專利名稱：：增加膠原或透明質(zhì)酸生產(chǎn)的肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及具有特定氨基酸序列的新肽，或者它的衍生物或鹽。此外，本發(fā)明涉及含有該新肽等的組合物，利用該新肽等的方法，該新肽等的用途，編碼該新肽等的多核苷酸。本發(fā)明的新肽或者它的衍生物或者鹽可以用于增強(qiáng)選自細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
：通常，已經(jīng)知道動物的結(jié)締組織含有作為其主要成分的膠原、透明質(zhì)酸、彈性蛋白、硫酸軟骨素、硫酸乙酰肝素、疏酸皮膚素、層粘連蛋白等等。在它們中間，膠原和透明質(zhì)酸在結(jié)締組織中起重要作用，如下文描述。換句話說，膠原是組成動物的結(jié)締組織的主要蛋白質(zhì)，且具體地，膠原占人體總蛋白質(zhì)的近30%。因?yàn)槟z原的主要功能在于形成活組織的骨骼結(jié)構(gòu)，所以膠原廣泛分布于皮膚、軟骨組織、角膜、心臟、肝等等中，作為構(gòu)成動物的組織形式的骨骼結(jié)構(gòu)的主要組分。因?yàn)槟z原特異性地作用于各種類型細(xì)胞的粘附，和細(xì)胞的分化或增殖，而且也具有作為細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)因子的作用，所以膠原的減少可以引起各種疾病，如角膜病癥，如角膜潰瘍，關(guān)節(jié)病癥，如風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎，和在一些情況中引起炎性疾病。在皮膚真皮細(xì)胞外基質(zhì)中，從膠原纖維形成網(wǎng)絡(luò)束維持組織形狀。當(dāng)膠原纖維成熟并增殖而繼續(xù)進(jìn)行交聯(lián)形成時，得到厚和直的膠原纖維束，其又在年輕皮膚中產(chǎn)生合適的皮膚繃緊度(tautness)。然而，在衰老皮膚中，隨著成纖維細(xì)胞活性(例如，膠原生產(chǎn)活性等等)的降低，因?yàn)檎嫫ぜ?xì)胞外基質(zhì)中膠原纖維顯著減少和形成異常的老化交聯(lián)，所以皮膚變得僵硬，并且原來富有彈性的皮膚繃緊度出現(xiàn)不希望看到的損失。結(jié)果，在皮膚中形成皺紋和下垂。已經(jīng)詳細(xì)研究了光老化對無毛小鼠的月交原纖維束結(jié)構(gòu)的改變(見Jowm"/，4，36-37,1998)。結(jié)果表明在用UVB照射的無毛小鼠中，形成了皺紋，膠原纖維束被破壞，并且皮膚彈性降低，從而與皺紋的形成匹配。此外，還已知膠原在持水功能中很出色。為了改善膠原減少引起的狀態(tài)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了各種增強(qiáng)膠原合成的物質(zhì)。例如，已知視黃酸(見，例如R.Marks等人，5n'fe/zJowr"a/o/Dwm^o/ogy,122,91-98，1990)，含有由甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸組成的三種氨基酸的制劑(見例如，日本專利公開號Hei7-194375),來自甘草、桑才對樹皮、,薈、問荊(A《w^Wwwarvewse)、金4艮花(Loniceraeflos)、黃檗樹皮、魁蒿(」Wem/wV^n'"ce;w)、龍膽等等的植物提取物(見例如，日本專利公開號2001-206835),TGF-0,抗壞血酸等等。此外，作為增強(qiáng)膠原合成的另一種物質(zhì)，已知由I型前膠原的182到241位氨基酸殘基組成的肽(見例如，K.Katayama等人，j5/oc/^m/^o;，30，7097-7104,1991),和選自由I型前膠原的182到241位氨基酸殘基組成的上述肽的Lys-Thr-Thr-Lys-Ser肽(見例如，K.Katayama等人，歷o/.C/^m.，268(14),9941-9944,1990)。另一方面，透明質(zhì)酸是一類酸性粘多糖，其存在于皮膚、軟骨、關(guān)節(jié)液、臍帶、眼玻璃體或者其他結(jié)締組織中。尤其在皮膚表皮中，已知透明質(zhì)酸廣泛分布于基底層到顆粒層，并且透明質(zhì)酸支持表皮細(xì)胞外空間的結(jié)構(gòu)，并且參與諸如營養(yǎng)物或者廢物的物質(zhì)從表皮基底層到角質(zhì)細(xì)胞層的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且用于觸發(fā)增強(qiáng)表皮細(xì)胞的周轉(zhuǎn)。此外，已經(jīng)知道透明質(zhì)酸具有強(qiáng)的水保持作用，可以在僅lg透明質(zhì)酸中保持約6L水，并且通過該作用，透明質(zhì)酸在細(xì)胞間隙中起保持水分的作用。已知透明質(zhì)酸隨著老化逐漸減少，且該減少與膠原的情況一樣，也是導(dǎo)致皮膚老化，例如形成皮膚皺紋和皮膚下垂、皮膚彈性和皮膚繃緊度下降、皮膚干燥或皮膚粗糙的原因之一。然而，透明質(zhì)酸是一種聚合物化合物，從而不容易從皮膚外部向表皮提供透明質(zhì)酸，并且為了對諸如表皮細(xì)胞之間的部分提供透明質(zhì)酸，重要的是增強(qiáng)活體內(nèi)透明質(zhì)酸的生物合成。為了改善透明質(zhì)酸減少引起的狀態(tài)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)透明質(zhì)酸合成的各種物質(zhì)。例如，已知蘆薈提取物、秋葵提取物、水溶性e-l,3-葡聚糖衍生物、酵母提取物(日本專利公開號2004-051533)、屬于楷膜藻科(Kallymeniaceae)Callophyllis屬的海藻類提取物(日本專利公開號2000-136147)、熏衣草提取物(日本專利公開號Hei10-182402)、屬于叢梗藻科(Durvilleaceae)Durvillea屬的海藻類提取物(日本專利公開號Hei09-176036)。發(fā)明概述以希望開發(fā)一種新的材料，其是安全的并且能夠顯著增強(qiáng)選自膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)。鑒于上述傳統(tǒng)技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的是提供新的材料，其是安全的并且能夠顯著增強(qiáng)選自膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)。由于對解決上述問題的深入研究的結(jié)果，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有特定氨基酸序列的新肽可以用作新的材料，其是安全的并且能夠顯著增強(qiáng)選自膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)。從而完成了本發(fā)明。具體地，本發(fā)明的要點(diǎn)涉及[1]式(I)代表的肽Leu-Glu-His(1)，或者它的衍生物，或者其鹽；[2]肽，其在如上面[l]中定義的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸的替代和/或添加，并且其能夠增強(qiáng)選自細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)，或者它的衍生物或者其鹽，附帶條件是該肽不含有Lys-Thr-Thr~Lys-Ser;[3]式(II)代表的肽Leu-Glu畫His隱Ala(SEQIDNO:1)(11)，或者它的衍生物，或者其鹽；[4]式(III)代表的肽Leu畫Glu-Lys-Ala(SEQIDNO:18)(III),或者它的衍生物，或者其鹽；[5]式(IV)代表的肽Leu-Asp畫His曙Ala(SEQIDNO:19)(IV)，或者它的衍生物，或者其鹽；[6]式(V)代表的肽Leu國Glu畫ffis-Ala-Phe(SEQIDNO:20)(V)，或者它的衍生物，或者其鹽；[7]含有如上面[1]到[6]的任一項(xiàng)定義的肽或它的衍生物或者其鹽的組合物；[8]用于增強(qiáng)選自細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)的方法，其通過使用如上面[1]到[6]的任一項(xiàng)定義的肽或它的衍生物或者其鹽或者如上面[7]中定義的組合物實(shí)現(xiàn)；[9]如上面[1]到[6]的任一項(xiàng)定義的肽或它的衍生物或者其鹽在生產(chǎn)用于增強(qiáng)選自細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)的組合物中用途；[10]由編碼如上面[1]到[6]的任一項(xiàng)定義的肽的核普酸序列組成的多核苷酸；[11]由編碼如上面[1]到[6]的任一項(xiàng)定義的肽的核普酸序列的反義序列組成的多核普酸；[12]含有如上面[10]或者[11]定義的多核苷酸的質(zhì)粒；[13]含有如上面[10]或者[11]定義的多核苦酸的表達(dá)載體；和[14]含有如上面[10]或者[11]定義的多核苦酸的轉(zhuǎn)化體。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提供了能夠增強(qiáng)選自膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)的新的材料。此外，已顯示本發(fā)明的肽或者它的衍生物或者其鹽當(dāng)作用于細(xì)胞時不顯著減少細(xì)胞數(shù)目。因此，根據(jù)本發(fā)明，提供了新的肽或者它的衍生物或者其鹽，其能夠增強(qiáng)選自膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)，并且可以安全^f吏用而不顯示出細(xì)胞毒性。本發(fā)明提供了式(I)代表的肽Leu-Glu-His，或者它的衍生物或者其鹽。本發(fā)明還提供了肽，其特征是該肽在式(I):Leu-Glu-His代表的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸的替代和/或添加，并且能夠增強(qiáng)選自細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)(其中該肽不含有Lys-Thr-Thr-Lys-Ser)，或它的衍生物或者其鹽。在本說明書中，"肽的衍生物"指例如，通過肽的乙酰化、棕櫚酰化、十四烷基化、酰胺化、丙烯酸酯化(acrylation)、丹石黃?；⑸锼鼗?、磷酸化、琥珀酰化、iV-(某)酰苯胺(anilide)形成、芐氧羰基化、甲?；?、硝化、磺化、醛形成、環(huán)化、糖基化、一甲基化、二曱基化、三甲基化、胍基化、amidination、馬來?；⑷阴；?、氨曱酰化、三硝基苯基化、nitrotroponylation或者乙酰乙?；鹊玫降难苌铩Ｆ渲?，棕櫚?；莾?yōu)選的，因?yàn)轭A(yù)期它能增加對細(xì)胞的通透性，并且N-末端的乙酰化、C-末端的酰胺化和C-末端的甲基化也是優(yōu)選的，因?yàn)轭A(yù)期它們賦予對從末端降解肽的外肽酶的抗性，并從而增加活體中的穩(wěn)定性。在本說明書中，"鹽"指肽或者它的衍生物的任何可藥用鹽(包括無機(jī)鹽和有機(jī)鹽)，并且包括例如，肽或者它的衍生物的鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽、銨鹽、鹽酸鹽、疏酸鹽、硝酸鹽、有機(jī)鹽(乙酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、蘋果酸鹽、草酸鹽、乳酸鹽、琥珀酸鹽、延胡索酸鹽、丙酸鹽、曱酸鹽、苯曱酸鹽、苦味酸鹽、苯磺酸鹽等等)等等，優(yōu)選地銨鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽和乙酸鹽，更優(yōu)選銨鹽和乙酸鹽。氨基酸的替代優(yōu)選為但不具體限于，保守氨基酸替代，即，氨基酸的保守替代。在本說明書中，術(shù)語"氨基酸的保守替代"指下面表l中所示的每組中氨基酸之間的替代。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>酸(M)、蘇氨酸(T)其中，氨基酸的優(yōu)選的保守替代包括天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)之間的替代，精氨酸(R)、賴氨酸(K)和組氨酸(H)之間的替代，色氨酸(W)和苯丙氨酸(F)之間的替代，苯丙氨酸(F)和纈氨酸(V)之間的替代，亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)和丙氨酸(A)之間的替代，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)之間的替代，等等。一個或多個氨基酸的(保守)替代優(yōu)選地指一個或幾個氨基酸的(保守)替代，更優(yōu)選地1到3個氨基酸的(保守)替代，更優(yōu)選1到2個氨基酸的(保守)替代，甚至更優(yōu)選1個氨基酸的(保守)替代。一個或多個氨基酸的添加指加入優(yōu)選1到22個氨基酸，更優(yōu)選1到12個氨基酸，甚至更優(yōu)選1到5個氨基酸，甚至更優(yōu)選1到3個氨基酸，還更優(yōu)選1到2個氨基酸。在Leu-Glu-His(下文中稱作LEH，如在一些情況中，氨基酸的單字母密碼所示)中具有一個或多個氨基酸的保守替代和/或添加的肽包括，但不限于，例如，含有一個或多個氨基酸的保守替代的那些肽(例如，IEH、LDH、LDK、LEK等等)，和向LEH序列加入一個或多個氨基酸的那些肽(例如，LEHA、LEHW、LEHF、LEHV、LEHL、LEHI、LEHM、LEHG、LEHS、LEHT、ALEH、GLEH、SLEH、MLEH、TLEH、LEHAW、LEHAF、LEHAV、LEHAL、LEHAI、LEHAM、LEHAG、LEHAS、LEHAT、ALEHA、GLEHA、SLEHA、MLEHA、TLEHA、FLEHA、SLEHHT、GLEHAL、DLEHAL、QLEHAK、SLEHAD、QLEHAR、EFLEHA、LEHAVV、DPELEHA、HLEHAAS、LEHASVD等)等等。其中，優(yōu)選的肽包括IEH、LDH、LDK、LEK、LEHA、LEHF、LEHG、LEHAF、FLEHA、SEEHHT、GLEHAL、DLEHAL、QLEHAK、SLEHAD、QLEHAR、EFLEHA、LEHAVV、DPELEHA、HLEHAAS、LEHASVD等等，且更優(yōu)選地，肽是LEHA和LEHAF。此外，在LEH肽中具有一個和多個氨基酸的保守替代和添加的肽包括j旦不限于作為優(yōu)選的實(shí)例的例如，IEHA、LDHA、LDKA、LEKA等等。此類肽的更優(yōu)選的實(shí)例包括在LEHA肽中具有一個和多個氨基酸的替代和/或添加的肽，更優(yōu)選在LEHA肽中具有一個和多個氨基酸的保守替代和/或添加的肽。這里，一個和多個氨基酸的(保守)替代和/或添加具有與上文所述的相同的含義。此外，從在LEH肽中具有一個和多個氨基酸的保守替代和/或添加的肽中缺失一個或幾個氨基酸的肽也包括在本發(fā)明的肽中，只要該肽能夠增強(qiáng)細(xì)胞中的膠原或者透明質(zhì)酸的生產(chǎn)。此類肽包括例如，EHA、LHA、LEA等等，其是從LEHA肽缺失一個氨基酸的肽。在本說明書中，術(shù)語"能夠增強(qiáng)選自細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)"指當(dāng)目的肽或者它的衍生物或者其鹽作用于細(xì)胞時，與目的肽或者它的衍生物或者其鹽不作用于細(xì)胞的情況相比，細(xì)胞中膠原、透明質(zhì)酸或者兩者的生產(chǎn)的量增加了。該術(shù)語指例如，當(dāng)目的肽或者它的衍生物或者其鹽在人細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)的測試中以10pg/ml的濃度作用時，與目的肽或者它的衍生物或者其鹽不作用的情況相比，細(xì)胞中膠原的生產(chǎn)量達(dá)到例如，約110%或以上，更優(yōu)選約120%或以上，甚至更優(yōu)選約130%或以上。該術(shù)語也指，例如，當(dāng)目的肽等以100pg/ml的濃度作用時，與目的肽等不作用的情況相比，細(xì)胞中透明質(zhì)酸的生產(chǎn)量達(dá)到例如，約110%或以上，更優(yōu)選約120%或以上，甚至更優(yōu)選約130%或以上。在特定實(shí)施方案中，關(guān)于上述術(shù)語的細(xì)胞指成纖維細(xì)胞或者角質(zhì)形成細(xì)胞，且在另一特定實(shí)施方案中，指皮膚成纖維細(xì)胞或表皮角質(zhì)形成細(xì)胞。可以以本領(lǐng)域中已知的方法制備本發(fā)明的肽。例如，可以通過化學(xué)合成方法(例如，固相方法(例如，F(xiàn)moc方法)、液相方法等等)合成本發(fā)明的肽，或者可以通過如重組表達(dá)的方法制備本發(fā)明的肽。組成本發(fā)明的肽的氨基酸可以是L-或者D-型，優(yōu)選L-型。此外，通過已知的方法，如蛋白酶處理，從含有目的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的氨基酸序列切出由目的氨基酸序列組成的肽，也可以制備本發(fā)明的肽。例如，含有LEH序列和LEHA序列的蛋白質(zhì)包括如下面表2中顯示的蛋白質(zhì)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>ga〃o戸由"D618-621(seqidno:17)在考慮到蛋白酶的序列特異性等的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)?shù)剡x擇適于從含有目的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的氨基酸序列切出由目的氨基酸序列組成的肽的蛋白酶。例如為了從來自胡蘿卜的上述序列(SEQIDNO:6)切出LEH序列和/或LEHA序列，切出方法例如可以為并用嗜熱菌蛋白酶(來自Sac/〃w^zwmo/7ro^o(y"cwj和月夷凝乳蛋白酶(來自牛胰)，等等。此外，例如，為了從上述來自馬鈴薯的序列(SEQIDNO:8)切出LEH序列和/或LEHA序列，方法可以為例如伴隨使用蛋白酶M"Amano"G(來自米曲霉(A^erg"/^oo;zm):AmanoEnzyme,Inc.生產(chǎn))和上述嗜熱菌蛋白酶等等。此夕卜，例如，為了從上述來自稻的序列(SEQIDNO:9)切出LEH序列和/或LEHA序列，方法可以為例如伴隨使用上述蛋白酶M"Amano"G和上述嗜熱菌蛋白酶，等等。此外，例如，為了從上述來自大豆的序列(SEQIDNO:10)切出LEH序列和/或LEHA序列，方法例如可以為使用上述嗜熱菌蛋白酶等等。此外，例如，為了從上述來自菜豆的序列(SEQIDNO:11)切出LEH序列和/或LEHA序列，方法可以為例如伴隨使用上述胰凝乳蛋白酶和上述嗜熱菌蛋白酶，等等。此外，例如，為了從上述來自木薯的序列(SEQIDNO:12)切出LEH序列和/或LEHA序列，方法可以為例如伴隨使用上述胰凝乳蛋白酶和上述嗜熱菌蛋白酶，等等。此外，例如，為了從上述來自日本叉牙七鰓鰻的序列(SEQIDNO:16)切出LEH序列和/或LEHA序列，方法可以為例如伴隨使用胰蛋白酶(來自豬胰)和上述嗜熱菌蛋白酶，等等。含有目的氨基酸序列的蛋白質(zhì)和蛋白酶的組合不限于上述組合，并且優(yōu)選組合包括大豆蛋白(來自大豆的蛋白質(zhì))和嗜熱菌蛋白酶的組合。當(dāng)用蛋白酶水解蛋白質(zhì)時，使用的反應(yīng)條件不受特別限制，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)普通技術(shù)知識選擇。例如，當(dāng)使用市售的蛋白酶時，可以根據(jù)其使用說明選擇反應(yīng)條件。通?？梢允褂?0。C到80°C,優(yōu)選40。C到70。C,更優(yōu)選50。C到6(TC的反應(yīng)溫度。此外，通常，可以使用2到30小時，優(yōu)選3到24小時，更優(yōu)選10到20小時，尤其優(yōu)選12到18小時的反應(yīng)時間。反應(yīng)pH優(yōu)選所使用的蛋白酶的大約最佳的pH。結(jié)束反應(yīng)的方法也不受特別限制，并且可以使用已知的方法。此類方法包括例如，熱處理，如85。C加熱15分鐘或者100。C加熱5分鐘，等等。用蛋白酶水解處理后，根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法，通過純化可以得到目的肽。作為此類已知的方法，例如，可以使用強(qiáng)酸離子交換樹脂、十八烷基二氧化硅(octadecylsilica)(ODS)樹脂等等。例如，通過將用蛋白酶處理過的肽的水溶液吸附到ODS樹脂，并用任意濃度的有機(jī)溶劑(例如，乙腈等)洗脫肽，可以純化目的肽。另一方面，例如，通過將用蛋白酶處理的肽的水溶液吸附到強(qiáng)酸離子交換樹脂，并用鹽濃度為0.18M到0.25M，更優(yōu)選0.20M到0.23M的洗脫物(例如，氯化鈉、氯化鉀溶液等等)洗脫肽，可以純化目的肽。從而，與通過化學(xué)合成方法生產(chǎn)的情況相比，從成本觀點(diǎn)看，用蛋白酶水解天然蛋白質(zhì)得到的肽是有利的。此外，據(jù)認(rèn)為通過用蛋白酶水解天然肽得到的肽對于活體更安全。因此，所得到的肽適用于內(nèi)用藥、食物、敏感性皮膚的化妝品、飼料等等，其對活體的應(yīng)用需要較高的安全性。通過本領(lǐng)域中已知的方法可以制備本發(fā)明肽的書f生物。例如，該方法示例如下，其中以LEH肽的N-末端乙酰化為例(根據(jù)Fmoc方法進(jìn)4亍的固相合成方法(L.A.Carpino,G.Y.Han,C/zem.Soc.,92,5748(1970))。首先，將Fmoc-His(l-Trt)-OH的C-末端結(jié)合到用于固相合成的樹脂，之后通過哌啶處理除去保護(hù)基(Fmoc)。隨后，將得到的樹脂中和并洗滌，并向His的N-末端引入Fmoc-Glu(OtBu)-OH。其次，通過哌啶處理除去保護(hù)基(Fmoc),并再次中和和洗滌得到的樹脂。之后，向Glu的N-末端引入N-乙酰-亮氨酸。從所得的樹脂切出肽鏈，并通過用TFA(三氟乙酸)解理His的Trt基團(tuán)和Glu的tBu基團(tuán)進(jìn)行去保護(hù)。最后，通過制備型HPLC除去未反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行純化，以得到N-末端乙?；腖EH。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白通過適當(dāng)修改上述方法可以制備任意衍生物，并且例如，當(dāng)制備N-末端棕櫚酰化的LEH時，可以將上述N-乙酰-亮氨酸改變成N-棕櫚酰-亮氨酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本領(lǐng)域中已知的任一種方法可以容易地制備本發(fā)明的肽的鹽。所得到的本發(fā)明的肽或者它的衍生物或其鹽可以用于增強(qiáng)選自細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)。如下面的實(shí)施例所示，證實(shí)在添加此類肽或者它的衍生物或其鹽的培養(yǎng)溶液中培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞中I型膠原的生產(chǎn)量增加，并且在該培養(yǎng)溶液中培養(yǎng)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞導(dǎo)致細(xì)胞中透明質(zhì)酸生產(chǎn)的量增加。本發(fā)明還提供了組合物，其特征在于該組合物含有上述肽或者它的4汙生物或其鹽。由于此類特征，該組合物可以例如合適地用作藥物組合物、食物、化妝品或飼料，且此外，用作用于闡明與膠原或透明質(zhì)酸有關(guān)的生理狀況的研究試劑。藥物組合物包括例如，以人為代表的哺乳動物中膠原和/或透明質(zhì)酸的量減少導(dǎo)致的疾病的治療劑或預(yù)防劑。具體地，本發(fā)明的組合物可以合適地用作關(guān)節(jié)疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎的治療劑和/或預(yù)防劑，或者用作用于由于暴露于紫外線、老化等等引起的皺紋或者皮膚下垂的預(yù)防劑和/或治療劑，和另外用作皮膚的彈性或者繃緊度下降的預(yù)防劑和/或治療劑。食物包括例如，用于改善或預(yù)防以人為代表的哺乳動物中膠原和/或透明質(zhì)酸的量減少引起的狀況的食物。具體地，本發(fā)明的組合物可以合適地用作改善或預(yù)防諸如關(guān)節(jié)痛的癥狀的食物，或者用作用于改善或預(yù)防由于暴露于紫外線、老化等等引起的皺紋或者皮膚下垂的食物?？赹'、，-、'、又，化妝品包括例如，用于預(yù)防和/或改善由于暴露于紫外線、老化等等引起的皺紋或者皮膚下垂的化妝品，和用于預(yù)防和/或改善皮膚的彈性或者繃緊度下降的化妝品。飼料包括例如，用于改善或預(yù)防家畜如牛、豬、家禽、羊和馬或者寵物動物如狗和貓中膠原和/或透明質(zhì)酸的量減少導(dǎo)致的狀況的飼料。具體地，本發(fā)明的組合物可以合適地用作改善或預(yù)防膠原和/或透明質(zhì)酸的量減少導(dǎo)致的各種疾病的飼料，所述疾病為諸如角膜病癥，如角膜潰瘍，關(guān)節(jié)病癥，如風(fēng)濕病、關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎，和炎性疾病。肽等等的類型、組合物的劑量開;式等等而變。通^常，從得到增強(qiáng)膠原和/或透明質(zhì)酸生產(chǎn)的顯著作用的觀點(diǎn)看，含量優(yōu)選為按重量計(jì)o.oooi到70%,更優(yōu)選按重量計(jì)0.001到50%，甚至更優(yōu)選按重量計(jì)0.001到20%，更優(yōu)選按重量計(jì)0.01到10%,還優(yōu)選按重量計(jì)0.05到10%,更優(yōu)選按重量計(jì)0.12到10%。通過在可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)的范圍內(nèi)，合適地組合通常用于制劑、食物等領(lǐng)域中的載體、基質(zhì)和/或添加劑和上述肽或者它的衍生物或者其鹽，可以制備本發(fā)明的組合物。在一個實(shí)施方案中，通過組合通過一次純化上述肽或者它的衍生物或者其鹽得到的純化物來制備本發(fā)明組合物，以便具有例如按重量計(jì)0.05%或以上，優(yōu)選按重量計(jì)0.08%或以上，更優(yōu)選按重量計(jì)0.1%或以上，甚至更優(yōu)選按重量計(jì)0.12%或以上的濃度，以便具有上述含量。載體可以與例如糖(例如，甘露糖醇、乳糖、葡聚糖等等)、纖維素(例如，羥丙基纖維素、曱基纖維素、結(jié)晶纖維素等等)、弱水溶性樹膠(例如，阿拉伯樹膠、西黃蓍膠等等)、交聯(lián)的烯類聚合物、脂類等等的一種或多種組合使用。基質(zhì)可以與例如水、脂肪和油、礦物油、蠟、脂肪酸、硅酮油、固醇、酯、金屬皂、醇等等的一種或多種組合使用。添加劑可以與例如表面活性劑、增溶組分、乳化劑、油性組分、穩(wěn)定劑、增稠劑、防腐劑、粘合劑、潤滑劑、分散劑、pH調(diào)節(jié)劑、增濕劑(moisturizer)、紫外線吸收劑、螯合劑、經(jīng)皮吸收增強(qiáng)劑、抗氧化劑、崩解劑、增塑劑、緩沖劑、維生素、氨基酸、著色劑、加香劑等等的一種或多種組合使用。此外，如果需要，為了加入其他有用的作用，本發(fā)明的組合物可以含有一種或多種各種組分的組合，如皮膚增白組分、抗炎組分、抗生素組分、細(xì)胞激活組分、收斂劑組分、抗氧化劑組分、痤瘡改善性組分、用于增強(qiáng)生物學(xué)組分如膠原的合成的組分、增強(qiáng)循環(huán)的組分、增濕的組分和抗老化組分。本發(fā)明的組合物可以采取任一種劑量形式，如用于外用劑(包括化妝品)，用于內(nèi)用劑(包括食物和祠料)等等，并且可以優(yōu)選地作為外用劑使用。用于外用劑可以以任意形式使用，如液體、乳劑、乳膏、洗劑、糊劑、奶油凍、凝膠、片(通過基質(zhì)支持)、氣溶膠和噴霧劑?；瘖y品可以以任意形式使用，如用于基本皮膚護(hù)理的化妝品，如洗劑、乳劑、乳膏、油和面膜，以及化妝品，如粉底、胭脂和口紅，以及另外的清潔制劑，如洗面劑(facewash)、清潔制劑和身體清潔制劑，和;木浴劑。用于內(nèi)用劑(包括食物和飼料)可以以任何形式使用，例如，片劑、丸劑、顆粒、細(xì)小顆粒、粉末、硬膠嚢、軟膠嚢、干燥糖漿、溶液(包括可飲用的制劑、懸浮液和糖漿)、凝膠制劑、脂質(zhì)體制劑、提取制劑、酊劑、清涼劑制劑和膠凍制劑。此外，對于食物的情況，組合物可以以食物的任一種通常的形式提供，如面包、面條、現(xiàn)成的食物、加工的肉產(chǎn)品(例如，火腿、香腸等等)、加工的海產(chǎn)品、調(diào)味品(例如，色拉調(diào)料等等)、乳制品、糖食(例如，餅干、糖果、果凍、冰洪淋等等)、湯和汁。當(dāng)生產(chǎn)成這種形式時，取決于目的食物的性質(zhì)等等，通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知、、飼;;受:體限制Z因?yàn)轱?十可以以任一種i式使用。本發(fā)明的組合物可以用于增強(qiáng)選自細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)，其中利用上述肽或者它的衍生物或者其鹽增強(qiáng)細(xì)胞中膠原和/或透明質(zhì)酸生產(chǎn)的能力。本發(fā)明還提供了增強(qiáng)選自細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)的方法，其特征在于使用上述肽或者它的衍生物或者其鹽或者上述組合物。在本發(fā)明的方法中，上述肽或者它的衍生物或者其鹽或者上述組合物可以以有效量或者以上的量用于得到增強(qiáng)選自膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)的作用。具體地，用于本發(fā)明方法中的上述肽或者它的衍生物或者其鹽的量在用于外用劑的情況中，通常優(yōu)選為約0.1ng到2g/天/體重約S0kg的成年人。在用于內(nèi)用劑的情況中，體重約50kg的成年人的用量通常優(yōu)選為約0.001mg到10，000mg/天，更優(yōu)選約1到l，OOOmg/天，甚至更優(yōu)選約1到100mg/天。鹽或者上述組合物的步驟。在該種:清況下,'應(yīng)s用于皮膚的上述^或者它的^f汙生物或者其鹽的量優(yōu)選為約lng到500yg/cn^，更優(yōu)選約0.01到50yg/cm2，甚至更優(yōu)選約0.1到10yg/cm2。本發(fā)明還提供了上述肽或者它的衍生物或者其鹽在生產(chǎn)用于增強(qiáng)選自細(xì)月包中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)的組合物中的用途，所述組合物優(yōu)選可以用作用于外用劑的組合物?？梢允褂蒙鲜鲭幕蛘咚难苌锘蛘咂潲}，從而使得在組合物中具有上述含量。本發(fā)明還提供了多核苷酸，其特征是該多核苦酸由編碼上述肽的核苦酸序列組成。本發(fā)明的多核苷酸不受具體限制，只要該多核苷酸編碼上述肽。例如，作為編碼LEHA的多核香酸，根據(jù)遺傳密碼表，顯然編碼LEHA的任何序列都可以合適的使用，這取決于密碼子選擇等等。優(yōu)選地，通過下面的序列示例該多核苷酸TTGGAACATGCG(SEQIDNO:2)TTGGAACATGCA(SEQIDNO:3)CTTGAACACGCG(SEQIDNO:4)CTGGAGCACGCA(SEQIDNO:5)可以通過本領(lǐng)域中已知的方法制備本發(fā)明的多核苷酸。例如，使用通過商業(yè)途徑可獲得的DNA合成儀(例如，AppliedBiosystems3400DNA合成儀，AppliedBiosystems生產(chǎn))，可以制備該多核苷酸。使用如上述得到的多核苷酸，可以制備如下述的質(zhì)?；蛘弑磉_(dá)載體。本發(fā)明還提供了多核苷酸，其特征是該多核普酸由編碼上述肽的核香酸序列的反義序列組成。此類多核苷酸也可以以與如上述相同的方式制備。本發(fā)明的多核苷酸可以用于通過基因工程或者在基因療法等等中表達(dá)上述肽，或者作為闡明與膠原或者透明質(zhì)酸有關(guān)的生理狀況的試劑。此外，使用此類多核苷酸，可以制備下述本發(fā)明的質(zhì)?；蛘弑磉_(dá)載體。本發(fā)明還提供了質(zhì)粒，其特征是該質(zhì)粒含有上述多核苷酸。使用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一般技術(shù)，通過將本發(fā)明的多核普酸整合入已知的質(zhì)粒，可以制備本發(fā)明的質(zhì)粒，所述已知的質(zhì)粒包括但不具體限于，例如，pBR質(zhì)粒、pUC質(zhì)粒等等。本發(fā)明還提供了表達(dá)載體，其特征是該表達(dá)載體含有本發(fā)明的多核苦酸。使用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的一般技術(shù)，通過將本發(fā)明的多核苦酸整合入已知的載體，從而使得該多核苷酸可以表達(dá)，可以制備本發(fā)明的表達(dá)載體，所述已知的載體包括但不具體限于，例如，pcDNA3、pSD64、人謹(jǐn)菌體載體等等。使用如上述得到的質(zhì)粒或表達(dá)載體，可以制備如下述的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明還提供了轉(zhuǎn)化體，其特征是該轉(zhuǎn)化體含有上述多核苷酸。通過將上述質(zhì)?；虮磉_(dá)載體導(dǎo)入所需宿主中，將上述多核普酸直接整合入宿主的染色體等等，可以得到本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體。宿主不受具體限制，并且例如，大腸桿菌(￡.co/z')、酵母、昆蟲細(xì)i包、動物細(xì)胞等等都可以用作宿主。作為向宿主中導(dǎo)入表達(dá)載體的方法，可以使用已知的方法，如鈣處理方法、原生質(zhì)體方法、電穿孔方法或者DEAE葡聚糖方法。通過在適于表達(dá)上述肽的條件下培養(yǎng)上述得到的轉(zhuǎn)化體并純化上述肽可以得到該肽。實(shí)施例將基于實(shí)施例、比較例和參考例在下文描述本發(fā)明，但是本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例1LEH的制備1)肽的合成使用自動化肽合成儀(SHIMADZUCORPORATION:生產(chǎn)的PSSM8)通過Fmoc方法通過固相合成方法合成肽。具體步驟如下首先，將Fmoc-His(l-Trt)-OH的C-末端結(jié)合到用于固相合成的樹脂，之后通過哌啶處理除去保護(hù)基(Fmoc)。隨后，將該樹脂中和并洗滌，并向His的N-末端引入Fmoc-Glu(OtBu)-OH。其次，通過^/^定處理除去保護(hù)基(Fmoc)，再次中和并洗滌該樹脂。之后，向Glu的N-末端引入Fmoc-Leu-OH。接著，通過派咬處理除去保護(hù)基(Fmoc)，并從該樹脂切出肽鏈。通過用TFA(三氟乙酸)切割His的Trt基團(tuán)和Glu的tBu基團(tuán)進(jìn)行去保護(hù)。最后，通過制備型HPLC除去未反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行純化，以得到LEH。2)合成肽的純度測定將得到的純化產(chǎn)物進(jìn)行反相高效液相層析分析[柱HBondasphere5|aC18國100A(內(nèi)徑3.9mm,長度150mm),WatersCorporation生產(chǎn)；流動相含有0.1%三氟乙酸的溶劑A和含有0.1%三氟乙酸和90%乙腈的溶劑B從0分鐘(溶劑8=7%)到20分鐘(溶劑B=12%)的梯度；流速1ml/分鐘;檢測方法220nm波長下的吸光度]。在13.1分鐘出現(xiàn)單個尖峰，且純度為99%。實(shí)施例2LEHA的制備以與實(shí)施例1中描述的方法相同的方式合成和純化肽LEHA。將得到的純化的產(chǎn)物進(jìn)行反相高效液相層析分析[柱^Bondasphere5juC18-100A(內(nèi)徑3.9mm,長度150mm),WatersCorporation生產(chǎn)；流動相含有0.1%三氟乙酸的溶劑A和含有0.1%三氟乙酸和90%乙腈的溶劑B從0分鐘(溶劑B=12%)到20分鐘(溶劑B=H。/。)的梯度；流速lml/分鐘;檢測方法220nm波長下的吸光度]。在12.8分鐘出現(xiàn)單個尖峰，且純度為99%。實(shí)施例3使用LEH和LEHA測定皮膚成纖維細(xì)胞中膠原的生產(chǎn)在48孔培養(yǎng)平板中培養(yǎng)來自人正常皮膚的成纖維細(xì)胞(CRL-1836;ATCC)。更具體地，將細(xì)胞以12,500個細(xì)胞/cm2的密度涂敷在平板上，并在37。C、5%二氧化碳?xì)怏w和95%空氣的氣氛中培養(yǎng)約72小時。作為培養(yǎng)液，以每孔500ial的量使用含有濃度為10重量％的胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)時，除去培養(yǎng)液，并以每孔500jal的量向其中加入培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基通過將實(shí)施例1或2中合成的LEH或LEHA以10jug/ml的濃度加入D-MEM而制備。這里，以每孔500iul的量加入了沒有添加肽的培養(yǎng)基的細(xì)胞用作對照。培養(yǎng)72小時后，收集培養(yǎng)液，并通過酶if關(guān)免疫吸附測定(Anti-HumanProcollagentypeIC誦peptideEIAKit;TAKARABIOINC.生產(chǎn))定量收集的培養(yǎng)液中I型膠原的濃度?；诙康慕Y(jié)果，計(jì)算加入了肽的培養(yǎng)液中I型膠原的量，其中將對照培養(yǎng)液中I型膠原的量定義為100%。結(jié)果在表3中顯示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如表3中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入肽的每種培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，來自人正常皮膚的成纖維細(xì)胞中膠原的生產(chǎn)量顯著增加。實(shí)施例4使用LEH和LEHA的毒性測試在實(shí)施例3中收集培養(yǎng)液后，向細(xì)胞中加入250微升D-MEM,并隨后用CellCountingKit-8(DOJINDOLABORATORIES生產(chǎn))計(jì)數(shù)活細(xì)胞的數(shù)目。結(jié)果在表4中顯示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如表4中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入肽的每種培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)目沒有顯著減少。實(shí)施例5從大豆蛋白制備LEH和LEHA肽1)大豆蛋白的蛋白酶降解將lg除殼的大豆粉分散在40ml蒸餾水中，并用O.lNNaOH調(diào)節(jié)分散體的pH至8.5。向其中加入50微克嗜熱菌蛋白酶(來自萬a"7/wf/2^7noj^o^o(y"cws，商品名THERMOASEPCI0F，DAIWAKASEIK.K.生產(chǎn))，并在6(TC進(jìn)行降解15小時。反應(yīng)后，通過在IO(TC煮沸分散體10分鐘滅活嗜熱菌蛋白酶。讓分散體冷卻后，向其中加入lg助濾劑(商品名Radiolight500,SHOWACHEMICALINDUSTRYCO.,LTD生產(chǎn))，并攪拌混合物。之后，進(jìn)行過濾。2)收集粗肽使如上得到的濾液穿過裝有強(qiáng)酸離子交換樹脂(商品名"Dowex50Wx2，H+型，50-100目，，，TheDowChemicalCompany生產(chǎn))的150ml柱，并用5倍柱體積的去離子水洗滌柱，以除去非肽組分。通過使2M氨溶液穿過柱洗脫吸附到柱的組分，并收集肽級分。用蒸發(fā)器蒸餾除去氨，并進(jìn)一步濃縮級分并干燥成固體。通過向其中加入5ml水溶解干燥產(chǎn)物，通過進(jìn)行離心(10，000rpm，30分鐘)除去未溶解的物質(zhì)。用分析試劑盒(商品名QuantiProBCAassaykit,SIGMA)定量溶液中的肽。結(jié)果，證實(shí)收集了140mg粗肽。3)分子量分級分離將裝有SephadexG-25(中等型，AmershamBiosciences生產(chǎn))的凝膠過濾柱(())2.6x100cm)用0.1M磷酸鈉緩沖液(pH7.0)平衡，并向其中應(yīng)用如上述得到的140mg粗肽。以1.0ml/分鐘的流速進(jìn)行洗脫，并在280nm檢測，且收集分子量為1,000或以下的級分。將收集得到的級分去礦質(zhì)并濃縮到2ml體積。4)通過強(qiáng)酸離子交換樹脂分離將裝有強(qiáng)酸離子交換樹脂(商品名"SPSephadexC-25,H+型"，AmershamBiosciences生產(chǎn))的20ml柱用去離子水平衡，并向其應(yīng)用如上述得到的分子量為l，OOO或更小的濃縮級分。將柱用5倍柱體積的去離子水洗滌，并用從0到0.256M的氯化鈉水溶液的線性梯度洗脫組分。通過級分收集器以每級分2.0ml的量收集洗脫物。在得到的層析譜中，檢測到6個主要峰。分別收集這6個主要峰，具體為，用0.026到0.062M濃度的氯化鈉洗脫的14ml級分(下文中SP[l]),用0.062到0.092M濃度的氯化鈉洗脫的12ml級分(下文中SP[2])，用0.092到0.113M濃度的氯化鈉洗脫的8ml級分(下文中SP[3])，用0.113到0.168M濃度的氯化鈉洗脫的22ml級分(下文中SP[4]),用0.20到0.23M濃度的氯化鈉洗脫的14ml級分(下文中SP[5])，和用0.256M或以上的濃度的氯化鈉洗脫的16ml級分(下文中SP[6])。5)HPLC分析去礦質(zhì)后，將上述得到的SP[l]到SP[6]在下面的條件下進(jìn)行HPLC分析(柱)InertsilODS-2，())4.6x250mm,5jam(GLScienceInc.)(檢測)214nm(流速)1.0mL/分鐘(分離條件)溶劑(a):含有0.05%三氟乙酸的溶液溶劑(b):含有0,05%三氟乙酸和20%乙腈的溶液用100%溶劑(a)平衡柱后，在線性梯度下進(jìn)行洗脫，從而使得60分鐘時溶劑(b)將為100%。(注射體積)20jul(柱溫)室溫使用通過化學(xué)合成制備的Leu-Glu-His和Leu-Glu-His-Ala作為標(biāo)準(zhǔn)，將級分的洗脫時間與標(biāo)準(zhǔn)的洗脫時間比較。結(jié)果，與標(biāo)準(zhǔn)在相同洗脫時間檢測到峰的級分僅為SP[5]，并且在不同于SP[5]的級分中在與標(biāo)準(zhǔn)相同的洗脫時間時沒有發(fā)現(xiàn)顯著峰。6)N-末端氨基酸序列分析將與標(biāo)準(zhǔn)在相同的洗脫時間檢測到的SP[5]中的兩個峰進(jìn)行分配，并用N-末端氨基酸序列分析儀進(jìn)行分析(Procise494HTProteinSequencingSystems,AppliedBiosystems)。結(jié)果，證實(shí)這兩個峰對應(yīng)于Leu-Glu-His和Leu-Glu-His-Ala。7)定量從HPLC分析的結(jié)果計(jì)算，揭示當(dāng)用嗜熱菌蛋白酶處理lg除殼的大豆粉時，產(chǎn)生了30.1jugLeu-Glu-His和20.1jagLeu-Glu-His-Ala。實(shí)施例6使用來自大豆蛋白的LEH和LEHA測定皮膚成纖維細(xì)胞中膠原的生產(chǎn)除了調(diào)節(jié)實(shí)施例5中的得到的SP[5]級分中所含的肽至10|ig/ml的濃度并將其用于替代合成的LEH和LEHA外，以與實(shí)施例3中相同的方式檢查皮膚成纖維細(xì)胞中膠原生產(chǎn)的增強(qiáng)作用。結(jié)果在表5中顯示。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>如表5中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入SP[5]的培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，來自人正常皮膚的成纖維細(xì)胞中膠原的生產(chǎn)量顯著增加。實(shí)施例7使用來自大豆蛋白的LEH和LEHA的毒性測試對于實(shí)施例6收集培養(yǎng)液后的細(xì)胞，以與實(shí)施例4中相同的方式計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果在表6中顯示。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>如表6中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入SP[5]的培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)目沒有顯著減少。在使用如實(shí)施例5中所述的從大豆蛋白的制備的LEH和LEHA肽，以與上述相同的方式進(jìn)行膠原的生產(chǎn)的測定的情況中，也發(fā)現(xiàn)與合成的LEH和LEHA肽所示的增強(qiáng)作用相似的對膠原生產(chǎn)的增強(qiáng)作用。此外，當(dāng)使用從大豆蛋白制備的LEH和LEHA肽，如上述進(jìn)行毒性測試時，發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞數(shù)目沒有顯著減少。實(shí)施例8N-末端-乙?；疞EHA的制備通過Fmoc方法(L.A.Carpino,G.Y.Han,/」w.C72ew.5"oc.，92，5748(1970)),按照下面的固相合成方法制備LEHA肽的N-末端乙?；难苌?。首先，將Fmoc-Ala-OH的C-末端結(jié)合到用于固相合成的樹脂，之后通過哌啶處理除去保護(hù)基(Fmoc)。隨后，將得到的樹脂中和并洗滌，并向Ala的N-末端引入Fmoc-His(l-Trt)-OH。其次，通過哌啶處理除去保護(hù)基(Fmoc),并再次中和和洗滌所述樹脂。之后，向His的N-末端引入Fmoc-Glu(OtBu)-OH。接著，通過哌啶處理除去保護(hù)基(Fmoc)。隨后，中和和洗滌樹脂，并向Glu的N-末端引入N-乙酰-亮氨酸。從該樹脂切出肽鏈，通過用TFA(三氟乙酸)切割His的Trt基團(tuán)和Glu的tBu基團(tuán)進(jìn)行去保護(hù)。最后，通過制備型HPLC除去未反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行純化，以得到N-末端乙酰化的LEHA。所得純化產(chǎn)物的純度為96.8%。實(shí)施例9C-末端酰胺化LEHA的制備4要照固相合成方法通過Fmoc方法(L.A.Carpino，G.Y.Han，,」m.CA，.Soc.，92,5748(1970))制備LEHA肽的C-末端酰胺化的衍生物。首先，將Fmoc-Ala-OH的C-末端結(jié)合到4-曱基二苯曱基胺樹脂，之后通過哌咬處理除去保護(hù)基(Fmoc)。隨后，將該樹脂中和并洗滌，并向Ala的N-末端引入Fmoc-His(l-Trt)-OH。其次，通過哌咬處理除去保護(hù)基(Fmoc),并再次中和和洗滌該樹脂。之后，向His的N-末端引入Fmoc-Glu(OtBu)-OH。接著，通過哌啶處理除去保護(hù)基(Fmoc)。隨后，將該樹脂中和并洗滌，并向Glu的N-末端引入Fmoc-Leu-OH。從該樹脂切出肽鏈，通過用TFA(三氟乙酸)切割His的Trt基團(tuán)和Glu的tBu基團(tuán)進(jìn)行去保護(hù)。最后，通過制備型HPLC除去未反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行純化，以得到C-末端酰胺化的LEHA。所得純化產(chǎn)物的純度為94.0%。實(shí)施例10使用肽衍生物測定皮膚成纖維細(xì)胞中膠原的生產(chǎn)除了使用實(shí)施例8和9中制備的N-末端乙酰化的LEHA和C-末端酰胺化的LEHA代替實(shí)施例1和2中合成的LEH和LEHA外，以與實(shí)施例3中相同的方式檢查皮膚成纖維細(xì)胞中膠原生產(chǎn)的增強(qiáng)作用。結(jié)果在表7中顯示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如表7中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入肽衍生物的每種培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，來自人正常皮膚的成纖維細(xì)胞中膠原的生產(chǎn)量顯著增加。實(shí)施例U1^用肽書f生物的毒性測試對于在實(shí)施例10中收集培養(yǎng)液后的細(xì)胞，以與實(shí)施例4中相同的方式計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果在表8中顯示。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>如表8中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入肽衍生物的每種培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)目沒有顯著減少。實(shí)施例12皮膚表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中透明質(zhì)酸的生產(chǎn)的測定KURABOINDUSTRIESLTI^生產(chǎn)):更具體地，將細(xì)胞以25,000個細(xì)胞/cm2的密度涂敷在平板上，并在37。C、5%二氧化碳?xì)怏w和95%空氣的氣氛中培養(yǎng)約72小時。作為培養(yǎng)液，以每孔400jal的量使用HuMediaKG-2(KURABOINDUSTRIESLTD.生產(chǎn))。培養(yǎng)72小時后除去培養(yǎng)液，并以每孔400jal的量向其中加入HuMediaKG-2培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中加入了100或300jag/ml的濃度的如實(shí)施例2中所述合成的LEHA。這里，以每孔400jul的量加入了沒有添加LEHA的HuMediaKG-2的細(xì)月包用作對照。額外培養(yǎng)72小時后，收集培養(yǎng)液，并通過酶4關(guān)免疫吸附測定(透明質(zhì)酸測定試劑盒；SeikagakuCorporation生產(chǎn))定量收集的培養(yǎng)液中透明質(zhì)酸的濃度?；诙康慕Y(jié)果，計(jì)算加入了LEHA的培養(yǎng)液中透明質(zhì)酸的量，其中將對照培養(yǎng)液中透明質(zhì)酸的量定義為100%。結(jié)果在表9中顯示。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>如表9中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入LEHA的培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，正常人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞中透明質(zhì)酸的生產(chǎn)量顯著增加。令人驚奇的地，當(dāng)以300jag/ml的濃度使用LEHA時，發(fā)現(xiàn)了對于透明質(zhì)酸的生產(chǎn)的更為顯著的增強(qiáng)作用，其中與對照中相比，生產(chǎn)的透明質(zhì)酸的量為約200%。實(shí)施例13LEKA的制備以與實(shí)施例1中描述的方法相似的方式制備肽LEKA。接著，通過制備型HPLC除去未反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行純化，以得到LEKA。實(shí)施例14使用LEKA在皮膚成纖維細(xì)胞中生產(chǎn)膠原的測定除了使用如上述合成的LEKA肽代替實(shí)施例1和2中合成的LEH和LEHA外，以與實(shí)施例3中相同的方式檢查皮膚成纖維細(xì)胞中膠原生產(chǎn)的增強(qiáng)作用。結(jié)果在表10中顯示。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>如表10中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入LEKA肽的培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞,來自正常人皮膚的成纖維細(xì)胞中膠原的生產(chǎn)量增加。實(shí)施例15使用LEKA的毒性測試對于在實(shí)施例14中收集培養(yǎng)液后的細(xì)胞，以與實(shí)施例4相同的方式計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果在表11中顯示。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如表11中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入LEKA的培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)目沒有減少。實(shí)施例16LDHA的制備以與實(shí)施例1中描述的方法相同的方式制備肽LDHA。接著，通過制備型HPLC除去未反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行純化，以得到LDHA。實(shí)施例17使用LDHA在皮膚成纖維細(xì)胞中生產(chǎn)膠原的測定除了使用1pg/ml量的如上述合成的LDHA肽代替實(shí)施例1和2中10jag/ml量的合成的LEH和LEHA外，以與實(shí)施例3中相同的方式檢查皮膚成纖維細(xì)胞中膠原生產(chǎn)的增強(qiáng)作用。結(jié)果在表12中顯示。表12<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>如表12中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入LDHA肽的培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，來自正常人皮膚的成纖維細(xì)胞中膠原的生產(chǎn)量增加。實(shí)施例18使用LDHA的毒性測試對于在實(shí)施例17中收集培養(yǎng)液后的細(xì)胞，以與實(shí)施例4相同的方式計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果在表13中顯示。表13<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>如表13中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入LDHA的培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)目沒有減少。實(shí)施例19LEHAF的制備以與實(shí)施例1中描述的方法相同的方式制備肽LEHAF。接著，通過制備型HPLC除去未反應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行純化，以得到LEHAF。實(shí)施例20使用LEHAF在皮膚成纖維細(xì)胞中生產(chǎn)膠原的測定除了使用1或3ng/ml濃度的如上述合成的LEHAF肽代替實(shí)施例1和2中10iug/ml濃度的合成的LEH和LEHA夕卜，以與實(shí)施例3中相同的方式檢查皮膚成纖維細(xì)胞中膠原生產(chǎn)的增強(qiáng)作用。結(jié)果在表14中顯示。表14<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>如表14中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入LEHAF肽的培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，來自正常人皮膚的成纖維細(xì)胞中膠原的生產(chǎn)量增加。實(shí)施例21使用LEHAF的毒性測試對于在實(shí)施例20中收集培養(yǎng)液后的細(xì)胞，以與實(shí)施例4相同的方式計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)目。結(jié)果在表15中顯示。表15<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>如表15中所示，發(fā)現(xiàn)通過在加入LEHAF的培養(yǎng)液中培養(yǎng)細(xì)胞，活細(xì)胞數(shù)目沒有顯著減少。實(shí)施例22使用無毛小鼠測定抗皺紋作用通過用肽進(jìn)行的應(yīng)用測試測定對使用無毛小鼠通過紫外線產(chǎn)生皺紋的預(yù)防作用。換句話說，將5周齡雄性無毛小鼠分成3組(8只小鼠/組)，并在3周時間段內(nèi)每周用UVB紫外線照射小鼠三次(第一周密度為90mJ/cm2，第二周為120mJ/cm2,且第三周為150mJ/cm2)。將含有每種測試肽等的50微升測試溶液應(yīng)用于每組中無毛小鼠的背部，每天三次，進(jìn)行三周。從用紫外線第一次照射過了24天后，以7個等級通過視覺對皺紋評分(表16)，以評價對皺紋產(chǎn)生的預(yù)防作用?；趯拱櫦y作用的該測定，在應(yīng)用含有本發(fā)明的肽的測試溶液的組中發(fā)現(xiàn)了對皺紋產(chǎn)生的大的預(yù)防作用。表16:*皮纟丈目效'J#r查的4尋分,在尸/zo^^/^vwWo/.尸/7ofo/wmw"o/.尸/zo化mgof7,153-158，1990中稱作鈹紋評分_0.0在背部皮膚上沒有發(fā)現(xiàn)顯著的皮溝0.5在背部皮膚部分發(fā)現(xiàn)顯著的皮溝1.0在整個背部皮膚發(fā)現(xiàn)顯著的皮溝1.5對于整個背部皮膚中發(fā)現(xiàn)的皮溝，橫向的皮溝比縱向皮溝更深2.0對于整個背部皮膚中發(fā)現(xiàn)的皮溝，橫向的皮溝比縱向皮溝進(jìn)一步加深2.5在整個背部皮膚發(fā)現(xiàn)皺紋3.0在整個背部皮膚發(fā)現(xiàn)深的皺紋序列表自由文本序列表中SEQIDNO序列表中SEQIDNO序列表中SEQIDNO序列表中SEQIDNO序列表中SEQIDNO序列表中SEQIDNO序列表中SEQIDNO序列表中SEQIDNO1是本發(fā)明的肽。2是編碼LEHA肽的DNA。3是編碼LEHA肽的DNA。4是編碼LEHA肽的DNA。5是編碼LEHA肽的DNA。18是本發(fā)明的肽。19是本發(fā)明的肽。20是本發(fā)明的肽。權(quán)利要求1.式(I)代表的肽Leu-Glu-His①或者它的衍生物，或者其鹽。2.肽，或者它的衍生物或者其鹽，該肽在如權(quán)利要求1中定義的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸的替代和/或添加，并且該肽能夠增強(qiáng)選自細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)，附帶條件是該肽不含有Lys-Thr-Thr-Lys-Ser。3.權(quán)利要求2的肽或者它的衍生物，或者其鹽，其中所述替代是氨基酸的保守替代。4.式(II)代表的肽Leu畫Glu-His國Ala(SEQIDNO:1)(II)或者它的衍生物，或者其鹽。5.式(III)代表的肽Leu-Glu國Lys畫Ala(SEQIDNO:18)(III)或者它的衍生物，或者其鹽。6.式(IV)代表的肽Leu-Asp-His-Ala(SEQIDNO:19)(IV)或者它的衍生物，或者其鹽。7.式(V)代表的肽Leu-Glu畫His-Ala-Phe(SEQIDNO:20)(V)或者它的衍生物，或者其鹽。8.權(quán)利要求2或3的肽或者它的衍生物，或者其鹽，其中所述肽或者它的衍生物，或者其鹽是長度為3到25個的氨基酸殘基。9.組合物，其含有權(quán)利要求1到8任一項(xiàng)定義的肽或者它的衍生物，或者其鹽。10.權(quán)利要求9的組合物，其中該組合物可用于增強(qiáng)選自細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)。11.權(quán)利要求9或10的組合物，其中該組合物可以用作用于外用劑。全文摘要本發(fā)明涉及具有特定氨基酸序列的新肽，或者其衍生物或其鹽。此外，本發(fā)明涉及含有該新肽等的組合物，利用該新肽等的方法，該新肽等的用途，編碼該新肽等的多核苷酸。本發(fā)明的新肽或者其衍生物或者其鹽可以用于增強(qiáng)選自細(xì)胞中膠原和透明質(zhì)酸的至少一種成員的生產(chǎn)。文檔編號C07K5/08GK101146819SQ200680009008公開日2008年3月19日申請日期2006年3月17日優(yōu)先權(quán)日2005年3月22日發(fā)明者上村浩,常次修一,本間陽一,稻岡賢,菊地數(shù)晃申請人:老篤制藥株式會社