統(tǒng)中的純化。內(nèi)部蛋白序列分析首先通過SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進行酶消化。在SDS-PAGE微凝膠中的蛋白能可靠的只被胰蛋白酶在凝膠內(nèi)消化。用RPC-HPLC純化肽片段，然后用MALDI-TOF MS分析，篩選適合埃德曼測序分析的肽。凝膠內(nèi)蛋白只能用內(nèi)部序列分析法來分析，但是可以獲得非常準(zhǔn)確的肽質(zhì)量，這能提供額外的對氨基酸指定和數(shù)據(jù)庫搜索有用的信息。
PVDF結(jié)合蛋白適于N末端和內(nèi)部埃德曼測序分析。PVDF結(jié)合蛋白被合適的酶消化(胰蛋白酶、內(nèi)蛋白酶Lys-C、內(nèi)蛋白酶Glu-C、梭菌蛋白酶、內(nèi)蛋白酶、Asp-N、嗜熱菌蛋白酶)和非離子型去污劑，例如氫化Triton X-100。在PVDF結(jié)合蛋白中，用于將消化的肽從膜中釋放的去污劑能夠干擾基質(zhì)輔助的激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜分析。在加入酶之前，用二硫蘇糖醇(DTT)還原胱氨酸(Cys)，并用碘乙酰胺烷基化來生成羧基酰胺甲基化胱氨酸，能在N末端測序分析中被確認(rèn)。
為了確定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的氨基酸組成，在氣相中用苯酚催化的強鹽酸(HCl)酸性條件水解樣品。一旦水解完成，用一種熒光基團化合物衍生釋放的氨基酸，使結(jié)合的分子帶上特異的反相特性。反相高性能液相色譜(RP-HPLC)分離衍生氨基酸，并用熒光檢測器檢測。使用外部和內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，通過觀測到的峰面積來計算樣品中每個氨基酸的數(shù)量。這個信息可用于鑒定樣品并對樣品中的蛋白定量。例如，理論的和實際的結(jié)果的偏差可用于最初確定一個脫酰胺作用部位的可能性。和單糖分析相結(jié)合，它可以確定糖基化重量百分比組成和酸性糖蛋白重量百分?jǐn)?shù)。這個方法的局限在于它能提供因環(huán)境污染和氨基酸的偶然破壞而產(chǎn)生內(nèi)在變異的骨架實際序列信息。例如這種方法不可能檢測出序列的點突變。
肽質(zhì)量指紋分析(PMF)是另一種能夠確認(rèn)蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的方法。其過程包括最初用電泳(1維或2維)分離樣品，從凝膠中切取點/帶并用特殊的內(nèi)切蛋白酶(典型的用豬胰蛋白酶)消化。從凝膠碎塊中洗提出肽并用質(zhì)譜分析來確定存在的肽的質(zhì)量。隨后將產(chǎn)生的肽質(zhì)量和所有公布的蛋白質(zhì)的理論質(zhì)量碎片數(shù)據(jù)庫比較(或構(gòu)建的設(shè)計序列的理論肽質(zhì)量)。此技術(shù)依賴于蛋白質(zhì)的“指紋”(即它的肽質(zhì)量組合)是唯一的這個事實?？梢钥煽康蔫b定(超過90％的準(zhǔn)確度)小到4肽和30％的序列覆蓋。在分析的PMF階段可以鑒定修飾，例如脂部分和脫酰胺作用。和鑒定的蛋白質(zhì)不相符的峰通過串聯(lián)質(zhì)譜法(MS-MS)進一步分析，MS-MS技術(shù)使用了碰撞氣體進行碰撞產(chǎn)生的能量來打斷PTM的弱鍵。隨后對新釋放的分子和原先的肽進行質(zhì)量再分析來鑒定翻譯后修飾以及它附著的肽片段。
根據(jù)大小、電荷、疏水性、功能或目標(biāo)生物分子的特定成分將HPLC分為不同的模式。大體上，采用兩種或更多種色譜法來純化一種蛋白質(zhì)。在選擇色譜模式時最重要的是要考慮蛋白質(zhì)和樣品溶劑的特性可以通過表征本發(fā)明的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的特性來評價它們的二級結(jié)構(gòu)。
可以使用下面的一種或多種系統(tǒng)來分析蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的二級結(jié)構(gòu)。
為了研究蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，應(yīng)該采用并比較最常用的幾種分光鏡方法。可以用輻射連續(xù)波形，根據(jù)波的大小和形狀來確定電磁能。不同的分光鏡方法使用不同的電磁能。
波長是放射的單個波的長度(兩個連續(xù)波最大值之間的距離)。當(dāng)放射能增加時，波長變短。頻率和波數(shù)之間的關(guān)系為波數(shù)(cm-1)＝頻率(s-1)/光速(cm/s) 分子對電磁輻射的吸收包括振動和轉(zhuǎn)動躍遷和電子躍遷。用于鑒定二級結(jié)構(gòu)的測定分子振動能的最常用方法是紅外(IR)和拉曼光譜。但是它們的方法和測定分子吸收不同。
散射輻射能量小于斯托克斯譜線入射輻射。散射輻射能量大于反斯托克斯譜線入射輻射。激發(fā)增加或降低的能量和分子的基礎(chǔ)電子狀態(tài)振動能量間隔有關(guān)。因此，斯托克斯和反斯托克斯譜線波數(shù)是分子振動能的直接檢測量度。
在拉曼光譜只觀察到斯托克斯位移(Stokes shift)。斯托克斯譜線的波數(shù)小于(或波長大于)激發(fā)光。可以使用高能量激發(fā)源(例如激光)增強拉曼散射效率。激發(fā)源應(yīng)該是單色的，因為我們對激發(fā)和斯托克斯譜線的能量差異(波數(shù))感興趣。
為了使振動具有紅外活性(IR active)，分子的偶極矩必須發(fā)生變化。因此，碳酸酐的對稱伸展是不具有紅外活性的，因為偶極矩沒有發(fā)生變化。非對稱性伸展有紅外活性的原因是偶極矩發(fā)生了變化。為了使振動有拉曼活性(Raman active)，分子的偏振性必須發(fā)生振動改變。碳酸酐的對稱性伸展是有拉曼活性的，因為分子的偏振性發(fā)生了改變。因此，拉曼光譜補充了紅外光譜(Herzberg et al.Infrared andRaman Spectra of Polyatomic Molecules、Van Nostrand Reinhold、New York、NY、1945)。例如，因為缺乏偶極矩運動，紅外不能檢測同核二原子分子，但是拉曼光譜能夠檢測，因為鍵伸展和收縮使分子的偏振性發(fā)生了改變，此外電子和核之間的相互作用也發(fā)生了改變。
對于帶有翻轉(zhuǎn)中心的高度對稱的多原子分子(例如苯)，有可能在紅外光譜中有譜帶活性而在拉曼光譜中沒有譜帶活性，反之亦然。在對稱性低或非對稱分子中，有可能在紅外和拉曼光譜中都有活性。
紅外光譜檢測波長和樣品紅外線吸收強度。紅外線能量能使分子振動激發(fā)到更高能量水平。紅外和拉曼光譜都檢測鍵長和鍵角的振動。
紅外通過檢測對應(yīng)于分子從v＝0到v＝1(或更高)狀態(tài)的振動激發(fā)的特定能量的光吸收來表征分子振動。有一些決定紅外光譜檢測分子的能力的選擇規(guī)則，紅外線不能激發(fā)所有正常模式的振動(Herzberget al.1945、如上)。
紅外光譜能提供蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的定性和定量信息，例如α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角和不規(guī)則結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)分析中的最有用的紅外譜帶是酰胺I(1620-1700cm-1)、酰胺II(1520-1580cm-1)和酰胺III(1220-1350cm-1)。酰胺I是蛋白質(zhì)的最強吸收帶。它包含C＝O(70-85％)和C-N基團(10-20％)的伸縮振動。確切的譜帶位置由骨架構(gòu)象和氫鍵模式?jīng)Q定。酰胺II比酰胺I復(fù)雜。酰胺II由平面內(nèi)N-H彎曲(40-60％)、C-N(18-40％)和C-C(10％)伸縮振動決定。酰胺III帶用處不大(Krimm andBandekar、Adv Protein Chem 38181-364、1986)。大多數(shù)FTIR酰胺I帶B折疊結(jié)構(gòu)通常位于1629cm-1左右，最小1615cm-1，最大1637cm-1，次要部分可能在1696cm-1附近(最低1685cm-1)顯示峰，α螺旋主要在1652cm-1。1680cm-1附近是β轉(zhuǎn)角。
拉曼散射的原理與紅外吸收不同。拉曼光譜檢測分子的非彈性散射光的波長和強度。拉曼散射，分子振動能量使入射光波長發(fā)生改變，產(chǎn)生拉曼散射光。
為了有拉曼活性，振動為非彈性散射，其關(guān)鍵是在振動中偏振性發(fā)生改變。在對稱伸展中，在最小和最大核間距之間電子結(jié)合強度是不同的。因此，振動中偏振性發(fā)生變化，并且這種振動模式散射拉曼光，此振動是有拉曼活性的。在非對稱伸展中，伸展的鍵中的電子更容易偏振，壓縮的鍵中的電子更難偏振。偏振性總體上沒有改變，非對稱伸展是沒有拉曼活性的(Herzberg et al.1945，如上)。
圓二色性能被用于檢測任何非對稱結(jié)構(gòu)，例如蛋白質(zhì)。旋光發(fā)色團吸收不同量的右旋和左旋光，這種不同的吸收導(dǎo)致陽性和陰性吸收光譜(通常，從左旋偏振光譜中減去右偏振光譜)。通常，遠(yuǎn)紫外或酰胺區(qū)域(190-250nm)主要由肽鍵貢獻，提供酰胺鍵羰基環(huán)境的信息，因此提供蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的信息，α螺旋通常在208、222nm處顯示兩個負(fù)峰(Holzwarth et al J Am Chem Soc 178350，1965)，β折疊在196nm顯示一個負(fù)峰，無規(guī)則卷曲在218nm顯示一個負(fù)峰。近紫外區(qū)域(250-350nm)的峰由芳香發(fā)色團(Phe、Tyr、Trp)的環(huán)境貢獻。二硫鍵使250nm附近的最小CD帶增大。
圓二色性通常伴隨側(cè)鏈結(jié)構(gòu)緊緊的高度折疊的三維結(jié)構(gòu)。大多數(shù)蛋白質(zhì)變性釋放空間位阻，變性程度增大，圓二色譜減弱。例如，hGH的側(cè)鏈圓二色譜對加入變性劑引起的部分變性非常敏感。一些可逆的分子化學(xué)變化，例如二硫鍵還原或堿滴定將改變側(cè)鏈圓二色譜。對于hGH，完全去除生色團或者影響特定的生色團的圓二響應(yīng)的變化都可以引起這些譜差，但是變性或構(gòu)象改變不引起譜差(Aloj et al.J BiolChem 2471146-1151，1971)。
紫外吸收光譜是檢測蛋白特性的最有效的方法之一。它能提供蛋白質(zhì)濃度和發(fā)色團直接環(huán)境的信息。蛋白質(zhì)功能團，例如氨基、醇(或酚)羥基、羰基、羧基或硫氫基能被轉(zhuǎn)換為強發(fā)色團。可見和近紫外光譜被用于監(jiān)測兩種類型的生色團金屬蛋白質(zhì)(大于400nm)和含有Phe、Trp、Tyr殘基的蛋白質(zhì)(260-280nm)。紫外或熒光信號的改變可以是陰性的或陽性的，有賴于蛋白質(zhì)序列和溶液特性。
熒光檢測分子被輻射到激發(fā)狀態(tài)后發(fā)射的能量。許多蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸在250 to 300nm內(nèi)被激發(fā)，發(fā)射300到400nm范圍內(nèi)的熒光。只有帶有Phe、Trp、Tyr殘基的蛋白質(zhì)能被檢測，強度順序為Trp》Tyr》Phe。熒光光譜能反映受蛋白質(zhì)折疊影響的微環(huán)境信息。例如，埋入的Trp通常處于疏水環(huán)境，在325到330nm范圍內(nèi)發(fā)射熒光，但是暴露的殘基或自由氨基酸在350到355nm處發(fā)射熒光。一種探測蛋白質(zhì)伸展的常用試劑是Bis-ANS。Bis-ANS的熒光是pH依賴型的。雖然它在水中的信號弱，但是它能通過結(jié)合到蛋白質(zhì)中伸展的暴露的疏水位點來增加信號(James and Bottomley Arch BiochemBiophy 356296-300，1998)。
折疊蛋白質(zhì)中Tyr和Trp的有效淬滅造成蛋白質(zhì)伸展后信號的顯著增加。一種簡單的溶質(zhì)也可以引起這種變化。為了使檢測靈敏度最大化，可以使用信號率。例如，在研究rFXIII伸展中，使用350nm和330nm熒光強度的比率(Kurochkin et al.J Mol Biol248414-430，1995)。可以通過熒光供體和吸收受體之間激發(fā)能量轉(zhuǎn)換的方法研究構(gòu)象改變，因為轉(zhuǎn)換效率依賴這兩種生色團之間的距離(Honroe et al.Biochem J 258199-204，1989)。用熒光來探查抗胰蛋白酶構(gòu)象(K won and Yu、Biophim Biophys Acta1335265-272，1997)，來確定HAS的Tm(Farruggia et al.Int J BiolMacromol 2043-51，1997)，并檢測MerP伸展相互作用(Aronsson etal.FEBS Lett.411359-364，1997)。
在中性pH下，熒光發(fā)射光譜強度順序為Trp＞Tyr。在酸性pH下，因為構(gòu)象改變破壞了能力轉(zhuǎn)換，Tyr的熒光強于Trp。熒光實驗還確證了胍引起的蛋白質(zhì)伸展轉(zhuǎn)變中的中間體。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的理化形式的三級和四級結(jié)構(gòu)對查明其功能也是重要的。
可以采用一種或多種下述系統(tǒng)來測定蛋白質(zhì)或它們的嵌合分子的三級和四級結(jié)構(gòu)。
NMR和X射線衍射晶體分析是研究蛋白質(zhì)3D結(jié)構(gòu)的最常用技術(shù)。其它簡述的探查蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的方法包括近紫外區(qū)域的CD、紫外光譜二級衍生(Ackland et al.J Chromatogr 540187-198，1991)和熒光。
NMR是結(jié)構(gòu)生物學(xué)中研究分子結(jié)構(gòu)和分子間相互作用的主要的方法之一。除了研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以外，NMR還能用于研究本發(fā)明中的蛋白質(zhì)或嵌合分子中的碳水化合物結(jié)構(gòu)。化學(xué)家通常使用簡單的一維NMR譜技術(shù)研究化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)?？梢允褂枚S技術(shù)測定更復(fù)雜分子的結(jié)構(gòu)。時域NMR被用于探查溶液中分子動力學(xué)。固態(tài)NMR被用于測定固態(tài)分子結(jié)構(gòu)。NMR能被用于研究蛋白質(zhì)、核苷酸和多種生物、藥理學(xué)和醫(yī)學(xué)相關(guān)的低分子量化合物的結(jié)構(gòu)和動力學(xué)特性。但是，不是所有的核都具有能被NMR讀取的適當(dāng)?shù)奶匦?，例如不是所有的核都具有自旋，自旋是NMR所需要的。自旋引起核產(chǎn)生NMR信號，發(fā)揮小磁場的功能。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它們的嵌合分子的結(jié)晶結(jié)構(gòu)。
X射線衍射晶體分析是一種實驗技術(shù)，X射線能被晶體衍射，具有合適波長(在埃范圍里，～10-8cm)的X射線被相當(dāng)大小的原子的電子云所衍射。根據(jù)晶體中周期組合的分子或原子X射線衍射的衍射模式，電子密度能被重構(gòu)?？梢詮难苌鋽?shù)據(jù)或補衍射實驗中得到附加相位信息，來完成重構(gòu)。隨后逐步建立實驗電子密度模型，根據(jù)數(shù)據(jù)優(yōu)化，結(jié)果得到非常準(zhǔn)確的分子結(jié)構(gòu)。
X射線衍射晶體分析已經(jīng)發(fā)展為用任何射線研究所有狀態(tài)的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，例如離子、電子、超熱中子和質(zhì)子，波長和待測原子或分子結(jié)構(gòu)間的距離相似。
光散射光譜基于這樣一個簡單的原則，大粒子比小粒子散射的光多。在310-400nm區(qū)域，基于大粒子散射光是一個傾斜的基線，例如溶液中聚集體Schmid et al.Protein structure，a practicalapproach，Creighton Ed.，IRI Press，Oxford，England，1989)。
光散射光譜能被用于評估蛋白質(zhì)分子量，它是一種監(jiān)測蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)或蛋白質(zhì)聚集體的簡單工具。蛋白質(zhì)聚集程度可以用簡單的濁度檢測表征。最終產(chǎn)生的溶液制劑進行透明度檢查，因為大多數(shù)聚集蛋白呈現(xiàn)云霧狀和乳色。準(zhǔn)彈性光散射光譜(QELSS)，有時被稱為光子相關(guān)光譜(PCS)或動態(tài)光散射(DLS)，是一種大分子(蛋白質(zhì)、多糖、合成聚合物、膠團、膠體顆粒和聚集體)復(fù)雜液體擴散的非侵入式探查技術(shù)。在多數(shù)事例中，光散射光譜直接產(chǎn)生散射類相互擴散系數(shù)。當(dāng)應(yīng)用到稀釋的單分散溶液時，QELSS得到的擴散系數(shù)能估計大小。在多分散系中，它估計分子量分布的寬度。對于精確測定，使用200-500mW激光能量，廣泛采用常規(guī)的Ar+/Kr+氣體激光器(Phillies Anal Chem621049A-1057A，1990)。用人類恥骨松弛激素檢測了蛋白質(zhì)聚集體(Liet al.Biochemistry 345162-5772，1995)。
蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的穩(wěn)定性也是功能的一個重要決定因素。此特性的分析方法包括DSC、TGA和冷凍干燥低溫顯微鏡，分析冷凍-融化抗性和蛋白酶抗性。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子凍干(冷凍干燥)后能更穩(wěn)定。凍干被用于增加產(chǎn)品的穩(wěn)定性和/或貯存期限，因為產(chǎn)品以粉末形式儲存，而不是液體形式。其過程包括開始冷凍樣品，隨后在真空下通過脫水去除液體。最終結(jié)果是一種干燥的蛋白質(zhì)及輔料(使用的其它物質(zhì)成分)的“餅狀物”。最終得到的餅狀物的一致性對成功重建是關(guān)鍵的。凍干過程能導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生改變，尤其是通過交聯(lián)的聚集形式，還有脫酰胺作用和其它修飾。這些能丟失、降低活性或誘導(dǎo)針對聚集體的免疫反應(yīng)，從而降低功效。為了檢測凍干穩(wěn)定性，使用穩(wěn)定劑(例如甘露醇、海藻糖、吐溫80、人血清白蛋白等)將蛋白質(zhì)按配方凍干。如果蛋白質(zhì)的活性能通過合適的生物檢測法測定，凍干后用ELISA檢測恢復(fù)的蛋白質(zhì)的量。能用HPLC或蛋白印跡分析檢測蛋白質(zhì)聚集體。
在凍干之前，應(yīng)該確定成分的Tg或Te(定義Tg或Te)，來設(shè)置首次干燥中產(chǎn)品的最大容許溫度。同樣，成分的結(jié)晶度或無定形度信息有助于更合理的設(shè)計凍干循環(huán)。能使用差示掃描熱量法(DSC)、熱重量分析(TGA)或凍干低溫顯微鏡獲得這些熱學(xué)參數(shù)產(chǎn)品信息差示掃描熱量法(DSC)是一種物理熱分析方法，檢測、表征和分析材料的熱學(xué)特性并確定熱容、融化熱函和相應(yīng)的轉(zhuǎn)變點。DSC以線性比率掃描一個溫度范圍。根據(jù)“功率補償零點平衡”原理，儀器內(nèi)的個別的熱源分別為樣品和參考盤提供熱量。在物理轉(zhuǎn)換過程中，能量吸收或發(fā)出引起提供給樣品儲存器的能量數(shù)量的不平衡。依賴樣品不同的熱學(xué)行為，能量將從樣品中被取走或擴散，溫度差異將被檢出為傳給計算機電信號。結(jié)果，加熱器的自動調(diào)整使樣品儲存器的溫度和參照儲存器相等。補償需要的電能和測熱效果相等。
能根據(jù)形狀和DSC融化吸熱的溫度用DSC估計有機物的純度。在相同條件下，和熱流DSC相比功率補償DSC提供非常高的分辨率。功率補償DSC產(chǎn)生確定性和準(zhǔn)確性更好的融化局部區(qū)域，因為融化局部區(qū)域不象次解析率熱流DSC那樣在一個窄溫度間隔中模糊。功率補償DSC本身就能產(chǎn)生更好的局部融化區(qū)域，因此能進行更好的純度分析。借助StepScan DSC的幫助，使用傳統(tǒng)的和時間證明的方法，功率補償DSC能提供直接的熱容檢測，不需要重疊合法或提取正弦波振幅。
熱重量分析(TGA)檢測樣品質(zhì)量損失和重量損失率，作為溫度或時間的函數(shù)。
在DSC中，凍干低溫器能快速達到一個寬溫度范圍。目前，作為前規(guī)劃的和規(guī)劃的實驗工具，在凍干低溫器中模擬凍干循環(huán)提供了最好的小規(guī)模研究蛋白質(zhì)組分熱學(xué)參數(shù)的平臺。凍干顯微鏡能預(yù)測冷凍和干燥中組分和過程因素的影響。低溫實驗只需要2-3mL樣品，使此技術(shù)成為一個有價值的研究稀有的、難以獲得的藥物的工具。它是研究凍干循環(huán)中的冷凍效果、比率、干燥率、融化率的一種良好的工具。凍干低溫顯微鏡實驗可有助于退火研究。因為凍干技術(shù)的廣泛應(yīng)用，以及對極其昂貴的藥物(例如蛋白質(zhì)和基因治療藥物)穩(wěn)定化的大量需求，希望制藥工業(yè)在不久以后將實現(xiàn)過程中的顯微監(jiān)測。
能使用下述系統(tǒng)中的一種或多種來測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的冷凍融化抗性。
翻譯中或翻譯后修飾，例如糖基化，可以保護蛋白質(zhì)經(jīng)受反復(fù)凍/融循環(huán)。為了檢測它，可以比較蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子和大腸桿菌產(chǎn)生的無載體相似物。蛋白質(zhì)或它的嵌合分子被稀釋到合適的介質(zhì)中(例如細(xì)胞生長培養(yǎng)基，PBS或類似其它物質(zhì))，隨后用多種方法冷凍，例如在液氮中立刻冷凍、放置于-70℃緩慢冷凍或在干冰中快速冷凍。雖然在室溫下快速融化或在4℃緩慢融化樣品。隨后將一些樣品再次冷凍，此過程重復(fù)一些循環(huán)。用ELISA檢測存在的蛋白質(zhì)量，有經(jīng)驗的工作人員選擇合適的生物檢測方法測定活性。活性/殘存蛋白質(zhì)的值和初始材料相比，來確定許多冷凍/融化循環(huán)后的抗性。
蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子在溶液中可以改變熱學(xué)穩(wěn)定性。在體外可以按如下測定本發(fā)明的熱學(xué)穩(wěn)定性。
蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子能混合到緩沖液中，例如含有載體蛋白(例如人血清白蛋白)磷酸鹽緩沖液，并在特定溫度下保溫特定的時間(例如37℃，7天)。能用ELISA測定處理后蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的殘存數(shù)量，并和儲存于-70℃的材料想比較。相關(guān)領(lǐng)域有經(jīng)驗的人員進行合適的生物檢測測定殘存的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的生物活性。
能使用一種或幾種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的蛋白酶抗性。
為了比較蛋白酶抗性，含有蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子的溶液和含有大腸桿菌表達的相似物的溶液能和選擇的蛋白酶孵育(例如未純化的血清蛋白酶、純化的蛋白酶、重組蛋白酶)不同的時間段。采用合適的ELISA(例如捕獲和檢測抗體的識別表位被蛋白酶切割位點分割)測定殘存的蛋白量，采用有經(jīng)驗的人員選擇的合適的生物檢測方法測定殘存蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的活性。
可以使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的生物利用度。
生物利用度是給藥后一種藥物或其它物質(zhì)被目標(biāo)組織可利用的程度。生物利用度依賴于藥物的半衰期或它到達目標(biāo)組織的能力。
含有蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子的混合物采用皮下或肌肉內(nèi)注射。蛋隨后用ELISA或放射性計數(shù)測定血液中蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的水平?；蛘撸糜薪?jīng)驗的人員選擇的合適的生物檢測方法檢測血液樣品中的蛋白質(zhì)活性，例如，刺激特定的靶細(xì)胞群體的增殖。因為樣品來自于血漿或血清，因此可能有其它一些分子對檢測出的活性有影響。這可以通過使用待測蛋白質(zhì)的中和抗體來控制。因此，任何殘存的生物活性都是其它血清成分引起的。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的穩(wěn)定性或半衰期。
蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子在血清和血漿中可能具有變化的半衰期。在體外可以按如下測定本發(fā)明的半衰期。含有蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子的混合物能混合到人血清/血漿中并在特定溫度下孵育特定時間(例如37℃，4小時，12小時等)。能用ELISA測定處理后殘存的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的量。采用相關(guān)領(lǐng)域有經(jīng)驗的人員選擇的合適的生物檢測方法測定殘存蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的生物活性。選擇的血清可以來自于不同的人血液組(例如A、B、AB、O等)。
也可以在體內(nèi)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的半衰期。含有蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子的混合物，可以用放射性示蹤劑或其它方法標(biāo)記，能被靜脈內(nèi)、皮下、后眼窩、尾部靜脈、肌肉內(nèi)或腹膜內(nèi)注射到實驗選擇的物種中，例如小鼠、大鼠、豬、靈長類動物、人。注射后不同時間點取得血液樣品，分析存在的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子(用ELISA或用TCA沉淀放射性計數(shù))。用含有大腸桿菌或CHO生產(chǎn)的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的混合物作為對比的對照。
為了確定蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子的半衰期，在體內(nèi)，可以對雄性Wag/Rij大鼠或其它合適的動物靜脈內(nèi)注射一種蛋白質(zhì)或它的嵌合分子。
在給予物質(zhì)之前，取樣200μl EDTA血液作為陰性對照。在注射后不同時間點，采用相同技術(shù)從動物中取樣200μl EDTA血液。在最后一次血液取樣后，殺死動物。在收集后30分鐘內(nèi)樣品在室溫下離心15分鐘。用特殊的ELISA測定每個血漿樣品中蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子的濃度。
蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子可以穿過血腦屏障。
可以采用下述測定法體外檢測蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子是否結(jié)合人腦上皮細(xì)胞。
能檢測放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子結(jié)合人腦毛細(xì)管上皮細(xì)胞的能力。采用本領(lǐng)域已知的方法將分離的蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子人工結(jié)合上放射性標(biāo)記，實現(xiàn)一定的比放射性，例如氯胺-T方法標(biāo)記125I或3H。
人腦上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)能在平底96孔板中生長，長滿后5天用丙酮輕輕固定。細(xì)胞被溶解，轉(zhuǎn)移到玻璃纖維膜上。能用液體閃爍計數(shù)器檢測放射性標(biāo)記蛋白或本發(fā)明的嵌合分子。
能采用下述測定法在體內(nèi)檢測蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子結(jié)合人腦上皮細(xì)胞。
使用新鮮冷凍的(沒有經(jīng)過固定)、在恒冷切片機中切片的、放置于玻璃片上并用丙酮固定的人腦組織切片檢測人特異性蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子和人腦毛細(xì)血管的結(jié)合。使用定量放射自顯影檢測腦切片中3H-蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子的結(jié)合。
可以在靈長類系統(tǒng)中在體內(nèi)檢測人特異性蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子的組織分布和血液清除率。
在兩只雄性短尾猴或其它合適的靈長類動物中，一個蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子被用于確定14C-標(biāo)記的蛋白或本發(fā)明的嵌合分子的組織分布和血液清除，蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子和3H標(biāo)記的對照蛋白質(zhì)被同時給予帶有靜脈內(nèi)導(dǎo)管的動物。在實驗過程中，收集血液樣品來測定蛋白質(zhì)從循環(huán)中的清除。在注射后24小時，殺死動物并選擇器官，收集代表性的組織來測定同位素的分布和自然清除。此外，根據(jù)Triguero等人(J of Neurochemistry 541882-1888，1990)的方法對來自腦不同區(qū)域的樣品進行毛細(xì)管減少實驗。此方法從腦組織勻漿中去除了超過90％的血管系統(tǒng)(Triguero等，上面引用)。
放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子從毛細(xì)管部分到實質(zhì)部分的時間依賴型再分布和蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子的時間依賴型遷移通過血腦屏障相一致。
蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子可以促進或抑制血管生成。
可以使用本領(lǐng)域已知的方法測定蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子的血管生成的潛在作用。例如，可以在血管生成模型中通過微血管萌發(fā)測定血管生成程度。在這個檢測中，按Shepherd等人(ArteriosclerThromb Vase Biol 24898-904，2004)的方法分離大鼠脂肪微血管片段(RFMFs)，從處死的動物中收集附睪脂肪墊，切碎并用膠原酶消化。在通過離心的方法從脂肪和脂肪細(xì)胞中分離出RFMFs和單獨細(xì)胞，并懸浮于0.1％BSA PBS中。連續(xù)過濾RFMF懸液來去除片段中的組織碎片、單細(xì)胞和紅細(xì)胞。以15,000RFMF/ml在冷的、pH中性的大鼠尾I型膠原中懸浮RFMFs，并鋪在48孔板中的孔中(例如0.25ml/孔)進行培養(yǎng)。在膠原聚合后，每個膠中加入相等體積的含10％FBS的DMEM。在形成凝膠后，血管生成的血管延長特性在培養(yǎng)第4天逐步出現(xiàn)。因為缺乏粗糙性、平滑肌伴隨形態(tài)，很容易區(qū)分這些新生成血管和母體血管片段。能用蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子處理RFMF 3-D培養(yǎng)物，培養(yǎng)第5和6天測定新生成血管長度。
還可以用Guedez等人(Am J Pathol 1621431-1439，2003)描述的體內(nèi)血管生成檢測法測定蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子的血管生成潛在作用。這個檢測方法包括在裸鼠中皮下移植半閉合(semiclosed)硅酮圓柱體(血管反應(yīng)器，angioreactor)。血管反應(yīng)器中填充了預(yù)混合或未預(yù)混合蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子的細(xì)胞外基質(zhì)。在恢復(fù)前靜脈注射異硫氰酸熒光素(FITC)-葡聚糖來定量血管反應(yīng)器中的血管化作用，隨后進行熒光分光光度檢測。對血管反應(yīng)器進行熒光分光光度檢測能顯示不同發(fā)育階段的細(xì)胞和侵入的新生血管。
蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子可以具有不同的可用免疫測定技術(shù)測定的免疫反應(yīng)性特征，包括和一個或多個直接針對分子的抗體的相互作用。免疫測定技術(shù)的例子包括酶交聯(lián)免疫吸附檢測(ELISA)、斑點印跡和免疫層析檢測，例如傾動試驗或試驗紙檢驗。
可以使用免疫測定過程測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的水平，例如，一種商業(yè)銷售的ELISA試劑盒。因為免疫試劑盒中提供的抗體的特異性，蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子可以對非人細(xì)胞表達的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子具有不同的免疫反應(yīng)性特征。例如，免疫測定法的捕獲和/或檢測抗體可以是特異性的直接針對非人細(xì)胞表達的人蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的抗體。
此外，非人細(xì)胞表達的人蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的不正確的折疊會導(dǎo)致在正確折疊的人細(xì)胞表達的人蛋白質(zhì)或它的嵌合分子中不暴露的抗原表位暴露。非正確折疊可以通過，例如，在非人細(xì)胞胞漿中過度產(chǎn)生異性蛋白來產(chǎn)生，例如，大腸桿菌(Baneyx Current Opinion inBiotechnology，70411-421，1999)。進一步，非人細(xì)胞表達的人蛋白質(zhì)或它的嵌合分子可以具有不同的蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子翻譯后修飾形式。例如，非人細(xì)胞表達的人蛋白質(zhì)或它的嵌合分子可以具有異常的數(shù)量和/或類型的糖結(jié)構(gòu)、磷酸根、硫酸根、脂或其它殘基。這可能導(dǎo)致在蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子中不暴露的抗原表位的暴露。相反的，翻譯后修飾模式的改變可能導(dǎo)致缺乏蛋白質(zhì)或本發(fā)明的嵌合分子中的抗原表位，所述抗原表位在非人細(xì)胞中表達的人蛋白質(zhì)或它的嵌合分子中暴露。
任何一個或組合的上述因素可能導(dǎo)致如下面的非正確的檢測 (a)在實驗室樣品或人組織中天然產(chǎn)生的人蛋白質(zhì)，或 (b)在實驗室樣品、人組織或在人胚胎干細(xì)胞(hES)培養(yǎng)基中人細(xì)胞表達的重組人蛋白質(zhì)或它的嵌合分子使用合適的免疫測定法測定的人細(xì)胞表達的人蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的免疫反應(yīng)性特征可以提供人體中蛋白質(zhì)的免疫原性的表征，如下文所述。
多數(shù)生物產(chǎn)品引起某一水平的針對它們的抗體應(yīng)答。在某些情況下抗體應(yīng)答能導(dǎo)致可能的嚴(yán)重副作用和/或損失效果。例如，一些接受非人細(xì)胞表達的重組蛋白或它的嵌合分子治療的患者可能產(chǎn)生中和抗體，尤其是在長期治療使用中，并因此減弱蛋白質(zhì)的效果和/或促成副作用。人細(xì)胞表達的人蛋白質(zhì)或嵌合分子不太可能產(chǎn)生中和抗體，因此和非人細(xì)胞表達的人蛋白質(zhì)或它的嵌合分子相比增強了療效。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的免疫原性。
多數(shù)生物產(chǎn)品引起某一水平的針對它們的抗體應(yīng)答。在某些情況下抗體應(yīng)答能導(dǎo)致可能的嚴(yán)重副作用和/或損失效果。例如，一些接受重組EPO治療的患者可能產(chǎn)生中和抗體，并和患者自身的EPO交叉反應(yīng)。在這個例子中，他們會發(fā)生單純紅細(xì)胞再生障礙，并對EPO治療產(chǎn)生抗性，導(dǎo)致需要經(jīng)常的透析。
免疫原性是在有機體中能引起免疫應(yīng)答的能力。免疫原性部分依賴于所述物質(zhì)的大小，并且部分依賴于它和宿主分子的不相似程度。因為具有新的生理化學(xué)特性，蛋白質(zhì)或它的嵌合分子可能具有改變的免疫原性。例如，蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的糖基化結(jié)構(gòu)可能屏蔽或減弱抗體對抗原表位的識別，因此防止或減弱抗體結(jié)合到蛋白質(zhì)或它的嵌合分子上?；蛘?，一些抗體可以識別在非糖基化蛋白質(zhì)中不存在的糖肽表位。
可以通過不同的免疫測定方法確定病人樣本識別具有特征性的生理化學(xué)形式的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的能力，如此處所述。設(shè)計適當(dāng)?shù)拿庖邷y定方法包括考慮直接的合適的檢測、定量和表征抗體應(yīng)答。一些對免疫測定設(shè)計和優(yōu)化的建議被列于Mire-Sluis等人的JImmunol Methods 289(1-2)1-16，2004中，引入本文作為參考文獻。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定在治療性移植中使用的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子。
本發(fā)明擴展使用蛋白質(zhì)或它的嵌合分子來操作干細(xì)胞。一個主要的干細(xì)胞治療性應(yīng)用是組織、軟骨或骨頭再生。在一個實施例中，在生物相容的3維基質(zhì)中的細(xì)胞有可能被引入到人體中。移植將包括細(xì)胞混合物、骨架、生長因子和必須的成分，例如生物可降解聚合物、蛋白聚糖等。打算在構(gòu)建過程中向這些基質(zhì)中摻入蛋白質(zhì)或它的嵌合分子來調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為。這種移植可以被用于骨頭形成、神經(jīng)從祖細(xì)胞生長和其它應(yīng)用。人細(xì)胞衍生的蛋白質(zhì)可以減少干細(xì)胞培養(yǎng)條件下的異基因蛋白質(zhì)的數(shù)量和/或品種，并因此降低了非人病原體感染的風(fēng)險。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子可以和用于形成移植物的基質(zhì)發(fā)生不同的相互作用，并調(diào)節(jié)的細(xì)胞摻入移植物中。預(yù)計聯(lián)合使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子和移植物成分將導(dǎo)致一種或多種下述藥理學(xué)性狀，例如高增殖、促進分化、希望的分化狀態(tài)的維持、更強的分化譜系特異性、增加基質(zhì)成分的分泌、形成更好的三維結(jié)構(gòu)、增強信號、更好的結(jié)構(gòu)性能、降低毒性、減少副作用、減少炎癥、減少免疫細(xì)胞浸潤、減少注射、移植物持續(xù)時間更長、移植物功能更長久、對移植物周圍細(xì)胞更好的刺激、更好的組織再生、更好的器官功能、更好的組織重塑。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對不同基因表達的效果。
能分析暴露于蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的細(xì)胞的基因表達差異。
微陣列技術(shù)能同時測定一個有機體基因組中幾乎所有的基因的mRNA表達。此方法使用基因“芯片”，對應(yīng)不同基因序列的寡核苷酸附著在“芯片”中的固體載體上。利用從感興趣的細(xì)胞或組織中提取的mRNA得到的標(biāo)記的cDNA和芯片孵育，讓cDNA和附著的互補序列雜交。還需要使用對照，在隨后進行雜交和清洗后比較兩者的信號。使用專門的軟件來測定哪些基因上調(diào)或下調(diào)或哪些表達未改變。每個芯片可以分析數(shù)千基因。例如使用Affymetrix技術(shù)，人基因組U133(HG-U133)集合，包括兩個GeneChip(注冊商標(biāo))陣列，含有大約45000個探針集合，代表了從大約33000個被良好證實的人類基因中提取的39000多個轉(zhuǎn)錄子。GeneChip(注冊商標(biāo))小鼠基因組4302.0在單張陣列中含有39000多個轉(zhuǎn)錄子。
這種類型的分析揭示了總體mRNA表達模式的變化，因此可以發(fā)現(xiàn)未知的被特定刺激物調(diào)控的基因的表達變化。因此此技術(shù)適合于分析和本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子相關(guān)的誘導(dǎo)的基因表達。
確定受特定刺激物調(diào)控的已知的和新基因?qū)⒂兄诖_認(rèn)在特定的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子生物活性中重要的生物化學(xué)通路。這些信息將對確定新型治療靶點有用。
該系統(tǒng)還能用于觀察和可購買的產(chǎn)品相比本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子誘導(dǎo)的基因表達變化。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的結(jié)合能力效果。
可以研究本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子和不同物質(zhì)的結(jié)合能力，所述物質(zhì)包括細(xì)胞外基質(zhì)、人造材料、硫酸肝素、載體或輔因子。
可以使用下述測定法確定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子中的特定蛋白質(zhì)結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)的效果。
在合適的緩沖液中表面包被細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，包括但不限于膠原、玻璃體結(jié)合蛋白、纖維結(jié)合蛋白、層粘連蛋白。未結(jié)合位點可以用本領(lǐng)域已知的方法包被，例如，和BSA溶液孵育。清洗表面，例如，用PBS溶液，隨后在表面加入含有待檢測蛋白(例如本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子)的溶液。包被后，清洗表面并和識別蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的抗體孵育。隨后檢測結(jié)合的抗體，例如，使用一種識別一抗的酶聯(lián)二抗。通過和合適的物質(zhì)孵育并觀察顏色變化反應(yīng)將結(jié)合的抗體可視化。和未糖基化的蛋白質(zhì)相比，糖基化蛋白能更強的粘附到細(xì)胞外基質(zhì)蛋白上。
或者，將相等數(shù)量的(用ELISA濃度或生物測定活性單位指定)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子，或用非人細(xì)胞表達的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子相似物，和基質(zhì)包被的小孔一起孵育，隨后清洗小孔，用ELISA檢測結(jié)合數(shù)量?？梢酝ㄟ^樣品和包被表面孵育后ELISA反應(yīng)性的下降間接測定結(jié)合數(shù)量。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子結(jié)合人造材料的能力。
為了測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子結(jié)合人造材料的能力，表面在合適的緩沖液中包被人造材料，包括但不限于金屬、支架。清洗表面，例如，用用PBS溶液，隨后在表面加入含有待檢測蛋白(例如本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子)的溶液。包被后，清洗表面并和識別蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的抗體孵育。隨后檢測結(jié)合的抗體，例如，使用一種識別一抗的酶聯(lián)二抗。通過和合適的物質(zhì)孵育并觀察顏色變化反應(yīng)將結(jié)合的抗體可視化。
或者，將相等數(shù)量的(用ELISA濃度或生物測定活性單位指定)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子，和用非人細(xì)胞表達的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子相似物，和人造材料包被的小孔一起孵育，隨后清洗小孔，用ELISA檢測結(jié)合數(shù)量?？梢酝ㄟ^樣品和包被表面孵育后ELISA反應(yīng)性的下降間接測定結(jié)合數(shù)量。
結(jié)合人造表面的能力可能具有生物學(xué)效果，例如在支架包被中。或者，包被有一種本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的支架被用于種植細(xì)胞。隨后監(jiān)測細(xì)胞的生長和分化，并和未包被的或包被不同的支架相比較。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子結(jié)合硫酸肝素的能力。
由于本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的理化形式，預(yù)計它們和硫酸肝素有不同的相互作用。預(yù)計這些差別在細(xì)胞增殖、分化、遷移等實驗?zāi)Ｐ椭惺敲黠@的。在指定治療中聯(lián)合使用蛋白質(zhì)或它的嵌合分子和硫酸肝素預(yù)計有特征性的藥理學(xué)性狀。可能是血清半衰期延長、生物利用度增加、減少免疫相關(guān)清除、更強的效果、減小劑量降低副作用和相關(guān)的優(yōu)點。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子結(jié)合載體或輔因子的能力。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)或它的嵌合分子存在于血漿中時，它們將結(jié)合其它分子。這些分子可以被命名為“載體”或“輔因子”，并將影響這些因子的生物利用度或血清半衰期。
和純化的血漿蛋白質(zhì)孵育并用分子排阻色譜分析所得溶液能測定本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子和它們的結(jié)合配體的相互作用。如果蛋白質(zhì)或它的嵌合分子結(jié)合一種輔因子，得到的復(fù)合物將具有更大的分子量，導(dǎo)致洗脫時間改變。能比較復(fù)合物的生物活性、體外或體內(nèi)半衰期和生物利用度。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對生物測定的效果。
可以進行多種生物測定法檢測本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的活性，包括測定細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞大小、細(xì)胞因子/細(xì)胞因子受體粘附、細(xì)胞粘附、細(xì)胞散布、細(xì)胞運動、遷移和浸潤、趨化性、配體受體結(jié)合、受體激活、信號傳導(dǎo)和同工型比率變化。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對細(xì)胞增殖的效果。
細(xì)胞，在具體的實施方案中，指數(shù)生長的細(xì)胞，在含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的生長培養(yǎng)基中孵育。這可以在細(xì)頸瓶或96孔板中進行。細(xì)胞生長一段時間隨后用直接(例如細(xì)胞計數(shù))或間接(MTT、MTS、氚化胸腺嘧啶)的方法計數(shù)細(xì)胞。和僅含培養(yǎng)基的對照相比較測定增殖的增加或減少。在并行系列實驗中可以使用不同的濃度的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子來獲得劑量響應(yīng)特征?？梢杂盟鼫y定ED50和ED100(產(chǎn)生一半最大的和最大的響應(yīng)效果所需要的劑量)。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對細(xì)胞分化或細(xì)胞維持未分化狀態(tài)的效果。
細(xì)胞在存在有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的生長培養(yǎng)基中孵育。在合適的一段時間后，對分化指示物進行細(xì)胞分析。它可以是細(xì)胞表面特定標(biāo)志物的表達、胞漿標(biāo)志物的表達，細(xì)胞尺寸、形狀或胞質(zhì)特征的變化。標(biāo)志物可能包括蛋白質(zhì)、糖結(jié)構(gòu)(例如葡萄糖胺聚糖，例如硫酸肝素、硫酸軟骨素等)、脂(糖鞘脂或脂雙層成分)?？梢允褂枚喾N技術(shù)檢測這些變化，所述技術(shù)包括顯微鏡、蛋白印記、FACS染色或前向/側(cè)向散射特征。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對細(xì)胞凋亡的效果。
凋亡被定義為程序化細(xì)胞死亡，和壞死等其它細(xì)胞死亡方式不同。它由確定的細(xì)胞變化所表征，例如信號通路的激活(例如Fas、TNFR)導(dǎo)致一個被稱為半胱天冬酶(caspases)的蛋白酶亞群被激活。啟動半胱天冬酶的激活導(dǎo)致致死半胱天冬酶的激活，它切割多種細(xì)胞蛋白，導(dǎo)致核斷裂，核層纖蛋白斷裂，細(xì)胞質(zhì)起泡并破壞細(xì)胞。凋亡可被蛋白質(zhì)配體誘導(dǎo)，例如FasL、TNFa、淋巴細(xì)胞毒素或被信號誘導(dǎo)，例如紫外光和引起DNA損傷的物質(zhì)。
細(xì)胞在含有蛋白質(zhì)或它的嵌合分子或其它適合檢測的試劑的生長培養(yǎng)基中孵育。例如，可能需要能阻斷轉(zhuǎn)錄(放線菌素D)或翻譯(放線菌酮)的試劑。在孵育合適的一段時間后，用合適的方法測定細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞數(shù)量下降可能意味著凋亡?？梢酝ㄟ^細(xì)胞染色獲得其它凋亡表征，例如，膜聯(lián)蛋白或觀察特征性的梯形DNA形式?？梢酝ㄟ^和細(xì)胞滲透半胱天冬酶抑制劑(例如z-VAD FMK)孵育來防止凋亡標(biāo)志物的表達，隨后檢測凋亡標(biāo)志物，來進一步證實凋亡。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子可能通過細(xì)胞生存通路(例如Bc12或Akt通路)提供生存信號來防止凋亡。能通過細(xì)胞Bcl2表達增加或使用直接針對Akt的磷酸特異性抗體檢測Akt激活形式(磷酸化)增加的蛋白印記證實這些通路的激活。
對于這些檢測，細(xì)胞培養(yǎng)在含有或不含有生存因子(例如IL-3和某種免疫細(xì)胞)條件下。培養(yǎng)在缺乏生存因子條件下的部分細(xì)胞在延長培養(yǎng)下凋亡，培養(yǎng)在足夠數(shù)量生存因子條件下的細(xì)胞將生存下來或增殖?？梢酝ㄟ^蛋白印記、免疫細(xì)胞化學(xué)和FACS分析測定負(fù)責(zé)這些效果的細(xì)胞通路的激活。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子抑制凋亡的效果。
檢測了本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子在體外保護大鼠、小鼠和人皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞在含氧量低和缺乏葡萄糖條件下出現(xiàn)細(xì)胞死亡的活性。為此，從大鼠胚胎中提取了細(xì)胞培養(yǎng)物。為了測定本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的效果，細(xì)胞在含有30mM葡萄糖無血清培養(yǎng)基和95％潮濕度空氣/5％CO2(含氧量正常)或在不含葡萄糖無血清培養(yǎng)基和95％潮濕度氮氣/5％CO2(低氧和葡萄糖缺乏)條件下，在缺乏或存在本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子條件下，在水套培養(yǎng)箱中的模塊培養(yǎng)倉中在37℃下維持48小時。細(xì)胞培養(yǎng)物暴露于低氧和葡萄糖缺乏條件下少于24小時并隨后恢復(fù)到含氧量正常條件下24小時。用Alamar藍的熒光分析細(xì)胞毒性，該方法通過代謝活性測定細(xì)胞活力。
在另一個方法中，神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物在含氧量正常條件下，在缺乏或存在不同濃度的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子條件下，暴露于1mM L-谷氨酸或α-氨基-3-羥-5-甲基惡唑-4-丙酸(AMPA)24小時。用Alamar藍的熒光分析細(xì)胞毒性，該方法通過代謝活性測定細(xì)胞活力。
蛋白質(zhì)或它的嵌合分子可以影響多種細(xì)胞的生長、凋亡、發(fā)育或分化。在其它可檢測參數(shù)中，這些變化能被細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器發(fā)育造成的細(xì)胞大小變化和胞質(zhì)復(fù)雜度變化所反映。例如，懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)角質(zhì)化細(xì)胞分化，表現(xiàn)為表面標(biāo)志物(例如β1整聯(lián)蛋白、β1integrins)下調(diào)，細(xì)胞變大，胞質(zhì)復(fù)雜度增加。能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對細(xì)胞大小或胞質(zhì)復(fù)雜度的效果。
FACS測定一束激光入射到細(xì)胞上后散射出的光線數(shù)量。通常使用提供波長為488nm的氬激光器。細(xì)胞越大，前向光束被阻斷的越多，因此前散射水平和細(xì)胞大小相關(guān)。為了測定細(xì)胞大小的變化，用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子處理的細(xì)胞被稀釋在鞘液(sheath fluid)中并注射進入流式細(xì)胞儀(FACSVantage SE、Becton Dickinson)。未處理的細(xì)胞作為對照。細(xì)胞通過一束光，光的前向散射數(shù)量和細(xì)胞大小相關(guān)。
也可以用FACS測定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器生長和發(fā)育的變化(胞質(zhì)復(fù)雜度)。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器向側(cè)面散射光線。因此，能用上述方法細(xì)胞造成的光線側(cè)面散射數(shù)量測定胞質(zhì)復(fù)雜度的變化，并且可以通過測定細(xì)胞發(fā)出的光線側(cè)面散射水平測定細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的復(fù)雜水平和細(xì)胞顆粒度水平。
可以使用FACS測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對細(xì)胞大小或胞質(zhì)復(fù)雜度的效果，來比較例如20000個處理的細(xì)胞發(fā)出的信號特征和相等數(shù)量的未處理細(xì)胞發(fā)射的信號。通過比較不同處理細(xì)胞群的信號，能檢測細(xì)胞大小和胞質(zhì)復(fù)雜度的相對變化。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對細(xì)胞生長、凋亡、發(fā)育或分化的效果。
能用染料例如碘化丙啶(propidium iodine)標(biāo)記處理細(xì)胞的DNA來測定蛋白質(zhì)誘導(dǎo)的凋亡和細(xì)胞生長或細(xì)胞周期變化，碘化丙啶的激發(fā)波長在488nm區(qū)域，發(fā)射在620nm區(qū)域。發(fā)生凋亡的細(xì)胞DNA凝縮，大小和顆粒度也不同。這些因素給出了正向大小散射特征和熒光信號，并因此將正發(fā)生凋亡的細(xì)胞群和正常細(xì)胞區(qū)分開。細(xì)胞中的DNA數(shù)量也反映了細(xì)胞處于細(xì)胞周期的哪個階段。例如，G2期細(xì)胞的DNA數(shù)量是G0期的兩倍。這可以通過G2期細(xì)胞發(fā)出兩倍的熒光信號得到反映?？梢允褂肍ACS比較例如20000個處理的細(xì)胞發(fā)出的熒光信號和相等數(shù)量的未處理細(xì)胞發(fā)射的信號，測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的效果。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子還可以改變多種蛋白質(zhì)的表達。能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子對蛋白質(zhì)表達的效果。
為了測定整個細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達的增加和降低，可以固定并通透細(xì)胞，隨后和以感興趣蛋白質(zhì)抗原表位為靶點的熒光素交聯(lián)的抗體孵育。在氬激光器系統(tǒng)中可以使用很多種熒光標(biāo)記。此實驗中常使用FITC、Alexa Fluor 488、Cyanine 2、Cyanine 3這些熒光分子。通過標(biāo)記細(xì)胞表面上只有暴露的表位能被抗體標(biāo)記的非通透細(xì)胞，此方法還能被用于測定表面標(biāo)志物和蛋白質(zhì)的表達變化?？梢允褂肍ACS比較例如20000個處理的細(xì)胞發(fā)出的熒光信號和相等數(shù)量的未處理細(xì)胞發(fā)射的信號，測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的效果。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對配體/受體粘附的效果。
和那些以前已知理化形式相比，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子可能具有更低或更高粘附性。相互作用可以是和蛋白質(zhì)受體，因為糖結(jié)構(gòu)(例如選擇蛋白，例如L-選擇蛋白和P-選擇蛋白)、和細(xì)胞外基質(zhì)成分(例如纖維結(jié)合蛋白、膠原、玻璃體結(jié)合蛋白和層粘連蛋白)、或者和非蛋白質(zhì)成分例如糖分子(硫酸肝素，其它葡萄糖胺聚糖)。
蛋白質(zhì)或它的嵌合分子還可以和非生物材料例如組織培養(yǎng)塑料、醫(yī)療器械成分(例如支架或其它移植物)或牙科材料發(fā)生不同的相互作用。對于醫(yī)療器械這可能改變移植物移入率、移植物和特定的細(xì)胞類型或和軀體連接類型之間的相互作用可以使用任何合適的蛋白質(zhì)粘附檢測方法。例如，在特定的實施例中，含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的溶液和一個固定化表面上的結(jié)合配偶體孵育。孵育后，用ELISA檢測溶液中的蛋白質(zhì)或嵌合分子的數(shù)量，殘存的和起始材料之間的數(shù)量差異是結(jié)合到配偶體上的量。例如，可以用ECM蛋白(例如纖維結(jié)合蛋白)第一層包被的96孔板的小孔測定蛋白質(zhì)或嵌合分子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)之間的相互作用。隨后和BSA溶液孵育阻止非特異結(jié)合。在清洗后，加入一種已知濃度的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子溶液達確定的時間。隨后去除溶液，測定溶液中殘存的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的量。通過用針對蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的抗體孵育小孔來測定結(jié)合到ECM蛋白上的量，隨后用一種合適的系統(tǒng)(或者一種標(biāo)記的二抗或者用生物素-親和素酶復(fù)合物例如ELISA所使用的)進行檢測。
測定結(jié)合到其它表面的量的方法可以包括從惰性移植片表面水解蛋白質(zhì)或它的嵌合分子，隨后測定溶液中的氨基酸。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對細(xì)胞粘附的效果。
細(xì)胞粘附到基質(zhì)(例如細(xì)胞外基質(zhì)成分例如纖維結(jié)合蛋白、玻璃體結(jié)合蛋白、膠原、層粘連蛋白等)至少部分是通過整聯(lián)蛋白分子介導(dǎo)的。整聯(lián)蛋白分子包含α和β-亞單位，并且α和β-亞單位獨特的結(jié)合體能增加針對特定配體的結(jié)合特異性(例如a2b1整聯(lián)蛋白結(jié)合膠原、a5b1結(jié)合纖維結(jié)合蛋白等)。整聯(lián)蛋白亞單位具有大的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域用于結(jié)合配體，和較短的胞漿區(qū)結(jié)構(gòu)域用于和細(xì)胞骨架相互作用。在存在配體時，胞漿區(qū)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件(外內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo))。細(xì)胞外信號事件能夠調(diào)控整聯(lián)蛋白對它們的配體的親和性，隨后導(dǎo)致整聯(lián)蛋白胞質(zhì)尾區(qū)的變化(內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo))。
和本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子孵育可以通過一些方法改變細(xì)胞粘附。首先，它能定性的改變特定整聯(lián)蛋白亞群的表達，導(dǎo)致結(jié)合能力的改變。其次，可以改變特定的整聯(lián)蛋白的表達量，導(dǎo)致細(xì)胞與其目標(biāo)基質(zhì)的結(jié)合發(fā)生改變。第三，可以在不改變特定的整聯(lián)蛋白的表面表達的情況下改變整聯(lián)蛋白的親和力(內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo))。所有這些變化都可以改變細(xì)胞對一個譜系配體的結(jié)合，或改變對特定的某種配體的結(jié)合。
可以用通常在96孔板中進行的細(xì)胞-ECM粘附檢測法檢測本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子。用基質(zhì)包被小孔，隨后用BSA包被孔中未結(jié)合位點。將包被的孔和確定數(shù)量的細(xì)胞孵育，隨后洗去未結(jié)合的細(xì)胞，在含有或不含有蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的條件下孵育結(jié)合的細(xì)胞。通過間接方法例如MTT/MTS來測定細(xì)胞的數(shù)量?；蛘?，用放射性標(biāo)記物(例如51Cr)標(biāo)記細(xì)胞，在每個孔中加入已知數(shù)量的放射活性(即細(xì)胞)。測定結(jié)合放射活性，計算占加載數(shù)量的比例。
細(xì)胞還粘附到其它細(xì)胞上，例如一群細(xì)胞粘附到單層的另一種細(xì)胞上。為了檢測此情況，懸浮細(xì)胞被標(biāo)記上放射活性并加入到單層細(xì)胞上。隨后細(xì)胞在存在或不存在蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的條件下孵育。洗去未結(jié)合的細(xì)胞，溶解殘存的細(xì)胞混合群體并檢測放射活性。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對細(xì)胞擴展的效果。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子對細(xì)胞擴展具有不同的效果。細(xì)胞開始擴散是細(xì)胞運動性和浸潤行為的關(guān)鍵步驟。在體外細(xì)胞可以以多種方式開始擴散。將懸浮細(xì)胞鋪在ECM成分上將導(dǎo)致通過整聯(lián)蛋白的粘附和配體結(jié)合。這啟動了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，導(dǎo)致Cdc42、Rac和Rho小GTPases家族的激活。這些蛋白質(zhì)的激活導(dǎo)致肌動蛋白聚合和片足(1amellipodium)延伸，導(dǎo)致細(xì)胞逐漸展平并且它們的受體接觸到更多的整聯(lián)蛋白。最終細(xì)胞完全平扁并形成黏著斑(含有整聯(lián)蛋白和信號蛋白的大結(jié)構(gòu))。還可以通過用生長因子刺激粘附的細(xì)胞來啟動細(xì)胞擴展，也導(dǎo)致Cdc42/Rac/Rho蛋白質(zhì)的激活和黏著斑的形成。
可以通過在蛋白質(zhì)或它的嵌合分子刺激后不同時間點檢測大量細(xì)胞來對細(xì)胞擴展進行定量?？梢允褂脠D像分析軟件測定每個細(xì)胞的區(qū)域，并可以將細(xì)胞擴展百分比和細(xì)胞擴展程度和時間進行比較。Cdc42/Rac/Rho通路更強的激活能啟動更快速的擴展，此外，暫時性的，可以在有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子時測定它們激活的定性和定量差異。這依次反映了本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子誘導(dǎo)的信號事件的變化。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對細(xì)胞運動性、遷移和浸潤的效果。
粘附到組織培養(yǎng)皿上的細(xì)胞不是靜止的保持錨定在一個位點上，而是持續(xù)的伸展和收縮它們的細(xì)胞體。當(dāng)用定時間隔照相觀察時，可以觀察到細(xì)胞在平皿中走來走去，分離的單個細(xì)胞或細(xì)胞群體都是如此。這種運動既可以是“隨機走動”(即不朝向特定方向)，也可以是定向的?？梢酝ㄟ^加入生長因子增強兩種類型的運動?？梢允褂枚〞r間隔照相在給定時間段中定量細(xì)胞覆蓋的總距離和總方向性。
在定向遷移中，細(xì)胞將通過感受化學(xué)梯度并定向它們的遷移機器朝化學(xué)引誘物的源頭運動。在許多情況下，化學(xué)引誘物是生長因子。能通過提供化學(xué)引誘物源頭(例如通過長移液管)然后用定時間隔照相對細(xì)胞向源頭的遷移進行成像，來定量測定定向遷移。
測定定向遷移的另一種系統(tǒng)是博伊登室檢測。在這個檢測中，細(xì)胞被置于通過分割膜中小孔和下室相連的上室中。兩個室中都加入生長培養(yǎng)基，但是只在下室中加入化學(xué)引誘物，導(dǎo)致兩個室間存在擴散梯度。細(xì)胞被生長因子源所吸引并遷移通過分割膜中的小孔，進入到膜的下表面。數(shù)小時后，取走膜并對遷移到膜底部的細(xì)胞進行計數(shù)測定。
細(xì)胞浸潤過程使用了許多和遷移相同的組件。可以使用細(xì)胞浸潤多層細(xì)胞外基質(zhì)來作為細(xì)胞浸潤模型。例如，基質(zhì)膠是基底膜成分的混合物(ECM成分，生長因子等)，在4℃下為液態(tài)，但是在37℃迅速形成凝膠?？梢岳盟鼇戆徊┮恋鞘业纳媳砻妫谙聦蛹尤牖瘜W(xué)引誘物。對于通過到膜下表面的細(xì)胞，它們必須使用酶(例如膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP))來降解基質(zhì)膠并朝化學(xué)引誘物進行定向遷移。這個檢測模擬了細(xì)胞浸潤所需的多種過程。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對趨化性的效果。
在體外可以在博伊登室中測定細(xì)胞朝化學(xué)引誘物方向的遷移。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子被放置到下室，將合適的靶細(xì)胞群放置到上室?？梢詸z測通過一層細(xì)胞的遷移，來模擬免疫細(xì)胞從血液到炎癥部位的遷移的體外過程。用長滿的一層細(xì)胞包覆博伊登室的孔的上表面，所述細(xì)胞例如上皮、內(nèi)皮或成纖維細(xì)胞，這將阻斷免疫細(xì)胞直接遷移通過孔中的洞，免疫細(xì)胞將需要粘附到單層細(xì)胞上并遷移通過它來到達被檢測蛋白處。只在用蛋白質(zhì)或它的嵌合分子處理的孔的博伊登室下表面或下孔培養(yǎng)基中存在細(xì)胞表明了蛋白質(zhì)或嵌合分子的趨化性能力。為了表明此效果是蛋白質(zhì)或它的嵌合分子特異性的，可以在下室中讓蛋白和中和抗體一起孵育。
此外，為了檢測一種物質(zhì)(化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)、糖)防止趨化性的能力，在博伊登室的下室中將該物質(zhì)和含有已知趨化性能力的溶液(可以是特異性趨化因子、細(xì)胞來源的或分泌一系列趨化因子的細(xì)胞的條件培養(yǎng)基)一起孵育。隨后在上室加入易感細(xì)胞群，按上述進行檢測。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對配體受體-結(jié)合的效果。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子可能具有不同的配體-受體結(jié)合能力?？梢酝ㄟ^多種參數(shù)測定配體-受體結(jié)合，例如，解離常數(shù)(Kd)、解離速率常數(shù)(k-)、結(jié)合速率常數(shù)(k+)。配體-受體結(jié)合的差異可能和不同的信號時限和激活有關(guān)，導(dǎo)致不同的生物結(jié)果。
可以通過斯卡恰特作圖法或其它方法例如Biacore法來測定和分析配體-受體結(jié)合。
對于斯卡恰特作圖法，用例如放射性標(biāo)記(例如125I)來標(biāo)記的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子，在存在不同數(shù)量的無放射性的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的競爭劑的條件下，和表達相應(yīng)配體或受體的細(xì)胞或其提取物一起孵育。測定特異性結(jié)合的標(biāo)記的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的數(shù)量，并計算結(jié)合參數(shù)。
對于Biacore法，和蛋白質(zhì)或它的嵌合分子相對應(yīng)的重組配體或受體和檢測單位相配對。含有所選蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的溶液隨后通過檢測細(xì)胞，并且通過檢測單位特性的變化來測定結(jié)合。通過將含有蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的溶液通過檢測細(xì)胞直到記錄到一個固定的讀數(shù)(當(dāng)所有允許的位點都被占有時)來測定結(jié)合速率常數(shù)。不含有蛋白質(zhì)或嵌合分子的溶液通過細(xì)胞，蛋白質(zhì)從相應(yīng)配體或受體上解離下來，給出了解離速率常數(shù)。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對受體激活的效果。
可以通過細(xì)胞內(nèi)源蛋白誘導(dǎo)的信號事件中的差異來對比蛋白質(zhì)或它的嵌合分子和相對應(yīng)的配體或受體之間的相互作用?？梢杂玫鞍踪|(zhì)或它的嵌合分子，用結(jié)合/解離速率常數(shù)或解離常數(shù)精確的表征相互作用時限。
細(xì)胞經(jīng)常內(nèi)攝激活的受體。隨后受體/配體復(fù)合物解離(例如，細(xì)胞小囊泡中的低pH導(dǎo)致配體脫離)，并且受體重循環(huán)到細(xì)胞表面。此外，該復(fù)合物也可能成為降解的靶點。在此過程中，受體將有效下調(diào)并且不能產(chǎn)生進一步的信號，但當(dāng)它們重循環(huán)時則能重復(fù)信號過程。不同的受體結(jié)合或激活可能導(dǎo)致受體從降解轉(zhuǎn)變?yōu)橹匮h(huán)通路，導(dǎo)致更強的生物響應(yīng)。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對信號傳導(dǎo)的效果。
配體或受體結(jié)合到蛋白質(zhì)或它的嵌合分子上可能通過多種胞漿蛋白發(fā)出信號，其中可能包括反向信號。當(dāng)膜結(jié)合形式的配體通過結(jié)合它的可溶性或膜結(jié)合形式受體來傳導(dǎo)信號時，反向信號發(fā)生。反向信號還可能發(fā)生在通過一種抗體結(jié)合膜結(jié)合配體之后。這些信號事件(包括反向信號事件)導(dǎo)致基因和蛋白質(zhì)表達的變化。因此，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子能誘導(dǎo)或抑制在不同的通路中的不同的信號傳導(dǎo)或其它信號傳導(dǎo)事件，例如JAK/STAT通路、Ras-erk通路、AKT通路的激活，PKC、PKA、Src、Fas、TNFR、NFkB、p38MAPK、c-Fos的激活，將蛋白質(zhì)募集到受體，受體磷酸化，受體內(nèi)攝，受體串?dāng)_或分泌。
募集到蛋白質(zhì)或它的嵌合分子上的配體或受體可能對本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子是唯一的，因為誘導(dǎo)了配體或受體的不同的構(gòu)象。測定這些差異的一個方法是用一種交聯(lián)到sepahrose小珠上的抗體來免疫沉淀配體或受體。免疫沉淀并清洗后，將蛋白質(zhì)上樣2D凝膠電源，分析比較點模式?？梢郧邢掠胁町惖狞c并用質(zhì)譜鑒定。
能使用一種或多種下述系統(tǒng)測定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子對表面標(biāo)志物的上調(diào)和下調(diào)的效果。
細(xì)胞對本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子可能具有多種響應(yīng)。在細(xì)胞表面有一系列蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的溝通。通過調(diào)控內(nèi)攝作用和胞吐作用過程，多種蛋白質(zhì)被運到和運離細(xì)胞表面。在細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)的典型蛋白質(zhì)包括受體、結(jié)合蛋白、調(diào)控蛋白和信號分子。蛋白質(zhì)表達和降解率的變化也改變細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的水平。一些蛋白質(zhì)還被儲存于細(xì)胞內(nèi)容器中，特殊信號能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)在這些容器和細(xì)胞膜之間的運輸。
細(xì)胞在含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的培養(yǎng)基中孵育合適的時間，和暴露在相同的不含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的培養(yǎng)基中的細(xì)胞相比較。能溶解細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)并通過離心和細(xì)胞分離。能用蛋白質(zhì)印記法測定特定的蛋白質(zhì)的表達水平。還可以用熒光素交聯(lián)的抗體標(biāo)記細(xì)胞，用共聚焦顯微鏡系統(tǒng)可視化或通過熒光激活細(xì)胞分選法(FACS)計數(shù)。這將檢測出細(xì)胞上蛋白質(zhì)表達和分布的任何變化。還可以通過使用多個抗體，利用共聚焦顯微鏡和免疫沉淀研究蛋白質(zhì)相關(guān)作用的變化。相似的，這些實驗可以擴展到體內(nèi)動物模型中。可以從用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子處理的動物特定部位提取細(xì)胞，用相同的方法進行檢測。
通過在體外或體內(nèi)加入本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子誘導(dǎo)分化的細(xì)胞將表達不同的標(biāo)志物，該標(biāo)志物將這些細(xì)胞和為處理細(xì)胞區(qū)分開。一些細(xì)胞，例如，祖細(xì)胞或干細(xì)胞，能分化為多種同工型，通過它們的表面標(biāo)志物區(qū)分。一個本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子可能刺激祖細(xì)胞按特定的比例分化為多種同工型。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)及其嵌合分子有可能對細(xì)胞排斥有效。
蛋白質(zhì)或它的嵌合分子在調(diào)控細(xì)胞和神經(jīng)元生長和指向的效果是方便的細(xì)胞排斥檢測方法。
破壞亞單位和蛋白質(zhì)其它組件之間的相互作用是抑制蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的生物效果的一種方法。通過多種方法鑒定抑制這種生物效果的化合物。
高通量篩選項目使用小化學(xué)實體庫(化合物或肽)來產(chǎn)生先導(dǎo)化合物用于臨床開發(fā)?？梢允褂靡恍z測方法來篩選庫中的化合物影響生物相關(guān)終末點的能力。在一次檢測中的一個單獨小孔中檢測庫中每個有潛力的化合物，確定化合物的效果。下面提供了一些檢測的實施例。
對這種檢測，細(xì)胞被鋪到微量板(96孔板、384孔板等)中。細(xì)胞將具有蛋白質(zhì)或它的嵌合分子激活的讀出機制。這可以包括檢測細(xì)胞生長、檢測特定通路的刺激(例如基于FRET的技術(shù))、檢測報告基因的誘導(dǎo)(例如CAT、β-半乳糖苷酶、熒光蛋白)、檢測凋亡和檢測分化。隨后細(xì)胞在存在或缺乏特定小分子的條件下暴露于本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子中?？梢栽诩尤氲鞍踪|(zhì)或它的嵌合分子之前、之后或之中加入藥物。在合適的時間段后，使用合適的方法對個別孔讀數(shù)(例如FRET的熒光或熒光蛋白的誘導(dǎo)，MTT中的細(xì)胞數(shù)量，β-半乳糖苷酶活性等)。不加入任何藥物或細(xì)胞因子的對照孔作為比較。任何能夠抑制受體/細(xì)胞因子復(fù)合物的分子將給出和對照不同的讀數(shù)。還需要進一步的實驗來顯示抑制的特異性。此外，藥物可能通過非細(xì)胞因子、非受體機制來影響檢測方法(假陽性)。
蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的配體或受體被固定化在固體表面。隨后加入蛋白質(zhì)或它的嵌合分子和待檢測化合物?？梢韵燃尤氲鞍踪|(zhì)或它的嵌合分子，隨后加入化合物；先加入化合物，隨后加入蛋白質(zhì)或它的嵌合分子；或者化合物和蛋白質(zhì)或它的嵌合分子一起加入。隨后通過合適的檢測抗體檢測結(jié)合的蛋白質(zhì)或嵌合分子?？梢杂靡环N酶(例如用于比色法檢測的堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶)或一種用于熒光檢測的熒光標(biāo)簽標(biāo)記檢測抗體。此外，可以用一種合適的技術(shù)標(biāo)記(例如生物素、放射性標(biāo)記)蛋白質(zhì)或嵌合分子并用一種合適的技術(shù)(例如，對于生物素標(biāo)記，抗生物素蛋白鏈菌素和比色檢測系統(tǒng)；對于放射性標(biāo)記，溶解復(fù)合物并計數(shù))檢測。通過和對照孔相比讀數(shù)的下降來測定蛋白質(zhì)結(jié)合的抑制。
蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的可溶性配體或受體結(jié)合在小珠上。這種結(jié)合反應(yīng)既可以是一種吸附過程也可以涉及將它們化學(xué)交聯(lián)到板上。在一個合適的小孔中將小珠和蛋白質(zhì)或嵌合分子和一種候選化合物孵育。可以先加入蛋白質(zhì)或嵌合分子，隨后加入化合物；先加入化合物，隨后加入蛋白質(zhì)或嵌合分子；或者將化合物和蛋白質(zhì)或嵌合分子一起加入。隨后加入熒光標(biāo)記的識別一種蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的檢測抗體。去除未結(jié)合的抗體并將小珠通過FACS。如果化合物抑制蛋白質(zhì)或它的嵌合分子和它的受體的相互作用，檢測的熒光數(shù)量將會下降。
為了篩選蛋白質(zhì)及其相應(yīng)配體/受體和一種抑制化合物之間的多個相互作用，需要使用FACS儀器分析散射特征的能力。更大直徑的圓珠將具有和較小圓珠不同的散射特征，并可以被分離出用于分析(“gating”)。
一些不同的蛋白質(zhì)，其中一種是本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子，都交聯(lián)到具有特定直徑的圓珠上。隨后在含有一種候選化合物的圓珠混合液中加入上述蛋白質(zhì)的配體/受體混合物。隨后用一種特異性的熒光標(biāo)記的二抗檢測結(jié)合的配體/受體?？贵w可以全部標(biāo)記上相同的檢測熒光基團。隨后通過在FACS儀器上運行樣品并對每個已知大小的圓珠gating來測定化合物阻止蛋白質(zhì)結(jié)合它的配體/受體的能力。隨后分別分析單獨的每個結(jié)合結(jié)果。這個分析方法的主要好處是可以用一些蛋白質(zhì)平行檢測篩選的每個化合物，相應(yīng)的減少了篩選時間。
蛋白質(zhì)或它的嵌合分子還可以通過其晶體結(jié)果進行表征。蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的理化形式可以提供唯一的3維晶體結(jié)構(gòu)。此外，還可以使用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子產(chǎn)生蛋白質(zhì)-配體/受體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)。因為本發(fā)明提供了和人天然存在形式基本上相似的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子，該復(fù)合物有可能是天然存在的蛋白質(zhì)-配體/受體復(fù)合物的體內(nèi)結(jié)構(gòu)的更合適的代表。一旦獲得晶體結(jié)構(gòu)，就能確定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子和潛在的抑制這種相互作用的化合物之間的相互作用。
一旦通過高通量篩選或從蛋白質(zhì)-配體/受體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中確定潛在的化合物，就可以開始進行理性設(shè)計藥物過程。
在根據(jù)具有設(shè)計指定特性的化合物進行模擬物設(shè)計中通常采用一些步驟。首先，確定在決定所需特性中關(guān)鍵的和/或重要的化合物特定部位。對于肽來說，可以通過系統(tǒng)性的改變肽中的氨基酸殘基來完成上述工作，例如依次置換每個殘基。常使用丙氨酸掃描來精煉這種肽基序。這些部分或殘基構(gòu)成了化合物的活性部位，所述活性部位被稱為它的藥效基團。
一旦發(fā)現(xiàn)了藥效基團，根據(jù)它的物理特性使用一系列來源的數(shù)據(jù)來模型化其結(jié)構(gòu)，所述物理特性例如立體化學(xué)、成鍵、大小和/或電荷，所述系列來源的數(shù)據(jù)例如分光鏡技術(shù)、X射線衍射數(shù)據(jù)和核磁共振。在這個建模過程可以使用計算分析、相似性做圖(藥效基團的電荷和/或體積模型，而不是原子間的成鍵)和其它技術(shù)。
在這個方法的一個變體中，制作配體及其結(jié)合伴侶的三維結(jié)構(gòu)模型。這對于配體和/或結(jié)合伴侶在結(jié)合時改變構(gòu)象尤其有用，在設(shè)計模擬物中能讓建?？紤]到這個問題。可以使用建模來產(chǎn)生和線性序列或一種3維構(gòu)象發(fā)生相互作用的抑制劑。
隨后選擇可以將模擬藥效基團的化學(xué)基團移植上去的模板分子?？梢苑奖愕倪x擇模板分子和移植上去的化學(xué)基團，因此模擬物是容易被合成的，有可能是藥理學(xué)上可接受的，并且在體內(nèi)不降解，保持著先導(dǎo)化合物的生物活性?；蛘?，當(dāng)模擬物是基于肽時，可以通過將肽環(huán)化來得到進一步的穩(wěn)定性，增加其剛性。隨后可以篩選通過這種方法發(fā)現(xiàn)的模擬物來觀察它們是否具有目標(biāo)特性，或者它們表現(xiàn)出多大程度的目標(biāo)特性。隨后可以進行進一步的優(yōu)化或修飾，將一個或多個最終的模擬物進入體內(nèi)或臨床檢測。
理性藥物設(shè)計的目標(biāo)是產(chǎn)生感興趣的生物活性多肽或者小分子的結(jié)構(gòu)類似物，它們和這些多肽或小分子相互作用(例如激動劑、拮抗劑、抑制劑或增強劑)，以便于形成藥物，例如，更有活性或更穩(wěn)定的多肽形式，或者，例如在體內(nèi)增強或干擾多肽的功能。見，例如Hodgson(Bio/Technology 919-21、1991)。在一個過程中，首先通過X射線衍射晶體分析法、通過計算機建?；蜃畹湫偷摹⑼ㄟ^多種方法相結(jié)合來確定感興趣的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。還可以通過基于同源蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)建模來獲得關(guān)于多肽結(jié)構(gòu)的有用信息。一個理性藥物設(shè)計的例子是開發(fā)HIV蛋白酶抑制劑(Erickson et al.Science 249527-533、1990)。此外，可以通過丙氨酸掃描來分析目標(biāo)分子(Wells、MethodsEnzymol 2022699-2705、1991)。在這個技術(shù)中，一個氨基酸殘基被Ala置換，并確定它對肽活性的影響。用這種方式分析肽的每個氨基酸殘基來確定肽的重要區(qū)域。
還可能分離出靶標(biāo)特異性抗體，通過功能分析選擇，并隨后解析它的晶體結(jié)構(gòu)。原則上，這個方法產(chǎn)生一個藥物核心，可以基于它進行后續(xù)的藥物設(shè)計。有可能通過對一個有功能的、有藥理學(xué)活性的抗體產(chǎn)生抗獨特型抗體來完全省略蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)晶體學(xué)。抗獨特型抗體的結(jié)合位點作為鏡像圖像的鏡像圖像，因此被期待為原始受體的類似物。因此抗獨特型抗體能被用于從化學(xué)或生物產(chǎn)生的肽庫中鑒定并分離肽。隨后用選擇的肽作為藥物核心。
在一方面，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子被用作免疫源來產(chǎn)生抗體。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的理化形式能增加針對蛋白質(zhì)或嵌合分子的抗體；針對本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的糖肽的抗體；或直接針對蛋白質(zhì)或它的嵌合分子中的另一個翻譯中或翻譯后修飾的肽的抗體。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子可能具有體內(nèi)正常情況下不易接近(但是有可能存在)的表位。例如，有可能在受體結(jié)構(gòu)域內(nèi)存在一個在正常情況下和一個異側(cè)受體的一部分接觸的區(qū)域?？梢杂眠@些表位產(chǎn)生和內(nèi)源受體交叉應(yīng)答的單克隆抗體。這種抗體可以阻斷一個受體元件和另一個的相互作用，并因此防止信號傳導(dǎo)。這可以在過量表達細(xì)胞因子或受體時用作治療使用?？贵w還可以在受體過量表達并且不需要配體就產(chǎn)生信號時用作治療使用。
抗體還可以用于在治療疾病中檢測蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的水平(例如，血清水平來確定半衰期)。
此外，抗體可用于診斷測定在特定樣品中是否存在本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子。
所提到的“抗體”包括所提到的抗體的所有形式，包括但不限于全抗(例如含有完整的Fc區(qū)域)，包括例如單克隆抗體；抗原結(jié)合抗體片段，包括例如Fv、Fab、Fab′和F(ab′)2片段；人源化抗體；人類抗體(例如，在轉(zhuǎn)基因動物或通過噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生的抗體)；和通過基因工程技術(shù)產(chǎn)生的免疫球蛋白衍生肽。和其它的特指的不同，術(shù)語“抗體”和如此處所述包括全抗和它的抗原結(jié)合片段。
除非另外指出，本發(fā)明關(guān)于抗體的特異性表示該抗體基本上只結(jié)合它的目標(biāo)抗原，沒有無關(guān)蛋白的可感知的結(jié)合。但是，有可能一個抗體將被設(shè)計或選擇為結(jié)合兩個或更多的相關(guān)蛋白質(zhì)。相關(guān)蛋白質(zhì)包括不同相同蛋白質(zhì)或來自于不同物種的同源蛋白的剪接變體或片段。這種抗體還被認(rèn)為對那些蛋白質(zhì)有特異性，并被包括于本發(fā)明中。術(shù)語“基本上”意味著在這個背景下對非目標(biāo)抗原沒有高于基底水平的可檢測的結(jié)合，即非特異性。
可以通過熟知的方法制備本發(fā)明的抗體。參見，例如，MonoclonalAntibodies、HybridomasA New Dimension in Biological Analyses、Kennet等人(eds.)、Plenum Press、New York(1980)；和AntibodiesA Laboratory Manual、Harlow和Lane(eds.)、Cold Spring HarborLaboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、(1988)。
產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的一個方法包括用動物產(chǎn)生的一個本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子或它的免疫原性部分(例如，一個包含受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽，抗體通過受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域來結(jié)合一個蛋白質(zhì)或它的嵌合分子中的多肽或免疫原性部分)免疫一個非人動物，例如一只小鼠或一只轉(zhuǎn)基因小鼠。有多種方法來增加特定蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的抗原性，例如給予佐劑或共軛抗原，包括針對所需抗體響應(yīng)的抗原和另一個元件，這些方法都是本領(lǐng)域所熟知的并且是可以采用的。典型的免疫法包括最初的免疫和隨后的一系列增強免疫?？梢詫游锶⊙⒎治鲅逯械目贵w滴度?？梢詫游镞M行增強，直到達到滴度的平臺期?？梢栽谥亟M細(xì)胞培養(yǎng)物中用蛋白質(zhì)融合制備共軛劑。同樣，聚集劑例如明礬適用于增強免疫響應(yīng)。
多克隆和單克隆抗體都可以通過這個方法制備。獲得兩種類型抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。多克隆抗體使用較少但相對容易的制備，用有效數(shù)量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子或它的免疫原性部分注射合適的動物，從動物中收集血清并使用任何已知的免疫吸附技術(shù)分離特異性的針對蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的抗體。通過此方法產(chǎn)生的抗體使用相對較少，因為產(chǎn)品存在潛在的不均一性。
使用單克隆抗體被顯著偏愛的原因是它們可以大量生產(chǎn)，并且產(chǎn)品具有同質(zhì)性?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法生產(chǎn)單克隆抗體。
此處使用的術(shù)語“單克隆抗體”是指從大量的同質(zhì)性抗體中獲得的抗體，即，由除了少量存在的可能的天然產(chǎn)生的突變以外相同的群體組成的單獨抗體。單克隆抗體是高特異性的，直接針對單一的抗原位點。此外，和典型的包括針對不同抗原決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，每個單克隆抗體直接針對抗原上單一的抗原決定簇。修飾語“單克隆”是指抗體的特征是從充分同源抗體群體中獲得的，而不是解釋為需要通過任何特定的方法產(chǎn)生抗體。例如，依照本發(fā)明所使用的單克隆抗體可以通過Kohler等人Nature 256495(1975)首先公布的雜交瘤方法來制備，或可以通過重組DNA方法制備(見，例如美國專利號4、816、567)。“單克隆抗體”還可以從噬菌體抗體庫中分離，使用例如Clackson等人Nature 352624-628、1991和Marks等人J Mol Biol 222581-597、1991所述的方法。
本發(fā)明設(shè)想了一種產(chǎn)生一種雜交瘤細(xì)胞系的方法，包括用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子免疫一種非人動物，例如小鼠或轉(zhuǎn)基因小鼠；從免疫的動物中收獲脾細(xì)胞；將收獲的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系融合來產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞；并且鑒定生產(chǎn)能結(jié)合一種蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系。
這種雜交瘤細(xì)胞系和它們產(chǎn)生的單克隆抗體被包括在本發(fā)明中。通過常規(guī)技術(shù)純化雜交瘤細(xì)胞系分泌的單克隆抗體?？梢赃M一步篩選雜交瘤或它們產(chǎn)生的單克隆抗體來鑒定出帶有所需的特定特性的單克隆抗體，例如通過細(xì)胞因子受體抑制其信號的能力。
在生產(chǎn)本發(fā)明的抗體的最初階段可以用于免疫動物的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子或它的免疫原性部分應(yīng)該來自于人表達來源。
可以通過常規(guī)方法產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合片段。這種片段的實例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段，包括單鏈Fv片段(命名為sFv或scFv)。通過遺傳工程產(chǎn)生的抗體片段和衍生物，例如二硫化穩(wěn)定的Fv片段(dsFv)、單鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(Abs)，根據(jù)本發(fā)明，還設(shè)想了微型抗體和雙體用于使用。
可以通過已知技術(shù)制備這種直接針對蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的單克隆抗體的片段和衍生物并篩選所需特性，所述技術(shù)包括此處所述的檢測。這些檢測提供了鑒定能結(jié)合蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的本發(fā)明的抗體的片段和衍生物的方法，并能鑒定那些還保留抑制蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的信號的活性的片段和衍生物。這些技術(shù)必然包括分離編碼感興趣的mAb中的多肽鏈(或它的一部分)的DNA，和通過重組DNA技術(shù)操作這些DNA。可以通過將DNA融合到另一個感興趣的DNA上或其它方法(例如通過誘變或其它常規(guī)技術(shù))來增加、刪除或替換一個或多個氨基酸殘基。
可以從已經(jīng)用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子免疫的小鼠的B細(xì)胞中分離編碼抗體多肽的DNA(例如重或輕鏈、僅可變區(qū)或全長)?？梢允褂贸Ｒ?guī)程序分離DNA。噬菌體展示是另一個已知技術(shù)的例子，通過它可以制備抗體的衍生物。在一種方法中，在任何合適的重組表達系統(tǒng)中表達作為一種感興趣抗體的一部分的多肽，并且表達的多肽可以被組裝形成抗體分子。
可以通過氨基酸橋(短肽聯(lián)結(jié)子)將重鏈和輕鏈可變區(qū)(Fv區(qū))片段連接起來形成單鏈抗體，形成一個單多肽鏈。通過在編碼兩個可變區(qū)多肽(VL和VH)的DNA之間融合編碼多肽聯(lián)結(jié)子的DNA來制備這種單鏈Fvs(scFvs)。根據(jù)兩個可變結(jié)構(gòu)域之間的靈活的聯(lián)接子的長度，所得抗體片段能形成二聚體或三聚體(Kortt等人ProteinEngineering 10423、1997)。發(fā)展出來的生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)包括美國專利4、946、778；Bird(Science 242423、1988)、Huston等人(Proc Natl Acad Sci USA 855879、1988)和Ward等人(Nature334544、1989)所述技術(shù)。此處提供的從抗體衍生出的單鏈抗體被包括在本發(fā)明中。
在一個實施例中，本發(fā)明提供了能結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子并抑制蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的信號的抗體的抗體片段或嵌合分子、重組子或合成形式。
已知技術(shù)能從感興趣的抗體中取得不同亞類或同種型的抗體，即，亞類轉(zhuǎn)換。因此，例如可以從IgM單克隆抗體得到IgG1或IgG4單克隆抗體，反之亦然。此技術(shù)可以產(chǎn)生擁有指定抗體(母抗體)的抗原結(jié)合特性的新抗體，但還顯示和母抗體不同的抗體同種型或亞類所具有的生物學(xué)特性?？梢圆捎弥亟MDNA技術(shù)。在此過程中可以使用編碼特定抗體多肽的克隆DNA，例如編碼所需同種型抗體的恒定區(qū)的DNA。
可以在動物中使用上述單克隆生產(chǎn)過程，例如小鼠，來生產(chǎn)單克隆抗體。從這些動物中得到的平?？贵w，例如小鼠抗體，通常被認(rèn)為不適合用于人體，因為它們會引起免疫應(yīng)答。因此，這種抗體可能需要修飾來適用于人體。制備嵌合分子和/或人源化抗體的過程是本領(lǐng)域所熟知的，將在下面進一步詳述。
此處的單克隆抗體特別包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和來自于非人物種(例如小鼠)的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈中的其余部分和來自于人體的抗體的相應(yīng)序列相同或同源，這種抗體的片段也是這樣，因此它們表現(xiàn)出所需的生物學(xué)活性(美國專利4、816、567；和Morrison等人.Proc Natl Acad Sci USA816851-6855、1984)。
非人(例如小鼠)抗體的“人源化”形式是嵌合抗體，其中含有少量的來自于非人免疫球蛋白的序列。對于大多數(shù)的部分，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受者抗體)，其中接受者抗體的互補決定區(qū)(CDRs)被非人物種(供體抗體)相應(yīng)的CDRs所替換，所述非人物種例如擁有所需特性(例如特異性和親和性)的小鼠、大鼠、兔子或非人靈長類動物。在一些例子中，人免疫球蛋的框架區(qū)殘基被相應(yīng)的非人殘基替換。并且，人源化抗體可以包含在接受體抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。進行這些修飾來進一步精煉抗體的性能。總之，人源化抗體將基本上包含所有至少一個，并且典型是兩個的可變結(jié)構(gòu)域，其中所有的或基本所有的互補決定區(qū)對應(yīng)于非人免疫球蛋白，并且所有的或大體所有的框架區(qū)殘基是人免疫球蛋白序列。人源化抗體還將可選的含有至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，典型的是人免疫球蛋白。進一步的細(xì)節(jié)參見Jones等人Nature 321522-525、1986；Reichmann等人Nature 332323-329、1988；Presta、Curr Op Struct Biol 2593-596、1992；Liu等人Proc Natl Acad Sci USA 843439、1987；Larrick等人Bio/Technology7934、1989；和Winter和Harris、TIPS 14139、1993。
在進一步的實施例中，本發(fā)明提供了免疫檢測試劑盒，能檢測一種生物制品中的人細(xì)胞所表達的人蛋白質(zhì)的水平，所述生物制品包括包含天然產(chǎn)生人蛋白的生物制品。
本發(fā)明的能使用免疫檢測試劑盒檢測的生物制品包括但不限于實驗室樣品、細(xì)胞、組織、血液、血清、血漿、尿、糞便、唾液和痰。
本發(fā)明的免疫檢測試劑盒包含一種固相支持基質(zhì)，不限于但包括一種膜、浸漬片、珠、凝膠、管或多孔、平底、圓底或v形底的微量培養(yǎng)板，例如96孔板；直接針對感興趣的人蛋白質(zhì)的抗體制劑(捕獲抗體)；包被溶液制劑(例如BSA或酪蛋白)；二抗制劑(檢測抗體)，直接針對感興趣的人蛋白質(zhì)并與合適的檢測分子(例如堿性磷酸酶)共軛；一種顯色底物溶液(例如硝基四偶氮藍)；一種添加底物溶液(例如5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽)；一種底物緩沖液母液(例如0.1M Tris-HCL(pH 7.5)和0.1M NaCl、50mM MgCl2)；已知濃度(標(biāo)準(zhǔn))的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的制劑；和使用說明書。
可以從包括酶、染料、熒光分子、化學(xué)發(fā)光劑、同位素或膠體金等試劑的列表中選擇合適的檢測分子結(jié)合到包括(但不限于)葡萄球菌蛋白A或鏈球菌G蛋白等分子上。
在一個具體實施方案中，捕獲和檢測抗體是單克隆抗體，其制備包括用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子免疫非人動物，例如小鼠或轉(zhuǎn)基因小鼠，隨后如上文所述進行標(biāo)準(zhǔn)方法。單克隆抗體還可以二選一的用重組的方法生產(chǎn)，如上文所述，并可以包括人或嵌合抗體部分或結(jié)構(gòu)域。
在另一個實施方案中，捕獲和檢測抗體是多克隆抗體，其制備包括用本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子免疫非人動物，例如小鼠或兔子、羊或馬，隨后如上文所述進行標(biāo)準(zhǔn)方法。
檢測試劑盒的組件按預(yù)定比例提供，不同試劑的相對數(shù)量適當(dāng)?shù)淖兓瘉砭S持溶液中的試劑濃度，讓檢測靈敏度基本上最大化。特別地，可以以干粉的方式提供試劑，通常是凍干的，包括輔料，溶解后讓每個試劑溶液對于待測的生物制品都具有合適的濃度使用說明書可以詳細(xì)介紹本發(fā)明的免疫檢測試劑盒的使用方法。例如，使用說明書可以介紹用配制的捕獲抗體溶液在合適的濃度下包被固相支持基質(zhì)的方法，例如4℃過夜。使用說明書可以進一步詳細(xì)介紹用配制的包被溶液包被非特異性蛋白質(zhì)結(jié)合位點的方法；在合適條件下(例如37℃1小時或室溫2小時)加入系列稀釋的含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的樣品并孵育，隨后使用本領(lǐng)域已知的合適的緩沖液進行系列清洗，例如含有0.05％吐溫20的0.1M PBS(pH 7.2)溶液。此外，說明書可以提供，應(yīng)用檢測抗體制劑后在合適條件下進行孵育，例如，37℃1小時或室溫2小時，隨后進行一系列清洗。利用提供的檢測底物和底物緩沖液制備檢測緩沖液的工作溶液，隨后加入每個孔中，保持在合適的條件下，從室溫5分鐘到37℃1小時?？梢酝ㄟ^加入1N NaOH或2N H2SO4終止產(chǎn)色反應(yīng)。
在另一個備選的實施方案中，使用說明書可以提供能夠同時按預(yù)訂比例加入的待加入的任何或所有上述組分的任何組合，不同試劑的相對數(shù)量適當(dāng)?shù)淖兓瘉砭S持溶液中的試劑濃度，讓復(fù)合物形成所產(chǎn)生的可檢測信號基本上最大化。
可以使用ELISA平板讀出器或分光光度計，在合適的光密度(OD)下，或作為激發(fā)光，使用分光光度計、熒光計或流式細(xì)胞儀，在合適的波長下，或使用放射性計數(shù)器，在合適的能譜下，或通過光密度計，或通過和圖表或指標(biāo)進行視覺比較，檢測有色產(chǎn)物或熒光或化學(xué)發(fā)光或放射性或其它通過結(jié)合、共軛連接檢測試劑產(chǎn)生的信號的水平。和上述樣品平行檢測標(biāo)準(zhǔn)制劑的系列稀釋溶液。產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線或圖表，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線或圖表內(nèi)插(interpolated)計算樣品中蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的水平。
本發(fā)明還提供了人衍生蛋白或它的嵌合分子，用作免疫檢測中的標(biāo)準(zhǔn)蛋白。本發(fā)明還進一步擴展到一種測定在生物制品中人細(xì)胞表達的人蛋白或它的嵌合分子的水平的方法，包括合適的測定人蛋白或嵌合分子的測定法，該檢測法包括(a)將生物制品和一種或多種直接針對人蛋白或它的嵌合分子的抗體相結(jié)合，(b)測定該抗體或每個抗體結(jié)合生物制品中人蛋白或嵌合分子的水平；(c)將標(biāo)準(zhǔn)人蛋白或一種嵌合分子樣品和一種或多種之間針對人蛋白或嵌合分子的抗體相結(jié)合；(d)測定該抗體或每個抗體的結(jié)合生物制品中人蛋白或嵌合分子的水平；(e)比較該抗體或每個抗體結(jié)合生物制品中人蛋白或嵌合分子的水平和該抗體或每個抗體結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)人蛋白或嵌合分子樣品的水平；尤其是，標(biāo)準(zhǔn)人蛋白或嵌合分子樣品是一種包含本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的制劑。
生物制品包括但不限于實驗室樣品、細(xì)胞、組織、血液、血清、血漿、尿、糞便、唾液和痰。如上文所述或通過本領(lǐng)域已知的方法，生物制品能結(jié)合一種或多種捕獲抗體。例如，首先用制備的捕獲抗體溶液在合適的條件下包被固相支持基質(zhì)(例如，4℃過夜)；隨后用制備的包被溶液封閉非特異性蛋白質(zhì)的結(jié)合位點；隨后加入含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的系列稀釋樣品并在合適的條件下孵育(例如37℃1小時或室溫2小時)，隨后使用本領(lǐng)域已知的合適的緩沖液進行系列清洗(例如含有0.05％吐溫20的0.1M PBS(pH 7.2)溶液)。
隨后，生物制品和一種或多種結(jié)合有如此處所述的合適的檢測分子的檢測抗體相結(jié)合。例如，應(yīng)用檢測抗體制劑后在合適條件下進行孵育(例如，37℃ 1小時或室溫2小時)，隨后進行一系列清洗。
可以如上文所述或通過本領(lǐng)域已知的方法測定結(jié)合水平。例如，利用檢測底物和底物緩沖液制備檢測緩沖液的工作溶液，隨后加入每個孔中，保持在合適的條件下，從室溫5分鐘到37℃1小時?？梢酝ㄟ^加入1N NaOH或2N H2SO4終止產(chǎn)色反應(yīng)。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明如上文所述設(shè)想了了一個分離的蛋白質(zhì)或嵌合分子。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的TNF-α的特征，其包括 -表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為10-30kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為4-8.5； -約有2到50個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個同工型，在一個具體實施方案中，為10-40個同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為1到99％，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95，96，97，98，99，在一個具體實施方案中，為0-10％； -N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為8到30kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為8到25kDa，在一個具體實施方案中，為10到20kDa； -免疫反應(yīng)特征(T13)區(qū)別于在非人類細(xì)胞系統(tǒng)中表達的人TNF-α，在一個具體實施方案中，當(dāng)用含有非人類細(xì)胞系統(tǒng)中表達的人TNF-α的ELISA試劑盒測定本發(fā)明TNF-α的蛋白濃度時，本發(fā)明TNF-α的蛋白濃度被低估。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征了本發(fā)明的LT-α的特征 -表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為15到32kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為5到11； -約有2到100個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個同工型，在一個具體實施方案中，為7-33個同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，在一個具體實施方案中，為0到42％； -N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為10到30kDa，在具體實施方案中，為12到25kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為10到25kDa，在一個具體實施方案中，為12到23kDa； -免疫反應(yīng)特征(T13)區(qū)別于在非人類細(xì)胞系統(tǒng)中表達的人LT-α，在一個具體實施方案中，本發(fā)明LT-α的蛋白濃度用ELISA試劑盒測定時偏低，因為ELISA試劑盒包含了非人類細(xì)胞系統(tǒng)中表達的人LT-α。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的TNFR I-Fc的特征，其包括 -表觀分子量(P1)約為5到120，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120，在一個具體實施方案中，為45到75kDa； -pI(P2)范圍約為2到12，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，在一個具體實施方案中，為5.5-9.5； -約有2到20個同工型(P3)，例如2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20個同工型，在一個具體實施方案中，為8-16個同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為10到90％，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90％，在一個具體實施方案中，為0-36％； -N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為35到65kDa，在一個具體實施方案中，為36到60kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為35到65kDa，在一個具體實施方案中，為36到60kDa； -酸性單糖含量的百分比(P8)約為0-50％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50，在一個具體實施方案中，為0-10％； -單糖含量(P9)和唾液酸含量(P10)，用GalNAc作為標(biāo)準(zhǔn)時，為1∶0.1-8的海藻糖，1∶7-27的G l cNAc，1∶1-14的半乳糖，1∶2-17的甘露糖和1∶0-3的NeuNAc，在一個具體實施方案中，為1∶1-4.5的海藻糖，1∶10-18的GlcNAc，1∶3-9的半乳糖，1∶4-11的甘露糖和1∶0.1-2的NeuNAc；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，為3∶0.01-3的海藻糖，3∶0.01-3的GalNAc，3∶1-17的GlcNAc，3∶0.1-5的半乳糖和3∶0-3的NeuNAc，在一個具體實施方案中，為3∶0.1-1.5的海藻糖，3∶0.1-1的GalNAc，3∶3-11的GlcNAc，3∶1-2.5的半乳糖和3∶0-2的NeuNAc； -硫酸鹽含量(P11)，用Ga1Nac作為標(biāo)準(zhǔn)時，為1∶0.1-21的硫酸鹽，在一個具體實施方案中，為1∶1.5-14的硫酸鹽；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，為3∶0.1-6的硫酸鹽，在一個具體實施方案中，為3∶0.5-4的硫酸鹽； -硫酸鹽化(P59)表示為分子中單糖含量的百分?jǐn)?shù)，為0-50％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50，在一個具體實施方案中，為10-16％； -N-連接寡糖的中性百分比(P13)約為30到100％，例如30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％，在一個具體實施方案中，為80到100％，在進一步的具體實施方案中，為94到97％； -N-連接寡糖的酸性百分比(P14)約為0到50％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50％，在一個具體實施方案中，為0到20％，在進一步的具體實施方案中，為3到6％； -O-連接寡糖的中性百分比(P15)約為24到67％，例如24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67％，在一個具體實施方案中，為29到62％，在進一步的具體實施方案中，為34到57％； -O-連接寡糖的酸性百分比(P16)約為10到80％，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80％，在一個具體實施方案中，為38到71％，在進一步的具體實施方案中，為43到66％； -N-連接寡糖的位置(P21)包括N-299(從信號序列的起始處進行編號)，給予PNGase后，通過PMF得到鑒定。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的TNFRII-Fc的特征，其包括 -表觀分子量(P1)約為10到150，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150，在一個具體實施方案中，為46到118kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為4到10； -約有2到52個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52，在一個具體實施方案中，為10到40個同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，在一個具體實施方案中，為0到56％； -N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為40到100kDa，在一個具體實施方案中，為46到87kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為40到95kDa，在一個具體實施方案中，為42到80kDa； -酸性單糖含量的百分比(P8)約為0-50％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50，在一個具體實施方案中，為1到10％； -單糖含量(P9)和唾液酸含量(P10)，用Ga 1NAc作為標(biāo)準(zhǔn)時，為1∶0.01-3的海藻糖，1∶0.1-5的GlcNAc，1∶0.1-3的半乳糖，1∶0.1-3的甘露糖和1∶0.01-3的NeuNAc；在一個具體實施方案中，為1∶0.01-2的海藻糖，1∶0.1-3的GlcNAc，1∶0.1-2的半乳糖，1∶0.1-2的甘露糖和1∶0.01-2的NeuNAc；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，為3∶0.01-3的海藻糖，3∶1-17的GalNAc，3∶2-32的GlcNAc，3∶1-9的半乳糖和3∶0.1-3的NeuNAc，在一個具體實施方案中，為3∶0.1-2的海藻糖，3∶3-11的GalNAc，3∶5-21的GlcNAc，3∶3-6的半乳糖和3∶0.1-2的NeuNAc； -硫酸鹽含量(P11)，用GalNac作為標(biāo)準(zhǔn)時，為1∶0.1-6的硫酸鹽，在一個具體實施方案中，為1∶1-4的硫酸鹽；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，為3∶4-29的硫酸鹽，在一個具體實施方案中，為3∶9-19的硫酸鹽； -硫酸鹽化(P59)表示為分子中單糖含量的百分?jǐn)?shù)，為10-90％，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90％，在一個具體實施方案中，為27到41％； -N-連接寡糖的中性百分比(P13)約為10到100％，例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％，在一個具體實施方案中，為69到89％，在進一步的具體實施方案中，為74到84％； -N-連接寡糖的酸性百分比(P14)約為0到80％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80％，在一個具體實施方案中，為11到31％，在進一步的具體實施方案中，為16到26％； -O-連接寡糖的中性百分比(P15)約為5到90％，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90，在一個具體實施方案中，為17到54％，在進一步的具體實施方案中，為22到49％； -O-連接寡糖的酸性百分比(P16)約為5到99％，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99，在一個具體實施方案中，為46到83％，在進一步的具體實施方案中，為51到78％； -一個或多個N-聚糖的結(jié)構(gòu)列在表37(a)的N-連接寡糖的比例中(P19)； -一個或多個O-聚糖的結(jié)構(gòu)列在表37(b)的O-連接寡糖的比例中(P20)； -生物活性區(qū)別于在非人類細(xì)胞系統(tǒng)中表達的人TNFRII-Fc，在一個具體實施方案中，本發(fā)明TNFRII-Fc在L-929細(xì)胞中中和TNF-α誘導(dǎo)的細(xì)胞(T30)毒性的能力比E.coli細(xì)胞中表達的人TNFRII-Fc的能力高8-18倍。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的OX40-Fc的特征，其包括 -表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為46到75kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為4到9； -約有2到50個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50同工型，在一個具體實施方案中，為8-16個同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，在一個具體實施方案中，為0到36％； -N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為40到75kDa，在一個具體實施方案中，為44到72kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為38到75kDa，在一個具體實施方案中，為41到70kDa； -N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為46到65kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為46到65kDa； -單糖含量(P9)和唾液酸含量(P10)，用GalNAc作為標(biāo)準(zhǔn)時，為1∶0.01-3的海藻糖，1∶1-4的GlcNAc，1∶0.1-3的半乳糖，1∶0.1-3的甘露糖和1∶0-3的NeuNAc；在一個具體實施方案中，為1∶0.1-1的海藻糖，1∶2-3的GlcNAc，1∶0.5-2的半乳糖，1∶0.5-1的甘露糖和1∶0-2的NeuNAc；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，為3∶0.1-3的海藻糖，3∶1-7的GalNAc，3∶3-15的GlcNAc，3∶2-9的半乳糖和3∶0-3的NeuNAc，在一個具體實施方案中，為3∶0.5-2的海藻糖，3∶3-5的GalNAc，3∶6-10的GlcNAc，3∶4-5的半乳糖和3∶0-2的NeuNAc； -唾液酸含量(P10)表示為分子中單糖含量的百分?jǐn)?shù)，約為0到50％，例如0，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50％，在一個具體實施方案中，為0-10％； -硫酸鹽含量(P11)，用GalNac作為標(biāo)準(zhǔn)時，為1∶0-3的硫酸鹽，在一個具體實施方案中，為1∶0.30-2的硫酸鹽；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，為3∶0.1-7的硫酸鹽，在進一步的具體實施方案中，為3∶1-5的硫酸鹽； -硫酸鹽化(P59)表示為分子中單糖含量的百分?jǐn)?shù)，為0-50％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50，在一個具體實施方案中，為9到15％； -N-連接寡糖的中性百分比(P13)約為69到100％，在一個具體實施方案中，為74到100％，在進一步的具體實施方案中，為79到195％； -N-連接寡糖的酸性百分比(P14)約為0到31％，在一個具體實施方案中，為0到26％，在進一步的具體實施方案中，為5到21％； -O-連接寡糖的中性百分比(P15)約為20到100％，在一個具體實施方案中，為40到90％，在進一步的具體實施方案中，為45到80％； -O-連接寡糖的酸性百分比(P16)約為0到80％，在一個具體實施方案中，為10到60％，在進一步的具體實施方案中，為20到55％； -N-連接寡糖的位置(P21)包括N-160到N-298(從信號序列的起始處進行編號)，給予PNGase后，通過PMF得到鑒定。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的BAFF的特征，其包括 -表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為10到22kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為4到8； -約有2到50個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50同工型，在一個具體實施方案中，為5到10個同工型。
-糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，在一個具體實施方案中，為0到25％。
-N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)約為8到22kDa，在一個具體實施方案中，為10到22kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為8到22kDa，在一個具體實施方案中，為10到22kDa； -生物活性區(qū)別于在非人類細(xì)胞系統(tǒng)中表達的人BAFF，在一個具體實施方案中，本發(fā)明BAFF誘導(dǎo)RPMI 8226細(xì)胞增殖的能力是E.coli細(xì)胞中表達的人BAFF的1.1-2.4倍。
在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的NGFR-Fc的特征，其包括 -表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為55到105kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為3∶6； -約有2到50個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50同工型，在一個具體實施方案中，為8到16個同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，在一個具體實施方案中，為11到53％。
-N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)為45到100kDa之間，在一個具體實施方案中，為48到90kDa； -N-連接的和O-連接的寡糖去糖基化后的實測分子量(P7)約為45到95kDa，在一個具體實施方案中，為48到85kDa；在具體實施方案中，用以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的Fa s配體的特性，其包括 -表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為15到35kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14； -約有2到50個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50同工型； -糖類重量百分?jǐn)?shù)(P5)約為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％，在一個具體實施方案中，為0到51％。
-N-連接寡糖去糖基化后的實測分子量(P6)為10到28kDa之間，在一個具體實施方案中，為12到21kDa； -N-連接寡糖的位置(P21)包括N-184(從信號序列的起始處進行編號)，給予PNGase后，通過PMF得到鑒定。
在一個實施例中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子在N-交聯(lián)部分(P19)中含有至少一個下述結(jié)構(gòu)。在這些圖表中，″u″或“？”表示異頭結(jié)構(gòu)為a或者b，和/或交聯(lián)位置為2、3、4、和/或6。
XX聚糖結(jié)構(gòu)
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Ga l(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-3)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-6)][GlcNAc(？1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(？1-6)]GlcNAc+″+3xGal(？1-？)GlcNAc(？1-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[G al(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-3)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-6)][GlcNAc(？1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(？1-6)]GlcNAc+″+3xGal(？1-？)GlcNAc(？1-？)+Fuc(？1-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+3xGal(b1-4)GlcNAc(b1-3)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Ga l(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″+3xGal(b1-4)GlcNAc(b1-3)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+3xGal(b1-4)GlcNAc(b1-3)+Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″+3xGal(b1-4)GlcNAc(b1-3)+Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Ga l(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-3)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-6)][GlcNAc(？1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(？1-6)]GlcNAc+″+4xGal(？1-？)GlcNAc(？1-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Ga l(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-3)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-6)][GlcNAc(？1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(？1-6)]GlcNAc+″+4xGal(？1-？)GlcNAc(？1-？)+Fuc(？1-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-3)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-6)][GlcNAc(？1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(？1-6)]GlcNAc+″+5x Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(bl-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}kGlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″Where j+k＝14&j、k＞＝1″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(a1-？)[Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}kGlcNAc(b1-2)Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″Where j+k＝14&j、k＞＝1″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}kGlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[NeuAc(a2-？)Gal(b1-4){Gl cNAc(b1-3)Gal(b1-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″Where j+k＝14&k、j＞＝1″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}kGlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″Where j+k＝14&j、k＞＝1″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(a1-？)[Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}kGlcNAc(b1-2)Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″Wherej+k＝14&j、k＞＝1″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}kGlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[NeuAc(a2-？)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″Where j+k＝14&j、k＞＝1″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}kGlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Ga l(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″Where j+k＝14&j、k＞＝1″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(a1-？)[Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}kGlcNAc(b1-2)Man(a1-？)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″Wherej+k＝14&j、k＞＝1″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}kGlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[NeuAc(a2-？)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″Where j+k＝14&j、k＞＝1″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}kGlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″Wherej+k＝14&j、k＞＝1″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(a1-？)[Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}kGlcNAc(b1-2)Man(a1-？)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″Where j+k＝14&j、k＞＝1″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a 2-？)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}kGlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[NeuAc(a2-？)Gal(b1-4){GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)}jGlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″Where j+k＝14&j、k＞＝1″
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-4)Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-4)][Man(a1-6)]Man(b1-4) GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-6)[GlcNAc(b1-4)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Man(a1-6)Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc Man a1-3 Man al-6 Man b1-4 GlcNAc b1-4 GlcNAc 聚糖結(jié)構(gòu)Man(a1-3)Man(a1-6)Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc NeuAc a2-u Galb1-4 G1cNHc b1-2 Man a1-3 Man b1-4 GlcNAc 聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)Man(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)HSO3(-4)GalNAc(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-2)[GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[GlcNAc(b1-4)][Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-2)[GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-2)[GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-2)[GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)[GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)HSO3(-4)GalNAc(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[HSO 3(-4)GalNAc(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)Gl cNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(？1-？)[Gal(？1-？)]GlcNAc(？1-？)Man(a1-？)[Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(？1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Man(a1-3)Man(a1-6)[Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)Man(a1-？)[GlcNAc(？1-？)Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(？1-？)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[GlcNAc(b1-2)[GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)GalNAc(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)HSO3(-4)GalNAc(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)Man(a1-？)[GlcNAc(？1-？)Man(a1-？)][GlcNAc(？1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(？1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[NeuAc(a2-6)GalNAc(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[NeuAc(a 2-6)GalNAc(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+2xMan″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Man(a1-3)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(？1-？)[Gal(？1-？)]GlcNAc(？1-？)Man(a1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)HSO3(-6)[NeuAc(a2-3)]Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-？)[NeuAc(a 2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a 2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)[GalNAc(a1-3)]Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)[GalNAc(a1-3)]Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Fuc(a1-2)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)][GlcNAc(b1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[GlcNAc(？1-？)]Man(a1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)Man(a1-？)][GlcNAc(？1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(？1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc+″+NeuAc″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc+″+2x NeuAc″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Fuc(a1-6)[Gal(b1-4)]GlcNAc(？1-2)Man(？1-6)]Man(？1-4)[Fuc(a1-3)Fuc(a1-3)]GlcNAc+″+NeuAc(？2-6)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(a1-6)[Man(a1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Man(a1-3)[Man(a1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+Fuc(a1-3)″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+NeuAc(a2-6)″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+3x NeuAc(a2-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-4)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-4)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+Fuc(a1-2)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″+Fuc(a1-3)″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-3)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″+NeuAc(a2-3)+NeuAc(a2-6)″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+Fuc+2x NeuAc(a2-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-3)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a 2-3)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-4)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-3)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-4)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+3x NeuAc(a2-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″+HSO3(-6)+2x NeuAc(a2-3)+NeuAc(a2-6)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″+2x HSO3(-6)+2x NeuAc(a2-3)+NeuAc(a2-6)″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-3)[Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(al-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc+″+Gal(b1-2)GlcNAc(b1-3)+3x NeuAc″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(a1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″+NeuAc(a2-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Ga l(a1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″+NeuAc(a2-3)+NeuAc(a 2-6)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(a1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″+HSO3(-6)+2x NeuAc(a2-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-4)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-3)[Fuc(a1-2)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+3x NeuAc(a2-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-4)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(bl-4)]GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-4)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+3x NeuAc(a 2-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″+3x NeuAc(a 2-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)[NeuAc(a 2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)[NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-4)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+4x NeuAc(a2-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+2x Fuc″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-3)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-6)][GlcNAc(？1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(？1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-3)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-6)][GlcNAc(？1-4)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(？1-6)]GlcNAc+″+Fuc″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(a1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(a1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(a1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)[NeuAc(a2-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-3)[Gal(a1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc+″+2x Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)+2x NeuAc″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)+4xNeuAc(a2-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)]Man(a1-6)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+5x NeuAc(a2-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(bl-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)[Fuc(a1-6)]GlcNAc+″+Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)]Man(a1-6)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+2x Fuc+Gal(b1-4)GlcNAc(？1-？)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-4)]Man(a1-？)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-2)Man(a1-？)]Man(b1-4)GlcNAc(b1-4)GlcNAc+″+2x Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)+Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)″ 在一個實施例中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子在O-交聯(lián)部分中至少包含一個下述結(jié)構(gòu)(P20)。在這些圖表中，″u″或“？”表示異頭結(jié)構(gòu)為a或者b，和/或交聯(lián)位置為2、3、4、和/或6。
Fuc 聚糖結(jié)構(gòu)Fuc Glc u1-u Fuc 聚糖結(jié)構(gòu)Glc(？1-？)Fuc GlcNAc 聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc GalNAc 聚糖結(jié)構(gòu)GalNAc NeuAc a2-6GalNAc 聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)GalNAc GlcNAc b1-3GalNAc 聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-3)GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GlcNAc(b1-3)[NeuAc(a2-6)]GalNAc Gal b1-3GalNAc 聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-3)GalNAc Gal 聚糖結(jié)構(gòu)Gal NeuAc a2-3Gal 聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal Xyl u1-u Glc 聚糖結(jié)構(gòu)Xyl(？1-？)Glc NeuAc a2-3Gal b1-4Xyl 聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)Xyl Xyl u1-u Glc 聚糖結(jié)構(gòu)Xyl(？1-？)Glc Xyl u1-u Glc +Xyl 聚糖結(jié)構(gòu)Xyl(？1-？)Glc+″+Xyl″ NeuAc a2-3Gal b1-3GalNAc 聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)Ga lNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)[NeuAc(a2-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-3)[NeuAc(a2-6)]GalNAc Fuc a1-2Gal b1-3GalNAc 聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-3)GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-3)[NeuAc(a2-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(？2-？)Gal(？1-？)[Fuc(a1-？)]GalNAc delta4，5GlcA b1-3GalNAc b1-4GlcA b1-3Gal b1-3Gal b1-4Xyl 聚糖結(jié)構(gòu)delta4，5GlcA(b1-3)GalNAc(b1-4)GlcA(b1-3)Gal(b1-3)Gal(b1-4)Xyl
聚糖結(jié)構(gòu)delta4，5GlcA(b1-3)[HSO3(-4)]GalNAc(b1-4)GlcA(b1-3)Gal(b1-3)Gal(b1-4)Xyl
聚糖結(jié)構(gòu)HSO3(-？)[NeuAc(a2-？)]GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-3)[GlcNAc(b1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-4)GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-4)GlcNAc(b1-6)[GlcNAc(b1-6)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-4)GlcNAc(b1-6)Gal(b1-3)[Fuc(a1-4)GlcNAc(b1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc Fuc a12Galb1-3GlcNAcb1-3GalNAc 聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(bl-3)GlcNAc(b1-3)GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-3)GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-3)GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[GlcNAc(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)[GlcNAc(b1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-6)[GlcNAc(b1-3)]GalNAc Gal b1-4GlcNAcb1-3Gal b1-3GalNAc 聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-3)GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GalNAc(b1-4)[NeuAc(a2-3)]Gal(b1-3)GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)GalNAc(b1-4)[NeuAc(a2-3)]Gal(b1-3)[NeuAc(a2-6)]GalNAc NeuAc u2-u Gal u1-u GalNAcu1-u GalNAc 聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(？2-？)Gal(？1-？)GalNAc(？1-？)GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a 2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-？)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-？)GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc NeuAc a2-u Gal b1-u GlcNAcb1-u Gal u1-u GalNAc 聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-？)Gal(b1-？)GlcNAc(b1-？)Gal(？1-？)GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]Ga1NAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]Ga1NAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-3)[HSO3(-6)GlcNAc(b1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a 2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-3)[Fuc(a1-4)]GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc+″+Fuc(a1-2)″
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(？2-3)Gal(？1-3)[Fuc(？1-4)]GlcNAc(？1-3)Gal(？1-3)GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Ga 1(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-3)Gal(b1-3)GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-3)[Gal(b1-4)GlcNAcb1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)G1cNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]Ga lNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Gal(b1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Ga lNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Ga l(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(？2-3)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-3)Gal(？1-3)[Gal(？1-4)GlcNAc(？1-6)]GalNAc+″+Fuc″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-？)GlcNAc(b1-？)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-？)[Gal(b1-？)]GlcNAc(b1-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(？1-？)Gal(？1-？)[Fuc(？1-？)]GlcNAc(？1-？)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[NeuAc(？2-？)Gal(？1-？)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)Gal(？1-？)[Fuc(？1-？)]GlcNAc(？1-？)[NeuAc(？2-？)Gal(？1-？)]GalNAc+″+Fuc″
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(？1-？)Gal(？1-？)[Fuc(？1-？)]GlcNAc(？1-？)Gal(？1-？)[Fuc(？1-？)]GlcNAc(？1-？)[NeuAc(？2-？)Gal(？1-？)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)Gal(？1-？)GlcNAc(？1-？)[NeuAc(？2-？)Gal(？1-？)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-？)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-3)[NeuAc(a2-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-？)GlcNAc(？1-？)[Gal(b1-？)GlcNAc(？1-？)]Gal(b1-？)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc構(gòu)(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-？)Gal(b1-4)GlcNAc(bl-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-6)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-3)GlcNAc(b1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Gal(b1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-3)[Fuc(a1-4)]GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-4)[Gal(b1-3)]GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Ga1(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-3)[Fuc(a1-4)]GlcNAc(b1-3)[Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-6)]Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Ga1(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)Gal(b1-3)[Fuc(a1-4)]GlcNAc(b1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a 2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-？)GlcNAc(b1-3)[Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-？)GlcNAc(b1-6)]Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-3)Gal(b1-3)[Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-？)GlcNAc(b1-3)[Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-？)GlcNAc(b1-6)]Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-3)Gal(b1-3)[Gal(b1-4)G lcNAc(b1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-？)GlcNAc(b1-3)[Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-？)GlcNAc(b1-6)]Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-3)Gal(b1-3)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-？)GlcNAc(b1-3)[Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-？)GlcNAc(b1-6)]Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-3)[Fuc(a1-2)[Gal(a1-3)]Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)NeuAc(a2-3)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)G1cNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc+″+Fuc(a1-3)″
聚糖結(jié)構(gòu)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]Ga lNAc+″+2x Fuc(a1-3)″
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-3)Gal(b1-4)[Fuc(a1-3)]GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[Gal(b1-3)]GalNAc
聚糖結(jié)構(gòu)Fuc(a1-3)[Gal(b1-4)]GlcNAc(b1-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-？)Gal(b1-4)GlcNAc(b1-6)[NeuAc(a2-3)Gal(b1-3)]GalNAc 可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法修飾宿主細(xì)胞來獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的理化形式，包括但不限于向宿主細(xì)胞中引入一種或多種編碼一種酶或多種酶、產(chǎn)生所需理化形式的轉(zhuǎn)基因。這種轉(zhuǎn)基因包括多種類型的唾液酸轉(zhuǎn)移酶，例如ST3Ga11、ST3Ga12、ST3Ga13、ST3Ga14、ST3Ga15、ST3Ga16、ST6Ga11、ST6Ga12、ST6GalNAc1、ST6GalNAc2、ST6GalNAc3、ST6GalNAc4、ST6GalNAc5、ST8Sial、ST8Sia2、ST8Sia3、ST8Sia4、ST8Sia5、ST8Sia6；半乳糖轉(zhuǎn)移酶，例如GalT1、GalT2；墨角藻糖基轉(zhuǎn)移酶例如FUT1、FUT2、FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT8、FUT9、FUT10、FUT11；硫轉(zhuǎn)移酶；GlcNAc轉(zhuǎn)移酶例如GNT1、GNT2、GNT3、GNT4、GNT5；天線切割酶(antenna-cleaving enzymes)和內(nèi)切糖苷酶。
例如，N-聚糖結(jié)構(gòu)的無效末端唾液酸化作用導(dǎo)致表達的蛋白質(zhì)血清半衰期減少，所述蛋白質(zhì)例如重組人AchE，可以通過向HEK 293細(xì)胞中加入大鼠β-半乳糖苷α-2、6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)基因改善此情況(JBiochem 336647-658、1998；J Biochem 363619-631、2002)。
相似地，特定的Lewis x基團的無效結(jié)構(gòu)例如N-聚糖結(jié)構(gòu)的sialyl Lewisx結(jié)構(gòu)導(dǎo)致表達蛋白配體結(jié)合的減少，所述表達蛋白例如重組人PSGL-1，可以通過向HEK 293細(xì)胞中加入墨角藻糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)基因來改善此情況(Fritz等人PNAS9512283-12288、1998) 在一個具體實施方案中，使用轉(zhuǎn)化有α-2、3或α-2、6唾液酸轉(zhuǎn)移或者α-2、3和α-2、6唾液酸轉(zhuǎn)移酶(“唾液酸化蛋白”)的人細(xì)胞系產(chǎn)生蛋白質(zhì)或它的嵌合分子。唾液酸化蛋白的例子包括唾液酸化TNF-α、唾液酸化TNF-α-Fc、唾液酸化LT-α、唾液酸化LT-α-Fc、唾液酸化TNFRI、唾液酸化TNFRI-Fc、唾液酸化TNFRII、唾液酸化TNFRII-Fc、唾液酸化OX40、唾液酸化OX40-Fc、唾液酸化BAFF、唾液酸化BAFF-Fc、唾液酸化NGFR、唾液酸化NGFR-Fc、唾液酸化Fas配體、唾液酸化Fas配體-Fc。
特別地，用理化參數(shù)(Px)的特征來表征本發(fā)明的唾液酸化蛋白，包括單糖(P9)和唾液酸含量(P10)，當(dāng)以GalNAc為標(biāo)準(zhǔn)時為1∶0.1-100NeuNAc；當(dāng)以3倍甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)時時為3∶0.1-100NeuNAc。本發(fā)明的唾液酸化蛋白的N-連接寡糖中性百分?jǐn)?shù)(P13)為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。本發(fā)明的唾液酸化蛋白的N-連接寡糖酸性百分?jǐn)?shù)(P14)為1到100％，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。本發(fā)明的唾液酸化蛋白的O-連接寡糖中性百分?jǐn)?shù)(P15)為0到99％，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98or 99％。本發(fā)明的唾液酸化蛋白的O-連接寡糖酸性百分?jǐn)?shù)(P16)為1到100％，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
和沒有轉(zhuǎn)基因的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的半衰期相比，唾液酸化蛋白的體內(nèi)半衰期(T11)增加。
在一個具體實施方案中，唾液酸化蛋白含有至少一個此處所述結(jié)構(gòu)式，或至少一個此處所述結(jié)構(gòu)式，其中一個或多個NeuNAc交聯(lián)是N-交聯(lián)部分中的α2、6交聯(lián)。
在一個具體實施方案中，唾液酸化蛋白含有至少一個此處所述結(jié)構(gòu)式，或至少一個此處所述結(jié)構(gòu)式，其中一個或多個NeuNAc交聯(lián)是O-交聯(lián)部分中的α2、6交聯(lián)。
在一個具體的實施方案中，以下一個或多個理化特性(Px)以及藥理學(xué)特性(Ty)表征本發(fā)明的唾液酸化-TNFRI-Fc，其具有-表觀分子量(P1)約為1到250，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250kDa，在一個具體實施方案中，為48到85kDa； -pI(P2)范圍約為2到14，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14，在一個具體實施方案中，為5.5到8.5；-約有2到50個同工型(P3)，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個同工型，在一個具體實施方案中，為10-18個同工型；在一個具體實施方案中，使用轉(zhuǎn)化了FUT3(“海藻糖化蛋白”)的人細(xì)胞系中得到本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其嵌合分子。海藻糖化蛋白例如包括海藻糖化TNF-α、海藻糖化TNF-α-Fc、海藻糖化LT-α、海藻糖化LT-α-Fc、海藻糖化TNFRI、海藻糖化TNFRI-Fc、海藻糖化TNFRII、海藻糖化TNFRII-Fc、海藻糖化OX40、海藻糖化OX40-Fc、海藻糖化BAFF、海藻糖化BAFF-Fc、海藻糖化NGFR、海藻糖化NGFR-Fc、海藻糖化Fas配體、海藻糖化Fas配體-Fc。
特別地，用理化參數(shù)(Px)的特征來表征本發(fā)明的唾液酸化蛋白，包括單糖(P9)和唾液酸含量(P10)，當(dāng)以GalNAc為標(biāo)準(zhǔn)時為1到0.1-100NeuNAc；當(dāng)以3倍甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)時為3到0.1-100NeuNAc。
在一個具體實施方案中，海藻糖化蛋白擁有更多的含有Lewis結(jié)構(gòu)(例如Lewis a、Lewis b、Lewis x或Lewis y)或sialyl Lewis結(jié)構(gòu)(例如sialyl Lewis a或sialyl Lewis x)的結(jié)構(gòu)部分。
在一個具體實施方案中，和沒有轉(zhuǎn)基因的表達的本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的結(jié)合親合力相比，海藻糖化蛋白擁有改變的配體結(jié)合親合力。
使用從TNF-α、LT-α、TNFRI、TNFRII、OX40、BAFF、NGFR、Fas配體中選擇的蛋白分子的各自的正向引物和反向引物，從EST中通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)采用本領(lǐng)域已知的方法擴增編碼相關(guān)蛋白的DNA，例如根據(jù)Invitrogen公司的PCR Super Mix High Fidelity(Cat.No.10790-020)。消化擴增子并連接到合適載體的相應(yīng)的限制酶位點上，例如pIRESbleo3、pCMV-SPORT6、pUMCV3、pORF、pORF9、pcDNA 3.1/GS、pCEP4、pIRESpuro3、pIRESpuro4、pcDNA3.1/Hygro(+)、pcDNA3.1/Hygro(-)、pEF6/V5-His。連接載體轉(zhuǎn)化到合適的大腸桿菌宿主細(xì)胞中，例如XLGold、超感受態(tài)細(xì)胞(Strategene)、XL-Blue、DH5α、DHl0B或其它。
對于嵌合分子的產(chǎn)生，從EST中采用合適的正向和反向引物通過PCR擴增免疫球蛋白的Fc結(jié)構(gòu)域的DNA序列，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgGA1、IgGA2、IgGM、IgGE、IgGD。擴展子被克隆到合適的載體的相應(yīng)的限制酶位點上，例如，pIRESbleo3、pCMV-SPORT6、pUMCV3、pORF、pORF9、pcDNA3.1/GS、pCEP4、pIRESpuro3、pIRESpuro4、pcDNA3.1/Hygro(+)、pcDNA3.1/Hygro(-)、pEF6/V5-His。相應(yīng)蛋白的DNA序列被擴增并克隆到各自的以Fc為框架的Fc-載體的相應(yīng)的限制酶位點上。
在一個具體實施方案中，F(xiàn)c受體結(jié)合區(qū)或Fc區(qū)域的補體激活區(qū)可以被重組修飾，包括Fc區(qū)氨基酸序列的一個或多個氨基酸插入、刪除或替換。此外，F(xiàn)c受體結(jié)合區(qū)或Fc區(qū)域的補體激活區(qū)可以被化學(xué)修飾，改變?yōu)樗奶腔问剑诎被峁羌苌匣蛉魏侮P(guān)聯(lián)的共翻譯實體或翻譯后實體上加入或去除碳水化物部分、加入多不飽和脂肪酸部分或其它基于脂的部分。Fc區(qū)域還可以是縮短形式，通過一種酶酶切來實現(xiàn)，所述酶包括木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或其它任何位點特異性的蛋白酶。Fc區(qū)域可以通過二聚體、三聚體或更高等級的多聚體的結(jié)合相應(yīng)配體或受體能力更強的嵌合蛋白，促進自發(fā)構(gòu)象形成。
使用合適的限制性酶進行鑒別消化來鑒定/分離含有帶有相應(yīng)基因的細(xì)菌克隆。分離陽性克隆并-70℃甘油儲存。隨后將克隆擴增到750ml含有氨芐青霉素(100μg/ml)的無菌LB液體培養(yǎng)基中37℃搖動培養(yǎng)16小時。根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法提取質(zhì)粒，優(yōu)選的，根據(jù)QiagenEndofree P1asmid Mega試劑盒(Qiagen Mega Prep Kit#12381)。
適合引入含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的克隆DNA序列的人宿主細(xì)胞包括但不限于HEK 293及其任何衍生體，HEK 293 c18、HEK293-T、HEK 293 CEN4、HEK 293F、HEK 293FT、HEK 293E、AD-293(Stratagene公司)、293A(Invitrogen公司)、Hela細(xì)胞及其任何衍生體，HepG2、PA-1 Jurkat、THP-1、HL-60、H9、HuT 78、Hep-2、Hep G2、MRC-5、PER.C6、SKO-007、U266、Y2(Apollo公司)、WI-38、WI-L2。
可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法修飾宿主細(xì)胞來獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的理化形式，包括但不限于向宿主細(xì)胞中引入一種或多種編碼一種酶或多種酶、產(chǎn)生所需理化形式的轉(zhuǎn)基因?？梢酝ㄟ^引入特殊的DNA序列來優(yōu)化克隆DNA序列整合到宿主細(xì)胞基因組中，不同類型的整合包括但不限于位點特異性的、靶向性的、直接的或酶介導(dǎo)的整合。
可以通過多種本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)染方法將蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的DNA引入到合適的宿主細(xì)胞中，例如，使用化學(xué)試劑例如二乙氨基乙基葡聚糖(DEAE-dextran)、磷酸鈣、人工脂質(zhì)體或通過直接微注射、電穿孔、生物顆粒運輸或感染或轉(zhuǎn)染病毒結(jié)構(gòu)，如下所述。
DEAE-dextran是一種陽離子聚合物，和帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合。DNA/聚合體復(fù)合物中聚合體上過多的正電荷能讓復(fù)合物更接近締合帶有負(fù)電荷的細(xì)胞膜。據(jù)推測復(fù)合物的吸收依靠內(nèi)吞作用。轉(zhuǎn)染中使用的其它合成的陽離子聚合物包括1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)、聚乙烯亞胺和dendrimers。
多種細(xì)胞類型的瞬時和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染可以使用磷酸鈣共沉淀。按某種受控的方式將DNA和氯化鈣混合，然后加入到緩沖的堿金屬鹽的/磷酸鹽溶液中，混合液在室溫下孵育。產(chǎn)生沉淀并被細(xì)胞通過內(nèi)吞作用或吞噬作用吸收。
脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因運輸中脂質(zhì)體的最常用脂成分是在生理學(xué)pH下具有凈正電荷的脂成分。通常將陽離子脂和中性脂混合，例如L-dioleoyl磷脂酰乙醇胺(DOPE)。脂分子的陽離子部分和核酸的負(fù)電荷締合，導(dǎo)致在脂質(zhì)體/核酸復(fù)合物中核酸緊縮。通過內(nèi)吞作用吸收復(fù)合物。
將DNA直接微注射到培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞核中是一種有效的但是費力的技術(shù)，不適合需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的情況。
電穿孔使用一種電脈沖產(chǎn)生孔隙，讓核酸進入細(xì)胞，對于使用的每種類型的細(xì)胞此技術(shù)都需要對脈沖的持續(xù)時間和強度進行細(xì)調(diào)和優(yōu)化?？少徺I的電穿孔設(shè)備包括Amaxa Biosystems公司的Nucleofector試劑盒(Amaxa Biosystems，Germany)。
此方法依賴于核酸微粒高速運輸?shù)绞荏w細(xì)胞中。
用病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)感染或轉(zhuǎn)染包括使用逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如慢病毒屬，或DNA病毒，例如腺病毒。其過程包括使用一種病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來傳送外來基因進入到宿主細(xì)胞中。
在一些實施方案中，通過瞬時方法或從穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系產(chǎn)生蛋白質(zhì)或它的嵌合分子。使用粘附或懸浮細(xì)胞系進行瞬時轉(zhuǎn)染。對于粘附細(xì)胞系，細(xì)胞在含有血清的培養(yǎng)基(2-10％血清)中生長，所述培養(yǎng)基例如DMEM，DMEM/F12(JRH)。使用的血清可以是胎牛血清(FCS)、供體小牛血清(DCS)、新生小牛血清(NBCS)等。通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法將質(zhì)粒載體引入到細(xì)胞。在一個具體的實施方案中，使用DEAE dextran或磷酸鈣沉淀法轉(zhuǎn)染蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的DNA。轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞轉(zhuǎn)換到合適的收集培養(yǎng)基(例如無血清DMEM/F12)中收集表達的蛋白或它的嵌合分子。
可以通過使用上面簡述方法引入質(zhì)粒載體進行蛋白質(zhì)或它的嵌合分子從懸浮細(xì)胞中的瞬時表達。懸浮細(xì)胞能在含血清培養(yǎng)基或無血清培養(yǎng)基(例如Freestyle培養(yǎng)基(Invitrogen)，CD293培養(yǎng)基(Invitrogen)，Exce11培養(yǎng)基(JRH)等)中生長?？梢栽跓o血清條件下進行轉(zhuǎn)染，通過在一種合適的培養(yǎng)基中使用合適的轉(zhuǎn)染方法進行轉(zhuǎn)染，例如，lipofectamine在OptiMEM培養(yǎng)基中。
瞬時表達通常導(dǎo)致轉(zhuǎn)染后2-3天表達高峰。游離型載體在細(xì)胞中復(fù)制并持續(xù)表達。因此，為了獲得大量的產(chǎn)物，將游離表達載體轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中并擴增細(xì)胞。蛋白質(zhì)或它的嵌合分子表達到培養(yǎng)基中，在細(xì)胞擴增幾周后進行收集。表達培養(yǎng)基可以是含血清或無血清的，細(xì)胞可以是粘附的或懸浮的。
通過轉(zhuǎn)染表達載體進入細(xì)胞獲得穩(wěn)定克隆，隨后用合適的試劑進行選擇，例如福來霉素、均霉素、嘌呤霉素、新霉素G418、甲氨喋呤等。穩(wěn)定克隆將能在選擇中生存，因為質(zhì)粒中除了編碼蛋白質(zhì)或嵌合分子的基因以外還含有抗性基因。引入基因后1到2天，開始對全部細(xì)胞(穩(wěn)定池)或?qū)Π凑湛寺∶芏蠕伆宓募?xì)胞進行選擇。對非轉(zhuǎn)染細(xì)胞群也進行選擇來確定選擇試劑的殺細(xì)胞效果。對于粘附細(xì)胞，讓細(xì)胞在組織培養(yǎng)板上生長直到獲得可見的分離的克隆。隨后用胰酶消化或物理方法將它們從平板中移出并鋪到組織培養(yǎng)孔中(96孔板中每個孔一個克隆)。對于懸浮細(xì)胞，選擇后進行有限稀釋克隆，克隆隨后得到擴增，隨后進行表征和/或進行下一輪的有限稀釋分析。
生長在含有血清的培養(yǎng)基中的穩(wěn)定克隆能適應(yīng)逐漸減少血清水平，隨后脫落并在低血清下懸浮生長。隨后進一步降低血清水平直到無血清狀態(tài)。一些培養(yǎng)基能使適應(yīng)更快(例如，從含有粘附的條件直接替換為無血清懸浮生長)，一個例子是Invitrogen公司的CD293培養(yǎng)基。
在無血清培養(yǎng)基中生長后，克隆可以開始進行培養(yǎng)基優(yōu)化。在許多不同的培養(yǎng)基中檢測克隆的生產(chǎn)特性，例如，完整有活力細(xì)胞數(shù)量，直到獲得最適成分。這依賴于生產(chǎn)的生產(chǎn)方法。例如，在一個培養(yǎng)基中細(xì)胞可能擴增，隨后在產(chǎn)物收集前加入增強表達的添加劑。
過量表達的蛋白或嵌合分子可能在宿主細(xì)胞中積累。細(xì)胞內(nèi)蛋白的回收包括用裂解緩沖液處理宿主細(xì)胞，所述裂解緩沖液包括但不限于含有如下成分的緩沖液NP40，Triton X-100，Triton X-114，十二烷基硫酸鈉(SDS)，牛膽酸鈉，去氧膽酸鈉，CHAPS，CHAPSO，Brij-35，Brij-58，Tween-20，Tween-80，辛基葡糖苷和Octylthioglucoside。另一種裂解宿主細(xì)胞方法可以包括聲裂法、勻漿、弗氏細(xì)胞壓碎和反復(fù)凍融和用低滲溶液處理細(xì)胞。
可以在多種不同生物反應(yīng)器中生產(chǎn)最終產(chǎn)物，經(jīng)由非限定性的例子，包括攪拌池、氣升式(airlift)、填充床灌流、微載體、中空纖維、袋技術(shù)、細(xì)胞工廠。其方法可以是連續(xù)培養(yǎng)、批次、流加培養(yǎng)(fed batch)或誘導(dǎo)?？梢栽诘脱迮囵B(yǎng)基中加入胨類來增加容積蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
使用特別為本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子定制的純化策略純化本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子。純化方法包括但不限于正切流動過濾(TFF)；硫酸銨沉淀；分子篩析色譜(SEC)；凝膠過濾色譜(GFC)；親合色譜(AFC)；A蛋白親和提純；受體介導(dǎo)的配位色譜(RMLC)；染料配位色譜(DLC)；離子交換色譜(IEC)，包括陰離子或陽離子交換色譜(AEC或CEC)；反相色譜(RPC)；疏水作用色譜(HIC)；金屬螯合層析(MCC)。
TFF是一種快速和有效的生物分子分離方法，用于濃縮、脫鹽或分餾樣品。TFF能濃縮數(shù)百升樣品為10毫升。和合適的分子量截留膜相結(jié)合，TFF能分離不同大小和分子量的生物分子(額定分子量截留(NMWC)為5KDa，10KDa，30KDa，100KDa)。透析過濾過程包括稀釋樣品隨后再濃縮，能被用于脫鹽或替換樣品緩沖液。
鹽析或硫酸銨沉淀能用于濃縮蛋白質(zhì)稀釋溶液。還用于分餾蛋白質(zhì)混合物。增加含蛋白質(zhì)的溶液的離子強度引起蛋白質(zhì)分子之間相似電荷排斥效果減弱。它還降低維持蛋白質(zhì)分子周圍溶劑殼層的力。當(dāng)這些力減小到足夠程度時，蛋白質(zhì)將沉淀；和親水蛋白相比，疏水蛋白在較低鹽濃度下沉淀。通過逐步增加離子強度并進行離心進行蛋白質(zhì)化合物的分級分離是一種非常有效的部分純化蛋白質(zhì)的方法。
SEC根據(jù)樣品流經(jīng)多孔基質(zhì)，通過大小分離蛋白質(zhì)。SEC和GFC原理相同，它被用于分離液相系統(tǒng)中的分子。在SEC中，比填充材料中的孔大的分子和溶劑前沿一起首先流出，是完全排除在外的。中間大小的分子，介于完全排除和保留之間，根據(jù)其大小通過基質(zhì)材料中的孔。自由進出孔的小分子被保留。因此，不同大小的蛋白質(zhì)有不同的洗脫體積和保留時間。對于結(jié)構(gòu)相似的分子，分子大小越大，它們流程的越早。在運行任何樣品之前，應(yīng)該建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定工作限度和參考保留時間。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)形狀相同時，可以根據(jù)柱中不同孔徑的填充物，通過紫外吸收、熒光或光散射快速篩選柱洗脫物的分子量。光子相關(guān)光譜(PCs)通常用于靜態(tài)樣品和液相色譜檢測中。低角度激光散射也被偶聯(lián)到色譜檢測中，直接檢測分子量，和蛋白質(zhì)的形狀無關(guān)(Carr等人AnalBiochem 175492-499，1988)。SEC-HPLC被用于檢測hGH降解和聚集(Pikal等人Pharm Res 8427-436，1991)。它還被用于估計研究的β-半乳糖苷酶的污染情況(Yoshioka et al.Pharm Res 10103-108，1993)。
AFC根據(jù)生物分子之間的化學(xué)結(jié)構(gòu)間的特異性的相互作用和合適的親和配體純化生物分子。通過互補的固定化的配體特異性的并且可逆的吸附目標(biāo)分子。配體可以是一種抑制劑、底物、模擬物或輔因子，或者一種能特異性識別目標(biāo)分子的抗體。隨后，通過競爭性置換將吸附的分子洗脫掉，或者通過pH或離子強度轉(zhuǎn)換讓構(gòu)象改變。
A蛋白親和純化是使用某種細(xì)菌蛋白的親和力的一個親和純化例子，所述細(xì)菌蛋白能廣泛結(jié)合抗體，不管抗體對抗原的特異性。A蛋白、G蛋白、L蛋白都具有了解清楚的抗體結(jié)合特性。這三種蛋白已經(jīng)重組生產(chǎn)并常規(guī)用于從多種中親和純化關(guān)鍵抗體類型。A蛋白、G蛋白的遺傳工程重組形式被稱為蛋白A/G，也是可以使用的。這些抗體結(jié)合蛋白能被固定化在支持基質(zhì)上。此方法已經(jīng)被修改用于純化目標(biāo)蛋白上連接有抗體A蛋白結(jié)合區(qū)域(Fc區(qū)域)的重組蛋白中。在生理條件下結(jié)合到固定化的A蛋白分子上，通過改變pH或離子強度洗脫。
RMLC是一種特殊類型的AFC，使用了受體對其相關(guān)目標(biāo)分子的固有親和性。受體分子通過活性氨基、活性氫、羰基、羧基或巰基基團被固定化在合適的色譜支持基質(zhì)上。在一個RMLC例子中，受體-Fc嵌合分子分子通過受體Fc部分對A蛋白的親和力被固定在A蛋白瓊脂糖凝膠珠上。此方法具有定向固定受體，向其對應(yīng)的細(xì)胞因子暴露出其配體結(jié)合位點的優(yōu)勢。在生理條件下讓目標(biāo)分子吸附到受體上，通過改變pH或離子強度洗脫。
DLC是一種ALC，使用了活性染料選擇性和可逆的結(jié)合蛋白能力。染料通常是一氯磺酰胺化合物?；钚月然鶊F能人三嗪染料容易的固定化在支持基質(zhì)上，例如瓊脂糖凝膠(Sepharose)或瓊脂糖，并且最近能固定化在尼龍膜上。
這些染料結(jié)合蛋白的最初發(fā)現(xiàn)來自于觀察到用作凝膠過濾柱外水體積標(biāo)志物的葡聚糖藍(cibacron藍FG-3A的共軛化合物)能延緩某些蛋白質(zhì)的洗脫。于是進行了染料對特定蛋白的特異性的一些研究，多數(shù)使用原型cibacron藍染料。這些染料在結(jié)合使用核苷酸作為輔因子的蛋白質(zhì)和酶方面顯示出最有效的結(jié)合特性，所述蛋白和酶例如激酶和脫氫酶，雖然其它蛋白例如血清清蛋白也能緊密結(jié)合。人們認(rèn)為芳香族三嗪染料結(jié)構(gòu)和煙酰胺腺嘌呤(NAD)的核苷酸結(jié)構(gòu)相似，并且染料和這些蛋白中的煙酰胺腺嘌呤折疊發(fā)生相關(guān)作用。在許多情況下，通過底物或核苷酸輔因子在競爭形式下能將結(jié)合蛋白洗脫下來，并且染料已經(jīng)顯示出在自由溶液中競爭底物結(jié)合位點的特性?？磥硭坪踹@些染料能通過靜電的和疏水的相互作用和更特異性的和配體結(jié)合位點的“偽親和”相互作用結(jié)合蛋白。通過修飾增加染料配體的特異性來進一步模擬配體(擬生態(tài)染料)已經(jīng)被成功用于純化許多脫氫酶和蛋白酶中(McGettrick等人離子交換色譜(IEC)使用了蛋白因離子交換柱基質(zhì)和蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用在柱子中的滯留來純化蛋白。當(dāng)流動相pH超過目標(biāo)蛋白的p I時，目標(biāo)蛋白帶負(fù)電，并將和陰離子交換柱(AEC)發(fā)生相互作用。當(dāng)流動相pH低于目標(biāo)蛋白的pI時，目標(biāo)蛋白帶正電，應(yīng)使用陽離子交換柱(CEC)。通過使用和目標(biāo)分子相同的電荷來增加平衡離子的濃度來洗脫目標(biāo)蛋白。
RPC根據(jù)分子和色譜支持基質(zhì)之間的疏水相互作用分離生物分子。通過控制分離中的pH，在可電離的化合物的中性形式下，它們最容易分析。流動相添加劑，例如三氟乙酸，通過形成離子對增加蛋白疏水性，強烈吸附到固定相。通過改變固定相的極性，生物分子從色譜的支持基質(zhì)上洗脫下來。
HIC和RPC相似，但是具有更大的額定孔徑。在HIC中，洗脫溶劑使用水相鹽溶液，代替RPC中使用的水相或有機相流動相。并且，樣品洗脫順序和RPC相比是相反的。蛋白表面包含親水殘基和疏水“片”，后者通常位于折疊蛋白的內(nèi)部來穩(wěn)定蛋白質(zhì)。當(dāng)疏水片變?yōu)楸┞兜剿喹h(huán)境中時，它們將破壞蛋白的正常溶劑特性，變?yōu)闊崃W(xué)不利的。在水相流動相中，無機鹽(例如硫酸銨)濃度越高，表面張力越大，因此增加HIC樹脂疏水基團和蛋白之間的疏水相互作用的強度，發(fā)生吸附。但是，當(dāng)梯度降低鹽濃度時，水相流動相的表面張力下降，因此導(dǎo)致疏水性相互作用降低，導(dǎo)致蛋白從柱子疏水基團上解吸附。MCC是一種根據(jù)蛋白質(zhì)對螯合金屬離子的親和力分離蛋白的技術(shù)。不同的金屬離子包括但不限于通過共價結(jié)合的螯合配體(例如亞氨二醋酸)固定在色譜支撐物固定相的Cu2+，Co2+，Zn2+，Mn2+，Mg2+或Ni2+。金屬離子的自由配位點被用于結(jié)合不同的蛋白質(zhì)和多肽。通過用競爭性分子置換蛋白或者通過改變pH來洗脫。例如，降低緩沖液pH導(dǎo)致蛋白質(zhì)-金屬離子復(fù)合物的結(jié)合親和力降低，蛋白質(zhì)解吸附。或者，使用梯度降低pH(采用不連續(xù)梯度或線性梯度形式)從柱子上洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。
可以通過本領(lǐng)域已知的多種方法修飾宿主細(xì)胞來獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子的理化形式。
本發(fā)明設(shè)想了在蛋白質(zhì)或嵌合分子表達和純化之后，將碳水化合物化學(xué)或酶偶聯(lián)到蛋白質(zhì)或嵌合分子的肽鏈上?？梢允褂没瘜W(xué)和/或酶偶聯(lián)過程來修飾、增加或降低數(shù)量或碳水化合物取得的數(shù)量或特征。依賴所使用的偶聯(lián)模式，糖可以附加到(a)精氨酸的酰胺基，(b)自由羧基基團，(c)巰基基團，例如半胱氨酸中的那些，(d)羥基基團例如絲氨酸、蘇氨酸、羥基賴氨酸中的那些，(e)芳香族殘基例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的那些，(f)谷氨酰胺的酰胺基團，或(g)氨基例如組氨酸、精氨酸或賴氨酸中的那些。可以通過化學(xué)或酶學(xué)方法進行附加。例如，可以使用合適的重組糖基轉(zhuǎn)移酶在蛋白質(zhì)或它的嵌合分子上連續(xù)附加糖單位。還可以使用糖基轉(zhuǎn)移酶增加共價連接有取代基的糖。例如，可以通過唾液酸轉(zhuǎn)移酶將帶有共價附加的聚乙二醇(PEG)的唾液酸轉(zhuǎn)移到末端半乳糖殘基來增加分子大小和血清半衰期。
還可以化學(xué)或酶法修飾蛋白質(zhì)或嵌合分子的碳水化合物側(cè)鏈來摻入多種功能團，包括磷酸根、硫酸根、羥基、羧酸根、O-硫酸根和N-乙?；鶊F。
還可以化學(xué)或酶法去除蛋白質(zhì)或它的嵌合分子中的碳水化合物?？梢允褂萌谆撬峄蛞环N相當(dāng)?shù)幕衔镞M行化學(xué)去糖基化。這種處理會導(dǎo)致大多數(shù)或所有糖的割裂，除了結(jié)合糖，并且保持多肽完整。和可以通過多種內(nèi)切糖苷酶和糖苷外切酶從蛋白質(zhì)或它的嵌合分子中去除個別的糖或整個鏈。
可以通過用唾液酸酶來修飾蛋白質(zhì)或嵌合分子的聚糖成分，或用中等程度的酸處理來去除殘留的唾液酸；用外切-或內(nèi)切-糖苷酶來裁剪N-交聯(lián)低聚糖天線或縮短O-連接寡糖。還可以用海藻糖苷酶或硫酸酯酶處理來去除側(cè)基，例如海藻糖和硫酸根?？梢曰瘜W(xué)法向氨基酸骨架上添加偽聚糖結(jié)構(gòu)例如聚乙二醇或葡聚糖，或者可以使用帶有糖-dUDP前體的甘油轉(zhuǎn)移酶雞尾酒來向聚糖合成的增加糖亞單位。
本發(fā)明設(shè)想了化學(xué)或酶法偶聯(lián)蛋白質(zhì)或它的嵌合分子到放射性核素上。這種蛋白質(zhì)或嵌合分子可以從含有TNF-α、TNF-α-Fc、LT-α、LT-α-Fc、TNFRI、TNFRI-Fc、TNFRII、TNFRII-Fc、OX40、OX40-Fc、BAFF、BAFF-Fc、NGFR、NGFR-Fc、Fas配體、Fas配體-Fc的列表中選擇。
可以使用碘化作用向蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的肽鏈附加碘同位素(例如123I)。尤其是，同位素可以附加到蛋白質(zhì)或它的嵌合分子的肽鏈的(a)酪氨酸的酚環(huán)上，或(b)組氨酸的咪唑環(huán)上?？梢允褂寐劝?T(Chloramine-T)、一氯化碘、三碘化物、電解質(zhì)的、酶的、結(jié)合、去金屬化、非水溶性碘化試劑或碘珠的方法進行碘化作用。
可以使用锝標(biāo)記方法使用本領(lǐng)域已知的方法將99mTc附加到本發(fā)明的蛋白質(zhì)或嵌合分子上，例如通過用還原試劑(例如氯化亞錫)還原99mTcO4-，隨后通過雙功能螯合劑(例如二亞乙三胺五乙酸(DTPA))進行99mTc標(biāo)記蛋白質(zhì)或嵌合分子。
本發(fā)明設(shè)想了蛋白質(zhì)或它的嵌合分子化學(xué)或酶法偶聯(lián)到化學(xué)治療劑上?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法將合適的試劑(例如唑來膦酸)結(jié)合到蛋白質(zhì)或它的嵌合分子上，例如，通過N-hydroxysulfosuccinimide增強的碳化二亞胺介導(dǎo)的偶聯(lián)反應(yīng)。
本發(fā)明設(shè)想了蛋白質(zhì)或它的嵌合分子化學(xué)或酶法偶聯(lián)到毒素上?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法將合適的毒素(包括蜂毒素、vanous毒素、縮短的假單胞菌外毒素、蓖麻毒素、白樹毒素和diptheria毒素)結(jié)合到蛋白質(zhì)或嵌合分子上，所述方法例如通過馬來酰亞胺或碳化二亞胺偶聯(lián)化學(xué)作用。
可以通過讓分離的蛋白質(zhì)或嵌合分子和患者中的目標(biāo)受體或配體發(fā)生接觸的方法將此處所述的分離的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子運輸?shù)交颊唧w內(nèi)。在一個具體的實施方案中，蛋白質(zhì)或它的嵌合分子作為“藥物組合物”被運輸?shù)幕颊咧小?br> 另一方面，本發(fā)明設(shè)想了一種含有上文所述的分離的一種或多種蛋白質(zhì)或嵌合分子和藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑的藥物組合物。
適用于注射使用的組合物形式包括無菌水溶液(水可溶的)和無菌粉末用于臨時制備無菌注射溶液。在生產(chǎn)和儲存條件下它必須是穩(wěn)定的，并且必須保持避免微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染。載體可以是一種溶劑或稀釋劑包括，例如，水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、它們的合適的混合物和植物油。可以維持合適的流動性，例如，通過使用表面活性劑。可以通過多種抗細(xì)菌和抗真菌劑，例如對羥苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、thirmerosal等，來防止微生物的活動。在許多情況下，優(yōu)選等滲試劑，例如，糖或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中使用延緩吸收試劑來延長可注射組合物的吸收，例如，單硬脂酸鋁和凝膠。
通過在所需數(shù)量的合適的帶有所需活性成分和可選的其它活性成分的溶劑中摻入活性化合物，來制備無菌注射溶液，隨后過濾滅菌或采用其它合適的滅菌方法。對于用于制備無菌注射溶液的無菌粉末，合適的制備方法包括真空干燥和凍干，所述方法產(chǎn)生活性成分粉末加任意添加的所需成分。
當(dāng)活性劑被合適的保護時，可以口服給藥，例如，和無活性的稀釋劑或和可同化的可食載體，或者可以封裝在硬的或軟殼膠囊中，或者可以壓縮為片劑，或者可以直接摻入到日常飲食的食物中或通過母乳給藥。對于口服治療給藥，活性成分可以摻入輔料并以可吸收片劑、含片、膠囊、酏劑、懸浮液、糖漿劑、薄脆餅等形式使用。這種組合物和制劑應(yīng)該含有至少1％重量的活性成分。組合物和制劑的百分比可以，當(dāng)然，是變化的并且可以合宜的介于單位重量的5％到大約80％之間。在這種治療用的組合物中活性試劑的數(shù)量為將獲取的合適的劑量。在一個具體的實施方案中，制備根據(jù)本發(fā)明的組合物或制劑，口服劑量單位形式含有大約0.1μg和200mg之間的調(diào)節(jié)劑。其它劑量包括從大約1μg到大約1000mg，從大約10μg到大約500mg。這些劑量可以是每個個體或每公斤體重。可以每小時、每天、每周、每月或每年給藥。
片劑、含片、丸劑、膠囊等還可以含有下述列表的組合物?？梢约尤胝澈蟿├鐦渲?、阿拉伯膠、玉米淀粉、明膠；輔料例如磷酸二鈣；崩解劑例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、褐藻酸等；潤滑劑例如硬脂酸鎂；甜味劑例如蔗糖、乳糖或糖精，或者加入增香劑例如薄荷、冬青油或櫻桃調(diào)味料。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時，它可以含有上述類型的材料和液體載體。多種其它材料可以用于包被或另外修飾劑量單位的物理形式。例如，可以用蟲膠、蔗糖或兩者一起包被片劑、丸劑或膠囊。糖漿或酏劑可以含有活性化合物，蔗糖作為甜味劑，甲醇和對羥苯甲酸丙酯作為防腐劑，染料和調(diào)味料例如櫻桃或柑橘調(diào)味料。當(dāng)然，在配制任何劑量單位形式中使用的任何材料應(yīng)該是藥物純的并且對于使用的數(shù)量基本是無毒的。此外，活性化合物可以摻入緩釋制劑和劑型中。
本發(fā)明還設(shè)想了局部給藥劑型。在局部給藥劑型中，活性試劑可以是在乳膏或洗劑或蠟制劑或其它液體溶液中懸浮的，因此局部應(yīng)用乳膏或洗劑或蠟制劑或液體溶液導(dǎo)致活性試劑被引入患者的生物表面。活性試劑選自一個或多個本發(fā)明的TNFRI-Fc或TNFRII-Fc或其變體、同系物或類似物。
在具體實施方案中，局部用組合物包含TNFRI和/或TNFRII和/或TNFRI或TNFRII的嵌合分子，嵌合分子由TNFRI或TNFRII直接地或者通過一個或多個蛋白質(zhì)連接子融合到抗體的Fc部分或它們的功能同系物上得到。在其他具體實施方案，局部用組合物進一步包含藥學(xué)上可接受的局部用載體。
因此，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含TNFRI-Fc多肽或其變體、同系物或類似物和/或TNFRII-Fc多肽或其變體、同系物或類似物，以及藥學(xué)上可接受的局部用載體或稀釋劑。
雖然，從TNFRI多肽或其變體、同系物或類似物和/或TNFRII多肽或其變體、同系物或類似物和/或TNFRI-Fc或其變體、同系物或類似物和/或TNFRII-Fc或其變體、同系物或類似物的角度，在此舉例說明了本發(fā)明的局部用制劑，但是，本發(fā)明也擴展到由功能相當(dāng)?shù)幕钚栽噭┙M成的藥物組合物?！肮δ芟喈?dāng)?shù)幕钚栽噭崩绨ㄆ渌黅NF結(jié)合試劑和融合于除Fc區(qū)以外但本質(zhì)上提供相同功能的多肽部分的TNFRI或TNFRII(或包含其一個或多個細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的片斷) 本發(fā)明也特別設(shè)想了目的多肽的“變體、同系物或類似物”。術(shù)語“變體”或“同系物”包括，與TNFRI多肽和/或TNFRII多肽和/或TNFRI-Fc多肽和/或TNFRII-Fc多肽的氨基酸序列相比，一個或多個氨基酸發(fā)生插入、缺失或置換的多肽。
目的多肽的“類似物”包括但不限于側(cè)鏈經(jīng)過修飾的多肽，在合成中摻入人工氨基酸和/或其衍生物的合成多肽以及利用交聯(lián)劑和其它方法增強多肽的結(jié)構(gòu)限制。
本發(fā)明所設(shè)想了側(cè)鏈修飾例如包括還原性烷基，與乙醛發(fā)生反應(yīng)，接著用NaBH4還原；amidination with methylacetimidate；用無水醋酐進行?；?；用氰酸鹽對氨基進行氨甲酰化；用2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)對氨基進行三硝基苯化作用；用琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐對氨基進行?；?；在NaBH4還原后，用吡哆醛-5-磷酸鹽對賴氨酸進行加成。
精氨酸殘基的胍基團可以用例如2，3-乙基去甲腎上腺素、苯乙二醛和乙二醛的試劑形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物來進行修飾。
羧基基團可以通過碳化二亞胺的活化進行修飾，通過形成O-酰基異脲，繼而衍生得到，例如形成相應(yīng)的酰胺。
巰基基團可以通過以下方法進行修飾，例如與碘乙酸或碘乙酰胺發(fā)生羧甲基化；過氧甲酸氧化得到磺基丙氨酸；與其它硫氫化合物形成混合二硫化物；與馬來酰亞胺、馬來酸酐或其它取代的馬來酰亞胺發(fā)應(yīng)；用4-氯汞苯甲酸、4-氯汞苯磺酸，氯化汞苯，2-氯汞基-4-硝基酚和其它汞制劑形成汞制劑衍生物；與氰酸鹽在堿性pH下發(fā)生氨甲?；?。
色氨酸殘基可以進行以下修飾，例如，用N-溴代琥珀酰亞胺進行氧化或用2-羥基-5-硝基溴代苯或磺酰鹵化物對吲哚環(huán)進行烷基化。另一方面，酪氨酸可以通過四硝基甲烷的硝化改變形成3-硝基酪氨酸衍生物。
對組胺酸的咪唑環(huán)進行修飾，可以通過以下途經(jīng)來完成用碘乙酸衍生物進行烷基化或用焦碳酸二乙酯進行N-乙?；?。
在合成肽的過程中摻入人工氨基酸合衍生物，例如包括但不限于，利用正亮氨酸、4-氨基丁酸、4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸、6-氨基己酸、t-丁?；拾彼?、正纈氨酸、苯基甘氨酸、鳥氨酸、肌氨酸、4-氨基-3-羥基-6-甲基庚酸、2-噻吩基丙氨酸和/或右旋氨基酸。在此涉及的人工氨基酸列表在表5a中給出。
在另一個具體實施方案中，藥物組合物適于局部施用，并且其包含編碼TNFRI多肽或TNFRI-Fc多肽的片斷的核苷酸，所述的核苷酸序列是基本如一個或多個SEQ ID NO63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85所示的核苷酸序列，或與上面所列的任一序列具有至少有大約70％同一性的核苷酸序列，或與上述的任一序列或它們的互補形式在低嚴(yán)格條件下能夠雜交的核苷酸序列。
在另一個具體實施方案中，藥物組合物適于局部施用，并且其包含編碼TNFRII多肽或TNFRII-Fc多肽片斷的核苷酸，所述的核苷酸序列是基本如一個或多個SEQ ID NO91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121所示的核苷酸序列，或與上面所列的任一序列具有至少有約70％同一性的核苷酸序列，或與上述的任一序列或它們的互補形式在低嚴(yán)格條件下能夠雜交的核苷酸序列。
在一個具體實施方案中，藥物組合物適于局部施用，并且其包含由TNFRI多肽或TNFRI-Fc多肽片斷，其具有下述的氨基酸序列基本如一個或多個SEQ ID NO64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86所示的氨基酸序列，與之具有至少70％的相似性或其變體、同系物、類似物；或者由TNFRII多肽或TNFRII-Fc多肽的片斷；基本如一個或多個SEQ ID NO92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122所示的氨基酸序列，或與之具有至少70％的相似性或其變體、同系物、類似物。
TNFRI和/或TNFRI I和/或TNFRI-Fc和/或TNFRII-Fc也可以是經(jīng)過共翻譯或翻譯后的修飾或添加的產(chǎn)物，例如包括向它們的氨基酸骨架上或共翻譯或翻譯后整體上進行糖基化的形式和/或向其上附加多部飽和脂肪酸部分或其它以脂為基礎(chǔ)的部分。
在此使用的術(shù)語“生物學(xué)表面”設(shè)想了器官外部或內(nèi)部的任何的表面。例如，本發(fā)明的局部用制劑的“生物學(xué)表面”可能適用于包括身體內(nèi)部或外部的生物學(xué)表面例如皮膚表面，傷口表面，interlesionalfissures，裂縫的內(nèi)部和外部以及沿著消化道，呼吸道，胃腸道和生殖泌尿道的任何地方。
除了傳統(tǒng)乳膏、乳劑、貼片或噴霧劑以外，本發(fā)明的試劑還可以被局部的和/或透皮的運輸，使用一系列基于離子電滲療法或電穿孔(poration)的方法。
“離子電滲療法”基于電流引起帶電粒子運動的能力。置于皮膚上的一對靠近的電極在皮膚和下面的毛細(xì)血管之間建立了一個電勢。在正極，帶正電荷的藥物分子被驅(qū)離皮膚表面到毛細(xì)血管。相反的，在負(fù)極帶負(fù)電的藥物分子將被推動透過皮膚。因為電流能關(guān)閉和改變，離子電滲療法裝置能快速啟動并關(guān)閉，藥物運輸是高度可控的并且是程序化的。
電穿孔技術(shù)使用了高頻脈沖能量，以多種形式(例如射頻輻射、激光、熱或光)來短暫打破角質(zhì)層，角質(zhì)層是阻止多數(shù)藥物進入到血流中的皮膚層。重要的是注意和離子電滲不同，電穿孔技術(shù)使用的能量不用于運輸藥物通過皮膚，只是方便它的移動。電穿孔提供了一個“窗口”，和正常情況相比藥物底物能更容易和快速的通過。
此外，藥學(xué)可接受的載體可以，雖然不是必須的，以藥理學(xué)活性堿的形式存在。
術(shù)語“堿”采用其傳統(tǒng)意義，即溶解在含水的液體中可以產(chǎn)生氫氧根離子的物質(zhì)。水是一個典型的水溶液，而且可以是皮膚表面天然的濕氣，或存在于貼片或組合物中，所用的貼片或組合物可以包含額外的水分，以及/或者與一個密封的保護層聯(lián)合使用。相似的，所用的任何液體或半固體制劑為水成制劑時更佳，或者連接一個密閉材料組成的保護層后使用。任何可以使用的堿的條件是，其化合物在含水液體中可以產(chǎn)生游離的氫氧根離子。堿可以以直接或間接的形式產(chǎn)生氫氧根離子，因此，堿也可以理解為“氫氧根-釋放試劑”。直接產(chǎn)生氫氧根離子的氫氧根-釋放試劑通常含有氫氧根基團，直接將氫氧根離子釋放到溶液中，例如堿金屬的氫氧化物。間接產(chǎn)生氫氧根離子的氫氧根-釋放試劑通常是在水環(huán)境中發(fā)理化學(xué)反應(yīng)并產(chǎn)生氫氧根離子的化合物，例如金屬的碳酸鹽或胺。
本發(fā)明的藥理學(xué)活性堿是一種藥學(xué)可接受的無機或有機堿。首選無機堿包括無機氫氧化物，無機氧化物，弱酸的無機鹽及其復(fù)合物。首選有機堿為含氮堿類。
長久以來一直認(rèn)為強堿，例如NaOH不適于作為藥理學(xué)活性堿，因為它們會損傷皮膚。但是，在皮膚接觸制劑或貼片中，將皮膚暴露在堿或堿溶液中，可以增加皮膚對不同藥物的通透性而不引起皮膚損傷。利用多種堿或堿濃度，使皮膚表面溶液達到預(yù)期pH。相應(yīng)地，選擇盡可能低的pH使其不引起皮膚損傷，但足以增強皮膚對不同活性試劑的通透性。這樣，優(yōu)化任何貼片或制劑中的堿含量很重要，增加藥物通過身體表面的流量并使皮膚損傷的可能性降到最低。一般而言，與本發(fā)明的制劑或藥物遞送系統(tǒng)相接觸的身體表面的pH傾向于8.0到13.0左右的范圍，8.5到11.5左右更佳，最好在8.5到10.5左右。在某些方面，pH在9.5到11.5左右的范圍，傾向于10.0到11.5左右。
在一個具體實施方案中，身體表面的pH值是制備因素之一，即制備制劑或系統(tǒng)以得到身體表面的預(yù)期pH值。無水制劑和經(jīng)皮系統(tǒng)沒有可測定的pH，因此配制該制劑或系統(tǒng)在身體表面達到一個靶pH值。水分可以從身體表面遷移到制劑或系統(tǒng)，使堿溶解，將堿釋放到液體中，從而在皮膚表面達到預(yù)期的靶pH值。在這種情況下，首選親水成分。此外，當(dāng)使用水制劑時，制劑在用于皮膚后其pH可能隨時間發(fā)生變化。例如，凝膠、液體、乳膏等，在用于身體表面后，可能發(fā)生水分的凈損失，即丟失的水分超過從身體表面獲得的水分。在這種情況下，與配制得到的pH相比，制劑的pH可能發(fā)生了變化。配制該水制劑，使其在皮膚表面獲得一個靶pH，從而輕松解決以上問題。
在本發(fā)明的另一個具體實施方案中，制劑的pH或藥物遞送系統(tǒng)中藥物組合物的pH在3.0到13.0左右的范圍，傾向于3∶10.0左右，3.5到8.5左右更佳，最好在4到7左右。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，制劑的pH比身體表面的pH高。例如，使用一個水制劑時，來自身體表面的水分可以稀釋制劑，因此在身體表面達到一個不同的pH，通常比制劑本身的pH低。
典型的無機堿是無機氫氧化物，無機氧化物，弱酸的無機鹽，及其復(fù)合物。首選無機堿其水溶液具有高pH并且是食物或醫(yī)藥添加劑可以接受的。當(dāng)涉及“堿”時，應(yīng)理解為同時包括水合和無水合的形式。
無機氫氧化物包括，例如，氨水，一價堿金屬氫氧化物和二價堿金屬氫氧化物，及其復(fù)合物。首選無機氫氧化物包括氨水；一價堿金屬氫氧化物例如氫氧化鈉和氫氧化鉀；二價堿金屬氫氧化物例如氫氧化鈣和氫氧化鎂；及其復(fù)合物。
本發(fā)明制劑和系統(tǒng)中無機氫氧化物的用量，通常表示為占局部用組合物，或占藥物遞送系統(tǒng)的藥物庫或貼片的0.3-7.0w/w％左右，傾向于0.5-4.0w/w％，0.5-3.0w/w％左右更佳，最好在0.75-2.0w/w％左右。
前面提到的用量尤其適用于這些制劑和貼片，其中的活性試劑是(1)一個不帶電的分子，例如其中的堿性藥物是不電離的游離堿的形式，(2)酸性藥物的堿性鹽，或(3)制劑或貼片中不存在另外的種類可以與無機氫氧化物發(fā)生任何顯著性水平的反應(yīng)或中和。
對于這樣的制劑和貼片，其中的藥物以酸性鹽的形式存在，和/或制劑或系統(tǒng)中存在另外的種類可以與無機堿(即酸滅活成分)反應(yīng)或中和，無機氫氧化物的用量傾向于下列之和(1)中和酸性鹽和/或其它能夠被堿中和的種類所需要的用量，加上(2)制劑或藥物庫的0.3-7.0w/w％左右，傾向于0.5-4.0w/w％，0.5-3.0w/w％左右更佳，最好在0.75-2.0w/w％左右。這樣，對于一個酸性鹽，增效劑向于存在一定用量足以中和鹽，加上一額外的用量(即，0.3-7.0w/w％左右，傾向于0.5-4.0w/w％，0.5-3.0w/w％左右更佳，最好在0.75-2.0w/w％左右)來增加藥物通過皮膚或粘膜組織的流量。以中性游離堿或酸性藥物的堿性鹽形式存在的堿性藥物通常不受堿的影響，因此，對于這些藥物，(1)中的用量通常是中和無活性的酸性成分所需要的。對于貼片，前面提到的百分?jǐn)?shù)是相對于組成成分和粘合劑、膠或貯液器的總重量。
通過控制堿釋放的速率和/或數(shù)量，尤其是在藥物遞送過程中，可以使用更高數(shù)量的無機氫氧化物。
無機氧化物包括，例如，氧化鎂，氧化鈣等等。
本發(fā)明制劑和系統(tǒng)的無機氧化物的用量可能顯著高于上面所述的無機氫氧化物用量，可以高達20w/w％，在某些情況下可以高達25w/w％或更高，但通常在2-20w/w％左右的范圍?？紤]到任何能夠被堿中和的種類的存在，可以對這些用量進行調(diào)整。
弱酸的無機鹽包括磷酸銨(二元)；弱酸的堿金屬鹽例如醋酸鈉、硼酸鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、磷酸鈉(三元)、磷酸鈉(二元)、碳酸鉀、碳酸氫鉀、檸檬酸鉀、醋酸鉀、磷酸鉀(二元)、磷酸鉀(三元)；弱酸的堿金屬鹽例如磷酸鎂和磷酸鈣；等等，及其復(fù)合物。
首選弱酸的無機鹽包括，磷酸銨(二元)和弱酸的堿金屬鹽。
適于本發(fā)明使用的有機堿存在氨基、酰胺基、肟、氰基、芳香環(huán)或非芳香族的含氮雜環(huán)，碳酰胺基團，及其復(fù)合物。更確切的，合適的有機堿例子為含氮堿類，包括但不限于伯胺、仲胺、叔胺、酰胺、肟、含氰基(--CN)的種類、芳香族或非芳香族的含氮雜環(huán)、尿素，及其復(fù)合物。
對于含氮堿類，試劑的用量表示為占局部用制劑，或占藥物遞送系統(tǒng)的藥物庫或貼片的0.5-4.0w/w％左右，傾向于0.5-3.0w/w％左右，0.75-2.0w/w％左右更佳?？紤]到慮到任何能夠被堿中和的種類的存在，可以對這些用量進行調(diào)整。
適合的含氮堿類可以包括以下任何一種或其復(fù)合物 -伯胺(--NH2)基團； -單取代(仲胺)氨基基團--NHR、其中的R為烴基、通常是烷基或芳香基、例如較低的烷基或苯基、也可以被一個或多個非烴基取代基取代、例如1到3的鹵素、羥基、硫氫基、或較低的烴氧基(這種--NHR基團包括、例如甲氨基、乙氨基、異丙氨基、丁氨基、環(huán)丙氨基、環(huán)己氨基、n-己氨基、苯氨基、苯甲氨基、氯乙烯氨基、羥乙基氨基等)； -二取代(叔胺)氨基基團--NRaRb，其中的Ra和Rb可以相同或不同，可以是上面R的定義(合適的--NRaRb包括、例如二甲氨基、二乙氨基基、二異丙氨基、二丁氨基、甲基丙氨基、甲基己氨基、甲基環(huán)己氨基、乙基環(huán)丙氨基、乙基氯乙烯氨基、甲基苯甲氨基、甲基苯氨基、甲基甲苯氨基、甲基-p-氯苯甲氨基、甲基環(huán)己氨基等)； -酰胺--(CO)--NRcRd，其中Rc和Rd可以相同或不同，可以是氫或R，其中R定義同上(包括，例如其中的Rc和Rd一個是H而另一個是甲基、丁基、苯甲基等的酰胺)； -氰基(--CN)； -芳香族含氮雜環(huán)，通常是五或六元單環(huán)取代基，或二環(huán)融合或五元和六元環(huán)連接而成(例如吡咯基、吡啶基、喹基、吡咯烷基、嘧啶基、咪唑基、1，2，4-三唑基、四唑基等)；以及 -芳香族含氮雜環(huán)，通常是四元或六元環(huán)，包括內(nèi)酰胺和酰亞胺，例如吡咯、嗎啉、哌嗪、哌、N-苯基-β-丙內(nèi)酰胺、γ-丁內(nèi)酰胺、ω-己內(nèi)酰胺、乙酰亞胺基、鄰苯二甲酰亞胺、琥珀酰亞胺等。
伯胺、仲胺和叔胺通常是根據(jù)分子結(jié)構(gòu)NR1R2R3所圍繞的N進行分類，其中的R1、R2和R3選自H、烷基、羥烷基、烷氧基烷基，烯基、羥烯基、烷氧基烯基、環(huán)烷基、環(huán)烷基取代的烷基，單環(huán)芳基和單環(huán)烷基取代的烷基，條件為至少一個R1、R2和R3不是H。這種胺例如包括但不限于二乙醇胺、三乙醇胺、異丙醇胺、三異丙醇胺、二丁醇胺、三丁醇胺、N-十二烷基乙醇胺、N-(2-甲氧乙基)十二烷胺、N-(2，2-二甲氧乙基)十二烷胺、N-乙基-N-(十二烷基)乙醇胺、N-乙基-N-(2-甲氧乙基)十二烷胺、N-乙基-N-(2，2-二甲氧乙基)十二烷胺、二甲基十二烷胺-N-氧化物、單十二酰氨基賴氨酸、二十六酰賴氨酸、十二烷胺、十八烷胺、苯乙胺、三乙胺、PEG-2齊墩果烷、PEG-5齊墩果烷、十二烷基2-(N，N-二甲氨基)丙酸鹽、二(2-羥乙基)油胺及其復(fù)合物。
典型的伯胺包括2-氨基乙醇、2-氨基庚烷、2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、n-戊胺、苯甲胺、1，4-丁二胺、n-丁胺、環(huán)己胺、乙胺、乙二胺、甲胺、α-甲基芐胺、苯乙胺、丙胺和三羥甲基氨基甲烷。
典型的仲胺包括含有以下基團的化合物，例如甲氨基、乙氨基、異丙氨基、丁氨基、環(huán)丙氨基、環(huán)己氨基、n-己氨基、苯氨基、苯甲氨基、氯乙基氨基、羥乙基氨基、等等。典型仲胺包括二乙醇胺、二乙胺、二異丙胺和二甲胺。
典型的叔胺包括含有以下基團的化合物，例如二丁基氨基、二甲基氨基、二異丙基氨基、乙基氯乙基氨基、乙基環(huán)丙基氨基、甲基己基氨基、甲基環(huán)己基胺、甲基炳基胺、甲基苯甲基胺、甲基-氯苯基胺、甲基環(huán)己基胺、甲基苯基胺、甲基甲苯?；?、等等。典型的叔胺包括N，N-二乙基苯胺、N，N-二甲基甘氨酸、三乙醇胺、三乙胺和三甲胺。
酰胺，是熟練技術(shù)人員偏愛的，具有R4--(CO)--NR5R6的分子結(jié)構(gòu)，其中R4、R5和R6通常選自H、烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基取代的烷基、單環(huán)芳基、和單環(huán)烷基取代的烷基。在此描述的合適的酰胺例子包括但不限于四氮六甲酰胺、四氮六甲烯酰胺、環(huán)己基十二酰胺、環(huán)己基王巴它酰胺、N，N-二甲基酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、N，N-二甲基辛酰胺、N，N-二甲基葵酰胺、二甲基-m-甲苯酰胺、二乙基-m-甲苯酰胺及其復(fù)合物。
在此描述的適于作為藥理學(xué)活性堿的含氮雜環(huán)包括，例如2-吡咯酮、1-甲基-2-吡咯酮、5-甲基-2吡咯酮、1，5-二甲基-2-吡咯酮、1-乙基-2-吡咯酮、1-丙基-3-十二烷基吡咯酮、1-dodecyclazacycloheptan-2-one、乙烯硫脲、乙內(nèi)酰脲、乙二酰脲、咪唑啉脲、N-十八烷基嗎啉、十二烷基吡啶、N-十二烷基吡咯烷、N-十二烷基哌啶、N-十二烷基二哌啶及其復(fù)合物。
芳香族含氮雜環(huán)通常含有一個5元-或6元-取代基，或一個二環(huán)融合的環(huán)或5元或6元連接的環(huán)，例如咪唑基、吲哚基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、喹基，四唑基、1，2，4-三唑基等。
在此描述的適于作為有機堿的芳香族含氮雜環(huán)包括，例如，2-氨基-吡啶、苯并咪唑、2，5-二氨基嘧啶、2，4-二甲基咪唑、2，3-二甲基吡啶、2，4-二甲基吡啶、3，5-二甲基吡啶、咪唑、甲氧吡啶、γ-甲基吡啶、2，4，6-三甲基吡啶及其復(fù)合物。
非芳香族含氮雜環(huán)，通常含有4元到6元環(huán)，例如乙酰亞胺基、嗎啡基、內(nèi)酰胺和酰亞胺(例如γ-丁內(nèi)酰胺、ε-己內(nèi)酰胺、N-苯基-β-丙內(nèi)酰胺)、苯二(甲)酰亞氨基、哌啶基、哌基、哌嗪基、吡咯基、琥珀酰亞胺基等。
非芳香族含氮雜環(huán)包括，例如1，2-二甲基哌啶、2，5-二甲基哌嗪、1，2-二甲基吡咯、1-乙基哌啶、n-甲基吡咯、嗎啡、哌嗪、哌啶、吡咯、2，2，6，6-四甲基哌啶及其復(fù)合物。
對于所有在此描述的藥理學(xué)活性堿，任何特定試劑的最佳用量依賴于堿性的強弱，堿的分子量，和其它因素，例如所給予藥物仲可電離位點的數(shù)目乙基制劑或貼片中其它任何酸性種類。熟練技術(shù)人員可以輕易確定任何特地果農(nóng)試劑的最佳用量，保證制劑在皮膚表面達到有效pH，制劑一旦使用，pH范圍在7.5到13.0左右，傾向于8.0到11.5左右，8.5到10.5左右的范圍更佳。這樣依次保證達到最大的治療水平，同時排除對身體表面的損傷可能性或者至少使其大幅度降低。
在局部用制劑的組合物中，活性試劑可以分散在乳膏、軟膏、蠟或其它液體或半液體狀溶液中，這樣，乳膏或軟膏或洗液或蠟或液體的局部用制劑可以將活性試劑帶到患者生物學(xué)表面上或內(nèi)部。在此使用的術(shù)語”生物學(xué)表面”設(shè)想了器官外部或內(nèi)部任何表面。例如，本發(fā)明的局部用制劑的“生物學(xué)表面”可能用于包括任何上皮表面例如皮膚呼，吸道，胃腸道，包括口腔粘膜和生殖泌尿道。術(shù)語“局部用藥”包括，在生物學(xué)表面的睪丸內(nèi)給藥，以及腦裂或裂縫給藥。
一個“局部用制劑”通常含有一個局部治療用的藥學(xué)可接受的載體，包括但不限于中性無菌乳膏、乳膏、洗液、蠟、膠、膠狀物，軟膏、糊、煙霧劑、貼片、粉末，和/或其復(fù)合物。首選藥學(xué)可接受的載體有乳膏，例如Cetaphil Moisturising Cream(Galderma Laboratories，L.P.)，QV cream(Lision Hong)，Sorbolene等等。在另一個具體實施方案中，藥學(xué)可接受的載體有洗液，例如Alpha Keri Moisturising Lotion(Mentholatum)，DermaVeen Moisturing Lotion(DermaTechLaboratories)，QV Skin Lotion(Lision Hong)，Cetaphil MoisturingLotion(Galderma Laboratories，L.P.)等等。在另一個具體實施方案中，藥學(xué)可接受的載體包括油，例如emu oil。
乳膏是粘稠液或半固體乳狀液，水包油或油包水。膏基是水可洗的，由一個油相，一個乳化劑和一個水相組成。油相，也稱作“內(nèi)部”相，通常由凡士林和一個脂肪醇例如十二醇或十八醇組成。水相的體積通常超過油相，但不是必須的，通常包含一個稀釋劑。乳膏制劑中的乳化劑通常是非離子、陰離子、陽離子或兩性表面活性劑。
首選乳化劑包括，但不限于，脂肪醇聚氧乙烯醚(Peregal A-20)，硬脂酸例如聚乙二醇硬脂酸(軟化劑SG)，硬脂酸甘油酯和硬脂酸甘油酯的任何聚醇形式例如FEG-5硬脂酸甘油酯，十六醇，地蒽酚或其復(fù)合物。
首選油相成分包括，但不限于二甲基硅油，dimethiconol，環(huán)甲硅油，二異丙基己二酸，十六醇，十八醇，石蠟，凡士林，杏仁油和硬脂酸。
在特殊方面，水相成分包括但不限于純水，甘油(丙三醇)，丙二醇，對羥基苯甲酸乙酯和任何稀釋劑。
在某些具體方案中，乳膏進一步由一種或多種膜形成劑組成，但不限于聚丁烯酸甘油酯，丙烯酸酯/C10-30烷基丙烯酸雜合多聚體；抗氧化劑包括但不限于生育酚醋酸酯；防腐劑包括但不限于苯氧乙醇，苯甲醇；其它添加劑包括但不限于辛醚，EDTA二鈉，氫氧化鈉和乳酸。
在一個具體實施方案中，乳膏包括純水，聚丁烯酸甘油酯，丙二醇，凡士林，辛醚，PEG-5硬脂酸甘油酯，丙三醇，二甲基硅油，dimethiconol，十六醇，甜杏仁油，丙烯酸酯/C10-30烷基丙烯酸雜合多聚體，醋酸維生素E，苯氧乙醇，苯甲醇，EDTA二鈉，氫氧化鈉，乳酸。
在另一個具體實施方案中，乳膏包括甘油，輕質(zhì)液體石蠟，軟的白色石蠟，二甲基硅油，角鯊?fù)椋岵唇鸺柞ィ缺郊状肌?br> 軟膏是半固體制劑，通常以凡士林或其它石油衍生物為基礎(chǔ)。被熟練技術(shù)人員所偏愛的特定的軟膏基質(zhì)可以獲得最優(yōu)給藥，同時也可以獲得其它預(yù)期特征，例如軟化等等。同其它載體或介質(zhì)類似，軟膏基質(zhì)應(yīng)該是無活性、穩(wěn)定、無刺激性和不致敏的。軟膏基質(zhì)可以分成四類含油基質(zhì)；可乳化的基質(zhì)；乳劑基質(zhì)；和水溶性基質(zhì)。含油基質(zhì)包括，例如植物油，來自動物的脂肪，來自石油的半固體烴類?？扇榛幕|(zhì)，也是所謂的可吸收軟膏基質(zhì)，含少量的水或無水，包括例如硫酸羥基甘油三硬脂酸酯，羊毛脂，和吸水性軟石蠟。乳劑基質(zhì)是油包水(W/O)乳劑或水包油(O/W)乳劑，其中油成分包括，例如十六醇，單硬脂酸甘油酯，羊毛脂，和硬脂酸。首選水溶性基質(zhì)是從聚乙二醇中制備得到，具有不同的分子量。
膠是透明、粘性、果凍樣半固體或固體，高分子量聚合物分散在水基質(zhì)或醇基質(zhì)中得到。醇制膠需干燥、冷凍，最適于急性滲出性搔癢疹；非醇制膠更潤滑，適于頭皮中的干魚鱗狀損傷。
洗液，是用于皮膚表面而沒有摩擦的制劑，通常是液體或半液體制劑，其中的固體顆粒包括活性制劑，存在于水或醇基質(zhì)中。洗液通常是固體的懸浮液，對于現(xiàn)有的目的，傾向于由水包油型的液體油狀乳化劑組成。在此，對于治療大面積身體區(qū)域時，洗液是首選制劑，這是由于更具有流動性的制劑的使用方便性。洗液通常包括懸浮劑來獲得更好的分散，以及有利于在接觸皮膚時集中和貯存活性試劑的化合物，例如甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉等等。
貼片是半固體劑型，其中的活性試劑懸浮在一個合適的基質(zhì)中?；诨|(zhì)的性質(zhì)，貼片分為脂類貼片或從單相水凝膠獲得的貼片。脂類貼片中的基質(zhì)通常是凡士林、吸水性軟石蠟等等。從單性水相凝膠獲得的貼片通常摻入羧甲基纖維素等等作為基質(zhì)。
在一個實施方案中，可以單獨或和其它藥物或療法聯(lián)合使用本發(fā)明的藥物組合物，所述其它藥物或療法采用了和非人細(xì)胞系表達的蛋白質(zhì)或它的嵌合分子一樣的方式，例如大腸桿菌、酵母或CHO表達的蛋白質(zhì)或嵌合分子，用于單獨或和其它藥物一起治療疾病，所述疾病包括無β脂蛋白血癥、A-V、β-2-微球蛋白淀粉樣變性、A-T、A1AD、A1AT、Aagenaes、奧斯科格綜合征、阿-斯二氏綜合征、阿-史二氏綜合征、阿瑟綜合征、AAT、阿-考-利三氏綜合征、腹肌缺失綜合征、腹壁缺損、腹性癲癇、腹型偏頭痛、外展肌痙攣性發(fā)音困難、外張肌痙攣性發(fā)音困難、阿伯克龍比綜合征、眼瞼巨口綜合征、ABS、HPRT缺乏，胼胝體Schinzel Typ缺乏，四肢頭皮和顱缺損，無月經(jīng)Primar，HGPRT缺乏，Absorptive Hyperoxaluriaor Enteric、Abt-Letterer-Siwe病，ACADL、ACADM缺乏，ACADM、ACADS、刺狀紅細(xì)胞增多神經(jīng)病，刺狀紅細(xì)胞增多，大皰性表皮松解，黑棘皮癥(病)，大皰性棘層肥厚，帶有A型胰島素抵抗力的黑棘皮癥(病)，帶有B型胰島素抵抗力的黑棘皮癥(病)，棘皮痣，缺過氧化氫酶血癥，無過氧化氫酶癥，ACC、房室旁道、無頭畸形、帶有心臟缺陷ACF、弛緩不能、阿查德-梯綜合征、阿查德(馬凡變種)、阿沙爾氏綜合征、無膽色素尿性黃疸、軟骨成長不全、類型四軟骨成長不全、第三類軟骨成長不全、軟骨發(fā)育不全、軟骨發(fā)育不全遲緩、軟骨發(fā)育不全性侏儒、打噴嚏綜合征、色盲、全色盲者、全色盲、全色盲、消色痣、酸性神經(jīng)酰胺酶缺乏、酸性麥芽糖酶缺乏癥、酸性β-葡萄糖苷酶缺乏癥、酸血癥、酸血癥、丙二酸血癥偶發(fā)性共濟失調(diào)和虛弱、酸中毒、半肢畸形骨骺發(fā)育不良、ACM、聽神經(jīng)鞘瘤、聽神經(jīng)瘤、帶有下肢發(fā)育不全的尖頭多指(趾)并指(趾)畸型、尖頭多指(趾)并指(趾)畸型II、尖頭多指(趾)并指(趾)畸型IV、尖頭多指(趾)并指(趾)畸型III、后天失語驚厥癥、后天布朗綜合征、獲得性癲癇性失語、凝血因子XIII缺乏癥、后天形成的ACC(由感染引起的、而仍然是在子宮內(nèi))、獲得性高草酸鹽尿癥、獲得性低丙種球蛋白血癥、獲得性免疫缺陷綜合癥(艾滋病)、獲得性鐵超負(fù)荷、獲得性脂肪營養(yǎng)障礙、獲得性部分脂肪營養(yǎng)障礙、獲得性游動脾、ACR、肢端發(fā)育不全伴面部及生殖器畸形、Acro Renal、Acrocallosal Syndrome Schinzel Type、尖頭并指(趾)(畸形)、I型尖頭并指(趾)(畸形)、I型尖頭并指(趾)(畸形)亞型I、II型尖頭并指(趾)(畸形)、III型尖頭并指(趾)(畸形)、IV型尖頭并指(趾)(畸形)、V型尖頭并指(趾)(畸形)(ACS5或ACS V)亞型I、尖頭頭骨不對稱和輕度并指、尖頭、acrochondrohyperplasia、腸病性肢皮炎、肢端發(fā)育不全、肢端營養(yǎng)障礙性神經(jīng)病、面骨發(fā)育不全Nager型、面骨發(fā)育不全Postaxial型、面骨發(fā)育不全Genee-Wiedep型、肢皮早老家族、肢端肥大癥、紅斑性肢痛病、肢端肢中發(fā)育不全、肢端肢中段性侏儒、肢端過小癥骨骼發(fā)育不全、肢端過小癥發(fā)育不良、帶有骨質(zhì)疏松的肢端溶骨癥和顱骨和下頜骨變化、肢端溶骨癥、肢端感覺異常、ACSI、ACS II型、ACS III型、ACS、ACS3、促腎上腺皮質(zhì)激素缺乏癥、行動肌陣攣、急性臂叢神經(jīng)炎綜合征、急性臂叢神經(jīng)根綜合征、急性腦戈謝病、急性膽管炎、急性播散腦脊髓脊神經(jīng)根病、急性彌散性組織細(xì)胞增生癥X、急性出血性腦灰質(zhì)炎、特急性多發(fā)性神經(jīng)炎、急性免疫調(diào)解多發(fā)性神經(jīng)炎、小兒急性家族性腦中葉硬化、急性間歇性卟啉、急性卟啉癥、急性肉狀瘤病、急性肩神經(jīng)炎、急性中毒性表皮松懈、?；o酶脫氫酶缺乏長鏈、?；o酶脫氫酶缺乏短鏈、脂酰輔酶A二羥基丙酮?；D(zhuǎn)移酶、乙?；o酶A氧化酶缺乏、ADA、ADA缺乏、AdamComplex、亞-貝二氏綜合征、釉質(zhì)細(xì)胞瘤、Adams Oliver綜合征、自適應(yīng)結(jié)腸炎、ADD combined type、ADD、艾迪疾病帶有腦硬化、艾迪病貧血、艾迪生氏病、阿狄森(氏)貧血、腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、阿狄森(氏)惡性貧血、內(nèi)收拇指-精神發(fā)育遲緩、內(nèi)收肌痙攣性發(fā)音困難、內(nèi)收肌痙攣性發(fā)音困難、男性化老年婦女腺瘤、結(jié)腸與直腸腺上皮增生、結(jié)腸腺瘤息肉病、家族腺瘤性息肉、腺苷脫氨酶缺乏癥、腺苷基琥珀酸酶缺乏癥、多動癥主要動沖動型、多動癥為主心不在焉型、多動癥、蛛網(wǎng)膜粘連、艾迪綜合征、艾迪綜合征、艾迪緊張性瞳孔、艾迪瞳孔、adipogenital(拉)色素性視網(wǎng)膜炎多指、adipogenital(拉)色素性視網(wǎng)膜炎綜合征、Adiposa Dolorosa、痛性肥胖癥、肥胖性生殖器退化、青春期胱氨酸病、多囊腎、腎上腺皮質(zhì)腺瘤、腎上腺疾病、腎上腺皮質(zhì)功能亢進、引起垂體促腎上腺皮質(zhì)激素過剩、腎上腺發(fā)育不全、腎上腺功能不全、腎上腺腫瘤、腎上腺男性化、腎上腺-色素性視網(wǎng)膜炎-多趾綜合征、腎上腺皮質(zhì)功能不全、腎上腺皮質(zhì)功能減退、促腎上腺皮質(zhì)激素缺乏單獨的、(先天性)腎上腺性性腺綜合征、腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥、腎上腺髓周圍神經(jīng)病、腎上腺-色素性視網(wǎng)膜炎-多趾綜合征、成人胱氨酸病、成人皮肌炎、成人型低磷酸酯酶癥、成人黃斑變性、成人發(fā)病ALD、成年發(fā)病ceroidosis、成人發(fā)病髓質(zhì)囊性疾病、成人發(fā)病惡性貧血、成人發(fā)病辛德勒疾病、成年發(fā)病亞急性壞死性腦脊髓病、成人多囊腎病、成人發(fā)病髓質(zhì)囊性疾病、adynlosuccinate裂合酶缺失、AE、AEC綜合征、AFD、纖維蛋白原血癥、非洲肺鐵末沉著癥、AGA、無神經(jīng)節(jié)性巨結(jié)腸、老年黃斑變性、胼胝體發(fā)育不全、胼胝體發(fā)育不全、胼胝體發(fā)育不全-嬰兒痙攣眼異常、胼胝體發(fā)育不全和脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜異常、胼胝體發(fā)育不全-脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎、肥大細(xì)胞增生病、Agnosis Primary、AGR Triad、AGU、無腦回(畸形)、無腦回-巨腦回畸形頻段、AHC、AHD、AHDS、AHF缺乏、AHG缺乏、AHO、Ahumada Del Castillo、艾卡爾迪綜合征、AIED、AIMP、AIP、AIS、運動不能性癲癇發(fā)作、ALA-D卟啉病、無乳糖酶缺乏(癥)、Alagille綜合征、奧蘭島眼病(x連鎖)、alaninuria、埃爾伯-勛伯格疾病、白化、白化病、不完全白化病、奧爾布賴特遺傳性骨病、尿黑酸癥、酒精相關(guān)的出生缺陷、酒精胚胎病、酒精性肝硬化、Ald、ALD、ALD、醛固酮、帶有血壓正常的醛甾酮增多癥、先天性白內(nèi)障、亞歷山大病、亞力山大病(嬰兒型腦白質(zhì)營養(yǎng)不良)、痛性肌萎縮、痛覺神經(jīng)營養(yǎng)不良、黑尿癥、尿黑酸黃褐病、烷基DHAP合酶缺失、Allan-Herndon-Dudley綜合征、阿蘭-亨綜合征、阿蘭-亨-Dudley智力遲鈍、變應(yīng)性肉芽腫性血管炎、Cronkhite-加拿大的變應(yīng)性肉芽腫性血管炎、前腦無葉無裂畸形、斑禿、局限性脫發(fā)、局限性脫發(fā)、局限性脫發(fā)、脫發(fā)-白發(fā)(癥-皮紋葡萄膜炎-白癜風(fēng)-耳聾皮膚葡萄膜-O、脫發(fā)seminuniversalis、全禿、泛脫發(fā)、阿爾佩斯病、alpers彌漫性變性的腦灰質(zhì)與肝硬化、alpers進展的小兒灰質(zhì)營養(yǎng)不良(大腦)、甲抗胰蛋白酶缺乏癥、阿爾法-14糖苷酶缺乏癥、阿爾法-半乳糖苷酶缺陷、阿爾法-半乳糖苷缺硼、阿爾法高密度脂蛋白缺乏、α-L-海藻糖苷酶缺乏海藻糖苷(貯積)病3型、α-GalNAc缺陷Schindler型、α脂蛋白、甘露糖苷過多癥、α-N-乙酰半乳糖胺酶缺陷Schindler型、α-NAGA缺失Schindler型、α-神經(jīng)氨(糖)酸苷酶缺陷、α-地中海貧血/精神發(fā)育遲緩綜合征非缺失型、α脂蛋白、奧爾波特綜合征、ALS、alstroem氏綜合征、alstroem、alstrom綜合征、交替偏癱綜合征、兒童交替性偏癱、阿爾茨海默氏病、家庭性黑牙合性白癡、家庭性黑牙合性白癡成人、家庭性黑牙合性白癡小兒、外陰性別不明、AMC、AMD、成釉細(xì)胞瘤、釉質(zhì)生長不全、閉經(jīng)-溢乳nonpuerperal、閉經(jīng)-溢乳-FSH減少綜合征、閉經(jīng)、氨基酸失常、氨基酸-軟骨病-高磷酸鹽尿綜合征、AMN、羊膜穿刺、羊膜帶、羊膜帶綜合征、羊膜帶破裂復(fù)雜、羊膜帶序列、羊膜破裂序列、先天性截肢、AMS、阿姆斯特丹矮小綜合癥de Lange、淀粉-1、6-糖苷酶缺乏癥、長期血液透析淀粉關(guān)節(jié)、淀粉狀角膜營養(yǎng)不良、淀粉樣多神經(jīng)病、淀粉樣變性病、淀粉家族性地中海熱、支鏈淀粉病、先天性肌發(fā)育不全、肌萎縮側(cè)索硬化癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥、肌萎縮側(cè)索硬化癥-葡聚糖體、AN、AN1、AN2、肛門閉鎖、肛膜、肛門直腸畸形、肛門狹窄、Analine 60淀粉樣變性病、血(內(nèi))α-脂蛋白缺乏、analrectal、analrectal、多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、安德森病、安德森--法布里病、安徒生糖原病、安德森-華寶綜合征、安德烈綜合征、安德烈綜合征二型、雄激素不敏感、雄激素不敏感綜合征局部、雄激素不敏感綜合征局部、Androgenic Steroids、貧血自體免疫溶血性疾病、Anemia Blackfan Diamond、貧血、先天性的、拇指三節(jié)指骨綜合癥、溶血性貧血冷抗體、溶血性貧血帶有PGK缺失、惡性貧血、無腦畸形、angelman綜合征、血管骨肥大綜合征、血管濾泡淋巴結(jié)增生、血管血友病、血管角質(zhì)瘤體、漫性體血管角質(zhì)瘤、彌漫性血管角質(zhì)瘤、視網(wǎng)膜血管瘤病、淋巴血管瘤、血管神經(jīng)性水腫遺傳的、先天性外胚層缺陷、無汗性x連鎖外胚層發(fā)育不良、虹膜缺失、虹膜缺失-生殖器性別不清的精神發(fā)育遲滯、虹膜與精神發(fā)育遲滯、虹膜缺失-小腦共濟失調(diào)智殘、虹膜局部小腦共濟失調(diào)精神發(fā)育遲滯、虹膜局部小腦共濟失調(diào)智力發(fā)育不全、虹膜缺失型I、虹膜缺失型II、無虹膜-維爾姆斯腫瘤聯(lián)合征、無虹膜Wilms瘤-性腺胚細(xì)胞瘤、瞼緣粘連-外胚層發(fā)育缺陷唇裂/腭裂、強直性脊柱炎、Annular groves、無牙癥、真無牙、色弱、異常發(fā)育異常牙本質(zhì)、冠部牙本質(zhì)發(fā)育異常、命名性失語、無眼、肛腸、肛門直腸畸形、嗅覺喪失、前弓形腿伴隨侏儒癥、牙膜角膜營養(yǎng)不良、抗驚厥癥、抗Epstein-Barr病毒核抗原(EBNA)抗體缺陷、抗體缺乏、抗體缺乏帶有接近正常免疫球蛋白、抗血友病因子缺乏癥、抗血友病球蛋白缺乏癥、抗磷脂綜合征、抗磷脂抗體綜合征、抗凝血酶III缺乏、典型抗凝血酶III缺乏(I型)、抗胰蛋白酶缺失、Antley-Bixler綜合征、Antoni麻痹、脛不安、主動脈弓綜合征、主動脈及二尖瓣閉鎖合并左心綜合征、主動脈瓣狹窄、aparoschisis、APC、apeced綜合征、阿佩爾綜合征、aperts、失語、先天性顱外軸性發(fā)育不全、先天性皮膚發(fā)育不全、先天性皮膚發(fā)育不全并末端橫向肢體缺損、再生障礙性貧血、再生障礙性貧血先天性異常、APLS、呼吸暫停、Appalachian型淀粉樣變性病、蘋果皮綜合征、失用(癥)、頰面失用(癥)、結(jié)構(gòu)失用(癥)、Ideational失用(癥)、ideokinetic失用(癥)、觀念運動失用(癥)、馬達失用(癥)、眼球運動失用(癥)、APS、蛛網(wǎng)膜炎、蜘蛛足樣指/趾攣縮Beals型、蜘蛛足樣指/趾、蛛網(wǎng)膜囊腫、蛛網(wǎng)膜骨化、蛛網(wǎng)膜炎、Aran-Duchenne、阿-杜二氏肌萎縮、再生障礙性貧血、精氨酸缺失、精氨酸血(癥)、arginino succinase缺失、精氨琥珀酸酶缺乏癥、精氨基琥珀酸裂解酶缺陷癥、精氨基琥珀酸-ASL、精氨基琥珀酸合成酶缺乏、精氨(基)琥珀酸尿、Argonz-Del Castillo綜合征、無嗅腦[畸形]、亞美尼亞綜合征、阿諾德-基亞里畸形、阿諾德-加綜合征、ARPKD、肌陣攣性心律失常、右心室發(fā)育不良、肝動脈發(fā)育不良、動靜脈畸形、靜脈畸形腦、動脈炎巨細(xì)胞、關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合征、關(guān)節(jié)-齒-骨發(fā)育不良、關(guān)節(jié)眼病、先天性多發(fā)性關(guān)節(jié)松弛、遠(yuǎn)端、IIA型、ARVD、芳(香)基硫酸酯酶B缺乏癥、AS、ASA缺乏、上行性麻痹、ASD、房間隔缺損、ASH、子宮腔粘連綜合征、Ashkenazi型淀粉樣變性病、ASL缺乏、天冬氨?；咸烟前纺颉共窬C合征、艾斯伯格型自閉癥、窒息性胸廓發(fā)育不良、脾綜合征、ASS缺乏、哮喘、星形細(xì)胞瘤I級(良性)、星形細(xì)胞瘤II級(良性)、不對稱哭相心臟缺陷、非對稱性心室間隔肥厚、無癥狀胼胝、AT、AT III缺陷、AT III變體IA、AT III變體Ib、AT 3、共濟失調(diào)、共濟失調(diào)毛細(xì)血管擴張癥、共濟失調(diào)并乳酸酸中毒II型、共濟失調(diào)腦癱、衰弱性共濟失調(diào)、言語共濟失調(diào)、ATD、手足腦癱、皮炎濕疹、食管閉鎖伴有或不伴有食管氣管瘺、房間隔缺損、原始房間隔缺損、心房間隔和小室間隔缺損、心房撲動、心房顫動、心房-手指發(fā)育不良、房間隔缺損、房室傳導(dǎo)阻滯、房室管畸形、房室間隔缺損、諾里(氏)病、萎縮型腳氣病、橄欖萎縮、注意力缺陷障礙、注意缺陷障礙[伴多動]、減毒結(jié)腸腺瘤、非典型性淀粉樣變性病、非典型血癥、內(nèi)耳道閉鎖、耳顳綜合征、孤獨癥、自閉癥-艾斯伯格型、自閉癥癡呆共濟失調(diào)和目的性手部使用缺損、自閉癥兒童孤獨癥、自身免疫性艾迪生氏病、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、自身免疫性-多(種)內(nèi)分泌腺病-念珠菌病、自身免疫性多腺疾病I型、常染色體顯性遺傳白化病、常染色體顯性CompellingHelioophthalmic Outburst綜合征、常染色體顯性遺傳索蛋白遠(yuǎn)端肌病并遲發(fā)、常染色體顯性EDS、常染色體顯性eme ry-dreifuss型肌肉萎縮癥、常染色體顯性圓錐角膜、常染色體顯性佩-梅二氏腦硬化癥、常染色體顯性多囊腎病、常染色體顯性遺傳脊髓小腦變性、常染色體隱性遺傳無丙種球蛋白病、常染色體隱性遺傳中央核肌病、常染色體隱性遺傳康-許二氏綜合征、常染色體隱性遺傳EDS、常染色體隱性遺傳埃-德二氏肌營養(yǎng)不良、常染色體隱性遺傳形式的眼部白化、常染色體隱性遺傳胼胝發(fā)育不全、常染色體隱性圓錐角膜、常染色體隱性遺傳性多囊腎病、常染色體隱性遺傳重癥聯(lián)合免疫缺陷、AV、AVM、AVSD、AWTA、腋下膿腫、軸突性神經(jīng)病巨型、Azorean神經(jīng)疾病、B-K痣綜合征、Babinski-Froelich綜合征、BADS、baillarger氏綜合征、巴爾干疾病、巴-格二氏綜合征、球囊二尖瓣、巴洛病同心圓硬化、波羅的海肌陣攣性癲癇、bannayan-佐納納綜合癥(bzs)、bannayan-萊利-ruvalcaba綜合征、本蒂氏病、bardet-biedl綜合征、裸淋巴細(xì)胞綜合征、巴洛氏綜合征、巴[拉克爾]-西[蒙]二氏病、巴雷特食管、貝瑞特潰瘍、巴特綜合征、巴特氏綜合征、基底細(xì)胞痣綜合征、巴澤多病、巴-科綜合征、巴藤病、Batten-Mayou綜合征、Batten-Spielmeyer-Vogt病、貝敦特納氏綜合癥、貝敦特納型先天性肌病、Batten-Vogt綜合征、BBB綜合征、BBB綜合癥(opitz)、BBBG綜合征、BCKD缺失、BD、BDLS、BE、貝亞爾斯綜合征、貝亞爾斯綜合征、貝亞爾斯-赫克特綜合征、藍色橡皮皰樣痣綜合征、BEB、bechterew綜合征、貝克爾病、貝克肌營養(yǎng)不良、貝克爾痣、Beckwith Wiedemann綜合征、眼距過寬-尿道下裂綜合征、Begnez-Cesar綜合癥、Behcet綜合征、Behcet病、Behr1、Behr2、貝爾氏麻痹、良性黑棘皮病、良性星形細(xì)胞瘤、良性顱神經(jīng)腫瘤、良性胱氨酸病、良性自發(fā)性瞼痙攣、良性原發(fā)性震顫、良性家族性血尿、良性局灶性肌萎縮、ALS良性局灶性肌萎縮、良性腦積水、良性高活動度綜合征、角化良性黑棘皮病、良性陣發(fā)性腹膜炎、良性復(fù)發(fā)性血尿、良性復(fù)發(fā)性肝內(nèi)膽汁淤積、良性脊髓性肌萎縮癥并腓肥厚、良性對稱性脂肪過多癥、良性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、貝-賽二氏綜合征、伯杰氏病、腳氣、貝曼綜合征、貝爾納-霍內(nèi)爾綜合征、伯-蘇綜合征、貝斯聶癢疹、卵黃狀黃斑變性、β-丙氨酸-丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶、β-半乳糖苷酶缺乏莫基奧綜合征、β-葡糖醛酸酶缺乏、β氧化缺陷、β重型地中海貧血、β輕型地中海貧血、β-脂蛋白缺失、貝特倫肌病、Beuren綜合征、BH4缺乏癥、Biber-Haab-Dimmer角膜營養(yǎng)不良、二葉式主動脈瓣、Biedl-Bardet、雙歧腦顱、雙功能酶缺陷、雙側(cè)聽多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤病、雙側(cè)聽神經(jīng)瘤、無脾序列征、雙側(cè)腎發(fā)育不全、雙邊顳葉障礙、膽汁發(fā)作、葡萄糖苷酸(基)轉(zhuǎn)移酶缺陷I型、Binder綜合征、binswanger病、Binswanger腦病、生物素酶缺乏癥、鳥頭侏儒Seckel型、出生缺陷、胎記、雙顳鉗痕綜合征、心室纖維化、Bjornstad綜合征、B-K痣綜合征、黑鎖-白化病-耳聾sensoneural型(BADS)、布-戴二氏貧血綜合征、膿溢原發(fā)性關(guān)節(jié)炎、瞼裂狹小、下垂癥、倒轉(zhuǎn)型內(nèi)眥贅皮綜合征、瞼痙攣、瞼痙攣良性原發(fā)、口腔眼瞼痙攣、布累西格囊腫、BLFS、失明、Bloch-Siemens色素失調(diào)癥成黑素細(xì)胞增多病皮膚Linearis、Bloch-Siemens-Sulzberger綜合征、布洛赫-蘇茲貝格綜合征、血型、血型A、血型B、血型AB、血型O、布魯姆綜合征、Bloom-Torre-Mackacek綜合征、藍橡皮奶頭痣、青紫嬰兒、藍尿布綜合征、BMD、BOD、BOFS、骨腫瘤表皮樣囊腫息肉、邦-迪-布三氏綜合征、Bonnevie-Ulrich綜合征、遺傳性過早白發(fā)綜合征、梅-弗綜合征、BORJ、borjeson綜合征、伯-福-萊三氏綜合征、腦肝腎綜合征、Bowen-Conradi綜合征、Bowen-Conradi Hutterite、Bowen-Conradi型Hutterite綜合征、Bowman’s Layer、BPEI、BPES、臂叢神經(jīng)炎、臂叢神經(jīng)炎綜合征、臂叢神經(jīng)炎、臂叢神經(jīng)病變、臂缺血、布-德二氏綜合征、短頭(畸形)、短形型先天性、心動過緩、顱腦損傷因圍產(chǎn)期窒息、腦瘤、腦腫瘤良性、腦腫瘤惡性、支鏈α-酮酸脫氫酶缺乏癥、支鏈酮尿I、分支酶缺乏、Branchio-Oculo-Facial綜合征、branchio-oto腎發(fā)育不全、branchio-oto腎綜合征、branchiooculofacial綜合征、Branchiooculofacial綜合征、Brandt綜合征、brandywine型牙本質(zhì)發(fā)育不全、brandywine的型牙本質(zhì)發(fā)育不全、乳腺癌、良性復(fù)發(fā)性肝內(nèi)膽汁淤積綜合征、脆骨病、寬β脂蛋白病、寬拇指綜合癥、寬拇指和大腳趾特征的面部智力發(fā)育遲緩、寬拇指、Broca失語、Brocq-Duhring病、青銅色糖尿病、青銅色彌漫性硬化癥、褐色白化病、褐釉遺傳、布朗-塞卡爾(氏)綜合征、布朗綜合征、BRRS、勃魯格爾綜合征、Bruton無γ球蛋白血(癥)、BS、BSS、Buchanan綜合征、Budd綜合征、巴德-基亞里綜合征、Buerger-Gruetz綜合征、bulbospinal肌肉萎縮x連鎖、過勞綜合征、遺傳性大皰、大皰CIE、大皰性先天性魚鱗病樣紅皮癥、大皰性魚鱗病、大皰性類天皰瘡、Burkitt淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤非洲型、Burkitt淋巴瘤、非非洲型、BWS、Byler病、C綜合征、c1酯酶抑制因子異常II型血管性水腫、C1-INH、c1酯酶抑制因子缺乏I型血管水腫、C1NH、卡-里二氏病、CAD、CADASIL、CAH、跟骨外翻、calcaneovalgus、雙水焦磷酸鈣沉著、胼胝體發(fā)育不全和眼部異常、腓肥厚脊髓性肌肉萎縮癥、軀干發(fā)育異常、軀干侏儒癥、軀干綜合征、屈指-腭裂--畸形足、屈指有限顎偏移、彎肢性侏儒、肢體屈曲綜合征、肢體屈曲綜合征長肢型、卡-恩二氏病、Canada-Cronkhite疾病、卡納萬病、卡納萬病包括的、卡納萬腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、癌癥、癌癥家族綜合征Lynch型、cantrell綜合征、Cantrell-Haller-Rayich綜合征、Cantrell五聯(lián)癥、氨甲酰磷酸合成酶缺乏癥、碳水化合物缺陷糖蛋白綜合癥、碳水化合物缺陷糖蛋白綜合癥Ia型、碳水化合物誘發(fā)的高脂血癥、葡萄糖乳糖的碳水化合物不耐受、二氧化碳酸中毒、多重羧化酶缺陷、心肢綜合征、心聽覺綜合征、Jervell and and Lange-Nielsen的cardioauditory綜合征、心臟皮膚綜合征、心-面-皮膚綜合征、心面綜合征Cayler型、II型糖原貯積病、心肌疾病著色斑病、心肌病、心肌病并索蛋白存儲肌病、心肌病由于索蛋白缺陷、心肌病-中性粒細(xì)胞減少癥、心肌病-中性粒細(xì)胞減少癥致死小兒心肌病、心臟病淀粉樣變性、賁門痙攣、cardocardiac綜合征、肉堿-?；舛緣A易位酶缺乏、肉堿缺乏和紊亂、肉堿缺乏癥原發(fā)、肉堿缺乏癥繼發(fā)、肉堿缺乏癥繼發(fā)到MCAD缺乏、肉[毒]堿缺乏病、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I&II(cPTI&II)、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶缺乏、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶缺乏I型、肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶缺乏I型包括良性典型肌肉形式包括嬰幼兒重癥形式、肉堿運輸缺損(原發(fā)性肉堿缺乏癥)、肌肽酶缺乏癥、肌肽血、卡羅利病、卡彭特綜合征、卡彭特的、軟骨-毛發(fā)發(fā)育不全、castleman病、castleman病透明血管型、castleman病漿細(xì)胞型、Castleman腫瘤、貓眼綜合征、貓哭綜合征、catalayse缺失、Cataract-牙科綜合征、Cataractx連鎖梅毒性牙、兒茶酚胺類激素、catel-manzke綜合征、catel-manzke型palatodigital綜合征、尾發(fā)育異常、尾發(fā)育不良序列征、尾部發(fā)育不全綜合征、灼痛綜合征成人、海綿狀血管瘤、海綿狀血管瘤、海綿狀血管瘤、海綿狀淋巴管、海綿狀畸形、cayler綜合征、Cazenave白癜風(fēng)、CBGD、CBPS、CCA、CCD、CCHS、CCM綜合征、CCMS、CCO、CD、CDGla、CDGlA、CDGS Ia型、CDGS、CDI、CdLS、腹腔疾病、口炎性腹瀉、腹腔口炎性腹瀉-皮炎、細(xì)胞免疫缺陷與嘌呤核苷磷酸化酶缺陷、celsus白癜風(fēng)、中樞性窒息、中央核疾病、中樞性尿崩癥、中央形成多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤、中樞通氣不足、中樞性睡眠呼吸暫停、遠(yuǎn)心脂肪營養(yǎng)障礙、中央核性、CEP、腦膨出、頭(與)胸廓脂肪營養(yǎng)障礙、神經(jīng)酰胺三己糖苷酶缺乏癥、小腦發(fā)育不全、小腦發(fā)育不全、小腦偏側(cè)味覺缺失、小腦發(fā)育不全、小腦蚓部發(fā)育不全、小腦蚓部發(fā)育不全-呼吸深快-幕式眼動共濟失調(diào)遲緩、小腦綜合征、Cerebellarparenchymal病IV、小腦髓部畸形綜合征、小腦眼皮膚毛細(xì)血管擴張、Cerebellarparenchymal病IV家族性的、橋小腦角腫瘤、腦蛛網(wǎng)膜炎、腦常染色體遺傳性腦血管病伴皮層下梗死和腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、Wernicke-Korsakoff綜合征、大腦性雙癱、大腦性巨人癥、腦缺血、腦血管畸形、腦性麻痹、腦oculorenal營養(yǎng)不良、腦眼面部骨骼綜合征、大腦-肋骨-下頜綜合征、腦肝腎綜合征、大腦黃斑變性、cerebromuscular營養(yǎng)不良Fukuyama型、腦(與)眼發(fā)育不全、腦(與)眼發(fā)育不全肌營養(yǎng)不良綜合征、腦-眼-面-骨骼綜合征、大腦視網(wǎng)膜動靜脈瘤綜合征、腦苷脂脂沉積、腦甙(沉積)病、腦-腱性黃瘤病、腦血管亞鐵鈣沉著、蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥成人形式、頸部肌張力障礙、頸部肌張力障礙、頸眼聽障礙綜合征、頸椎椎管狹窄癥、頸椎椎體融合、CES、CF、CFC綜合征、CFIDS、CFND、CGD、CGF、泛發(fā)Chalasodermia、Chanarin Dorfman病、Chanarin Dorfman綜合征、Chanarin Dorfman魚鱗癬癥、Chandler綜合征、Charcot病、夏-馬-圖三氏肌萎縮、圖思(氏)病、夏-馬-圖三氏病、圖思(氏)病、夏-馬-圖三氏病變種、Charcot-Marie-Tooth-Roussy-Levy病、CHARGE聯(lián)合征、Charge綜合征、CHARGE綜合征、chaund外胚層發(fā)育不良、切-東二氏綜合征、CSH綜合征、肉芽腫性唇炎、唇裂、chemke綜合征、Cheney綜合征、櫻桃紅點和肌陣攣綜合征、CHF、CHH、chiari病、chiari畸形I、chiari畸形、chiariI型(chiari畸形I)、chiariII型(chiari畸形II)、chiariI型綜合征、Chiari-Budd綜合征、希-阿二氏綜合征、chiari畸形II、兒童綜合征、兒童魚鱗癬癥、兒童綜合征魚鱗病、兒童腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥、兒童皮肌炎、兒童發(fā)型肌張力障礙、兒童周期性嘔吐、兒童巨軸索神經(jīng)病、兒童磷酸酶過低癥、兒童期肌營養(yǎng)不良、CHN、膽汁郁積、膽汁郁積遺傳型挪威型、肝內(nèi)膽汁淤積、新生兒膽汁郁積、口服避孕藥使用者膽汁郁積、膽汁郁積并周圍肺動脈狹窄、妊娠膽汁淤積、膽固醇碳鏈酶缺乏、斑點狀軟骨發(fā)育異常、亨納曼(氏)綜合征、胎兒軟骨營養(yǎng)障礙、軟骨營養(yǎng)不良性肌強直、軟骨營養(yǎng)障礙、軟骨營養(yǎng)障礙并畸形足、骺軟骨營養(yǎng)障礙、增生形式軟骨營養(yǎng)障礙、艾-范二氏綜合征、軟骨發(fā)育不全、chondrohystrophia、軟骨骨營養(yǎng)障礙、舞蹈病棘紅細(xì)胞增多癥、絨膜絨毛取樣、脈絡(luò)膜異常、脈絡(luò)膜異常并ACC、chorireninal缺損-Joubert綜合征、脈絡(luò)膜硬化、無脈絡(luò)膜、尖頭-多及并指/趾畸形綜合征、克-西-圖三氏綜合征、克-西-圖三氏綜合征、圣誕節(jié)病、克里斯馬斯病、3號染色體缺失遠(yuǎn)端3p、3號染色體遠(yuǎn)端3p單體性、3號染色體遠(yuǎn)端3q2重迭、3號染色體遠(yuǎn)端3q2三體、3號染色體單體3p2、染色體3q部分重疊綜合征、染色體3q、部分三體綜合征、3號染色體-三體性3q2、4號染色體4q31-qter缺失綜合征、4號染色體4q32-qter缺失綜合征、4號染色體4q33-qter缺失綜合征、4號染色體長臂缺失、4號染色體長臂缺失、4號染色體單體性4q、4號染色體單體性4q、4號染色體單體性遠(yuǎn)側(cè)4q、4號染色體部分缺失4p、4號染色體、局部短臂缺失、4號染色體部分單體遠(yuǎn)側(cè)4q、4號染色體部分單體4p、4號染色體部分三體4(q25-qter)、4號染色體部分三體4(q26 or q27-qter)、4號染色體部分三體4(q31 or 32-qter)、4號染色體部分三體4p、4號染色體部分三體4q2和4q3、4號染色體部分三體遠(yuǎn)端4、4號染色體環(huán)、4號染色體4q末端缺失綜合征、染色體4q綜合征、染色體4q綜合征、4號染色體三體4、4號染色體三體4p、4號染色體XY/47 XXY(Mosiac)、5號染色體單體5p、5號染色體、局部短臂缺失綜合征、5號染色體三體5p、5號染色體三體5p全部(5p11-pter)、5號染色體三體的5p部分(5p13或14-pter)、染色體5p綜合征、6號染色體部分三體6q、6號染色體環(huán)、6號染色體三體6q2、7號染色體上單體7p2、7號染色體部分短臂缺失(7p2-)、7號染色體終端7p缺失[del(7)(p21-p22)]、8號染色體單體8p2、8號染色體單體8p21-pter、8號染色體部分缺失(短臂)、8號染色體部分單體8p2、9號染色體完整三體9P、9號染色體部分缺失短臂、9號染色體部分單體9p、9號染色體部分單體9p22、9號染色體部分單體9p22-pter、9號染色體部分三體9P包括、9號染色體環(huán)、9號染色體四體9p、9號染色體四體9p鑲嵌、9號染色體三體9p(多個變種)、9號染色體三體9(pter-p21到q32)包括、9號染色體三體鑲嵌、9號染色體三體鑲嵌、10號染色體遠(yuǎn)端三體10q、10號染色體單體、10號染色體單體10p、10號染色體、部分缺失(短臂)、10號染色體、10p-局部、10號染色體部分染色體10q24-qter、10號染色體三體10q2、11號染色體長臂部分單體、11號染色體部分單體11q、11號染色體部分三體、11號染色體部分三體11q13-qter、11號染色體部分三體11q21-qter、11號染色體部分三體11q23-qter、染色體11q、部分三體、12號染色體等臂染色體12p鑲嵌、13號染色體部分單體13q、13號染色體、長臂部分單體、14號染色體環(huán)、14號染色體三體、15號染色體遠(yuǎn)端三體15q、染色體r15、15號染色體環(huán)、15號染色體三體15q2、染色體15q、部分重疊綜合征、17號染色體中間缺失17p、18號染色體長臂缺失綜合征、18號染色體單體18p、18號染色體單體18Q、18號染色體環(huán)、18號染色體四體18p、染色體18q綜合征、21號染色體鑲嵌21綜合癥、21號染色體環(huán)、21號染色體易位21綜合癥、22號染色體倒重疊(22pter-22q11)、22號染色體部分三體(22pter-22q11)、22號染色體環(huán)、22號染色體三體鑲嵌、染色體48xxyy、染色體48xxxy、染色體r15、染色體三體化、染色體三體化、三倍體染色體綜合癥、x染色體、染色體XXY、慢性無膽色素尿性黃疸、慢性蛛網(wǎng)膜粘連、慢性腎上腺皮質(zhì)功能不全、慢性海綿體炎、先天性慢性再生障礙性貧血、慢性吞噬功能不全、家族性慢性肉芽腫、慢性家族性黃疸、慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(CFIDS)、慢性肉芽腫病、慢性格-巴二氏綜合征、慢性特發(fā)性黃疸、慢性特發(fā)多發(fā)性神經(jīng)炎(CIP)、慢性炎癥性脫髓鞘性多神經(jīng)病、慢性炎癥性脫髓鞘性神經(jīng)病、慢性運動性抽搐、慢性皮膚粘膜念珠菌病、慢性多發(fā)性抽動、慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎、慢性閉塞性膽管炎、慢性消化性潰瘍和食管炎綜合征、慢性進行性舞蹈病、慢性漸進性眼外肌麻痹綜合征、慢性漸進性眼外肌麻痹與肌病、慢性漸進性眼外肌麻痹并襤褸紅色纖維、慢性復(fù)發(fā)性神經(jīng)病、慢性肉樣瘤、慢性痙攣、兒童慢性嘔吐、CHS、丘-施二氏綜合征、瘢痕性類天皰瘡、CIP、肝硬化先天性色素、肝硬化、cistinuria、瓜氨酸血癥、CJD、典型Schindler病、典型型普綜合征、典型型Pfeiffer綜合征、典型血友病、典型形式科凱恩綜合征I型(A型)、典型利氏病、典型苯丙酮尿癥、典型x連鎖佩-梅二氏腦硬化、CLE、唇裂/腭裂粘液囊腫下唇PP指狀及生殖器異常、唇裂-腭裂瞼裂狹小兔眼及增寬、唇裂/腭裂大拇指畸形和小頭畸型、腭裂關(guān)節(jié)攣縮-擔(dān)架助步器畸形、腭裂和唇裂、鎖骨顱骨發(fā)育不全w/小頜(癥)、缺拇指&遠(yuǎn)端無指(趾)畸形、鎖骨發(fā)育不全、鎖骨顱骨發(fā)育不全、喀喇音雜音綜合征、CLN1、陣攣性痙攣、cloustons綜合征、畸形足、CMDI、CMM、CMT、CMTC、CMTX、COA綜合征、主動脈縮窄、科茨病、鵝卵石發(fā)育異常、Cochin Jewish病、科凱恩綜合征、COD-MD綜合征、COD、Coffin Lowry綜合征、Coffin綜合征、Coffin Siris綜合征、COFS綜合征、Cogan角膜營養(yǎng)不良、Cogan里斯綜合征、科恩綜合征、冷凝集素病、抗腎小球基膜抗體病、冷抗體溶血性貧血、潰瘍性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎、火棉膠嬰兒、缺損心臟缺損閉鎖鼻孔遲緩生長發(fā)育生殖泌尿系統(tǒng)異常及異常耳、缺損、結(jié)腸神經(jīng)官能癥、色盲、色盲、Colpocephaly、柱狀樣食管、結(jié)合錐桿細(xì)胞變性、聯(lián)合免疫缺陷與免疫球蛋白、聯(lián)合中外胚葉缺陷、常見變異型低丙種球蛋白血癥、常見變異型免疫缺陷病、共同心室、交通性腦積水、完全缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、完全性房室隔缺損、補體成分1抑制劑缺乏、補體成分c1調(diào)節(jié)成分缺失、完全性心臟傳導(dǎo)阻滯、復(fù)合碳水化合物不耐受、復(fù)雜的局部疼痛綜合征、復(fù)雜VATP合酶缺失、復(fù)合物I、復(fù)合物INADH脫氫酶缺陷、復(fù)合物II、復(fù)合物II丁二酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶缺乏癥、復(fù)合物III、復(fù)合物III輔酶Q10細(xì)胞色素c氧化還原酶缺陷、復(fù)合物IV、復(fù)合物IV細(xì)胞色素C氧化酶缺陷、復(fù)合物IV缺失、復(fù)合物V、腦震蕩、錐桿細(xì)胞變性、錐桿細(xì)胞變性進展的、錐體營養(yǎng)不良、錐桿細(xì)胞營養(yǎng)不良、匯合網(wǎng)狀乳頭狀瘤病、先天性低pk動力學(xué)、先天性無腹部肌肉、先天性無胸腺和甲狀旁腺、先天性色素缺乏、先天性艾迪生氏病、先天性腎上腺增生、先天性腎上腺增生、先天性無纖維蛋白原血癥、先天性肺泡換氣不足、新生兒先天性貧血、先天性雙側(cè)persylvian綜合征、先天性布朗綜合征、先天性心臟缺損、先天性中樞性低通氣綜合征、先天性大腦性麻痹、先天性頸椎骨連結(jié)、先天性拇指緊并智力發(fā)育遲緩、先天性攣縮性細(xì)長指(趾)、先天性多重攣縮并蜘蛛足樣指/趾、先天性發(fā)紺、先天性顱骨和頭皮缺陷、肝內(nèi)膽管先天性擴張、先天性髓鞘形成障礙、先天性吞噬功能不全、先天性發(fā)育異常血管擴張、先天性紅細(xì)胞生成性卟啉癥、先天性因子XIII缺乏癥、先天性無法自主控制呼吸、先天性家族性非溶血性黃疸I型、先天性家族拖延性腹瀉、先天性形式科凱恩綜合征II型(B型)、先天性泛發(fā)性纖維瘤病、先天性德國麻疹、先天性巨軸索神經(jīng)病、先天性心臟傳導(dǎo)阻滯、先天性心臟缺損、先天性Hemidysplasia并魚鱗樣紅皮癥及肢體缺損、先天性溶血性黃疸、先天性溶血性貧血、先天性肝纖維化、先天性遺傳性角膜變性、先天性遺傳性淋巴水腫.、先天性軟骨增殖過多、先天性hypomyelinating多發(fā)性神經(jīng)病、先天性hypomyelination神經(jīng)病、先天性hypomyelination、先天性hypomyelination(Onion Bulb)多發(fā)性神經(jīng)病、先天性魚鱗病樣紅皮癥、先天性圓錐角膜、先天性高乳酸血癥、先天性乳糖不耐受、先天性脂肪營養(yǎng)不良、先天性肝硬化、先天性肺葉氣腫、先天性局限性肺氣腫、先天性巨舌(癥)、先天性髓狹窄、先天性巨結(jié)腸癥、先天性色素痣、先天性中胚層dysmorphodystrophy、先天性中胚葉營養(yǎng)不良、先天性微絨毛萎縮、先天性多發(fā)性關(guān)節(jié)、先天性肌營養(yǎng)不良癥、hypomyelination所致先天性神經(jīng)病、先天性全血細(xì)胞減少、先天性惡性貧血、先天性惡性貧血由于缺乏內(nèi)因子、先天性惡性貧血由于缺乏內(nèi)因子、先天性色素沉著、先天性卟啉癥、先天性近位肌病并索蛋白存儲肌病、先天性肺氣腫、先天性純紅細(xì)胞貧血、先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血、先天性視網(wǎng)膜失明、先天性視網(wǎng)膜囊腫、先天性色素性視網(wǎng)膜炎、先天性視網(wǎng)膜劈裂、先天性Rod病、先天性風(fēng)疹綜合征、先天性頭皮缺損并遠(yuǎn)端肢體缺陷、先天性感覺神經(jīng)病、先天性SMA并關(guān)節(jié)彎曲、先天性球形紅細(xì)胞性貧血、先天性脊柱骨骺發(fā)育不良、先天性栓頸髓綜合征、先天性酪氨酸病、先天性水痘綜合征、先天性海綿狀血管畸形、先天性血管遮蔽視網(wǎng)膜、先天性字盲、先天性游動脾(兒科)、充血性心肌病、圓錐形角膜、結(jié)合性血膽紅素過多癥、結(jié)膜炎、結(jié)膜炎Ligneous、結(jié)膜-尿道-滑膜綜合征、Conn綜合征、結(jié)締組織病、康拉迪病、conradihunermann綜合征、全身再生障礙性貧血、體質(zhì)性紅細(xì)胞發(fā)育不全、體質(zhì)性濕疹、體質(zhì)性肝功能不全、體質(zhì)性血栓病血小板、制約先天性階、縮窄性心包炎并侏儒癥、連續(xù)肌纖維活動綜合征、攣縮性蜘蛛指(趾)綜合征、雙腳肌肉萎縮攣縮并動眼(運動)運用不能、瘈疭、Cooley貧血、銅運輸疾病、糞卟啉癥、三房心、三房心Sinistrum、三腔二房心、兩腔心、科里病、角膜營養(yǎng)不良、角膜淀粉樣變性病、角膜混濁-皮膚Laxa-智力發(fā)育遲緩、角膜營養(yǎng)不良、Cornelia de Lange綜合征、日冕牙本質(zhì)發(fā)育不全、冠心病、冠心病、胼胝體發(fā)育不全、皮質(zhì)基底神經(jīng)節(jié)變性、外皮畸形、皮質(zhì)基底神經(jīng)節(jié)變性(CBGD)、皮質(zhì)延髓變性、皮質(zhì)methloxidase缺乏I型、皮質(zhì)methyloxidase缺乏II型、皮質(zhì)醇、Costello綜合征、嬰兒猝死癥、COVESDEM綜合征、COX、COX缺失、COX缺陷法國加拿大型、COX缺陷嬰兒線粒體肌病包括deToni-Fanconi-Debre、COX缺陷型良性嬰幼兒線粒體肌病、CP、CPEO、CPEO并肌病、CPEO并襤褸紅色纖維、CPPD家族形式、CPT缺陷、CPTD、顱動脈炎、顱的腦膜腦膨出、Cranio-Oro-Digital綜合征、顱腕跗營養(yǎng)不良、腦膨出、頭蓋骨綜合征智力發(fā)育遲緩Scott型、顱面骨發(fā)育不全、顱面骨發(fā)育不全-PD動脈-多毛癥-唇發(fā)育不全、craniofrontonasal發(fā)育異常、顱骨干骺端發(fā)育不良、cranioorodigital綜合征、cranioorodigital綜合征II型、顱狹小crouzon型、顱狹小、顱縫早閉鼻孔閉鎖橈骨肱骨骨連結(jié)、顱縫早閉多毛癥面部及其他異常、顱縫早閉面中部發(fā)育不良及足部畸形、顱縫早閉原發(fā)、顱縫早閉-橈骨發(fā)育不良綜合征、顱縫早閉與橈骨缺損、顱裂(畸形)、CREST綜合癥、克羅伊茨費爾特-雅各布病、貓叫綜合征、嬰兒暴亡癥、克里格勒-納賈爾綜合征I型、克隆氏病、克-卡二氏綜合征、Cross綜合征、Cross綜合征、克-麥-布三氏綜合征、Crouzon、Crouzon綜合征、Crouzon顱面骨發(fā)育不全、冷球蛋白血癥原發(fā)性混合、隱眼并指綜合征、隱睪癥-侏儒-智力低下、施奈德(氏)結(jié)晶狀角膜營養(yǎng)不良、CS、CSD、CSID、CSO、CST綜合征、卷曲頭發(fā)融合瞼指甲發(fā)育異常、克-白-施三氏綜合征、Curth Macklin型魚鱗hystric、CurthMacklin型、Cushing’s、柯興氏綜合征、Cushing’s III、皮膚惡性黑色素瘤的遺傳、皮膚性卟啉病、皮膚松弛癥、皮膚松弛癥-生長缺失綜合征、先天性毛細(xì)血管擴張性大理石樣皮膚、CVI、CVID、CVS、周期性嘔吐綜合征、腎髓質(zhì)性疾病、水囊狀淋巴管瘤、囊性纖維化、囊性淋巴管瘤、胱氨酸-賴氨酸-精氨酸ornithinuria、胱氨酸貯積癥、阿-考-利三氏綜合征、胱氨酸尿、胱氨酸尿并雙堿基氨基酸尿癥、胱氨酸尿I型、胱氨酸尿II型、胱氨酸尿III型、先天性腎髓質(zhì)囊腫、細(xì)胞色素c氧化酶缺陷、D.C.、dacryosialoadenopathy、dacryosialoadenopathia、dalpro、道爾頓、色盲、Danbolt-Cross綜合征、眼跳跳腳綜合征、丹迪-沃克綜合征、丹迪-沃克囊腫、丹迪-沃克畸形、丹迪-沃克畸形、Danish心臟型淀粉樣變性病(型III)、達里耶病、Davidson病、Davies病、DBA、DBS、DC、DD、De Barsy綜合征、De Barsy-Moens-Diercks綜合征、德朗熱綜合征、De Morsier綜合征、De Santis Cacchione綜合征、凡科尼綜合征、先天性耳聾和功能性心臟病、耳聾-侏儒-視網(wǎng)膜萎縮、耳聾-功能性心臟病、耳聾指(趾)甲營養(yǎng)不良骨營養(yǎng)不良和智力遲鈍、耳聾與卷發(fā)Bjornstad型、神經(jīng)性耳聾與肛門閉鎖及姆指發(fā)育不全、脫支酶缺乏、年度性皮膚剝脫、腸細(xì)胞內(nèi)在因子受體缺乏、自然殺手細(xì)胞缺乏、肉堿腎重吸收缺損、糖蛋白唾液酸苷酶缺乏、線粒體呼吸鏈復(fù)合物IV缺陷、缺乏血小板膜糖蛋白ib、缺失血管假性血友病因子受體、短鏈?；o酶脫氫酶缺乏(ACADS)、肢中性侏儒畸形、退行性舞蹈病、退行性腰椎管狹窄癥、德戈斯病、Degos-Kohlmeier病、網(wǎng)狀色素沉著癥、DEH、代-羅二氏綜合征、德雅蘭-索塔斯病、9p缺失綜合征局部、11q缺失綜合征局部、13q缺失綜合征局部、delleman-oorthuys綜合征、delleman綜合征、癡呆并肺葉萎縮及Neuronal細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含物、脫髓鞘疾病、DeMyer綜合征、牙本質(zhì)發(fā)育不全牙冠、牙本質(zhì)發(fā)育不全牙根、牙本質(zhì)發(fā)育不全I型、牙本質(zhì)發(fā)育不全II型、牙本質(zhì)發(fā)育不全brandywine型、牙本質(zhì)發(fā)育不全遮蔽型、牙本質(zhì)發(fā)育不全III型、牙-眼-骨發(fā)育不全、dentooculocutaneous綜合征、Denys-Drash綜合征、二丙基醋酸鈉、DepakeneTM暴露、雙丙戊酸鈉、Depakote Sprinkle、去色-牙齦纖維瘤-小眼畸形、德卡姆病、異位性皮炎、剝脫性皮炎、皰疹樣皮炎、多態(tài)型皮炎、泛發(fā)性皮膚松馳、泛發(fā)性皮膚松馳、皮膚松垂、皮肌炎sine肌炎、皮肌炎、皮膚脆裂癥、皮膚口炎StevensJohnson型、Desbuquois夸綜合征、索蛋白存儲肌病、新生兒脫皮、綠色弱、發(fā)展性閱讀障礙、發(fā)育格斯特曼綜合征、德韋爾吉疾病、德維克病、視神經(jīng)脊髓炎、右位心-支氣管擴張和鼻竇炎、右位心并內(nèi)臟逆轉(zhuǎn)、DGS、DGSX Golabi-Rosen綜合征包括、DH、DHAP烷基轉(zhuǎn)移酶缺失、DHBS缺失、DHOF、DHPR缺失、尿崩癥、尿崩癥糖尿病視神經(jīng)萎縮和耳聾、尿崩癥垂體神經(jīng)部的、糖尿病胰島素依賴型、糖尿病、糖尿病艾迪生氏病水腫、糖尿病酸中毒、糖尿病長胡須婦女綜合征、糖尿病神經(jīng)病變、戴-布二氏貧血、膈肌呼吸暫停、骨干性續(xù)連癥、畸形性侏儒、骨畸形性發(fā)育不良、骨畸形性侏儒綜合征、二羧基氨基酸尿、脂肪酸β-氧化缺損造成的二羧酸尿癥、脂肪酸β-氧化缺損造成的二羧酸尿癥、MCADH缺損造成的二羧酸尿癥、二色性色盲、Dicker-Opitz、DIDMOAD、間腦綜合征、兒童間腦綜合征、消瘦間腦綜合征、Dienoyl-輔酶還原酶缺陷、嬰兒彌漫性腦變性、彌漫性腦變性疾病、彌漫性特發(fā)性骨質(zhì)增生、Diffusum-Glycopeptiduria、DiGeorge綜合征、Digital-Oro-Cranio綜合征、Digito-Oto-Palatal綜合征、Digito-Oto-Palatal綜合癥I型、Digito-Oto-Palatal綜合癥II型、二鹽生物蝶呤合成酶缺乏癥、二氫蝶啶還原酶缺乏癥、磷酸二羥丙酮合酶、擴張型(充血)心肌病、迪米特里疾病、腦性麻痹的雙側(cè)癱瘓、Diplo-Y綜合征、二糖酶缺失、二糖不耐癥I、盤狀紅斑狼瘡、盤狀紅斑狼瘡、DISH、角化病、角化病I型、角化病4、角化病6、角化病8、角化病9Netherton型、角化病11植烷酸型、角化病12(中性脂儲存型)、角化病13、角化病14、角化病14毛發(fā)硫營養(yǎng)障礙型、角化病15(角膜炎耳聾型)、角化病16、角化病18型變異性紅角皮病型、角化病19、角化病20、角化病24、脾臟移位、播散性紅斑狼瘡、播散性神經(jīng)性皮炎、多發(fā)性硬化、遠(yuǎn)端11q單體、遠(yuǎn)端11q綜合征、遠(yuǎn)端先天性多數(shù)關(guān)節(jié)彎曲IIA型、遠(yuǎn)端先天性多數(shù)關(guān)節(jié)彎曲IIA型、遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲IIA型、遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲2A型、遠(yuǎn)端重復(fù)6q、遠(yuǎn)端重疊10q、重復(fù)(10q)綜合征、遠(yuǎn)端重疊15q、遠(yuǎn)端單體9p、遠(yuǎn)端三體6q、遠(yuǎn)端三體10q綜合癥、遠(yuǎn)端三體11q、雙丙戊酸鈉、DJS、DKC、DLE、DLPIII、DM、DMC綜合征、DMC病、DMD、遺傳DNS、DOCI、DOC2、DOC4、DOC 6(Harlequin型)、DOC 8Curth-Macklin型、DOC 11植烷酸型、DOC 12(中性脂儲存型)、DOC 13、DOC 14、DOC 14毛發(fā)硫營養(yǎng)障礙型、DOC 15(角膜炎耳聾型)、DOC 16、DOC 16 UnilateralHemidysplasia型、DOC 18、DOC 19、DOC 20、DOC 24、竇勒氏體-脊髓病、dolichospondylic發(fā)育異常、細(xì)長指(趾)、細(xì)長指(趾)綜合征、顯型Kenny-Caffe綜合征、顯型先天性肌強直病、Donahue綜合征、Donath-Landsteiner溶血性貧血、多納-蘭茲泰納綜合征、耳聾-指(趾)甲發(fā)育不全-骨發(fā)育不全-智力發(fā)育遲緩綜合征、耳聾-指(趾)甲發(fā)育不全-骨發(fā)育不全-智力發(fā)育遲緩綜合征、DRD、DorfmanChanarin綜合征、Dowling-Meara綜合征、唐氏綜合癥、DR綜合征、drash綜合征、DRD、Dreifuss-Emery型肌肉萎縮癥與攣縮、心肌梗死后綜合征、漂移脾臟、藥物誘導(dǎo)的黑棘皮病、藥物誘導(dǎo)的紅斑狼瘡、藥物相關(guān)腎上腺功能不全、Drummond綜合征、干型腳氣病、干眼癥、DTD、Duane眼球退縮綜合征、杜安綜合征、杜安綜合征IA 1B和1C型、杜安綜合征2A 2B和2C型、杜安綜合征3A 3B和3C型、1867強森癥候群、杜賓-約翰遜綜合征、多博維茨綜合征、進行性假肥大性肌營養(yǎng)不良、Duchenne癱瘓、Duhring病、Duncan病、Duncan病、十二指腸閉鎖、十二指腸狹窄、十二指腸炎、重疊4p綜合征、重復(fù)6q局部、Dupuy綜合征、Dupuytren攣縮、Dutch-Kennedy綜合征、侏儒癥、侏儒癥campomelic、侏儒癥管狀骨皮層增厚及瞬時低鈣、侏儒癥Levi型、侏儒癥間向性、侏儒癥-甲發(fā)育不良、侏儒癥-心包炎、侏儒癥并腎萎縮和耳聾、侏儒癥并佝僂病、DWM、Dyggve MelchiorClausen綜合征、家族性自主神經(jīng)異常、家族性血β脂蛋白異常、dyschondrodysplasia并血管瘤、軟骨骨生成障礙、遺傳性泛發(fā)性色素異常病、頭顱異常和內(nèi)臟囊腫、先天性角化不良、先天性角化不良常染色體隱性遺傳、先天性角化不良斯科金斯型、先天性角化不良綜合征、毛囊角化不良Vegetans、誦讀困難、髓鞘形成不良性白質(zhì)營養(yǎng)不良、髓鞘形成不良性白質(zhì)營養(yǎng)不良-megalobare、痙攣性發(fā)音困難、亨納曼(氏)綜合征、骺骨發(fā)育異常Hemimelica、指甲發(fā)育異常并牙發(fā)育不全、鎖骨頭顱發(fā)育不全、纖維發(fā)育異常、發(fā)育異常巨人綜合癥X連鎖的、骨性牙質(zhì)發(fā)育異常、發(fā)育不良性痣綜合征、發(fā)育不良痣型、肌陣攣性小腦協(xié)同失調(diào)、食管協(xié)同失調(diào)、肌張力障礙、眥錯位、肥胖性生殖器退化、營養(yǎng)不良內(nèi)皮炎眼角膜、營養(yǎng)不良mesodermalis、營養(yǎng)不良性大皰性表皮松解癥、營養(yǎng)不良、窒息性胸廓、強直性肌營養(yǎng)不良、E-D綜合征、Eagle-Barrett綜合征、視網(wǎng)膜Eales、視網(wǎng)膜靜脈周圍炎、耳朵異常-攣縮-骨發(fā)育異常并脊柱后側(cè)凸、耳臏矮小綜合癥、早期約束缺陷、早期高鈣血綜合征并Elfin Facie、早發(fā)性肌張力障礙、Eaton Lambert綜合征、EB、Ebstein異常、EBV易感性(EBVS)、EBVS、ECD、ECPSG、外胚層發(fā)育不良、外胚層發(fā)育不全并唇裂和腭裂、外胚層發(fā)育不良-外分泌胰腺功能不全、外胚層發(fā)育不良Rapp-Hodgkin型、外胚層和中胚層發(fā)育不良先天性、外胚層和中胚層發(fā)育不良伴骨參與、多腔性糜爛性外胚葉病、晶狀體異位、膀胱外翻、異位ACTH綜合征、異位促腎上腺皮質(zhì)激素綜合征、肛門閉鎖、手先天性缺指、缺指(畸形)、缺指(趾)-外胚層發(fā)育異常-唇腭裂綜合征、缺指(趾)-外胚層發(fā)育異常-唇腭裂綜合征、缺指(趾)-外胚層發(fā)育異常-唇腭裂、濕疹、濕疹-血小板減少免疫缺陷綜合癥、EDA、EDMD、EDS、EDS動脈瘀斑型、EDS關(guān)節(jié)松弛、EDS典型嚴(yán)重形式、EDSdysfibronectinemic、EDS重型、EDS運動過度、EDS脊柱后側(cè)凸、EDS脊柱后側(cè)凸、EDS緩和型、EDS眼球脊柱側(cè)凸、EDS Progeroid、EDS牙周變性、EDS血管、EEC綜合征、EFE、EHBA、EHK、埃勒斯-當(dāng)洛綜合征、埃勒斯-當(dāng)洛綜合征、埃勒斯-當(dāng)洛IX、艾森曼格爾復(fù)征、艾森曼格爾復(fù)征、艾森曼格爾病、艾森曼格爾反應(yīng)、艾森門格綜合征、艾森門格綜合征、的ekman-lobstein疾病、手ektrodactyly、EKV、彈力纖維病、廣泛彈性組織(纖維)破裂、營養(yǎng)不良性彈性組織變性綜合癥、選擇性緘默癥(obsolete)、選擇性緘默癥、心電圖(ECG或EKG)、電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白(ETF)脫氫酶缺陷(GAII & MADD)、電生理研究(EPS)、出生象指甲、象皮病先天性血管瘤病、血管擴張性肥大、小精靈面容并高鈣血癥、埃-范二氏綜合征、埃-范二氏綜合征、胚組織瘤腎臟、胚性腺肌肉瘤腎、胚胎腎臟癌腎、胚胎混合腫瘤腎、EMC、Emery Dreyfus肌肉萎縮癥、埃-德二氏肌營養(yǎng)不良、金剛砂-dreifuss型綜合征、EMF、EMG綜合征、空蝶鞍綜合征、彌漫性軸周性腦炎、同心性軸周性腦炎、腦膨出、顱面血管瘤病、腦病、腦三叉神經(jīng)血管瘤病、內(nèi)生軟骨瘤病多發(fā)性海綿狀血管瘤、地方性多發(fā)性神經(jīng)炎、心內(nèi)膜墊缺損、心內(nèi)膜墊缺損、內(nèi)膜增生、心內(nèi)膜彈力纖維增生癥(EFE)、內(nèi)源性高甘油三酯血癥、內(nèi)淋巴水腫、子宮內(nèi)膜生長、子宮內(nèi)膜異位癥、心肌心內(nèi)膜纖維化、角膜內(nèi)皮先天性營養(yǎng)不良、內(nèi)皮角膜上皮營養(yǎng)不良、內(nèi)皮、恩格爾曼病、巨舌、小腸結(jié)腸炎、腸細(xì)胞維生素B12吸收不良、eosinophia綜合征、嗜酸性蜂窩組織炎、嗜酸性筋膜炎、嗜酸性肉芽腫、嗜酸性粒細(xì)胞綜合征、表皮痣綜合征、大皰性表皮松解、獲得性大皰表皮松解、遺傳性大皰性表皮松解、大皰性表皮松解致死的、表皮松解Hereditaria Tarda、表皮松解性角化過度(癥)、表皮松解性角化過度(癥)(大皰CIE)、奔馳性癲癇、癲癇、腎上腺素、骨骺變化和高度近視、骺軟骨瘤良性、Epiphysealis Hemimelica發(fā)育異常、偶發(fā)的異常眼球運動、上皮基底膜角膜營養(yǎng)不良、Meesmann青少年角膜上皮營養(yǎng)不良、多重上皮瘤病伴痣、上皮、Epival、EPS、男性Epstein-Barr病毒誘導(dǎo)淋巴增生癥、重癥肌無力綜合征、erdheim切斯特疾病、多形紅斑滲出、多形(性)紅斑Stevens Johnson型、erythroblastophthisis、胎兒紅細(xì)胞、新生兒紅細(xì)胞增多、兒童幼紅細(xì)胞增多貧血、紅細(xì)胞磷酸甘油酸激酶缺乏癥、不全性紅細(xì)胞發(fā)生、進行性紅斑角皮病對稱的、進行性紅斑角皮病對稱魚鱗病、變異性紅角皮病、變異性紅角皮病型、冬令紅斑角質(zhì)松解、紅細(xì)胞生成性卟啉病、紅細(xì)胞生成性卟啉病、埃斯科瓦爾綜合征、食道閉鎖、食管蠕動停止、食管炎消化性潰瘍、食道閉鎖及/或氣管食管瘺、家族性原發(fā)性血脂過多癥、原發(fā)性果糖尿癥、特發(fā)性血尿、自發(fā)性出血性血小板增多癥、特發(fā)性混合型冷沉淀球蛋白血癥、原發(fā)性moschowitz疾病、特發(fā)性血小板增多癥、特發(fā)性血小板減少、血小板增多癥、特發(fā)性震顫、酯酶抑制劑缺陷、范可尼貧血Estren-Dameshek變種、與雌激素有關(guān)的膽汁郁積、ET、ETF、ethylmalonic adipicaciduria、奧伊倫堡病、pc、EVCS、夸張驚跳反應(yīng)、露腦(畸形)、外源性高甘油三酯血癥、臍疝-巨舌-巨人綜合征、貧血性甲狀腺腫、膨脹風(fēng)疹綜合征、膀胱外翻、EXT、對外軟骨瘤病綜合癥、肝外膽管閉鎖、髓外漿細(xì)胞瘤、滲出性視網(wǎng)膜炎、眼睛后退綜合征、FA1、FAA、法布里病、FAC、FACB、FACD、FACE、FACF、FACG、FACH、面神經(jīng)麻痹、面神經(jīng)麻痹、面部外胚層發(fā)育不良、面部外胚層發(fā)育不良、面肩胛肱骨營養(yǎng)不良、面-耳-脊椎畸形譜、面-心-皮膚綜合癥、面-額-鼻發(fā)育不全、faciocutaneoskeletal綜合征、面-指(趾)-生殖器綜合征、面生殖發(fā)育異常、faciogenitopopliteal綜合征、faciopalatoosseous綜合征、faciopalatoosseous綜合征II型、面肩肱肌營養(yǎng)不良、人為低血糖癥、因子VIII缺陷、因子IX缺乏癥、因子XI缺乏癥、因子XII缺乏癥、因子XIII缺陷、基底節(jié)鈣化癥、基底節(jié)鈣化癥、胃分泌胃抗惡性貧血因子衰竭、Fairbank疾病、Fallot四聯(lián)癥、家族肢皮早老、家族肢端過小癥、家族性腺瘤性結(jié)腸息肉、家族性腺瘤息肉病并腸外表現(xiàn)、家族性前腦無葉無裂畸形、家族性α-脂蛋白缺乏癥、家族性肌萎縮舞蹈病并刺狀紅細(xì)胞增多、家族性肌陣攣心律失常、家族性關(guān)節(jié)軟骨鈣沉著、家族性非典型痣-惡性黑色素瘤綜合征、家族性寬β脂蛋白病、家族鈣痛風(fēng)、家族焦磷酸鈣關(guān)節(jié)病、家族性慢性阻塞性肺病、家族持續(xù)脫皮、家族性皮膚淀粉樣變性、家族性異常蛋白血癥、家族性肺氣腫、家族性腸病微絨毛、家族性中心凹注視視網(wǎng)膜先天性裂、家族冬眠綜合癥、家族性高膽固醇、家族性血色病、家族性高膽固醇血、家族性高密度脂蛋白缺乏癥、家族性高血清膽固醇、家族高脂血癥、家族低蛋白質(zhì)血癥并淋巴管炎腸病、家族性黃疸、家族性少年伴隨nephronophtisis的眼部異常、家族性苔蘚樣淀粉樣變性(IX型)、家族性腰椎管狹窄癥、家族性原發(fā)性淋巴水腫、家族性地中海熱、多發(fā)性家族性息肉病、家族性頸項皰、家族性發(fā)作性多漿膜炎、家族性結(jié)腸息肉、家族性原發(fā)性肺動脈高壓、家族性腎性糖尿、家族性脾性貧血、家族性駭病、家族性內(nèi)臟淀粉樣變性病(VIII型)、FAMMM、FANCA、FANCB、FANCC、FANCD、FANCE、Fanconi全骨髓病、Fanconi各類血細(xì)胞減少癥、FanconIII、Fanconi貧血、Fanconi貧血I型、Fanconi貧血互補群、Fanconi貧血互補群A、Fanconi貧血互補群B、Fanconi貧血互補群C、Fanconi貧血互補群D、Fanconi貧血互補群E、Fanconi貧血互補群G、Fanconi貧血互補群H、Fanconi貧血Estren-Dameshek變種、FANF、FANG、FANH、FAP、FAPG、Farber病、Farber脂肪肉芽腫、FAS、空腹性低血糖、脂肪所致高脂血癥、兒童致命肉芽腫病、脂肪氧化障礙、脂肪肝并腦病、FAV、FCH、FCMD、FCS綜合征、FD、FDH、發(fā)熱性皮膚粘膜綜合征Stevens Johnson型、發(fā)熱性中性急性皮膚病、熱性癲癇發(fā)作、Feinberg綜合征、范[辛格]-勒[羅伊]二氏綜合征、女性偽特納氏綜合癥、股骨發(fā)育不全雙邊Robin異常、股骨發(fā)育不全雙邊、股骨面綜合征、股骨發(fā)育不全-異常面容綜合征、胎兒酒精綜合征、胎兒抗驚厥劑癥、胎兒水囊狀淋巴管瘤、酒精胎兒效應(yīng)、水痘胎兒效應(yīng)、反應(yīng)停胎兒效應(yīng)、水痘-帶狀皰疹病毒胎兒效應(yīng)、心肌心內(nèi)膜纖維化、胎兒面部綜合征、胎兒虹膜炎綜合征、胎兒輸血綜合征、胎兒丙戊酸鹽綜合征、胎兒丙戊酸暴露綜合征、胎兒感染水痘、胎兒水痘帶狀皰疹綜合征、FFDD II型、FG綜合癥、FGDY、FHS、纖維蛋白穩(wěn)定因子缺乏癥、纖維形成酶缺失、星形(膠質(zhì))細(xì)胞纖維素變性、類(血)纖維蛋白腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、纖維蛋白連接酶缺失、成纖維細(xì)胞瘤、(胰管)粘稠物阻塞癥、(拉)進行性骨化性纖維發(fā)育不良、纖維彈性組織心內(nèi)膜炎、纖維肌痛、纖維肌痛-纖維肌炎、纖維肌炎、纖維化性膽管炎、纖維組織炎、多關(guān)節(jié)纖維性關(guān)節(jié)強硬、纖維性海綿體炎、纖維性結(jié)構(gòu)不良、陰莖纖維斑塊、陰莖纖維硬化、Fickler-Winkler型、菲德勒病、Fifth Digit綜合征、Filippi綜合征、芬蘭型淀粉樣變(V型)、第一級先天性心臟傳導(dǎo)阻滯、第一和第二鰓弓綜合征、Fischer綜合征、魚味綜合征、裂隙舌、腺癌綜合征、弗-謝二氏病、含黃素單氧化酶2、漂浮β-脂蛋白病、Floating-Harbor綜合征、游動脾、嬰兒松弛綜合征、瓣膜松弛綜合征、流利失語、FMD、FMF、FMO Adult LiverForm、FMO2、FND、局灶性腦缺血、局灶性真皮發(fā)育不全綜合征、局灶性真皮發(fā)育不全、局灶性皮膚指骨發(fā)育不全、局灶性肌張力障礙、病灶性癲癇、局灶性真皮面部發(fā)育不全II型、局灶性神經(jīng)性肌強直、FODH、苯丙酮尿性白癡綜合征、Fong病、FOP、福布斯病、福-奧二氏綜合征、forestier的疾病、福-埃二氏綜合征(X連鎖)、福瑟吉爾病、Fountain綜合征、進展性黃斑營養(yǎng)不良、FPO綜合征II型、FPO、Fraccaro型軟骨成長不全(IB型)、脆性X染色體綜合征、Franceschetti-Zwalen-Klein綜合征、Francois顱面骨畸型綜合征、Francois-Neetens斑點營養(yǎng)不良、斑點狀角膜營養(yǎng)不、弗雷澤綜合征、FRAXA、FRDA、Fredrickson型I高脂蛋白血癥、弗-謝二氏綜合征、Freire-Maia綜合征、弗雷氏綜合征、friedreich共濟失調(diào)、friedreich病、friedreich衰弱、FRNS、Froelich綜合征、弗-希二氏綜合征、弗-希二氏綜合征哺乳期子宮萎縮、額指(趾)綜合征、frontofacionasal發(fā)育不全、frontofacionasal發(fā)育異常、額鼻發(fā)育異常、額鼻發(fā)育異常并冠狀顱縫早閉、果糖-1-磷酸醛縮酶缺乏、果糖血癥、果糖尿癥、弗賴恩斯綜合征、FSH、FSHD、FSS、富克斯?fàn)I養(yǎng)不良、海藻糖苷(貯積)病1型、海藻糖苷(貯積)病2型、海藻糖苷(貯積)病3型、福原綜合征、Fukuyama病、Fukuyama型肌營養(yǎng)不良、延胡索酰乙酰乙酸酶缺失、溝舌、G綜合征、G6PD缺陷、G6PD、GA I、GA IIB、GA IIA、GA II、GAII & MADD、溢乳-閉經(jīng)綜合征nonpuerperal、溢乳-閉經(jīng)無懷孕、氨基半乳糖6-硫酸酯酶缺失、半乳糖-1-磷酸轉(zhuǎn)尿苷酰酶缺失、半乳糖血(癥)、GALB缺失、Galloway-Mowat綜合征、Galloway綜合征、GALT缺失、丙種球蛋白缺乏癥、GAN、神經(jīng)節(jié)苷脂神經(jīng)氨(糖)酸苷酶缺陷、神經(jīng)節(jié)苷唾液酸酶缺乏、神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥GM1 1型、神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥GM1 2型、神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥β己糖胺酶B缺乏、Gardner綜合征、脂肪軟骨營養(yǎng)不良、Garies-Mason綜合征、加瑟綜合征、胃內(nèi)因子未能分泌、腸細(xì)胞維生素B12、胃泌素瘤、胃炎、胃食管裂傷出血、胃腸道息肉及外胚層改變、胃十二指腸潰瘍、腹裂(畸形)、戈謝病、Gaucher-Schlagenhaufer、Gayet-Wernicke綜合征、GBS、GCA、GCM綜合征、GCPS、Gee-Herter病、季-塞二氏病、Gehrig病、南方網(wǎng)氏綜合征、Genee-Wiedemann綜合征、全身性肌張力障礙、泛發(fā)家族神經(jīng)性肌強直、泛發(fā)纖維瘤病、全身性屈曲癲癇、全身性糖原病、泛發(fā)性多汗癥、泛發(fā)脂褐質(zhì)沉積癥、泛發(fā)重癥肌無力、泛發(fā)肌強直、全身性散發(fā)神經(jīng)粘液瘤、遺傳疾病、生殖器缺陷、生殖系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)缺陷、格斯特曼綜合征、Gerstmann Tetrad、GHBP、GHD、GHR、巨軸突病、巨軸索神經(jīng)病、巨良性淋巴瘤、巨細(xì)胞成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、巨細(xì)胞動脈炎、巨細(xì)胞病變肝、巨細(xì)胞性肝炎、巨細(xì)胞新生兒肝硬化、視網(wǎng)膜巨大囊腫、巨淋巴結(jié)增生、巨血小板綜合征遺傳、巨舌、gic黃斑營養(yǎng)不良、Gilbert病、吉爾伯特綜合征、吉耳伯-德夫斯綜合征、Gilbert-Lereboullet綜合征、Gilford綜合征、Gilles de la Tourette綜合癥、Gillespie綜合征、牙齦纖維瘤病-異常手指指甲鼻子耳朵脾腫大、GLA缺乏、GLA、GLB1、青光眼、視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)瘤、完全失語、球樣細(xì)胞性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、舌下垂小頜(癥)及腭裂、葡糖腦苷脂酶缺失、葡糖腦苷脂沉積病、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥、6-磷酸葡萄糖運輸缺陷、葡萄糖-6-磷酸鹽轉(zhuǎn)移缺失、葡萄糖G磷酸酶缺乏癥、葡萄糖-半乳糖吸收不良、神經(jīng)酰胺脂沉積[癥]、戊二酸尿I、戊二酸血癥I、戊二酸血癥II、戊二酸尿II、戊二酸尿型II、戊二酸尿型III、戊二酸血癥I、戊二酸血癥II、戊二酸尿I、戊二酸尿II、戊二酸尿IIA型、戊二酸尿IIB型、戊二酰-輔酶A脫氫酶缺乏癥、glutaurate-天冬氨酸運輸缺陷、谷蛋白敏感性腸病、肌肉糖原病型VII、糖原累積病I、糖原累積病III、糖原累積病IV、糖原累積病v型、糖原累積病VI、糖原累積病VII、糖原累積病VIII、糖原累積病II型、糖原累積病型II、糖原病、糖原病I型、糖原病IA型、糖原病IB型、糖原病II型、糖原病II型、糖原病III型、糖原病類型IV、糖原病v型、糖原病VI型、糖原病型VII、糖原病型VIII、羥基乙酸尿癥、糖脂類脂沉著癥、GM2神經(jīng)節(jié)苷脂沉積癥1型、GNPTA、Goitrous自身免疫性甲狀腺炎、戈爾登哈(氏)綜合征、Goldenhar-Gorlin綜合征、Goldscheider病、戈爾茨綜合征、Goltz-Gorlin綜合征、性腺發(fā)育不全45X、性腺發(fā)育不全X0、前房角發(fā)育不良-牙發(fā)育不全、Goodman綜合征、Goodman、肺出血腎炎綜合征、戈登綜合征、Gorlin綜合征、格-肖-摩三氏綜合征、gottron進行性對稱性先天性紅斑角皮病、gottron氏綜合征、古-加二氏綜合征、癲癇大發(fā)作、顆粒型角膜營養(yǎng)不良、肉芽腫性動脈炎、肉芽腫性結(jié)腸炎、肉芽腫性皮炎并嗜曙紅細(xì)胞增多、肉芽腫性回腸炎、格雷夫斯病、格雷夫斯甲亢、格雷夫斯病、Greig頭多指綜合征、Groenouw I型角膜營養(yǎng)不良、Groenouw II型角膜營養(yǎng)不良、格-斯二氏綜合征、grotton綜合征、生長激素受體缺乏、生長激素結(jié)合蛋白缺失、生長激素缺乏癥、Myhre Growth-Mental缺失綜合征、發(fā)育遲緩-Rieger異常、GRS、gruber的綜合征、GS、GSD6、GSD8、GTS、鳥苷三磷酸環(huán)化水解酶缺失、鳥苷三磷酸環(huán)化水解酶缺失、Guenther卟啉病、蓋-斯二氏綜合征、Guillain-Barré、傳染性神經(jīng)元炎、先天性紅細(xì)胞生成性卟啉病、H病、H.Gottron綜合征、習(xí)慣痙攣、HAE、先天性因子XII缺乏癥、哈格曼因子、Haim-Munk綜合征、豪-謝綜合征綜合征、Ha jduCheney、HAL缺失、霍-帕二氏綜合征、哈-斯-弗三氏綜合征、哈-斯二氏綜合征、哈勒沃登-施帕茨病、哈-斯二氏綜合征、Hallopeau-Siemens病、拇重復(fù)軸后性多指癥及缺乏胼胝、Halushi-Behcet綜合癥、淋巴錯構(gòu)瘤、Hand-Schueller-Christian綜合征、HANE、Hanhart綜合征、快樂木偶綜合癥、原田綜合征、HardE綜合征、HARD綜合征、唇裂、斑色胎、Harlequin型DOC6、Harlequin型魚鱗病、Harley綜合征、Harrington綜合征、Hart綜合征、哈特奈撲病、哈特奈撲病癥、糙皮病-小腦共濟失調(diào)-氨基酸尿癥、Hashimoto病、Hashimoto-Pritzker綜合征、Hashimoto綜合征、Hashimoto甲狀腺炎、Hashimoto-Pritzker綜合征、Hay Well綜合征、外胚層發(fā)育不全海-韋綜合征、HCMM、HCP、HCTD、HD、心-手綜合征(Holt-Oram型)、心臟病、赫克特綜合征、HED、Heerferdt-Waldenstrom和Lofgren綜合征、hegglin病、heinrichsbauer綜合征、血管瘤、家族性血管瘤、血管瘤血小板減少綜合征、軟骨營養(yǎng)障礙性侏儒、血管瘤鰓裂唇pseudocleft綜合征、半面(身材)短小、Hemimegalencephaly、腦性麻痹輕偏癱、腦性麻痹偏癱、脊髓半切除、血色素沉著(癥)、血色病綜合征、透析相關(guān)性淀粉樣變、血紅蛋白觸控綜合征、溶血性貧血新生兒、冷溶血性貧血抗體、新生兒溶血病、溶血性尿毒癥綜合征、血友病、血友病A、血友病B、血友病B因子IX、血友病C、出血性血小板減少營養(yǎng)不良、Hemorrhagica Aleukia、鐵血黃素沉著病、肝果糖激酶缺失、肝磷酸激酶缺失、肝卟啉病、肝卟啉病、肝靜脈閉塞病、丙型肝炎、肝腎綜合癥、肝豆?fàn)詈俗冃浴epatophosphorylase缺失、肝腎糖原沉積病、肝腎綜合癥、肝腎酪氨酸血癥、遺傳紅斑性肢痛病、遺傳黑尿癥、遺傳性淀粉樣變性、遺傳性血管水腫、遺傳性Areflexic站立困難、多神經(jīng)炎型遺傳性運動失調(diào)、遺傳性共濟失調(diào)、遺傳性共濟失調(diào)脊髓小腦性共濟失調(diào)型、遺傳性良性黑棘皮病、遺傳性小腦共濟失調(diào)、遺傳性舞蹈病、遺傳性慢性進行性舞蹈病、遺傳性結(jié)締組織病、遺傳性糞卟啉癥、遺傳性糞卟啉癥、遺傳性皮膚惡性黑素瘤、遺傳性耳聾-視網(wǎng)膜色素變性、遺傳性缺鋅病、遺傳性DNS、遺傳性異位沉積癥、遺傳性肺氣腫、遺傳性果糖代謝紊亂、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張型I、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張型II、遺傳性出血性毛細(xì)血管擴張型III、遺傳性高尿酸血癥及舞蹈手足徐動癥、遺傳性薄紅細(xì)胞增多Major、遺傳性薄紅細(xì)胞增多Minor、遺傳性淋巴水腫.、遺傳性遲發(fā)性淋巴水腫、遺傳性遲發(fā)性淋巴水腫I型、遺傳性遲發(fā)性淋巴水腫II型、遺傳性運動感覺神經(jīng)病、遺傳性運動感覺神經(jīng)病I、遺傳性運動感覺神經(jīng)病III型、遺傳性腎炎、遺傳性腎炎并神經(jīng)性耳聾、遺傳性淀粉樣變性腎病、遺傳性腎病及耳聾、遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌、遺傳性非息肉性結(jié)腸直腸癌、遺傳性非球形紅細(xì)胞溶血性貧血、遺傳性甲-骨發(fā)育不良癥、遺傳性視神經(jīng)視網(wǎng)膜病、遺傳性結(jié)腸息肉、遺傳性感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)病I型、遺傳性感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)病II型、遺傳性感覺神經(jīng)和自主神經(jīng)病III型、遺傳性感覺運動神經(jīng)病、遺傳性感覺神經(jīng)病I型、遺傳性感覺神經(jīng)病I型、遺傳性感覺神經(jīng)病II型、遺傳性感覺神經(jīng)病第III類、遺傳性感覺根性神經(jīng)病變I型、遺傳性感覺根性神經(jīng)病變I型、遺傳性感覺根性神經(jīng)病變II型、遺傳性位點特異性癌癥、遺傳性球形紅細(xì)胞溶血性貧血、遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥、遺傳性高酪氨酸血癥1型、遺傳性結(jié)締組織病、致死性遺傳性大皰性表皮松解癥、Hermans-Herzberg斑痣性錯構(gòu)瘤病、海-普二氏綜合征、雌雄同體、帶狀皰疹、環(huán)狀皰疹Stevens-Johnson型、埃爾病、雜合子β地中海貧血、hexoaminidase α亞單位缺失(變異B)、hexoaminidase α亞單位缺失(變異B)、HFA、HFM、HGPS、HH、HHHO、HHRH、HHT、裂孔疝-小頭畸型-腎病Galloway型、化膿性汗腺炎、hidrosadenitis腋脈、hidrosadenitis化膿、出汗性外胚層發(fā)育不良、HIE綜合征、高肛門閉鎖、高鉀、高位肩胛、HIM、先天性巨結(jié)腸癥、獲得性先天性巨結(jié)腸癥、先天性巨結(jié)腸癥多指尺側(cè)&大趾和VSD、先天性巨結(jié)腸癥與D型短指、多毛癥、HIS缺乏、組氨酸氨裂解酶(HAL)缺失、組氨酸酶缺失、組氨酸血癥、組織細(xì)胞增多病、組織細(xì)胞增多病X、HLHS、HLP II型、HMG、HMI、HMSN I、HNHA、HOCM、霍奇金病、霍奇金病、何杰金氏淋巴瘤、Hollaender-Simons病、霍-艾二氏綜合征、全羧化酶合成酶缺乏癥、前腦無裂畸形、前腦無裂畸形復(fù)雜、前腦無裂序列征、霍-奧二氏綜合征、Holt-Oram型心-手綜合征、血(內(nèi))高胱氨酸過多、高胱氨酸尿癥、尿黑酸氧化酶缺乏、homogentisicacidura、純合甲抗胰蛋白酶缺乏癥、HOOD、霍內(nèi)爾綜合征、Horton病、HOS、HOS1、Houston-Harris型Achrondrogenesis(IA型)、HPS、HRS、HS、HSAN I型、HSAN II型、HSAN-III、HSMN、HSMN III型、HSNI、HSN-III、Huebner-Herter病、Hunner’s Patch、hunner潰瘍、亨特綜合癥、Hunter-Thompson型肢端肢中發(fā)育不全、亨廷頓舞蹈病、亨廷頓舞蹈病、第I型粘多糖增多癥、赫爾利綜合征、胡-射二氏綜合征、HUS、郝-吉二氏早衰綜合癥、郝-吉二氏綜合征、郝-韋-普三氏綜合征、Hutterite綜合征Bowen-Conradi型、Hyaline Panneuropathy、積水性無腦(畸型、腦積水、腦積水無腦回(畸形)和視網(wǎng)膜發(fā)育異常、腦積水內(nèi)部Dandy-Walker型、腦積水hydrocephalus非交通性腦積水Dandy-Walker型、腦積水、腎積水并奇特面部表情、羥化酶缺乏、頸部水囊瘤、Hyper-IgE綜合征、Hyper-IgM綜合征、醛甾酮過多癥、醛甾酮過多癥并血鉀過少Alkatosis、醛甾酮過多癥不伴隨高血壓、高氨血、氨[基]甲酰磷酸合成酶缺乏所致高氨血、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏所致高氨血、高氨血II型、超β肌肽血、體質(zhì)性肝機能不良、高膽紅素血II、家族性高鈣血癥與腎鈣質(zhì)沉著和尿藍母尿、高鈣血癥-supravalvar主動脈狹窄、Hypercalciuric佝僂病、血碳酸過多性酸中毒、分解代謝過度蛋白丟失性腸病、血氯過多性酸中毒、高膽固醇血癥、高膽固醇血癥類型IV、血(內(nèi))乳糜微粒過多癥、高胱氨酸血癥、hyperekplexia、可過度伸展關(guān)節(jié)、高球蛋白血癥性紫癜、血內(nèi)甘氨酸過多癥并酮癥酸中毒和乳酸酸中毒、血內(nèi)甘氨酸過多非酮癥、高促性腺素性功能減退癥、高免疫球蛋白E綜合征、超免疫球蛋白E-復(fù)發(fā)性感染綜合癥、血(清中)免疫球蛋白過多癥E-葡萄球菌性、高血鉀、運動機能亢進綜合征、Hyperlipemic視網(wǎng)膜炎、高脂血癥I、高脂血癥IV、高脂蛋白血癥型I、高脂蛋白血癥型III、高脂蛋白血癥型IV、高草酸尿、hyperphalangy-食指指彎曲并小頜舌下垂綜合征、高苯丙氨酸血癥、增殖性大皰性表皮松解、呼吸過度、高鉀血癥、血前β-脂蛋白過多、血脯氨酸過多(癥)I型、血脯氨酸過多(癥)II型、脾機能亢進、距增寬并食管畸形和尿道下裂、器官距離過遠(yuǎn)-尿道下裂綜合征、肥厚性心肌病、肥大性間質(zhì)性神經(jīng)病、增生性間質(zhì)性神經(jīng)炎、間質(zhì)性增生性神經(jīng)根神經(jīng)病、refsum肥厚性神經(jīng)病、肥厚型梗阻性心肌病、高尿酸血癥舞蹈手足徐動癥自殘綜合征、高尿酸血癥-智力發(fā)育不全、高纈氨酸血、鈣化不全(無機鹽不足)型、軟骨形成不足、hypochrondroplasia、血(內(nèi))丙種球蛋白過少、嬰兒暫時性血(內(nèi))丙種球蛋白過少、hypogenital營養(yǎng)不良并糖尿病傾向、缺舌-缺指(趾)綜合征、低血糖癥、外源性低血糖、低血糖癥并巨舌(癥)、hypoglycosylation綜合征1a型、hypoglycosylation綜合征1a型、性腺機能減退并嗅覺喪失、低促性腺素功能減退癥和嗅覺喪失、少汗性外胚葉發(fā)育不全、汗外胚層發(fā)育異常癥常染色體顯性遺傳型、汗外胚層發(fā)育異常癥常染色體顯性遺傳型常染色體顯性型、低鉀血、低鉀血癥性堿中毒與多鈣尿、低鉀血綜合征、腸乳糖酶缺、Hypomaturation型(乳白色牙)、Ito黑色素過少癥、短肢-稀毛-面部血管瘤綜合征、hypomyelination神經(jīng)病、甲狀旁腺功能減退、磷酸酶過少癥、磷酸鹽血癥性佝僂病并高鈣血癥、色素沉著不足、色素減少黃斑病變、降口角肌發(fā)育不全與心臟缺陷、再生不良性貧血、先天性發(fā)育不全性貧血、發(fā)育不全性軟骨營養(yǎng)障礙、發(fā)育不全牙釉質(zhì)-甲松離-少汗、發(fā)育不全(發(fā)育不全-explastic)型、左心發(fā)育不良綜合征、發(fā)育不全-(拇指)三指節(jié)畸形、低血鉀癥、尿道下裂-吞咽困難綜合征、嗅覺減退、下丘腦錯構(gòu)母細(xì)胞瘤腦下垂體機能減退肛門閉鎖多指、丘腦-幼兒肥胖癥、甲狀腺機能減退、肌張力減退-智力減退-性腺機能減退性肥胖綜合癥、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶缺損(完全缺失)、I-細(xì)胞病、醫(yī)源性低血糖癥、IBGC、IBIDS綜合癥、IBM、IBS、IC、I-細(xì)胞病、ICD、ICE綜合征Cogan-Reese型、冰島型淀粉樣變性病(型VI)、I-細(xì)胞病、魚鱗病樣紅皮癥角膜參與和耳聾、魚鱗病樣紅皮毛發(fā)生長異常及男性、魚鱗病樣紅皮癥與白細(xì)胞空泡形成、魚鱗病、先天鱗癬、先天性魚鱗并毛發(fā)硫營養(yǎng)障礙癥、豪豬狀魚鱗病、豪豬狀魚鱗病、迂回線狀魚鱗病、單純魚鱗病、魚鱗病Tay綜合征、尋常性魚鱗病、魚鱗癬中性脂質(zhì)貯積病、黃疸鉤端螺旋體病、黃疸鉤端螺旋體病、黃疸(慢性家族性)、新生兒重癥黃疸、黃疸intermittens juvenalis、原發(fā)性肺泡換氣不足、原發(fā)性淀粉樣變性、原發(fā)性Takayasu動脈炎、原發(fā)性基底神經(jīng)節(jié)鈣化(IBGC)、原發(fā)性臂叢神經(jīng)病變、原發(fā)性頸部肌張力障礙、原發(fā)性肺動脈擴張、原發(fā)性面神經(jīng)麻痹、原發(fā)性家族性高脂血癥、原發(fā)性肥厚性主動脈瓣狹窄、原發(fā)性低蛋白質(zhì)血癥、原發(fā)性免疫球蛋白缺乏癥、原發(fā)性新生兒肝炎、原發(fā)性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎、原發(fā)性周圍靜脈周圍炎、原發(fā)性肺纖維化、難治性原發(fā)性鐵粒幼紅細(xì)胞性貧血、原發(fā)性腎性血尿、特發(fā)性脂瀉、原發(fā)性血小板增多、原發(fā)性血小板減少性紫癜、原發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、IDPA、iga腎病、IHSS、回腸炎、回腸結(jié)腸炎、Illinois型淀粉樣變性病、ILS、IM、IMD2、IMD5、由于缺乏胸腺的免疫功能缺陷、免疫性溶血性貧血陣發(fā)性冷、免疫缺陷與運動失調(diào)性毛細(xì)血管擴張癥、免疫缺陷細(xì)胞并異常免疫球蛋白合成、免疫缺陷?？勺儾婚_分類、免疫缺陷與Hyper-IgM、免疫缺陷并白細(xì)胞減少、免疫缺陷-2、免疫缺陷-5(IMD5)、免疫球蛋白缺乏癥、肛門閉鎖、肛門閉鎖與手足和耳朵異常、閉鎖鼻淚管與早衰綜合征、無力中性白細(xì)胞綜合征、不能完全張口和短手指屈肌、INAD、先天性缺陷尿素合成精氨酸型、先天性缺陷UreaSynthesis Arginino Succinic型、先天性尿素合成氨甲酰磷酸型、先天性缺陷尿素合成瓜氨酸血癥型、先天性尿素合成谷氨酸合成型、INCL、包涵體肌炎、完全性房室隔缺損、不全睪丸女性化、色素失調(diào)癥、Incontinenti Pigmenti Achromians、食指異常并小頜舌下垂綜合征、印第安納型淀粉樣變性(第二類)、靜止性系統(tǒng)性肥大細(xì)胞增多癥、小兒后天失語、小兒常染色體隱性遺傳性多囊腎病、小兒腳氣、小兒腦神經(jīng)節(jié)苷脂、小兒大腦癱瘓、小兒阿-考-利三氏綜合征、小兒癲癇、小兒范科尼綜合征并阿-考-利三氏綜合征、嬰兒芬蘭型神經(jīng)元臘樣脂褐質(zhì)癥、小兒戈謝病、小兒低血糖、小兒hypophasphatasia、小兒肺葉肺氣腫、小兒肌陣攣性腦病、小兒肌陣攣性腦病并多肌陣攣、嬰兒型肌纖維瘤病、嬰幼兒壞死性腦病、嬰兒神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積癥、小兒神經(jīng)軸索營養(yǎng)不良、嬰幼兒發(fā)病Schindler病、小兒植烷酸貯積病、小兒雷夫敘姆病(IRD)、小兒sipoidosis GM-2gangliosideosis(s型)、小兒睡眠呼吸暫停、嬰兒痙攣癥、小兒脊髓性肌肉萎縮癥(所有類型)、小兒脊髓性肌萎縮癥ALS、小兒脊髓性肌萎縮型I型、嬰兒型神經(jīng)元臘樣脂褐質(zhì)癥、傳染性肝炎、炎癥性腸病、炎性乳腺癌、炎性線狀皮脂腺痣綜合征、枕骨裂腦露畸形、胰島素抵抗的黑棘皮病、胰島素性脂肪營養(yǎng)不良、胰島素依賴型糖尿病、意向肌陣攣、中間型胱氨酸病、中級楓糖尿癥、間歇性共濟失調(diào)與丙酮酸脫氫酶缺乏癥、間歇性槭糖尿病、腦內(nèi)積水癥、間質(zhì)性膀胱炎、間質(zhì)性中間缺失包括4q、腸原性脂肪代謝障礙、腸噬脂肉芽腫、腸淋巴管擴張癥、腸息肉I、腸息肉II、腸息肉III、腸息肉病-皮膚色素沉著綜合癥、腸假性梗阻與眼外肌麻痹、顱內(nèi)新生物、顱內(nèi)腫瘤、顱內(nèi)血管畸形、子宮內(nèi)侏儒癥、子宮內(nèi)粘連、倒立微笑并隱匿性神經(jīng)性膀胱、Iowa型淀粉樣變性(IV型)、IP、IPA、虹膜角膜內(nèi)皮綜合征、虹膜角膜內(nèi)皮(ICE)綜合征Cogan-Resse型、iridogoniodysgenesis并軀體異常、虹膜萎縮并角膜水腫和青光眼、虹膜痣綜合征、鐵超負(fù)荷性貧血、鐵超負(fù)荷疾病、過敏性腸綜合征、過敏性大腸綜合征、isaacs綜合征、Isaacs-Merten綜合征、局部缺血性心肌病、隔離無腦回序列、異亮氨酸33淀粉樣變性、異戊酸輔酶A脫氫酶缺乏癥、異戊酸酸血癥、異戊酸血癥、異戊酰輔酶A羧化酶缺陷、ITO黑(色)素過少癥、ITO、ITP、IVA、Ivemark綜合征、iwanoff囊腫、Jackknife抽搐、Jackson-Weiss顱縫早閉、Jackson-Weiss綜合征、杰克遜氏癲癇病、雅各布森綜合征、雅-雷二氏綜合征、Jaffe-Lichenstein病、Jakob病、雅-克二氏病、Janeway I、Janeway丙種球蛋白異常血癥、Jansen干骺端成骨不全、Jansen型干骺端軟骨發(fā)育不良、亞-萊綜合征、頜動瞬目(反射)、JBS、JDMS、Jegher綜合征、空腸閉鎖、空腸炎、空腸回腸炎、耶韋爾和朗格-尼爾森綜合征、熱納綜合征、JMS、喬布綜合征、Job-Buckley綜合征、約-布二氏異常、John Dalton、約[翰遜]-斯[蒂文]二氏病、jonston脫發(fā)、Joseph病、Joseph病I型、Joseph病II型、Joseph病III型、Joubert綜合征、Joubert-Bolthauser綜合征、JRA、Juberg Hayward綜合征、Juberg-Marsidi綜合征、Juberg-Marsigi智力遲鈍綜合征、法蘭西跳躍病、Maine法蘭西跳躍病、幼年型關(guān)節(jié)炎、幼年常染色體隱性遺傳性多囊腎病、幼年期胱氨酸病、幼年(兒童)皮肌炎(JDMS)、幼年糖尿病、幼年戈謝病、幼年痛風(fēng)舞蹈手足徐動癥和智力遲鈍綜合征、幼年維生素b12小腸吸收不良、幼年維生素b12小腸吸收不良、幼年性黃斑變性、青少年惡性貧血、青年性視網(wǎng)膜劈裂癥、青少年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、青少年脊髓性肌萎縮包括、青少年脊髓性肌萎縮包括ALS、青少年脊髓性肌萎縮III型、近關(guān)節(jié)痛性肥胖癥、腎小球旁增生、歌舞伎化妝綜合征、卡勒病、kallmann綜合征、Kanner綜合征、Kanzaki病、卡波疾病(非卡波西肉瘤)、κ輕鏈缺失、Karsch-Neugebauer綜合征、kartagener綜合征-慢性sinobronchial病和右位心、卡塔格納三聯(lián)征、卡-梅二氏綜合征、卡斯特綜合征、川崎病、川崎綜合癥、KBG綜合征、KD、Kearns-Sayre病、Kearns-Sayre綜合征、Kennedy病、Kennedy綜合征、Kennedy型脊髓延髓肌肉萎縮癥、Kennedy-Stefanis病、Kenny病、Kenny綜合征、Kenny型管狀骨(髓腔)狹窄(癥)、Kenny-Caffe綜合征、Kera.Palmoplant.Con.Pes Planus Ony.Periodon.Arach.、角膜炎魚鱗病耳聾綜合征、圓錐角膜、局限性后圓錐形角膜、角質(zhì)層分離、先天性剝脫性角質(zhì)松解、Winter去角質(zhì)紅斑、角膜軟化癥、毛囊角化病、脫發(fā)性小棘毛囊角化病、脫發(fā)性小棘毛囊角化病魚鱗病、角化黑棘皮病、角化病palmoplantaris與牙周病和甲彎曲、角化病palmoplantaris先天性扁平足甲彎曲牙周變性蜘蛛足樣指/趾、先天性角化病palmoplantaris、扁平足、鉤甲、牙周病、蜘蛛足樣指/趾、肢端溶骨癥、圖案狀紅色角化病、脂溢性角化病、酮酸脫羧酶缺陷、酮酸尿、酮癥甘氨酸血癥、KFS、KID綜合癥、腎臟發(fā)育不全、囊性腎臟視網(wǎng)膜發(fā)育不全Joubert綜合癥、Killian綜合征、Killan/Teschler-Nicola綜合征、Kiloh-Nevin綜合征III、發(fā)紐結(jié)病、舞蹈眼綜合征、kleeblattschadel畸形、克-列二氏綜合征、Kleine-Levin冬眠綜合癥、Klinefelter、克-費二氏綜合征、克-費二氏綜合征I型、克-費二氏綜合征II型、克-費二氏綜合征III型、Klippel Trenaunay綜合征、克-特-韋三氏綜合征、克-布二氏綜合征、KMS、Kniest發(fā)育不良、克尼斯克綜合征、克尼斯克病、Koebberling-Dunnigan綜合征、科-德二氏病、Kok病、Korsakoff精神病、korsakoff綜合征、Krabbe病包括、Krabbe腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、Kramer綜合征、KSS、KTS、KTW綜合征、庫夫斯病、庫-韋病、庫-威二氏綜合征、庫-蘭二氏麻痹、KWS、L-3-羥基-?；?輔酶a脫氫酶(LCHAD)缺陷、laband綜合征、Labhart-Willi綜合征、迷路綜合征、迷路積水、淚管-耳-齒-指(趾)綜合征、乳糖酶獨自不耐受、乳糖酶缺乏、哺乳期子宮萎縮、乳酸酸中毒萊伯遺傳性視神經(jīng)病、乳酸和丙酮酸酸血癥并碳水化合物靈敏感、乳酸和丙酮酸酸血癥并偶發(fā)性共濟失調(diào)和虛弱、乳酸和丙酮酸鹽、高乳酸血癥、成人不耐乳糖、乳糖不耐受、兒童不耐乳糖、LADD綜合征、LADD、拉福拉病包括、Lzfora小體病、拉-羅二氏因子缺乏癥、LAM、Lambert型魚鱗病、蘭伯特-伊頓綜合征、蘭伯特-伊頓肌無力綜合征、層狀隱性魚鱗病、層狀魚鱗病、Lancereaux-Mathieu-Weil螺旋體病、landau-kleffner綜合征、Landouzy Dejerine肌肉萎縮癥、Landry上行性麻痹、Langer-Salidino型軟骨發(fā)育不全(第二類)、Langer Giedion綜合征、蘭格漢斯細(xì)胞肉芳腫病、朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥(LCH)、大心房和心室缺損、拉倫侏儒癥、Laron型垂體性侏儒癥、拉爾森(氏)綜合征、喉張力障礙、拉塔病(在馬來西亞發(fā)現(xiàn))、晚期小兒神經(jīng)軸索營養(yǎng)不良、晚期小兒神經(jīng)軸索營養(yǎng)不良、遲發(fā)科凱恩綜合征三型(c型)、遲發(fā)性肌張力障礙、遲發(fā)性免疫球蛋白缺乏癥、遲發(fā)佩-梅二氏腦硬化、格子狀角膜變性、角膜網(wǎng)絡(luò)狀營養(yǎng)不良、Launois-Bensaude、洛-克二氏綜合征、Laurence綜合征、Laurence-Moon綜合征、勞-穆-鮑-比四氏綜合征、勞-賽二氏綜合征、LCA、LCAD缺失、LCAD、LCAD、LCADH缺乏、LCH、LCHAD、LCPD、熱納綜合征、leband綜合征、leber黑矇癥、leber先天性黑矇、黑矇癥、先天性柱錐體缺失、Leber′s先天性視網(wǎng)膜毯層變性、Leber′s先天毯視網(wǎng)膜發(fā)育異常、Leber’s病、Leber’s視神經(jīng)萎縮、Leber’s視神經(jīng)病，左心室纖維化、小腿潰瘍、Legg-Calve-幼年性變形性骨軟骨炎、Leigh’s病、Leigh’s綜合癥、Leigh’s綜合癥(亞急性壞死性腦脊髓病)、Leigh腦壞死、Lennox-Gastaut綜合征、雀斑-飲水過多-消化綜合癥(Lentigio-Polypose-Digestive Syndrome)、Lenz DysmorphogeneticSyndrome、lenz發(fā)育異常、lenz眼小畸形綜合癥、Lenz綜合癥、豹斑綜合征、矮妖精貌綜合征、柔腦脊膜血管瘤、鉤端螺旋體性黃疸、Leri-Weill Disease、Leri-Weill軟骨骨生成障礙、Leri-WeilSyndrome、萊穆瓦耶綜合征、Leroy Disease、Lesch Nyhan Syndrome，致死性嬰兒海蔥次苷甲肌病、致死性新生兒侏儒癥、致死性骨軟骨發(fā)育不良、累-賽二氏病(非類脂組織細(xì)胞增多病)、白細(xì)胞異常白化病、白細(xì)胞包埋伴隨血小板異常、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、腦白質(zhì)營養(yǎng)不良伴隨羅森塔爾纖維、Leukoencephalitis(腦白質(zhì)炎)PeriaxialisConcentric(集中性的)、舞蹈-棘狀細(xì)胞增多綜合征、果糖尿、Levy-Hollister綜合征、角膜緣帶肌營養(yǎng)不良、乳球蛋白、Lerbe氏遺傳性神經(jīng)病、左頸內(nèi)動脈、尖銳紅苔癬、尖銳苔癬、苔癬樣淀粉樣變性、扁平苔癬、苔癬銀屑病、Lignac-Debre-Fanconi Syndrome，利尼亞克-范科尼綜合征、木樣結(jié)膜炎、肢帶型肌營養(yǎng)不良、LimbMalformations-Dento-Digital Syndrome(四肢畸形...)，局限性糊精聚積病，線性痣黑素過度病、線狀痣Sebacous綜合癥、線形硬皮病，線性脂腺痣序列、線狀脂腺痣綜合征、舌裂、皺襞舌、裂縫舌、舌面運動障礙、Lip Pseudocleft-hemangiomatous Branchial CystSyndrome(唇假裂-血管瘤鰓裂囊腫綜合癥)、脂質(zhì)肉芽腫病、脂質(zhì)組織細(xì)胞增多病、角甙脂型、脂質(zhì)積累病、脂肪貯積肌病伴隨SCAD不足(Lipid-Storage myopathy Associated with SCAD Deficiency)、嬰兒神經(jīng)節(jié)苷脂沉積、Lipoatrophic糖尿病(Lipoatrophic DiabetesMellitus)、脂肪營養(yǎng)障礙、脂質(zhì)角膜營養(yǎng)不良、脂質(zhì)超常增生假兩性畸型(Lipoid Hyperplasia-Male Pseudohermaphrotitism)、先天性胰腺脂肪過多癥、脂粘多糖貯積病、Lipomyelomeningocele、脂蛋白酶缺失性家族性腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、激光同位素分離、LIS1、無腦回1、無腦回I型、無腦回異形伴隨胼胝體小腦發(fā)育不全或其他異常、小兒痙攣性雙側(cè)癱、肝磷酸化酶、肝、腎、脾、乳糖吸收障礙綜合癥、腦葉萎縮、智力腦葉萎縮、葉性前腦無裂畸形、嬰兒肺葉緊張肺氣腫、洛博斯泰因病(I型)、螯狀指畸形、局部大皰性表皮松解、局部脂肪營養(yǎng)障礙、局部肩帶骨神經(jīng)炎、呂夫勒菌病、呂夫勒菌心肌心內(nèi)膜纖維化伴隨嗜曙紅血球增多、呂夫勒菌壁性心內(nèi)膜炎、洛克恩綜合癥、高級洛克恩綜合癥、長鏈3-羥?；?輔酶A脫氫酶、長鏈脂酰輔酶A脫氫酶缺陷、長鏈脂酰輔酶A脫氫酶、長鏈酰基-CoA脫氫酶缺乏、無耳聾性QT綜合征、低血糖、低密度β-脂蛋白缺失、低位肛門閉鎖、低鉀綜合癥、眼腦腎綜合征Lowe’s Syndrome、Lowe-BickelSyndrome、Lowe-Terry-MacLachlan Syndrome，下腰痛、硫黃乳、白細(xì)胞三烯d、Lubs綜合征、勒夫特病、腰部椎管狹窄、腰椎管狹窄癥、腰骶椎管狹窄、Lundborg-Unverricht Disease、Lundborg-UnverrichtDisease Included、Lupus、狼瘡、紅斑狼瘡、Luschka-MagendieForamina Atresia、萊爾綜合征、中毒性表皮融解壞死、淋巴結(jié)樣的甲狀腺腫、淋巴管擴張的蛋白丟失性腸病、淋巴管平滑肌瘤、淋巴管平滑肌瘤、淋巴管瘤、淋巴管畸形、Lynch Syndromes，Lynch SyndromeI，Lynch Syndrome II，Schindler型溶酶體α-N-乙酰半乳糖胺酶缺失(Lysosomal Alpha-N-Acetylgalactosaminidase DeficiencySchindler Type)、Lysosomal Glycoaminoacid StorageDisease-Angiokeratoma Corporis Diffusum，溶酶體糖苷酶缺失、單關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)炎、Machado Disease、馬-約病、巨腦、巨頭畸形、巨頭畸形偏身肥大、巨頭畸形伴隨多發(fā)性脂肪瘤和Hemangiomata、巨頭畸形伴隨假視神經(jīng)乳頭水腫和Multiple(多重)Hemangiomata、巨球蛋白血癥、巨舌(癥)、巨舌-臍突出-內(nèi)臟肥大綜合癥、Macrostomia(巨口)Ablepheron Syndrome、Bernard-Soulier Type家族性巨血小板減少癥(Macrothrombocytopenia Familial Bernard-Soulier Type)、視網(wǎng)膜黃斑性退化、斑疹性淀粉樣變性、黃斑變性、盤狀黃斑變性、盤狀黃斑變性、盤狀黃斑變性、斑點狀角膜營養(yǎng)障礙、最大容許量、Madelung’s Disease、馬富奇綜合征(多發(fā)性軟骨瘤伴內(nèi)臟海綿狀血管瘤)、癲癇大發(fā)作、吸收不良、吸收不良-外胚層發(fā)育異常-鼻翼發(fā)育不全、Maladie de Roger，Maladie de Tics，瘧疾、雄性四肢和腎畸形、雄性性腺發(fā)育障礙癥、惡性棘皮癥、惡性黑棘皮病、惡性星形細(xì)胞瘤、惡性萎縮性丘疹病、惡性瘧、惡性高苯丙氨酸血、惡性高熱、惡性體溫過高、惡性黑色素瘤、中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤、馬洛里-魏斯二氏撕裂、馬洛里-魏斯二氏撕裂、馬-韋綜合征(賁門粘膜裂傷綜合征)、Mammary Paget’s Disease、下頜骨成釉細(xì)胞瘤、下頜面骨發(fā)育不全、甘露糖苷過多癥、面-點-指紋型角膜營養(yǎng)不良(Map-Dot-Fingerprint Type Corneal Dystrophy)、槭糖尿病、大理石狀骨、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(馬-米二氏綜合征)、馬卡斯·格恩頜動瞬目綜合癥、馬卡斯·格恩(氏)現(xiàn)象、馬卡斯·格恩下垂癥伴隨頜動瞬目反射、岡恩綜合征(單側(cè)瞼下垂時、患側(cè)上瞼與下頜聯(lián)合運動)、馬卡斯·格恩(頜動瞬目反射)綜合癥、馬卡斯·格恩下垂(伴隨頜動瞬目反射)、馬-沃二氏綜合征(常染色體隱性遺傳性多發(fā)性關(guān)節(jié)彎曲畸形)、馬-沃二氏結(jié)締組織病、馬方營養(yǎng)衰竭、馬方-Achard綜合癥、馬方綜合癥、馬方綜合癥I型、馬方變異體、馬方型運動過度綜合癥、邊緣部角膜營養(yǎng)不良、瑪麗共濟失調(diào)、瑪麗病、馬-施二氏病、MarieStrumpell Disease，馬-施二氏脊椎炎(關(guān)節(jié)強硬性脊椎炎)，馬-斯二氏綜合征(遺傳性共濟失調(diào)、白內(nèi)障、侏儒及智力缺陷綜合征)，馬-斯-格綜合癥、標(biāo)志X染色體綜合征、馬紹爾綜合征、Maroteaux LamySyndrome、Maroteaux Type Acromesomelic Dysplasia，馬紹爾外胚層發(fā)育不良伴隨視覺聽力缺陷、馬紹爾-史密斯綜合癥、馬紹爾綜合癥、馬紹爾型聾-近視-洪水-鞍鼻(Marshall TypeDeafness-Myopia-Cataract-Saddle Nose)、馬-奧綜合征(假副甲狀腺功能低減癥)、馬-貝綜合癥、Martorell綜合征、MASA Syndrome、大面積肌陣攣病、肥大細(xì)胞白血病、肥大細(xì)胞增生病、肥大細(xì)胞增生病伴隨血液紊亂、Maumenee Corneal Dystrophy(角膜營養(yǎng)不良)、上頜骨成釉細(xì)胞瘤、上頜骨骨代謝障礙、上頜竇-鼻發(fā)育異常、上頜竇-鼻發(fā)育異常粘合型、上頜竇-眼瞼聯(lián)帶運動、梅-海二氏(血小板)異常(梅-黑二氏異常、遺傳性核酸異常)、中鏈?；o酶A脫氫酶缺乏、麥卡德爾病(糖原貯積病IV型)、McCune-Albright、(腎)髓質(zhì)囊性病，McKusick型干骺端軟骨發(fā)育不良、二尖瓣關(guān)閉速度、混合型結(jié)締組織病、美氏綜合癥、美-格二氏綜合征(內(nèi)臟囊腫-頭顱發(fā)育不良綜合征)、正中面裂綜合征、地中海貧血、中鏈?；o酶A脫氫酶、中鏈?；o酶A脫氫酶缺失、中鏈?；o酶A脫氫酶缺失、(腎)髓質(zhì)囊性病、髓狀海綿樣腎、最大呼氣流量、食管擴張、巨腦、巨腦伴隨玻璃樣包涵體、Megalencephaly with Hyaline Panneuropathy、巨幼紅細(xì)胞性貧血、妊娠期幼巨紅細(xì)胞性貧血、巨角膜-精神遲滯綜合癥、基底細(xì)胞痣綜合征、Meige氏淋巴水腫、Meige氏綜合癥(Meige’s Syndrome)、巨牙腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、腸粘膜粘膜黑斑息肉病、腸粘膜粘膜黑斑息肉病、MELAS Syndrome，MELAS，Melkersson Syndrome，梅-弗綜合征，梅-尼二氏骨發(fā)育不良，梅-尼二氏綜合征、粘膜脂肪營養(yǎng)障礙、達科斯塔綜合征(神經(jīng)性循環(huán)衰弱)、美尼爾斯病(耳性眩暈病)、美尼爾斯病、腦膜毛細(xì)管血管瘤、門克斯病、鋼發(fā)綜合征I、失語身體失調(diào)及拇指外翻型智力遲鈍、智力遲緩-耳聾-骨骼異常-粗糙臉及厚唇(Mental Retardation-Deafness-Skeletal Abnormalities-CoarseFace with Full Lips)、第五拇指和腳趾發(fā)育不全型智力遲緩、骨軟骨發(fā)育不全型智力遲緩、生長遲滯-耳聾-生殖器短小型智力遲緩(Mental Retradation-X-linked with Growth Delay-Deafness-Microgeni-talism)、Menzel型橄欖體腦橋小腦萎縮、人魚綜合征、肌陣孿癲癇破碎紅纖維綜合癥、肌陣孿癲癇破碎紅纖維綜合癥、Merten-Singleton Syndrome、肢體損傷綜合癥、腎小球系膜免疫球蛋白a型腎病、腸系膜脂肪營養(yǎng)障礙、Mesiodens-Cataract Syndrome、Mesodermal Dysmorphodystrophy、Mesomelic Dwarfism-MadelungDeformity，代謝性酸中毒、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、內(nèi)翻跖、間向性侏儒綜合癥、變型骨發(fā)育不良、變型骨發(fā)育不良I、變型骨發(fā)育不良II、甲基丙二酸血癥、甲基丙二酸單酰CoA羧基變位酶缺失癥、Meulengracht’s Disease，下頜面骨發(fā)育不全I、巨球蛋白血癥、惡性組織細(xì)胞增多癥、微血管病性溶血性貧血、腦過小、原發(fā)性小頭侏儒I、小頭畸型、小頭-裂孔疝氣-腎病變Galloway型(Microcephaly-Hiatal Hernia-Nephrosis Galloway Type)、小頭-裂孔疝氣-腎病變綜合癥、小囊性角膜(上皮)營養(yǎng)不良、小紅細(xì)胞癥、Microlissencephaly、眼小畸形、無眼或眼小畸形伴隨相關(guān)異常、腦回小伴隨肌營養(yǎng)不良、無小耳畸形的膝蓋骨小頜綜合癥、微絨毛包埋病，腎小球膜免疫性沉積物、收縮中期卡嗒音收縮晚期雜音綜合癥、Miescher’s Type I Syndrome、米庫利茲綜合征、Mikulicz-RadeckiSyndrome，Mikulicz-Sjogren Syndrome、輕度常染色體隱性遺傳、輕中度槭糖尿病、輕度槭糖尿病、軸后面骨發(fā)育不全、米-迪綜合征、米-弗綜合癥、梅熱病、明-肖二氏綜合征(家族性球形紅細(xì)胞增多癥，先天溶血性貧血，先天溶血性黃疸)、癲癇小發(fā)作、維勒布蘭德病(體質(zhì)性血小板異常癥)、鏡像右位心、線粒體β-氧化紊亂、線粒體和細(xì)胞質(zhì)的、線粒體細(xì)胞病、線粒體細(xì)胞病、Kearn-Sayre Type、線粒體腦病、線粒體腦肌病乳酸性酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作、線粒體肌病、線粒體腦肌病乳酸性酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作、線粒體磷酸烯醇丙酮酸羧激酶缺乏、二尖瓣脫垂、混合性呼吸暫停、混合型結(jié)締組織病、混合型肝性卟啉癥、非流暢性失語、混合性睡眠呼吸暫停、強直陣攣混合性斜頸、MJD、芒伊爾-庫恩綜合征(先天性病，篩竇炎與支氣管擴張癥聯(lián)合存在)、惡性淋巴瘤I(ML I)、惡性淋巴瘤II、惡性淋巴瘤III、惡性淋巴瘤IV、地中海淋巴瘤紊亂I(ML Disorder Type I)，ML Disorder TypeII，ML Disorder Type III，ML Disorder Type IV、膜性狼瘡性腎炎、中度神經(jīng)發(fā)育遲緩綜合癥、運動神經(jīng)元病、MNGIE、MNS、Mobitz I，Mobitz II、默比厄斯(氏)綜合征(先天性雙側(cè)面癱)、莫比烏斯綜合征(痛性運動不能)、Moersch-Woltmann綜合征、莫爾綜合征(OFD綜合征II型、舌裂、傳導(dǎo)性耳聾、拇指部分重疊)、Monomodal視性失語(Monomodal Visual Amnesia)，多發(fā)性單神經(jīng)炎、單神經(jīng)炎、單一神經(jīng)末梢病變、單體性3p2(Monosomy 3p2)、Monosomy 9p Partial，Monosomy 11q Partial，Monosomy 13q Partial，Monosomy 18qSyndrome，Monosomy X、單股性纖維性結(jié)構(gòu)不良、Morgagni-Turner-Albright Syndrome、局限性硬皮病、離心性骨軟骨發(fā)育不良、粘多糖貯積癥IV型、粘多糖貯積癥IV型A、粘多糖貯積癥IV型B、粘多糖貯積癥IV型綜合癥、脊髓空洞癥、花斑四體9p(MosaicTetrasomy 9p)，運動神經(jīng)元病、運動神經(jīng)元綜合癥、運動神經(jīng)元病、運動神經(jīng)元病、運動神經(jīng)元病、動力系統(tǒng)疾病(聚集并緩慢)、煙霧陰影疾病、moyamoya病(由于腦底異常血管網(wǎng)破裂所致阻塞及小出血引起的大腦缺血導(dǎo)致進行性神經(jīng)機能缺陷，腦底異常血管網(wǎng)病)、粘多糖(貯積)病，粘多糖(貯積)病I，粘多糖(貯積)病I H，粘多糖(貯積)病1H/S Hurler/Scheie Syndrome，MPS IS Scheie Syndrome，MPSII，MPS II A，MPS IIB，MPS II-AR、常染色體隱性遺傳亨特綜合征、MPS II-XR，MPS II-XR嚴(yán)重常染色體隱性遺傳，粘多糖(貯積)病V，粘多糖(貯積)病VI，粘多糖(貯積)病VI Severe Intermediate MildMaroteaux-Lamy(輕中重度...)，粘多糖(貯積)病V II，粘多糖(貯積)病VIIsly綜合癥(粘多糖貯積癥VII型由于β-葡糖苷酸酶缺乏引起的疾病)、粘多糖(貯積)病VIII、粘多糖(貯積)紊亂、MPS Disorder I，MPS Disorder H，MPS Disorder IH，MPS Disorder VI，MPS DisorderType VII，邁-羅二氏綜合征(典型癥狀為反復(fù)發(fā)作的面癱，非炎癥性面腫及折疊性唇裂)、惡性狹窄、多系統(tǒng)萎縮癥、多發(fā)性硫酸脂酶缺乏癥、對稱性脂肪過多癥、主動脈瓣下肌性狹窄、槭糖尿病、槭糖尿病Ib型、槭糖尿病II型、粘脂沉積癥III、粘脂沉積癥IV、粘多糖增多癥、粘多糖增多癥I-H、粘多糖增多癥I-S，粘多糖增多癥II，粘多糖增多癥III，粘多糖增多癥IV，粘多糖增多癥VI，粘多糖增多癥VII，粘多糖增多癥I型、粘多糖增多癥II型、粘多糖增多癥III型、粘多糖增多癥IV型、黏性、多硫酸酯酶缺乏癥、粘液性結(jié)腸炎、(胰管)粘稠物阻塞癥、Mulibrey Dwarfism，Mulibrey Nanism Syndrome、副中腎管發(fā)育不全-腎發(fā)育不全-頸胸體節(jié)發(fā)育不全、副中腎管-腎-頸胸-上肢體缺陷、副中腎管和腎發(fā)育不全伴隨上肢和肋畸形、副中腎管-腎-頸胸體節(jié)畸形、Binswanger型多發(fā)性腦梗死性癡呆、MulticentricCastleman’s Disease、多病灶嗜曙紅細(xì)胞肉芽瘤、多重乙酰輔酶A脫氫酶缺失/戊二酸尿II型、Multiple Angiomas(復(fù)雜血管瘤)andEndochondromas、多發(fā)性羧酶缺乏癥、多發(fā)性軟骨疣、多發(fā)性軟骨性外生骨疣、多發(fā)性內(nèi)生軟骨瘤病、多發(fā)性內(nèi)分泌缺陷綜合征、多發(fā)性骨骺發(fā)育不良、多發(fā)性外生骨疣、多發(fā)性外生骨疣綜合征、多發(fā)性家族性息肉病、多發(fā)性色素斑綜合征、多發(fā)性骨髓瘤、肩帶多神經(jīng)炎、骨軟骨瘤病、多發(fā)周圍神經(jīng)炎、多發(fā)硫酸酯酶缺乏、對稱性脂肪過多癥、多系統(tǒng)萎縮癥、多發(fā)性骨性結(jié)合骨發(fā)育不全、多發(fā)性骨性結(jié)合骨發(fā)育不全伴隨長骨碎裂、Mulvihill-Smith綜合癥、MURGS聯(lián)合征(米勒管、腎臟、頸椎缺陷)、Murk Jansen型干骺端軟骨發(fā)育不良或發(fā)育異?；蚪Y(jié)構(gòu)不良、肌肉肉毒堿缺乏癥、肌肉中央軸疾病、肌磷酸果糖激酶缺乏、肌肉中央核疾病疾病、肌肉營養(yǎng)障礙、肌營養(yǎng)不良x連鎖隱性(遺傳)、先天肌肉萎縮癥伴隨中樞神經(jīng)系統(tǒng)牽連、精神遲滯致進行性先天肌營養(yǎng)不良、面肩胛臂的肌肉萎縮癥、肌風(fēng)濕病、肌強直-遞進性發(fā)作、肌肉骨骼痛、四肢短缺病、啞癥、、微血管壓、微血管壓、MWS、重癥肌無力、假麻痹性重癥肌無力、Lambert-Eaton肌無力綜合征癥、髓鞘破壞彌漫性硬化、骨髓瘤病、Myhre綜合癥、肌陣攣無定向型癲癇小發(fā)作、肌陣攣張力障礙、嬰兒肌陣攣腦病、肌陣攣型癲癇、Hartung型肌陣攣型癲癇(Myoclonic Epilepsy Hartung Type)、肌陣攣性癲癇伴隨蓬毛樣紅纖維、肌陣攣型癲癇和蓬毛樣紅纖維病、家族性遞進肌陣攣癲癇、家族性肌陣攣癲癇、肌陣攣發(fā)作、肌陣攣、肌陣攣性癲癇、Myoencephalopathy Ragged-Red Fiber Disease(...蓬毛樣紅纖維病)、肌纖維瘤病、先天肌纖維瘤病、肌原性面-肩胛-腓骨綜合癥、Myoneurogastointestinal Disorder andEncephalopathy(腦病)、肌病先天性多數(shù)關(guān)節(jié)彎曲、肌肉[毒]堿缺乏病、肌肉中央?yún)^(qū)纖維化、myopathy Congenital(先天性肌病...)Nonprogressive、myopathy Congenital Nonprogressive withCentral Axis，肌病伴隨肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶缺失、myopathy-Marinesco-Sjogren綜合癥、肌病-代謝康胃素棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶缺失、肌病線粒體-腦病-乳酸酸中毒-中風(fēng)、伴隨肌漿體和肌漿體的肌病、肌磷酸化酶缺失、骨化性肌炎、斯太納特(氏)病(萎縮性肌強直，肌強直性營養(yǎng)不良)、先天性肌強直病、先天間歇性肌強直、肌強直性營養(yǎng)不良、肌強直肌病侏儒軟骨營養(yǎng)障礙和面部異常、肌管性肌病、伴X染色體的肌管性肌病、Myproic Acid，myriachit(西伯利亞說法)、黏液水腫、N-乙酰半乳糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶缺乏、N-乙?；劝彼岷铣擅溉毕荨⑦€原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸缺陷、Naegeli EctodermalDysplasias(外胚層器官發(fā)育不良)、納赫爾綜合征、納赫爾面骨發(fā)育不全綜合征、納赫爾綜合征、n-乙酰-β-d-氨基葡萄糖苷酶缺乏、(指、趾)甲營養(yǎng)不良-耳聾綜合癥、(指、趾)甲發(fā)育不全和牙發(fā)育不全、指甲膝蓋綜合征、南斯-霍蘭綜合征，鳥頭侏儒、小頭(畸形)、小眼、發(fā)作性睡眠、發(fā)作性睡眠綜合癥、非水反相色譜法、鼻-額-(Nasal-fronto-faciodysplasia)、鼻翼發(fā)育不全甲狀腺功能減退消化液缺乏、鼻上頜發(fā)育不全、鼻脂肪營養(yǎng)障礙(Nasu Lipodystrophy)、NBIA1、官能性抑郁癥、神經(jīng)缺損指數(shù)、無蛋白膳食、引起壞死的腦脊髓病(Necrotizing Encephalomyelopathy of Leigh’s，)、引起壞死的呼吸器官肉芽腫病、Neill-Dingwall Syndrome、納爾遜綜合征(雙側(cè)腎上腺切除后發(fā)生腦下垂體腫瘤及皮膚粘膜色素沉著)、纖維狀肌病、新生兒腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥、新生兒腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥(NALD)，新生兒腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥(ALD)，新生兒常染色體隱性遺傳多囊性腎病、新生兒侏儒、新生兒肝炎、新生兒低血糖、新生兒乳糖耐受不良、滲出性腸病致使新生兒淋巴水腫、新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎、新生兒Progeroid綜合癥，Wiedemann-Rautenstrauch氏新生兒假性腦積水Progeroid綜合癥、新生物蛛網(wǎng)膜炎、腎胚細(xì)胞瘤、腎原發(fā)性尿崩癥、家族性少年腎結(jié)核、腎病性胱氨酸病、腎-假兩性畸形-腎母細(xì)胞瘤、腎病-小頭畸型綜合癥、腎變病-煙胺比林dysmigration綜合癥(Nephrosis-Neuronal Dysmigration Syndrome)、腎病變-糖尿病-侏儒-佝僂-血磷酸鹽過少綜合癥、Netherton Disease，內(nèi)瑟頓綜合征(伴有結(jié)節(jié)毛的魚鱗癬)、內(nèi)瑟頓綜合征魚鱗病、Nettleship FallsSyndrome(x連鎖隱性)、Neu-Laxova綜合征、Neuhauser綜合癥、神經(jīng)管缺陷、神經(jīng)痛性肌萎縮、粘多糖-n-乙酰神經(jīng)氨水解酶缺陷、神經(jīng)性黑皮癥、聽神經(jīng)神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)棘紅細(xì)胞增多癥、Schindler型神經(jīng)軸性營養(yǎng)不良、大腦鐵聚集I型神經(jīng)退行性變(NBIAI)，聽神經(jīng)神經(jīng)纖維瘤，神經(jīng)先天性多關(guān)節(jié)攣縮，眼腦脊髓病，神經(jīng)性肌強直，局部神經(jīng)性肌強直、神經(jīng)性肌強直、擴散的、家族的、神經(jīng)性肌強直、局部神經(jīng)性肌強直、散發(fā)的、Schindler型煙胺比林軸突營養(yǎng)障礙，成年煙胺比林蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積癥、少年神經(jīng)元臘樣脂褐質(zhì)癥、I型煙胺比林蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥、噬神經(jīng)細(xì)胞急性葡萄糖腦苷脂酶缺乏癥、神經(jīng)性淀粉樣變性病、神經(jīng)性腳氣病、神經(jīng)共濟失調(diào)和色素性視網(wǎng)膜炎、Brachialpelxus神經(jīng)病變綜合癥、遺傳性知覺器官神經(jīng)病變I型、傳性知覺器官神經(jīng)病變II型、神經(jīng)精神醫(yī)學(xué)卟啉癥、中性脂類積貯病、Nev II，痣樣基底細(xì)胞癌綜合征、痣、痣多孔、粉刺樣痣、貧血性痣、Jadassohn皮脂型痣、Nezelof綜合癥、Nezelof型胸腺不發(fā)育、Nezelof型重度聯(lián)合免疫缺陷、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤1、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤2、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤-1、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤-2、標(biāo)準(zhǔn)人血清、Niemann皮克病、Niemann皮克病A型(急性噬神經(jīng)細(xì)胞型)、Niemann皮克病B型、Niemann皮克病C型(慢性噬神經(jīng)細(xì)胞型)、Niemann皮克病D型(Nova凹形變異)，Niemann皮克病E型，Niemann皮克病F型(海藍組織細(xì)胞病)、夜盲(癥)、Nigrospinodentatal退化(Nigrospinodentatal Degeneration)、NII kawakuroki綜合癥(N II kawakuroki Syndrome)、新生兒狼瘡綜合征、結(jié)節(jié)性黑色素瘤、Noack綜合癥I型、遺傳原發(fā)性夜間肌陣攣、結(jié)節(jié)角膜退化、非大皰性先天魚鱗癬樣紅皮病、非大皰性先天魚鱗癬樣紅皮病、阻塞性腦積水、非缺失型α地中海貧血/精神發(fā)育遲緩，綜合癥、非酮高甘氨酸血癥I型(NKHI)，非酮性高甘氨酸血癥、非脂性網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖、非噬神經(jīng)細(xì)胞慢性成人戈謝病、非瘢痕化表皮松解大泡生成、非動脈硬化性大腦鈣化、非關(guān)節(jié)性風(fēng)濕病、非大腦型、青少年戈謝病、非糖尿性糖尿病、非局部缺血型海蔥次苷甲肌病、輕微冠狀動脈缺乏導(dǎo)致的非酮癥低血糖和肉[毒]堿缺乏病、脂酰輔酶A脫氫酶缺失導(dǎo)致的非酮癥低血糖、非酮甘氨酸血癥、Nonne’s綜合癥、Nonne-Milroy-Meige綜合癥、非乳光乳光牙本質(zhì)、非產(chǎn)后乳溢閉經(jīng)，非分泌性骨髓瘤、非球形紅細(xì)胞溶血型貧血、非熱帶性口炎性腹瀉、努南綜合征(假特納綜合征)、去甲腎上腺素、標(biāo)準(zhǔn)壓腦積水、Norman-Roberts綜合癥、Norrbottnian戈謝病、Norrie病、挪威型遺傳性膽汁郁積、尼曼-皮克二氏病(神經(jīng)鞘磷脂沉積病)、NPS、壞死性涎腺組織化生病、正常血清白蛋白、頸背張力障礙癡呆綜合癥、營養(yǎng)性神經(jīng)病變、Nyhan綜合癥、眼耳脊椎發(fā)育不良光譜、阻塞性呼吸暫停、阻塞性腦積水、阻塞性睡眠呼吸暫停、燕麥形細(xì)胞癌綜合癥、咬合Thromboaortopathy、燕麥形細(xì)胞癌綜合癥、隱蔽顱內(nèi)脈管畸形、隱性脊柱神經(jīng)管閉合不全序列征、Ochoa綜合癥、褐黃病、褐黃病性關(guān)節(jié)炎、眼-腦-腎綜合征、OCRL、耳頭畸形、眼白化病、眼睛皰疹、眼睛重癥肌無力、眼耳脊椎發(fā)育不良、眼耳脊椎(發(fā)育不良)綜合癥、眼-口-生殖器綜合征、眼腦綜合癥伴隨色素沉著不足、眼腦皮膚綜合癥、眼腦腎、眼腦腎營養(yǎng)不良、眼皮膚白化病、眼-腦-腎綜合征、眼腦體綜合征(不發(fā)育)、眼皮膚白化病、眼皮膚白化病切東綜合征、眼、齒、指(趾)發(fā)育不良、眼牙數(shù)字綜合癥、眼-齒-骨骼發(fā)育異常、眼胃腸道肌肉營養(yǎng)不良、眼胃腸道肌肉營養(yǎng)不良、眼頜骨發(fā)育不全伴隨稀毛、烏-弗-多三氏綜合征、眼球運動攣縮和肌內(nèi)萎縮、眼交感神經(jīng)的麻痹、ODD綜合征(眼齒指(趾)綜合征)、牙源性腫瘤、牙香毛簇綜合癥、口-面-指(趾)、口-面-指(趾)綜合征、俄亥俄型淀粉樣變性病(VII型)、內(nèi)耳炎、先天性內(nèi)耳炎、遲發(fā)內(nèi)耳炎、棄耕地綜合癥、羊水過少序列征、精神幼稚病、精神幼稚病患者營養(yǎng)不良、橄欖體腦橋小腦萎縮、橄欖體腦橋小腦萎縮伴隨癡呆和錐體外束征、橄欖體腦橋小腦萎縮伴隨視網(wǎng)膜退化、橄欖體腦橋小腦萎縮I、橄欖體腦橋小腦萎縮II、橄欖體腦橋小腦萎縮III、橄欖體腦橋小腦萎縮IV、橄欖體腦橋小腦萎縮V、骨軟骨瘤病、奧利爾骨軟骨瘤病、臍突出-內(nèi)臟肥大-巨舌(癥)綜合癥、Ondine詛咒、洋蔥-延髓神經(jīng)病變、薤白多發(fā)性神經(jīng)病、甲-骨發(fā)育不良癥、Onychotrichodysplasia伴隨中性粒細(xì)胞減少癥、橄欖體腦橋小腦萎縮、橄欖體腦橋小腦萎縮I、橄欖體腦橋小腦萎縮II、橄欖體腦橋小腦萎縮III、橄欖體腦橋小腦萎縮IV、橄欖體腦橋小腦萎縮V、耳-腭-指(趾)綜合征、耳-腭-指(趾)綜合征I型、耳-腭-指(趾)綜合征II型、耳-腭-指(趾)I綜合征、耳-腭-指(趾)II綜合征、眼肌麻痹癥、眼肌麻痹-腸內(nèi)假性梗阻、眼肌麻痹、視網(wǎng)膜和鎘肌病色素退化、眼肌麻痹陽性綜合征、眼肌麻痹綜合癥、Opitz束支傳導(dǎo)阻滯綜合癥、OpitzBBB/G復(fù)合物綜合癥、Opitz BBBG綜合癥、Opitz-Frias綜合癥、Opitz G綜合征(器官距離過遠(yuǎn)-尿道下裂綜合)、Opitz G/BBB綜合癥、Opitz g綜合征(器官距離過遠(yuǎn)-尿道下裂綜合征)、Opitz-Kaveggia綜合癥、Opitz Oculogenitolaryngeal綜合癥、Opitz三角頭(畸形)綜合癥、奧皮茨綜合征(眼距寬、尿道下裂綜合征)、視性眼陣攣、視性眼陣攣-肌陣攣、Opthalmoneuromyelitis、視力萎縮多發(fā)性神經(jīng)病和耳聾、視神經(jīng)脊髓炎、視神經(jīng)神經(jīng)脊髓炎、Opticomyelitis、視交叉蛛網(wǎng)膜炎、口面裂縫、口面運動運動障礙、口面張力障礙、口面指發(fā)育不良綜合征、口面指發(fā)育不良綜合征I型、口面指發(fā)育不良綜合征I、口面指發(fā)育不良綜合征II、口面指發(fā)育不良綜合征III、口面指發(fā)育不良綜合征IV、眶(內(nèi))囊腫伴隨大腦和病灶皮膚畸形、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶、鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺陷、Orocraniodigital綜合癥、口-面-指綜合征、Oromandibular張力障礙、直立性低血壓、奧斯勒-韋伯-朗迪病(遺傳性出血性毛細(xì)管擴張)、Osseous-Oculo-Dento發(fā)育不良、Osseous-Oculo-Dento發(fā)育不良、骨炎畸形、骨軟骨營養(yǎng)不良畸形、骨軟骨肉瘤、Melnick和Needles型骨發(fā)育不良、成骨缺陷、成骨不全、先天性成骨不全癥，遲發(fā)性成骨不全癥，Osteohypertrophic毛細(xì)血管瘤、嬰兒多型骨病Hyperostotica鞏膜炎、嬰兒多型骨病Hyperostotica鞏膜炎、Osteopathyrosis、骨硬化癥、成人型常染色體顯性骨硬化癥、嬰兒型惡性常染色體顯性骨硬化癥、中級典型性輕度常染色體隱性遺傳骨硬化癥、全身性脆性骨硬化、骨硬化性骨髓瘤、原中隔孔缺損(包括心內(nèi)膜墊缺損)、繼發(fā)孔缺損、鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、耳鼻喉腭指狀綜合癥、耳-腭-指綜合征I型、耳-腭-指綜合征II型、耳-腭-指綜合征I型、耳-牙發(fā)育異常、耳腭指綜合征、耳腭指綜合征II型、Oudtshoorn皮膚、卵巢侏儒綜合癥型、卵巢發(fā)育不全綜合癥型、卵巢楔形切除、草酸鹽沉著癥、氧化酶不足、尖頭[畸形]、尖頭[畸形]-尖頭[畸形]、壓力容積、震顫麻痹、兒童丘疹性肢皮炎、甲肥厚Ichtyosiforme、先天性指(趾)甲肥厚伴隨誕生牙、先天性指(趾)甲肥厚、先天性指(趾)甲肥厚散布角化癥(經(jīng)酮)、杰-柳二氏型先天性指(趾)甲肥厚、陣發(fā)性心房纖維顫動伴隨多系統(tǒng)萎縮癥、Paget病、骨Paget病、胸Paget病、乳頭Paget病、乳頭乳暈Paget病、冰內(nèi)生物綜合癥、疼痛性眼肌麻痹、PAIS、腭肌陣攣、腭-耳-指綜合癥II型、里斯特氏綜合征、Pallister-Hall綜合征、Pallister-Killian花斑綜合癥、里斯特氏花斑非整倍性、里斯特氏花斑綜合癥、12p四體性Pallister嵌合體綜合征、Pallister-W綜合癥、掌跖角化過度和禿頂、癱瘓、胰囊性纖維化、抑酞酶分泌不足和骨髓機能障礙、抑酞酶潰瘍原的腫瘤綜合癥、全骨髓再生障礙、全骨髓病、泛酰酸激酶伴隨的神經(jīng)退行性變(PKAN)、帕-列二氏綜合征(掌跖角化過度-牙周炎綜合征)，Papillotonic Psuedotabes，麻痹周期強直、麻痹性腳氣病、麻痹性臂叢神經(jīng)炎、旁正中的下唇唇凹-腘翼狀贅蹼綜合征、旁正中間腦綜合癥、副淀粉樣變性、復(fù)雜肌陣攣、先天性肌強直病、Von Eulenburg先天性肌強直病、Parkinson病、陣發(fā)性前房心動過速、陣發(fā)性冷性血紅蛋白尿癥、陣發(fā)性張力障礙、陣發(fā)性舞蹈手足徐動癥、陣發(fā)性Kinesigenic張力障礙、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(并有貧血)、普通陣發(fā)性血紅蛋白尿、發(fā)作性睡眠、鸚鵡綜合癥、Parry病、帕-羅二氏綜合征、Parsonage-Turner綜合癥、部分雄激素不敏感綜合征、4號染色體短臂部分缺失、5號染色體短臂部分缺失、9號染色體短臂部分缺失、3q部分復(fù)制綜合癥、15q部分復(fù)制綜合癥、局部面癱伴隨泌尿異常、部分性脂肪代謝障礙、11號染色體長臂局部單體性、局部脊柱知覺綜合癥、11q部分三體型、Partington綜合癥、陣發(fā)性房性心動過速、開放性動脈導(dǎo)管、病理肌陣攣、少關(guān)節(jié)型的-起始幼年型關(guān)節(jié)炎、泡林藤屬、妊娠和分娩并發(fā)病癥、房室束穿行部、PC缺乏、PC缺乏A簇、PC缺乏B簇，先天性肌強直病、先天副肌強直、PCC缺乏、陣發(fā)性冷性血紅蛋白尿、PCLD，血漿凝固時間、舒張壓、動脈導(dǎo)管未閉、PDH缺乏、皮爾森綜合征丙酮酸羧化酶缺乏癥、小兒阻塞性睡眠呼吸暫停、蛻皮綜合癥、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、佩-梅二氏病(家族性腦中葉硬化)、糙皮-小腦共濟失調(diào)-腎氨基酸尿綜合癥、骨盆痛綜合癥、尋常天皰瘡、Pena ShokeirII型綜合癥、Pena Shokeir綜合癥II型、陰莖纖維瘤病、陰莖纖維化、陰莖硬結(jié)、五X綜合征、Cantrell五聯(lián)癥、五聯(lián)癥綜合癥、五染色體性X、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶缺失、Pepper綜合癥、女性化侏儒綜合征、關(guān)節(jié)周圍的，肌風(fēng)濕病、心包收縮伴隨生長不足、膠原周(圍)淀粉樣變性、圍產(chǎn)期多囊腎病、會陰肛門、周期性淀粉狀蛋白綜合癥、周期性睡眠病態(tài)饑餓、周期性綜合周圍神經(jīng)病癥、周期性視網(wǎng)膜囊性退化、周期性骨發(fā)育不全-鼻發(fā)育不全-智力遲緩、末梢神經(jīng)炎、周圍神經(jīng)病變、腹膜心包膈疝、惡性貧血、四肢不全伴隨小頜(癥)、腓側(cè)肌萎縮、腓神經(jīng)神經(jīng)麻痹、Peroutka噴嚏、過氧化物酶脂酰輔酶A氧化、過氧化物酶β-氧化失常、過氧化物酶雙功能酶、過氧化物酶乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶、過氧化物酶乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶缺陷、主動脈干永存、幼年性變形性骨軟骨炎、癲癇小發(fā)作、變異型小發(fā)作、杰格斯(氏)綜合征、Peutz-Touraine綜合癥、陰莖纖維性海綿體炎、斐弗、斐弗綜合征I型(尖頭并指畸形)、前列腺素a I、前列腺素a II、前列腺素a III、磷酸甘油酸酯激酶、PH I型、PH I型、咽囊綜合征、肺心病短鏈?；o酶A脫氫酶缺失、苯丙氨酸羥化酶缺乏癥、苯丙氨酸血癥、苯丙酮尿癥、苯丙酮酸性精神幼稚病、海豹肢癥、海豹肢綜合癥、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶缺陷、磷酸果糖激酶缺乏、磷酸甘油酸激酶缺乏癥、磷酸甘油激酶、磷酸化酶六激酶缺失、磷酸化酶缺乏糖原貯積病、肝磷酸化酶激酶缺失、光噴嚏反射、光噴嚏、光線療法角膜切除術(shù)、PHS，物理學(xué)家約翰.道爾頓、植烷酸貯積病、Pi Phenotype ZZ、PI，腦皮克病、皮克病、皮克韋坎(氏)綜合征(肺泡換氣低下肥胖綜合征)、皮爾·羅斑(氏)刺槐毒素、皮爾·羅斑(氏)復(fù)合物、皮爾·羅斑(氏)序列、皮爾·羅斑(氏)綜合征、皮爾·羅斑(氏)綜合癥伴隨Hyperphalangy和指(趾)彎曲、Pierre-Marie病、蒼白球黑質(zhì)紅核色素沉著退化、Pili Torti和神經(jīng)性耳聾、PiliTorti-感覺神經(jīng)聽力損傷、垂體性侏儒癥II型、腎上腺切除術(shù)術(shù)后垂體(腫)瘤、毛發(fā)糠疹、毛發(fā)(角化性)紅糠疹，胰管空腸吻合術(shù)、PKAN、多囊性腎病、多囊性腎病1、多囊性腎病2、多囊性腎病3、苯丙酮酸尿、苯丙酮酸尿1、斜形頭、漿細(xì)胞性骨髓瘤、漿細(xì)胞性骨髓瘤、漿細(xì)胞性白血病、血漿促凝血酶原激酶成分缺乏、血漿轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶缺失、陰莖海綿體硬結(jié)癥海綿體、陰莖海綿體硬結(jié)癥、類脊髓灰質(zhì)炎、裂縫舌、PLS，胸大肌缺損、Pneumorenal綜合癥、陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿，、周圍神經(jīng)髓磷脂、嘌呤核苷磷酸化酶)缺乏、多囊卵巢病、對羥苯丙酮、皮膚異色萎縮和奔流、先天性皮膚異色病、波蘭異常、波蘭序列征(一側(cè)胸肌缺失及并指畸形)、波蘭并趾、波蘭綜合征(胸大肌無發(fā)育并短指綜合征)、進行性大腦灰質(zhì)營養(yǎng)不良、多關(guān)節(jié)炎Enterica，結(jié)節(jié)性多動脈炎、多關(guān)節(jié)-起發(fā)的幼年型關(guān)節(jié)炎I型、多關(guān)節(jié)-起發(fā)的幼年型關(guān)節(jié)炎II型、多關(guān)節(jié)-起發(fā)的幼年型關(guān)節(jié)炎I型和II型、多軟骨炎、多囊性腎病、髓型多囊性腎病、多囊性肝病、多囊卵巢病、多囊肝腎病、多指(趾)-Joubert綜合癥、多發(fā)育不良性大皰性表皮松解、多營養(yǎng)不良型智力發(fā)育不全，多發(fā)營養(yǎng)不良性侏儒、多(內(nèi)分泌)腺性自身免疫綜合征III型、多(內(nèi)分泌)腺性自身免疫綜合征II型、多(內(nèi)分泌)腺性自身免疫綜合征I型、多(內(nèi)分泌)腺性自身免疫綜合征II型、(內(nèi)分泌腺摘除后的激素)缺失綜合征II型、多腺體綜合征、多腺體視網(wǎng)膜黃斑退化、多形態(tài)黃斑變性、血小板糖蛋白Ib多晶型現(xiàn)象、角膜多形性角膜變性、風(fēng)濕性多肌病、多肌炎和皮肌炎、原發(fā)性無丙種球蛋白血癥、多發(fā)性神經(jīng)炎、多發(fā)性神經(jīng)病-耳聾-眼萎縮、周圍多發(fā)性神經(jīng)病、多發(fā)性神經(jīng)病和多神經(jīng)根神經(jīng)瘤、多發(fā)性骨纖維性發(fā)育不良，多骨者、家族性腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、Gardner型息肉病、息肉病錯構(gòu)腸、息肉-骨瘤-表皮囊綜合癥、息肉病皮膚色素沉著和指甲改變、息肉斑綜合癥、再發(fā)性多漿膜炎、Y多體性、多指(趾)(畸形)伴隨奇異狀顱、Greig型多指(趾)(畸形)-同質(zhì)異形頭蓋骨、蓬佩病、糖原貯積病-II型、腘翼狀胬肉綜合征、豪豬人、孔洞腦、孔洞腦、膽色素原脫氨酶、卟啉癥、急性間歇性卟啉癥、ALA-D卟啉癥、遲發(fā)性皮膚卟啉癥、遺傳性原糞卟啉癥、皮膚遲發(fā)性癥狀性卟啉癥、肝卟淋病雜色鏢鱸、瑞典型卟啉病、多樣性卟啉病、急性間歇性比咯紫質(zhì)、卟啉、斑形脫發(fā)，葡萄酒色痣、葡萄牙型淀粉樣變性、感染后多發(fā)性神經(jīng)炎、進行性肌陣攣性癲癇、進行性骨發(fā)育異常、進行性蒼白退化綜合癥、進行性脊延髓肌萎縮癥、進行性核上性麻痹、進行性全身性硬化癥、進行性脈絡(luò)膜毯層營養(yǎng)不良、脯氨酸氧化酶缺乏、丙酸血癥、丙酸血癥I型(PCCA缺失)、丙酸血癥II型(PCCB缺失)、丙酰輔酶A羧化酶缺失、紅色弱、第一原色盲、充血性心力衰竭繼發(fā)性蛋白丟失性腸病、Proteus綜合征、包括4q在內(nèi)的基部丟失、原發(fā)性色素性視網(wǎng)膜炎、PRS、干梅腹綜合征、畸形性骨炎、粘脂貯積癥III型、假性營養(yǎng)不良、假性黑(色)棘皮癥、假性軟骨發(fā)育不全、假性膽堿脂酶缺乏、假痛風(fēng)、假血友病、假兩性畸型、假兩性同體-腎紊亂-Wilm腫瘤、假肥大性肌營養(yǎng)不良、假性甲狀旁腺功能減退癥、假性低磷酸酶癥、假多胚現(xiàn)象、假性反應(yīng)停綜合征、，彈性痣、銀屑病、毛囊膠孢子蟲病、假性妊娠、佩萊格里尼-斯蒂德(氏)綜合征，意識運動震撼、精神運動性癲癇、意識運動等量癲癇、PTC缺乏癥、翼狀胬肉、翼狀頸皮、大面積翼狀胬肉、頸蹼淋巴管擴張綜合征、肺動脈閉鎖、肺淋巴管肌瘤病、，肺動脈狹窄、肺狹窄-心室間隔缺損、髓石、髓發(fā)育不良、主動脈弓綜合征、單純無淋巴細(xì)胞癥、單純表皮組織細(xì)胞增多病、嘌呤核苷磷酸化酶缺陷、嘌呤核苷磷酸化酶缺陷、Purtilo綜合癥、彈性痣、彈性痣顯性性狀、彈性痣隱性性狀、致密性成骨不全癥、致密性成骨不全癥、癲癇小發(fā)作、焦谷氨酸尿(癥)、焦谷氨酸尿(癥)、吡咯啉羧化物脫氫酶缺失、丙酮酸羧化酶缺乏癥、丙酮酸羧化酶缺乏癥A簇、丙酮酸羧化酶缺乏癥B簇，丙酮酸脫氫酶缺失、丙酮酸激酶缺乏癥、q25-qter，q26or q27-qter，q 31 or 32-qter，伴隨細(xì)胞外鈣沉積過少的QT延長、非先天耳聾性QT延長、伴隨先天耳聾性QT延長、痙攣性兩側(cè)麻痹四肢癱瘓、腦性麻痹四肢癱瘓、量子散開、r4，r6，r14，r18，r21，r22，脊柱后裂、橈骨發(fā)育不全-巨核細(xì)胞血細(xì)胞減少癥、橈骨發(fā)育不全-血小板減少綜合征、橈骨發(fā)育不全-血小板減少綜合征神經(jīng)麻痹、根性神經(jīng)病知覺、根性神經(jīng)病知覺退縮、根部牙本質(zhì)發(fā)育異常、急發(fā)性張力障礙帕金森(氏)綜合征、Rapp-Hodgkin綜合癥、Rapp-Hodgkin(少汗的)外胚層器官發(fā)育不良綜合癥、Rapp-Hodgkin少汗的外胚層器官發(fā)育不良綜合癥、罕見的遺傳性共濟失調(diào)伴隨由植烷酸羥化酶缺陷導(dǎo)致的多神經(jīng)炎改變和耳聾、Rautenstrauch-Wiedemann綜合征、Rautenstrauch-Wiedemann型新生兒吉福德(氏)綜合征、Raynaud現(xiàn)象、重組干燥血漿、反應(yīng)性功能性低血糖、先天隱形肌強直繼發(fā)性反應(yīng)性低血糖、神經(jīng)纖維瘤病、直腸會陰成形術(shù)、再發(fā)性嘔吐、交感反射神經(jīng)血管營養(yǎng)障礙、交感反射性營養(yǎng)不良綜合癥、屈光不正、頑固性貧血、冰凍麻痹、雷夫敘姆病(多神經(jīng)炎型遺傳性運動失調(diào)病)、雷夫敘姆病(多神經(jīng)炎型遺傳性運動失調(diào)病)、節(jié)段性回腸炎、Reid-Barlow綜合癥、賴芬斯坦綜合征(性腺機能不全、睪丸萎縮精子少、尿道裂、女性化乳房)、Reiger異常-生長遲緩、Reiger綜合癥、Reimann間發(fā)性疾病、Reimann綜合癥、Reis-Bucklers角膜營養(yǎng)不良、Reiter綜合癥、復(fù)發(fā)Guillain-Barre綜合癥、復(fù)發(fā)-忽重忽輕型多發(fā)性硬化癥、腎發(fā)育不全、腎臟發(fā)育不良、遺傳、腎臟發(fā)育不良-Loken-Senior型視黃醛發(fā)育不全、腎性糖尿、腎性糖尿A型、腎性糖尿B型、腎性糖尿O型、腎-眼腦營養(yǎng)不良、腎-視黃醛發(fā)育異常伴隨(腎)髓質(zhì)囊性病、意向性肌陣攣、原子力意向性肌陣攣、軸后面骨發(fā)育不全、原子力意向性肌陣攣、軸后面骨發(fā)育不全、軸后性多指癥、腦炎后的意向性肌陣攣、后角膜營養(yǎng)不良遺傳、豆?fàn)詈撕缶C合征、胺碘苯丙酸乙酯使用后的蛛網(wǎng)膜炎、出生后的痙攣性兩側(cè)麻痹、手術(shù)后的膽汁阻塞、產(chǎn)后溢乳閉經(jīng)綜合征、產(chǎn)后垂體功能減退、產(chǎn)后全垂體機能減退綜合癥、產(chǎn)后全垂體機能減退、產(chǎn)后垂體壞死、體位性低血壓、失鉀性腎炎、失鉀綜合癥、Potter I型嬰兒多囊腎病、PotterIII型嬰兒多囊腎病、持續(xù)性肺動脈高壓、PPS，帕-魏二氏綜合征、Prader-Labhart-Willi凡科尼綜合征、前白蛋白77位酪氨酸淀粉樣變性病、預(yù)激綜合征、孕烯醇酮缺失、早產(chǎn)兒心房收縮、早老綜合征、早產(chǎn)兒心室收縮、新生兒心室綜合波、新生兒或分娩時神經(jīng)軸性營養(yǎng)不良、早老性癡呆、早老性視網(wǎng)膜黃斑退化、原發(fā)性腎上腺機能不足、原發(fā)性無丙種球蛋白血癥、原發(fā)性醛固酮增多癥、原發(fā)性肺泡換氣不足、原發(fā)性淀粉樣變性、原發(fā)性貧血、原發(fā)腳氣、原發(fā)膽汁、原發(fā)性膽汁性肝硬變、原發(fā)布朗綜合征、原發(fā)肉[毒]堿缺乏病缺乏、原發(fā)中樞通氣不足綜合征、原發(fā)性睫運動障礙型、原發(fā)性皮膚淀粉樣變性病、原發(fā)性張力障礙、初期腎上腺皮質(zhì)功能減退癥、原發(fā)家族性上顎發(fā)育不全、原發(fā)性血色病、原發(fā)型多汗(癥)、原發(fā)性尿草酸鹽過多[I型]、原發(fā)性尿草酸鹽過多1型(PHi)、原發(fā)性尿草酸鹽過多I型、原發(fā)性尿草酸鹽過多II型、原發(fā)性尿草酸鹽過多III型、原發(fā)性性腺機能減退、原發(fā)性小腸淋巴管擴張、原發(fā)性側(cè)索硬化癥、原發(fā)非遺傳的淀粉樣變性病、原發(fā)閉塞肺血管疾病、原發(fā)性進行性多發(fā)性硬化癥，原發(fā)性肺動脈高壓、原發(fā)性進行性多發(fā)性硬化癥，原發(fā)性肺動脈高壓、原發(fā)性閱讀障礙、原發(fā)性腎性糖尿、原發(fā)硬化性膽管炎、自發(fā)性血小板增多，原發(fā)中樞神經(jīng)系腫瘤、視覺性失認(rèn)癥、直腸結(jié)腸炎、直腸結(jié)腸炎、成年吉福德(氏)綜合征、兒童吉福德(氏)綜合征、吉福德(氏)矮小、Progeriod身材矮小癥伴隨色素痣、De Barsy Progeriod綜合癥、進行性自主衰竭伴隨多系統(tǒng)萎縮、進行性延髓性麻痹、包括進行性延髓性麻痹、進行性心肌病變性著色斑病、家族進行性小腦性共濟失調(diào)、進行性大腦灰質(zhì)營養(yǎng)不良、灰質(zhì)營養(yǎng)不良(大腦)、進生性骨干發(fā)育不全、進行性單側(cè)面萎縮、進行性家族性肌陣攣性癲癇、進行性一側(cè)面萎縮、進行性感覺遲鈍、進行性嬰兒大腦灰質(zhì)營養(yǎng)不良、進行性豆?fàn)詈俗冃?、進行性脂肪營養(yǎng)不良、兒童進行性肌營養(yǎng)不良、家族性腎-視網(wǎng)膜營養(yǎng)不良、腎-視網(wǎng)膜綜合癥、郎-奧-韋三氏綜合征、呼吸性酸中毒、呼吸道功能障礙、呼吸肌陣攣多動腿綜合征、RestrictiveCardio myopathy、Retention Hyperlipemia、Rehtore綜合征(不明顯)、網(wǎng)狀細(xì)胞發(fā)育不全、Retinal Aplastic-Cystic Kidneys-JoubertSyndrome、視錐退化、視錐營養(yǎng)不良、視錐-視桿營養(yǎng)不良、色素性視網(wǎng)膜炎、色素性視網(wǎng)膜炎和先天性耳聾、視網(wǎng)膜成神經(jīng)細(xì)胞瘤、視黃醇缺陷、視網(wǎng)膜先天性裂、青少年視網(wǎng)膜先天性裂、眼球退縮綜合征、眼球后神經(jīng)病變、豆?fàn)詈撕缶C合征、Rett綜合征、、Reye綜合征、Reye綜合征、RGS、Rh血液因子、Rh病、Rh因子不相容性、Rh不相容性、Rh[血型]不相容性、風(fēng)濕熱、風(fēng)濕熱、風(fēng)濕熱、鼻鼻竇性大腦蛛網(wǎng)膜炎、肢端斑點狀軟骨發(fā)育異常(RCDP)、缺過氧化氫酶血癥、傳統(tǒng)的Refsum病(多神經(jīng)炎型遺傳性運動失調(diào)病)、節(jié)律性肌陣攣、Rib GapDefects with Micrognathia、Ribbing病(不明顯)、Ribbing病(骨骺端軟骨發(fā)育不全)、里-漢二氏綜合征、Rieger綜合征、Rieter綜合征、右心室纖維化、賴?yán)?戴綜合征、賴-史二氏綜合征、環(huán)狀染色體14、環(huán)狀染色體18、環(huán)4、環(huán)4染色體、環(huán)6、環(huán)6染色體、環(huán)9、環(huán)9染色體R9、環(huán)14、環(huán)15染色體(鑲嵌樣圖象)、環(huán)18、環(huán)染色體18、環(huán)21、環(huán)21染色體、環(huán)22、環(huán)22染色體、里特病(新生兒剝脫性皮炎)、Ritter-Lyell綜合征、RLS、RMSS、Roberts SC-短肢綜合征、羅伯茨綜合征、羅伯茨短四肢畸形綜合征、Robertson外胚層發(fā)育不良、Robin形態(tài)缺陷、Robin序列征(原發(fā)缺陷-早期下頜發(fā)育不良)、Robin綜合征、Robinow侏儒癥、Robinow綜合征、Robinow綜合征顯性形式、Robinow綜合征隱性形式、線形體、羅杰病(先天性心室間隔缺損)、Rokitansky病、羅馬諾-沃德綜合征、龍貝里綜合征(進行性半面萎縮)，無根牙，Rosenberg-Chutorian綜合征、Rosewater綜合征、Rosselli-Gulienatti綜合征、Rothmund-Thomson綜合征(先天性血管萎縮性皮膚異色病)、羅-雷二氏綜合征、RP、伴X染色體的RS、RS(魯賓斯坦因綜合征)、RSDS、RSH綜合征、RSS(俄羅斯春夏型腦炎)、RSTS、RTS(魯賓斯坦(氏)綜合征)、先天性風(fēng)疹、魯賓斯坦因綜合征、魯-塔二氏綜合征、魯-塔二氏拇指與大趾增寬綜合征、赤發(fā)赤臉白化病、Ruhr綜合征、Russell間腦惡病質(zhì)、Russell綜合征、Russell綜合征(嬰兒間腦綜合征)、Russell-Silver侏儒癥、魯-辛二氏綜合征、伴X染色體的魯-辛二氏綜合征、魯-邁綜合征(RMSS)、魯瓦卡巴綜合征、Ruvalcaba型骨異常增生癥伴隨精神發(fā)育遲緩、骶骨退化、先天性骶骨發(fā)育不全、SAE、塞-科二氏綜合征、Sakati、Sakati綜合征、Sakati-Nyhan綜合征、點頭狀痙攣、涎腺出汗綜合征、Salzman小結(jié)狀角膜營養(yǎng)不良、桑德霍夫病、Sanfilippo綜合征、Sanfilippo型A、Sanfilippo型B、Santavuori病、Santavuori-Haltia病、Boeck結(jié)節(jié)病、肉樣瘤病、Sathre-chotzen、星期六麻痹、SBMA(脊延髓肌萎縮癥)、SC斷肢綜合征、SC綜合征、SCA3、SCAD缺陷、成人局部發(fā)作的SCAD缺陷、先天性全身SCAD缺陷、SCAD、SCAD缺陷、皮膚燙傷綜合征、先天性頭皮缺陷、舟狀頭、肩胛骨升高、Scapuloperoneal肌病、Scapuloperoneal肌肉營養(yǎng)不良、Scapuloperoneal綜合征疾病型、瘢痕形成大泡、SCHAD、Schaumann病、沙伊綜合征、SchereshevkII-Turner綜合征、席爾德病(彌漫性軸突周圍性腦炎)、席爾德腦炎、席爾德病、I型席爾德病(嬰兒發(fā)作)、嬰兒期的席爾德病、席爾德病、II型席爾德病(成人發(fā)作)、Schinzel綜合征、Schinzel-Giedon綜合征、Schinzel肢端解釋綜合征、Schinzel-Giedion面中部退縮綜合征、腦裂、精神分裂癥、愚型干骺端軟骨發(fā)育不良、愚型干骺端成骨不全、施-弗二氏綜合征、施密特綜合征、Schopf-Schultz-Passarge綜合征、Schueller-Christian病、Schut-Haymaker型、Schut-Haymaker-Passarge綜合征、1A型和1B型施-詹二氏綜合征、施-詹二氏綜合征、2型施-詹二氏綜合征、SCID、硬皮癥、全身漸進性家族硬化癥、彌散性家族腦硬化癥、坐骨神經(jīng)壓碎、Scott頭蓋骨綜合征伴隨智力遲鈍、溝舌、SCS、SD、SDS、SDYS、季節(jié)性結(jié)膜炎、脂腺痣綜合征、脂腺痣、脂溢性角化病、皮脂溢性疣、塞克爾綜合征、塞克爾型侏儒征、繼發(fā)性先天性心臟傳導(dǎo)阻滯、繼發(fā)性淀汾樣變性、繼發(fā)性瞼痙攣、繼發(fā)性非熱帶性口炎性腹瀉、繼發(fā)性布朗綜合征、繼發(fā)性腳氣病、繼發(fā)性全身淀粉樣病變、繼發(fā)性張力障礙、繼發(fā)性分泌小體缺陷、繼發(fā)性I gA缺陷、SED遲緩、先天性SED、SEDC、間歇性線狀無色痣、間歇性張力障礙、間歇性肌陣攣、塞普綜合征、Seitelberger病、癲癇、IgG亞型選擇性缺陷、選擇性緘默、IgG亞型選擇性缺陷、選擇性IgM缺陷、選擇性緘默、選擇性IgA缺陷、自體愈合細(xì)胞增多病、半葉性前腦無裂畸形、精細(xì)管萎縮癥、老年性視網(wǎng)膜劈裂癥、老年疣、Senior-Loken綜合征、I型遺傳性感覺神經(jīng)病、II型遺傳性感覺神經(jīng)病、I型遺傳性感覺神經(jīng)病、感覺神經(jīng)根性神經(jīng)病、退行性感覺神經(jīng)根性神經(jīng)病、膿毒漸進性肉芽腫病、Septo-Optic發(fā)育不良、血漿局限性腦膜炎、血清蛋白酶抑制劑缺陷、血漿肌肽酶缺陷、塞特萊斯綜合征、重度聯(lián)合免疫缺陷癥、重度聯(lián)合免疫缺陷癥伴隨腺苷脫胺酶缺陷、重度聯(lián)合免疫缺陷癥(SCID)、性轉(zhuǎn)換、性幼稚癥、SGB綜合征、希恩綜合征、Shields型牙質(zhì)生長不全、帶狀皰疹、水痘-帶狀皰疹病毒、航行腳氣病、SHORT綜合征、斷臂18染色體缺失綜合征、短鏈脂酰輔酶A脫氫酶(SCAD)缺陷、身材矮小和面毛細(xì)血管擴張、身材矮小性面/骨骼異常-阻滯-巨牙、身材矮小-伸展過度-Rieger異常-出牙延遲、身材矮小-甲發(fā)育不良、身材矮小和面毛細(xì)血管擴張性紅斑、SHORT綜合征、Shoshin腳氣病、肩胛帶綜合征、舒-戴二氏綜合征、Shwachman綜合征、Shwachman-Diamond-Oski綜合征、Shwachmann綜合征、夏-德綜合征、Shy-Ma gee綜合征、SI缺陷、粘脂病I型、II型嬰兒唾液酸沉積癥、唾液酸沉積癥、Sialolipidosis、病態(tài)竇房結(jié)綜合征、鐮狀細(xì)胞性貧血、鐮狀紅細(xì)胞病、鐮狀細(xì)胞-血紅蛋白C病、鐮狀細(xì)胞-血紅蛋白D病、鐮狀細(xì)胞-地中海貧血病、鐮刀樣細(xì)胞特征、高鐵成紅細(xì)胞性貧血、高鐵成紅細(xì)胞性貧血、成高鐵紅細(xì)胞染色、SIDS、Siegel-Cattan-Mamou綜合征、Siemens-Bloch型有色皮膚病、西門子綜合征、西爾弗綜合征、塞爾沃-魯塞爾侏儒癥、塞爾沃-魯塞爾綜合征、Simmond病、西門子綜合征、單一的表皮溶解性大皰、單一的畸形綜合征、Simpson-Golabi-Behmel綜合征、Sinding-Larsen-Johansson病、辛-梅二氏綜合征、竇性心律不齊、靜脈竇、竇性心動過速、人魚體序列征、并腿畸胎、內(nèi)臟逆位支氣管擴張和鼻竇炎、SJA綜合征、Sjogren Larsson并發(fā)性魚鱗病、舍格倫綜合征、

綜合征、SJS(史蒂文斯-約翰遜綜合征)、骨骼發(fā)育異常、Weismann Netter Stuhl型骨骼發(fā)育異常、脫皮綜合征、皮膚腫瘍、顱骨不對稱和輕度精神發(fā)育遲緩、顱骨不對稱和輕度并指、SLE(全身性紅斑狼瘡)、睡眠性呼吸暫停、SLO、Sly綜合征、SMA、嬰兒急性SMA、SMA I、SMA III、I型SMA、II型SMA、III型SMA、SMA 3、SMAX1、SMCR、Smith Lemli Opitz綜合征、Smith Magenis綜合征、Smith Magenis染色體部位、Smith-McCort侏儒癥、Smith病、Smoldering Myeloma、SMS、SNE、光線照射引起噴嚏、丙戊酸鈉、孤立性骨漿細(xì)胞瘤、Sorsby病、Sotos綜合征、Souques-Charcot綜合征、南非遺傳性卟啉病、痙攣性發(fā)音困難、痙攣性斜頸、痙攣性斜頸、痙攣性大腦性麻痹、痙攣性結(jié)腸、痙攣性發(fā)音困難、痙攣性截癱、SPD鈣質(zhì)沉著病、正常免疫球蛋白的特異抗體缺陷、特異閱讀障礙、SPH2、球形紅細(xì)胞性貧血、球形紅細(xì)胞癥、球形晶狀體-短矮畸形綜合征、鞘磷脂沉積癥、神經(jīng)鞘磷脂酶缺乏、蜘蛛狀指、斯皮爾梅伊爾-沃格特病、Spielmeyer-Vogt-Batten綜合征、脊柱裂、脊柱裂孔、脊柱裂孔、脊柱動靜脈畸形、家族遺傳性脊髓性共濟失調(diào)、脊髓性共濟失調(diào)、脊髓壓碎、脊髓彌漫性特發(fā)性骨肥厚、脊柱DISH、脊髓性肌萎縮、各型脊髓性肌萎縮、ALS型脊髓性肌萎縮、脊髓性肌萎縮-腓過度增生、I型脊髓性肌萎縮、III型脊髓性肌萎縮、3型脊髓性肌萎縮、脊髓性肌萎縮-腓過度增生、脊髓骨化蛛網(wǎng)膜炎、脊柱狹窄、脊髓小腦性共濟失調(diào)、I型脊髓小腦萎縮、I型脊髓小腦萎縮(SCA1)、II型脊髓小腦萎縮(SCA II)、III型脊髓小腦萎縮(SCAIII)、III型脊髓小腦萎縮(SCA3)、IV型脊髓小腦萎縮(SCAIV)、V型脊髓小腦萎縮(SCAV)、VI型脊髓小腦萎縮(SCAVI)、VII型脊髓小腦萎縮(SCAVII)，鉤端螺旋體性黃疸，脾發(fā)育不全綜合征、脾下垂、脾下垂、手裂畸形-下頜面骨發(fā)育不全、手裂畸形、脊椎關(guān)節(jié)炎、I型脊柱肋骨發(fā)育異常、脊椎骨骺遲緩性發(fā)育不良、脊椎胸廓結(jié)構(gòu)不良、脊椎關(guān)節(jié)強硬性馬尾神經(jīng)根病、海綿腎、多型性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、自發(fā)性低血糖、高位肩胛、春季卡他性眼炎、SRS、ST、腐敗魚綜合征、葡萄球菌皮膚燙傷綜合征、Stargardt病、Startle病、癲癇持續(xù)狀態(tài)、斯-里-奧三氏綜合征、硬毛病、斯坦-利文撒爾二氏綜合征、斯坦納特病、Stengel綜合征、Stengel-Batten-Mayou-Spielmeyer-Vogt-Stock病、狹窄性膽管炎、腰錐管狹窄、狹窄、類固醇硫酸脂酶缺乏、Stevanovic外胚層器官發(fā)育不良、Stevens Johnson綜合征、STGD、Stickler綜合征、硬漢綜合征、硬漢綜合征、Still病、施-特-杜三氏綜合征、Stillis病、刺激物敏感的肌陣攣、硬漢綜合征、硬漢、Streeter Anomaly、常染色體顯性型紋狀體黑質(zhì)變性、Striopallidodentate Calcinosis、間質(zhì)、德斯米膜、間質(zhì)角膜營養(yǎng)不良、淋巴瘤性甲狀腺腫、斯-卡-韋三氏綜合征、斯特奇-韋伯綜合征、斯特奇-韋伯斑痣性錯構(gòu)瘤病、亞急性海綿樣腦病、亞急性壞死性腦脊髓病、亞急性海綿樣腦病、亞急性壞死性腦病、亞急性肉樣瘤病、亞急性嗜神經(jīng)的、主動脈瓣下狹窄、動脈硬化性皮層下腦病、心內(nèi)膜下硬化、琥珀酰膽堿敏感性、先天性蔗糖酶-異麥芽糖酶缺陷、先天性蔗糖-異麥芽糖吸收不良癥、先天性蔗糖不耐受、嗜蘇丹型腦白質(zhì)營養(yǎng)不良ADL、嗜蘇丹型腦白質(zhì)營養(yǎng)不良佩-梅二氏病家族性腦中葉硬化型、內(nèi)藏嗜蘇丹型腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、嬰兒猝死綜合征、Sudeck氏萎縮癥、Sugio-KajII綜合征、Summerskill綜合征、尖頭并指、Summitt氏尖頭并指、Summitt綜合征、上斜肌鞘綜合征、腎上腺、主動脈瓣上狹窄、室上性心動過速、Surdicardiac綜合征、耶-蘭綜合征、持續(xù)室性心動過速、汗腺潰瘍、汗味綜合征、斯威特綜合征、瑞士干酪軟骨綜合征、阿佩爾(氏)綜合征、I型并指伴發(fā)小頭畸形和智力遲鈍、Syndromatic肝導(dǎo)管發(fā)育不全、脊髓空洞癥、全身性非白血病性網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增殖、系統(tǒng)性淀粉樣變性、全身肉堿缺乏癥、系統(tǒng)性彈性破裂、全身性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性肥大細(xì)胞病、全身性肥大細(xì)胞增多癥、全身性幼年型關(guān)節(jié)炎、全身性硬化癥、Systopic脾、胸腺依賴性淋巴細(xì)胞缺乏、食物進腸過速低血糖癥、心動過速、塔卡熱綜合征、主動脈弓綜合征、大動脈炎、仰趾足、馬蹄內(nèi)翻足、馬蹄足、內(nèi)翻足、外翻足、縱排脊柱狹窄、丹吉爾病、視網(wǎng)膜毯層變性、橈骨發(fā)育不全-血小板減少綜合征、遲發(fā)性張力障礙、遲發(fā)性肌肉萎縮癥、遲發(fā)性運動障礙、遲發(fā)性口部運動障礙、遲發(fā)性張力障礙、緩慢尺骨麻痹、靶型紅細(xì)胞貧血、巨跟骨、垂井病、內(nèi)含TAS中線缺乏、TAS中線缺乏、Tay Sachs鞘脂類代謝障礙、泰-薩克斯病、Tay魚鱗病綜合征、Tay Sachs鞘脂類代謝障礙、Tay魚鱗病綜合征、I型塔伊貝綜合征、塔伊貝綜合征、TCD、TCOF1、特-柯二氏綜合征、變形性肌張力不全、毛發(fā)-牙齒-骨綜合征、I型毛發(fā)-牙齒-骨綜合征、II型毛發(fā)-牙齒-骨綜合征、III型毛發(fā)-牙齒-骨綜合征、毛細(xì)血管擴張、內(nèi)眥距離過寬與并發(fā)畸形、內(nèi)眥距離過寬-尿道下裂綜合征、顳葉性癲癇、顳颥動脈炎/巨細(xì)胞動脈炎、顳颥動脈炎、中毒性上皮壞死、腱鞘上部斜粘著、張力肌痛、4q內(nèi)末端缺失、Terrian角膜營養(yǎng)不良、角膜營養(yǎng)不良綜合征、脊索受限綜合征、脊索受限畸形序列征、脊髓栓系綜合征、頸部脊索受限綜合征、四氫生物喋呤缺乏、四氫生物喋呤缺乏、法樂(氏)四聯(lián)癥、短四肢畸形-血小板減少綜合征、9號染色體短臂四體性、9p四體性、18號染色體短臂四體性、丘腦綜合征、丘腦性疼痛綜合征、丘腦感覺過敏性感覺缺失、中型地中海貧血、輕型地中海貧血、重型地中海貧血、硫胺素缺乏癥、硫胺素反應(yīng)型楓糖尿病、薄基底膜型腎病、乙酰輔酶A乙?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥、RCDP、酰基輔酶A磷酸二羥丙酮?；D(zhuǎn)移酶、第三和第四咽囊綜合征、三度先天性心臟傳導(dǎo)阻滯、肌強直性白內(nèi)障、胸盆指(趾)營養(yǎng)不良、胸脊椎管、胸腹綜合征、胸腹心異位綜合征、三M綜合征、三M細(xì)骨型侏儒癥、Glanzmann and Naegeli血小板機能不全、原發(fā)性血小板增多癥、血小板減少-橈骨缺失綜合征、血小板減少及血管瘤綜合征、AT III引起的遺傳性血栓形成傾向、血栓性血小板減少性紫癜、血栓性潰瘍性結(jié)腸炎、胸腺發(fā)育不良伴正常免疫球蛋白、胸腺發(fā)育不全、DiGeorge型胸腺發(fā)育不全、原發(fā)性胸腺發(fā)育不全伴無γ球蛋白血癥、DiGeorge型胸腺發(fā)育不全、先天性胸腺發(fā)育不全、三叉神經(jīng)痛、抽搐、Tinel’s綜合征、托洛薩-亨特綜合征、強直性痙攣性斜頸、強直性瞳孔綜合征、牙齒和指甲綜合征、弓形體病、其他病毒、風(fēng)疹、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒感染、TORCH綜合征、變形性肌張力不全、斜頸、全身性脂肪營養(yǎng)不良、完全性肺靜脈異常連接、Touraine’s口瘡病、穢語綜合征、Tourette障礙、Townes-Brocks綜合征、湯斯綜合征、中毒性麻痹性貧血、中毒性表皮壞死溶解、Toxopachyosteose DiaphysaireTibio-Peroniere、Toxopachyosteose、弓形體病和病毒性風(fēng)疹、細(xì)胞巨化病毒、單純性皰疹、伴有或不伴有食管閉鎖的氣管食管瘺、氣管食管瘺、一過性新生兒重癥肌無力、過渡型房室間隔缺損、大動脈轉(zhuǎn)位、經(jīng)電話傳送監(jiān)護、蛋氨酸-30甲狀腺激素結(jié)合蛋白淀粉樣變性病(I型)、Trapezoidocephaly-多重骨連接綜合征、特雷歇·柯林斯(氏)綜合征、特-弗二氏綜合征、Trevor病、三心房心臟、毛發(fā)-牙齒-骨綜合征、(毛)發(fā)灰白營養(yǎng)不良、毛發(fā)-鼻-指(趾)綜合征、三尖瓣閉鎖、三功能蛋白質(zhì)缺乏癥、三叉神經(jīng)痛、甘油三酯儲存障礙、長鏈脂肪酸氧化受損、膀胱三角炎、三角頭、三角頭綜合征、三角頭C綜合征、三甲基氨基酸尿癥、三指節(jié)拇指發(fā)育不全遠(yuǎn)端指甲營養(yǎng)不良、拇指三節(jié)指骨綜合征、Behcet三聯(lián)體綜合征、三X染色體綜合征、第四染色體三體綜合征、三倍體綜合征、三倍性、三倍性綜合征、牙關(guān)緊閉假屈曲指綜合征、三體性、三體性G綜合征、三體性X、6q部分三體性、部分6q三體性綜合征、嵌合型9三體性、9P三體綜合征、部分11q三體性、嵌合型14三體性、嵌合型14三體性綜合征、21(號染色體)三體型綜合征、嵌合型22三體性、嵌合型22三體性綜合征、TRPS，TRPS1，TRPS2，TRPS3、真雌雄同體、動脈干、色氨酸吸收不良、色氨酸加氧酶綜合征、TS，TTP，TTTS，結(jié)節(jié)性(腦)硬化、腎小管擴張、特科特綜合征、特納綜合征、遺傳性骨-指(趾)甲發(fā)育不良綜合征、伴有正常染色體(核型)的特納綜合征、Turner-Varny綜合征、尖形頭、孿生兒輸血綜合征、雙生胎兒血液交換綜合征、A型、B型、AB型、O型、I型糖尿病、I型家族性不完全男性、不完全性男性假兩性畸形、I型戈謝病(家族性脾性貧血、葡萄糖腦苷脂酶缺乏癥)、I型組織細(xì)胞增多病、II型(PCCB缺乏癥)、II型酪氨酸血癥、間歇性缺血性心跳驟停、先天性末端多關(guān)節(jié)攣縮、III型戈謝病(家族性脾性貧血、葡萄糖腦苷脂酶缺乏癥)、III型酪氨酸血癥、III型遺傳性乳光牙本質(zhì)、典型性視網(wǎng)膜先天性裂、酪氨酸酶陰性白化病(I型)、酪氨酸酶陽性白化病(II型)、I型酪氨酸血癥急性型、I型酪氨酸血癥慢性型、酪氨酸病、尿素循環(huán)酶病、潰瘍性結(jié)腸炎、非特異性慢性潰瘍性結(jié)腸炎、尺骨乳房綜合征、Pallister尺骨乳房綜合征、尺神經(jīng)麻痹、潛水醫(yī)學(xué)會、公開病愈率、Unconjugated Benign Bilirubinemiav、甲狀旁腺活動低下、單側(cè)魚鱗病樣紅斑伴同側(cè)肢體畸形、單側(cè)軟骨瘤病、單側(cè)胸肌缺陷及并指、單側(cè)半發(fā)育不良、單側(cè)巨腦、單側(cè)部分脂肪代謝障礙、單側(cè)腎發(fā)育不全、結(jié)腸不規(guī)則、肌陣攣性癲癇、翁-倫病(肌陣攣)、Unverricht-Lundborg-Laf Disease、進行性肌陣攣性癲癇、上肢-心血管綜合征(Holt-Oram)，上運動神經(jīng)元病、上呼吸道呼吸暫停、尿素循環(huán)障礙、精氨酸酶型尿素循環(huán)障礙、精氨酸琥珀酸酶型尿素循環(huán)障礙、氨甲?；姿岷铣擅感湍蛩匮h(huán)障礙、瓜氨酸血癥型尿素循環(huán)障礙、典型性N-丙烯基谷氨酸合成酶型尿素循環(huán)障礙、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶型尿素循環(huán)障礙、尿道綜合征、尿道-眼-關(guān)節(jié)綜合征、I型重癥二磷酸尿苷葡萄糖苷酸(基)轉(zhuǎn)移酶缺乏癥、尿道缺陷、Urofacial綜合征、III型六氫尿卟啉共合成酶、色素性蕁麻疹、烏謝爾綜合征(先天性聾視網(wǎng)膜色素變性綜合征)、I型烏謝爾綜合征、II型烏謝爾綜合征、III型烏謝爾綜合征、IV型烏謝爾綜合征、子宮粘連、Uoporphyrinogen I合成酶、眼色素層炎、眼色素層腦膜炎綜合征、變異的克雅氏病、VACTEL聯(lián)合征、VACTERL聯(lián)合征、VACTERL綜合征、跟骨外翻、纈氨酸轉(zhuǎn)酰胺酶缺乏癥、纈氨酸血癥、丙戊酸、丙戊酸鹽接觸、丙戊酸接觸、丙戊酸、Van Buren’s病、Van der Hoeve-Habertsma-Waardenburg-Gauldi綜合征、不定期發(fā)病免疫球蛋白缺乏癥丙種球蛋白異常血癥、變異的克羅伊茨費爾特-雅各布病、水痘胚胎病、多樣性卟啉病、脈管性胎記、Binswanger’s型脈管性癡呆、脈管性勃起組織瘤、脈管性血友病、血管畸形、腦血管畸形、血管炎、血管舒縮失調(diào)、加壓素抵抗性尿崩癥、加壓素敏感性尿崩癥、法特聯(lián)合征、vcf綜合征、vcf，Velocardiofacial綜合征、性病的關(guān)節(jié)炎、靜脈畸形、心室纖維性顫動、心室間隔缺損、先天性心室缺損、心室間隔缺損、室性心動過速、小靜脈畸形、VEOHD、小腦蚓發(fā)育不全、小腦發(fā)育不全、春季角(膜)結(jié)膜炎、毛瘤、脊椎的肛門的氣管食管的食管的橈骨的、脊椎強直性骨肥厚、Huntington’s舞蹈癥的早期發(fā)作、極長鏈乙酰輔酶A脫氫酶缺乏癥、前庭神經(jīng)鞘瘤、前庭神經(jīng)鞘瘤多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤、前庭小腦的、Virchow’s尖頭、內(nèi)臟黃肉芽腫病、內(nèi)臟黃肉芽腫病、內(nèi)臟肌病-外部眼肌麻痹、內(nèi)臟肥大-臍帶突出-巨舌綜合征、視性失語、維生素A缺乏癥、維生素B1缺乏癥、黃斑營養(yǎng)不良、白癜風(fēng)、頭部白癜風(fēng)、玻璃體視網(wǎng)膜變性、春季角(膜)結(jié)膜炎、伏格特-小柳-原田三氏綜合征、VLCAD、沃格特綜合征(紋狀體綜合征)、Vogt Cephalosyndactyly、Vogt Koyanagi Harada綜合征、(馮)別-施二氏綜合征、Von Eulenburg先天性肌強直病、Von Frey’s綜合征、馮·吉爾克病、(馮)希-林二氏綜合征、Von Mikulicz綜合征、馮·雷克林霍曾病、Von Willebrandt病、后葉加壓素、弗龍里克病(I型)、室間隔缺損、普通型角化病、普通型魚鱗病、W綜合征、瓦爾敦堡綜合征、瓦-克二氏綜合征、瓦爾敦堡綜合征(I型)、瓦爾敦堡綜合征(II型)、II A型瓦爾敦堡綜合征、II B型瓦爾敦堡綜合征、III型瓦爾敦堡綜合征、IV型瓦爾敦堡綜合征、Waelsch’s綜合征、WAGR復(fù)合體、WAGR綜合征、Waldenstroem’s巨球蛋白血癥、Waldenstrom’s Purpura、Waldenstrom’s綜合征、Waldmann病、Walker-Warburg綜合征、游動脾、Warburg綜合征、溫型抗體溶血性貧血、溫型交叉反應(yīng)抗體疾病、瓦滕貝格綜合征、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、腦部水分、細(xì)菌性心內(nèi)膜炎、Watson-Alagille綜合征、沃-弗二氏綜合征、蠟質(zhì)的疾病、威-貝二氏綜合征、韋弗綜合征、Weaver-Smith綜合征、Weber-Cockayne病、Wegener’s肉芽腫病、韋爾病(鉤端螺旋體性黃疸)、Weil綜合征、Weill-Marchesani、韋-馬二氏綜合征、Weill-Reyes綜合征、Weismann-Netter-Stuhl綜合征、Weissenbacher-Zweymuller綜合征、韋爾綜合征、Wenckebach、Werdnig-Hoffman病、Werdnig-Hoffman癱瘓、Werlhof’s病、沃納綜合征、Wernicke’s(C)I綜合征、Wernicke’s失語癥、Wernicke-Korsakoff綜合征、韋斯特綜合征、濕性腳氣病、WHCR、Whipple’s病、腸脂肪肉芽腫癥、吹口哨面容綜合征、吹口哨面容及風(fēng)車葉狀手綜合征、White-Darier病、懷-諾二氏綜合征、輪生痣樣黑色素過度病、WHS、Wieacker綜合征、Wieacker綜合征、Wieacker-Wolff綜合征、Wiedmann-Beckwith綜合征、Wiedemann-Rautenstrauch綜合征、維爾德穆特綜合征，Willebrand-Juergens病、威-普二氏綜合征，威廉斯綜合征、Williams-Beuren綜合征、腎母細(xì)胞瘤，腎母細(xì)胞瘤-虹膜缺失-成性腺細(xì)胞瘤-智力發(fā)育遲緩綜合征、腎母細(xì)胞瘤-虹膜缺失-成性腺細(xì)胞瘤-智力發(fā)育遲緩、腎母細(xì)胞瘤-虹膜缺失-成性腺細(xì)胞瘤-智力發(fā)育遲緩綜合征、腎母細(xì)胞瘤-假兩性畸形-腎病、腎母細(xì)胞瘤和假兩性畸形、腎母細(xì)胞瘤-假兩性畸形-腎小球病、Wilson’s病、Wilson’s綜合征、Winchester-Grossman綜合征、維-奧二氏綜合征、Wiskott-Aldrich型免疫缺陷、頭皮白痂病外胚層器官發(fā)育不良、頭皮白痂病牙齒-指甲綜合征、Wittmaack-Ekbom綜合征、WM綜合征、韋克斯勒記憶量表、WNS、Wohlfart病、沃-庫-韋病(遺傳性近位性神經(jīng)原性肌萎縮癥)、4號染色體短臂部分單體綜合征、Wolf-Hirschhorn染色體區(qū)域(WHCR)、Wolf-Hirschhorn綜合征、沃-帕-懷綜合征、遺傳性少年型糖尿病、沃爾曼病(酸性脂肪酶缺乏所致溶酶體貯積病)、WoodyGuthrie’s病、吾-巴-懷三氏綜合征、Writer’s痙攣、WS，WSS，WWS、視網(wǎng)膜動靜脈瘤、X染色體連鎖的Addison’s病、X染色體連鎖的腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥、X染色體連鎖的成人脊延髓肌萎縮癥、X染色體連鎖的成人脊髓性肌萎縮、x連鎖無丙種球蛋白血癥伴生長激素缺乏癥、x連鎖無丙種球蛋白血癥，淋巴組織增生型X連鎖綜合征、X連鎖的心肌病和中性粒細(xì)胞減少癥、X連鎖的中央核型肌病、X-連鎖銅缺乏癥、X連鎖的銅吸收不良、X連鎖的顯性康-許二氏綜合征、X連鎖的顯性遺傳性胼胝體發(fā)育不良、X連鎖的張力障礙-帕金森綜合征、X連鎖的魚鱗病、嬰兒伴性無丙種球蛋白血癥、X連鎖的新生兒Nectrotizing腦病、X連鎖的青年性視網(wǎng)膜劈裂癥、X連鎖的無腦回癥、X連鎖的淋巴組織增生綜合征、X連鎖的智力發(fā)育低下-緊握的拇指綜合征、X連鎖的智力發(fā)育低下伴張力減退、X連鎖的智力發(fā)育低下和巨睪丸、X連鎖的進行性多樣性免疫缺陷、X連鎖的隱性康-許二氏綜合征、X連鎖的隱性重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征、X連鎖的視網(wǎng)膜先天性裂、X連鎖的脊柱骨骺發(fā)育不良、黃嘌呤氧化酶缺乏癥(黃嘌呤尿缺乏、遺傳性)、全身的黃肉芽腫病、結(jié)節(jié)性黃瘤，著色性干皮病、顯性著色性干皮病、AIXPA型著色性干皮病、Type B II XPB著色性干皮病、Type E V XPE著色性干皮病、Type C III XPC著色性干皮病、Type D IV XPD著色性干皮病、TypeF VI XPF著色性干皮病、Type G VII XPG著色性干皮病、著色性干皮病變種Type XP-V、干皮病-畸形足琺瑯質(zhì)缺陷、干皮性白癡、干眼癥，干燥性角膜炎、X連鎖淋巴組織增生、先天性性腺發(fā)育不全綜合征、著色性干皮病、XX男性綜合征、性別逆轉(zhuǎn)、XXXXX綜合征、XXY綜合征、XYY綜合征、XYY染色體模式、黃色突變性白化病、黃指(趾)甲綜合征、YKL，年青女性動脈炎、Yunis-Varon綜合征、YY綜合征、Z-E綜合征、Z和蛋白酶抑制劑缺乏癥、澤韋格綜合征、Zellweger腦-肝-腎綜合征、佐-埃二氏綜合征、齊-奧二氏病(變形性肌張力不全)、濟-拉二氏綜合征、先天性鋅缺乏、津-柯-恩三氏綜合征、ZLS、佐林格-埃利森綜合征。
在一個具體實施方案中，含有由分離TNF-α或其嵌合分子的藥物組合物可以與其它生物制品、藥物或治療聯(lián)合應(yīng)用或單獨應(yīng)用、用于治療疾病或癥狀例如許多實體瘤(尤其是靶向去除腫瘤)包括內(nèi)分泌腺腫瘤、胃腸癌、頭頸部癌、腎臟和生殖泌尿器腫瘤、惡性黑色素瘤、食管癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、軟組織肉瘤如手和腿、肝癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、膽管癌；傳染性疾病如HIV感染、以及相關(guān)的疾癥如Kaposi肉瘤、治療瘧疾、結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、單核細(xì)胞增多性李司忒菌、鼠傷寒沙門菌、成人利什曼病、克氏錐蟲、鼠弓形體、Plasmodium chaubaudi、惡性瘧原蟲、丙型肝炎、SARS病毒感染以及嗜肺性菌團病桿菌肺炎；睡眠障礙例如睡眠性呼吸暫停；肥胖癥(用于脂肪組織切除)和多種病狀(用于一般組織切除)。
在另一個具體實施方案中，含有分離LT-α或其嵌合分子的藥物組合物可以與其它生物制品、藥物或治療聯(lián)合應(yīng)用或單獨應(yīng)用，用于治療腫瘤生長和轉(zhuǎn)移相關(guān)的疾病，包括成人實體瘤、內(nèi)分泌腺腫瘤、胃腸癌、頭頸部癌、腎臟和生殖泌尿器腫瘤、惡性黑色素瘤、肉瘤、食管癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌及轉(zhuǎn)移性骨癌；放射或細(xì)胞毒抗癌藥物引起的細(xì)胞損傷效應(yīng)；傳染性疾病如HIV感染、以及相關(guān)的疾癥如Kaposi肉瘤、治療瘧疾、結(jié)核分枝桿菌、鳥分枝桿菌、單核細(xì)胞增多性李司忒菌、鼠傷寒沙門菌、成人利什曼病、克氏錐蟲、鼠弓形體、丙型肝炎、SARS、冠狀病毒感染以及嗜肺性菌團病桿菌肺炎；神經(jīng)再生如神經(jīng)壓碎損傷后運動功能康復(fù)；敗血癥；以及惡病質(zhì)；自身免疫性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，炎性腸病，例如Crohn??；多發(fā)性硬化癥；以及糖尿病。
在另一個具體實施方案中，含有分離TNFRI或其嵌合分子如TNFRI-Fc的藥物組合物可以與其它生物制品、藥物或治療聯(lián)合應(yīng)用或單獨應(yīng)用，用于治療傳染性疾病如HIV；丙型肝炎；HIV-1相關(guān)的結(jié)核??；SARS；冠狀病毒感染；重度敗血癥；敗血癥性休克，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌；肉毒素性休克；關(guān)節(jié)炎包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多關(guān)節(jié)幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(JRA)、脊椎關(guān)節(jié)病、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、重度痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、幼年原發(fā)性關(guān)節(jié)炎、慢性多關(guān)節(jié)炎、全身性紅斑狼瘡；疼痛如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、口腔手術(shù)后的疼痛和腫脹、顳頜關(guān)節(jié)病、慢性背部和/或頸部關(guān)節(jié)相關(guān)的疼痛、重度急性坐骨神經(jīng)痛、骨轉(zhuǎn)移引起的疼痛、髓核脫出引起的坐骨神經(jīng)痛、多區(qū)域疼痛綜合癥-1型(CRPS 1)；牛皮癬；哮喘；呼吸道的過敏性和非過敏性炎癥反應(yīng)；Wegener肉芽腫?。黄ぜ⊙?；多發(fā)性肌炎；眼色素層炎；非傳染性鞏膜炎；骨髓增生異常綜合癥；Graves眼病；強直性脊柱炎患者的鞏膜炎；血管炎；小血管炎；復(fù)發(fā)性脂膜炎；腫瘤壞死因子受體相關(guān)的周期性綜合癥(TRAPS)；韋-克二氏病(WCD)；貝切特??；丘-施二氏血管炎；丘-施二氏綜合癥；結(jié)節(jié)性多動脈炎；巨細(xì)胞動脈眼；郝-伯二氏??；多發(fā)性肌炎/皮肌炎；Sjogren綜合癥；睡眠性呼吸暫?；颊叩氖人Y例如在肥胖癥患者中由阻塞性睡眠呼吸暫停引起；多中心網(wǎng)狀組織細(xì)胞增多癥；壞疽性膿皮癥；大動脈炎；心臟線粒體功能障礙，大動脈炎，以及心力衰竭時的凋亡；成年開始的大動脈炎(AOSD)；Crohn??；酒精性肝炎；肌炎；巨細(xì)胞動脈炎；原發(fā)的子宮內(nèi)膜異位；慢性嬰兒神經(jīng)表皮關(guān)節(jié)網(wǎng)(CINCA)綜合癥；格-巴二氏綜合征；郝-伯二氏??；潰瘍性口炎；假體外周的骨質(zhì)溶解例如在全髖關(guān)節(jié)置換后；原發(fā)性淀粉樣變性；血免疫球蛋白過多癥和周期熱綜合癥；男性和女性的不育癥；內(nèi)耳炎；朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥；免疫性血小板減少性紫癜；慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)?。欢嘀行木W(wǎng)狀組織細(xì)胞增多癥；自身免疫性淚腺炎；周圍神經(jīng)病例如腹部疾??；多軟骨炎；腸壁囊樣積氣癥；神經(jīng)類肉瘤病；色素絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎；壞死性脈管炎；急性兒童潰瘍性結(jié)腸炎；炎性腸??；川畸病；肌病例如在進行性假肥大性肌營養(yǎng)不良(DMD)時；亞-貝二氏綜合癥引起的眼鏡感染；Hallopeau持續(xù)性肢端皮炎；化膿性汗腺炎；腎淀粉樣變性；不明原因的結(jié)腸炎；移植后閉塞性細(xì)支氣管炎；增生性膿性口腔炎；SAPHO綜合癥；脂性漸進性壞死；紅人綜合癥；腫瘤例如乳腺癌包括聯(lián)合化療或其它生物生物治療；腫瘤相關(guān)的惡病質(zhì)；皮膚T淋巴細(xì)胞瘤；移植排斥現(xiàn)象例如移植物抗宿主病(GVHD)(例如急性非傳染性肺病(原發(fā)性肺炎綜合癥，IPS)以及同種異體干細(xì)胞移植后的亞急性肺功能障礙)；肺移植缺血-再灌注損傷；重度抗類固醇急性GVHD；在造血干細(xì)胞移植時；在器官移植時，例如慢性移植損傷如腎移植。
然而，在另一個具體實施方案中，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時，TNFRI分子或嵌合分子如TNFRI-Fc組成的藥物組合物也可以與甲氨喋呤聯(lián)合給藥。在另一個具體實施方案中，本發(fā)明與其它生物活性分子聯(lián)合給藥，例如來氟米特、硫唑嘌呤、環(huán)胞素A或柳氮磺吡啶或其它單克隆抗體(例如抗-TNF抗體，Mac I或LFA I抗體)或其它與TNF產(chǎn)物相關(guān)的受體包括IL-1或IL-2受體。
在另一個具體實施方案中，含有分離TNFRII或其嵌合分子的藥物組合物可以與其它生物制品、藥物或治療聯(lián)合應(yīng)用或單獨應(yīng)用，用于治療傳染性疾病如HIV；丙型肝炎；HIV-1相關(guān)的結(jié)核??；SARS；冠狀病毒感染；重度敗血癥；敗血癥性休克，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌；肉毒素性休克；關(guān)節(jié)炎包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，多關(guān)節(jié)幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(JRA)，脊椎關(guān)節(jié)病，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，重度痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，強直性脊柱炎，幼年原發(fā)性關(guān)節(jié)炎，慢性多關(guān)節(jié)炎，全身性紅斑狼瘡；疼痛如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，口腔手術(shù)后的疼痛和腫脹，顳頜關(guān)節(jié)病，慢性背部和/或頸部關(guān)節(jié)相關(guān)的疼痛，重度急性坐骨神經(jīng)痛，骨轉(zhuǎn)移引起的疼痛，髓核脫出引起的坐骨神經(jīng)痛，多區(qū)域疼痛綜合癥-1型(CRPS 1)；牛皮癬；哮喘；呼吸道的過敏性和非過敏性炎癥反應(yīng)；Wegener肉芽腫?。黄ぜ⊙?；多發(fā)性肌炎；眼色素層炎；非傳染性鞏膜炎；骨髓增生異常綜合癥；Graves眼??；強直性脊柱炎患者的鞏膜炎；血管炎；小血管炎；復(fù)發(fā)性脂膜炎；腫瘤壞死因子受體相關(guān)的周期性綜合癥(TRAPS)；韋-克二氏病(WCD)；貝切特?。磺?施二氏血管炎；丘-施二氏綜合癥；結(jié)節(jié)性多動脈炎；巨細(xì)胞動脈眼；郝-伯二氏?。欢喟l(fā)性肌炎/皮肌炎；Sjogren綜合癥；睡眠性呼吸暫?；颊叩氖人Y例如在肥胖癥患者中由阻塞性睡眠呼吸暫停引起；多中心網(wǎng)狀組織細(xì)胞增多癥；壞疽性膿皮癥；大動脈炎；心臟線粒體功能障礙，氧化應(yīng)激，以及心力衰竭時的凋亡；成人發(fā)作的Stills病(AOSD)；Crohn病；酒精性肝炎；肌炎；巨細(xì)胞動脈炎；原發(fā)的子宮內(nèi)膜異位；慢性嬰兒神經(jīng)表皮關(guān)節(jié)網(wǎng)(CINCA)綜合癥；格-巴二氏綜合征；郝-伯二氏??；潰瘍性口炎；假體外周的骨質(zhì)溶解例如在全髖關(guān)節(jié)置換后；原發(fā)性淀粉樣變性；血免疫球蛋白過多癥和周期熱綜合癥；男性和女性的不育癥；內(nèi)耳炎；朗格漢斯細(xì)胞組織細(xì)胞增生癥；免疫性血小板減少性紫癜；慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病；多中心網(wǎng)狀組織細(xì)胞增多癥；自身免疫性淚腺炎；周圍神經(jīng)病例如腹部疾病；多軟骨炎；腸壁囊樣積氣癥；神經(jīng)類肉瘤??；色素絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎；壞死性脈管炎；急性兒童潰瘍性結(jié)腸炎；炎性腸??；川畸病；肌病例如在進行性假肥大性肌營養(yǎng)不良(DMD)時；亞-貝二氏綜合癥引起的眼鏡感染；Hallopeau持續(xù)性肢端皮炎；化膿性汗腺炎；腎淀粉樣變性；不明原因的結(jié)腸炎；移植后閉塞性細(xì)支氣管炎；增生性膿性口腔炎；SAPHO綜合癥；脂性漸進性壞死；紅人綜合癥；腫瘤例如乳腺癌包括聯(lián)合化療或其它生物生物治療；腫瘤相關(guān)的惡病質(zhì)；皮膚T淋巴細(xì)胞瘤；移植排斥現(xiàn)象例如移植物抗宿主病(GVHD)(例如急性非傳染性肺病(原發(fā)性肺炎綜合癥，IPS)以及同種異體干細(xì)胞移植后的亞急性肺功能障礙)；肺移植缺血-再灌注損傷；重度抗類固醇急性GVHD；在造血干細(xì)胞移植時；在器官移植時，例如慢性移植損傷如腎移植。
治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時，含有TNFRII分子或TNFRII嵌合分子的藥物組合物也可以與甲氨喋呤聯(lián)合給藥。然而，在另一個具體實施方案中，本發(fā)明與其它生物活性分子聯(lián)合給藥，例如來氟米特，硫唑嘌呤，環(huán)胞素A或柳氮磺吡啶或其它單克隆抗體(例如抗-TNF抗體，Maci或LFAI抗體)或其它與TNF產(chǎn)物相關(guān)的受體包括IL-1或il-2受體。
在另一個具體實施方案中，含有分離OX40或其嵌合分子的藥物組合物可以與其它生物制品、藥物或治療聯(lián)合應(yīng)用或單獨應(yīng)用，用于治療包括單不限于T細(xì)胞介導(dǎo)的疾病例如過敏性、炎性和自身免疫性疾病例如移植排斥、自身免疫性疾病和炎癥、移植物抗宿主病(GVHD)、同種異體骨髓移植后的急性GVHD、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、炎性腸病、實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)、多發(fā)性硬化癥、腫瘤、狼瘡性腎炎、炎性腸病、哮喘、多發(fā)性硬化癥；Crohn?。粷冃越Y(jié)腸炎；潰瘍性結(jié)腸炎；乳腺癌、結(jié)腸直腸癌、自身免疫性腦炎、炎性肺損傷例如流感引起的哮喘和肺炎以及自身免疫性糖尿病。
在另一個具體實施方案中，含有分離BAFF或其嵌合分子的藥物組合物可以與其它生物制品、藥物或治療聯(lián)合應(yīng)用或單獨應(yīng)用，用于調(diào)節(jié)B細(xì)胞、T細(xì)胞、樹狀突細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的生物學(xué)過程，并激活BAFFR，例如增加B淋巴細(xì)胞的增殖、活化和存活；用于治療免疫缺陷(例如B淋巴細(xì)胞增殖、活化或存活不充分的患者，或者一般變異免疫缺陷(CVID)患者，或IgA缺陷的患者)；用于在接種疫苗的過程中增加抗體的產(chǎn)生；用于治療B細(xì)胞惡性瘤例如慢性淋巴細(xì)胞性白血病(B-CLL)，非Hodgkin淋巴瘤(NHL)，以及多發(fā)性骨髓瘤(MM)。
然而，在另一個具體實施方案中，BAFF連接于放射性核素、毒素或化療藥物，作為一種治療方法，可以用于靶向并殺死B細(xì)胞惡性瘤。合適的放射性核素例如包括碘-123，碘-131，锝-99和釔-90。合適的毒素例如包括vanous toxin和截短的假單胞菌外毒素。
在另一個具體實施方案中，BAFF(以及含有BAFF的嵌合分子)的氨基酸變體，具有BAFF拮抗活性，可以用于治療BAFF 3表達下調(diào)相關(guān)的疾病，例如B細(xì)胞淋巴瘤和自身免疫性疾病。
在另一個具體實施方案中，含有分離NGFR或其嵌合分子的藥物組合物可以與其它生物制品、藥物或治療聯(lián)合應(yīng)用或單獨應(yīng)用，用于抑制乳腺癌的生長以及其它腫瘤，其中NGF和其它NGFR配體為促有絲分裂劑；用于抑制神經(jīng)源性炎癥引起的表皮和全身性炎性疾病的發(fā)病，例如牛皮癬，異位性皮炎，蕁麻疹，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，潰瘍性結(jié)腸炎和支氣管哮喘；在HIV感染患者中，去除HIV感染的巨嗜細(xì)胞；以及阻斷脊髓損傷后自主性反射異常如膀胱反射亢進的進展。
在另一個具體實施方案中，含有分離Fas配體或其嵌合分子的藥物組合物可以與其它生物制品、藥物或治療聯(lián)合應(yīng)用或單獨應(yīng)用，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，移植物抗宿主病，中毒性表皮壞死溶解，自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合癥，免疫缺陷，肝衰竭，Alzheimer病，多發(fā)性硬化癥，骨髓損傷和中風(fēng)后的神經(jīng)再生。
然而，在另一個具體實施方案中，含有分離Fas配體或其嵌合分子的藥物組合物可以與其它藥物或治療聯(lián)合應(yīng)用或單獨應(yīng)用，用于促進同種異體移植物的存活，以及預(yù)防自身免疫性疾病包括多發(fā)性硬化癥和糖尿病的發(fā)作。
在另一個具體實施方案中，含有分離Fas配體或其嵌合分子的藥物組合物可以與其它藥物或治療聯(lián)合應(yīng)用或單獨應(yīng)用，用于在許多不同的惡性疾病中誘導(dǎo)凋亡，包括非白血性白血病，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，乳腺癌和其它實體瘤，它們都表達Fas。
而且，本發(fā)明的藥用藥物組合物有更高的藥效，更強的熱穩(wěn)定性，更長的血清半衰期或在與表達在非人細(xì)胞系的蛋白質(zhì)或其嵌合體相比時具有更高的血液溶解性。本發(fā)明也表現(xiàn)出了更低的免疫相關(guān)的清除作用或相關(guān)副作用。由于這些改良的特性，與表達在非人細(xì)胞系的蛋白質(zhì)或其嵌合體相比本發(fā)明的藥物組合物可以以更低的頻率給藥。降低給藥頻率可以增強病人的適應(yīng)性從而有利于治療結(jié)果。病人的生活質(zhì)量同樣也會有所提高。
因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可以以治療劑量用與表達在非人細(xì)胞系的蛋白質(zhì)或其嵌合體相同的給藥方式給藥。治療劑量是指產(chǎn)生體內(nèi)活性必須的藥物組合物的量。給予復(fù)合物的精確的量由如所治療癥狀的準(zhǔn)確類型、治療病人的身體條件和藥物組合物中的其他成分等因素決定。含有本發(fā)明蛋白或嵌合分子同工型的藥物組合物可以以利于給藥的不同的配方配制用以治療具有上述一個或多個癥狀的病人。藥物組合物的平均治療有效程度可能有所不同。預(yù)計的有效劑量在0.1ng/kg體重到20μg/kg體重之間；或根據(jù)合格醫(yī)師的建議或處方。
在一個具體實施方案中，根據(jù)本發(fā)明制備的組合物和制劑，用于局部應(yīng)用，每個療程使用0.1μg到20g之間的活性藥物(例如TNFRI和/或TNFRII和/或TNFRI-Fc和/或TNFRII-Fc)?？梢悦啃r、每天、每周、每月或每年給藥。
本發(fā)明的局部用組合物可以通過以下方式進行制備用在此描述的藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑，混合TNFRI-Fc或其變體、同系物或類似物或TNFRI多肽或其變體、同系物或類似物和/或TNFRII多肽或其變體、同系物或類似物和/或TNFRII-Fc或其變體、同系物或類似物。在一個具體實施方案中，藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑為一乳膏，其中，該乳膏選自Cetaphil Moisturising Cream(Galderma Laboratories，L.P.)，QV Cream(Lision Hong)，Sorbolene等等。
在另一個具體實施方案中，局部用制劑用沙立度胺和藥學(xué)可接受的載體或稀釋劑混合混合TNFRI多肽或其變體、同系物或類似物或/和TNFRII多肽或其變體、同系物或類似物和/或TNFRI-Fc或其變體、同系物或類似物和/或TNFRII-Fc或其變體、同系物或類似物。TNFRI多肽或其變體、同系物或類似物或/和TNFRII多肽或其變體、同系物或類似物和/或TNFRI-Fc或其變體、同系物或類似物和/或TNFRII-Fc或其變體、同系物或類似物在局部用制劑中的最終濃度應(yīng)等于或少于50mg/ml左右。在此涉及的“等于或少于50mg/ml”包括但不限于以下濃度0.001、0.002、0.003、0.004、0.005、0.006、0.007、0.008、0.009、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24、0.25、0.26、0.27、0.28、0.29、0.30、0.31、0.32、0.33、0.34、0.35、0.36、0.37、0.38、0.39、0.40、0.41、0.42、0.43、0.44、0.45、0.46、0.47、0.48、0.49、0.50、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0、12.5、13.0、13.5、14.0、14.5、15.0、15.5、16.0、16.5、17.0、17.5、18.0、18.5、19.0、19.5、20.0、20.5、21.0、21.5、22.0、22.5、23.0、23.5、24.0、24.5、25.0、25.5、26.0、26.5、27.0、27.5、28.0、28.5、29.0、29.5、30.0、30.5、31.0、31.5、32.0、32.5、33.0、33.5、34.0、34.5、35.0、35.5、36.0、36.5、37.0、37.5、38.0、38.5、39.0、39.5、40.0、40.5、41.0、41.5、42.0、42.5、43.0、43.5、44.0、44.5、45.0、45.5、46.0、46.5、47.0、47.5、48.0、48.5、49.0、49.5和50.0mg/ml。
在一個具體實施方案中，TNFRI-Fc或其變體、同系物或類似物或者TNFRII-Fc或其變體、同系物或類似物在局部用制劑中的終濃度為0.25mg/ml左右。
由TNFRI-Fc和/或TNFRII-Fc組成的局部用制劑，可以進一步包含沙立度胺或其變體、同系物或類似物，尤其是非致畸的類似物。該具體方案從兩個水平計算TNF-α，即通過抑制TNF-α的生物合成途徑和通過中和過量的TNF-α。
沙立度胺(或α-(N-苯二(甲)酰亞氨基)戊二酰亞胺)是一個谷氨酸衍生物。它是一個二環(huán)結(jié)構(gòu)，在戊二酰亞胺環(huán)中有一個不對稱碳原子。它以S(-)和R(+)對映同工型等量混合的形式存在。沙立度胺是一個免疫調(diào)節(jié)分子，具有抗炎和免疫抑制活性，但它的作用機理還沒有被完全了解。沙立度胺具有抑制TNF-α產(chǎn)生的能力和修飾TNF-α誘導(dǎo)粘附分子在上皮細(xì)胞和人白細(xì)胞上表達的能力。在許多LPS刺激的細(xì)胞類型中，包括人單核細(xì)胞(Sampaio et al.J Exp Med 173(3)699-703，1991)和海馬槽細(xì)胞(Tavares et al.Respir Med 91(1)31-9，1997)中，沙立度胺選擇性抑制TNF-α的產(chǎn)生，這是通過增強TNF-αmRNA的降解達到的(Moreira et al.J Exp Med 177(6)1675-80，1993)。
沙立度胺在局部用制劑中的最終濃度應(yīng)等于或少于100mg/ml。在此涉及的“等于或少于100mg/ml”包括以下濃度0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100mg/ml。
在一個具體實施方案中，沙立度胺在局部用制劑中的最終濃度為10到30mg/ml，沙立度胺在局部用制劑中的濃度為20mg/ml時更好。
本發(fā)明進一步提供了至少包含部分蛋白或其嵌合分子的分離的蛋白質(zhì)或嵌合分子和藥物組合物在不同療法和/或診斷中的應(yīng)用。
更具體地，本發(fā)明提供了治療或預(yù)防被試哺乳動物疾病的方法，其中可以增加本發(fā)明中的蛋白或嵌合分子的量或活性來緩解疾病，這種方法包括向所述被試哺乳動物給予有效劑量的分離的蛋白質(zhì)、包含該蛋白的嵌合分子、包含該蛋白質(zhì)的胞外區(qū)域片斷的嵌合分子、或包含該分離的蛋白質(zhì)或嵌合分子的藥物組合物。在某一特定方面，本發(fā)明為治療具有TNF-α水平過高特征的炎性病癥或與TNF-α相關(guān)或TNF-α引起病情加劇的病癥提供了治療方法，服藥方法包括給予患者有效治療劑量的局部用制劑，它由在此描述的TNFRI-Fc和/或TNFRII-Fc組成。TNF-α相關(guān)的癥狀通常定義為TNF-α抑制劑可以治療的癥狀。
TNF-α過量存在于許多自身免疫性疾病中，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，Crohn病和許多在此描述的炎性皮膚癥狀。TNF-α“過量”可以廣泛定義為患者血液或血清中的TNF-α超過患者內(nèi)源性可溶TNF-α受體能夠結(jié)合的數(shù)目。典型的，TNF-α過量的結(jié)果是炎癥反應(yīng)。
在一個具體實施方案中，“病癥”指一種疾癥，由一種或多種癥狀組成，表現(xiàn)在患者的皮膚表面或內(nèi)部，方法包括給予含有在此描述的TNFRI-Fc和/或TNFRII-Fc的局部用制劑，用于患者受影響的皮膚。病癥選自以下列表時更佳牛皮癬，貝切特病，大皰性皮炎、濕疹、霉菌感染、麻風(fēng)病、嗜中性皮炎、糠疹(或玫瑰糠疹)、黑糠疹(或黑色小孢子菌病)、毛發(fā)紅糠疹、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性多血管以及中毒性表皮壞死溶解；或者使用附加藥物引起的病癥，例如使用Aldara乳膏引起的癥狀包括紅斑、腐蝕、潰瘍、剝落、魚鱗、干燥、形成疙瘩、結(jié)硬皮、皮膚滲出液。但是，本發(fā)明不應(yīng)該僅僅考慮這些疾病的治療。
在此使用的術(shù)語“患者具有TNF-α水平過高特征的病癥”應(yīng)當(dāng)理解為包括具有以下特征的病癥檢測到組織中TNF mRNA過高或患者血清中的TNF-α過高，以及無論患者是否檢測到血清TNF-α過量，給予任何可以降低TNF-α數(shù)量或活性的藥劑都可以治療的疾病。
在一個具體實施方案中，本發(fā)明設(shè)想了治療牛皮癬的方法，方法包括給予患者有效治療劑量的由在此描述的TNFRI-Fc和/或TNFRII-Fc組成的藥劑。相應(yīng)的，在此使用的術(shù)語“牛皮癬”應(yīng)理解為覆蓋該疾病的所有變種，包括鼠疫、滴狀牛皮癬、皮褶牛皮癬、指甲牛皮癬、全身紅皮性牛皮癬、膿皰性牛皮癬、掌-躑膿皰病、Von Zumbusch牛皮癬和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎。
本發(fā)明的方法包括給予患者藥學(xué)制劑?？梢悦啃r、每天、每周、每月或每年給藥。此外，給藥方法可以包括每單位時間多次給藥，例如給藥方法可以包括每小時、每天、每周、每月或每年給予藥劑1、2、3、4、或5次。給藥方法也可以包括每多個時間單位單次給藥，例如給藥方法可以包括每1、2、3、4或5小時、天、周、月或年給予藥劑一次。如上所述，給藥方法更適于局部應(yīng)用于一個生物學(xué)表面或一個人造表面進而用于生物學(xué)表面。例如，藥劑可以用在紗布或碎片上，再把它們放置在需要治療的區(qū)域。
此外，每次給藥時，每100cm2受影響的區(qū)域給予的藥劑份量可以包括從0.1ml到10ml。這包括以下份量0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.0ml，每100cm2需要治療的區(qū)域。
在一個具體實施方案中，某皮膚區(qū)域表現(xiàn)出一種或多種疾癥的癥狀，需要每天治療，使用0.5ml的局部用制劑，其組成為TNFRI(0.25mg/ml)和沙立度胺(20mg/ml)，每100cm2受影響的區(qū)域，每天一次。在某些具體方案中，高達2ml左右組成為TNFRI(0.25mg/ml)和沙立度胺(20mg/ml)的局部用制劑用于100cm2左右受影響的區(qū)域。
在另一個具體實施方案中，炎癥區(qū)域每天給藥一次，給予0.5ml局部用制劑(TNFRI(0.25mg/ml)；沙立度胺(20mg/ml))，每100cm2炎癥區(qū)域，每天一次。在某些具體方案中，高達2ml左右的局部用制劑(TNFRI(0.25mg/ml)；沙立度胺(20mg/ml))用于100cm2左右受影響的區(qū)域，每天一次。
在另一個具體實施方案中，炎癥區(qū)域每兩天天給藥一次，給予0.5ml局部用制劑(TNFRI(0.25mg/ml)；沙立度胺(20mg/ml))，每100平方厘米左右的炎癥區(qū)域。在某些具體方案中，高達2ml左右的局部用制劑(TNFRII(0.25mg/ml)；沙立度胺(20mg/ml))用于100cm2左右受影響的區(qū)域，每兩天一次。
在一個具體實施方案中，炎癥區(qū)域每兩天給藥一次，給予0.5ml局部用制劑(TNFRII(0.25mg/ml)；沙立度胺(20mg/ml))，每100平方厘米左右的炎癥區(qū)域。在某些具體方案中，高達2ml左右的局部用制劑(TNFRII(0.25mg/ml)；沙立度胺(20mg/ml))用于100cm2受影響的區(qū)域，每兩天一次。
在一個具體實施方案中，某皮膚區(qū)域表現(xiàn)出一種或多種疾癥的癥狀，需要每天治療，使用0.5ml的局部用制劑，其組成為TNFRI-Fc(0.25mg/ml)和沙立度胺(20mg/ml)，每100cm2左右受影響的區(qū)域，每天一次。在某些具體方案中，高達2ml左右組成為TNFRI-Fc(0.25mg/ml)和沙立度胺(20mg/ml)的局部用制劑用于100cm2左右受影響的區(qū)域。
在另一個具體實施方案中，炎癥區(qū)域每天給藥一次，給予0.5ml局部用制劑(TNFRII-Fc(0.25mg/ml)；沙立度胺(20mg/ml))，每100cm2炎癥區(qū)域，每天一次。在某些具體方案中，高達2ml左右的局部用制劑(TNFRII-Fc(0.25mg/ml)；沙立度胺(20mg/ml))用于100cm2左右受影響的區(qū)域，每天一次。
在另一個具體實施方案中，炎癥區(qū)域每兩天給藥一次，給予0.5ml局部用制劑(TNFRI-Fc(0.25mg/ml)；沙立度胺(20mg/ml))，每100平方厘米左右的炎癥區(qū)域。在某些具體方案中，高達2ml的局部用制劑(TNFRI-Fc(0.25mg/ml)；沙立度胺(20mg/ml))用于100cm2左右受影響的區(qū)域，每兩天一次。
在一個具體實施方案中，炎癥區(qū)域每兩天給藥一次，給予0.5ml局部用制劑(TNFRII-Fc(0.25mg/ml)；沙立度胺(20mg/ml))，每100平方厘米炎癥區(qū)域。在某些具體方案中，高達2ml的局部用制劑(TNFRII-Fc(0.25mg/ml)；沙立度胺(20mg/ml))用于100cm2受影響的區(qū)域，每兩天一次。
本發(fā)明進一步設(shè)想了用由本發(fā)明的藥劑聯(lián)合其它治療試劑或治療方案組成的方法。一種或多種治療試劑可以與TNFRI和/或TNFRII和/或TNFRI-Fc和/或TNFRII-Fc聯(lián)合用藥。對于“聯(lián)合用藥”，指以相同的制劑或兩種不同的制劑通過相同或不同的途經(jīng)同時給藥，或者以相同或不同的途經(jīng)相繼給藥。對于“相繼”給藥，指的是給予兩種試劑或治療方案之間存在一段時間不同的秒、分、小時或天。相繼給藥的試劑或治療方案可以以任何次序給藥。
當(dāng)另一種治療試劑是聯(lián)合給藥時，它可以用于全身或局部。
相應(yīng)的，本發(fā)明提供了一個多部分的藥物包裝，其組成為第一部分包含TNFRI和/或TNFRII和/或TNFRI-Fc和/或TNFRII-Fc，以適于局部給藥的形式，而第二部分或相繼的部分包含另一種活性試劑，以適于局部或系統(tǒng)用藥的形式，第一部分還包含藥學(xué)可接收的局部用載體。
因此，在一個具體實施方案中，本發(fā)明設(shè)想了治療患者牛皮癬或相關(guān)皮膚病癥的方法，方法包括局部給予患者有效劑量的由TNFRI和/或TNFRII和/或TNFRI-Fc和/或TNFRII-Fc組成的藥劑以及另一種活性試劑。其它與本發(fā)明的藥劑可以聯(lián)合給藥的活性試劑包括 (i)焦油煤焦油是已知的牛皮癬治療中的輔助用藥，并且可以從粗制煤焦油、焦油洗液中獲得，并以精制形式摻入預(yù)制乳膏、洗液和洗發(fā)劑中。與焦油中已發(fā)現(xiàn)物質(zhì)相似的化學(xué)藥品可以根據(jù)它已知的物質(zhì)作為地蒽酚或蒽林使用。
(ii)UV線一般通過一個人工光源得以應(yīng)用。
(iii)腎上腺皮質(zhì)素外用腎上腺皮質(zhì)素以多種不同的堿形式可以幫助治療牛皮癬，但它通常最多只能幫助1-2天。有某些特定區(qū)域例如耳朵和手背，焦油治療不是非常有效，因而在這些區(qū)域，利用腎上腺皮質(zhì)素通常是最好的。最好避免使用內(nèi)用腎上腺皮質(zhì)素片劑，除非其它任何治療都沒有幫助的情況下。這些片劑的主要問題是它們可以幫助治療，但當(dāng)它們停止使用時，牛皮癬會突然出現(xiàn)并且變得比原來更惡劣，即所謂的反跳作用。
(iv)Calcipotriol是維生素D的一種合成形式。維生素D已經(jīng)被認(rèn)可許多年，用于改善牛皮癬皮膚上存在的重大異常，但是，即使只比日常推薦用量略高的維生素D被吸收，也能導(dǎo)致體內(nèi)鈣代謝問題(可能的腎結(jié)石和不規(guī)則心跳)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Calcipotriol也具有改善牛皮癬的能力，而對鈣代謝的影響很小。如果軟膏用在面部或頸部，存在面部皮炎的風(fēng)險，因此只推薦用于軀干和四肢，并且敷用后徹底清洗手部非常重要，以避免不慎轉(zhuǎn)移到面部皮膚。
(v)PUVA光療PUVA是用于治療的名字，由補骨脂素(使皮膚對A范圍的人工紫外線照射敏感)聯(lián)合UVA組成。兩者聯(lián)用對牛皮癬的小半鞘翅有強大影響，使細(xì)胞的快速分裂減慢，細(xì)胞的快速分裂是被認(rèn)為發(fā)生在活性牛皮癬中的。UVA照射的劑量應(yīng)緩慢地增加，如果引入該治療過快，會發(fā)生皮膚燒傷。一種PUVA光療的變種最近發(fā)展了一種技術(shù)，即沐浴PUVA。不同于口服攝入補骨脂素，沐浴僅需在UVA照射前花費10分鐘，含有補骨脂素化學(xué)物質(zhì)。在治療期的白天，所有形式的PUVA治療，陽光保護措施都很重要。PUVA不是牛皮癬的一線治療方案。
(vi)甲氨喋呤甲氨喋呤已經(jīng)被用于牛皮癬的治療。該活性試劑也以更高的劑量用于治療某些癌癥和白血病。
(vii)體卡松體卡松是一種“類維生素A”(維生素A的一種合成衍生物)，可以用于處理非常嚴(yán)重的牛皮癬病例，以及牛皮癬的膿泡。
(viii)環(huán)孢菌素已知環(huán)孢菌素可以抑制患有牛皮癬時皮膚上發(fā)生的炎癥。
(ix)蒽林蒽林是從柯椏粉衍生而來，柯椏粉來自柯椏樹的樹皮，并且已用于治療牛皮癬超過100年 (x)水楊酸水楊酸是一種可以幫助去除鱗屑的化學(xué)藥物。
(xi)褪黑激素一種親脂的強有效的抗氧化劑，證明可以緩和炎性皮膚。
其他的活性試劑也包括其它細(xì)胞因子抑制劑例如抑制IGF-1或IGF-1R的分子，以及抑制IGF結(jié)合蛋白如IGFBP-1，2，3或4的分子。
涉及的細(xì)胞因子的抑制包括抑制編碼細(xì)胞因子的遺傳物質(zhì)的表達。這種抑制劑包括反義核苷酸分子，正義核苷酸分子，dsRNA(DNA-衍生的或合成的RNA)以及核酶。
下面以非限制性的實施例對本發(fā)明進一步加以闡述。
實施例1 載體-Fc構(gòu)建體的制備 (a)pIRESbleo3-Fc 編碼人IgG1的Fc結(jié)構(gòu)域的DNA序列通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增，來自EST cDNA庫(Clone ID 6277773、Invitrogen)，使用分別摻入了限制性內(nèi)切酶BamH1和BstX1位點的正向引物(SEQ ID NO21)和反向引物(SEQ ID NO22)。該擴增子克隆入pIRESbleo3(Cat.No.6989-1、BD Biosciences)中相應(yīng)的酶切位點以制備構(gòu)建體pIRESbleo3-Fc。pIRESbleo3-Fc用BamH1和BstX1消化釋放出780bp期望大小的插入片段，如凝膠電泳所測定的。
(b)表達蛋白質(zhì)或蛋白-Fc的DNA構(gòu)建體的制備編碼蛋白質(zhì)或其胞外結(jié)構(gòu)域的DNA序列通過PCR擴增，來自ESTcDNA庫，使用根據(jù)表8引入了限制性酶切位點的正向引物和反向引物。擴增后，擴增子經(jīng)合適的限制性內(nèi)切酶消化并且克隆到如表8所示的表達載體中，以制備載體-蛋白質(zhì)或載體-蛋白Fc構(gòu)建體。編碼蛋白-Fc的構(gòu)建體的制備過程中，編碼蛋白質(zhì)的DNA序列克隆到Fc核苷酸序列的上游，使兩個序列符合讀框地融合，所以在蛋白質(zhì)表達時，蛋白直接地或通過連接子地與Fc區(qū)域融合。TNFRII-Fc-pCEP-4的制備包括擴增TNFRII-Fc序列并用表8所給的酶切位點克隆入pCEP-4。合適的限制性內(nèi)切酶用于消化含有編碼蛋白質(zhì)或蛋白-Fc的DNA序列的載體，以釋放如表8中所示的期望大小的片段。對載體-蛋白質(zhì)或載體-蛋白-Fc構(gòu)建體測序以確定此處所描述的克隆過程的完整性。
表8 蛋白質(zhì)-Fc和相關(guān)的克隆信息 (c)制備表達OX40-Fc的DNA構(gòu)建體編碼OX40細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)的DNA序列以二步克隆方法連接在IgGI Fc序列的上游。第一步包括用正向引物(SED ID NO123)和反向引物(SEQ ID NO124)以及EST cDNA文庫(5180287，Invitrogen)作為模板，擴增OX40ECD的第一個個292bp。引物分別摻入限制性酶切位點EcoRV和BamHI。純化的擴增產(chǎn)物克隆入pIRESbleo3-Fc表達載體的相應(yīng)酶切位點，人IgGI Fc序列的上游。第二步包括，用正向引物(SEQID NO125)和反向引物(SEQ ID NO126)以及先前擴增的OX40序列作為模板，擴增OX40ECD序列剩下的355bp。引物在擴增產(chǎn)物的兩端都摻入限制性酶切位點BamHI。純化的擴增產(chǎn)物連接入BamHI位點，第一個OX40序列的下游和Fc序列的上游。HpaII酶切證明第二段OX40序列的正確方向。在OX40序列中引入一個人工的BamHI位點不導(dǎo)致影響翻譯蛋白的氨基酸序列的移碼。
另外，編碼克隆入載體(例如pIRESbleo3或pCEP4)的蛋白的核苷酸序列可以用引物進行擴增，引物中摻入的限制性酶切位點使編碼Fc核苷酸序列上游蛋白的DNA序列可以克隆入載體-Fc(例如pIRESbleo3-Fc或pCEP4-Fc)的上游)中，因此蛋白和Fc核苷酸序列是直接或通過連接子融合在結(jié)構(gòu)內(nèi)。
(d)制備Megaprep載體-蛋白或載體-蛋白-Fc 將750μl前晚轉(zhuǎn)染了載體-蛋白或載體-蛋白-Fc的大腸桿菌接種于含氨芐青霉素(100μg/ml)的750ml無菌LB培養(yǎng)基中。37℃振搖孵育16小時。按照Qiagen Endofree Plasmid Mega Kit(Qiagen MegaPrep Kit#12381)制備質(zhì)粒。
實施例2 (a)本發(fā)明的TNF-α的制備、分離和純化 (i)本發(fā)明的TNF-α的制備第0天，在5個500cm2的組織培養(yǎng)皿(Corning)上鋪3×107個轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系的細(xì)胞，例如HEK 293，HEK293c18，HEK 293T，293CEN4，HEK 239F，HEK 293E，HEK 293FT，AD-293(Stratagene)或293A(Invitrogen)。每個培養(yǎng)皿，細(xì)胞加入90ml Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium/Ham營養(yǎng)復(fù)合物F12(DMEM/F12)(JRH Biosciences)，培養(yǎng)基中需加入10％(v/v)熱滅活胎牛血清(FCS，JRH Biosciences)，4mM L-谷氨酰胺(Amresco)，10mM HEPES(Sigma)，和1％(v/v)青霉素-鏈霉素(青霉素G 5000U/ml，硫酸鏈霉素5mg/ml)(JRHBiosciences)。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第1天，用磷酸鈣進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，每個平皿中的培養(yǎng)基替換成120ml新鮮的DMEM/F12，其中含有10％(v/v)熱滅活FCS或DCS，4mM的L-谷氨酰胺，10mM HEPES和1％(v/v)青霉素-鏈霉素。制備磷酸鈣/DNA沉淀為，在無菌水(BD Biosciences)中加入1200μg具有人TNF-α基因的pIRESbleo3(Invitrogen)質(zhì)粒DNA和3720μl 2M的氯化鈣溶液(BD Biosciences)，終體積為30ml(溶液A)，或者，在1×TE中，將相同數(shù)目的質(zhì)粒DNA加到3000μl 2.5M的CaCl2中，終體積為30ml(溶液A)。用10ml的移液管將溶液A滴加入30ml 2×HEPES緩沖液(HBS)(溶液B)(BD Biosciences)中。在滴加的過程中，氣泡緩慢通過溶液B。將混合物在25℃孵育20min并渦旋。每個平皿中滴加入12ml的混合物。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜?；蛘撸?小時后，去除含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每平皿加入100ml DMEM/F12，其中含10％(v/v)DCS，4mM L-谷氨酰胺，1％(v/v)青霉素-鏈霉素和終濃度為3.5-4.0mM的HCl，培養(yǎng)基的最終pH為7。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第2天，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清。每個平皿用50ml DMEM/F12培養(yǎng)基清洗其中的物質(zhì)兩次，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，含有40mM的N-乙酰基-D-甘露糖胺(New ZealandPharmaceuticals)，7或10mM的L-谷氨酰胺，15mM的HEPES，0.5或4.1g/L的甘露糖(Sigma)和1％(v/v)的青霉素-鏈霉素和ITS溶液(5mg/L牛胰島素，5mg/L部分鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白和5μg/ml的硒)(Sigma)(或者，無ITS溶液)。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第3天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，含有40mM的N-乙?；?D-甘露糖胺，7或10mM的L-谷氨酰胺，15mM HEPES(或者，無HEPES)，0.5或4.1g/L的甘露糖和1％(v/v)的青霉素-鏈霉素，和ITS溶液(或者，無ITS溶液)。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，混合物4℃保存。
在第4天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，并將它與第3天收集的樣品混合。用一個0.45微米的低蛋白結(jié)合濾器(Durapore，Millipore)去除微粒。通過加入十分之一體積200mM MES/50mM MgCl2(pH6)，將混合的樣品調(diào)節(jié)pH至6?；旌衔?70℃保存或立即使用。
(ii)TNF-α的分離和純化用一個正切流動過濾(TFF)裝置(Pelicon XL，Ultracell，Millipore)，將950ml過濾的細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮20倍左右。樣品以150ml/min的速度注入150cm2的再生纖維素膜上，截斷5KDa的分子量，直到樣品濃縮到30ml的體積。濃縮的樣品加入70ml 50mM的HEPES(pH為8.5)透析過濾，濃縮體積仍為30ml。該透析過濾步驟重復(fù)兩次，終體積為50ml。接著，用一個0.45微米的低蛋白結(jié)合濾器(Durapore，Millipore)對該濃縮透濾樣品進行過濾。TNF-α的純化是將濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)上清通過TFF，其位于一根預(yù)先用50mM的HEPES(pH為8.5)平衡的離子交換柱(Bio-Rad Laboratories，MacroPrep HS)上。接著，用50mM HEPES(pH為8.5)到100％50mM的HEPES(pH為8.5)含1M NaCl的線性梯度溶液洗脫結(jié)合的TNF-α。得到的成分通過1D SDS PAGE用4-20％的梯度Tris-Glycine膠(Invitrogen)分析表觀分子量和純度，并用抗-TNF-ELISA(R&D系統(tǒng))進行定量?；旌虾琓NF-α的溶液，將其濃縮到1ml以下，利用離心濾器裝置(Amicon Ultra，Millipore)進行分子排阻色譜。
分子排阻色譜是在結(jié)合的陰離子交換成分上進行的，利用一個Superdex 75制備的16/70柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。1％碳酸氫銨平衡緩沖液的流速為1ml/min?？偟牧鲃訒r間為120min，高峰洗脫時間在20到100min之間。用銀染色的4-20％梯度的Tris-甘氨酸膠(Invitrogen)和TNF-α ELISA對洗脫成分進行分析。發(fā)現(xiàn)50min左右的高峰洗脫含有TNF-α。混合含TNF-α的溶液，并利用離心濾器裝置(Amicon Ultra，Millipore)濃縮到2ml以下。
發(fā)現(xiàn)純化的TNF-α其表觀MW為17kDa左右，銀染色的SDS PAGE分析得到其純度至少為95％。根據(jù)280nm的吸收度進行測定，摩爾消光系數(shù)為21555M-1cm-1，得到TNF-α的終濃度為157μg/ml。
(b)本發(fā)明的LT-α的制備、分離和純化 (i)本發(fā)明的LT-α的制備第0天，在5個500cm2的組織培養(yǎng)皿(Corning)上鋪3×107個來自轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系的細(xì)胞，例如HEK 293、HEK293 c18、HEK 293T、293 CEN4、HEK 239F、HEK 293E、HEK 293FT、AD-293(Stratagene)或293A(Invitrogen)。每個培養(yǎng)皿、細(xì)胞加入90ml Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium/Ham營養(yǎng)復(fù)合物F12(DMEM/F12)(JRH Biosciences)、培養(yǎng)基中需加入10％(v/v)熱滅活胎牛血清(FCS、JRH Biosciences)、4mM L-谷氨酰胺(Amresco)、10mM HEPES(Sigma)和1％(v/v)青霉素-鏈霉素(青霉素G 5000U/ml，硫酸鏈霉素5mg/ml)(JRHBiosciences)。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第1天，用磷酸鈣進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，每個平皿中的培養(yǎng)基替換成120ml新鮮的DMEM/F12，其中含有10％(v/v)熱滅活FCS、4mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES和1％(v/v)青霉素-鏈霉素。制備磷酸鈣/DNA沉淀為，在無菌水(BD Biosciences)中加入1200μg具有人LT-α基因的pIRESbleo3(Invitrogen)質(zhì)粒DNA和3720μ12M的鈣溶液(BD Biosciences)，終體積為30ml(溶液A)。用10ml的移液管將溶液A滴加入30ml 2×HEPES緩沖液(HBS)(溶液B)(BD Biosciences)中。在滴加的過程中，氣泡緩慢通過溶液B。將混合物在25℃孵育20min并渦旋。每個平皿中滴加入12ml的混合物。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第2天，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清。每個平皿用50ml DMEM/F12培養(yǎng)基清洗其中的物質(zhì)兩次，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，含有40mM的N-乙?；?D-甘露糖胺(New ZealandPharmaceuticals)，7mM的L-谷氨酰胺(Ameresco)，0.5g/L的甘露糖(Sigma)和1％(v/v)的青霉素-鏈霉素。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第3天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，含有40mM的N-乙?；?D-甘露糖胺，7mM的L-谷氨酰胺，0.5g/L的甘露糖和1％(v/v)的青霉素-鏈霉素。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，混合物4℃保存。
在第4天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，并將它與第3天收集的樣品混合?；旌系氖占瘶悠?，在用0.45微米低蛋白結(jié)合濾器(Durapore，Millipore)去除微粒之前，加入十分之一體積200mMMES/50mM MgCl2(pH6)調(diào)節(jié)其pH至6?；旌衔?℃保存或立即使用。長期儲存時，上清在-70℃保存。
(ii)本發(fā)明的LT-α的分離和純化染料-配體色譜(DLC)過程用于LT-α純化的第一步。某些固定的活性染料可以用于屏蔽LT-α避免有效結(jié)合，并以批量純化microtitre的形式釋放。接著，以小規(guī)模柱的形式檢測相配的染料-蛋白結(jié)合物。
小規(guī)模純化時，在pH為6或7.3的情況下，5ml溶化的細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品通過0.5ml的染料-配體柱。在這個最佳化步驟中，選擇最佳的染料-細(xì)胞因子和pH組合，使回收率最高，擴大比例用于大體積DLC。
對于大比例DLC，選擇活性染料編號18 High(Zymatrix)作為活性染料，對LT-α具有最佳的結(jié)合和洗脫性質(zhì)。過濾的細(xì)胞培養(yǎng)上清在重力作用下通過4.0ml或8.0ml的柱身(Alltech，Extract Clean Filtercolumns)，分別含有預(yù)先用50mM MES/5mM MgCl2平衡到pH6的3ml或6ml DLC樹脂。柱子用緩沖液A(20mM MES/5mM MgCl2，pH6)進行沖洗直到洗出液，用colourmetric蛋白分析(Biorad蛋白分析)沒有監(jiān)測到蛋白。LT-α用三種洗脫緩沖液按以下順序洗脫洗脫液1緩沖液C(50mM Tris-Cl/10mM EDTA pH 8) 洗脫液2ENl.0(50mM Tris-Cl/10mM EDTA/1.0M NaCl pH 8) 洗脫液3EN2.0(50mM Tris-Cl/10mM EDTA/2.0M NaCl pH 8) 洗脫的部分通過銀染色的1D SDS PAGE用4-20％的梯度Tris-Glycine膠(Invitrogen)以及抗LT-αELISA(R&D系統(tǒng))進行分析。發(fā)現(xiàn)LT-α結(jié)合于活性染料18High，以及在緩沖液C和緩沖液EN1.0中得到洗脫。SDS PAGE分析得到70％的污染蛋白在第一步純化步驟中去除。將含有LT-α的DLC部分混合，并利用一個離心濾器裝置(Ami con Ultra，Millipore)濃縮到5ml左右。
接著將濃縮的樣品十倍稀釋，在它通過一個陰離子交換柱(Bio-RadLaboratories，Uno S1)之前，柱子預(yù)先用50mM MES(pH6.5)(Sigma)平衡到pH6.5。結(jié)合的LT-α用用50mM MES(pH6.5)到含1M NaCl的50mM MES(pH6.5)梯度溶液進行洗脫。得到的成分通過銀染色的1D SDS PAGE用4-20％的梯度Tris-Glycine膠(Invitrogen)分析表觀分子量和純度?；旌虾琇T-α的溶液，將其濃縮到1ml以下，利用離心濾器裝置(Amicon Ultra，Millipore)進行分子排阻色譜。
分子排阻色譜在濃縮的樣品上進行，利用一個Superdex 75制備的16/70級(Pharmacia，Uppsala，Sweden)柱。1％碳酸氫銨平衡緩沖液的流速為1ml/min?？偟牧鲃訒r間為120min，高峰洗脫時間在20到100min之間。通過4-20％的Tris-甘氨酸膠(Invitrogen)進行銀染色的SDS PAGE對洗脫成分進行分析。發(fā)現(xiàn)45min左右的高峰洗脫含有LT-α?；旌虾琇T-α的溶液，并利用離心濾器裝置(Amicon Ultra，Millipore)濃縮到2ml以下。
發(fā)現(xiàn)純化的LT-α其表觀MW為20-38Da左右，通過4-20％的Tris-甘氨酸膠(Invitrogen)進行銀染色的SDS PAGE，分析得到其純度至少為95％。根據(jù)280nm的吸收度進行測定，摩爾消光系數(shù)為21430M-1cm-1，得到LT-α的終濃度為78μg/ml。
(c)本發(fā)明的TNFRI-Fc的制備、分離和純化 (i)本發(fā)明的TNFRI-FC的制備第0天，在5個500cm2的組織培養(yǎng)皿(Corning)上鋪3×107個轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系的細(xì)胞，例如HEK 293、HEK293 c18、HEK 293T、293CEN4、HEK 239F、HEK 293E、HEK 293FT、AD-293(Stratagene)或293A(Invitrogen)。每個培養(yǎng)皿、細(xì)胞加入90ml Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium/Ham營養(yǎng)復(fù)合物F12(DMEM/F12)(JRH Biosciences)，培養(yǎng)基中需加入10％(v/v)熱滅活胎牛血清(FCS，JRH Biosciences)，4mM L-谷氨酰胺(Amresco)，10mM HEPES(Sigma)和1％(v/v)青霉素-鏈霉素(青霉素G 5000U/ml，硫酸鏈霉素5mg/ml)(JRHBiosciences)。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第1天，用磷酸鈣進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，每個平皿中的培養(yǎng)基替換成120ml新鮮的DMEM/F12，其中含有10％(v/v)熱滅活FCS或DCS、4mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES和1％(v/v)青霉素-鏈霉素。制備磷酸鈣/DNA沉淀為，在無菌水中加入1200μg具有人TNFRI-Fc基因的pIRESbleo3(Invitrogen)質(zhì)粒DNA和3720μl 2M的氯化鈣溶液(BDBiosciences)，終體積為30ml(溶液A)，或者，在1×TE中，將相同數(shù)目的質(zhì)粒DNA加到3000μl 2.5M的CaCl2中，終體積為30ml(溶液A)。用10ml的移液管將溶液A滴加入30ml 2×HEPES緩沖液(HBS)(溶液B)(BD Biosciences)中。在滴加的過程中，氣泡緩慢通過溶液B。將混合物在25℃孵育20mi n并渦旋。每個平皿中滴加入12ml的混合物。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。或者，孵育4小時后，去除含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每平皿加入100mlDMEM/F12，其中含10％(v/v)DCS，4mM L-谷氨酰胺，1％(v/v)青霉素-鏈霉素和終濃度為3.5-4.0mM的HCl，培養(yǎng)基的最終pH為7。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第2天，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清。每個平皿用50ml DMEM/F12培養(yǎng)基清洗其中的物質(zhì)兩次，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，含有40mM的N-乙?；?D-甘露糖胺(New ZealandPharmaceuticals)、7或10mM的L-谷氨酰胺、15mM HEPES、0.5或4.1g/L的甘露糖(Sigma)、1％(v/v)的青霉素-鏈霉素和ITS溶液(5mg/L牛胰島素，5mg/L部分鐵飽和的人轉(zhuǎn)鐵蛋白和5μg/ml的硒)(Sigma)(或者，無ITS溶液)。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第3天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，含有40mM的N-乙酰基-D-甘露糖胺、7或10mM的L-谷氨酰胺、15mM HEPES(或者、不含HEPES)、0.5或4.1g/L的甘露糖、1％(v/v)的青霉素-鏈霉素ITS溶液(或者，不含ITS溶液)。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，混合物4℃保存。
在第4天，收集培養(yǎng)皿中不含血清的DMEM/F12培養(yǎng)基。在收集培養(yǎng)基中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，并將它與第3天收集的無血清樣品混合?；旌系募?xì)胞培養(yǎng)機收集樣品用0.45mm低蛋白結(jié)合濾器(Durapore，Millipore)過濾。混合物凍存于-70℃或立即使用。
(ii)本發(fā)明的TNFRI-FC的分離和純化收集培養(yǎng)基，加入2M的Tris-HCl(pH8)(Sigma)，使其終濃度為100mM，將pH調(diào)整到pH8，過濾(Durapore，0.45μm，Millipore)。1升pH調(diào)整后的含TNFRI-Fc的培養(yǎng)基在重力作用下穿過帶有1ml柱床體積的蛋白A瓊脂糖柱(Pharmacia)，柱子預(yù)先用100mM的Tris-Cl(pH8)平衡到pH8。用20倍柱體積的柱緩沖液(100mM的Tris-Cl，pH8)沖洗后，用0.1M的檸檬酸(Sigma)(pH4.4)洗脫TNFRI-Fc，接著用0.1M的檸檬酸(Sigma)(pH2.2)洗脫，并分別立即加入100μl和400μl的2M Tris-HCl(pH9)(Sigma)進行中和。通過銀染色的SDS PAGE，用4-20％的梯度Tris-甘氨酸膠(Invitrogen)進行分析。混合純化的含TNFRI-Fc的溶液，并濃縮到1ml以下，利用離心濾器裝置(AmiconUltra，Millipore)進行分子排阻色譜。
分子排阻色譜在濃縮的樣品上進行，利用Superdex 200制備的16/70級(Pharmacia，Uppsala，Sweden)柱。1％碳酸氫銨平衡緩沖液的流速為1ml/min?？偟牧鲃訒r間為120min，高峰洗脫時間在20到100min之間。通過4-20％的Tris-甘氨酸膠(Invitrogen)進行銀染色的SDS PAGE對洗脫成分進行分析?；旌虾琓NFRI-Fc的溶液，并利用離心濾器裝置(Amicon Ultra，Millipore)濃縮到2ml以下。
發(fā)現(xiàn)純化的TNFRI-Fc其表觀MW在45-95Da之間，通過銀染色的SDSPAGE分析得到其純度至少為99％。根據(jù)280nm的吸收度進行測定，摩爾消光系數(shù)為51725M-1cm-1，得到TNFRI-Fc的終濃度為213.86μg/ml。
(d)本發(fā)明的TNFRII-Fc的制備、分離和純化 (i)本發(fā)明的TNFRII-Fc的制備第0天，在5個500cm2的組織培養(yǎng)皿(Corning)上鋪3×107個來自轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系的細(xì)胞，例如HEK 293、HEK 293 c18、HEK 293T、293 CEN4、HEK 293F、HEK 293E、HEK 293FT、AD-293(Stratagene)或293A(Invitrogen)。每個培養(yǎng)皿、細(xì)胞加入90ml Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium/Ham營養(yǎng)復(fù)合物F12(DMEM/F12)(JRH Biosciences)、培養(yǎng)基中需加入10％(v/v)熱滅活胎牛血清(FCS、JRH Biosciences)、10mM HEPES(Sigma)、4mM L-谷氨酰胺(Ameresco)和1％(v/v)青霉素-鏈霉素(JRH)。
在第1天，用磷酸鈣進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，每個平皿中的培養(yǎng)基替換成120ml新鮮的DMEM/F12(JRH Biosciences)，其中含有10％胎牛血清(JRH)。制備磷酸鈣/DNA沉淀為，在無菌水中加入1200μg具有人TNFRII-Fc基因的pIRESbleo3(Clonetech，BD Biosciences)質(zhì)粒DNA和3720μl CaCl2，終體積為30ml(溶液A)。用10ml的移液管將溶液A滴加入30ml 2×HEPES緩沖液(HBS)(溶液B)中。在滴加的過程中，氣泡緩慢通過溶液B。將混合物在25℃孵育20min并渦旋。用移液管每個平皿中滴加入12ml的混合物。4小時后，去除含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每平皿加入100ml DMEM/F12(pH7)，其中含10％(v/v)熱滅活胎牛血清(JRH Biosciences)，10mM HEPES，4mM L-谷氨酰胺，1％(v/v)青霉素-鏈霉素和3.5或4.0mM的HCl，孵育過夜。
在第2天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，含有40mM的N-乙?；?D-甘露糖胺、7mM的L-谷氨酰胺、0.5g/L的甘露糖和1％(v/v)的青霉素-鏈霉素。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，混合物4℃保存。
在第3天，收集無血清的DMEM/F12，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清的DMEM/F12。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入100mM的PMSF，1％(v/v)和500mM的EDTA，1％(v/v)，混合物4℃保存。
在第4天，收集平皿中無血清的DMEM/F12。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)基中加入100mM的PMSF、1％(v/v)和500mM的EDTA按照1％(v/v)，并將該混合物與第一次收集的無血清樣品進行混合，混合的細(xì)胞培養(yǎng)上清用0.45微米低蛋白結(jié)合濾器(Durapore，Millipore)過濾?；旌衔?70℃保存或立即使用。
(ii)本發(fā)明的TNFRII-Fc的分離和純化收集培養(yǎng)基，加入2M的Tris-HCl(pH8)(Sigma)，使其終濃度為100mM，將pH調(diào)整到pH8，過濾(Durapore，0.45μm，Millipore)。1升pH調(diào)整后的含TNFRII-Fc的培養(yǎng)基在重力作用下穿過帶有1ml柱床體積的蛋白A瓊脂糖柱(Pharmacia)，柱子預(yù)先用100mM的Tris-Cl(Sigma)平衡到pH8。用20倍柱體積的柱緩沖液(100mM的Tris-Cl，pH8)沖洗后，用0.1M的檸檬酸(Sigma)(pH4.4)洗脫TNFRII-Fc，接著用0.1M的檸檬酸(Sigma)(pH2.2)洗脫，并分別立即加入100μl和400μl的2M Tris-HCl(pH9)(Sigma)進行中和。通過銀染色的SDS PAGE，用4-20％的梯度Tris-甘氨酸膠(Invitrogen)進行分析?；旌霞兓暮琓NFRII-Fc的溶液，并濃縮到1ml以下，利用離心濾器裝置(Amicon Ultra，Millipore)進行分子排阻色譜。
分子排阻色譜在濃縮的樣品上進行，利用Superdex 200制備的16/70級(Pharmacia，Uppsala，Sweden)柱。1％碳酸氫銨平衡緩沖液的流速為1ml/min?？偟牧鲃訒r間為120min，高峰洗脫時間在20到100min之間。通過4-20％的Tris-甘氨酸膠(Invitrogen)進行銀染色的SDS PAGE對洗脫成分進行分析。混合含TNFRII-Fc的溶液，并利用離心濾器裝置(Amicon Ultra，Millipore)濃縮到2ml以下。
發(fā)現(xiàn)純化的TNFRII-Fc其表觀MW在45-100kDa之間，通過銀染色的SDS PAGE分析得到其純度至少為99％。根據(jù)280nm的吸收度進行測定，摩爾消光系數(shù)為61110M-1cm-1，得到TNFRII-Fc的終濃度為1321μg/ml。
(e)本發(fā)明的BAFF的制備、分離和純化 (i)本發(fā)明的BAFF的制備第0天，在5個500cm2的組織培養(yǎng)皿(Corning)上鋪3×107個來自轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系的細(xì)胞，例如HEK 293、HEK 293c 18、HEK 293T、293 CEN4、HEK 239F、HEK 293E、HEK 293FT、AD-293(Stratagene)或293A(Invitrogen)。每個培養(yǎng)皿，細(xì)胞加入90ml Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium/Ham營養(yǎng)復(fù)合物F12(DMEM/F12)(JRH Biosciences)，培養(yǎng)基中需加入10％(v/v)供者小牛血清(DCS，JRH Biosciences)，4mM L-谷氨酰胺(Amresco)和1％(v/v)青霉素-鏈霉素(青霉素G5000U/ml，硫酸鏈霉素5mg/ml)(JRH Biosciences)。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第1天，用磷酸鈣進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，每個平皿中的培養(yǎng)基替換成120ml新鮮的DMEM/F12，其中含有10％熱滅火的FCS或DCS，4mM L-谷氨酰胺，10mM HEPES，和1％(v/v)青霉素-鏈霉素。制備磷酸鈣/DNA沉淀為，在無菌水中加入1200μg具有人BAFF基因的pIRESbleo3(Invitrogen)質(zhì)粒DNA和3720μl 2M的氯化鈣溶液(BD Biosciences)，終體積為30ml(溶液A)，或者，在無菌的1×TE中將相同數(shù)量的質(zhì)粒DNA加到3000μl 2.5M的CaCl2中。用10ml的移液管將溶液A滴加入30ml 2×HEPES緩沖液(HBS)(溶液B)(BD Biosciences)中。在滴加的過程中，氣泡緩慢通過溶液B。將混合物在25℃孵育20min并渦旋。用將12ml混合物滴加入每個平皿中。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。或者，孵育4小時后，去除含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每平皿加入100mlDMEM/F12，其中含10％(v/v)DCS，4mM L-谷氨酰胺，1％(v/v)青霉素-鏈霉素和終濃度為3.5-4.0mM的HCl，培養(yǎng)基的最終pH為7。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第2天，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清。每個平皿用50ml DMEM/F12培養(yǎng)基清洗其中的物質(zhì)兩次，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基、含有40mM的N-乙?；?D-甘露糖胺(New ZealandPharmaceuticals)、7或10mM的L-谷氨酰胺、0.5或4.1g/L的Mannose(Sigma)和1％(v/v)的青霉素-鏈霉素。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第3天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，含有40mM的N-乙?；?D-甘露糖胺、7或10mM的L-谷氨酰胺、0.5或4.1g/L的Mannose和1％(v/v)的青霉素-鏈霉素。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，混合物4℃保存。
在第4天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，并將它與第3天收集的樣品混合，混合的收集樣品，在用0.45微米低蛋白結(jié)合濾器(Durapore，Millipore)去除微粒?；旌衔?70℃保存或立即使用。
(ii)本發(fā)明的BAFF的分離和純化用一個正切流動過濾(TFF)裝置(Pelicon XL，Ultracell，Millipore)，將950ml過濾的細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮20倍左右。樣品以150ml/min的速度注入150cm2的再生纖維素膜上，截斷5KDa的分子量，直到樣品濃縮到30ml的體積。濃縮的樣品加入70ml 50mM的HEPES(pH為8)透析過濾，濃縮體積仍為30ml。該透析過濾步驟重復(fù)兩次，終體積為50ml。接著，用一個0.45微米的低蛋白結(jié)合濾器(Durapore，Millipore)對該濃縮透濾樣品進行過濾。
BAFF的純化是將濃縮的細(xì)胞培養(yǎng)上清通過TFF，其位于一根預(yù)先用50mM的HEPES(pH為8.5)平衡的離子交換柱(Bio-Rad Laboratories，MacroPrep HS)上。接著，用50mM HEPES(pH為8)到100％50mM的HEPES(pH為8)含1M NaCl的線性梯度溶液洗脫結(jié)合的BAFF。得到的成分通過1D SDS PAGE用4-20％的梯度Tris-Glycine膠(Invitrogen)分析表觀分子量和純度，并用抗-BAFF ELISA(R&D系統(tǒng))進行定量。發(fā)現(xiàn)BAFF以兩種不同的離子形式從陰離子交換柱中洗脫?；旌虾珺AFF的溶液，將其濃縮到1ml以下，利用離心濾器裝置(Amicon Ultra，Millipore)進行分子排阻色譜。
分子排阻色譜在結(jié)合的陰離子交換成分上上進行，利用Superdex75制備的16/70級(Pharmacia，Uppsala，Sweden)柱。1％碳酸氫銨平衡緩沖液的流速為1ml/min?？偟牧鲃訒r間為120min，高峰洗脫時間在20到100min之間。用4-20％Tris-甘氨酸膠(Invitrogen)和BAFFELISA對洗脫的部分進行分析?；旌虾珺AFF的部分，并利用離心濾器裝置(Amicon Ultra，Millipore)濃縮到2ml以下。
發(fā)現(xiàn)純化的BAFF其表觀MW在16-17kDa之間。根據(jù)280nm的吸收度進行測定，摩爾消光系數(shù)為14565M-1cm-1，得到BAFF的終濃度為50μg/ml。
(f)本發(fā)明的NGFR-Fc的制備、分離和純化 (i)本發(fā)明的NGFR-Fc的制備第0天，在5個500cm2的組織培養(yǎng)皿(Corning)上鋪3×107個轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系的細(xì)胞，例如HEK 293，HEK 293 c18，HEK 293T，293 CEN4，HEK 293F，HEK 293E，HEK 293FT，AD-293(Stratagene)或293A(Invitrogen)。每個培養(yǎng)皿，細(xì)胞加入90ml Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium/Ham營養(yǎng)復(fù)合物F12(DMEM/F12)(JRH Biosciences)，培養(yǎng)基中需加入10％(v/v)熱滅活胎牛血清(FCS，JRH Biosciences)，4mM L-谷氨酰胺(Amresco)和1％(v/v)青霉素-鏈霉素(青霉素G5000U/ml，硫酸鏈霉素5mg/ml)(JRH Biosciences)。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第1天，用磷酸鈣進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，每個平皿中的培養(yǎng)基替換成120ml新鮮的DMEM/F12，其中含有10％(v/v)熱滅活FCS，4mM L-谷氨酰胺，和1％(v/v)青霉素-鏈霉素。制備磷酸鈣/DNA沉淀為，在無菌水中加入1200μg具有人NGFR-Fc基因的pIRESbleo3(Invitrogen)質(zhì)粒DNA和3720μl 2.5M的CaCl2溶液，終體積為30ml(溶液A)。用10ml的移液管將溶液A滴加入30ml 2×HEPES緩沖液(HBS)(溶液B)中。在滴加的過程中，氣泡緩慢通過溶液B。將混合物在25℃孵育20min并渦旋。每個平皿中滴加入12ml的混合物。4小時后，去除含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每平皿加入100mlDMEM/F12，其中含10％(v/v)熱滅活的FCS，4mM L-谷氨酰胺，1％(v/v)青霉素-鏈霉素和終濃度為3.5mM的HCl，培養(yǎng)基的最終pH為7。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第2天，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清。每個平皿用50ml DMEM/F12培養(yǎng)基清洗其中的物質(zhì)兩次，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，含有40mM的N-乙?；?D-甘露糖胺(New ZealandPharmaceuticals)，10mM的L-谷氨酰胺，0.5g/L的甘露糖(Sigma)和1％(v/v)的青霉素-鏈霉素。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第3天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，含有40mM的N-乙?；?D-甘露糖胺，10mM的L-谷氨酰胺，0.5g/L的甘露糖和1％(v/v)的青霉素-鏈霉素。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，混合物4℃保存在第4天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，并將它與第3天收集的樣品混合。混合的收集樣品，在用0.45微米低蛋白結(jié)合濾器(Durapore，Millipore)去除微粒之前，加入2M Tris-HCl(pH8)(Sigma)調(diào)節(jié)其pH至8，終濃度為100mM。混合物-70℃保存或立即使用。
(ii)本發(fā)明的NGFR-Fc的分離和純化收集培養(yǎng)基，加入2M的Tris-HCl(pH8)(Sigma)，使其終濃度為100mM，將pH調(diào)整到pH8，過濾(Durapore，0.45μm，Millipore)。1升pH調(diào)整后的含NGFR-Fc的培養(yǎng)基在重力作用下穿過帶有1ml柱床體積的蛋白A瓊脂糖柱(Pharmacia)，柱子預(yù)先用100mM的Tris-Cl(Sigma)平衡到pH8。用20倍柱體積的柱緩沖液(100mM的Tris-Cl，pH8)沖洗后，用0.1M的檸檬酸(Sigma)(pH4.4)洗脫NGFR-Fc，接著用0.1M的檸檬酸(Sigma)(pH2.2)洗脫，并分別立即加入100μl和400μl的2M Tris-HCl(pH9)(Sigma)進行中和。通過銀染色的SDS PAGE，用4-20％的梯度Tris-甘氨酸膠(Invitrogen)進行分析?；旌霞兓暮琋GFR-Fc的溶液，并濃縮到1ml以下，利用離心濾器裝置(AmiconUltra，Millipore)進行分子排阻色譜。
分子排阻色譜在濃縮的樣品上進行，利用Superdex 200制備的16/70級(Pharmacia，Uppsala，Sweden)柱。1％碳酸氫銨平衡緩沖液的流速為1ml/min?？偟牧鲃訒r間為120min，高峰洗脫時間在20到100min之間。通過4-20％的Tris-甘氨酸膠(Invitrogen)進行銀染色的SDS PAGE對洗脫成分進行分析?；旌虾琋GFR-Fc的溶液，并利用離心濾器裝置(Amicon Ultra，Millipore)濃縮到2ml以下。
發(fā)現(xiàn)純化的NGFR-Fc其表觀MW在50-110kDa，通過銀染色的SDSPAGE分析得到其純度至少為95％。根據(jù)280nm的吸收度進行測定，摩爾消光系數(shù)為55735M-1cm-1，得到NGFR-Fc的終濃度為1259μg/ml。
(g)本發(fā)明的Fas配體的制備、分離和純化 (i)本發(fā)明的Fas配體的制備第0天，在5個500cm2的組織培養(yǎng)皿(Corning)上鋪3×107個轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞系的細(xì)胞，例如HEK 293，HEK293 c18，HEK 293T，293CEN4，HEK 239F，HEK 293E，HEK 293FT，AD-293(Stratagene)或293A(Invitrogen)。每個培養(yǎng)皿，細(xì)胞加入90ml Dulbecco’s ModifiedEagle’s Medium/Ham營養(yǎng)復(fù)合物F12(DMEM/F12)(JRH Biosciences)，培養(yǎng)基中需加入10％(v/v)供者小牛血清(DCS，JRH Biosciences)，4mM L-谷氨酰胺(Amresco)和1％(V/V)青霉素-鏈霉素(青霉素G5000U/ml，硫酸鏈霉素5mg/ml)(JRH Biosciences)。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第1天，用磷酸鈣進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，每個平皿中的培養(yǎng)基替換成120ml鮮的DMEM/F12，其中含有10％(v/v)DCS，4mM L-谷氨酰胺，和1％(v/v)青霉素-鏈霉素。制備磷酸鈣/DNA沉淀為，在無菌水(BD Biosciences)中加入1200μg具有人Fa s配體基因的pIRESbleo3(Invitrogen)質(zhì)粒DNA和3720μl 2.5M的CaCl2(BD Biosciences)，終體積為30ml(溶液A)。用10ml的移液管將溶液A滴加入30ml 2×HEPES緩沖液(HBS)(溶液B)(BD Biosciences)中。在滴加的過程中，氣泡緩慢通過溶液B。將混合物在25℃孵育20min并渦旋。每個平皿中滴加入12ml的混合物。4小時后，去除含轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每平皿加入100ml DMEM/F12(pH7)，其中含10％(v/v)DCS，4mM L-谷氨酰胺，1％(v/v)青霉素-鏈霉素和終濃度為3.5mM的HCl，培養(yǎng)基的最終pH為7。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第2天，去除細(xì)胞培養(yǎng)上清。每個平皿用50ml DMEM/F12培養(yǎng)基清洗其中的物質(zhì)兩次，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，含有40mM的N-乙?；?D-甘露糖胺(New ZealandPharmaceuticals)，10mM的L-谷氨酰胺，0.5g/L的甘露糖(Sigma)，和1％(v/v)的青霉素-鏈霉素。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。
在第3天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，并在每個平皿中加入100ml新鮮的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，含有40mM的N-乙酰基-D-甘露糖胺，10mM的L-谷氨酰胺，0.5g/L的甘露糖，和1％(v/v)的青霉素-鏈霉素。平皿在37℃和5％CO2的條件下孵育過夜。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，混合物4℃保存。
在第4天，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。在收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入100mM的PMSF(1％(v/v))和500mM的EDTA(1％(v/v))，并將它與第3天收集的樣品混合?；旌系氖占瘶悠?，在用0.45微米低蛋白結(jié)合濾器(Durapore，Millipore)去除微粒之前，加入200mM MES/50mM MgCl2pH6調(diào)節(jié)其pH至6，?；旌衔?70℃保存或立即使用。
(ii)本發(fā)明的Fas配體的分離和純化染料-配體色譜(DLC)過程用于Fas配體純化的第一步。一系列活性染料可以用于屏蔽Fas配體避免有效結(jié)合，并以批量純化microtitre的形式釋放。接著，以小規(guī)模柱的形式檢測相配的染料-蛋白結(jié)合物。
小規(guī)模純化時，在pH為6或7.3的情況下，5ml溶化的細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品通過0.5ml的染料-配體柱。在這個最佳化步驟中，選擇最佳的活性染料-細(xì)胞因子和pH組合，使回收率最高，擴大比例用于大體積DLC。
對于大比例DLC，選擇活性染料編號18High(Zymatrix)作為活性染料，對Fas配體具有最佳的結(jié)合和洗脫性質(zhì)。過濾的細(xì)胞培養(yǎng)上清在重力作用下通過4.0ml或8.0ml的柱身(Alltech，Extract CleanFilter columns)，分別含有預(yù)先用50mM MES/5mM MgCl2平衡到pH6的3ml或6ml DLC樹脂。柱子用緩沖液A(20mM MES/5mM MgCl2，pH6)進行沖洗直到洗出液用colourmetric蛋白分析(Biorad蛋白分析)沒有監(jiān)測到蛋白。Fas配體用三種洗脫緩沖液按以下順序洗脫洗脫液1緩沖液C(50mM Tris-Cl/10mM EDTA pH 8) 洗脫液2EN1.0(50mM Tris-Cl/10mM EDTA/1.0M NaCl pH8) 洗脫液3EN2.0(50mM Tris-Cl/10mM EDTA/2.0M NaCl pH8) 通過4-20％Tris-甘氨酸膠(Invitrogen)進行銀染色的SDS PAGE以及通過抗-Fas配體的ELISA(R&D系統(tǒng))，對洗脫部分進行分析。發(fā)現(xiàn)Fas配體結(jié)合于活性染料8High并在ENl.0緩沖液中洗脫。SDS PAGE分析證明90％污染的蛋白在在這第一步純化中去除。用PD10柱(Amersham Biosciences)除去含有Fas配體的DLC溶液的鹽分，并混合用于陰離子交換色譜。
將去除鹽分的溶液從PD10柱通過陰離子交換柱(Bio-RadLaboratories，Uno S1)達到純化，離子交換柱預(yù)先用50mM MES(pH6.5)(Sigma)平衡到pH6.5。結(jié)合合的Fas配體用50mM MES(pH6.5)到含1M NaCl的50mM MES(pH6.5)的線性梯度溶液從柱子上洗脫。得到的成分通過ELISA和1D SDS PAGE用4-20％的梯度Tris-Glycine膠(Invitrogen)分析表觀分子量和純度。混合含細(xì)胞因子的溶液。
分子排阻色譜在濃縮的樣品上進行，利用Superdex 75制備的16/70級(Pharmacia，Uppsala，Sweden)柱。1％碳酸氫銨平衡緩沖液的流速為1ml/min?？偟牧鲃訒r間為120min，高峰洗脫時間在20和100min之間。通過4-20％Tris-甘氨酸膠(Invitrogen)進行銀染色的SDS PAGE對洗脫成分進行分析。
發(fā)現(xiàn)純化的Fas配體其表觀MW在25-36kDa之間。根據(jù)280nm的吸收度進行測定，摩爾消光系數(shù)為27515M-1cm-1，得到Fas配體的終濃度為94.8μg/ml。
(h)進一步的本發(fā)明的TNFRII-Fc(批號003)的制備、分離和純化實施方案 (i)本發(fā)明的TNFRII-Fc(批號003)的制備制備Freestyle 293F細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞總數(shù)至少為5×107個細(xì)胞。用臺盼蘭排除法確定Freestyle 293F細(xì)胞的密度和細(xì)胞總數(shù)。在一個125ml的錐形瓶中，將3×107個細(xì)胞加到28ml的Freestyle ExpressionMedium(Invitrogen)中。
接著，在制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物的同時將細(xì)胞在37℃振搖孵育。30μg具有TNFRII-Fc序列的質(zhì)粒DNA(pCEP-4-TNFRII-Fc)以25μl的體積加到975μl Opti-MEM(Invitrogen)中(溶液A)。40μl的293fectin(Invitrogen)加到960μl Opti-MEM中(溶液B)。
溶液A和溶液B在室溫孵育5分鐘，接著將其小心混合，室溫再孵育30分鐘。
將該轉(zhuǎn)染復(fù)合物加到28ml的293F細(xì)胞的懸浮液中。通過接種維持其表達培養(yǎng)基直至TNFRII-Fc表達停止。
在搖瓶或MantaRay培養(yǎng)瓶(Fisher Scientific)中進行蛋白的大規(guī)模表達。用Freestyle Expression Medium制備500ml或1000ml轉(zhuǎn)染了pCEP-4-TNFRII-Fc載體的Freestyle 293F細(xì)胞，細(xì)胞密度為4×105細(xì)胞/ml。接著將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在1000rpm離心10min，用5ml預(yù)熱的無菌PBS洗，1000rpm離心10min，并用10ml新鮮的Feestyle ExpressionMedium重懸。細(xì)胞以4.0×105細(xì)胞/ml的密度加到MantaRay培養(yǎng)瓶或搖瓶中，細(xì)胞重懸在500ml或1000ml預(yù)熱的Freestyle ExpressionMedium中。在帶攪拌的加濕培養(yǎng)箱中，在37℃，5％CO2條件下孵育細(xì)胞。
每24小時，用臺盼蘭排除法評估細(xì)胞的存活率。一旦細(xì)胞密度達到1.5×106細(xì)胞/ml(通常在接種后5天內(nèi))，收集上清。
(ii)本發(fā)明的TNFRII-Fc(批號003)的分離和純化 (a)本發(fā)明的TNFRII-Fc(批號003)的純化在無菌條件下進行，并用兩種色譜法實現(xiàn)。離心使表達培養(yǎng)上清(批號003)變澄清，并以5ml/min的流速加到蛋白A瓊脂糖柱(RN040633，Repligen)上。接著用10倍柱體積(200ml)0.1M的Tris-Cl(pH8.0)進行沖洗。結(jié)合的TNFRII-Fc(批號003)用冷的0.1M檸檬酸(pH4.0)洗脫，在8個標(biāo)記的50ml Falcon管中收集到20ml溶液。洗脫樣品在4℃孵育1小時使病毒失活，接著用2M Tris-Cl(pH8.5)中和洗脫液。
從蛋白A柱中洗脫的TNFRII-Fc在Q Sepharose Column陰離子交換柱中進一步純化，柱子預(yù)先用80mM檸檬酸400mM Tris-Cl(pH9.0)進行平衡。蛋白A洗脫液的流速為5ml/min，收集峰值樣品，4℃保存。結(jié)合的蛋白用含1M NaCl的平衡緩沖液進行洗脫。
通過峰值的溶液用4個Centriprep YM-10離心濾器裝置(Millipore)根據(jù)廠商的說明書進行濃縮。濃縮3倍后，將溶液的緩沖液變成1×DPBS pH7.0(2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，137mM NaCl和8mMNa2HPO4，pH7.0) UV280和Fc ELISA測得TNFRII-Fc(批號003)的最終產(chǎn)率為1.45mg/ml共60ml(即87mg總蛋白)。銀染色膠表明其純度在95％以上。
生物檢定結(jié)構(gòu)表明TNFRII-Fc(批號003)有效，在WEHI164細(xì)胞的增殖試驗中能夠抑制TNF-α的細(xì)胞毒性。
(b)或者，TNFRII-Fc用2ml的IPA-400HC rProtein A柱(RepligenRN040633)進行純化。將含有TNFRII-Fc的表達培養(yǎng)上清加到柱中，室溫持續(xù)4小時，并在4℃過夜。柱子用緩沖液(12.5ml 1M NaCl，0.1M Tris，pH8.0)進行沖洗，結(jié)合的TNFRII-Fc用14ml 0.1M的檸檬酸(pH4.0)進行洗脫，并用6ml pH為9.0的Tris中和。洗脫液用Centriprep YM-10離心濾器裝置根據(jù)廠商的說明書進行濃縮。根據(jù)以上所描述的方法檢測TNFRII-Fc(3mg/ml左右)。
實施例3 (a)本發(fā)明的TNF-α的表征 (i)二維聚丙烯酰胺電泳例2(a)收集的樣品通過透析或脫鹽柱(Pharmacia HR 10/10 FastDesalting Column)將其緩沖液換成再純化(18MOhm)的水，并用SpeedVac濃縮儀干燥?；蛘?，收集的樣品用已知的方法進行TCA活丙酮沉淀。樣品在次溶解于240μl的MSD緩沖液(5M尿素，2M硫脲，65mM DTT，2％(w/v)CHAPS，2％(w/v)磺基甜菜堿3-10，0.2％(v/v)兩性電解質(zhì)載體，40mM Tris，0.002％(w/v)溴酚藍，水)中，并在15000g離心8分鐘。
等電聚焦(IEF)用預(yù)制11cm或預(yù)制17cm凝膠pH 3-10固相pH梯度I EF膠條(BioRad)進行。IEF膠條在封閉管中的樣品中在室溫下再水化至少6小時。IEF膠條置于聚焦室中并用液狀石蠟覆蓋。IEF的操作存在11cm條帶時100V 1小時，200V 1小時，600V 2小時，1000V2小時，2000V 2小時，3500V 12小時和100V高達12小時，或存在17cm條帶時85kV小時(相同的電壓升高程序) 接下來的等電聚焦，膠條被還原并被烷基化，在應(yīng)用到第二向凝膠前。膠條在1×Tris/HCl pH 8.8、6M尿素、2％(w/v)SDS、2％(v/v)甘油、5mM三丁基氧膦(TBP)、2.5％(v/v)丙烯酰胺中培養(yǎng)至少20分鐘。
11cm膠條在第二向分離，通過Criterion預(yù)灌注(11×8cmx1mm厚)10-20％的Trisglycine梯度凝膠(BioRad)。17cm膠條分離為17×17cm、1.5mm厚，自灌注的10-20％的Tris glycine梯度凝膠。Precision或Kaleidoscope分子量標(biāo)記(BioRad)也用于凝膠。膠條放入槽中，使用含有作為行跡染料的溴酚藍的0.5％的瓊脂糖。
用Criterion或Protean II電泳系統(tǒng)(BioRad)進行SDS-PAGE(對于11cm膠，200V，1小時(直到緩沖液前沿即將跑出膠末端)，以及對于17cm膠，每塊膠15mA的恒定電流，21小時)。所用的緩沖液為192mM甘氨酸，0.1％(w/v)SDS、24.8mM Tris堿在pH 8.3下。
完成的二維膠用10％甲醇(MeOH)和7％醋酸(Hac)固定30分鐘-過夜。接著，膠用Sypro Ruby膠染料(BioRad)染色至少3小時，并用10％MeOH和7％HAc脫色至少30分鐘?；蛘?，膠在固定后用Deep Purple熒光染料染色。接著，將膠在300mM Na2CO3，35mM NaHCO3中浸泡2×30min，接著，避光浸泡在1∶20O稀釋的Deep Purple染料中至少1小時。接著用10％MeOH和7％HAc脫色2×15min。兩種情況下，膠都用FX激光光度計(BioRad)和合適的濾光片顯像。
用圖像分析軟件分析二維電泳蛋白圖譜軟件ImageJ(http://rsb.info.nih.gov/ij/)用于分析各凝膠上蛋白斑點的相對強度。對每塊膠所選區(qū)域的斑點進行光密度測定，并用合適的不含蛋白斑點的膠區(qū)域扣除本底。對目的蛋白斑點進行體積積分由此計算出斑點質(zhì)量中心。算每個蛋白的相對強度百分?jǐn)?shù)，將所有斑點密度的相加值標(biāo)準(zhǔn)化為100％，從而測定每個蛋白斑點相對于每塊膠中其它斑點的密度。
測定測定斑點離每塊膠基線的相對距離，并將它與每塊膠所利用的Precision或Kaleidoscope分子量標(biāo)標(biāo)記所指示的距離進行比較，從而確定各個斑點的分子量。一個四次多元指數(shù)函數(shù)分別適用于精密度標(biāo)記和摻入的蛋白斑點位置。
同工型的電荷(pKa值)用ImageJ通過測量斑點和各凝膠左側(cè)的分別的距離確定。由于條帶的pI值和每塊膠的物理距離存在線性關(guān)系，因而，可以輕易確定不同pKa值的同工型斑點所對應(yīng)的pI值。
每個蛋白斑點對應(yīng)TNF-α唯一的一個同工型。每塊膠中主要蛋白斑點對應(yīng)TNF-α的同工型。低密度斑點可能是TNF-α或低水平的污染物，但由于密度低，PMF不能證明。對膠的觀察表明本發(fā)明的TNF-α至少有10到30個同工型。表9和10給出了這些同工型的重要性質(zhì)pI值(±1.0)，表觀分子量(±20％)，和相對強度(實際數(shù)的±20％，或總數(shù)的±2％，任一個較大)。所列的數(shù)值對應(yīng)于，選取的含斑點的膠區(qū)域內(nèi)的密度加權(quán)中心，因此，它只反應(yīng)在每塊膠的所選區(qū)域內(nèi)某次讀數(shù)的蛋白pI和分子量?？紤]到2D膠大小的固有變異性和蛋白位置，基于表9和10所列的數(shù)值，確定分子pI值的范圍為4-8.5左右；基于表9和10所列的數(shù)值，確定分子的表觀分子量范圍為10-30kDa。
表9 TNF-α同工型的分子量和pI值表10TNF-α的分子量和pI值 (ii)一維聚丙烯酰胺電泳干燥由實施例2(a)收集的樣品，然后再溶解到60μl 1D樣品緩沖液中(10％甘油、0.1％SDS、10mM DTT、63mM tris-HCl)并在100℃加熱5分鐘。為了PNGaseF處理，取樣品的30μL部分，并且加入NP40至終濃度0.5％。加入5μL的PNGaseF，然后樣品在37℃培養(yǎng)3小時。為了樣品的糖苷酶cocktail處理法，取一部分然后加入NP40至終濃度0.5％。加入PNGase F 1μL、及唾液酸酶A(neuramidase)、O-聚糖酶、β(1-4)-半乳糖苷酶和β-N-乙酰葡糖胺酶各1μL。處理的和未處理的樣品在37℃培養(yǎng)3小時。處理的和未處理的樣品在預(yù)制Tris凝膠，例如Tris 4-20％梯度凝膠(BioRad)或Tris HCl梯度凝膠(Invitrogen)中電泳。精確分子量標(biāo)記(BioRad產(chǎn)品目錄編碼161-0363)也用于凝膠。Criterion 4-20％或18％凝膠用于1D SDS-PAGE(BioRad產(chǎn)品目錄編碼345-0033或345-0024)。用Mini Protean II或Criterion電泳系統(tǒng)(BioRad)跑SDS-PAGE，200V跑1小時左右，或直到緩沖液前沿即將跑出膠末端。所用緩沖液為192mM甘氨酸，0.1％(w/v)SDS，24.8mM Tris堿，pH 8.3。完成的膠用10％MeOH和7％HAc固定至少30分鐘。接著，膠用Sypro Ruby膠染料(BioRad)染色至少3小時，并用10％MeOH和7％HAc脫色至少30分鐘?；蛘撸z在固定后用Deep Purple(Amersham)根據(jù)廠商說明進行染色。膠用FX激光光度計(BioRad)和合適的濾光片顯像。去除N-連接寡糖(PNGase處理)后TNF-α的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在8到30kDa之間。去除N-連接和O-連接寡糖(糖苷酶處理)后TNF-α的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在10到20kDa之間。
(iii)N-端序列測定從以上制備的膠(從二維膠或一維膠)中切下蛋白條帶，放在一個0.5ml管中，并加入100ml提取緩沖液(100mM醋酸鈉，0.1％SDS，50mMDTT pH 5.5)。膠在37℃振搖孵育16小時。上清液按照廠商技術(shù)說明書用于ProSorb膜(ABI)并且按照廠商技術(shù)說明書用自動化494蛋白質(zhì)測序儀(Applied Biosystems)測序。獲得的序列用于確定蛋白質(zhì)的同一性。
(iv)肽質(zhì)量指紋譜蛋白質(zhì)條帶從上述制備的凝膠切下(從雙向凝膠或單向凝膠)并且用25μl洗滌緩沖液(在50mM NH4HCO3中有50％乙腈)洗滌。凝膠切片在室溫下保留至少1小時并且經(jīng)真空離心30分鐘干燥。凝膠切片和12μl胰島素溶液(20μg胰島素，1200μl NH4HCO3)置于各樣品槽中并且在4℃培養(yǎng)1小時。除去余下的胰島素溶液并且加入20μl 50mM NH4HCO3。混合物在37℃輕輕振蕩過夜培養(yǎng)。濃縮肽樣品并用C18 Zip-Tips(Millipore、Bedford、MA)或含有Poros R2(Perseptive Biosystems、Framingham、MA)層析樹脂的預(yù)制微型柱脫鹽。結(jié)合肽在0.8μl基質(zhì)溶液(α-氰基-4-羥基肉桂酸(Sigma)、8mg/ml在70％乙腈中/1％甲酸)中直接洗脫到目的平板中。胰蛋白酶的肽質(zhì)量指紋譜通過使用Perseptive Biosystems Voyager DE-STR的基質(zhì)-輔助激光解吸/解吸電離飛行時間質(zhì)譜測定(MALDI-TOF MS)產(chǎn)生。譜圖通過使用20kV加速電壓的反射模式獲得。質(zhì)量校準(zhǔn)使用胰島素自溶峰，2211.11Da和842.51Da作為內(nèi)標(biāo)進行。由肽質(zhì)量指紋譜(PMF)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)用于確定蛋白質(zhì)同一性。搜索(主要的Homo sapien(人類)和哺乳動物條目)在數(shù)據(jù)庫中進行，例如the SWISS-PROT和TrEMBL，經(jīng)過PeptIdent(www.expasy.ch/tools/peptident.html)程序。識別參數(shù)包括0.1Da允許誤差的肽質(zhì)量，每個肽逃脫胰蛋白酶裂解的最大片段，和蛋氨酸亞砜和半胱氨酸-丙烯酰胺修飾。識別基于匹配的肽質(zhì)量編號和這些肽覆蓋的氨基酸序列的總百分比，在其他數(shù)據(jù)庫輸入比較。一般的，具有至少30％總序列覆蓋的肽質(zhì)量對于確定同一性是必須的，但是非常低和高質(zhì)量的蛋白質(zhì)，和由這些蛋白得到的蛋白質(zhì)片段，不可能總是滿足這些標(biāo)準(zhǔn)，因此需要進一步識別。
無確定結(jié)果的或無蛋白同一性之處可以由MALDI-TOF PMF分析獲得，保留的肽混合物或從復(fù)制凝膠切下的相同的斑點經(jīng)胰蛋白酶消化并通過電噴霧離子化串聯(lián)MS(ESI-MS/MS)分析。為了ESI-MS/MS，肽由Poros R2微型柱上用1-2μl 70％乙腈，1％甲酸直接洗脫到硼硅電噴霧針頭(Micromass、Manchester、UK)。串聯(lián)MS用Q-Tof混合型三級/正交加速TOF質(zhì)譜儀(Micromass)進行。含有樣品的電噴霧針頭包埋在來源和用毛細(xì)管電壓900-1200V獲得的穩(wěn)定流中。進行先驅(qū)離子掃描以檢測混合物中肽的質(zhì)量和電荷比值(m/z)。各個個別的先驅(qū)離子的m/z挑選出來用于斷裂并且用18-30eV碰撞能量的氬氣碰撞。碎片離子(對應(yīng)來自前體肽的氨基酸的缺失)被記錄并用Mass Lynx Version 3.4(Micromass)處理。氨基酸序列通過用Mass Seq(Micromass)程序的y-或b-離子“梯度”系列的質(zhì)量差異推斷出來并且通過手工翻譯確定。然后，肽序列用于搜索NCBI和TrEMBL數(shù)據(jù)庫，使用BLASTP程序“short nearly exact matches”。兩個配對肽的最小值對于提供給定的同一性的確信是必須的。
膠斑點的同一性被證明是TNF-α。
(b)本發(fā)明的LT-α的鑒定 (i)二維聚丙烯酰胺電泳從例2(b)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(i)所描述的進行處理和分析。膠中主要蛋白斑點對應(yīng)LT-α的同工型。低密度斑點可能是LT-α或低水平的污染物，但由于密度低，PMF不能證明。對膠的觀察表明本發(fā)明的LT-α有7到33個同工型。表11和12給出了這些同工型的重要性質(zhì)pI值(±1.0)，表觀分子量(±20％)，和相對強度(實際數(shù)的±20％，或總數(shù)的±2％，任一個較大)。所列的數(shù)值對應(yīng)于，選取的含斑點的膠區(qū)域內(nèi)的密度加權(quán)中心，因此，它只反應(yīng)在每塊膠的所選區(qū)域內(nèi)某次讀數(shù)的蛋白pI和分子量?？紤]到2D膠大小的固有變異性和蛋白位置，基于表11和12所列的數(shù)值，確定分子p I值的范圍為5-11左右；基于表11和12所列的數(shù)值，確定分子的表觀分子量范圍為15-32kDa。
表11 LT-α同工型的分子量和pI值表12 LT-α同工型的分子量和pI值 (ii)一維聚丙烯酰胺電泳從例2(b)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(ii)所描述的進行處理。去除N-連接寡糖(通過PNGase處理)后LT-α的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在12和25kDa之間。去除N-連接和O-連接寡糖(通過糖苷酶處理)后LT-α的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在12和23kDa之間。
(iii)蛋白的N-端序列測定本發(fā)明的LT-α的N-端序列測定根據(jù)實施例3(a)(iii)所描述的得以完成。
(iv)肽質(zhì)量指紋本發(fā)明的LT-α的肽質(zhì)量指紋根據(jù)實施例3(a)(iv)所描述的得以完成。
膠斑點的同一性被證明是LT-α。
(c)本發(fā)明的TNFRI-Fc的鑒定 (i)二維聚丙烯酰胺電泳從例2(c)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(i)所描述的進行處理和分析。膠中主要蛋白斑點對應(yīng)TNFRI-Fc的同工型。低密度斑點可能是TNFRI-Fc或低水平的污染物，但由于密度低，PMF不能證明。對膠的觀察表明本發(fā)明的TNFRI-Fc有8到16個同工型。表13和14給出了這些同工型的重要性質(zhì)pI值(±1.0)，表觀分子量(±20％)，和相對強度(實際數(shù)的±20％，或總數(shù)的±2％，任一個較大)。所列的數(shù)值對應(yīng)于，選取的含斑點的膠區(qū)域內(nèi)的密度加權(quán)中心，因此，它只反應(yīng)在每塊膠的所選區(qū)域內(nèi)某次讀數(shù)的蛋白pI和分子量?？紤]到2D膠大小的固有變異性和蛋白位置，確定表13和14所列的數(shù)值，測得分子pI值的范圍為5.5-9.5左右；基于表13和14所列的數(shù)值，確定分子的表觀分子量范圍為45-75kDa。
表13 TNFRI-Fc同工型的分子量和pI值表14 TNFRI-Fc同工型的分子量和pI值 (ii)一維聚丙烯酰胺電泳從實施例2(c)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(ii)所描述的進行處理。去除N-連接寡糖(通過PNGase處理)后TNFRI-Fc的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在36和60kDa之間。去除N-連接和O-連接寡糖(通過糖苷酶處理)后TNFRI-Fc的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在36和60kDa之間。
(iii)蛋白的N-端序列測定本發(fā)明的TNFRI-Fc的N-端序列測定根據(jù)實施例3(a)(iii)所描述的得以完成。
(iv)肽質(zhì)量指紋本發(fā)明的TNFRI-Fc的肽質(zhì)量指紋根據(jù)實施例3(a)(iv)所描述的得以完成。
膠斑點的同一性被證明是TNFRI-Fc。
此外，觀察到胰蛋白酶肽的分子量有1Da的移動，這表明理論上人TNFRI-Fc氨基酸序列中的1NX(S/T/C)基序的天門冬酰胺殘基(N)被修飾成天門冬氨酸(D)，這符合PNGase F在去除相關(guān)的N-連接寡糖后誘導(dǎo)N到D的殘基修飾性質(zhì)。因此，本發(fā)明的TNFRI-Fc的一個得到證明的N-糖基化位點是N-299(從信號肽的起始處開始編號) (d)本發(fā)明的TNFRII-Fc的鑒定 (i)二維聚丙烯酰胺電泳從實施例2(d)或2(h)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(i)所描述的進行處理和分析。
膠中主要蛋白斑點對應(yīng)TNFRII-Fc的同工型。低密度斑點可能是TNFRI I-Fc或低水平的污染物，但由于密度低，PMF不能證明。對膠的觀察表明本發(fā)明的TNFRII-Fc有10到40個同工型。表15和15(a)給出了這些同工型的重要性質(zhì)pI值(±1.0)，表觀分子量(±20％)，和相對強度(實際數(shù)的±20％，或總數(shù)的±2％，任一個較大)。所列的數(shù)值對應(yīng)于，選取的含斑點的膠區(qū)域內(nèi)的密度加權(quán)中心，因此，它只反應(yīng)在每塊膠的所選區(qū)域內(nèi)某次讀數(shù)的蛋白pI和分子量。考慮到2D膠大小的固有變異性和蛋白位置，基于表15和15(a)所列的數(shù)值，確定分子pI值的范圍為4-10左右；確定表15和15(a)所列的數(shù)值，測得分子的表觀分子量范圍為46-118kDa。
表15TNFRII-Fc同工型的分子量和pI值表15(a) TNFRII-Fc(批號003)同工型的分子量和pI值 (ii)一維聚丙烯酰胺電泳從實施例2(h)(ii)(b)(批號003)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(ii)所描述的進行處理。去除N-連接寡糖(通過PNGase處理)后TNFRII-Fc的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在46和87kDa之間。去除N-連接和O-連接寡糖(通過糖苷酶處理)后TNFRII-Fc的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在42和80kDa之間 (iii)蛋白的N-端序列測定本發(fā)明的TNFRII-Fc的N-端序列測定根據(jù)上面實施例3(a)(iii)所描述的得以完成。產(chǎn)生的序列(PAQVAFTPYA)用于證明的TNFRII-Fc的同一性。
(iv)肽質(zhì)量指紋本發(fā)明的TNFRII-Fc的肽質(zhì)量指紋根據(jù)上面實施例3(a)(iv)所描述的得以完成。
膠斑點的同一性被證明是TNFRII-Fc。
此外，觀察到胰蛋白酶肽的分子量有1Da的移動，這表明理論上人TNFRII-Fc氨基酸序列中一個或多個NX(S/T/C)基序的天門冬酰胺殘基(N)被修飾成天門冬氨酸(D)，從而證明了本發(fā)明的TNFRII-Fc中一個或多個N-糖基化位點。
(e)本發(fā)明的OX40-Fc的鑒定 (i)二維聚丙烯酰胺電泳從實施例2(e)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(i)所描述的進行處理和分析。
膠中主要蛋白斑點對應(yīng)OX40-Fc的同工型。低密度斑點可能是OX40-Fc或低水平的污染物，但由于密度低，PMF不能證明。對膠的觀察表明本發(fā)明的OX40-Fc有8到16個同工型。表16給出了這些同工型的重要性質(zhì)pI值(±1.0)，表觀分子量(±20％)，和相對強度(實際數(shù)的±20％，或總數(shù)的±2％，任一個較大)。所列的數(shù)值對應(yīng)于，選取的含斑點的膠區(qū)域內(nèi)的密度加權(quán)中心，因此，它只反應(yīng)在每塊膠的所選區(qū)域內(nèi)某次讀數(shù)的蛋白pI和分子量?？紤]到2D膠大小的固有變異性和蛋白位置，基于表16所列的數(shù)值，確定分子pI值的范圍為4-9左右；基于表16所列的數(shù)值，確定分子的表觀分子量范圍為46-75kDa。
表16 OX40-Fc同工型的分子量和pI值 (ii)一維聚丙烯酰胺電泳從實施例2(e)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(ii)所描述的進行處理。去除N-連接寡糖(通過PNGase處理)后OX40-Fc的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在44和72kDa之間。去除N-連接寡糖(通過PNGase處理)和O-連接寡糖(通過雞尾酒糖苷酶處理)后OX40-Fc的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在41和70kDa之間。
(iii)N-端序列測定本發(fā)明的OX40-Fc的N-端序列測定根據(jù)實施例3(a)(iii)所描述的得以完成。
(iv)肽質(zhì)量指紋本發(fā)明的OX40-Fc的肽質(zhì)量指紋根據(jù)上面實施例3(a)(iv)所描述的得以完成。
膠斑點的同一性被證明是OX40-Fc。
此外，觀察到胰蛋白酶肽的分子量有1Da的移動，這表明理論上人OX40-Fc氨基酸序列中的2NX(S/T/C)基序的天門冬酰胺殘基(N)被修飾成天門冬氨酸(D)。因此，本發(fā)明的OX40-Fc得到證明的N-糖基化位點包括N-160和N-298(從信號肽的起始處開始編號)。
(f)本發(fā)明的BAFF的鑒定 (i)二維聚丙烯酰胺電泳從實施例2(f)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(i)所描述的進行處理和分析。
膠中主要蛋白斑點對應(yīng)BAFF的同工型。低密度斑點可能是BAFF或低水平的污染物，但由于密度低，PMF不能證明。對膠的觀察表明本發(fā)明的BAFF有5到10個同工型。表17給出了這些同工型的重要性質(zhì)pI值(±1.0)，表觀分子量(±20％)，和相對強度(實際數(shù)的±20％，或總數(shù)的±2％，任一個較大)。所列的數(shù)值對應(yīng)于，選取的含斑點的膠區(qū)域內(nèi)的密度加權(quán)中心，因此，它只反應(yīng)在每塊膠的所選區(qū)域內(nèi)某次讀數(shù)的蛋白p I和分子量?？紤]到2D膠大小的固有變異性和蛋白位置，基于表17所列的數(shù)值，確定分子pI值的范圍為4-8左右；基于表17所列的數(shù)值，確定分子的表觀分子量范圍為10-22kDa。
表17 BAFF同工型的分子量和pI值 (ii)一維聚丙烯酰胺電泳從實施例2(f)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(ii)所描述的進行處理。去除N-連接寡糖(通過PNGase處理)后BAFF的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在8和22kDa之間。去除N-連接寡糖(通過PNGase處理)和O-連接寡糖(通過雞尾酒糖苷酶處理)后BAFF的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在8-22kDa。
(iii)N-端序列測定本發(fā)明的BAFF的N-端序列測定根據(jù)上面實施例3(a)(iii)所描述的得以完成。
(iv)肽質(zhì)量指紋本發(fā)明的BAFF的肽質(zhì)量指紋根據(jù)實施例3(a)(iv)所描述的得以完成。
膠斑點的同一性被證明是BAFF (g)本發(fā)明的NGFR-Fc的鑒定 (i)二維聚丙烯酰胺電泳從實施例2(f)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(i)所描述的進行處理和分析。
膠中主要蛋白斑點對應(yīng)NGFR-Fc的同工型。低密度斑點可能是NGFR-Fc或低水平的污染物，但由于密度低，PMF不能證明。對膠的觀察表明本發(fā)明的NGFR-Fc有8到16個同工型。表18給出了這些同工型的重要性質(zhì)pI值(±1.0)，表觀分子量(±20％)，和相對強度(實際數(shù)的±20％，或總數(shù)的±2％，任一個較大)。所列的數(shù)值對應(yīng)于，選取的含斑點的膠區(qū)域內(nèi)的密度加權(quán)中心，因此，它只反應(yīng)在每塊膠的所選區(qū)域內(nèi)某次讀數(shù)的蛋白pI和分子量。考慮到2D膠大小的固有變異性和蛋白位置，基于表18所列的數(shù)值，確定分子pI值的范圍為3-6左右；基于表18所列的數(shù)值，確定分子的表觀分子量范圍為55-105kDa。
表18 NGFR-Fc的分子量和pI值 (ii)一維聚丙烯酰胺電泳從實施例2(g)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(ii)所描述的進行處理。
NGFR-Fc的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在55和105kDa之間。通過PNGase處理去除N-連接寡糖后NGFR-Fc的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在48和90kDa之間。去除N-連接寡糖(通過PNGase處理)和O-連接寡糖(通過雞尾酒糖苷酶處理)后NGFR-Fc的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在48和85kDa之間。
(iii)N-端序列測定本發(fā)明的NGFR-Fc的N-端序列測定根據(jù)實施例3(a)(iii)所描述的得以完成。
(iv)肽質(zhì)量指紋本發(fā)明的NGFR-Fc的肽質(zhì)量指紋根據(jù)實施例3(a)(iv)所描述的得以完成。
膠斑點的同一性被證明是NGFR-Fc。
(h)本發(fā)明的Fas配體的鑒定 (i)二維聚丙烯酰胺電泳從實施例2(h)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(i)所描述的進行處理和分析。
(ii)一維聚丙烯酰胺電泳從實施例2(h)收集到的樣品根據(jù)上面實施例3(a)(ii)所描述的進行處理。Fas配體的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在15-35Da之間。去除N-連接寡糖(通過PNGase處理)后Fas配體的表觀分子量(由SDS-PAGE觀察到)在12和21kDa之間。
(iii)N-端序列測定本發(fā)明的Fas配體的N-端序列測定根據(jù)實施例3(a)(iii)所描述的得以完成。
(iv)肽質(zhì)量指紋本發(fā)明的Fas配體的肽質(zhì)量指紋根據(jù)實施例3(a)(iv)所描述的得以完成。
膠斑點的同一性被證明是Fas配體。
觀察到胰蛋白酶肽的分子量有1Da的移動，這表明理論上人Fas配體氨基酸序列中的1NX(S/T/C)基序的天門冬酰胺殘基(N)被修飾成天門冬氨酸(D)。因此，本發(fā)明的Fas配體的一個得到證明的N-糖基化位點包括N-184(從信號肽的起始處開始編號)。
實施例4 (a)分析本發(fā)明的TNF-α的氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型組成。
(i)準(zhǔn)備樣品用于氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型分析為了鑒定單糖和寡糖的糖基化以及磷酸鹽和硫酸鹽的翻譯后修飾，首先通過水解或酶的方法將糖從多肽主鏈上移開。樣品緩沖液組分也被去除并換成水以避免在分析開始前發(fā)生水解和酶發(fā)應(yīng)。純化TNF-α的PBS溶液用4升去離子的超濾水(18MOhm)進行透析，持續(xù)4天，每天換2次，用額定截斷分子量(NMWC)為5KDa的再生纖維素透析膜(Spectrapore)。透析后，溶液用Savant Speed Vac(紐約，美國)干燥。干燥后的樣品用2ml去離子超濾水(18MOhm)重懸，分裝用于不同的分析。(ii)通過氣相水解方法的氨基酸組成成分分析樣品中的氨基酸用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯(AQC)衍理化的前置柱進行分析。用反向(C18)HPLC分離并定量穩(wěn)定的熒光氨基酸衍生物。所用步驟是基于Waters AccQTag氨基酸分析方法學(xué)。
取3份100μl的TNF-α分離樣品并在Speed Vac中干燥。接著，干燥的樣品在110℃水解24小時。水解后，樣品在進行如下衍理化之前再次干燥。干燥的樣品重新溶解在10μL的體內(nèi)氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(α-氨基丁酸，AABA)中，加入35μL硼酸鹽緩沖液，再加入15μL的AQC衍生試劑。反應(yīng)混合物在一個加熱塊中在50℃加熱12分鐘。將衍生的氨基酸溶液轉(zhuǎn)移到HPLC系統(tǒng)的自動采樣器中，HPLC系統(tǒng)由Wa ter sAlliance 2695分離柱，Waters 474熒光檢測器和Waters 2487雙波入長吸收度檢測器按序組成?？刂坪头治鲕浖荳aters Empower ProModule(Waters Corporation、Milford.MA、USA)。樣品通過WatersAccQTag柱(15cm×3.9mm ID)，使用本領(lǐng)域已知的色譜參數(shù)(例如合適的洗脫液和梯度流)。
(iii)中性和氨基單糖組成分析取2份100μl的TNF-α制備樣品，用2種方法進行處理來釋放單糖。每種處理，如下所示，重復(fù)三次。
1.用4M trifluroacetic acid(TFA)加熱到100℃水解4小時來釋放中性糖(半乳糖、葡萄糖、海藻糖和甘露糖)。
2.用2M HCl加熱到100℃水解4小時來釋放堿性糖(N-乙酰-氨基半乳糖、N-乙酰-氨基葡萄糖半乳糖)。
所有水解產(chǎn)物用Speed Vac系統(tǒng)低壓凍干，重新溶解在含0.8nmol內(nèi)標(biāo)的200μl水中。對于中性和堿性單糖，內(nèi)標(biāo)是2-脫氧葡萄糖。接著樣品在10,000g離心30分鐘以去除蛋白碎片。將上清轉(zhuǎn)移到一個新管中，并用Dionex LC50系統(tǒng)的高pH陰離子交換層析進行分析，其由一個GP50泵和一個ED50脈沖電流檢測器(Dionex Ltd)組成。用DionexCarboPac PA-20柱分析中性和堿性糖。用10mM的羥基濃度洗脫20分鐘。這是用Dionex EG50洗脫液產(chǎn)生系統(tǒng)完成。
(iv)酸性單糖組成分析取100μl的TNF-α制備樣品，并用以下方法處理以釋放唾液酸單糖。重復(fù)三次。
樣品用0.1M TFA在80℃水解40分鐘以釋放N-乙?；蚇-羥乙酰基甘露糖胺丙酮酸。水解產(chǎn)物用Speed Vac低壓凍干，重新溶解在含0.8nmol內(nèi)標(biāo)的200μl水中。對于唾液酸的分析，內(nèi)標(biāo)是乳糖醛酸。接著樣品在10,000g離心30分鐘以去除蛋白碎片。將上清轉(zhuǎn)移到一個新管中，并用Dionex LC50系統(tǒng)的高pH陰離子交換層析進行分析，其由一個GP50泵和一個ED50脈沖電流檢測器組成。唾液酸分析用DionexCarboPac PA1進行，使用本領(lǐng)域已知的色譜參數(shù)(例如合適的洗脫液和梯度流)。
(v)寡糖組成的分析對于分析寡糖組成，取2份300μl的TNF-α制備樣品，按以下的一種方法進行處理，重復(fù)三次 1.用肽-N4-(N-乙?；?β-D-葡萄糖胺基)天冬酰胺脫酰胺酶(PNGase)完成N-連接寡糖的釋放。首先，將五分之一體積的變性溶液(2％SDS(Sigma)/1M β-巰基乙醇(Sigma))加到樣品中。樣品加熱到100℃5分鐘。1/10th體積的15％Triton-X100(Sigma)加入到樣品中。樣品輕輕混合并且使其冷卻至室溫。加入25單位的PNGase(Sigma)并且在37℃培養(yǎng)。
2.通過β-消除的方法完成O-連接寡糖的釋放。1/2體積的4M四氫硼酸鈉(新制的)(Sigma)溶液加入到樣品中。1/2體積的0.4M NaOH(BDH、HPLC grade)加入到樣品中。樣品在50℃下培養(yǎng)16小時。樣品在冰中冷卻并且將1/2體積的0.4M乙酸(Sigma)加入到樣品中。
將N-連接和O-連接樣品都用Carbo Pac graphitised碳SPE柱進一步處理以去除緩沖液成分。柱平衡和洗脫條件如下首先，柱子用1倍柱體積的80％乙腈(Sigma)繼之2倍柱體積的水進行平衡。在重力作用下上樣，柱子用2倍體積的水沖洗。在柱中加入2ml的50％的乙腈以洗脫中性寡糖。在柱中加入2ml的50％的乙腈/0.1％的甲酸以洗脫酸性寡糖。任何殘留的寡糖都在加入2ml的80％乙腈/0.1％甲酸后得到洗脫。
由SPE柱分離的含有中性或氨基N-連接寡糖和中性或氨基O-連接寡糖的級分用Speed Vac干燥。樣品再溶解于200μl水，并且通過高pH陰離子交換層析分析，使用Dionex LC 20系統(tǒng)和GP50泵和ED50脈沖電流探測器一起。中性和氨基寡糖的分析是用CarboPac PA100柱和本領(lǐng)域已知的色譜參數(shù)(例如合適的洗脫液和梯度流)進行的。
(vi)硫酸鹽和磷酸鹽組成的分析硫酸鹽/磷酸鹽分析基本上通過由Harrison和Packer(Harrison and Packer Methods Mol Biol 125211-216、2000)描述的方法進行。
取100μl TNF-α制品的樣品用于硫酸鹽/磷酸鹽分析，并且在4M HCl中在100℃下水解4小時。通過在Speed Vac中干燥樣品除去HCl。然后，樣品再溶解于200μl H2O。24μl樣品注入帶有GP50泵和ED50脈沖電流探測器的Dionex LC 50系統(tǒng)中。通過Dionex IonPacIS11陰離子交換柱進行分離，使用本領(lǐng)域已知的色譜參數(shù)(例如合適的洗脫液和梯度流)。
(vii)TNF-α同工型的進一步分離用薄膜陰離子交換柱進行TNF-α同工型的進一步分離。合適的樣品體積，例如，24μl，通過ProPac SAX-10柱(Dionex Ltd)分離，使用帶有UV-Vis檢測器(Dionex Ltd)的Dionex SUMMIT系統(tǒng)。分離用合適的洗脫液和本領(lǐng)域已知的梯度進行。TNF-α同工型在不同型的峰中發(fā)現(xiàn)被洗脫。
(b)分析本發(fā)明的LT-α的氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型組成 (i)準(zhǔn)備樣品用于氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型分析純化LT-α的PBS溶液按上面實施例4(a)(i)所描述的進行處理。
(ii)用氣相水解方法(Gas Phase Hydrolysis Method)分析氨基酸組成制備的LT-α樣品按上面實施例4(a)(ii)所描述的進行處理。
(iii)分析中性和堿性單糖的組成制備的LT-α樣品按上面實施例4(a)(iii)所描述的進行處理。
(iv)分析酸性單糖的組成制備的LT-α樣品按上面實施例4(a)(iv)所描述的進行處理。
(v)分析寡糖的組成制備的LT-α樣品按上面實施例4(a)(v)所描述的進行處理。
(vi)分析硫酸鹽和磷酸鹽的組成制備的LT-α樣品按上面實施例4(a)(vi)所描述的進行處理。
(vii)進一步分離蛋白同工型制備的LT-α樣品按上面實施例4(a)(vii)所描述的進行處理。發(fā)現(xiàn)LT-α同工型以一種特殊峰的形式洗脫。
(c)分析本發(fā)明的TNFRI-Fc的氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型組成 (i)準(zhǔn)備樣品用于氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型分析純化TNFRI-Fc的PBS溶液按上面實施例4(a)(i)所描述的進行處理。
(ii)用氣相水解方法(Gas Phase Hydrolysis Method)分析氨基酸組成制備的TNFRI-Fc樣品按上面實施例4(a)(ii)所描述的進行處理。
(iii)分析中性和堿性單糖的組成制備的TNFRI-Fc樣品按上面實施例4(a)(iii)所描述的進行處理。
(iv)分析酸性單糖的組成制備的TNFRI-Fc樣品按上面實施例4(a)(iv)所描述的進行處理。
(v)分析寡糖的組成制備的TNFRI-Fc樣品按上面實施例4(a)(v)所描述的進行處理。
(vi)分析硫酸鹽和磷酸鹽的組成制備的TNFRI-Fc樣品按上面實施例4(a)(vi)所描述的進行處理。
(vii)進一步分離蛋白同工型制備的TNFRI-Fc樣品按上面實施例4(a)(vii)所描述的進行處理。發(fā)現(xiàn)TNFRI-Fc同工型以一種特殊峰的形式洗脫。
(viii)結(jié)果氨基酸組成將TNFRI-Fc水解、衍生并用所描述的反相高效液相色譜進行分析，得到以下氨基酸組成(表19)。結(jié)果表示為氨基酸在所給序列中出現(xiàn)次數(shù)的百分?jǐn)?shù) 表19
單糖和硫酸鹽單個單糖和硫酸鹽從TNFRI-Fc的氨基酸主鏈上水解得到，用用所描述的高pH陰離子交換色譜(HP AEC)進行分析，得到以下組分分析。從樣品從得到的結(jié)果分別用GalNAc和3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)(表20-22)。表23是對來自3個樣品的結(jié)果的總結(jié)。
表20
表21
表22
表23
考慮到以上所描述的色譜方法內(nèi)在變異性，用GalNAc作為標(biāo)準(zhǔn)時，確定本發(fā)明的TNFRI-Fc的單糖、唾液酸和硫酸鹽含量約為1∶1-4.5的海藻糖，1∶10-18的GlcNAc，1∶3-9的半乳糖，1∶4-11的甘露糖，1∶0.1-2的NeuNAc和1∶1.5-14的硫酸鹽；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，確定為3∶0.1-1.5的海藻糖，3∶0.1-1的Gal NAc，3∶3-11的GlcNAc，3∶1-2.5的半乳糖，3∶0-2的NeuNAc和3∶0.5-4的硫酸鹽。
氨基酸組成數(shù)據(jù)結(jié)合單糖和硫酸鹽數(shù)據(jù)，給出了不同種類的含量(表24)。考慮到以上所描述的色譜方法內(nèi)在變異性，確定本發(fā)明的TNFRI-Fc的酸性單糖百分?jǐn)?shù)范圍約為0-10％，硫酸鹽表示本發(fā)明的TNFRI-Fc的單糖百分?jǐn)?shù)，確定其范圍約為10-16％，確定本發(fā)明的TNFRI-Fc的N-連接寡糖的酸性百分?jǐn)?shù)范圍約為3-6％而本發(fā)明的TNFRI-Fc的O-連接寡糖的酸性百分?jǐn)?shù)范圍約為43-66％。
表24
(d)分析本發(fā)明的TNFRII-Fc的氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型組成 (i)準(zhǔn)備樣品用于氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型分析純化TNFRII-Fc的PBS溶液按上面實施例4(a)(i)所描述的進行處理。
(ii)用氣相水解方法(Gas Phase Hydrolysis Method)分析氨基酸組成制備的TNFRII-Fc樣品按上面實施例4(a)(ii)所描述的進行處理。
(iii)分析中性和堿性單糖的組成制備的TNFRII-Fc樣品按上面實施例4(a)(iii)所描述的進行處理。
(iv)分析酸性單糖的組成制備的TNFRII-Fc樣品按上面實施例4(a)(iv)所描述的進行處理。
(v)分析寡糖的組成制備的TNFRII-Fc樣品按上面實施例4(a)(v)所描述的進行處理。
(vi)分析硫酸鹽和磷酸鹽的組成制備的TNFRII-Fc樣品按上面實施例4(a)(vi)所描述的進行處理。
(vii)進一步分離蛋白同工型制備的TNFRII-Fc樣品按上面實施例4(a)(vii)所描述的進行處理。發(fā)現(xiàn)TNFRII-Fc同工型以一種特殊峰的形式洗脫。
(viii)結(jié)果氨基酸組成將制備的TNFRII-Fc水解、衍生并用所描述的反相高效液相色譜進行分析，得到以下氨基酸組成(表25)。結(jié)果表示為重量數(shù)值以及每個氨基酸在序列(包括SD)中出現(xiàn)的百分?jǐn)?shù)。
表25

單糖和硫酸鹽單個單糖和硫酸鹽從TNFRII-Fc的氨基酸主鏈上水解得到，用所描述的高pH陰離子交換色譜(HP AEC)進行分析，得到以下組分分析。結(jié)果分別用GalNAc和3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)(表26-28)。表29是對來自3個樣品的結(jié)果的總結(jié)。
表26
表27
表28
表29
考慮到上面所描述的色譜方法內(nèi)在變異性，用Gal NAc作為標(biāo)準(zhǔn)時，確定本發(fā)明的TNFRII-Fc的單糖、唾液酸和硫酸鹽含量約為1∶0.01-2的海藻糖，1∶0.1-3的GlcNAc，1∶0.1-2的半乳糖，1∶0.1-2的甘露糖，1∶0.01-2的NeuNAc和1∶1-4的硫酸鹽；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，確定為3∶0.1-2的海藻糖，3∶3-11的GalNAc，3∶5-21的GlcNAc，3∶3-6的半乳糖，3∶0.1-2的NeuNAc和3∶9-19的硫酸鹽。
氨基酸組成數(shù)據(jù)結(jié)合單糖和磷酸鹽和硫酸鹽數(shù)據(jù)，給出了不同種類的含量(表30)，表示為重量百分?jǐn)?shù)?？紤]到以上所描述的色譜方法內(nèi)在變異性，確定本發(fā)明的TNFRII-Fc的酸性單糖百分?jǐn)?shù)范圍約為1-10％，硫酸鹽表示為本發(fā)明的TNFRII-Fc的單糖百分?jǐn)?shù)，確定其范圍約為27-41％，確定本發(fā)明的TNFRII-Fc的N-連接寡糖的酸性百分?jǐn)?shù)范圍約為16-26％而本發(fā)明的TNFRII-Fc的O-連接寡糖的酸性百分?jǐn)?shù)范圍約為51-78％。
表30
(e)分析本發(fā)明的OX40-Fc的氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型組成 (i)準(zhǔn)備樣品用于氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型分析純化OX40-Fc的PBS溶液按上面實施例4(a)(i)所描述的進行處理。
(ii)用氣相水解方法(Gas Phase Hydrolysis Method)分析氨基酸組成制備的OX40-Fc樣品按上面實施例4(a)(ii)所描述的進行處理。
(iii)分析中性和堿性單糖的組成制備的OX40-Fc樣品按上面實施例4(a)(iii)所描述的進行處理。
(iv)分析酸性單糖的組成制備的OX40-Fc樣品按上面實施例4(a)(iv)所描述的進行處理。
(v)分析寡糖的組成制備的OX40-Fc樣品按上面實施例4(a)(v)所描述的進行處理。
(vi)分析硫酸鹽和磷酸鹽的組成制備的OX40-Fc樣品按上面實施例4(a)(vi)所描述的進行處理。
(vii)進一步分離蛋白同工型制備的OX40-Fc樣品按上面實施例4(a)(vii)所描述的進行處理。發(fā)現(xiàn)OX40-Fc同工型以一種特殊峰的形式洗脫。
(viii)結(jié)果氨基酸組成將制備的OX40-Fc水解、衍生并用所描述的反相高效液相色譜進行分析，得到以下氨基酸組成(表31)。結(jié)果表示為氨基酸在所給序列中出現(xiàn)的數(shù)目，用百分?jǐn)?shù)表示。已知甘氨酸在氨基酸分析中是一個常見污染物，可以改變氨基酸組成。考慮到這點后，結(jié)果與理論值具有可比性。
表31
單糖和硫酸鹽單個單糖、磷酸鹽和硫酸鹽從OX40-Fc的氨基酸主鏈上水解得到，用所描述的高pH陰離子交換色譜(HP AEC)進行分析，得到以下組分分析。從樣品從得到的結(jié)果分別用GalNAc和3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)(表32-34)。表35是對來自3個樣品的結(jié)果的總結(jié)。葡萄糖是一個常見污染物并且通常不是N-連接或O-連接寡糖的成分。
表32
表33
表34
表35
考慮到以上面描述的色譜方法內(nèi)在變異性，用GalNAc作為標(biāo)準(zhǔn)時，確定本發(fā)明的OX40-Fc的單糖、唾液酸和硫酸鹽含量約為1∶0.1-1的海藻糖，1∶2-3的GlcNAc，1∶0.5-2的半乳糖，1∶0.5-1的甘露糖，1∶0-2的NeuNAc和1∶0.30-2的硫酸鹽；用3倍的甘露糖作為標(biāo)準(zhǔn)時，確定為3∶0.5-2的海藻糖，3∶3-5的GalNAc，3∶6-10的GlcNAc，3∶4-5的半乳糖，3∶0-2的NeuNAc和3∶1-5的硫酸鹽。
對于每個OX40-Fc，氨基酸組成數(shù)據(jù)結(jié)合單糖和硫酸鹽數(shù)據(jù)，給出了不同種類的含量(表36)?？紤]到以上所描述的色譜方法內(nèi)在變異性，唾液酸表示為本發(fā)明的OX40-Fc的單糖百分?jǐn)?shù)，確定其范圍約為0-10％，硫酸鹽表示本發(fā)明的OX40-Fc的單糖百分?jǐn)?shù)，確定其范圍約為9-15％，確定本發(fā)明的OX40-Fc的N-連接寡糖的酸性百分?jǐn)?shù)范圍約為5-21％而本發(fā)明的OX40-Fc的O-連接寡糖的酸性百分?jǐn)?shù)范圍約為20-55％。
表36
(f)分析本發(fā)明的BAFF的氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型組成 (i)準(zhǔn)備樣品用于氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型分析純化BAFF的PBS溶液按上面實施例4(a)(i)所描述的進行處理。
(ii)用氣相水解方法(Gas Phase Hydrolysis Method)分析氨基酸組成制備的BAFF樣品按上面實施例4(a)(ii)所描述的進行處理。
(iii)分析中性和堿性單糖的組成制備的BAFF樣品按上面實施例4(a)(iii)所描述的進行處理。
(iv)分析酸性單糖的組成制備的BAFF樣品按上面實施例4(a)(iv)所描述的進行處理。
(v)分析寡糖的組成制備的BAFF樣品按上面實施例4(a)(v)所描述的進行處理。
(vi)分析硫酸鹽和磷酸鹽的組成制備的BAFF樣品按上面實施例4(a)(vi)所描述的進行處理。
(vii)進一步分離蛋白同工型制備的BAFF樣品按上面實施例4(a)(vii)所描述的進行處理。發(fā)現(xiàn)BAFF同工型以一種特殊峰的形式洗脫。
(g)分析本發(fā)明的NGFR-Fc的氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型組成 (i)準(zhǔn)備樣品用于氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型分析純化NGFR-Fc的PBS溶液按上面實施例4(a)(i)所描述的進行處理。
(ii)用氣相水解方法(Gas Phase Hydrolysis Method)分析氨基酸組成制備的NGFR-Fc樣品按上面實施例4(a)(ii)所描述的進行處理。
(iii)分析中性和堿性單糖的組成制備的NGFR-Fc樣品按上面實施例4(a)(iii)所描述的進行處理。
(iv)分析酸性單糖的組成制備的NGFR-Fc樣品按上面實施例4(a)(iv)所描述的進行處理。
(v)分析寡糖的組成制備的NGFR-Fc樣品按上面實施例4(a)(v)所描述的進行處理。
(vi)分析硫酸鹽和磷酸鹽的組成制備的NGFR-Fc樣品按上面實施例4(a)(vi)所描述的進行處理。
(vii)進一步分離蛋白同工型制備的NGFR-Fc樣品按上面實施例4(a)(vii)所描述的進行處理。發(fā)現(xiàn)NGFR-Fc同工型以一種特殊峰的形式洗脫。
(f)分析本發(fā)明的BAFF的氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型組成 (i)準(zhǔn)備樣品用于氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型分析純化BAFF的PBS溶液按上面實施例4(a)(i)所描述的進行處理。
(ii)用氣相水解方法(Gas Phase Hydrolysis Method)分析氨基酸組成制備的BAFF樣品按上面實施例4(a)(ii)所描述的進行處理。
(iii)分析中性和堿性單糖的組成制備的BAFF樣品按上面實施例4(a)(iii)所描述的進行處理。
(iv)分析酸性單糖的組成制備的BAFF樣品按上面實施例4(a)(iv)所描述的進行處理。
(v)分析寡糖的組成制備的BAFF樣品按上面實施例4(a)(v)所描述的進行處理。
(vi)分析硫酸鹽和磷酸鹽的組成制備的BAFF樣品按上面實施例4(a)(vi)所描述的進行處理。
(vii)進一步分離蛋白同工型制備的BAFF樣品按上面實施例4(a)(vii)所描述的進行處理。發(fā)現(xiàn)BAFF同工型以一種特殊峰的形式洗脫。
(h)分析本發(fā)明的Fas配基的氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型組成 (i)準(zhǔn)備樣品用于氨基酸、單糖、寡糖、磷酸鹽、硫酸鹽和同工型分析純化Fas配體的PBS溶液按上面實施例4(a)(i)所描述的進行處理。
(ii)用氣相水解方法(Gas Phase Hydrolysis Method)分析氨基酸組成制備的Fas配基樣品按上面實施例4(a)(ii)所描述的進行處理。
(iii)分析中性和堿性單糖的組成制備的Fas配基樣品按上面實施例4(a)(iii)所描述的進行處理。
(iv)分析酸性單糖的組成制備的Fas配基樣品按上面實施例4(a)(iv)所描述的進行處理。
(v)分析寡糖的組成制備的Fas配基樣品按上面實施例4(a)(v)所描述的進行處理。
(vi)分析硫酸鹽和磷酸鹽的組成制備的Fas配基樣品按上面實施例4(a)(vi)所描述的進行處理。
(vii)進一步分離蛋白同工型制備的Fas配基樣品按上面實施例4(a)(vii)所描述的進行處理。發(fā)現(xiàn)Fas配基同工型以一種特殊峰的形式洗脫。
實施例5 糖質(zhì)量指紋譜 (a)比較本發(fā)明蛋白和非人細(xì)胞表達的相應(yīng)人蛋白之間的糖質(zhì)量指紋本發(fā)明的蛋白用例3所描述的2D凝膠電泳技術(shù)進行分離，并在聚乙烯二氟乙烷(PVDF)膜上吸干。斑點用一個標(biāo)準(zhǔn)量的蛋白質(zhì)染料(膠體考馬斯藍、Sypro Ruby或Deep Purple)染色，并且同工型的相對量用光密度法定量。切離各個斑點并且用一系列去糖基化酶和/或化學(xué)方法處理，視情況而定，以除去存在的寡糖，按照本說明書描述的方法。一旦寡糖被除去，對其進行分離并且在使用石墨化碳柱和有機溶液(MeCN)梯度洗脫系統(tǒng)的液相色譜-電噴霧質(zhì)譜系統(tǒng)(LC-MS)中分析。產(chǎn)生的峰形產(chǎn)生了同工型中存在的寡糖的“指紋譜”。進一步的，質(zhì)譜系統(tǒng)對樣品中存在的各種糖的質(zhì)量產(chǎn)生信號，其通過用GlycoSuite數(shù)據(jù)庫的模式匹配以識別它們的結(jié)構(gòu)。另外，各個質(zhì)量峰可以多倍片段化以給出MSn光譜。這些片段可以得到結(jié)構(gòu)的預(yù)測，使用本領(lǐng)域已知的方法，例如，通過GlycosidIQ程序包的使用。
上面的分離、去糖基化和分析步驟用非人系統(tǒng)例如E.coli、酵母或CHO細(xì)胞表達的相應(yīng)蛋白進行重復(fù)，發(fā)現(xiàn)存在顯著的差異。在結(jié)構(gòu)水平，這樣的一個結(jié)果表明，本發(fā)明蛋白和非人細(xì)胞表達的相應(yīng)蛋白之間存在不同形式的寡糖結(jié)構(gòu)。
(b)比較本發(fā)明的TNFRII-Fc和CHO細(xì)胞表達的TNFRII-Fc之間的糖質(zhì)量指紋本發(fā)明的TNFRII-Fc用例3描述的2D凝膠電泳技術(shù)分離，并在聚乙烯二氟乙烷(PVDF)膜上吸干。斑點用一標(biāo)準(zhǔn)系列的蛋白染料(Colloidal Coomassie Blue，Sypro Ruby或Deep Purple)染色，而同工型的相對含量用光密度計算法進行定量。取出單個斑點，用一系列去糖基化酶和/或化學(xué)方法處理，在適合的條件下，根據(jù)上面實施例4(a)(v)所描述的方法去除存在的低聚糖。
一旦去除低聚糖，它們相互分離，并用液相色譜-電噴射質(zhì)譜系統(tǒng)(LC-MS)進行分離，利用一個graphitised碳柱和有機溶劑(MeCN)梯度洗脫系統(tǒng)。產(chǎn)生的峰特征代表本發(fā)明的TNFRII-Fc存在的N-連接和O-連接寡糖的“指紋”(分別為圖2(a)和2(e))。此外，將單個質(zhì)峰分割成多個片段得到MSn圖譜(圖2(b)和2(f))。片段用GlycosidIQ軟件進行分析，可以預(yù)測結(jié)構(gòu)(表37(a)和37(b))。
表37(a) 用GlycosidIQ推測的本發(fā)明的TNFRII-Fc中存在的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)

表37(b) 用GlycosidIQ推測的本發(fā)明的TNFRII-Fc中存在的O-連接寡糖的結(jié)構(gòu)
上面的分離、去糖基化和分析步驟用中國倉鼠卵巢(或CHO)細(xì)胞表達的TNFRII-Fc進行重復(fù)(圖2(c)，2(d)，2(g)和2(h)表38(a)和38(b))，接著將它與上面所描述的本發(fā)明的TNFRII-Fc的相應(yīng)結(jié)果進行比較。發(fā)現(xiàn)各自的糖質(zhì)量指紋存在顯著的差異。在結(jié)構(gòu)水平，這樣的一個結(jié)果表明，本發(fā)明的TNFRII-Fc和CHO細(xì)胞表達的人TNFRII-Fc之間存在不同形式的寡糖結(jié)構(gòu)。
表38(a) 用GlycosidIQ推測的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Enbrel)表達的TNFRII-Fc中存在的N-連接寡糖的結(jié)構(gòu)

表38(b) 用GlycosidIQ推測的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(Enbrel)表達的TNFRII-Fc中存在的O-連接寡糖的結(jié)構(gòu)
實施例6 熒光輔助糖電泳用熒光輔助糖電泳實驗(FACE protocols)獲得靶分子的寡糖分布型。來自目的細(xì)胞因子的寡糖用氫氧化銨從氨基酸主鏈水解，接著用熒光8-氨基萘基-1，3，6-三磺酸(ANTS)標(biāo)記。聚丙烯酰胺凝膠電泳用于分離種類和用于識別目的分子特有的寡糖分布型的標(biāo)準(zhǔn)。進一步的，用依賴于熒光的飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF)的基質(zhì)輔助激光解吸和電離-時間和對各種糖的離子化特異的基質(zhì)來識別寡糖。測定各種糖的質(zhì)量并且用GlycoSuite數(shù)據(jù)庫識別蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。潛在的糖結(jié)構(gòu)特征進一步通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)描述，其使得得到寡糖存在和它們的相對量的部分的或者全部的特征描述。進一步的，重復(fù)使用通過2D凝膠電泳識別同工型的方法以產(chǎn)生分離的各個同工型中存在的寡糖的分布型。
實施例7 QCM和SPR 用石英晶體微量天平(QCM)或表面等離子共振(SPR)檢測目的分子的結(jié)合特征和活性。兩種方法中，合適的分子受體用廠商描述的化學(xué)作用結(jié)合到晶片上。目的分子溶解于合適的生物緩沖液中并使其通過緩沖液與芯片上的受體相互作用。通過改變振蕩頻率(在QCM方法中)或通過改變芯片的光散射特性(在SPR方法中)來測量晶片表面上的總蛋白質(zhì)質(zhì)量的改變。然后，只用生物緩沖液處理芯片以觀察到目的分子釋放回溶液中。然后，受體達到飽和和完全分離的速率用于計算目的分子的結(jié)合曲線。
實施例8 轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞系的產(chǎn)生 (a)含有α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞系編碼α-2，6-唾液酸轉(zhuǎn)移酶(α2、6ST)的cDNA通過PCR由poly(A)-primed cDNA擴增。PCR產(chǎn)物連接到合適的載體中，例如pIRESpuro4或pCEP4，以產(chǎn)生α2，6ST質(zhì)粒。對克隆的cDNA測序并且通過與已經(jīng)公開的α-2，6ST cDNA序列比較證實其同一性。DNA測序用已知的方法進行。
哺乳動物宿主細(xì)胞，包括表達高水平目的分子的相同譜系的細(xì)胞株系(細(xì)胞系-目的分子)用α2，6ST質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，其還攜帶抗生素抗性標(biāo)記。通過抗生素存在下培養(yǎng)細(xì)胞進行穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的選擇；收集轉(zhuǎn)染后表現(xiàn)出抗生素-抗性的細(xì)胞株系并且用于細(xì)胞內(nèi)α2，6ST活性的檢驗。為了分離表達2，6ST的單個細(xì)胞株系，細(xì)胞收集物通過如Kronman(Gene 121295-304，1992)描述的限制稀釋法克隆。單個的細(xì)胞株系被隨機選擇，細(xì)胞擴增并且檢測株系的α2，6ST活性。
洗滌細(xì)胞沉淀，在溶解緩沖液中重懸，并且在超聲波降解前置于冰中。細(xì)胞溶胞產(chǎn)物離心并且將澄清的上清液用于蛋白質(zhì)濃度(經(jīng)由已知方法)和唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性分析。唾液酸轉(zhuǎn)移酶活性通過已知方法，例如Datta et al.(J Biol Chem 2701497-1500，1995)所描述的方法分析。
從高表達2、6ST細(xì)胞系-目的分子細(xì)胞中純化表達的目的分子并且進行體外和/或體內(nèi)半衰期生物測定(見實施例10)。來自高表達α2、6ST細(xì)胞的目的分子與得自沒有經(jīng)過任何轉(zhuǎn)基因操作的相同親本細(xì)胞系的目的分子或得自其他細(xì)胞系的目的分子相比，表現(xiàn)出增加的體外和/或體內(nèi)半衰期。
(b)含有海藻糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因宿主細(xì)胞系編碼海藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FT)的cDNA，例如FUT1、FUT2、FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT8、FUT9、FUT10、FUT11，通過PCR由poly(A)-primed cDNA擴增。PCR產(chǎn)物連接入合適的載體中，例如pIRESpuro4或pCEP4，以產(chǎn)生α2，6ST質(zhì)粒?？寺〉腸DNA測序并且通過與已經(jīng)公開的FT cDNA序列的比較證實它的同一性。DNA測序用已知方法進行。
人宿主細(xì)胞，包括表達高水平目的分子分子(細(xì)胞系-目的分子)的相同譜系的細(xì)胞株系用FT質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，其還攜帶抗生素抗性標(biāo)記。通過在抗生素存在下細(xì)胞的培養(yǎng)進行穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染細(xì)胞的選擇；收集轉(zhuǎn)染后表現(xiàn)出抗生素-抗性的細(xì)胞的株系并且用于細(xì)胞內(nèi)FT活性的檢驗。為了分離表達FT的單個細(xì)胞株系，細(xì)胞收集物通過限制稀釋法克隆，如Kronman(Gene 121295-304，1992)所描述；單個細(xì)胞株系被隨機選擇，細(xì)胞擴增并且檢測株系的FT活性。
洗滌細(xì)胞沉淀，在溶解緩沖液中重懸，并且在超聲波降解前置于冰中。細(xì)胞溶胞產(chǎn)物離心并且澄清的上清液用于蛋白質(zhì)濃度(經(jīng)已知方法)和FT活性分析。FT活性通過已知方法分析，例如Mas et al.(Glycobiology 8(6)605-13，1998)所描述的。
表達的目的分子由高表達FT細(xì)胞系-目的分子細(xì)胞純化。Lewis x-特異性抗體，例如L5和唾液酸化Lewis x-特異性抗體，例如KM93，HECA493、2H5或CSLEX，用于檢測Lewis x或唾液酸化Lewis x結(jié)構(gòu)的存在，依照本領(lǐng)域已知的方法，例如，如Lucka et al.(Glycobiology 15(1)87，2005)詳細(xì)描述的。或者，Lewis x或唾液酸化Lewis x結(jié)構(gòu)的存在可以通過用合適的糖苷酶處理樣品檢測并且檢測糖苷酶在參數(shù)上的影響，例如用MS時的質(zhì)量或用HPLC時的保留時間。糖質(zhì)量指紋譜，如實施例5中描述的，也可以用于預(yù)測Lewis x或唾液酸化Lewis x結(jié)構(gòu)的存在。
實施例9 差別基因表達基因表達的差別可以用目的分子的目的細(xì)胞系分析。目的細(xì)胞生長到合適的密度并且用一定范圍的濃度的目的分子或緩沖液對照處理多個小時，例如，72小時。
在不同的時間，進行RNA收獲，純化和逆轉(zhuǎn)錄，按照Affymetrix實驗方案。然后，制備標(biāo)記的cRNA(例如生物素標(biāo)記)并且與表達矩陣雜交，例如U133 GeneChips。然后洗滌并且信號放大，GeneChips用GeneChip掃描儀(Affymetrix)掃描，并且雜交強度和在不同時間點的倍數(shù)變化信息用GeneChip software(Affymetrix)獲得。
目的分子誘導(dǎo)獨特的基因表達并且導(dǎo)致與通過不同來源，例如E。coli、酵母或CHO細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子或受體誘導(dǎo)的分布型相比不同的mRNA分布型。
實施例10 本發(fā)明的目的分子的半衰期的測定目的分子的半衰期在體外系統(tǒng)進行測定。包含目的分子的組合物混合到人血清/血漿中并且在一定溫度培養(yǎng)一定時間(例如37度培養(yǎng)4小時、12小時等)。在該處理后保留的目的分子的量通過本領(lǐng)域已知的ELISA法或斑點印跡法測定。保留的目的分子的生物學(xué)活性通過由相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員選擇的合適的生物鑒定法的進行來測定。所選擇的血清可以來自于多種人類血型(例如A，B，AB，O等)。
目的分子的半衰期還在體內(nèi)系統(tǒng)中進行測定。包含目的分子的組合物通過放射性示蹤劑標(biāo)記(或其他方法)并且經(jīng)靜脈、皮下、后眼窩、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)注射到為研究所選擇的物種中，例如，小鼠、大鼠、豬、靈長類或人。在注射后的時間點取血樣并且對目的分子的存在進行分析(通過ELISA法，斑點印跡法或通過三氯乙酸(TCA)-沉淀標(biāo)記，例如放射性計數(shù))。含有產(chǎn)生自不同來源，例如E.coli，酵母，或CHO細(xì)胞的目的分子的組合物的比較可以作為對照進行。
實施例11 (a)本發(fā)明的目的分子的體內(nèi)試驗在此所描述的體內(nèi)試驗的個體受試者是溫血脊椎動物，包括人。
臨床試驗受到嚴(yán)格地控制以確保個體不置于不必要的風(fēng)險中并且他們被充分地告知他們在研究中的作用。
優(yōu)選的，為了補償接受治療的心理作用，治療以雙盲方式進行。志愿者隨機分配入對照或目的分子治療組。進一步地，有關(guān)的臨床醫(yī)生對于給藥給受者的治療制度也是盲的，以防止在他們的治療后觀察中存在偏見。用這種隨機方式，各志愿者具有被給予新的治療或?qū)φ盏南嗤臋C會。
志愿者接受目的分子或?qū)φ談┮欢螘r間，同時，結(jié)合表現(xiàn)出的疾病狀態(tài)或健康狀況的生物學(xué)參數(shù)在開始(任何治療前的基線)，結(jié)束(在最終的治療后)，和在研究期間規(guī)律的間隔中被測量。該測量包括與治療前水平相比的體液，組織或器官中目的分子的水平。其他測量包括，但不限于，疾病狀態(tài)或被治療的健康狀況的指標(biāo)，體重，血壓，疾病的藥理學(xué)指示劑的血清效價，例如特殊疾病指示劑或毒性和ADME(吸收，分布，代謝和排泄)測量。
記錄的各個病人的信息包括年齡(歲)，性別，身高(cm)，疾病狀態(tài)或病的家族史(是/否)，動機等級(少/中/大)和編號以及對于表現(xiàn)出的疾病或病的在先療法的種類。
參加該試驗的志愿者是成年人，年齡在18至65歲并且加入試驗的男性和女性的人數(shù)大致均等。具有某些特征的志愿者對于對照劑和目的分子治療平均分布。一般的，用對照劑治療的志愿者對治療有很少的或沒有反應(yīng)，然而在試驗結(jié)束時，用目的分子治療的志愿者顯示出他們的疾病狀態(tài)或病的指標(biāo)趨向于陽性。
(b)用局部用TNFRI-Fc制劑治療人牛皮癬皮膚在此描述的體內(nèi)試驗的受試者指恒溫脊椎動物，包括人類。
嚴(yán)格控制臨床試驗，確保受試者不用承受不必要的風(fēng)險，并且受試者被完全告知他們在研究中的作用。為了說明接收治療的心理作用，志愿者隨機分成局部安慰劑或局部TNFRI-Fc治療組。此外，為了避免醫(yī)生對治療的偏見，沒有告知他們給予志愿者的治療是局部用TNFRI-Fc還是局部用安慰劑。利用該隨機方法，每個志愿者獲得新的治療或安慰劑的機會相同。
志愿者接受局部用TNFRI-Fc(無沙立度胺，劑型見實施例19(c)的描述)或局部用安慰劑治療一段合適的時間，例如，在牛皮癬損傷的皮膚(總皮膚面積20cm2)上單次0.8ml給藥，隨訪7天，或者在相同的靶損傷皮膚上，多次0.8ml給藥，在21天內(nèi)給予9次(每隔一天)。與所指示的疾病狀態(tài)或狀況例如牛皮癬相關(guān)的生物學(xué)參數(shù)，在研究階段的開始(任何治療之前的基線測定)、結(jié)束(最終治療以后)，以及每個相同時間間隔進行測定。這種測定包括體液、組織或器官中的TNF-α水平，與治療前的水平相比。其它測定包括，但不限于，所治療的疾病狀態(tài)或狀況的指數(shù)體重，血壓，疾病或毒性藥理學(xué)指示劑的血清滴定度以及ADME(吸收、分布、代謝和排泄)的測定。尤其是，本發(fā)明的局部用TNFRI-Fc用于分配在TNFRI-Fc治療組的牛皮癬志愿患者。
記錄的各個病人的信息包括年齡(歲)，性別，身高(cm)，疾病狀態(tài)或病的家族史(是/否)，動機等級(少/中/大)和編號以及對于表現(xiàn)出的疾病或病的在先療法的種類。
.參與本研究的志愿者是18到65歲的成人，大致相同數(shù)目的女性和男性參與本研究。具有確定特征的志愿者平等地分配到局部安慰劑和局部TNFRI-Fc治療。
對治療的評估用4個范圍進行分級，即治愈、明顯有效、有效和無效。“治愈”指斑點上的炎癥區(qū)域徹底減小，并且搔癢癥消失?！懊黠@有效”指斑點上的炎癥區(qū)域縮小60％以上，并且搔癢癥減弱以及得到緩和?！坝行А敝赴唿c上的炎癥區(qū)域縮小20到60％，并且搔癢癥減弱以及得到緩和?！盁o效”指斑點上的炎癥區(qū)域縮小20％以下，或者搔癢癥加劇。
或者，治療評估根據(jù)局部斑點嚴(yán)重指數(shù)(LPSI)進行分級，每個靶斑點都進行了評估并對erthema、硬結(jié)和dessquamation評分，由臨床監(jiān)督醫(yī)師在每次特定的臨床診查時用五分等級進行評分。適于“多次給藥”治療方案的臨床診查時間表例如第0、11和21天。五分等級定義為0＝無癥狀；1＝輕度；2＝重度；3＝顯著；4＝非常顯著。將erthema、硬結(jié)和desquamation的分?jǐn)?shù)相加。LPSI的范圍為0到12，分?jǐn)?shù)最高代表最嚴(yán)重的疾病狀態(tài)。
一般而言，給予局部用安慰劑治療的志愿者對治療反應(yīng)很少或無反應(yīng)，而給予本發(fā)明的局部用TNFRI-Fc乳膏治療的志愿者在研究結(jié)束時，他們的疾病狀況或狀態(tài)指數(shù)呈現(xiàn)陽性趨勢。尤其是，本發(fā)明的局部用制劑對TNFRI-Fc治療組的大多數(shù)患者明顯有效。沒有觀察到明顯的副作用。
(c)用TNFRI-Fc治療人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在此描述的體內(nèi)試驗的受試者指恒溫脊椎動物，包括人類。
嚴(yán)格控制臨床試驗，確保受試者不用承受不必要的風(fēng)險，并且受試者被完全告知他們在研究中的作用。在臨床診查期間，調(diào)查者將抽取多個血樣；進行廣泛的體格檢查，包括評估腫脹、觸痛和疼痛的關(guān)節(jié)。為了說明接收治療的心理作用，志愿者隨機分成安慰劑或TNFRI-Fc治療組。此外，為了避免醫(yī)生對治療的偏見，沒有告知他們給予志愿者的治療是TNFRI-Fc還是安慰劑。利用該隨機方法，每個志愿者獲得新的治療或安慰劑的機會相同。
志愿者接受TNFRI-Fc或安慰劑治療一段合適的時間，與所指示的疾病狀態(tài)或狀況例如關(guān)節(jié)腫脹的程度相關(guān)的生物學(xué)參數(shù)，在研究階段的開始(任何治療之前的基線測定)、結(jié)束(最終治療以后)，以及每個相同時間間隔進行測定。測定結(jié)果包括炎癥參數(shù)水平例如體液、組織或器官中的TNF-α，與治療前的水平相比。其它測定結(jié)果包括，但不限于，所治療的疾病狀態(tài)或狀況的指數(shù)體重，血壓，疾病或毒性藥理學(xué)指示劑的血清滴定度以及ADME(吸收、分布、代謝和排泄)的測定。尤其是，將本發(fā)明的TNFRI-Fc用于分配在TNFRI-Fc治療組的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎志愿患者，每周皮下注射TNFRI-Fc兩次，持續(xù)八周。
每位患者記錄的信息包括年齡(歲)，性別，身高(cm)，疾病狀態(tài)或狀況的家族史(有/無)，誘因等級(部分/適度/主要)以及所指示的疾病或狀況過去治療方案的數(shù)目和類型。
參與本研究的志愿者是18到65歲的成人，相同數(shù)目的女性和男性參與本研究。具有確定特征的志愿者平等地分配到安慰劑和TNFRI-Fc治療。
對治療的評估用4個范圍進行分級，即治愈、明顯有效、有效和無效?！爸斡苯雍咸幓蜿P(guān)節(jié)無腫脹或相關(guān)的疼痛/觸痛癥狀?！懊黠@有效”指接合處或關(guān)節(jié)的腫脹大量縮小(60％以上)并伴隨關(guān)節(jié)疼痛和觸痛的顯著降低?！坝行А敝附雍咸幓蜿P(guān)節(jié)的腫脹縮小20-60％并伴隨相關(guān)的關(guān)節(jié)疼痛和觸痛的輕度降低?！盁o效”指接合處或關(guān)節(jié)的腫脹縮小20％以下并且沒有感覺到相關(guān)的關(guān)節(jié)疼痛有所改善。
一般而言，給予安慰劑治療的志愿者對治療反應(yīng)很少或無反應(yīng)，而給予本發(fā)明的TNFRI-Fc治療的志愿者在研究結(jié)束時，他們的疾病狀況或狀態(tài)指數(shù)呈現(xiàn)陽性趨勢。尤其是，本發(fā)明的制劑對TNFRI-Fc治療組的大多數(shù)患者明顯有效或有效。沒有觀察到明顯的副作用。
(d)用局部用TNFRII-Fc制劑治療人牛皮癬皮膚在此描述的體內(nèi)試驗的受試者指恒溫脊椎動物，包括人類。
該臨床試驗按上面實施例11(b)所描述的進行，除了非安慰劑治療組給予不添加沙立度胺的TNFRII-Fc局部用制劑組成，該劑型見實施例19(b)的描述。
一般而言，給予安慰劑治療的志愿者對治療反應(yīng)很少或無反應(yīng)，而給予本發(fā)明的TNFRII-Fc乳膏治療的志愿者在研究結(jié)束時，他們的疾病狀況或狀態(tài)指數(shù)(見實施例11(b)的描述)呈現(xiàn)陽性趨勢。尤其是，本發(fā)明的局部用制劑對TNFRII-Fc治療組的大多數(shù)患者明顯有效。沒有觀察到明顯的副作用。
(e)用TNFRII-Fc治療人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎在此描述的體內(nèi)試驗的受試者指恒溫脊椎動物，包括人類。
該臨床試驗按上面例11(c)所描述的進行，除了非安慰劑治療組給予本發(fā)明的TNFRII-Fc。
一般而言，給予安慰劑治療的志愿者對治療反應(yīng)很少或無反應(yīng)，而給予本發(fā)明的TNFRII-Fc乳膏治療的志愿者在研究結(jié)束時，他們的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(見實施例11(c)的描述)呈現(xiàn)陽性趨勢。尤其是，本發(fā)明的制劑對TNFRII-Fc治療組的大多數(shù)患者明顯有效或有效。沒有觀察到明顯的副作用。
(f)用局部用TNFRII-Fc制劑治療人毛發(fā)紅糠疹本發(fā)明的TNFRII-Fc局部用制劑包含TNFRII-Fc(250μg/ml)和沙立度胺(20mg/ml)，用于毛發(fā)紅糠疹志愿者。炎癥區(qū)域每兩天給藥一次，持續(xù)2周，每次2ml的局部用制劑。首次治療前志愿者的手見圖3(a)，同一值手在2周的治療方案結(jié)束后見圖3(b)。局部用制劑明顯降低裂紋。沒有觀察到明顯的副作用。
實施例12 (a)本發(fā)明的TNF-α的生物活性 TNF-α在小鼠纖維肉瘤細(xì)胞系WEHI 164中引起細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡。WEHI 164細(xì)胞用抑制轉(zhuǎn)錄的放線菌素D(2μg/ml)預(yù)處理。這增加WEHI 164對TNF-α的敏感性。在96孔板中，0-10ng/ml的TNF-α與每孔50,000個WEHI 164細(xì)胞在37℃孵育18小時。
接著用CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell ProlifertionAssay(Promega)測定TNF-α的細(xì)胞毒性。在該分析方法中，一個四唑鹽復(fù)合物MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽)在存在一個電子耦合劑(吩嗪硫酸甲酯)時被細(xì)胞生物還原成甲

產(chǎn)物。用分光光度計(BioRad全自動定量繪圖酶標(biāo)儀)在490nm測定溶液的吸收度，從而測定甲

的濃度。
從吸收度與濃度的曲線擬合得到一個四參數(shù)方程式，計算本發(fā)明的ED50，結(jié)果為0.012-0.018ng/ml(圖4)。
(b)本發(fā)明的LT-α的生物活性 LT-α在小鼠纖維肉瘤細(xì)胞系WEHI 164中引起細(xì)胞毒性和細(xì)胞死亡。WEHI 164細(xì)胞用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D(2μg/ml)預(yù)處理，接著接種于96孔板，0-400ng/ml的LT-α與每孔50,000個WEHI 164細(xì)胞共孵育，在37℃孵育18小時。
接著用CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay(Promega)測定細(xì)胞毒性。在該分析方法中，一個四唑鹽復(fù)合物MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽)在存在一個電子耦合劑(吩嗪硫酸甲酯)時被細(xì)胞生物還原成甲

產(chǎn)物。用分光光度計(E最大精密全自動定量繪圖酶標(biāo)儀，Molecular Devices)在490nm測定溶液的吸收度，從而測定甲

的濃度。
(c)本發(fā)明的TNFRI-Fc的生物活性利用TNFRI-Fc中和TNF-α在WEHI 164細(xì)胞系中介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的能力，測定其活性。連續(xù)稀釋TNFRI-Fc，從0.006到100ng/ml，與5ng/ml的TNF-α在37℃孵育1小時，使TNFRI-Fc與TNF-α結(jié)合。接著每孔加入5×104個WEHI-164細(xì)胞，細(xì)胞用2μg/ml的放線菌素D預(yù)處理，通過抑制轉(zhuǎn)錄增加細(xì)胞對TNF-α的敏感性。平板孵育20小時(37℃，5％CO2)，接著加入10％的細(xì)胞

AQueous One溶液試劑(Promega)，其中含有四唑鹽復(fù)合物MTS[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽內(nèi)鹽]和一個電子耦合劑(phenazine ethaosulfate；PES)。在490nm測定吸收度，反應(yīng)孔中的細(xì)胞數(shù)目。從吸收度與濃度的曲線擬合得到一個四參數(shù)方程式，計算ED50，結(jié)果為14-20ng/ml(圖6)。
(d)本發(fā)明的TNFRII-Fc的生物活性利用TNFRII-Fc中和TNF-α在WEHI-164細(xì)胞系中介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的能力，測定其活性。連續(xù)稀釋TNFRII-Fc，從0.006到100ng/ml，與5ng/ml的TNF-α在37℃孵育1小時，使TNFRII-Fc與TNF-α結(jié)合。接著每孔加入5×104個WEHI-164細(xì)胞，細(xì)胞用2μg/ml的放線菌素D預(yù)處理，通過抑制轉(zhuǎn)錄增加細(xì)胞對TNF-α的敏感性。將平板孵育20小時(37℃，5％CO2)，接著加入10％的細(xì)胞

AQueous One溶液試劑(Promega)，其中含有四唑鹽復(fù)合物MTS[3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽內(nèi)鹽]和一個電子耦合劑(phenazine ethaosulfate；PES)。在490nm測定吸收度，反應(yīng)孔中的細(xì)胞數(shù)目。從吸收度與濃度的曲線擬合得到一個四參數(shù)方程式，計算本發(fā)明的ED50，結(jié)果為14-20ng/ml(圖7)。
(e)比較本發(fā)明的TNFRII-Fc和非人系統(tǒng)表達的TNFRII-Fc的生物活性 E.coli表達的TNFRII-Fc(Pepro Tech，Cat#310-12)和本發(fā)明的TNFRII-Fc(1500μg/ml)的生物活性根據(jù)其對TNF-α在鼠L-929細(xì)胞中介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抑制效應(yīng)進行測定。將各自的結(jié)果進行比較。
將低壓凍干的TNFRII-Fc(Pepro Tech)重新溶解配成原來的濃度，-80℃保存。L-929細(xì)胞重懸在培養(yǎng)基中。將重懸液轉(zhuǎn)移到一塊分析平板中(8,000個細(xì)胞/孔；傳代#7)，每孔加入100ml。平板在37℃孵育過夜。
在單獨一塊板中，將TNFRII-Fc(Pepro Tech)連續(xù)稀釋在分析介質(zhì)中。每種稀釋液成對加入分析平板，每孔加入40μl的每種稀釋液。含4ng/ml TNF-α(Pepro Tech)的分析介質(zhì)每孔加入60μl。每孔的總體積為100μl。
將TNF-α-TNFRII-Fc復(fù)合物轉(zhuǎn)移到含L-929細(xì)胞的分析平板種。每孔加入100μl復(fù)合物。因此，每孔的最終體積為200μl，含1ng/ml的TNF-α。
將分析平板和其中的物質(zhì)孵育17小時。每孔加入20μl的Promega滴定96粘附細(xì)胞的水溶液。混合物在37℃孵育，6小時后在490nm測定吸收度。
用本發(fā)明的TNFRII-Fc重復(fù)上述實驗。
另一個對照(未給出)是，用本發(fā)明的TNFRII-Fc在TNF-α不存在的情況下對分析進行重復(fù)。L-929細(xì)胞重懸在培養(yǎng)基中。將重懸液轉(zhuǎn)移到一塊分析平板中(8,000個細(xì)胞/孔；傳代#7)，每孔加入100μl。平板在37℃孵育過夜。在單獨一塊板中，將本發(fā)明的TNFRII-Fc連續(xù)稀釋在分析介質(zhì)中，每孔加入100μl的每種稀釋液。將稀釋液加到原先位置的L-929細(xì)胞中。因此，每孔的最終體積為200μl。平板孵育17小時。每孔加入20μl的Promega滴定96粘附細(xì)胞的水溶液?；旌衔镌?7℃孵育，6小時后在490nm測定吸收度。
TNFRII(Pepro Tech)和本發(fā)明的TNFRII-Fc的50％(Conc.ED50)有效劑量濃度的測定將他們的A(490nm)對各自的log濃度作圖，并用GnuPlot將數(shù)值擬合成下列形式的函數(shù)，GnuPlot是一種圖形程序，將圖形擬合成數(shù)學(xué)函數(shù)和數(shù)據(jù)(http://www.gnuplot.info) f(x)＝cauchy(x) 而cauchy(x)＝a0+a1(a tan((x-a2)/a3)/π π＝3.1416 ED50對應(yīng)于cauchy函數(shù)的鞍點，與擬合參數(shù)“a2”以及asymptotic最小值和cauchy函數(shù)最大值之間的中值對應(yīng)的y值(A(490nm))一致(圖8)。得到TNFRII-Fc的ED50為3.2-4.8ng/ml。得到TNFRII(PeproTech)的ED50為39-59ng/ml。
發(fā)現(xiàn)TNFRII-Fc的活性比TNFRII(Pepro Tech)高8-18倍，ED50較低，因此生物活性更高。
(d)比較本發(fā)明OX-40-Fc和非人系統(tǒng)表達的OX40-Fc的活性據(jù)報道，OX40可以在小鼠T細(xì)胞系CTLL2中抑制OX40L誘導(dǎo)的IL-2的分泌。IL-2是CTLL2細(xì)胞的一個增殖和存活因子。因此，加入OX40可以抑制OX40L的增殖效應(yīng)。
在96孔板中，將2ng/ml的OX40L與0-100ng/ml本發(fā)明的OX40-Fc在37℃孵育1小時，使其發(fā)生結(jié)合。加入10000個CTLL2細(xì)胞/孔，37℃，72小時。接著用CellTiter 96 Aqueous One Solution CellProliferation Assay(Promega)測定細(xì)胞數(shù)目。在該分析方法中，一個四唑鹽復(fù)合物MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽)在存在一個電子耦合劑(吩嗪硫酸甲酯)時被細(xì)胞生物還原成甲

產(chǎn)物。用分光光度計(E最大精密全自動定量繪圖酶標(biāo)儀，Molecular Devices)在490nm測定溶液的吸收度，從而測定甲

的濃度。
用非人系統(tǒng)例如E.coli、酵母或CHO細(xì)胞表達的OX40-Fc重復(fù)上述分析。在曲線擬合吸收度后計算各自的ED50，并用一個四參數(shù)方程得到OX40-Fc的濃度。發(fā)現(xiàn)ED50存在顯著的差異。
(e)比較本發(fā)明的BAFF和非人系統(tǒng)表達的BAFF的活性據(jù)報道，BAFF可以誘導(dǎo)RPMI 2886細(xì)胞的增殖。在一個96孔板中，10000個RPMI 2886細(xì)胞/孔給予0-250ng/ml的本發(fā)明的BAFF，37℃，114小時。
接著用CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay(Promega)測定細(xì)胞數(shù)目。在該分析方法中，一個四唑鹽復(fù)合物MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽)在存在一個電子耦合劑(吩嗪硫酸甲酯)時被細(xì)胞生物還原成甲

產(chǎn)物。用分光光度計(E最大精密全自動定量繪圖酶標(biāo)儀，Molecular Devices)在490nm測定溶液的吸收度，從而測定甲

的濃度。
用E.coli表達的重組人BAFF分子(Peprotech)重復(fù)上述分析。
獲得本發(fā)明的BAFF的ED50為50-75ng/ml，而Peprotech(由E.coli表達)的BAFF的ED50為80-120ng/ml(圖9)。因此，本發(fā)明的BAFF誘導(dǎo)RPMI 8226細(xì)胞的增殖比E.coli表達的BAFF分子高1.1-2.4倍。
(e)本發(fā)明的NGFR-Fc的生物活性據(jù)報道，NFG-β可以誘導(dǎo)TF-1細(xì)胞的增殖。NGFR-Fc結(jié)合NGF-β并競爭性抑制這些分子結(jié)合于他們在細(xì)胞內(nèi)的NGF-β受體位點，使NGF-β不表現(xiàn)生物學(xué)活性，從而抑制了NGF-β的活性。因此，NGF-β與NGFR-Fc共孵育將抑制NGF-β誘導(dǎo)的TF-1細(xì)胞增殖。
在96孔板中，將1ng/ml的NGF-β與0-100ng/ml的本發(fā)明的NGFR-Fc在37℃孵育2小時，使其發(fā)生結(jié)合。加入18,000個TF-1細(xì)胞/孔，37℃，孵育65小時。接著用CellTiter 96Aqueous One SolutionCell Proliferation Assay(Promega)測定細(xì)胞數(shù)目。在該分析方法中，一個四唑鹽復(fù)合物MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽)在存在一個電子耦合劑(吩嗪硫酸甲酯)時被細(xì)胞生物還原成甲

產(chǎn)物。用分光光度計(E最大精密全自動定量繪圖酶標(biāo)儀，Molecular Devices)在490nm測定溶液的吸收度，從而測定甲

的濃度。在曲線擬合吸收度后計算ED50，并用一個四參數(shù)方程得到NGFR-Fc的濃度。從吸收度與濃度的曲線擬合得到一個四參數(shù)方程式，計算本發(fā)明的ED50，結(jié)果為670-1000ng/ml(圖10)。
(f)比較本發(fā)明的Fas配基和非人系統(tǒng)表達的Fas配基的生物活性據(jù)報道，存在10μg/ml的某交聯(lián)抗體時，F(xiàn)as配基可以在人T細(xì)胞白血病Jurkat細(xì)胞系中誘導(dǎo)凋亡。在96孔板中，10000個Jurkat細(xì)胞/孔給予0-1μg/ml的本發(fā)明的Fas配基，37℃，孵育65小時。
接著用CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay(Promega)測定細(xì)胞數(shù)目。在該分析方法中，一個四唑鹽復(fù)合物MTS(3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鹽)在存在一個電子耦合劑(吩嗪硫酸甲酯)時被細(xì)胞生物還原成甲

產(chǎn)物。用分光光度計(E最大精密全自動定量繪圖酶標(biāo)儀，Molecular Devices)在490nm測定溶液的吸收度，從而測定甲

的濃度。
在曲線擬合吸收度后計算ED50，并用一個四參數(shù)方程得到Fas配基的濃度。
用非人系統(tǒng)例如E.coli、酵母或CHO細(xì)胞表達的Fas配基重復(fù)上述分析，發(fā)現(xiàn)ED50存在顯著的差異。
實施例13 (a)本發(fā)明的TNF-α和非人系統(tǒng)表達的人TNF-α的體外免疫反應(yīng)特征比較本發(fā)明的TNF-α蛋白用R&D系統(tǒng)人TNF-α

ELISA試劑盒(Cat#DY210)根據(jù)廠商說明進行測定。
本發(fā)明的TNF-α用ELISA測定結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)廠商說明用R&D系統(tǒng)人TNF-α

ELISA試劑盒進行稀釋和測定。上面提及的ELISA試劑盒用E.coli中表達的人TNF-α作為標(biāo)準(zhǔn)。R&D系統(tǒng)E.coli表達的人TNF-α(Cat#210-TA)和WHO E.coli表達的人TNF-α(Cat#87/650)也進行測定。
從R&D系統(tǒng)

TNF-αELISA試劑盒結(jié)果得到OD450nm處本發(fā)明的TNF-α、R&D系統(tǒng)E.coli表達的人TNF-α和WHOE.coli表達的人TNF-α的濃度曲線，同時也得到E.coli表達的體內(nèi)DuoSet TNF-α的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖11)。
這些結(jié)果表明由R&D系統(tǒng)人TNF-α

ELISA試劑盒所測定的本發(fā)明的TNF-α的濃度偏低，該商業(yè)試劑盒采用E.coli表達的人TNF-α標(biāo)準(zhǔn)和E.coli表達的人TNF-α抗體，這是用于評估實驗室樣品和人患者樣品中天然的人體表達的TNF-α。
這些結(jié)果表明本發(fā)明的TNF-α和非人細(xì)胞表達的人TNF-α分子具有不同的免疫反應(yīng)特征。
(a)本發(fā)明的LT-α和非人系統(tǒng)表達的人LT-α的體外免疫反應(yīng)特征比較本發(fā)明的LT-α蛋白利用合適的吸光系數(shù)(ε)和基于SDS-PAGE分析測得的分子量根據(jù)A280吸收度方法進行測定。
本發(fā)明的LT-α用上面所描述的蛋白評估結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)廠商說明用R&D系統(tǒng)人TNF-β

ELISA試劑盒(Cat#DY211)進行稀釋和測定。上面提及的ELISA試劑盒用E.coli表達的人LT-α(TNF-β)進行校準(zhǔn)的一個蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。
從R&D系統(tǒng)

TNF-βELISA試劑盒結(jié)果得到本發(fā)明的LT-α的濃度為360pg/ml左右，這是利用0.22的OD450nm(圖12)根據(jù)E.coli表達的人重組LT-α的標(biāo)準(zhǔn)曲線評估得到。而本發(fā)明的LT-α在相同OD450nm值的實際濃度為1000pg/ml左右(圖12)。
這些結(jié)果表明由R&D系統(tǒng)人TNF-β

ELISA試劑盒所測定的本發(fā)明的LT-α的濃度偏低2倍以上，該商業(yè)試劑盒采用E.coli表達的人LT-α標(biāo)準(zhǔn)和E.coli表達的人LT-α抗體，這是用于評估實驗室樣品和人患者樣品中天然的人體表達的LT-α。
這些結(jié)果表明本發(fā)明的LT-α和非人細(xì)胞表達的人LT-α分子具有不同的免疫反應(yīng)特征。
(c)本發(fā)明的TNFRI-Fc和非人系統(tǒng)表達的可溶性人TNFRI分子的體外免疫反應(yīng)特征比較本發(fā)明的TNFRI-Fc蛋白用一種合適的蛋白濃度評估方法進行測定，例如用人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)Lowry法評估蛋白。
本發(fā)明的TNFRI-Fc用上面提及的蛋白評估結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)廠商說明用R&D系統(tǒng)可溶性人TNF RI

ELISA試劑盒(Cat#DY225)進行稀釋和測定。上面提及的ELISA試劑盒用E.coli細(xì)胞表達的可溶性人TNFRI進行校準(zhǔn)的一個蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。
根據(jù)商業(yè)ELISA試劑盒測定的本發(fā)明的TNFRI-Fc(作為單體)的蛋白濃度將不同于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析方法測定的濃度，商業(yè)ELISA試劑盒和/或免疫檢測方法所使用的捕獲和/或檢測抗體，是針對非人細(xì)胞表達的可溶性人TNFRI蛋白。需要注意的是，本發(fā)明的TNFRI-Fc是作為同型二聚體表達。
該結(jié)果表明本發(fā)明的TNFRI-Fc和非人細(xì)胞表達的可溶性人TNFRI分子具有不同的免疫反應(yīng)特征。
(d)本發(fā)明的TNFRII-Fc和非人系統(tǒng)表達的可溶性人TNFRII分子的體外免疫反應(yīng)特征比較本發(fā)明的TNFRII-Fc蛋白用一種合適的蛋白濃度評估方法進行測定，例如用人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)Lowry法評估蛋白。
本發(fā)明的TNFRII-Fc用上面提及的蛋白評估結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)廠商說明用R&D系統(tǒng)可溶性人TNF RII

ELISA試劑盒(Cat#DY726)進行稀釋和測定。上面提及的ELISA試劑盒用E.coli細(xì)胞表達的可溶性人TNF RII進行校準(zhǔn)的一個蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。
根據(jù)商業(yè)ELISA試劑盒測定的本發(fā)明的TNFRII-Fc(作為單體)的蛋白濃度將不同于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析方法測定的濃度，商業(yè)ELISA試劑盒和/或免疫檢測方法所使用的捕獲和/或檢測抗體，是針對非人細(xì)胞表達的可溶性人TNFRII蛋白。需要注意的是，本發(fā)明的TNFRII-Fc是作為同型二聚體表達。
該結(jié)果表明本發(fā)明的TNFRII-Fc和非人細(xì)胞表達的可溶性人TNFRII分子具有不同的免疫反應(yīng)特征。
(e)本發(fā)明的OX40-Fc和非人系統(tǒng)表達的可溶性人OX40分子的體外免疫反應(yīng)特征比較本發(fā)明OX40-Fc蛋白用一種合適的蛋白濃度評估方法進行測定，例如，用人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)Lowry法評估蛋白。
本發(fā)明OX40-Fc用上面提及的蛋白評估方法標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)廠商說明用IBL-Hamburg可溶性人OX40ELISA試劑盒(Cat#BE59401)進行稀釋和測定。上面提及的ELISA試劑盒用非人細(xì)胞細(xì)胞表達的可溶性人OX40進行校準(zhǔn)的一個蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)。
根據(jù)商業(yè)ELISA試劑盒測定的本發(fā)明OX40-Fc(作為單體)的蛋白濃度將不同于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析方法測定的濃度，而商業(yè)ELISA試劑盒和/或免疫檢測方法所使用的捕獲和/或檢測抗體，是針對非人細(xì)胞表達的可溶性人OX40蛋白。需要注意的是，本發(fā)明OX40-Fc是作為同型二聚體表達。
該結(jié)果表明本發(fā)明OX40-Fc和非人細(xì)胞表達的可溶性人OX40分子具有不同的免疫反應(yīng)特征。
(f)本發(fā)明的BAFF和非人系統(tǒng)表達的人BAFF的體外免疫反應(yīng)特征比較本發(fā)明的BAFF蛋白用一種標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析技術(shù)例如，Bradford蛋白分析(Bradford Anal Biochem 72248-254，1976)，或者利用合適的吸光系數(shù)(ε)和基于SDS-PAGE分析測得的分子量根據(jù)A280吸收度方法進行測定。
本發(fā)明的BAFF用標(biāo)注蛋白分析結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)廠商說明用商業(yè)ELISA試劑盒進行稀釋和測定，例如R&D系統(tǒng)人BAFF

ELISA試劑盒(Cat#DBLYS0)。上面提及的ELISA試劑盒用E.coli細(xì)胞表達的可溶性人BAFF進行標(biāo)準(zhǔn)。
根據(jù)商業(yè)ELISA試劑盒測定的本發(fā)明的BAFF的蛋白濃度將不同于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析方法測定的濃度，商業(yè)ELISA試劑盒所使用的捕獲和/或檢測抗體，是針對非人細(xì)胞表達的可人BAFF蛋白。
在一個結(jié)構(gòu)水平，這樣的一個結(jié)果將表明BAFF和非人細(xì)胞表達的人BAFF分子具有不同的免疫反應(yīng)特征。
(g)本發(fā)明的NGFR-Fc和非人系統(tǒng)表達的NGFR-Fc分子的體外免疫反應(yīng)特征比較本發(fā)明的NGFR-Fc蛋白用一種合適的蛋白分析方法進行測定，例如用人IgG作為標(biāo)準(zhǔn)Lowry法評估蛋白。
本發(fā)明的NGFR-Fc，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化后，用商業(yè)來源可獲得的試劑進行定量免疫測定。例如，抗NGFR-Fc-Fc的ELISA發(fā)展為利用人NGFR-Fc Mab(R&D系統(tǒng)Cat#MAB367)作為捕獲抗體，生物素化人NGFR-Fc Pab(R&D系統(tǒng)Cat#BAF367)作為檢測抗體，以及Sf21昆蟲細(xì)胞表達的重組人NGFR-Fc-Fc(R&D系統(tǒng)Cat#367-NR-050/CF)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。本發(fā)明的NGFR-Fc，用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，用以上提及的試劑采用已知的ELISA方法進行分析。
利用有來源的試劑根據(jù)定量免疫測定法測得的本發(fā)明的NGFR-Fc的蛋白濃度將不同于用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析方法測得的濃度，免疫測定法中所使用的捕獲和/檢測抗體是針對非人細(xì)胞表達的人NGFR-Fc嵌合蛋白。
在一個結(jié)構(gòu)水平，這樣的一個結(jié)果將表明本發(fā)明的NGFR-Fc和非人細(xì)胞表達的人NGFR-Fc嵌合分子具有不同的免疫反應(yīng)特征。
(h)本發(fā)明的Fas配基和非人系統(tǒng)表達的人Fas配基的體外免疫反應(yīng)特征比較本發(fā)明的Fas配基蛋白用一種標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析技術(shù)例如，Bradford蛋白分析(Bradford 1976 supra)，或者利用合適的吸光系數(shù)(ε)和基于SDS-PAGE分析測得的分子量根據(jù)A280吸收度方法進行測定。
本發(fā)明的Fas配基用標(biāo)注蛋白分析結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化，根據(jù)廠商說明用商業(yè)ELISA試劑盒進行稀釋和測定，例如R&D系統(tǒng)人Fas配基

ELISA試劑盒(Cat#DY126)。上面提及的ELISA試劑盒用CHO細(xì)胞表達的人Fas配基作為標(biāo)準(zhǔn)。
根據(jù)商業(yè)ELISA試劑盒測定的本發(fā)明的Fas配基的蛋白濃度將不同于根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白分析方法測定的濃度，商業(yè)ELISA試劑盒所使用的捕獲和/或檢測抗體，是針對非人細(xì)胞表達的人Fas配基蛋白。
在一個結(jié)構(gòu)水平，這樣的一個結(jié)果表明將本發(fā)明的Fas配基和非人細(xì)胞表達的人Fas配基分子具有不同的免疫反應(yīng)特征。
實施例14 本發(fā)明的目的分子的進一步純化和用ESI-MS/MS的肽質(zhì)量指紋譜除實施例2所述的純化方法外，本發(fā)明的目的分子的純化進一步通過RP-HPLC進行，用商業(yè)可獲得的柱。洗脫蛋白質(zhì)通過215或280nm吸光度監(jiān)測并且被收集，同時為了由于流動細(xì)胞和收集端之間的導(dǎo)管體積帶來的延遲進行校正。
來自1D或2D凝膠的含有蛋白質(zhì)樣品的凝膠塊在胰島素溶液中消化，如實施例3所述。或者，含有蛋白樣品的溶液用胰島素在碳酸氫銨緩沖液(10-25mM、pH 7.5-9)中消化。溶液在37℃下過夜培養(yǎng)。然后通過加入乙酸直到pH在4-5范圍內(nèi)以中止反應(yīng)。肽樣品被濃縮并且用C18 Zip-Tips(Millipore、Bedford、MA)或如實施例3所述，含有Poros R2層析樹脂(Perspetive Biosystems、Framingham、MA)的預(yù)制微柱除鹽。
蛋白樣品(2-5μl)注入C18預(yù)柱中并且用0.1％甲酸在30μl/min下沖洗以濃縮和除鹽。沖洗3分鐘后，預(yù)柱轉(zhuǎn)換為成列的含有C18 RP二氧化硅(Atlantis、75μm×100mm、Waters Corporation)的分析柱。肽用線性溶劑梯度由柱中洗脫，逐步地，從H2O∶CH3CN(95∶5；+0.1％甲酸)到H2O∶CH3CN(20∶80、+0.1％甲酸)以200nl/min進行40分鐘以上。LC洗脫在Micromass QTOF Ultima質(zhì)譜儀(Micromass、Manchester、UK)中經(jīng)陽離子nanoflow電噴霧分析。
串聯(lián)MS用Q-Tof混合四級/正交加速TOF質(zhì)譜儀(Micromass)進行。QTOF根據(jù)采集模式(DDA)的數(shù)據(jù)進行操作。獲得TOFMS檢測掃描(m/z 400-2000、1.0s)，同時三種最多的多電荷離子(計數(shù)＞15)在檢測掃描中連續(xù)地經(jīng)MS/MS分析。MS/MS譜收集8s(m/z 50-2000)。
LC/MS/MS數(shù)據(jù)用Mascot(Matrix Science、London、UK)和ProteinLynx Global Server(“PLGS”)(Micromass)搜索。蛋白樣品預(yù)期為目的分子。
實施例15 (a)非人動物中的免疫原性 (i)用目的蛋白質(zhì)的動物免疫非人動物分別的組，例如，小鼠用1-100ug本發(fā)明的蛋白質(zhì)和在非人細(xì)胞中表達的蛋白質(zhì)經(jīng)皮下，腹膜內(nèi)或肌內(nèi)(IP)免疫。動物在免疫后一個月接受二次免疫。免疫前，蛋白質(zhì)在佐劑中乳化，例如，用于初次免疫的完全Freud’s佐劑和用于二次免疫的不完全Freud’s佐劑。
(ii)對目的蛋白質(zhì)的抗體的鑒定為了測定抗體反應(yīng)，來自各組的動物從尾部取血并收集血清。蛋白特異性抗體通過固相ELISA用50ng/孔的本發(fā)明的蛋白質(zhì)測定。不同的免疫免疫球蛋白同種型通過用標(biāo)記的表現(xiàn)出抗IgG1、IgG2、IgG2b、IgG3、IgM、IgA、IgD的檢測抗體測定?；蛘?，抗性反應(yīng)靠吸附到用于斑點印跡法或western blot的膜上的本發(fā)明的蛋白質(zhì)測量。不同免疫球蛋白的同種型的測定按照上面所述檢測。預(yù)期本發(fā)明的蛋白質(zhì)引起不同于在非人細(xì)胞中表達的蛋白的抗體反應(yīng)。
(iii)T細(xì)胞增殖分析將免疫的動物安樂死并制備脾細(xì)胞。合適的數(shù)量的脾細(xì)胞，例如，5×105細(xì)胞，來自用本發(fā)明的蛋白質(zhì)免疫的動物，和不同濃度的本發(fā)明的蛋白質(zhì)一起培養(yǎng)一段時間，并且相同數(shù)量的來自用非人細(xì)胞中表達的蛋白質(zhì)免疫的動物的脾細(xì)胞和不同濃度的非人細(xì)胞中表達的蛋白一起培養(yǎng)。為了T細(xì)胞增殖分析，脾細(xì)胞培養(yǎng)96小時并在最后16小時用1μCi[3H]胸腺嘧啶(6-7μCi/umol)處理。收獲細(xì)胞到過濾器上并且摻入用標(biāo)準(zhǔn)方法測定的[3H]胸腺嘧啶。與在非人細(xì)胞中表達的蛋白質(zhì)相比，預(yù)期本發(fā)明的蛋白質(zhì)引起不同的增殖反應(yīng)。
(iv)IFN gamma分析為了IFN gamma分析，和本發(fā)明的蛋白質(zhì)或非人細(xì)胞表達的蛋白質(zhì)一起培養(yǎng)的脾細(xì)胞培養(yǎng)上清在96小時時收獲并且IFN gamma產(chǎn)物通過sandwich ELISA檢測，例如，R&D系統(tǒng)抗-IFN gamma

ELISA試劑盒(Cat#DIF50)，按照廠商技術(shù)說明書。預(yù)期來自用本發(fā)明的蛋白一起培養(yǎng)的細(xì)胞的培養(yǎng)上清的IFN gamma產(chǎn)物與來自用非人細(xì)胞中表達的蛋白質(zhì)一起培養(yǎng)的細(xì)胞的IFN gamma產(chǎn)物相比是不同的。
(b)體外人免疫原性分析 (i)人T細(xì)胞反應(yīng)分析人樹突狀細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞制備自人全血，如Stickler et al.Toxicological Sciences 77280-289、2004所述。樹突狀細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞置于96孔板中共培養(yǎng)，包含2×104樹突狀細(xì)胞和2×105 CD4+T細(xì)胞。本發(fā)明的蛋白質(zhì)和在非人細(xì)胞中表達的蛋白質(zhì)經(jīng)酶消化為肽片段，用通過切割位點預(yù)測軟件鑒定的合適的酶，例如，PeptideCutter(http://au.expasy.org/tools/peptidecutter)。得到的肽片段通過合適的技術(shù)純化，例如，液相色譜，并且加入共培養(yǎng)物中至終濃度5ug/ml。培養(yǎng)物培養(yǎng)5天，然后將0.5uCi 3H胸腺嘧啶加入各培養(yǎng)物中。將細(xì)胞收獲到過濾器中并且通過[3H]胸腺嘧啶摻入測定細(xì)胞增殖。
預(yù)期得自本發(fā)明的蛋白質(zhì)肽可以引起較弱的增殖反應(yīng)，相對于來自非人細(xì)胞中表達的蛋白質(zhì)的肽。
(ii)人抗體反應(yīng)分析對經(jīng)用非人細(xì)胞表達的蛋白質(zhì)治療的人供體取血并且制備血漿。通過抗50ng/well的本發(fā)明的蛋白質(zhì)和非人細(xì)胞中表達的蛋白質(zhì)的固相ELISA測定蛋白特異性抗體。不同的免疫球蛋白同種型通過用表現(xiàn)出抗人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA、IgD的標(biāo)記的檢測抗體測定。
或者，通過斑點印跡法或Western blot時吸附在的膜上本發(fā)明的蛋白質(zhì)和在非人細(xì)胞中表達的蛋白質(zhì)測定抗體反應(yīng)。不同免疫球蛋白同種型的測定按照上面所描述的檢測。
預(yù)期存在于用非人細(xì)胞表達的蛋白治療的人的血清中的免疫球蛋白可以結(jié)合在非人細(xì)胞中表達的蛋白質(zhì)，而與本發(fā)明的蛋白質(zhì)結(jié)合弱或不結(jié)合。
實施例16 來自重組基因組構(gòu)建體的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的制備 PCR擴增編碼本發(fā)明中TNF-α，LT-α或Fas配體基因組序列(SEQID NOs分別為191，192，193)，克隆進合適的表達載體，如pI RESbleo3，pCMV-SPORT6，pUMCV3，pORF，pORF9，pcDNA 3.1/GS，pCEP4，pIRESpuro3，pIRESpuro4，pcDNA3.1/Hygro(+)，pcDNA3.1/Hygro(-)，pEF6/V5-His。這些重組結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備用于實施例1(c)中所表述的人細(xì)胞轉(zhuǎn)化。本發(fā)明中重組DNA結(jié)構(gòu)GM-CSF，IL-3，IL-4和IL-5的生成和純化如實施例2所述進行。
實施例17 體內(nèi)比較本發(fā)明中OX40-Fc和CHO細(xì)胞表達的OX40-Fc對結(jié)腸炎的抑制在三硝基苯磺酸(TNBS)誘發(fā)結(jié)腸炎的鼠類模型中(Taylor Journalof Leukocyte Biology 72522-525，2002)評價本發(fā)明中OX40-Fc的效用和CHO細(xì)胞表達OX40-Fc抑制體內(nèi)免疫反應(yīng)的作用。在50％的乙醇溶液中稀釋TNBS終濃度為75μl總體積中含2mg TNBS。小鼠被輕微麻痹，用塑料導(dǎo)液管直腸內(nèi)注射75μl TNBS溶液誘發(fā)結(jié)腸炎。對照小鼠注射50％乙醇水溶液。在第4-6天，向TNBS誘發(fā)結(jié)腸炎小鼠和乙醇處理對照都注射合適量的，如100μg，或本發(fā)明中OX40-Fc或CHO細(xì)胞表達的OX40-Fc。第7天處死小鼠，由于CD4+T細(xì)胞滲入固有層結(jié)腸組織被染色。本發(fā)明中的OX40-Fc處理的小鼠滲入固有層的CD4+T細(xì)胞數(shù)量有顯著的降低。
TNF-αmRNA在上述小鼠結(jié)腸組織中的轉(zhuǎn)錄水平用實時反轉(zhuǎn)錄酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測定?？俁NA用RNeasy Mini Kit(Qiagen，Australia)根據(jù)制造商說明提取，RNA濃度用分光光度法測量。提取后，樣品儲存在-80℃直至使用。實時RT-PCR用TaqMan One-Step RT-PCR Master MixReagents Kit(PE Applied Biosystems)進行。在加入1×Master Mix，1×Multi Scribe and Rnase Inhibitor Mix，300nM TNF-α前引物，300nMTNF-α反引物，100nM TNF-α探針，1×18srRNA Primer and Probe Mix和100ng總RNA的25μl的反應(yīng)體系中進行合成。在ABI Prism 7700序列檢測儀(PE Applied Biosystems)中進行RT-PCR反應(yīng)。熱循環(huán)條件包括48℃逆轉(zhuǎn)錄30分鐘，95℃變性10分鐘，95℃15秒和60℃1分鐘40循環(huán)。此反應(yīng)的數(shù)據(jù)用合適的電腦軟件收集并分析。較CHO細(xì)胞表達OX40-Fc而言，本發(fā)明中OX40-Fc對TNF-αmRNA表達由更大程度上的降低作用。
實施例18 (a)制備表達α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶的DNA結(jié)構(gòu) 從EST cDNA文庫(克隆3090115，Invitrogen)中PCR擴增α2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶(a2，6ST)的DNA序列，用前引物(SEQ ID NO194)和反引物(SEQ ID NO195)分別組成Not 1和BamH1的限制酶切位點。擴增后，用Not 1和BamH1酶消化序列，克隆進表達載體pIRESbleo3相對應(yīng)的限制位點以制備載體pIRESbleo3-α2，6ST。用Not 1和BamHl酶消化pIRESbleo3-α2，6ST得到片斷為預(yù)計的1315bp。
或者，從EST cDNA文庫(克隆3090115，Invitrogen)中PCR擴增a2，6ST的DNA序列，用前引物(SEQ ID NO196)和反引物(SEQ ID NO197)分別組成BamH1和Not 1的限制酶切位點。擴增后，用BamH1和Not 1酶消化序列，克隆進表達載體pIRESpuro 3相對應(yīng)的限制位點以制備載體pIRESpuro3-a2，6ST。用Not 1和BamH1酶消化pIRESpuro3-a2，6 ST得到片斷為預(yù)計的1310bp。
(b)大量制備2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶表達載體在750ml含有氨芐青霉素(120μg/ml)的無菌LB培養(yǎng)基中接種750 μl培養(yǎng)過夜的pIRESbleo3-a2，6ST或pIRESpuro3-a2，6ST。在37℃振搖培養(yǎng)物16小時。用Qiagen Endofree Plasmid Mega Kit(Qiagen目錄號12381)制備質(zhì)粒。
(c)高度唾液酸化的TNFRI-Fc的生成和純化按1∶3的比例混合含有a2，6ST基因的質(zhì)粒pIRESbleo3-a2，6ST或pIRESpuro3-a2，6ST和含有TNFRI-Fc基因的質(zhì)粒pIRESbleo3-TNFRI-Fc。將混合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞，得到的上清純化方法與例2(c)一致，除了所得到的含有TNFRI-Fc的片斷不需要進一步濃縮。
研究發(fā)現(xiàn)純化的高度唾液酸化的TNFRI-Fc的近似分子量范圍為45-85kDa，銀染法鑒定純度至少為99％。
(d)高度唾液酸化的TNFRI-Fc特性根據(jù)實施例3(c)對高度唾液酸化的TNFRI-Fc進行聚丙烯酰胺雙向電泳。表39顯示了TNFRI-Fc同工型的表觀分子量，pI值和相對強度。數(shù)據(jù)根據(jù)在包含點的所選凝膠區(qū)域內(nèi)的強度加權(quán)中心列出，所以最能反映蛋白質(zhì)的pI和分子量。
表39 高度唾液酸化的TNFRI-Fc同工型的分子量和DI值實施例19 (a)含有本發(fā)明中蛋白質(zhì)的局部霜劑配方按例2中所敘述的方法，在一個注射器中用套管收集本發(fā)明目標(biāo)蛋白質(zhì)的片斷。將合適量的蛋白質(zhì)溶液滲入Falcon管，轉(zhuǎn)移進低蛋白結(jié)合管，與合適量的局部霜劑混合，如Cetaphil保濕霜劑(Galderma)，終目的蛋白濃度為10-1000μg/ml。在falcon管中慢慢攪拌使霜劑分布。分幾次將混合物從Falcon管中轉(zhuǎn)移至注射器以混合組分。霜劑被轉(zhuǎn)移至60ml注射器，從注射器中取出合適量的霜劑用于分析。剩余的均質(zhì)混合物隨后被轉(zhuǎn)入注射器。為了避免霜劑直接與橡皮封頭接觸，在轉(zhuǎn)入霜劑之前留下一定空間。
(b)含有本發(fā)明的TNFRII-Fc的局部霜劑配方按例2(d)或2(h)中所敘述的方法，在一個20ml注射器中用套管收集本發(fā)明的TNFRII-Fc的片斷。將14.0mL的1mg/mL蛋白質(zhì)溶液0.22μm滲入50mLFalcon管；0.5mL轉(zhuǎn)移進低蛋白結(jié)合管作為分析樣品。將43mL Cetaphil保濕霜劑(Galderma)用套管轉(zhuǎn)移進60mL注射器中，終TNFRII-Fc濃度為250μg/ml。將霜劑慢慢攪拌分布入falcon管中。分幾次將混合物從Falcon管中轉(zhuǎn)移至注射器以混合組分。將0.5mL此混合物轉(zhuǎn)移至1mL注射器中用于分析(樣品1)。每8mL均質(zhì)混合物隨后被轉(zhuǎn)入10mL注射器。為了避免霜劑直接與橡皮封頭接觸，在轉(zhuǎn)入霜劑之前留下一定空間。一半的霜劑被轉(zhuǎn)入60mL注射器。在Falcon管中加入1.0g沙立度胺，與剩余霜劑混合。重復(fù)將霜劑從管轉(zhuǎn)移至注射器的過程直至完全混合霜劑的所有組分。將0.5mL此混合物轉(zhuǎn)移至1mL注射器中用于分析(樣品2)。如上所述，每8mL均質(zhì)混合物隨后被轉(zhuǎn)入10mL注射器。
(c)含有本發(fā)明TNFRI-Fc的局部霜劑配方按例2(c)中所敘述的方法，收集本發(fā)明TNFRI-Fc的片斷，按在實施例19(b)中闡述的方法過濾和混合Cetaphil保濕霜劑至終TNFRI-Fc濃度為250μg/ml。按在實施例19(b)中闡述的，分離含有本研究250μg/ml TNFRI-Fc的均質(zhì)混合物，或不加沙立度胺或配置20mg/mL沙立度胺，每8mL轉(zhuǎn)入10mL注射器。
實施例20 (a)局部施用含有TNFRII-Fc的藥物組合物后TNFRII-Fc的生物分布本發(fā)明中的TNFRII-Fc是用氯胺T方法進行125I-標(biāo)記的。簡要地說，在20μl 0.5M pH7.4的磷酸鹽緩沖液中加入20μl 3.5mg/ml的TNFRII-Fc溶液。再依次加入2μl Na125-I(0.2mCi)，10μl氯胺T(10mg/ml)混合。30秒后加入10μl焦亞硫酸鈉(10mg/ml)終止反應(yīng)。用加入0.1M pH7.4磷酸鹽緩沖液的Sephadex G10柱層析去除反應(yīng)體系中游離的125I。洗出材料在用于生物分布研究之前儲存在4℃。125I-標(biāo)記的TNFRII-Fc以0.2mg/ml濃度溶解以1∶10比例與以下霜劑混合，名為Alpha Keri保濕洗劑(Mentholatum)，DermaVeen保濕洗劑(DermaTech實驗室)，QV潤膚液(Lision Hong)，Cetaphil保濕洗劑(Galderma實驗室，L.P.)。在麻醉Balb/C小鼠2×1cm剃毛的皮膚區(qū)域放置局部藥物成分。局部配方放置在小鼠上180分鐘后小鼠處以安樂死，移除所有器官用射線計數(shù)管計數(shù)。圖13顯示了穿過表皮給予本發(fā)明的局部配方的125I-標(biāo)記的TNFRII-Fc后，125I-標(biāo)記的TNFRII-Fc在小鼠中的分布，其中A是在Alpha Keri保濕洗劑(Mentholatum)中125I-標(biāo)記的TNFRII-Fc的局部配方；B是在DermaVeen保濕洗劑(DermaTech實驗室)中125I-標(biāo)記的TNFRII-Fc的局部配方；C是在QV潤膚液中125I-標(biāo)記的TNFRII-Fc的局部配方；D是在Cetaphil保濕洗劑(Galderma實驗室，L.P.)中125I-標(biāo)記的TNFRII-Fc的局部配方。
如圖13中所看到的，125I-TNFRII-Fc快速出現(xiàn)在皮膚，肌肉和皮膚的除毛區(qū)域。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解在此描述的發(fā)明可以被變異或修飾為與那些特別描述的不同。應(yīng)當(dāng)理解為本發(fā)明包括了所有的這樣的變異或修飾。本發(fā)明還分別或全部地包括了說明書中涉及的或指出的所有的步驟，特征，組合物和化合物和任意兩種或多種所述的步驟或特征的隨意組合。
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Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
100 105 110
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
115 120 125
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
130 135 140
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
145 150 155 160
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
165 170 175
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
180 185 190
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
195 200 205
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
210 215 220
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210>3
<211>714
<212>DNA
<213>人
<400>3
aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 60
ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac120
accctcatga tetcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa180
gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca240
aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg300
caccaggact ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaggg tctccaacaa agccctccca360
gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac420
accctgcccc catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc480
aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac540
aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag600
ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat660
gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaa 714
<210>4
<211>238
<212>PRT
<213>人
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Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
1 5 10 15
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
20 25 30
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
35 40 45
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
50 55 60
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
65 70 75 80
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
85 90 95
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
100 105 110
Arg Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
115 120 125
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
130 135 140
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
145 150 155 160
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
165 170 175
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
180 185 190
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
195 200 205
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
210 215 220
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
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<212>DNA
<213>人
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aaggtggaca agacagttga gcgcaaatgt tgtgtcgagt gcccaccgtg cccagcacca 60
cctgtggcag gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc120
tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccccgaggtc180
cagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccacgggag240
gagcagttca acagcacgtt ccgtgtggtc agcgtcctca ccgttgtgca ccaggactgg300
ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag gcctcccagc ccccatcgag360
aaaaccatct ccaaaaccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca420
tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac480
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc540
acacctccca tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac600
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac660
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 702
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<212>PRT
<213>人
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Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
35 40 45
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
50 55 60
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
65 70 75 80
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
85 90 95
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
100 105 110
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
115 120 125
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
130 135 140
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
165 170 175
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
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Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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aaggtggaca agagagttga gctcaaaacc ccacttggtg acacacctcc cccatgccca 60
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gagaaaacca tctccaaagc caaaggacag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc480
ccatcccggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc540
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gacaagagca ggtggcagca ggggaacatc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg720
cacaaccgct acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaa765
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Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Pro
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Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro
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Pro Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
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Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
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Val Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
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Thr Lys Leu Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser
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Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
130 135 140
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
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Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
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Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser
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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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Trp Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
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His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc420
ccatcccagg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc480
taccccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag540
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cacaaccact acacacagaa gagcctctcc ctgtctctgg gtaaa705
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<213>人
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Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser
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Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
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Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
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Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
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Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
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aagtccgtga catgccacgt gaagcactac acgaatccca gccaggatgt gactgtgccc 60
tgcccagttc cctcaactcc acctacccca tctccctcaa ctccacctac cccatctccc120
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<212>PRT
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Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
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Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro
20 25 30
Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser
35 40 45
Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn
50 55 60
Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe
65 70 75 80
Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Asp
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Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Ser Gly Cys
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Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr
115 120 125
Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn
130 135 140
Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu
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Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro
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Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly
195 200 205
Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp
210 215 220
Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu
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Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro
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Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys
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Tyr
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Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
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Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro
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Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser
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Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly
50 55 60
Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly
65 70 75 80
Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu
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Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr
100 105 110
Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys
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Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg
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Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln
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Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala
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Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His
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Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala
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Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp
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Gly Thr Cys Tyr
260
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ccccgcgacg gcttcttcgg caacccccgc aagtccaagc tcatctgcca ggccacgggt 600
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<212>PRT
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Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Lys Gln Leu Ser
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Leu Lys Leu Ser Ser Val Asn Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Val Ile Thr Arg Ala Ser Pro Gly Thr Asp Gly Arg Tyr Gly
35 40 45
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser
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65 70 75 80
Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp Phe Leu
85 90 95
Pro Asp Ser Ile Thr Phe Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile
100 105 110
Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala
115 120 125
Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln Gly Thr
130 135 140
Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn Lys Glu
145 150 155 160
Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys Val Ser
165 170 175
Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser
180 185 190
Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile Gln Val
195 200 205
Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr Thr Asp
210 215 220
Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Val
225 230 235 240
Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Ser Gln Ser Met
245 250 255
Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln Asn Ala
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Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly
485 490 495
Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala Gly
500 505 510
Thr Cys Tyr
515
<210>17
<211>1026
<212>DNA
<213>人
<400>17
gtggcacaca ctccatcgtc cacagactgg gtcgacaaca aaaccttcag cgtctgctcc 60
agggacttca ccccgcccac cgtgaagatc ttacagtcgt cctgcgacgg cggcgggcac120
ttccccccga ccatccagct cctgtgcctc gtctctgggt acaccccagg gactatcaac180
atcacctggc tggaggacgg gcaggtcatg gacgtggact tgtccaccgc ctctaccacg240
caggagggtg agctggcctc cacacaaagc gagctcaccc tcagccagaa gcactggctg300
tcagaccgca cctacacctg ccaggtcacc tatcaaggtc acacctttga ggacagcacc360
aagaagtgtg cagattccaa cccgagaggg gtgagcgcct acctaagccg gcccagcccg420
ttcgacctgt tcatccgcaa gtcgcccacg atcacctgtc tggtggtgga cctggcaccc480
agcaagggga ccgtgaacct gacctggtcc cgggccagtg ggaagcctgt gaaccactcc540
accagaaagg aggagaagca gcgcaatggc acgttaaccg tcacgtccac cctgccggtg600
ggcacccgag actggatcga gggggagacc taccagtgca gggtgaccca cccccacctg660
cccagggccc tcatgcggtc cacgaccaag accagcggcc cgcgtgctgc cccggaagtc720
tatgcgtttg cgacgccgga gtggccgggg agccgggaca agcgcaccct cgcctgcctg780
atccagaact tcatgcctga ggacatctcg gtgcagtggc tgcacaacga ggtgcagctc840
ccggacgccc ggcacagcac gacgcagccc cgcaagacca agggctccgg cttcttcgtc900
ttcagccgcc tggaggtgac cagggccgaa tgggagcaga aagatgagtt catctgccgt 960
gcagtccatg aggcagcgag cccctcacag accgtccagc gagcggtgtc tgtaaatccc 1020
ggtaaa 1026
<210>18
<21l>342
<212>PRT
<213>人
<400>18
Val Ala His Thr Pro Ser Ser Thr Asp Trp Val Asp Asn Lys Thr Phe
1 5 10 15
Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro Thr Val Lys Ile Leu Gln
20 25 30
Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe Pro Pro Thr Ile Gln Leu Leu
35 40 45
Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr Ile Asn Ile Thr Trp Leu
50 55 60
Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu Ser Thr Ala Ser Thr Thr
65 70 75 80
Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser Glu Leu Thr Leu Ser Gln
85 90 95
Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr Cys Gln Val Thr Tyr Gln
100 105 110
Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys Cys Ala Asp Ser Asn Pro
115 120 125
Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro Ser Pro Phe Asp Leu Phe
130 135 140
Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu Val Val Asp Leu Ala Pro
145 150 155 160
Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Lys Pro
165 170 175
Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys Gln Arg Asn Gly Thr Leu
180 185 190
Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr Arg Asp Trp Ile Glu Gly
195 200 205
Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro His Leu Pro Arg Ala Leu
210 215 220
Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro Arg Ala Ala Pro Glu Val
225 230 235 240
Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly Ser Arg Asp Lys Arg Thr
245 250 255
Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro Glu Asp Ile Ser Val Gln
260 265 270
Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp Ala Arg His Ser Thr Thr
275 280 285
Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe Phe Val Phe Ser Arg Leu
290 295 300
Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys Asp Glu Phe Ile Cys Arg
305 310 315 320
Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln Thr Val Gln Arg Ala Val
325 330 335
Ser Val Asn Pro Gly Lys
340
<210>19
<211>1044
<212>DNA
<213>人
<400>19
aaatgcgtgg tccagcacac cgccagcaag agtaagaagg agatcttccg ctggccagag 60
tctccaaagg cacaggcctc ctccgtgccc actgcacaac cccaagcaga gggcagcctc120
gccaaggcaa ccacagcccc agccaccacc cgtaacacag gaagaggagg agaagagaag180
aagaaggaga aggagaaaga ggaacaagaa gagagagaga caaagacacc agagtgtccg240
agccacaccc agcctcttgg cgtctacctg ctaacccctg cagtgcagga cctgtggctc300
cgggacaaag ccaccttcac ctgcttcgtg gtgggcagtg acctgaagga tgctcacctg360
acctgggagg tggctgggaa ggtccccaca gggggcgtgg aggaagggct gctggagcgg420
cacagcaacg gctcccagag ccagcacagc cgtctgaccc tgcccaggtc cttgtggaac480
gcggggacct ccgtcacctg cacactgaac catcccagcc tcccacccca gaggttgatg540
gcgctgagag aacccgctgc gcaggcaccc gtcaagcttt ctctgaacct gctggcctcg600
tctgaccctc ccgaggcggc ctcgtggctc ctgtgtgagg tgtctggctt ctcgcccccc660
aacatcctcc tgatgtggct ggaggaccag cgtgaggtga acacttctgg gtttgccccc720
gcacgccccc ctccacagcc caggagcacc acgttctggg cctggagtgt gctgcgtgtc780
ccagccccgc ccagccctca gccagccacc tacacgtgtg tggtcagcca cgaggactcc840
cggactctgc tcaacgccag ccggagccta gaagtcagct acctggccat gacccccctg900
atccctcaga gcaaggatga gaacagcgat gactacacga cctttgatga tgtgggcagc960
ctgtggacca ccctgtccac gtttgtggcc ctcttcatcc tcaccctcct ctacagcggc 1020
attgtcactt tcatcaaggt gaag 1044
<210>20
<211>348
<212>PRT
<213>人
<400>20
Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu Ile Phe
1 5 10 15
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
20 25 30
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
35 40 45
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
50 55 60
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
65 70 75 80
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
85 90 95
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
100 105 110
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
115 120 125
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
130 135 140
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
145 150 155 160
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
165 170 175
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
180 185 190
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
195 200 205
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
210 215 220
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
225 230 235 240
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Arg Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
245 250 255
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
260 265 270
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
275 280285
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Leu Ala Met Thr Pro Leu Ile Pro Gln Ser
290 295 300
Lys Asp Glu Asn Ser Asp Asp Tyr Thr Thr Phe Asp Asp Val Gly Ser
305 310 315 320
Leu Trp Thr Thr Leu Ser Thr Phe Val Ala Leu Phe Ile Leu Thr Leu
325 330 335
Leu Tyr Ser Gly Ile Val Thr Phe Ile Lys Val Lys
340 345
<210>21
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
cccaggatcc ccaaggtgga caagaaagtt gagcc35
<210>22
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>22
gggtacgtgc ccagcacact ggtgcgaccg 30
<210>23
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>23
aaaggatcca gcaacaccaa ggtg24
<210>24
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<400>24
aaattaattc cagcacactg gtcatttacc cggagacagg g 41
<210>25
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>25
ctgacaagat atcaggcagg ttc 23
<210>26
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>26
tggtctccag aattccagat gt 22
<210>27
<211>231
<212>DNA
<213>人
<400>27
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccecaagaag 60
acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg180
gaagagtccc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt c 231
<210>28
<211>77
<212>PRT
<213>人
<400>28
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Ser Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val
65 70 75
<210>29
<211>231
<212>DNA
<213>人
<400>29
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60
acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg180
gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt c 231
<210>30
<211>77
<212>PRT
<213>人
<400>30
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val
65 70 75
<210>31
<211>468
<212>DNA
<213>人
<400>31
agatcatctt ctcgaacccc gagtgacaag cctgtagccc atgttgtagc aaaccctcaa 60
gctgaggggc agctccagtg gctgaaccgc cgggccaatg ccctcctggc caatggcgtg120
gagctgagag ataaccagct ggtggtgcca tcagagggcc tgtacctcat ctactcccag180
gtcctcttca agggccaagg ctgcccctcc acccatgtgc tcctcaccca caccatcagc240
cgcatcgccg tctcctacca gaccaaggtc aacctcctct ctgccatcaa gagcccctgc300
cagagggaga ccccagaggg ggctgaggcc aagccctggt atgagcccat ctatctggga360
ggggtcttcc agctggagaa gggtgaccga ctcagcgctg agatcaatcg gcccgactat420
ctcgactttg ccgagtctgg gcaggtctac tttgggatca ttgccctg 468
<210>32
<211>156
<212>PRT
<213>人
<400>32
Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
1 5 10 15
Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala
20 25 30
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val
35 40 45
Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys
50 55 60
Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser
65 70 75 80
Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile
85 90 95
Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro
100 105 110
Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly
115 120 125
Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala
130 135 140
Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
145 150 155
<210>33
<211>699
<212>PRT
<213>人工序列
<400>33
Ala Thr Gly Ala Gly Cys Ala Cys Thr Gly Ala Ala Ala Gly Cys Ala
1 5 10 15
Thr Gly Ala Thr Cys Cys Gly Gly Gly Ala Cys Gly Thr Gly Gly Ala
20 25 30
Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Cys Gly
35 40 45
Cys Thr Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala Ala Gly Ala Cys Ala Gly
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Gly Cys Cys Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Cys
65 70 75 80
Cys Ala Gly Gly Cys Gly Gly Thr Gly Cys Thr Thr Gly Thr Thr Cys
85 90 95
Cys Thr Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys Cys Thr
100 105 110
Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys Gly Thr Gly Gly Cys Ala Gly Gly
115 120 125
Cys Gly Cys Cys Ala Cys Cys Ala Cys Gly Cys Thr Cys Thr Thr Cys
130 135 140
Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Thr Thr Thr Gly
145 150 155 160
Gly Ala Gly Thr Gly Ala Thr Cys Gly Gly Cys Cys Cys Cys Cys Ala
165 170 175
Gly Ala Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Gly Thr Cys Cys Cys Cys Cys
180 185 190
Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys Thr Cys Thr Cys Thr Cys Thr Ala Ala
195 200 205
Thr Cys Ala Gly Cys Cys Cys Thr Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Ala
210 215 220
Gly Gly Cys Ala Gly Thr Cys Ala Gly Ala Thr Cys Ala Thr Cys Thr
225 230 235 240
Thr Cys Thr Cys Gly Ala Ala Cys Cys Cys Cys Gly Ala Gly Thr Gly
245 250 255
Ala Cys Ala Ala Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Gly Cys Cys Cys Ala
260 265 270
Thr Gly Thr Thr Gly Thr Ala Gly Cys Ala Ala Ala Cys Cys Cys Thr
275 280 285
Cys Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Ala Gly Cys
290 295 300
Thr Cys Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Cys Gly
305 310 315 320
Cys Cys Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Thr Gly Cys Cys Cys Thr Cys
325 330 335
Cys Thr Gly Gly Cys Cys Ala Ala Thr Gly Gly Cys Gly Thr Gly Gly
340 345 350
Ala Gly Cys Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ala Thr Ala Ala Cys Cys Ala
355 360 365
Gly Cys Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala
370 375 380
Gly Ala Gly Gly Gly Cys Cys Thr Gly Thr Ala Cys Cys Thr Cys Ala
385 390 395 400
Thr Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Gly Thr Cys Cys Thr
405 410 415
Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys
420 425 430
Thr Gly Cys Cys Cys Cys Thr Cys Cys Ala Cys Cys Cys Ala Thr Gly
435 440 445
Thr Gly Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala Cys Cys Cys Ala Cys Ala Cys
450 455 460
Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys Cys Gly Cys Ala Thr Cys Gly Cys Cys
465 470 475 480
Gly Thr Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys Cys Ala Gly Ala Cys Cys Ala
485 490 495
Ala Gly Gly Thr Cys Ala Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Thr Cys
500 505 510
Thr Gly Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Gly Ala Gly Cys Cys Cys Cys
515 520 525
Thr Gly Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ala Gly Ala Cys Cys Cys
530 535 540
Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Ala Gly Gly Cys
545 550 555 560
Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Ala Thr Gly Ala Gly
565 570 575
Cys Cys Cys Ala Thr Cys Thr Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly
580 585 590
Gly Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr Gly Gly Ala
595 600 605
Gly Ala Ala Gly Gly Gly Thr Gly Ala Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys
610 615 620
Ala Gly Cys Gly Cys Thr Gly Ala Gly Ala Thr Cys Ala Ala Thr Cys
625 630 635 640
Gly Gly Cys Cys Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr Cys Thr Cys Gly Ala
645 650 655
Cys Thr Thr Thr Gly Cys Cys Gly Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly
660 665 670
Cys Ala Gly Gly Thr Cys Thr Ala Cys Thr Thr Thr Gly Gly Gly Ala
675 680 685
Thr Cys Ala Thr Thr Gly Cys Cys Cys Thr Gly
690 695
<210>34
<211>233
<212>PRT
<213>人工序列
<400>34
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Ser Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65 70 75 80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
130 135 140
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser ArgIle Ala
145 150 155 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
165 170 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
180 185 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
210 215 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210>35
<211>699
<212>DNA
<213>人工序列
<400>35
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60
acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg180
gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct240
tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg300
cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga360
gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc420
aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc480
gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag540
accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc600
cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt660
gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctg 699
<210>36
<211>233
<212>PRT
<213>人工序列
<400>36
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65 70 75 80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
130 135 140
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145 150 155 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
165 170 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
180 185 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
210 215 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210>37
<211>1428
<212>DNA
<213>人工序列
<400>37
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60
acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg180
gaagagtccc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct240
tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg300
cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga360
gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc420
aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc480
gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag540
accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc600
cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt660
gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgg gatccagcaa caccaaggtg720
gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca780
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc840
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 900
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 960
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag1020
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc1080
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg1140
cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc1200
ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac1260
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc1320
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct1380
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1428
<210>38
<211>476
<212>PRT
<213>人工序列
<400>38
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Ser Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65 70 75 80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
130 135 140
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145 150 155 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
165 170 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
180 185 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
210 215 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Ser Ser Asn Thr Lys Val
225 230 235 240
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pr0 Ser Val Phe Leu Phe
260 265 270
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
275 280 285
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
290 295 300
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val Hi s Asn Ala Lys Thr Lys Pro
305 310 315 320
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
325 330 335
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
340 345 350
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
355 360 365
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
370 375 380
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
385 390 395 400
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
405 410 415
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
420 425 430
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
435 440 445
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
450 455 460
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210>39
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<212>DNA
<213>人工序列
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acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg180
gaagagttcc ccagggacct ctctctaatc agccctctgg cccaggcagt cagatcatct240
tctcgaaccc cgagtgacaa gcctgtagcc catgttgtag caaaccctca agctgagggg300
cagctccagt ggctgaaccg ccgggccaat gccctcctgg ccaatggcgt ggagctgaga360
gataaccagc tggtggtgcc atcagagggc ctgtacctca tctactccca ggtcctcttc420
aagggccaag gctgcccctc cacccatgtg ctcctcaccc acaccatcag ccgcatcgcc480
gtctcctacc agaccaaggt caacctcctc tctgccatca agagcccctg ccagagggag540
accccagagg gggctgaggc caagccctgg tatgagccca tctatctggg aggggtcttc600
cagctggaga agggtgaccg actcagcgct gagatcaatc ggcccgacta tctcgacttt660
gccgagtctg ggcaggtcta ctttgggatc attgccctgg gatccagcaa caccaaggtg720
gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca780
cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc840
atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct900
gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg960
cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1020
gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1080
atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1140
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ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1260
aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1320
gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1380
ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa1428
<210>40
<211>476
<212>PRT
<213>人工序列
<400>40
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
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Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
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Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65 70 75 80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
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Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
130 135 140
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145 150 155 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
165 170 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
180 185 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
210 215 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu Gly Ser Ser Asn Thr Lys Val
225 230 235 240
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
245 250 255
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
260 265 270
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
275 280 285
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
290 295 300
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
305 310 315 320
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
325 330 335
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
340 345 350
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
355 360 365
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
370 375 380
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln ValSer Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
385 390 395 400
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
405 410 415
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
420 425 430
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
435 440 445
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
450 455 460
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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atgacaccac ctgaacgtct cttcctccca agggtgtgtg gcaccaccct acacctcctc60
cttctggggc tgctgctggt tctgctgcct ggggcccagg gg 102
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<212>PRT
<213>人
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Met Thr Pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg Val Cys Gly Thr Thr
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala
20 25 30
Gln Gly
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<212>DNA
<213>人
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ctccctggtg ttggcctcac accttcagct gcccagactg cccgtcagca ccccaagatg 60
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<210>46
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<212>PRT
<213>人
<400>46
Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala Arg Gln
1 5 10 15
His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala Ala His
20 25 30
Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg Ala Asn
35 40 45
Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn Asn Ser
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Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln Val Val
65 70 75 80
Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro Leu Tyr
85 90 95
Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe His Val
100 105 110
Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln Glu Pro
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Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr Gln Gly
130 135 140
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Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu
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<212>DNA
<213>人
<400>47
ctccctggtg ttggcctcac accttcagct gcccagactg cccgtcagca ccccaagatg 60
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cctagtactg tcttctttgg agccttcgct ctg 513
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<212>PRT
<213>人
<400>48
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Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe His Val
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Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln Glu Pro
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Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr Gln Gly
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Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu
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<212>PRT
<213>人工序列
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Gly Gly Thr Gly Thr Gly Thr Gly Gly Cys Ala Cys Cys Ala Cys Cys
35 40 45
Cys Thr Ala Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Thr Thr Cys
50 55 60
Thr Gly Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Gly Thr
65 70 75 80
Thr Cys Thr Gly Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Cys Cys
85 90 95
Cys Ala Gly Gly Gly Gly Cys Thr Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Gly Gly Cys Cys Thr Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr Thr Cys
115 120 125
Ala Gly Cys Thr Gly Cys Cys Cys Ala Gly Ala Cys Thr Gly Cys Cys
130 135 140
Cys Gly Thr Cys Ala Gly Cys Ala Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Ala
145 150 155 160
Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Thr Gly Cys Cys Cys Ala Cys Ala Gly
165 170 175
Cys Ala Cys Cys Cys Thr Cys Ala Ala Ala Cys Cys Thr Gly Cys Thr
180 185 190
Gly Cys Thr Cys Ala Cys Cys Thr Cys Ala Thr Thr Gly Gly Ala Gly
195 200 205
Ala Cys Cys Cys Cys Ala Gly Cys Ala Ala Gly Cys Ala Gly Ala Ala
210 215 220
Cys Thr Cys Ala Cys Thr Gly Cys Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Ala
225 230 235 240
Gly Cys Ala Ala Ala Cys Ala Cys Gly Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly
245 250 255
Cys Cys Thr Thr Cys Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Ala Thr Gly Gly
260 265 270
Thr Thr Thr Cys Thr Cys Cys Thr Thr Gly Ala Gly Cys Ala Ala Cys
275 280 285
Ala Ala Thr Thr Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Cys
290 295 300
Cys Cys Ala Cys Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys Ala Thr Cys Thr Ala
305 310 315 320
Cys Thr Thr Cys Gly Thr Cys Thr Ala Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly
325 330 335
Gly Thr Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala
340 345 350
Ala Ala Gly Cys Cys Thr Ala Cys Thr Cys Thr Cys Cys Cys Ala Ala
355 360 365
Gly Gly Cys Cys Ala Cys Cys Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Cys Ala
370 375 380
Cys Thr Cys Thr Ala Cys Cys Thr Gly Gly Cys Cys Cys Ala Thr Gly
385 390 395 400
Ala Gly Gly Thr Cys Cys Ala Gly Cys Thr Cys Thr Thr Cys Thr Cys
405 410 415
Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Thr Ala Cys Cys Cys Cys Thr Thr Cys
420 425 430
Cys Ala Thr Gly Thr Gly Cys Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr Cys Ala
435 440 445
Gly Cys Thr Cys Cys Cys Ala Gly Ala Ala Gly Ala Thr Gly Gly Thr
450 455 460
Gly Thr Ala Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly
465 470 475 480
Gly Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala Cys Thr
485 490 495
Cys Gly Ala Thr Gly Thr Ala Cys Cys Ala Cys Gly Gly Gly Gly Cys
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Cys Cys Ala Cys Cys Cys Ala Cys Ala Cys Ala Gly Ala Thr Gly Gly
545 550 555 560
Cys Ala Thr Cys Cys Cys Cys Cys Ala Cys Cys Thr Ala Gly Thr Cys
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Cys Thr Cys Ala Gly Cys Cys Cys Thr Ala Gly Thr Ala Cys Thr Gly
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<211>205
<212>PRT
<213>人工序列
<400>50
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Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala
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Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro
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Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe
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His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>PRT
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Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala
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Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala
35 40 45
Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Asn Leu Lys Pro Ala
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Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg
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Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn
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100 105 110
Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro
115 120 125
Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe
130 135 140
His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln
145 150 155 160
Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr
165 170 175
Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly lle Pro His Leu Val
180 185 190
Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu
195 200 205
<210>53
<211>1344
<212>DNA
<213>人工序列
<400>53
atgacaccac ctgaacgtct cttcctccca agggtgtgtg gcaccaccct acacctcctc 60
cttctggggc tgctgctggt tctgctgcct ggggcccagg ggctccctgg tgttggcctc120
acaccttcag ctgcccagac tgcccgtcag caccccaaga tgcatcttgc ccacagcacc180
ctcaaacctg ctgctcacct cattggagac cccagcaagc agaactcact gctctggaga240
gcaaacacgg accgtgcctt cctccaggat ggtttctcct tgagcaacaa ttctctcctg300
gtccccacca gtggcatcta cttcgtctac tcccaggtgg tcttctctgg gaaagcctac360
tctcccaagg ccacctcctc cccactctac ctggcccatg aggtccagct cttctcctcc420
cagtacccct tccatgtgcc tctcctcagc tcccagaaga tggtgtatcc agggctgcag480
gaaccctggc tgcactcgat gtaccacggg gctgcgttcc agctcaccca gggagaccag540
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aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
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<210>54
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列
<400>54
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Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala
20 25 30
Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala
35 40 45
Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala
50 55 60
Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg
65 70 75 80
Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn
85 90 95
Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln
100 105 110
Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro
115 120 125
Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe
130 135 140
His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln
145 150 155 160
Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr
165 170 175
Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val
180 185 190
Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu Gly Ser Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210>55
<211>1344
<212>DNA
<213>人工序列
<400>55
atgacaccac ctgaacgtct cttcctccca agggtgtgtg gcaccaccct acacctcctc 60
cttctggggc tgctgctggt tctgctgcct ggggcccagg ggctccctgg tgttggcctc120
acaccttcag ctgcccagac tgcccgtcag caccccaaga tgcatcttgc ccacagcaac 180
ctcaaacctg ctgctcacct cattggagac cccagcaagc agaactcact gctctggaga 240
gcaaacacgg accgtgcctt cctccaggat ggtttctcct tgagcaacaa ttctctcctg 300
gtccccacca gtggcatcta cttcgtctac tcccaggtgg tcttctctgg gaaagcctac 360
tctcccaagg ccacctcctc cccactctac ctggcccatg aggtccagct cttctcctcc 420
cagtacccct tccatgtgcc tctcctcagc tcccagaaga tggtgtatcc agggctgcag 480
gaaccctggc tgcactcgat gtaccacggg gctgcgttcc agctcaccca gggagaccag 540
ctatccaccc acacagatgg catcccccac ctagtcctca gccctagtac tgtcttcttt 600
ggagccttcg ctctgggatc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 720
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 780
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 840
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 960
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1200
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1260
gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1320
agcctctccc tgtctccggg taaa 1344
<210>56
<211>448
<212>PRT
<213>人工序列
<400>56
Met Thr Pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg Val Cys Gly Thr Thr
1 5 10 15
Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala
20 25 30
Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala
35 40 45
Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Asn Leu Lys Pro Ala
50 55 60
Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg
65 70 75 80
Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn
85 90 95
Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln
100 105 110
Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro
115 120 125
Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe
130 135 140
His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln
145 150 155 160
Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr
165 170 175
Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val
180 185 190
Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu Gly Ser Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210>57
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>57
agtgatatcc catagctgtc tggcatgg28
<210>58
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<212>DNA
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agcactggga tccctgagtc ctcagtg 27
<210>59
<211>57
<212>DNA
<213>人
<400>59
atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccgctgg tgctcctgga gctgttg57
<210>60
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<212>PRT
<213>人
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Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu
<210>61
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<212>DNA
<213>人
<400>61
atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccgctgg tgctcctgga gctgttggtg60
gga 63
<210>62
<211>21
<212>PRT
<213>人
<400>62
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val Gly
20
<210>63
<211>570
<212>DNA
<213>人
<400>63
gtgggaatat acccctcagg ggttattgga ctggtccctc acctagggga cagggagaag 60
agagatagtg tgtgtcccca aggaaaatat atccaccctc aaaataattc gatttgctgt120
accaagtgcc acaaaggaac ctacttgtac aatgactgtc caggcccggg gcaggatacg180
gactgcaggg agtgtgagag cggctccttc accgcttcag aaaaccacct cagacactgc240
ctcagctgct ccaaatgccg aaaggaaatg ggtcaggtgg agatctcttc ttgcacagtg300
gaccgggaca ccgtgtgtgg ctgcaggaag aaccagtacc ggcattattg gagtgaaaac360
cttttccagt gcttcaattg cagcctctgc ctcaatggga ccgtgcacct ctcctgccag420
gagaaacaga acaccgtgtg cacctgccat gcaggtttct ttctaagaga aaacgagtgt480
gtctcctgta gtaactgtaa gaaaagcctg gagtgcacga agttgtgcct accccagatt540
gagaatgtta agggcactga ggactcaggg 570
<210>64
<211>190
<212>PRT
<213>人
<400>64
Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro His Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His
20 25 30
Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr
35 40 45
Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu
50 55 60
Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys
65 70 75 80
Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser
85 90 95
Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln
100 105 110
Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser
115 120 125
Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val Hi s Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn
130 135 140
Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys
145 150 155 160
Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys
165 170 175
Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly
180 185 190
<210>65
<211>564
<212>DNA
<213>人
<400>65
atatacccct caggggttat tggactggtc cctcacctag gggacaggga gaagagagat 60
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tgccacaaag gaacctactt gtacaatgac tgtccaggcc cggggcagga tacggactgc180
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tgtagtaact gtaagaaaag cctggagtgc acgaagttgt gcctacccca gattgagaat540
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<210>66
<211>188
<212>PRT
<213>人
<400>66
Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg
1 5 10 15
Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln
20 25 30
Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr
35 40 45
Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu
50 55 60
Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser
65 70 75 80
Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys
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Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg
100 105 110
His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys
115 120 125
Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val
130 135 140
Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser
145 150 155 160
Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro
165 170 175
Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly
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<212>DNA
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atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccgctgg tgctcctgga gctgttggtg 60
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<210>68
<211>209
<212>PRT
<213>人工序列
<400>68
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
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Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
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Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser
195 200 205
Gly
<210>69
<211>1290
<212>DNA
<213>人工序列
<400>69
gtgggaatat acccctcagg ggttattgga ctggtccctc acctagggga cagggagaag 60
agagatagtg tgtgtcccca aggaaaatat atccaccctc aaaataattc gatttgctgt120
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gaccgggaca ccgtgtgtgg ctgcaggaag aaccagtacc ggcattattg gagtgaaaac360
cttttccagt gcttcaattg cagcctctgc ctcaatggga ccgtgcacct ctcctgccag420
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gtctcctgta gtaactgtaa gaaaagcctg gagtgcacga agttgtgcct accccagatt540
gagaatgtta agggcactga ggactcaggg atccccaagg tggacaagaa agttgagccc600
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga660
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<212>PRT
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Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro His Leu Gly
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Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His
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180 185 190
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
195 200 205
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Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
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Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
245 250 255
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
260 265 270
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
275 280 285
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
290 295 300
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
305 310 315 320
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
325 330 335
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
340 345 350
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
355 360 365
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
370 375 380
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
420 425 430
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<212>DNA
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<400>71
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cagtgcttca attgcagcct ctgcctcaat gggaccgtgc acctctcctg ccaggagaaa 420
cagaacaccg tgtgcacctg ccatgcaggt ttctttctaa gagaaaacga gtgtgtctcc 480
tgtagtaact gtaagaaaag cctggagtgc acgaagttgt gcctacccca gattgagaat 540
gttaagggca ctgaggactc agggatcccc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 600
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gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 720
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taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 900
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 960
aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1020
aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1080
gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1140
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gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1260
agcctctccc tgtctccggg taaa 1284
<210>72
<211>428
<212>PRT
<213>人工序列
<400>72
Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg
1 5 10 15
Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln
20 25 30
Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr
35 40 45
Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu
50 55 60
Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser
65 70 75 80
Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys
85 90 95
Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg
100 105 110
His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys
115 120 125
Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val
130 135 140
Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser
145 150 155 160
Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro
165 170 175
Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Ile Pro Lys Val
180 185 190
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
195 200 205
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
210 215 220
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
225 230 235 240
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
245 250 255
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
260 265 270
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
275 280 285
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
290 295 300
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
305 310 315 320
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
325 330 335
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
340 345 350
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
355 360 365
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
370 375 380
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
385 390 395 400
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
405 410 415
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
420 425
<210>73
<211>1290
<212>DNA
<213>人工序列
<400>73
gtgggaatat acccctcagg ggttattgga ctggtccctc acctagggga cagggagaag60
agagatagtg tgtgtcccca aggaaaatat atccaccctc aaaataattc gatttgctgt 120
accaagtgcc acaaaggaac ctacttgtac aatgactgtc caggcccggg gcaggatacg 180
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ctcagctgct ccaaatgccg aaaggaaatg ggtcaggtgg agatctcttc ttgcacagtg 300
gaccgggaca ccgtgtgtgg ctgcaggaag aaccagtacc ggcattattg gagtgaaaac 360
cttttccagt gcttcaattg cagcctctgc ctcaatggga ccgtgcacct ctcctgccag 420
gagaaacaga acaccgtgtg cacctgccat gcaggtttct ttctaagaga aaacgagtgt 480
gtctcctgta gtaactgtaa gaaaagcctg gagtgcacga agttgtgcct accccagatt 540
gagaatgtta agggcactga ggacteaggg atccccaagg tggacaagaa agttgagccc 600
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 660
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 720
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 780
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 840
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gagtacaagt gcagggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 960
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1020
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1080
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1140
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1200
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg1260
cagaagagcc tctccctgtc tecgggtaaa 1290
<210>74
<211>430
<212>PRT
<213>人工序列
<400>74
Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro His Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His
20 25 30
Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr
35 40 45
Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu
50 55 60
Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys
65 70 75 80
Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser
85 90 95
Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln
100 105 110
Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser
115 120 125
Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn
130 135 140
Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys
145 150 155 160
Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys
165 170 175
Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Ile Pro
180 185 190
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
195 200 205
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
210 215 220
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
225 230 235 240
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
245 250 255
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
260 265 270
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
275 280 285
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
290 295 300
Arg Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
305 310 315 320
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
325 330 335
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
340 345 350
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
355 360 365
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
370 375 380
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
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Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
420 425 430
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<211>1284
<212>DNA
<213>人工序列
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gacaccgtgt gtggctgcag gaagaaccag taccggcatt attggagtga aaaccttttc360
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cagaacaccg tgtgcacctg ccatgcaggt ttctttctaa gagaaaacga gtgtgtctcc480
tgtagtaact gtaagaaaag cctggagtgc acgaagttgt gcctacccca gattgagaat540
gttaagggca ctgaggactc agggatcccc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct600
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca660
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc720
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 780
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 840
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aagtgcaggg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 960
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<211>428
<212>PRT
<213>人工序列
<400>76
Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg
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Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln
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Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr
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Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu
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65 70 75 80
Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys
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100 105 110
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115 120 125
Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val
130 135 140
Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser
145 150 155 160
Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro
165 170 175
Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Ile Pro Lys Val
180 185 190
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
195 200 205
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
210 215 220
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
225 230 235 240
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
245 250 255
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
260 265 270
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
275 280 285
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Arg Val
290 295 300
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
305 310 315 320
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
325 330 335
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
340 345 350
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
355 360 365
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
370 375 380
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
385 390 395 400
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
405 410 415
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
420 425
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<212>DNA
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<212>PRT
<213>人工序列
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Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro His Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His
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Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr
35 40 45
Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu
50 55 60
Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys
65 70 75 80
Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser
85 90 95
Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln
100 105 110
Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser
115 120 125
Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn
130 135 140
Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys
145 150 155 160
Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys
165 170 175
Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Gly Ser
180 185 190
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
195 200 205
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
210 215 220
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
225 230 235 240
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
245 250 255
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
260 265 270
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
275 280 285
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
290 295 300
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
305 310 315 320
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
325 330 335
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
340 345 350
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
355 360 365
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
370 375 380
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
385 390 395 400
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
405 410 415
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
420 425 430
Lys
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<211>1293
<212>DNA
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<400>79
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tgctccaaat gccgaaagga aatgggtcag gtggagatct cttcttgcac agtggaccgg 300
gacaccgtgt gtggctgcag gaagaaccag taccggcatt attggagtga aaaccttttc 360
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tgtagtaact gtaagaaaag cctggagtgc acgaagttgt gcctacccca gattgagaat 540
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cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 660
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aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 960
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acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1293
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<211>431
<212>PRT
<213>人工序列
<400>80
Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro His Leu Gly Asp Arg
1 5 10 15
Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln
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Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr
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Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu
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Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser
65 70 75 80
Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val
130 135 140
Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser
145 150 155 160
Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro
165 170 175
Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser Gly Gly Ser Ser Asn
180 185 190
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
195 200 205
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
210 215 220
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
225 230 235 240
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
245 250 255
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
260 265 270
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
275 280 285
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
290 295 300
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
305 310 315 320
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
325 330 335
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
340 345 350
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
355 360 365
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
370 375 380
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
385 390 395 400
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
405 410 415
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
420 425 430
<210>81
<211>1347
<212>DNA
<213>人工序列
<400>81
atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccgctgg tgctcctgga gctgttggtg 60
ggaatatacc cctcaggggt tattggactg gtccctcacc taggggacag ggagaagaga120
gatagtgtgt gtccccaagg aaaatatatc caccctcaaa ataattcgat ttgctgtacc180
aagtgccaca aaggaaccta cttgtacaat gactgtccag gcccggggca ggatacggac240
tgcagggagt gtgagagcgg ctccttcacc gcttcagaaa accacctcag acactgcctc300
agctgctcca aatgccgaaa ggaaatgggt caggtggaga tctcttcttg cacagtggac360
cgggacaccg tgtgtggctg caggaagaac cagtaccggc attattggag tgaaaacctt420
ttccagtgct tcaattgcag cctctgcctc aatgggaccg tgcacctctc ctgccaggag480
aaacagaaca ccgtgtgcac ctgccatgca ggtttctttc taagagaaaa cgagtgtgtc540
tcctgtagta actgtaagaa aagcctggag tgcacgaagt tgtgcctacc ccagattgag600
aatgttaagg gcactgagga ctcagggatc cccaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa660
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960
tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210>82
<211>449
<212>PRT
<213>人工序列
<400>82
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser
195 200 205
Gly Ile Pro Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210>83
<211>1347
<212>DNA
<213>人工序列
<400>83
atgggcctct ccaccgtgcc tgacctgctg ctgccgctgg tgctcctgga gctgttggtg 60
ggaatatacc cctcaggggt tattggactg gtccctcacc taggggacag ggagaagaga120
gatagtgtgt gtccccaagg aaaatatatc caccctcaaa ataattcgat ttgctgtacc180
aagtgccaca aaggaaccta cttgtacaat gactgtccag gcccggggca ggatacggac240
tgcagggagt gtgagagcgg ctccttcacc gcttcagaaa accacctcag acactgcctc300
agctgctcca aatgccgaaa ggaaatgggt caggtggaga tctcttcttg cacagtggac360
cgggacaccg tgtgtggctg caggaagaac cagtaccggc attattggag tgaaaacctt420
ttccagtgct tcaattgcag cctctgcctc aatgggaccg tgcacctctc ctgccaggag480
aaacagaaca ccgtgtgcac ctgccatgca ggtttctttc taagagaaaa cgagtgtgtc540
tcctgtagta actgtaagaa aagcctggag tgcacgaagt tgtgcctacc ccagattgag600
aatgttaagg gcactgagga ctcagggatc cccaaggtgg acaagaaagt tgagcccaaa660
tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg720
tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag780
gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac840
gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc900
acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag960
tacaagtgca gggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020
gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg 1080
accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140
gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200
gactccgacg gctccttctt cctctacagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260
caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320
aagagcctct ccctgtctcc gggtaaa 1347
<210>84
<211>449
<212>PRT
<213>人工序列
<400>84
Met Gly Leu Ser Thr Val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu Val Leu Leu
1 5 10 15
Glu Leu Leu Val Gly Ile Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Leu Val Pro
20 25 30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
50 55 60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp
65 70 75 80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser
195 200 205
Gly Ile Pro Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Arg Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
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<211>1356
<212>DNA
<213>人工序列
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aagtgccaca aaggaaccta cttgtacaat gactgtccag gcccggggca ggatacggac240
tgcagggagt gtgagagcgg ctccttcacc gcttcagaaa accacctcag acactgcctc300
agctgctcca aatgccgaaa ggaaatgggt caggtggaga tctcttcttg cacagtggac360
cgggacaccg tgtgtggctg caggaagaac cagtaccggc attattggag tgaaaacctt420
ttccagtgct tcaattgcag cctctgcctc aatgggaccg tgcacctctc ctgccaggag480
aaacagaaca ccgtgtgcac ctgccatgca ggtttctttc taagagaaaa cgagtgtgtc540
tcctgtagta actgtaagaa aagcctggag tgcacgaagt tgtgcctacc ccagattgag600
aatgttaagg gcactgagga ctcaggggga tccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660
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<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<400>86
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His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys
35 40 45
Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys
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65 70 75 80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu
85 90 95
Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val
100 105 110
Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg
115 120 125
Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe
130 135 140
Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu
145 150 155 160
Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu
165 170 175
Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr
180 185 190
Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu Asn Val Lys Gly Thr Glu Asp Ser
195 200 205
Gly Gly Ser Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210>87
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
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<210>88
<211>30
<212>DNA
<213>人序列
<400>88
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<212>DNA
<213>人
<400>89
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<210>90
<211>22
<212>PRT
<213>人
<400>90
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala
20
<210>91
<211>693
<212>DNA
<213>人
<400>91
ttgcccgccc aggtggcatt tacaccctac gccccggagc ccgggagcac atgccggctc 60
agagaatact atgaccagac agctcagatg tgctgcagca aatgctcgcc gggccaacat120
gcaaaagtct tctgtaccaa gacctcggac accgtgtgtg actcetgtga ggacagcaca180
tacacccagc tctggaactg ggttcccgag tgcttgagct gtggctcccg ctgtagctct240
gaccaggtgg aaactcaagc ctgcactcgg gaacagaacc gcatctgcac ctgeaggccc300
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cagatctgta acgtggtggc catccctggg aatgcaagca tggatgcagt ctgcacgtcc540
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ctcccaatgg gccccagccc cccagctgaa ggg 693
<210>92
<211>231
<212>PRT
<213>人
<400>92
Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys
20 25 30
Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
35 40 45
Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu
50 55 60
Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser
65 70 75 80
Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys
85 90 95
Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys
100 105 110
Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
115 120 125
Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His
145 150 155 160
Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala
165 170 175
Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
180 185 190
His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr
195 200 205
Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
210 215 220
Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly
225 230
<210>93
<211>693
<212>DNA
<213>人
<400>93
ttgcccgccc aggtggcatt tacaccctac gccccggagc ccgggagcac atgccggctc 60
agagaatact atgaccagac agctcagatg tgctgcagca agtgctcgcc gggccaacat120
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tacacccagc tctggaactg ggttcccgag tgcttgagct gtggctcccg ctgtagctct240
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cgatcccaac acacgcagcc aactccagaa cccagcactg ctccaagcac ctccttcctg660
ctcccaatgg gccccagccc cccagctgaa ggg 693
<210>94
<211>231
<212>PRT
<213>人
<400>94
Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser
1 5 10 15
Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys
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Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
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Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu
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Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys
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130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His
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Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Arg Asp Ala
165 170 175
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225 230
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<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<400>95
atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctg gccgtcggac tggagctctg ggctgcggcg 60
cacgccttgc ccgcccaggt ggcatttaca ccctacgccc cggagcccgg gagcacatgc120
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caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac240
agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt300
agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc360
aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg420
cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg480
tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg540
ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcatgga tgcagtctgc600
acgtccacgt cccccacccg gagtatggcc ccaggggcag tacacttacc ccagccagtg660
tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc720
ttcctgctcc caatgggccc cagcccccca gctgaaggg 759
<210>96
<211>253
<212>PRT
<213>人工序列
<400>96
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
20 25 30
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln
35 40 45
Thr Ala Gln Met Cys Cys Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys
50 55 60
Val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gln Leu Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys
85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
Glu Gln Asn Arg Ile Cys Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu
115 120 125
Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
130 135 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val
145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val AlaIle Pro Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly
245 250
<210>97
<211>759
<212>DNA
<213>人工序列
<400>97
atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctg gccgtcggac tggagctctg ggctgcggcg 60
cacgccttgc ccgcccaggt ggcatttaca ccctacgccc cggagcccgg gagcacatgc120
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caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac240
agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt300
agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc360
aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg420
cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg480
tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg540
ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcaggga tgcagtctgc600
acgtccacgt cccccacccg gagtatggcc ccaggggcag tacacttacc ccagccagtg660
tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc720
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>98
Met Ala Pro Val Ala Val Trp Ala Ala Leu Ala Val Gly Leu Glu Leu
1 5 10 15
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Gly Ser Arg Cys Ser Ser Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg
100 105 110
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115 120 125
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ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1080
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1140
tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1200
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1260
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac1320
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac1380
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 1422
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20 25 30
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Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser
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Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
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130 135 140
Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His
145 150 155 160
Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Met Asp Ala
165 170 175
Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Gly Ser Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
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Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1080
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1140
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Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Gly Ser Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
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Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
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Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
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Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
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145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr
165 170 175
Asp Ile Cys Arg Pro His Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly
180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala Val His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser
210 215 220
Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ile Pro Lys
245 250 255
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
305 310 315 320
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
340 345 350
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Arg
355 360 365
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
370 375 380
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
385 390 395 400
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
405 410 415
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
420 425 430
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
435 440 445
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
450 455 460
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
465 470 475 480
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
485 490
<210>117
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>117
atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctg gccgtcggac tggagctctg ggctgcggcg 60
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caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac240
agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt300
agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc360
aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg420
cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg480
tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg540
ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcaggga tgcagtctgc 600
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cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1260
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<212>PRT
<213>人工序列
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1 5 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr
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Ser Lys Gln Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
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Asn Ala Ser Arg Asp Ala Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser
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Gln His Thr Gln Pro Thr Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser
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Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ile Pro Lys
245 250 255
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
275 280 285
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
290 295 300
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
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Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
325 330 335
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
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Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
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Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
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Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
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Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
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Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
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Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
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435 440 445
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<212>DNA
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<213>人
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<212>DNA
<213>人
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Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
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Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
85 90 95
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Gly
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<211>1260
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<213>人工序列
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ctcagaagtg ggagtgagcg gaagcagctg tgcacggcca cacaggacac agtctgccgc240
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atccccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca600
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<211>420
<212>PRT
<213>人工序列
<400>134
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Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln
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Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val
35 40 45
Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp
85 90 95
Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala
100 105 110
Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln
115 120 125
Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro
130 135 140
Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr
145 150 155 160
Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr
165 170 175
Arg Pro Val Gly Ile Pro Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
180 185 190
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
195 200 205
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
210 215 220
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
225 230 235 240
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
245 250 255
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
260 265 270
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
275 280 285
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
290 295 300
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
355 360 365
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
370 375 380
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385 390 395 400
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
405 410 415
Ser Pro Gly Lys
420
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<211>1260
<212>DNA
<213>人工序列
<400>135
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agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1200
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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165 170 175
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195 200 205
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Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
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245 250 255
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275 280 285
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Arg Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
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Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg
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Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala
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Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln
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Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
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Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
260 265 270
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
275 280 285
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
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Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
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Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
325 330 335
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
340 345 350
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420
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<213>人工序列
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Ile Pro Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
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His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
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260 265 270
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275 280 285
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<211>448
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115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Tle Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Gly
195 200 205
Ile Pro Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Arg Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
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<211>1353
<212>DNA
<213>人工序列
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atgtgcgtgg gggctcggcg gctgggccgc gggccgtgtg cggctctgct cctcctgggc 60
ctggggctga gcaccgtgac ggggctccac tgtgtcgggg acacctaccc cagcaacgac 120
cggtgctgcc acgagtgcag gccaggcaac gggatggtga gccgctgcag ccgctcccag 180
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gccacacagg acacagtctg ccgctgccgg gcgggcaccc agcccctgga cagctacaag360
cctggagttg actgtgcccc ctgccctcca gggcacttct ccccaggcga caaccaggcc420
tgcaagccct ggaccaactg caccttggct gggaagcaca ccctgcagcc ggccagcaat480
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ggccccccgg ccaggcccat cactgtccag cccactgaag cctggcccag aacctcacag600
ggaccctcca cccggcccgt ggggggatcc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag660
cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg720
ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc780
cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac840
tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac900
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acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa1353
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Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
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Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
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Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
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Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
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Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Gly
195 200 205
Gly Ser Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
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Pro Gly Lys
450
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cttgatatct caagtagtga tatggatg28
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<212>DNA
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agacatggat ccagtaggtc acagcagt28
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<212>DNA
<213>人
<400>147
atggatgact ccacagaaag ggagcagtca cgccttactt cttgccttaa gaaaagagaa 60
gaaatgaaac tgaaggagtg tgtttccatc ctcccacgga aggaaagccc ctctgtccga120
tcctccaaag acggaaagct gctggctgca accttgctgc tggcactgct gtcttgctgc180
ctcacggtgg tgtctttcta ccaggtggcc gccctgcaag gggacctggc cagcctccgg240
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ggagaaggca actccagtca gaacagcaga aataagcgt 399
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<212>PRT
<213>人
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Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu
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Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro
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Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu
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Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val
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Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg
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Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly
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<213>人
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ggagaaggca actccagtca gaacagcaga aataagcgt 399
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<211>133
<212>PRT
<213>人
<400>150
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Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro
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Arg Lys Glu Ile Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu
35 40 45
Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val
50 55 60
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65 70 75 80
Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly
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<211>456
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<213>人
<400>151
gccgttcagg gtccagaaga aacagtcact caagactgct tgcaactgat tgcagacagt 60
gaaacaccaa ctatacaaaa aggatcttac acatttgttc catggcttct cagctttaaa120
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tttatatatg gtcaggtttt atatactgat aagacctacg ccatgggaca tctaattcag240
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gaagaaggag atgaactcca acttgcaata ccaagagaaa atgcacaaat atcactggat420
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<211>152
<212>PRT
<213>人
<400>152
Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu
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Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe
20 25 30
Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys
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50 55 60
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65 70 75 80
Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu
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ggatcttaca catttgttcc atggcttctc agctttaaaa ggggaagtgc cctagaagaa540
aaagagaata aaatattggt caaagaaact ggttactttt ttatatatgg tcaggtttta600
tatactgata agacctacgc catgggacat ctaattcaga ggaagaaggt ccatgtcttt660
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Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu
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130 135 140
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Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser
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Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly
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Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu
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Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu
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tatactgata agacctacgc catgggacat ctaattcaga ggaagaaggt ccatgtcttt 660
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Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro
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Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu
35 40 45
Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val
50 55 60
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65 70 75 80
Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu
260 265 270
Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu Gly Ser Ser
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
325 330 335
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
340 345 350
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
355 360 365
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
370 375 380
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
385 390 395 400
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
405 410 415
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
420 425 430
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
435 440 445
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
450 455 460
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
465 470 475 480
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
485 490 495
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
500 505 510
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
515 520 525
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<211>1584
<212>DNA
<213>人工序列
<400>159
atggatgact ccacagaaag ggagcagtca cgccttactt cttgccttaa gaaaagagaa60
gaaatgaaac tgaaggagtg tgtttccatc ctcccacgga aggaaatccc ctctgtccga 120
tcctccaaag acggaaagct gctggctgca accttgctgc tggcactgct gtcttgctgc 180
ctcacggtgg tgtctttcta ccaggtggcc gccctgcaag gggacctggc cagcctccgg 240
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ggcctggagg aagctccagc tgtcaccgcg ggactgaaaa tctttgaacc accagctcca 360
ggagaaggca actccagtca gaacagcaga aataagcgtg ccgttcaggg tccagaagaa 420
acagtcactc aagactgctt gcaactgatt gcagacagtg aaacaccaac tatacaaaaa 480
ggatcttaca catttgttcc atggcttctc agctttaaaa ggggaagtgc cctagaagaa 540
aaagagaata aaatattggt caaagaaact ggttactttt ttatatatgg tcaggtttta 600
tatactgata agacctacgc catgggacat ctaattcaga ggaagaaggt ccatgtcttt 660
ggggatgaat tgagtctggt gactttgttt cgatgtattc aaaatatgcc tgaaacacta 720
cccaataatt cctgctattc agctggcatt gcaaaactgg aagaaggaga tgaactccaa 780
cttgcaatac caagagaaaa tgcacaaata tcactggatg gagatgtcac attttttggt 840
gcattgaaac tgctgggatc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 900
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 960
gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc1020
acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg1080
gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg1140
taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac1200
aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc1260
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Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu
1 5 10 15
Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro
20 25 30
Arg Lys Glu Ile Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu
35 40 45
Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val
50 55 60
Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg
65 70 75 80
Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly
85 90 95
Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu
100 105 110
Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn
115 120 125
Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln
130 135 140
Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys
145 150 155 160
Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser
165 170 175
Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr
180 185 190
Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met
195 200 205
Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu
210 215 220
Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu
225 230 235 240
Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly
245 250 255
Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu
260 265 270
Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu Gly Ser Ser
275 280 285
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
290 295 300
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
325 330 335
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
340 345 350
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
355 360 365
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
370 375 380
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
385 390 395 400
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
405 410 415
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
420 425 430
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
435 440 445
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
450 455 460
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
465 470 475 480
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
485 490 495
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
500 505 510
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
515 520 525
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<211>30
<212>DNA
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aaggatatcc gggcgatggg ggcaggtgcc30
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<211>30
<212>DNA
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<212>DNA
<213>人
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<213>人
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Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala
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<212>DNA
<213>人
<400>165
aaggaggcat gccccacagg cctgtacaca cacagcggtg agtgctgcaa agcctgcaac 60
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gcaggtgtgg tgaccacagt gatgggg627
<210>166
<211>209
<212>PRT
<213>人
<400>166
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1 5 10 15
Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn
20 25 30
Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val
35 40 45
Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu
50 55 60
Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala
85 90 95
Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp
100 105 110
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115 120 125
Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp
130 135 140
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145 150 155 160
Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly
165 170 175
Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu
180 185 190
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195 200 205
Gly
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<212>DNA
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<400>167
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<212>PRT
<213>人工序列
<400>168
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys
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35 40 45
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65 70 75 80
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
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100 105 110
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115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
130 135 140
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180 185 190
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195 200 205
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<213>人工序列
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Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys
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Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn
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Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu
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Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly
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Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu
180 185 190
Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met
195 200 205
Gly Ile Pro Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
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Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
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Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
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Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
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<213>人工序列
<400>171
aaggaggcat gccccacagg cctgtacaca cacagcggtg agtgctgcaa agcctgcaac 60
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gtgtgcgagg acaccgagcg ccagctccgc gagtgcacac gctgggccga cgccgagtgc 480
gaggagatcc ctggccgttg gattacacgg tccacacccc cagagggctc ggacagcaca 540
gcccccagca cccaggagcc tgaggcacct ccagaacaag acctcatagc cagcacggtg 600
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Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu
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Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg
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Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala
85 90 95
Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly
165 170 175
Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu
180 185 190
Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met
195 200 205
Gly Ile Pro Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
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Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
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Lys
<210>173
<211>1356
<212>DNA
<213>人工序列
<400>173
aaggaggcat gccccacagg cctgtacaca cacagcggtg agtgctgcaa agcctgcaac 60
ctgggcgagg gtgtggccca gccttgtgga gccaaccaga ccgtgtgtga gccctgcctg 120
gacagcgtga cgttctccga cgtggtgagc gcgaccgagc cgtgcaagcc gtgcaccgag 180
tgcgtggggc tccagagcat gtcggcgcca tgcgtggagg ccgacgacgc cgtgtgccgc 240
tgcgcctacg gctactacca ggatgagacg actgggcgct gcgaggcgtg ccgcgtgtgc 300
gaggcgggct cgggcctcgt gttctcctgc caggacaagc agaacaccgt gtgcgaggag 360
tgccccgacg gcacgtattc cgacgaggcc aaccacgtgg acccgtgcct gccctgcacc 420
gtgtgcgagg acaccgagcg ccagctccgc gagtgcacac gctgggccga cgccgagtgc 480
gaggagatcc ctggccgttg gattacacgg tccacacccc cagagggctc ggacagcaca 540
gcccccagca cccaggagcc tgaggcacct ccagaacaag acctcatagc cagcacggtg 600
gcaggtgtgg tgaccacagt gatgggggga tccagcaaca ccaaggtgga caagaaagtt 660
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 720
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 780
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 840
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 900
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 960
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 1020
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 1080
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 1140
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 1200
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 1260
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 1320
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaa 1356
<210>174
<211>452
<212>PRT
<213>人工序列
<400>174
Lys Glu Ala Cys Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys
1 5 10 15
Lys Ala Cys Asn Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn
20 25 30
Gln Thr Val Cys Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val
35 40 45
Val Ser Ala Thr Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu
50 55 60
Gln Ser Met Ser Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Ala Tyr Gly Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala
85 90 95
Cys Arg Val Cys Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp
100 105 110
Lys Gln Asn Thr Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp
115 120 125
Glu Ala Asn His Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp
130 135 140
Thr Glu Arg Gln Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys
145 150 155 160
Glu Glu Ile Pro Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly
165 170 175
Ser Asp Ser Thr Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu
180 185 190
Gln Asp Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met
195 200 205
Gly Gly Ser Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro G1u Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210>175
<211>1431
<212>DNA
<213>人工序列
<400>175
atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt 60
ctgggggtgt cccttggagg tgccaaggag gcatgcccca caggcctgta cacacacagc 120
ggtgagtgct gcaaagcctg caacctgggc gagggtgtgg cccagccttg tggagccaac 180
cagaccgtgt gtgagccctg cctggacagc gtgacgttct ccgacgtggt gagcgcgacc 240
gagccgtgca agccgtgcac cgagtgcgtg gggctccaga gcatgtcggc gccatgcgtg 300
gaggccgacg acgccgtgtg ccgctgcgcc tacggctact accaggatga gacgactggg 360
cgctgcgagg cgtgccgcgt gtgcgaggcg ggctcgggcc tcgtgttctc ctgccaggac 420
aagcagaaca ccgtgtgcga ggagtgcccc gacggcacgt attccgacga ggccaaccac 480
gtggacccgt gcctgccctg caccgtgtgc gaggacaccg agcgccagct ccgcgagtgc 540
acacgctggg ccgacgccga gtgcgaggag atccctggcc gttggattac acggtccaca 600
cccccagagg gctcggacag cacagccccc agcacccagg agcctgaggc acctccagaa 660
caagacctca tagccagcac ggtggcaggt gtggtgacca cagtgatggg gatccccaag 720
gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca 780
gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc 840
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac 900
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 960
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1020
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1080
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1140
ctgcccccat cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 1200
ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1260
tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 1320
accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 1380
gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 143l
<210>176
<211>477
<212>PRT
<213>人工序列
<400>176
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn
35 40 45
Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys
50 55 60
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
85 90 95
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
130 135 140
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
145 150 155 160
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
165 170 175
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
180 185 190
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
210 215 220
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ile Pro Lys
225 230 235 240
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
275 280 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210>177
<211>1431
<212>DNA
<213>人工序列
<400>177
atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt 60
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aagcagaaca ccgtgtgcga ggagtgcccc gacggcacgt attccgacga ggccaaccac480
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acacgctggg ccgacgccga gtgcgaggag atccctggcc gttggattac acggtccaca600
cccccagagg gctcggacag cacagccccc agcacccagg agcctgaggc acctccagaa660
caagacctca tagccagcac ggtggcaggt gtggtgacca cagtgatggg gatccccaag720
gtggacaaga aagttgagcc caaatcttgt gacaaaactc acacatgccc accgtgccca780
gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc840
ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac900
cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag960
ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 1020
caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag tgcagggtct ccaacaaagc cctcccagcc 1080
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc 1140
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ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 1260
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gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctccgggtaa a 1431
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<211>477
<212>PRT
<213>人工序列
<400>178
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn
35 40 45
Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys
50 55 60
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
85 90 95
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
130 135 140
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
145 150 155 160
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
165 170 175
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
180 185 190
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
210 215 220
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ile Pro Lys
225 230 235 240
Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
245 250 255
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
260 265 270
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
275 280 285
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
290 295 300
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
305 310 315 320
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
325 330 335
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Arg
340 345 350
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
355 360 365
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
370 375 380
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
405 410 415
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
420 425 430
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
435 440 445
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
450 455 460
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
<210>179
<211>1440
<212>DNA
<213>人工序列
<400>179
atgggggcag gtgccaccgg ccgcgccatg gacgggccgc gcctgctgct gttgctgctt 60
ctgggggtgt cccttggagg tgccaaggag gcatgcccca caggcctgta cacacacagc120
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gaggccgacg acgccgtgtg ccgctgcgcc tacggctact accaggatga gacgactggg360
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aagcagaaca ccgtgtgcga ggagtgcccc gacggcacgt attccgacga ggccaaccac480
gtggacccgt gcctgccctg caccgtgtgc gaggacaccg agcgccagct ccgcgagtgc540
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cccccagagg gctcggacag cacagccccc agcacccagg agcctgaggc acctccagaa660
caagacctca tagccagcac ggtggcaggt gtggtgacca cagtgatggg gggatccagc720
aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca780
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<211>480
<212>PRT
<213>人工序列
<400>180
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn
35 40 45
Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys
50 55 60
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
85 90 95
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
130 135 140
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
145 150 155 160
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
165 170 175
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
180 185 190
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
210 215 220
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Gly Ser Ser
225 230 235 240
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
245 250 255
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
260 265 270
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
275 280 285
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
290 295 300
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
305 310 315 320
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
325 330 335
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
340 345 350
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
355 360 365
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
370 375 380
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
385 390 395 400
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
405 410 415
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
420 425 430
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
435 440 445
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
450 455 460
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<400>181
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<210>182
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>182
agcccagaat tctatgttct tccgtca 27
<210>183
<211>387
<212>DNA
<213>人
<400>183
atgcagcagc ccttcaatta cccatatccc cagatctact gggtggacag cagtgccagc 60
tctccctggg cccctccagg cacagttctt ccctgtccaa cctctgtgcc cagaaggcct120
ggtcaaagga ggccaccacc accaccgcca ccgccaccac taccacctcc gccgccgccg180
ccaccactgc ctccactacc gctgccaccc ctgaagaaga gagggaacca cagcacaggc240
ctgtgtctcc ttgtgatgtt tttcatggtt ctggttgcct tggtaggatt gggcctgggg300
atgtttcagc tcttccacct acagaaggag ctggcagaac tccgagagtc taccagccag 360
atgcacacag catcatcttt ggagaag387
<210>184
<211>129
<212>PRT
<213>人
<400>184
Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro
50 55 60
Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly
65 70 75 80
Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala
100 105 110
Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu
115 120 125
Lys
<210>185
<211>456
<212>DNA
<213>人
<400>185
caaataggcc accccagtcc accccctgaa aaaaaggagc tgaggaaagt ggcccattta 60
acaggcaagt ccaactcaag gtccatgcct ctggaatggg aagacaccta tggaattgtc120
ctgctttctg gagtgaagta taagaagggt ggccttgtga tcaatgaaac tgggctgtac180
tttgtatatt ccaaagtata cttccggggt caatcttgca acaacctgcc cctgagccac240
aaggtctaca tgaggaactc taagtatccc caggatctgg tgatgatgga ggggaagatg300
atgagctact gcactactgg gcagatgtgg gcccgcagca gctacctggg ggcagtgttc360
aatcttacca gtgctgatca tttatatgtc aacgtatctg agctctctct ggtcaatttt420
gaggaatctc agacgttttt cggcttatat aagctc 456
<210>186
<211>152
<212>PRT
<213>人
<400>186
Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg Lys
1 5 10 15
Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu Glu
20 25 30
Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr Lys
35 40 45
Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr Ser
50 55 60
Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser His
65 70 75 80
Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met Met
85 90 95
Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala Arg
100 105 110
Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His Leu
115 120 125
Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser Gln
130 135 140
Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
145 150
<210>187
<211>843
<212>DNA
<213>人工序列
<400>187
atgcagcagc ccttcaatta cccatatccc cagatctact gggtggacag cagtgccagc 60
tctccctggg cccctccagg cacagttctt ccctgtccaa cctctgtgcc cagaaggcct 120
ggtcaaagga ggccaccacc accaccgcca ccgccaccac taccacctcc gccgccgccg 180
ccaccactgc ctccactacc gctgccaccc ctgaagaaga gagggaacca cagcacaggc 240
ctgtgtctcc ttgtgatgtt tttcatggtt ctggttgcct tggtaggatt gggcctgggg 300
atgtttcagc tcttccacct acagaaggag ctggcagaac tccgagagtc taccagccag 360
atgcacacag catcatcttt ggagaagcaa ataggccacc ccagtccacc ccctgaaaaa 420
aaggagctga ggaaagtggc ccatttaaca ggcaagtcca actcaaggtc catgcctctg 480
gaatgggaag acacctatgg aattgtcctg ctttctggag tgaagtataa gaagggtggc 540
cttgtgatca atgaaactgg gctgtacttt gtatattcca aagtatactt ccggggtcaa 600
tcttgcaaca acctgcccct gagccacaag gtctacatga ggaactctaa gtatccccag 660
gatctggtga tgatggaggg gaagatgatg agctactgca ctactgggca gatgtgggcc 720
cgcagcagct acctgggggc agtgttcaat cttaccagtg ctgatcattt atatgtcaac 780
gtatctgagc tctctctggt caattttgag gaatctcaga cgtttttcgg cttatataag 840
ctc843
<210>188
<211>281
<212>PRT
<213>人工序列
<400>188
Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro
50 55 60
Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly
65 70 75 80
Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala
100 105 110
Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu
115 120 125
Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg
130 135 140
Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu
145 150 155 160
Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr
165 170 175
Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr
180 185 190
Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser
195 200 205
His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met
210 215 220
Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala
225 230 235 240
Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His
245 250 255
Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser
260 265 270
Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu
275 280
<210>189
<211>1572
<212>DNA
<213>人工序列
<400>189
atgcagcagc ccttcaatta cccatatccc cagatctact gggtggacag cagtgccagc 60
tctccctggg cccctccagg cacagttctt ccctgtccaa cctctgtgcc cagaaggcct 120
ggtcaaagga ggccaccacc accaccgcca ccgccaccac taccacctcc gccgccgccg 180
ccaccactgc ctccactacc gctgccaccc ctgaagaaga gagggaacca cagcacaggc 240
ctgtgtctcc ttgtgatgtt tttcatggtt ctggttgcct tggtaggatt gggcctgggg 300
atgtttcagc tcttccacct acagaaggag ctggcagaac tccgagagtc taccagccag 360
atgcacacag catcatcttt ggagaagcaa ataggccacc ccagtccacc ccctgaaaaa 420
aaggagctga ggaaagtggc ccatttaaca ggcaagtcca actcaaggtc catgcctctg 480
gaatgggaag acacctatgg aattgtcctg ctttctggag tgaagtataa gaagggtggc 540
cttgtgatca atgaaactgg gctgtacttt gtatattcca aagtatactt ccggggtcaa 600
tcttgcaaca acctgcccct gagccacaag gtctacatga ggaactctaa gtatccccag 660
gatctggtga tgatggaggg gaagatgatg agctactgca ctactgggca gatgtgggcc 720
cgcagcagct acctgggggc agtgttcaat cttaccagtg ctgatcattt atatgtcaac 780
gtatctgagc tctctctggt caattttgag gaatctcaga cgtttttcgg cttatataag 840
ctcggatcca gcaacaccaa ggtggacaag aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact 900
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 960
cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 1020
gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 1080
gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1140
agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc1200
tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc1260
cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc1320
agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc1380
aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc1440
ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc1500
tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg1560
tctccgggta aa1572
<210>190
<211>524
<212>PRT
<213>人工序列
<400>190
Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp
1 5 10 15
Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys
20 25 30
Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro
35 40 45
Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro
50 55 60
Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly
65 70 75 80
Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly
85 90 95
Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala
100 105 110
Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu
115 120 125
Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg
130 135 140
Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu
145 150 155 160
Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr
165 170 175
Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr
180 185 190
Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser
195 200 205
His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met
210 215 220
Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala
225 230 235 240
Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His
245 250 255
Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser
260 265 270
Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu Gly Ser Ser Asn Thr Lys Val
275 280 285
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
290 295 300
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
305 310 315 320
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
325 330 335
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
340 345 350
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
355 360 365
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
370 375 380
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
385 390 395 400
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
405 410 415
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg
420 425 430
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
435 440 445
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
450 455 460
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
465 470 475 480
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
485 490 495
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
500 505 510
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
515 520
<210>191
<211>1797
<212>DNA
<213>人
<400>191
atgagcactg aaagcatgat ccgggacgtg gagctggccg aggaggcgct ccccaagaag 60
acaggggggc cccagggctc caggcggtgc ttgttcctca gcctcttctc cttcctgatc120
gtggcaggcg ccaccacgct cttctgcctg ctgcactttg gagtgatcgg cccccagagg180
gaagaggtga gtgcctggcc agccttcatc cactctccca cccaagggga aatgagagac240
gcaagagagg gagagagatg ggatgggtga aagatgtgcg ctgataggga gggatgagag300
agaaaaaaac atggagaaag acggggatgc agaaagagat gtggcaagag atggggaaga360
gagagagaga aagatggaga gacaggatgt ctggcacatg gaaggtgctc actaagtgtg420
tatggagtga atgaatgaat gaatgaatga acaagcagat atataaataa gatatggaga480
cagatgtggg gtgtgagaag agagatgggg gaagaaacaa gtgatatgaa taaagatggt540
gagacagaaa gagcgggaaa tatgacagct aaggagagag atgggggaga taaggagaga600
agaagatagg gtgtctggca cacagaagac actcagggaa agagctgttg aatgctggaa660
ggtgaataca cagatgaatg gagagagaaa accagacacc tcagggctaa gagcgcaggc720
cagacaggca gccagctgtt cctcctttaa gggtgactcc ctcgatgtta accattctcc780
ttctccccaa cagttcccca gggacctctc tctaatcagc cctctggccc aggcagtcag840
taagtgtctc caaacctctt tcctaattct gggtttgggt ttgggggtag ggttagtacc900
ggtatggaag cagtggggga aatttaaagt tttggtcttg ggggaggatg gatggaggtg960
aaagtagggg ggtattttct aggaagttta agggtctcag ctttttcttt tctctctcct 1020
cttcaggatc atcttctcga accccgagtg acaagcctgt agcccatgtt gtaggtaaga 1080
gctctgagga tgtgtcttgg aacttggagg gctaggattt ggggattgaa gcccggctga 1140
tggtaggcag aacttggaga caatgtgaga aggactcgct gagctcaagg gaagggtgga 1200
ggaacagcac aggccttagt gggatactca gaacgtcatg gccaggtggg atgtgggatg1260
acagacagag aggacaggaa ccggatgtgg ggtgggcaga gctcgagggc caggatgtgg1320
agagtgaacc gacatggcca cactgactct cctctccctc tctccctccc tccagcaaac1380
cctcaagctg aggggcagct ccagtggctg aaccgccggg ccaatgccct cctggccaat1440
ggcgtggagc tgagagataa ccagctggtg gtgccatcag agggcctgta cctcatctac1500
tcccaggtcc tcttcaaggg ccaaggctgc ccctccaccc atgtgctcct cacccacacc1560
atcagccgca tcgccgtctc ctaccagacc aaggtcaacc tcctctctgc catcaagagc1620
ccctgccaga gggagacccc agagggggct gaggccaagc cctggtatga gcccatctat1680
ctgggagggg tcttccagct ggagaagggt gaccgactca gcgctgagat caatcggccc1740
gactatctcg actttgccga gtctgggcag gtctactttg ggatcattgc cctgtga 1797
<210>192
<211>951
<212>DNA
<213>人
<400>192
atgacaccac ctgaacgtct cttcctccca agggtgtgtg gcaccaccct acacctcctc 60
cttctggggc tgctgctggt tctgctgcct ggggcccagg tgaggcagca ggagaatggg120
ggctgctggg gtggctcagc caaaccttga gccctagagc ccccctcaac tctgttctcc180
cctaggggct ccctggtgtt ggcctcacac cttcagctgc ccagactgcc cgtcagcacc240
ccaagatgca tcttgcccac agcaccctca aacctgctgc tcacctcatt ggtaaacatc300
cacctgacct cccagacatg tccccaccag ctctcctcct acccctgcct caggaaccca360
agcatccacc cctctccccc aacttccccc acgctaaaaa aaacagaggg agcccactcc420
tatgcctccc cctgccatcc cccaggaact cagttgttca gtgcccactt cctcagggat480
tgagacctct gatccagacc cctgatctcc cacccccatc ccctatggct cttcctagga540
gaccccagca agcagaactc actgctctgg agagcaaaca cggaccgtgc cttcctccag600
gatggtttct ccttgagcaa caattctctc ctggtcccca ccagtggcat ctacttcgtc660
tactcccagg tggtcttctc tgggaaagcc tactctccca aggccacctc ctccccactc720
tacctggccc atgaggtcca gctcttctcc tcccagtacc ccttccatgt gcctctcctc780
agctcccaga agatggtgta tccagggctg caggaaccct ggctgcactc gatgtaccac840
ggggctgcgt tccagctcac ccagggagac cagctatcca cccacacaga tggcatcccc900
cacctagtcc tcagccctag tactgtcttc tttggagcct tcgctctgta g 951
<210>193
<211>6815
<212>DNA
<213>人
<400>193
atgcagcagc ccttcaatta cccatatccc cagatctact gggtggacag cagtgccagc 60
tctccctggg cccctccagg cacagttctt ccctgtccaa cctctgtgcc cagaaggcct120
ggtcaaagga ggccaccacc accaccgcca ccgccaccac taccacctcc gccgccgccg180
ccaccactgc ctccactacc gctgccaccc ctgaagaaga gagggaacca cagcacaggc240
ctgtgtctcc ttgtgatgtt tttcatggtt ctggttgcct tggtaggatt gggcctgggg300
atgtttcagc tcttccacct acagaaggag ctggcagaac tccgagaggt aagcctgccg360
gcagactgct gtgccctgga ggcaccaggc ataaggggat ggagggccca ctgcctggct420
tgcaaagtgc ttttcaatcc tttttttttt tttcttagaa atgggttgtt ctagttattc480
tattctatag acagagaaat ggaggctcat aggggtgaag ggaatatttt ttactttgta540
aagaatcaga gcccaacagt ttgtctttcc tcagttgtca actcagtctg ttgaaccact600
tactgcctca tacctattga tttaaggagt aaaaaacaaa caaacaaaac ttttaagttt660
tgcttggaag taaatttgtt cagatgacca aactaaatct tgaaaattgg tacgattcca720
aatcacaaaa ctgagggaca gtgaggcaaa attgcttggc caaagcccaa gttagcagaa780
cttctgaggt atttggattc tctttccagg gcttggttta tttgacgatt ctgcctcttt840
tgcttaaaga attttatttt tattatacat cttttctctt tctgttttac tagtctacca900
gccagatgca cacagcatca tctttggaga agcaaatagg tgagtctttt ttcgcatgta 960
cattgagttc ccaaagatga tcctcagcac agaactatgt taatggaatg ccttaaattc1020
tgtcccacac tttggtttct gtacactata agaggaattc tggctaattc agaatctctg1080
gtctatgatt ccttgagctg ctttaaaaat gtgaagtgaa ttgaattgct cacaatcaat1140
atagctgagc actgcacaca attcaaaatc acttccactt gactttggaa agagacacac1200
atatacaacc ctggaccttt gccccctgag aagtggctcc aggcctgtcc ccttccacag1260
acatcctggt cctggcacac acgccagtgg ctgtaactcc tgggaagaga aggcgaaatg1320
aaggcagaga cagatgtttc tgagaaacgt cctttcctct tttaaatgcc ctaaagagat1380
tacattgaag ctttatttac aatatgtttt ataggatgta agcttttaaa acatggataa1440
tcaattcccc acattagaat ggtttttctt gaagtcactg agaagcttaa gggaagactt1500
cagccatcat tcaaaggatg ttcagcttca cccacagagg cagtcatgag gtacccttga1560
tcacaaagga aaatcctttg tatgggagct agggcaagaa gatgataggt tgaacactga1620
tctcatgaaa tttcagggca tagttgtgca agctctgtac agatagattt tacagtgtgc1680
ttcactagtc taagattcat tgaaatttta gatttagatt tacaatgaga ttcattgaat1740
ttttagaggt ggaaggaagc ttagaatata tctagtccag ccatttcatt ttttggaaga1800
gaaacaaaat accagatgga ttaggtgaat atgcccaaga ccactggtat gccattgggg1860
ctagaaggaa cacaggctct tgatgccttg tcacctacag ggctttccag tactggactg1920
gtgcctcatg aaggagggaa actcctgtct ctctgtagtg agcatggaat aagaaataga1980
tgaaaagcag gatacctctg caaagactat aggtagatct catccttaga aactcagaat2040
aaagaagaag gcagcactgg ccatctatta agtgaagcaa gttccagttt ctccggatgt2100
ggctactgca catgacccag tcgcctgtct actatcctag actgttaagt tcttatatga2160
gccactgttg ggatgctctg gcccctgctt ctgtgtccta atccttaaat gttagaaagt2220
ccatatgtac acaagcagag tggaaatatt tgatagaaaa gtaaagcctc tggaggacgt2280
ctgaaataag atcattttga aaatctgtgg aatgtgcctg gtctgatagg tatctaatta2340
ttcatctttc acccactctc tggagtcaat ttagtgatta aaagtcaaat gatcaggtga2400
gtcagatcca tctaccccag taagcaatta tgttctctag atcaacccaa ataaaccaga2460
aattggtaaa tcatcacatg gaaatcaaat cagtaacttt actaataaga aaagagatgc2520
aaattaaaaa tagggaatac caattttcat caaattaata aagattaaaa aaaaacccag2580
actgacaaag atttgagaga aaagtgcctg tgcaaacatt agtttcagcc agtatacatg2640
taaattgcta taactttttt tgaagagcgc tttagaaata catagcaaaa gcttgtaact2700
agtagtttac gttgtaatcc tatcgctaag aatttatctt aagaaaataa tcagagatgt2760
gcccgaagat ttatatataa ggatgttcat tacttcctta tgagcctatt tataataaat2820
aattcagaag aaacttgaat gcctcatacg agattagtta tatacattat ggtgtattca2880
gacaagcaca taataagcag caactaaaag tgatgtatca gaaggacatt taatgctttg2940
gggattgtgc actctgtatt gttagataaa aagacaagtt acaaaagggt atgtttagtt3000
tcatactgac tatgtaacca tgtatgcaca tttttatatt cttaggaact ggaaagtttt3060
acacactgac atactaacag tgattttctc tgggagatac tattatagat tatttatact3120
ttctaatttg ctccttttta cattttccat ttttttccgg ttaactaatt aaatctttta3180
ttcattcaca tgtgtgaggc tagatgttgg gtgttggatg ctgattgagg atgagccagc3240
ccagggggcc tgtccttatg gagcttttag cagggggaag aagctaaaca aaagcaagca3300
aacagaccat gcaattccaa agttgtacta agtacaacct gagaatcttc tttaaggagg3360
tgttgtttac gctaacacct tgggggtcag aagcccgatg agtgaacggc tgtgtgcatg3420
tgctgtggag tggggtgggg ctgggggcgg gcatttcagc gctgggaacg gcacatgcaa3480
aaaccctggg gcaggaagca ctcataacca gtgtctagga tatccttgca atttatttat3540
tccagtatag gtacagcaga tattcttagt gagcatgttc tgtaagaata acgttgtact3600
aggctctgtg agggatataa agacatgcaa catgtggttc tctgttccgt ttcctgccgg3660
tgcgtggctg agtgccagat tagttgctcg ggtggtttgc ggtgtaggaa tgcagaggag3720
actcagtttt gcctttcctg ttcgctaaca cctcctacat ggtgggttgt cttggatgac3780
tagagaggtc atgattgctc agctaatgtt ctctgtggat tgggccattc tcataccata3840
tgtgagtttt acaggctaat cacgaacctg acatagacaa gcatctcctg tgaatattta3900
ttgaagtctc agttagctga attcattagc taagtggcag ctgtctatct tgtctgaaac3960
agttgaagtc agagaaatag tgtctgtttt gagaactatt gtctatcctt ccatttaatt4020
tgtccaacat ttgctagtaa catgccctgt gttagaaact gggcttctct ggtgaactca4080
acgtatcgta aggaacttgt cgttatttga ggggaataag ataatttatg tagttacccc4140
agagacaaga ggagtcagaa atgacaagag aggggaagac agagggatcc tagatttcaa4200
aagaggggca gatcatattt gatcaaaaaa ggcttgagag ggtttcccaa agaaagcggt4260
aataggtagt ccttatggga tgtttaggaa tttgacacag aaatctgctt gaaagaacat4320
tacgggcaga agacatggca tgaacaaagg cacagaggaa ggaaagtggg ggtatgtgta4380
ggccacagaa ctcccgttgt gtggcaatgc tcagtgggag taaggagata aggctggaca4440
gatgggctgg gattgtgtga tggggatact tgtatacgac ggcatcttcg gggaggagca4500
attaaaggtg tttgaggact cagtgatatg aggtgattgt cagaggtctt aagataatta4560
atttggggca gattgtaaaa tgtcactggg ggaagatctg gtgacacgca gacagatcag4620
tagtcttctt cagcctctgt cctgtaagtc tttggaacaa gagaatcaga gtggacagag4680
ccctggaatt ggcgtcagga gagcagggtg tggtcccatc tgtgatgctg actagctggg4740
tcttcttgga ttagtcaccc aacttctaag ctcattttgc aatcgataag gtgggacaat4800
aatacctacc tcaaagggtt gtggtgagtt ctaaatgcaa taactgacat gacagctctt4860
tatgaataaa tgtttatatt aattatgttt tattgtaaca ttataattta tacatatgtc4920
aatcttaatt tggtttattt ttttacctct ttgtttctga aatatagact actatgaatc4980
ctgcagttca gacctacatg attagtatat gttagactgt tgccatttac ggttttaaaa5040
tctttttttt aaaatgattg gatttaaatt cccaccaaaa taatagttgc tatttcattt5100
taacatatat ttttcctctc tctatgatac aggccacccc agtccacccc ctgaaaaaaa5160
ggagctgagg aaagtggccc atttaacagg tctgtatctg gaaggtacag gtgagatttg5220
ggaaagcttt tggcaaaagg caaaatggct gcctggtttc cattaccagg ctctagagag5280
ttgttacttc ctggagacag tatttgaacc caataatact aacacttttc ttgtcgagtc5340
agtcttatga acacactttg atcccctatt ctctgggcaa ggccctcttc taaattggag5400
acctggagct gattatgaca tgacccctgc ccataagaag ctcattcttt tcagtcattc5460
caaagtccct tgggggattg ggggcacaga tccaagaggt gagagatgag aaggtgagga5520
atgaggactt attttagtca gtgctttctt ggttttctgg aagagcttca ctctgctttg5580
tccaagagta taaataggag tgagaaggga gactcaatcc tggcacttgt agagtttcaa5640
tatgtgcctg taaagtggag tgaaatgata tggtatgggc actcccatta taaactacat 5700
aaataatgga ataaatatca cagaaagtgg taggctattg tccctggaat tatttaggca 5760
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atgttgtggg gatacaaaga aaagggaact gtaccccaaa ttgaggggct gaataattct 6000
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tgctagttct gaagatagta aaatctttgt tccagagagc aaatattttc tcaataattt 6180
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ccagctgtca ttctgggtga aacatttgtt gaaggaaggg cccacagttt tgccttagaa 6360
acttagtttg ttggatgcat gactattcct tgttgaaagc tccttttgga tttatttcag 6420
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tatattccaa agtatacttc cggggtcaat cttgcaacaa cctgcccctg agccacaagg 6600
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ttaccagtgc tgatcattta tatgtcaacg tatctgagct ctctctggtc aattttgagg 6780
aatctcagac gtttttcggc ttatataagc tctaa 6815
<210>194
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
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gggattaggc ggccgcaggc ttgttttc 28
<210>195
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
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gatggagaag agtgaggatc ctgtgcttag cag33
<210>196
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<213>人工序列
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<210>197
<211>28
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<213>人工序列
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<210>198
<211>34
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<213>人工序列
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<210>199
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<400>199
aaaaaggatc ctcatttacc cggagacagg ga 3權(quán)利要求
1.分離的蛋白質(zhì)，其具有可測量的理化參數(shù)特征，其中所述的特征表示、關(guān)聯(lián)于一個或多個特征性的藥理學(xué)特性或形成一個或多個特征性的藥理學(xué)特性的基礎(chǔ)，其中所述的分離的蛋白質(zhì)具有包括多個可測量的理化參數(shù){[Px]1、[Px]2、...[Px]n、}的理化特征，其中Px表示可測量的理化參數(shù)且“n”是≥1的整數(shù)，其中[Px]1至[Px]n中的每一個各自為不同的可測量的理化參數(shù)，其中任一個可測量的理化特性的值或一個以上的可測量的理化特性的一系列的值表示、關(guān)聯(lián)于一個特征性的藥理學(xué)特性Ty的基礎(chǔ)或者一系列特征性的藥理學(xué)特性{[Ty]1、[Ty]2、....[Ty]m}或形成一個特征性的藥理學(xué)特性Ty的基礎(chǔ)或者一系列特征性的藥理學(xué)特性{[Ty]1、[Ty]2、....[Ty]m}的基礎(chǔ)，其中Ty表示一個特征性的藥理學(xué)特性且m是≥1的整數(shù)，其中[Ty]1到[Ty]m中的每一個各自為不同的藥理學(xué)特征，其中分離的蛋白質(zhì)選自TNF-α、LT-α、TNFRI-Fc、TNFRII-Fc、0X40-Fc、BAFF、NGFR-Fc和Fas配體。
2.權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)具有一個或多個表2所示的可測量的理化參數(shù)。
3.權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)，其中所述的蛋白質(zhì)具有一個或多個表3中所示的特征性的藥理學(xué)特性。
4.嵌合分子，其包含融合到一個或多個肽、多肽或蛋白質(zhì)部分上的權(quán)利要求1的TNF-α、LT-α、BAFF或Fas配體或其片斷。
5.權(quán)利要求4的嵌合分子，其中，肽、多肽或蛋白質(zhì)部分包括人免疫球蛋白的恒定區(qū)(Fc)或框架區(qū)。
6.權(quán)利要求4的嵌合分子，其中，嵌合分子選自TNF-α-Fc、LT-α-Fc、BAFF-Fc或Fas配體-Fc。
7.藥物組合物，含有權(quán)利要求1至6任一項的分離的蛋白質(zhì)或嵌合分子。
8.權(quán)利要求7的藥物組合物，其中該藥物組合物進一步包含藥學(xué)上可接受的局部用載體。
9.權(quán)利要求8的藥物組合物，其中藥學(xué)上可接受的局部用載體為霜劑或洗劑。
10.權(quán)利要求7到9的藥物組合物，其中嵌合分子為TNFRI-Fc或TNFRII-Fc。
11.在哺乳動物受試者中治療或預(yù)防疾病的方法，其中所述的疾病能夠通過增加蛋白質(zhì)的量或活性來改善，所述的方法包括給予所述哺乳動物受試者有效量的根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的分離的蛋白質(zhì)、權(quán)利要求4至6任一項的嵌合分子或權(quán)利要求7至9的藥物組合物。
12.核苷酸序列，選自SEQ ID No27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、127、129、131、133、135、137、139、141、143、147、149、151、153、155、157、159、163、165、167、169、171、173、175、177、179、183、185、187、189，或與上述列舉的任一序列具有至少大約90％同一性的核苷酸序列，或能與任一上述序列或它們的互補形式在高嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。
13.分離的蛋白質(zhì)或嵌合分子，由選自SEQ ID NO27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、127、129、131、133、135、137、139、141、143、147、149、151、153、155、157、159、163、165、167、169、171、173、175、177、179、183、185、187、189的核苷酸序列所編碼，或由與上述列舉的任一序列具有至少大約90％同一性的核苷酸序列或能與任一個上述序列或任一它們的互補形式在高嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列所編碼。
14.分離的核苷酸分子，編碼蛋白質(zhì)或嵌合分子或其功能部分，包括與SEQ ID NO27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、127、129、131、133、135、137、139、141、143、147、149、151、153、155、157、159、163、165、167、169、171、173、175、177、179、183、185、187、189具有至少90％的相似性的核苷酸序列，或最佳比對后和/或能夠與SEQ ID NO27、29、31、33、35、37、39、43、45、47、49、51、53、55、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、109、111、113、115、117、119、121、127、129、131、133、135、137、139、141、143、147、149、151、153、155、157、159、163、165、167、169、171、173、175、177、179、183、185、187、189或它們的互補形式的一個或多個在高嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。
15.分離的核苷酸分子，包括編碼具有基本上如SEQ ID NO28、30、32、34、36、38、40、44、46、48、50、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、128、130、132、134、136、138、140、142、144、148、150、152、154、156、158、160、164、166、168、170、172、174、176、178、180、184、186、188、190的一個或多個所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或嵌合分子的核苷酸序列，或編碼與SEQ ID NO28、30、32、34、36、38、40、44、46、48、50、52、54、56、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、90、92、94、96、98、100、102、104、106、108、110、112、114、116、118、120、122、128、130、132、134、136、138、140、142、144、148、150、152、154、156、158、160、164、166、168、170、172、174、176、178、180、184、186、188、190最佳比對后的一個或多個具有至少大約90％相似性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)或嵌合分子的核苷酸序列。
16.一種試劑盒，用于測定生物制品中存在的人細(xì)胞表達的人蛋白質(zhì)或嵌合分子的水平，包括(a)固相支持基質(zhì)；(b)一種或多種抗根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項的人蛋白質(zhì)或根據(jù)權(quán)利要求4至6任一項的嵌合分子的抗體；(c)封閉溶液；(d)一種或多種底物貯液；(e)底物緩沖溶液；(f)標(biāo)準(zhǔn)人蛋白質(zhì)或嵌合分子樣品和(g)使用說明書。
17.權(quán)利要求16的試劑盒，其中標(biāo)準(zhǔn)人蛋白質(zhì)或嵌合分子樣品是權(quán)利要求2至3任一項的分離的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求4的嵌合分子的制品。
18.權(quán)利要求16或17的試劑盒，其中每一種抗體衍生自用包含權(quán)利要求2或3任一項的分離的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求4的嵌合分子的制品對哺乳動物的免疫。
19.權(quán)利要求16至18的試劑盒，其中人細(xì)胞表達的人蛋白質(zhì)是天然存在的TNF-α、LT-α、TNFRI、TNFRII、OX40、BAFF、NGFR或Fas配體。
20.治療病癥的方法，所述病癥的特征是個體中的TNF-α水平過量，或者所述病病因個體中的TNF-α的水平過量而加劇，或者與TNF-α有關(guān)，所述方法包括向個體局部地施用治療有效量的權(quán)利要求10的藥物組合物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中，疾癥選自牛皮癬、Behcet氏病、大皰皮炎、濕疹、霉菌感染、麻風(fēng)病、嗜中性皮炎、斑點糠疹(或玫瑰糠疹)、黑質(zhì)糠疹(或掌黑癬)、毛發(fā)紅糠疹、全身性紅斑狼瘡、原發(fā)性小血管炎和中毒性表皮壞死松解癥、皮膚紅斑、糜爛、潰瘍、剝落、片落、干燥、成疤、結(jié)硬皮、皮膚分泌或滲出或使用如Aladara膏的治療引起的任何副作用。
全文摘要
本發(fā)明概括地涉及蛋白質(zhì)學(xué)、診斷學(xué)、治療學(xué)和營養(yǎng)學(xué)領(lǐng)域。尤其是本發(fā)明提供了屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族或與其相關(guān)的分離的蛋白質(zhì)分子或其中至少包含一部分該蛋白質(zhì)分子的嵌合分子，所述分離的蛋白質(zhì)分子，例如TNF-α、淋巴毒素-α(LT-α)、TNFR-I、TNFR-II、OX40、BAFF、NGFR、Fas配體；所述嵌合分子，如TNF-α-Fc、LT-α-Fc、TNFR-I-Fc、TNFR-II-Fc、OX40-Fc、BAFF-Fc、NGFR-Fc、Fas配體-Fc，其中蛋白質(zhì)或其嵌合分子具有可測量的理化參數(shù)特征，其中該特征表示、關(guān)聯(lián)于一個或多個藥理學(xué)特性或形成一個或多個藥理學(xué)特性的基礎(chǔ)。本發(fā)明進一步設(shè)想將分離的蛋白質(zhì)或其嵌合分子用于診斷、預(yù)防、治療、營養(yǎng)和/或研究應(yīng)用范圍中。
文檔編號C07K14/435GK101160322SQ200680008082
公開日2008年4月9日申請日期2006年1月27日優(yōu)先權(quán)日2005年1月28日
發(fā)明者J·D·普里斯特, A·D·沃茨, J·S·惠特克, T·A·多馬加拉, G·R·皮爾金頓, I·貝姆, C·M·Y·李, 林美安, N·S·托馬斯申請人:阿波羅生命科學(xué)有限公司

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