專利名稱：：新型抗胎盤生長因子抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及特別適用于抑制病理狀態(tài)中的血管發(fā)生的新型抗體及其片段和衍生物。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生這種特異性抗體的細(xì)胞系。本發(fā)明提供了包含本發(fā)明抗體、片段和/或衍生物的藥物組合物，還提供了預(yù)防和治療例如腫瘤形成、眼科疾病、肺動(dòng)脈高血壓和炎性疾病中的不良血管發(fā)生和/或血管滲漏的方法，以及預(yù)防和治療骨疾病如骨質(zhì)疏松的方法。
背景技術(shù)：
：異常血管形成是許多發(fā)病率高和死亡率高疾病的發(fā)病原因。闡明血管發(fā)生的機(jī)制可能有助于開發(fā)刺激缺血組織血管發(fā)生或抑制腫瘤血管形成的治療策略，近年在胚胎中的基因靶向研究鑒定到參與內(nèi)皮通道(血管發(fā)生)初步形成及其后繼成熟覆蓋平滑肌細(xì)胞的(動(dòng)脈生成)幾種機(jī)制。證明有不同的分子機(jī)制可能介導(dǎo)了病理?xiàng)l件下的血管發(fā)生，但參與的主要分子仍有待確定。已確定血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)參與脈管系統(tǒng)的發(fā)生和病理性生長(FrraraN.等，1999，CurrTopMicrobiolImmunol237，1-30)，此外，也已證明胎盤生長因子(PLGF)，VEGF的一種同系物，是多種疾病例如缺血性視網(wǎng)膜病、腫瘤、炎性疾病和浮腫時(shí)VEGF的特異性調(diào)節(jié)劑。已證明PLGF;小鼠具有病理性的血管發(fā)生和動(dòng)脈生成(CarmelietP.等2000，J.Pathol.190，387-405),而正常健康小鼠的生理性血管發(fā)生不受影響。因此，抑制PLGF可能對治療血管發(fā)生或動(dòng)脈生成導(dǎo)致的疾病有巨大潛能。PLGF的抑制劑是本領(lǐng)域熟知的，例如抗人PLGF的山羊多克隆抗體(R&D，pharmaceuticals,Abingdon，UK)禾口雞多克隆抗體(Gassmann等，1990，F(xiàn)asebJ.4，2528)。這些抗體可用于Western印跡、組織化學(xué)和免疫沉淀研究。WO01/85796描述了PIGE抑制劑的應(yīng)用，包括采用抗-PLGF單克隆抗體治療和預(yù)防諸如腫瘤形成之類的疾病。更具體說描述了制備能完全抑制小鼠PLGF-2與其受體Flt-l結(jié)合的鼠單克隆抗體，從而篩選出具有最有效抑制活性的抗體Mab-PL5D11。描述了該抗體在病理性血管發(fā)生動(dòng)物模型中的應(yīng)用。有動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生的抗體所具有的特征使其在人類治療中的應(yīng)用受到嚴(yán)重的限制。如Jaffers等，1986(Transplantation198641:572)中所述，作為外源蛋白，它們可能誘導(dǎo)抗免疫球蛋白應(yīng)答(對于小鼠抗體指產(chǎn)生人抗小鼠抗體或HAMA)，從而降低或損害它們的治療效率和/或誘發(fā)病人產(chǎn)生變態(tài)或超敏反應(yīng)。雖然采用人單克隆抗體可克服這種限制，但證明常規(guī)雜交瘤技術(shù)很難產(chǎn)生大量的人抗人抗體。因此本領(lǐng)域已采用重組技術(shù)構(gòu)建了既能保持動(dòng)物抗體(例如鼠單克隆抗體)的高結(jié)合親和力又顯示在人體內(nèi)免疫原性降低的"人源化"抗體。具體說，已提出的嵌合抗體中非人抗體的可變區(qū)(V)與人抗體的保守區(qū)(C)結(jié)合。在美國專利5,770，198中詳細(xì)描述了獲得這種嵌合免疫球蛋白的方法。在另一種降低鼠抗體免疫原性的嘗試中，只將(鼠抗體的)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，即V區(qū)中的超變區(qū)而不是整個(gè)V區(qū)域移植到人抗體中。這種人源化抗體稱為CDR-嫁接抗體(graftedantibody)。構(gòu)建能識(shí)別更復(fù)雜抗原的CDR-嫁接抗體導(dǎo)致抗體的結(jié)合活性顯著低于天然非人源化抗體。許多情況中證明只將非人CDR導(dǎo)入人抗體骨架中不足以保持完整的結(jié)合活性。為了鑒定人源化抗體設(shè)計(jì)中必須考慮的關(guān)鍵性氨基酸，需要感興趣的鼠抗體的精確計(jì)算機(jī)模型，并已提出這種設(shè)計(jì)的總體理論指南，在所有情況下，必須定制和優(yōu)化感興趣的特定非人抗體的制備方法。因此，仍然需要能理想地抑制人PLGF與其受體結(jié)合的(單克隆)抗體。此外，還需要這種抗體沒有免疫性，即不會(huì)誘導(dǎo)HAMA(或誘導(dǎo)傾向很低)。發(fā)明概述本發(fā)明涉新型抗PLGF單克隆抗體及其衍生物，該單克隆抗體及其衍生物能抑制PLGF與其受體結(jié)合。首次證明本發(fā)明的這種配體能夠在體內(nèi)病理狀態(tài)中抑制人PLGF。更具體說，本發(fā)明的抗體及其衍生物能夠減少人體內(nèi)腫瘤組織的體積和血管化。本發(fā)明抗體提供了當(dāng)前所用的靶向VEGF的抗血管發(fā)生的一種替代治療方法，其重要優(yōu)點(diǎn)是可顯著減少這些治療所伴隨的對生理性血管發(fā)生抑制所導(dǎo)致的副作用。本發(fā)明涉及抗原結(jié)合分子，具體指單克隆抗體及其片段或衍生物，包括與本文稱為16D3的抗體結(jié)合相同PLGF表位的人源化抗體和抗體片段。本發(fā)明的第一方面是提供能結(jié)合PLGF并能抑制PLGF功能的新型單克隆抗體，更具體說該抗體的特征是，它們的重鏈可變區(qū)包含序列SEQIDNO:2或與在其CDR區(qū)與其有至少80%、更具體至少90%、最具體至少95%序列相同性的序列，和/或它們的輕鏈可變區(qū)包含序列SEQIDNO:4或在其CDR區(qū)與其有至少80。/。、更具體至少90%、最具體至少95%序列相同性的序列，例如抗體16D3或及衍生物。在其它或可選的進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子在CDR區(qū)之外的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)中與序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:4分別有至少70%、具體至少80%、更具體至少90%、最具體至少95%的相同性。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施方式，所述抗體為人源化抗體，更具體為雜交抗體，最具體為小鼠/人雜交抗體，更具體為小鼠16D3/人IgGlK或IgG4K雜交抗體?；蛘咴撊嗽椿贵w是一種包含嫁接到人抗體骨架上的本發(fā)明能結(jié)合PLGF的小鼠16D3抗體的CDR區(qū)的抗體。本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及小鼠16D3抗體的抗原結(jié)合片段或其衍生物，例如其人源化抗體，例如但不限于Fab，F(xiàn)ab'，F(xiàn)(ab')2，至少兩個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的組合，可溶性或膜-錨定單鏈可變區(qū)，或單鏈可變區(qū)。這種抗原結(jié)合片段的具體實(shí)施方式所包括的片段包含16D3或及衍生物的至少兩個(gè)CDR，或更具體說包含選自以下的至少兩個(gè)CDR:SEQIDNO:17(GYTFTDYY)，SEQIDNO:18(IYPGSGNT)，SEQIDNO:19(VRDSPFFDY)，SEQIDNO:20(QSLLNSGMRKSF)，SEQIDNO:21(WAS)和SEQIDNO:22(KQSYHLFT)，或包含與其有至少80%、具體至少85%、更具體至少90%、最具體至少95%序列相同性的至少兩個(gè)序列。本發(fā)明的具體實(shí)施方式涉及提供能抑制PLGF活性的小鼠16D3抗體的單鏈可變區(qū)片段(scFv)和人源化scFv。更具體說，本發(fā)明提供的scFv包含氨基酸序列SEQIDNO:24或SEQIDNO:26或是在能夠結(jié)合PLGF的CDR內(nèi)與其有至少80。/。、具體至少85%、更具體至少卯。/。、最具體至少95。/。序列相同性的序列。本發(fā)明還有另一方面是提供能產(chǎn)生本發(fā)明單克隆抗體的細(xì)胞系，更具體說不僅包括能產(chǎn)生16D3抗體的細(xì)胞系16D3，而且包括例如重組技術(shù)產(chǎn)生的能夠產(chǎn)生衍生自16D3或其片段的抗原結(jié)合分子的細(xì)胞系。本發(fā)明還有另一方面是提供一種用于預(yù)防和治療哺乳動(dòng)物病理狀態(tài)或病癥中的(不良)血管發(fā)生、或者用于預(yù)防或治療骨質(zhì)重吸收疾病的藥物組合物，該組合物包含抗PLGF抗體與藥物學(xué)上可接受的運(yùn)載體的混合物，所述抗體為16D3或其片段或衍生物，更具體是人源化形式的16D3或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明的一具體實(shí)施方式是包含選自以下的16D3抗原結(jié)合片段或其衍生物的藥物組合物Fab、Fab，或F(ab')2、可溶性或膜-錨定單鏈可變部分、或單鏈可變域。本發(fā)明的最具體實(shí)施方式涉及包含抗原結(jié)合片段的藥物組合物，所述片段包含至少兩個(gè)選自下組的CDR:SEQIDNO:17(GYTFTDYY)、SEQIDNO:18(IYPGSGNT)、SEQIDNO:19(VRDSPFFDY)、SEQIDNO:20(QSLLNSGMRKSF)、SEQIDNO:21(WAS)和SEQIDNO:22(KQSYHLFT)，或包含至少兩個(gè)與選自SEQIDNO:17-22的兩個(gè)不同序列有至少80。/。、具體至少85%、更具體至少90%、最具體至少95%序列相同性的序列。本發(fā)明的一具體實(shí)施方式涉及包含本發(fā)明16D3抗體的scFv的藥物組合物，更具體指所包含的scFv含有選自SEQIDNO:17(GYTF丁DYY)、SEQIDNO:18(IYPGSGNT)、SEQIDNO:19(VRDSPFFDY)、SEQIDNO:20(QSLLNSGMRKSF)、SEQIDNO:21(WAS)和SEQIDNO:22(KQSYHLFT)的至少兩個(gè)CDR，或含有至少兩個(gè)與選自SEQIDNO:17-22的至少兩個(gè)不同序列有至少80%、具體至少85%、更具體至少90%、最具體至少95%相同性的序列，例如包含SEQIDNO:24的scFv。最具體的說，該藥物組合物包含16D3的人源化scFv，例如但不限于其CDR中含SEQIDNO:26或含有與其至有少80。/。、具體至少85%、更具體至少90。/。、最具體至少95%序列相同性能結(jié)合PLGF的人源化scFv。在本發(fā)明藥物組合物的另一具體實(shí)施方式中，除了本發(fā)明能結(jié)合PLGF的抗原結(jié)合分子以外，還包括治療有效量的另一種抗血管發(fā)生藥。該方面涉及的最具體抗血管發(fā)生藥例如有VEGF-和bFGF-抑制劑，最具體是抗-VEGF抗體。本發(fā)明另一目的是提供編碼本文公開的能結(jié)合PLGF的抗體的抗原結(jié)合片段的核苷酸序列，更具體指編碼細(xì)胞系16D3產(chǎn)生的16D3(抗體)重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列。最具體涉及編碼SEQIDNO:2和SEQIDNO:4可變區(qū)的核苷酸序列。另外還包括包含16D3至少兩個(gè)CDR的抗原結(jié)合片段的編碼多核苷酸序列，更具體說是編碼選自下組的至少兩個(gè)CDR的多核苷酸SEQIDNO:17(GYTFTDYY)、SEQIDNO:18(IYPGSGNT)、SEQIDNO:19(VRDSPFFDY)、SEQIDNO:20(QSLLNSGMRKSF)、SEQIDNO:21(WAS)和SEQIDNO:22(KQSYHLFT)，或包含與SEQIDNO:17-22有至少80%、具體至少850/。、更具體至少卯％、最具體至少95%序列相同性的至少兩個(gè)CDR的編碼序列。本發(fā)明核苷酸序列的具體實(shí)施方式提供于SEQIDNO1、3、5和6。其它具體實(shí)施方式包括編碼16D3的scFv和其人源化形式的核苷酸序列，更具體是SEQIDNO:23和SEQIDNO:25的序列和與其有至少80%、具體至少85%、更具體至少90%、最具體至少95%序列相同性的序列，最具體是編碼scFv的CDR區(qū)序列。然而應(yīng)理解由于遺傳密碼子的冗余性而存在的許多核苷酸序列都種屬于本發(fā)明范圍之內(nèi)本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供治療和/預(yù)防哺乳動(dòng)物病理狀態(tài)中的不良(或病理性)血管發(fā)生的方法，該方法包括給予需要這種治療和預(yù)防的哺乳動(dòng)物治療有效量的活性成分，這種活性成份是本發(fā)明的16D3抗體或其抗原結(jié)合片段或衍生物，最具體是本文所述的scFv。特別適合于本發(fā)明方法的是人源化抗體和抗體片段，如16D3的scFv或其衍生物。本發(fā)明方法的具體實(shí)施方式可治療和/或預(yù)防的疾病例如iS不限于癌癥，炎癥，眼部疾病，肺高壓和脈管滲漏。本發(fā)明的具體目標(biāo)是為哺乳動(dòng)物更具體是人的病理性血管發(fā)生，更具體是腫瘤生長、炎癥、眼部疾病或脈管滲漏提供有效和安全的治療(即無副作用)。最具體說，本發(fā)明的方法適合治療和/或予頁防實(shí)體腫瘤，更具體說適合治療和/或預(yù)防結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌和黑素瘤。本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合片段的進(jìn)一步應(yīng)用涉及免疫學(xué)檢測人樣品中的PLGF，例如在診斷方法中用作標(biāo)記的靶向分子和在癌癥治療中用于篩選對PLGF具有額外抑制作用的化合物。本發(fā)明的依據(jù)是令人驚奇地確定了能非常有效抑制PLGF的新型配體，即稱為新型的小鼠和人源化單克隆抗體及其片段、衍生物和同系物。最具體說，本發(fā)明證明了這種配體能減少腫瘤生長，最具體說能減少腫瘤體積20%和50%。附圖簡述以下描述不意味著將本發(fā)明的范圍限于本文所述實(shí)施例，而是結(jié)合納入本文作為參考的來理解本發(fā)明。圖1:按照本發(fā)明的實(shí)施方式用ELISA檢測抗體16D3(A)或人源化抗體16D3(hul6D3)(B)與人PLGF2(畢赤酵母菌生產(chǎn))的結(jié)合。圖2:按照本發(fā)明的實(shí)施方式用ELISA檢測抗體16D3(方形)或人源化抗體16D3(三角形)抑制PLGF與人Flt-l的結(jié)合。圖3:按照本發(fā)明的實(shí)施方式將rhuPLGF-2固定在CM5芯片上檢測以研究抗體16D3和其片段抑制潛力的Biacore實(shí)驗(yàn)結(jié)果。圖4:單克隆抗體16D3抑制皮下人胰腺DanG異種移植腫瘤模型中的腫瘤生長。按照本發(fā)明實(shí)施方式用抗-tPA('對照IgG，)(lC8:50mg/kg體重；n=10)、抗-hPLGF16D3('抗-hPLGF，)(50mg/kg體重；『10)、抗-mPLGF(PL5DllD4(按照專利WO01/85796所述獲得；50mg/kg體重；n=10)、抗-mPLGFPL5D11D4('抗-hPLGF/抗-mPLGF，)(各25mg/kg體重；n-10)和'運(yùn)載體，(n-10)治療長有約60mmS腫瘤的nu/nu小鼠。腫瘤接種18天后測定(A)月中瘤大小(B)月中瘤重量。圖5:單克隆抗體16D3以劑量依賴方式抑制皮下人胰腺DanG異種移植腫瘤模型中的腫瘤生長。按照本發(fā)明實(shí)施方式用抗-hPLGF16D3(50mg/kg-'1000嗎，/'C，，37.5mg/kg='750(igV'D，，25mg/kg='500(igV'E，，12.5mg/kg='250ug，/'F，;各濃度n:10)、對照IgG('lC8，/'B，；50mg/kg)和'運(yùn)載體，/'A，(i^lO)治療長有約60mm3腫瘤的nu/nu小鼠。A:腫瘤細(xì)胞接種后評(píng)價(jià)的腫瘤平均大??；B:20天后的腫瘤平均大小。圖6:單克隆抗體16D3抑制皮下人乳腺M(fèi)DA-AB異種移植腫瘤模型中的腫瘤生長。按照本發(fā)明實(shí)施方式用抗-hPLGF16D3(50mg/kg體重；n-10)或運(yùn)載體每周三次治療長有約60mm^中瘤的nu/nu小鼠。腫瘤接種32天后測定(A)月中瘤重量(B)月中瘤體積。圖7:單克隆抗體16D3抑制皮下人結(jié)腸LOVO異種移植腫瘤模型中的腫瘤生長。按照本發(fā)明實(shí)施方式用抗-hPLGF16D3(50mg/kg體重；11=10)或運(yùn)載體每周三次治療長有約60mmS腫瘤的nu/nu小鼠。腫瘤接種30天后測定(A)腫瘤重量(B)腫瘤體積。圖8:單克隆抗體16D3抑制皮下人黑素瘤Mel2a異種移植腫瘤模型中的腫瘤生長。按照本發(fā)明實(shí)施方式用抗-hPLGF16D3(50mg/kg體重；n-10)或運(yùn)載體每周三次治療長有約60mm、中瘤的nu/nu小鼠。腫瘤接種53天后測定腫瘤重量。圖9:單克隆抗體16D3預(yù)防皮下人胰腺DanG異種移植腫瘤模型的體重減輕。按照本發(fā)明實(shí)施方式用抗-hPLGF16D3(50mg/kg體重；n=10)、對照IgG、抗-hPLGF16D3和抗-mPLGF聯(lián)用(各25mg/kg體重；11=10)和運(yùn)體體(n-10)治療長有約60mr^腫瘤的nu/nu小鼠。將腫瘤重量從體重中扣除然后計(jì)算體重減輕百分比?？招闹委煹谝惶斓捏w重；實(shí)心柱治療最后一天的體重。圖10:單克隆抗體16D3和Avastin對皮下人胰腺DanG的腫瘤生長抑制有疊加作用。按照本發(fā)明實(shí)施方式用抗-hPLGF16D3(濃度分別為37.5mg/kg'，25mg/kg，12.5mg/kg體重;n=10)、對照IgG(lC8;50mg/kg)、Avastin(15mg/kg和5mg/kg體重，每周兩次，各n-10)和聯(lián)用抗-hPLGF(12.5mg/kg體重)與Avastin(5mg/kg體重；n^O)治療長有約60mi^腫瘤的nu/nu小鼠。腫瘤接種20天后處死小鼠檢測腫瘤體積。圖ll:本發(fā)明實(shí)施方式的小鼠抗體16D3的可變區(qū)核苷酸和氨基酸序列。A.編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列；B.編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列；C.重鏈可變區(qū)的氨基酸序列；D.輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。下劃線為根據(jù)本發(fā)明一實(shí)施方式人源化修飾的核苷酸或氨基酸部分。圖12:本發(fā)明實(shí)施方式的16D3的人源化可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列。A.編碼人源化重鏈可變區(qū)的核苷酸序列；B.編碼人源化輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列；C.人源化的重鏈可變區(qū)氨基酸序列；D.人源化的輕鏈可變區(qū)氨基酸序列。下劃線為人源化修飾的核苷酸或氨基酸部分。圖13:說明用于在293T細(xì)胞中表達(dá)人源化16D3的載體。圖14:A:scFvl6D3和人源化scFvl6D3與PLGF結(jié)合；B:scFvl6D3和人源化scFv16D3(B)抑制huPLGF-2與其受體huFlt-1結(jié)合。圖15:A:小鼠抗體16D3的scFv的氨基酸序列；B:抗體16D3的人源化scFv的氨基酸序列；下劃線部分為重鏈和輕鏈可變區(qū)以外的區(qū)域。圖16:說明按本發(fā)明一實(shí)施方式用于在293細(xì)胞中表達(dá)人源化16D3Fab的載體。圖17:A:按本發(fā)明實(shí)施方式用ELISA檢測人源化Fabl6D3與huPLGF的結(jié)合；B:人源化Fabl6D3抑制huPLGF-2與huFlt-l的結(jié)合定義本文所用術(shù)語"16D3"指以保藏號(hào)LMBP6399CB保藏于BCCM/LMBP的細(xì)胞系產(chǎn)生的抗PLGF單克隆抗體。術(shù)語"抗體片段"指抗體分子亞部分的單獨(dú)形式，或與其它片段的結(jié)合形式，能夠結(jié)合原相應(yīng)抗體所結(jié)合的抗原。典型的抗體片段為Fab'Fab'，F(xiàn)(ab')2，F(xiàn)v或scF，它們通常保留了與完整抗體相當(dāng)?shù)目乖H和力。更小的片段包括互補(bǔ)決定區(qū)或CDR，例如重鏈或輕鏈的CDR1、CDR2、CDR3禾n/或它們的兩個(gè)或多個(gè)CDR的組合。本文所用術(shù)語"衍生物"指對原始抗體(例如由雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生)及其片段的修飾不明顯影響其與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子。典型的修飾包括對原始抗體氨基酸序列的修飾或氨基酸序列功能基團(tuán)的修飾，例如在人源化敘述中，使該抗體或其片段與其它分子例如標(biāo)記或小珠結(jié)合，或糖基化修飾。因此，衍生物包括但不限于人源化抗體，雜交抗體，通過將原始抗體的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)和/或CDR嫁接或?qū)氲酵N或異種抗體或片段的骨架上而獲得的抗體或其它抗原結(jié)合分子?？贵w衍生物包括交替構(gòu)建的一個(gè)或多個(gè)抗體的CDR所產(chǎn)生的抗原結(jié)合分子例如合成多肽。本文所使用術(shù)語"人源化抗體或抗體片段"指其原始抗體相比，為了更加接近類似于人抗體而含有取代氨基酸的抗體分子或其片段。這些取代主要發(fā)生在抗體或抗體片段的骨架中，即發(fā)生在非抗原結(jié)合區(qū)。但是，考慮也可以取代CDR中不參與或很少參與抗原結(jié)合的氨基酸。本文所用"重構(gòu)"抗體或抗體片段或"雜交抗體"指包含至少兩種不同抗體的一部分的抗體，所述不同抗體可以是任選的同種或異種抗體。通常，人雜交抗體可以是一種抗體的人恒區(qū)連接另一抗體的人源化可變區(qū)(針對感興趣的抗原)，或一種抗體的人抗體骨架中的抗原結(jié)合區(qū)氨基酸序列已被另一抗體(例如針對感興趣人抗原的非人抗體)的序列取代。更具體說，將對感興趣抗原具有親和力的一種抗體(通常為非人抗體)的抗原結(jié)合區(qū)，例如一個(gè)或多個(gè)CDR，或可變區(qū)或其一部分，導(dǎo)入另一種抗體(通常為人抗體)的骨架中(例如CDR嫁接抗體)。本文用于指本發(fā)明兩種或多種抗原結(jié)合分子的術(shù)語"同源性"或"同源"是指抗原結(jié)合分子能結(jié)合相同的抗原，更具體說能結(jié)合相同的表位。評(píng)價(jià)兩種抗原結(jié)合分子能否與相同表位結(jié)合可以通過檢測兩種抗原結(jié)合分子彼此能否競爭結(jié)合相同抗原，例如競爭結(jié)合試驗(yàn)。同源性抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合應(yīng)具有相似特異性。本文所用的兩條序列的"序列相同性"涉及到當(dāng)兩條序列排列對比時(shí)，該二序列中更短序列的具有相同的核苷酸或氨基酸的位置數(shù)目除以核苷酸或氨基酸總數(shù)。所述序列相同性宜高于70-80%，優(yōu)選81-85%，更優(yōu)選86-90%，特別優(yōu)選91-95%，最優(yōu)選96-100%，更特別優(yōu)選100%。鑒于可變區(qū)骨架對結(jié)合抗原的貢獻(xiàn)有限，序列相同性最為常見的特定區(qū)域是互補(bǔ)決定區(qū)或CDR，例如構(gòu)成CDR的氨基酸序列及其編碼核苷酸序列。因此，當(dāng)一特定序列與CDR內(nèi)特定序列有例如80。/。的序列相同，這二條序列只在組成CDR的序列之間具有序列相同性。本文所用術(shù)語"PLGF"指胎盤生長因子。已發(fā)現(xiàn)PLGF主要存在兩種剪接變體或同種型149個(gè)氨基酸的PLGF-l和170個(gè)氨基酸的PLGF-2，后者在其羧基末端含21個(gè)氨基酸插入，但也已發(fā)現(xiàn)了其它同種型。當(dāng)指PLGF或其片段或衍生物的抗體時(shí)，術(shù)語"抑制"用于指能夠抑制PLGF與其受體Flt-l結(jié)合的抗體、其片段或衍生物。發(fā)明詳述本發(fā)明將通過參考特定實(shí)施方式和特定的附圖行描述，但本發(fā)明的范圍不限于此而只由權(quán)利要求書限定范圍。本發(fā)明涉及能結(jié)合本文所述抗體16D3所結(jié)合的相同PLGF表位的抗原結(jié)合分子，具體是單克隆抗體、其片段或衍生物。由細(xì)胞系LMBP6399CB產(chǎn)生的"抗體16D3"是抗人源PLGF的抗體，能結(jié)合人PLGF(兩種同種型PLGF-l和PLGF-2)?？贵w16D3能抑制人PLGF與其受體Fit-l的結(jié)合，抑制PLGF-活性。因此，在治療應(yīng)用或動(dòng)物模型中為了檢測和篩選目的，抗體16D3本身及其片段或衍生物，編碼該抗#:、片段或衍生物的核苷酸序列都可用來抑制PLGF?；蛘?，可用該抗體來檢測和/或定量體內(nèi)、離體或體外(組織的)PLGF。因此，本發(fā)明提供了本發(fā)明抗原結(jié)合分子和編碼它們的核苷酸的不同應(yīng)用。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明抗原結(jié)合分子的方法和產(chǎn)生這些抗原結(jié)合分子的細(xì)胞系。本發(fā)明的第一方面涉及能產(chǎn)生本發(fā)明抗原結(jié)合分子的細(xì)胞系，更具體說產(chǎn)生能結(jié)合與16D3或其片段或衍生物所結(jié)合的相同抗原的單克隆抗體的細(xì)胞系。本發(fā)明該方面的一具體實(shí)施方式是也稱為'細(xì)胞系16D3'的雜交瘤細(xì)胞系，該細(xì)胞系產(chǎn)生單克隆抗體16D3并保藏于BCCM/LMBP(BelgianCo-ordinatedCollectionsofMicroorganisms/PlasmidCollectionLaboratoriumvoorMoleculaireBiologie，UniversityofGhentK丄.Ledeganckstraat35，B-9000Ghent,BE，由Thromb-X于2005年3月29日保存，保藏號(hào)為LMBP6399CB)。本發(fā)明還提供產(chǎn)生衍生自單克隆抗體16D3的單克隆抗體的細(xì)胞系。這種細(xì)胞系可通過修飾編碼單克隆抗體16D3的序列獲得，最具體是16D3的非抗原結(jié)合區(qū)的編碼序列。檢測這種修飾的性質(zhì)的方法有待建立，本文中描述了適當(dāng)修飾的實(shí)例。本發(fā)明第二方面涉及能結(jié)合16D3所結(jié)合相同抗原的抗原結(jié)合分子。更具體說，本發(fā)明涉及以上所述的由細(xì)胞系16D3所產(chǎn)生的能結(jié)合PLGF和抑制PLGF活性的稱為16D3的抗體和其同系物、其片段和衍生物。因此本發(fā)明一具體實(shí)施方式提供由細(xì)胞系LMBP6399CB產(chǎn)生的抗-人PLGF單克隆抗體16D3，和此抗體的片段。單克隆抗體16D3的特征是其重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別為SEQIDNO:2和序列IDNO:4所示。按照具體實(shí)施方式，本發(fā)明涉及抗體16D3的片段，更具體是其抗原結(jié)合片段。這種片段包括但不受限于Fab'、Fab'、F(ab')2、CDR、具有該抗體一部分序列或其CDR的肽、單個(gè)可變區(qū)和它們的組合。可用本
技術(shù)領(lǐng)域：
熟知的單克隆抗體水解消化方法產(chǎn)生Fab，、Fab，、F(ab，)2片段，例如Stanworth等，(f^^邀扇i^學(xué)手J7f/朋必ooyt五x/erz'me她〃m膽w/og^，(1978)，第1巻，第瞎(BlackwellScientificPublications)。這些保留了結(jié)合抗原能力的片段，但喪失了母抗體的許多能質(zhì)，如激活補(bǔ)體或結(jié)合Fcy受體的能力。更具體說，本發(fā)明提供的片段包含分別與SEQIDNO:2和SEQIDNO:4相應(yīng)的16D3的重鏈和輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式涉及包含16D3的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)及其衍生物的片段。下文說明了兩種最常用的鑒定CDR的方法IMGT和KABAT，和包含16D3的二種類型CDR之一的片段都視為屬于本發(fā)明的內(nèi)容，包含這些片段或CDR的16D3衍生物也屬于本發(fā)明。根據(jù)對CDR的IMGT鑒定，16D3可變區(qū)內(nèi)的CDR區(qū)與序列對應(yīng)于SEQIDNO:17(GYTFTDYY)、SEQIDNO:18(IYPGSGNT)、SEQIDNO:19(VRDSPFFDY)、SEQIDNO:20(QSLLNSGMRKSF)、SEQIDNO:21(WAS)和SEQIDNO:22(KQSYHLFT)序列。因此，本發(fā)明提供包含SEQIDNO:17-NO:22中所提供的16D3的一個(gè)或多個(gè)CDR的16D3抗體片段。本發(fā)明的另一具體實(shí)施方式提供了可溶性或膜錨定的16D3單鏈可變區(qū)的16D3片段。單鏈可變區(qū)片段(scFv)—般為工程改造的抗體片段，通常由免疫球蛋白的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變區(qū)或其一部分通過可屈曲的肽接頭連接在一起而構(gòu)成。scFv可任選地包含感興趣抗體的CDR區(qū)和另一抗體的框架區(qū)?？扇芜x人源化scFv的框架和/或CDR區(qū)的氨基酸序列以減少其在人體中用作藥物時(shí)的抗原性。本發(fā)明提供分別包含序列SEQIDNO:24和SEQIDNO:26的16D3的scFv及其人源化形式。獲得抗體單鏈可變區(qū)的方法是技術(shù)人員所熟知的在本文實(shí)施例6中有所描述。例如該方法包括在不同反應(yīng)中擴(kuò)增和克隆人重鏈和輕鏈可變區(qū)的DNA序列，然后例如在VH和VL之間通過兩步聚合酶鏈反應(yīng)插入15個(gè)氨基酸的接頭序列(Gly4Ser)3(例如參見DieffenbachandDvel(sler，《PCR引物，實(shí)驗(yàn)手冊》(PCRPrimer,alaboratorymanual)(1995)，ColdSpringHarbourPress,Plainview，NY，USA)。然后將產(chǎn)生的片段插入到合適的載體中表達(dá)單鏈可變區(qū)片段成為可溶性或噬菌體展示的多肽。這些可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法實(shí)現(xiàn)，例如見Gilliand等，r^ywe^w詠era(1996)47:l-20所述。本發(fā)明還提供16D3的片段，這種片段為代表抗體16D3超變區(qū)或其組合的抗原結(jié)合多肽。可利用應(yīng)用生物系統(tǒng)合成儀通過合成而獲得這種多肽，所述多肽合成儀例如是可從Milligen(USA)獲得的9050型合成儀，或相關(guān)的技術(shù)類型。本發(fā)明的另一實(shí)施方式涉及抗體16D3的衍生物或其片段。更具體說，本發(fā)明涉及分別包含如公開的序列SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所示的重鏈可變區(qū)或輕鏈可變區(qū)，但其恒定區(qū)與16D3的不同的抗體。其其或者，本發(fā)明16D3抗體的衍生物包含16D3的如SEQIDNO:17(GYTFTDYY)、SEQIDNO:18(IYPGSGNT)、SEQIDNO:19(VRDSPFFDY)、SEQIDNO:20(QSLLNSGMRKSF)、SEQIDNO:21(WAS)和SEQIDNO:22(KQSYHLFT)序列中的至少兩個(gè)CDR，而CDR禾B/或恒定區(qū)之間的框架區(qū)不同。根據(jù)本發(fā)明的一實(shí)施方式，抗體16D3的衍生物或其片段與SEQIDNO:2和SEQIDNO:4所提供的16D3的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列有至少80。/。，具體至少85%，更具體至少90%，最具體至少95%的序列相同性。最具體說，本發(fā)明提供包含分別與CDR區(qū)內(nèi)的SEQIDNO:2和SEQIDNO:4序列有至少80。/。，具體至少85%，更具體至少90%，最具體至少95。/。序列相同的重鏈和/或輕^l可變區(qū)的抗體16D3的衍生物或其片段。框架區(qū)內(nèi)的序列相同性可以但不限于少于80%。也考慮包含至少兩個(gè)分別與序列SEQIDNO:17-22有至少80%，具體至少85%，更具體至少90%，最具體至少95%序列相同的CDR的衍生物。根據(jù)另一實(shí)施方式，本發(fā)明提供16D3的scFv的衍生物，這種衍生物包含的序列與SEQIDNO:24序列有至少80%，具體至少85%，更具體至少90%，最具體至少95%的序列相同性，和與SEQIDNO:26序歹U(最具體為CDR區(qū)內(nèi))有至少80。/。，具體至少85%，更具體至少90%，最具體至少95%的序列相同性。本發(fā)明的另一實(shí)施方式提供人源化的16D3衍生物或其片段。這種人源化的16D3衍生物為同系物在于它們保留對PLGF的結(jié)合親和力。按照一具體實(shí)施方式，人源化的16D3衍生物也保留了抑制PLGF活性的能力。非人抗體的人源化可通過取代抗體骨架上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸，即那些不參與抗體與抗原結(jié)合的氨基酸使其與人抗體骨架更相似而實(shí)現(xiàn)?？紤]人源化有不同的類型或水平。本發(fā)明的具體實(shí)施方式涉及含非人抗體或其片段的全部區(qū)域，更具體是其恒定區(qū)用人抗體的恒定區(qū)取代的抗體或片段，從而產(chǎn)生嵌合性(如人/鼠)抗體或片段。另一具體實(shí)施方式是將抗PLGF的非人抗體的抗原結(jié)合氨基酸序列(例如兩個(gè)或多個(gè)CDR)導(dǎo)入人抗體骨架中的抗體(例如，CDR嫁接抗體)。將非人單克隆抗體的結(jié)合互補(bǔ)決定區(qū)("CDR")與人框架區(qū)一具本是人基因的恒定C區(qū)聯(lián)合的方法是技術(shù)人員熟知的，例如見Jones等，Nature(1986)321:522或Riechmann，Nature(1988)332:323中所述。或者也可考慮取代本發(fā)明的非人抗PLGF抗體的更多個(gè)有限數(shù)目的氨基酸。本發(fā)明的具體實(shí)施方式涉及含有圖9人源化重鏈和/或輕鏈可變區(qū)或其一部分的抗體，和含有SEQIDNO:17-22的至少兩個(gè)，更具體3-5個(gè)，最具體所有6個(gè)CDR的抗體。本發(fā)明其它實(shí)施方式涉及的人源化抗體包含的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)分別與SEQIDNO:6和SEQIDNO:8的序列有至少80%，具體至少85%，更具體至少90%，最具體至少95%的序列相同?；蛘撸景l(fā)明提供的人源化抗體所含的至少兩個(gè)，更具體3-4個(gè)，最具體6個(gè)CDR分別與SEQIDNO:17-22的序列有至少80%，具體至少85%,更具體至少90%，最具體至少95。/。的序列相同。因此，本發(fā)明涉及衍生自鼠抗體16D3的人源化抗體和/或嵌合抗體或雜交抗體。在一具體實(shí)施方式中，突變鼠抗體16D3的特定氨基酸以消除免疫原性氨基酸。因此，在一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含SEQIDNO:2序列的重鏈可變區(qū)部分氨基酸序列的抗原結(jié)合分子，該分子中含有以下一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變I2V、P9A、K40A和/或TlllL。另外或或者，衍生自16D3抗體的人源化抗體是含有SEQIDNO:4序列的輕鏈可變區(qū)部分氨基酸序列的抗原結(jié)合分子，該分子中含有以下一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變S5T、S9D、，A15L、K18R、R22N禾口/或L89V。因此根據(jù)一具體實(shí)施方式，本發(fā)明提供的抗原結(jié)合分子含SEQIDNO:2序列的重鏈可變區(qū)部分氨基酸序列，其中有以下一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變I2V、P9A、K40A禾卩/或T111L。還含SEQIDNO:4序列的輕鏈可變區(qū)部分氨基酸序列，其中有以下一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變S5T、S9D、A15L、K18R、R22N禾口/或L89V。在另一實(shí)施方式中，通過將鼠抗體16D3的輕鏈和/或重鏈可變區(qū)嫁接到人免疫球蛋白框架中或偶聯(lián)于人抗體恒定區(qū)，更具體說人IgG的恒定區(qū)(人源化)進(jìn)一步人源化所述抗體。在該方面尤其適合的是能體內(nèi)激活自然殺傷細(xì)胞的IgGlK。因此在一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及雜交的Hul6D3-IgGlK。本發(fā)明的另一實(shí)施方式是雜交的Hul6D3-IgG4K雜交體。人lgG抗體(和因此也利用人IgG骨架禾卩/或恒定區(qū)獲得的雜交抗體)顯示半衰期延長，因此能提供非常穩(wěn)定的血液水平從而可大幅減少給藥的頻率。此外，采用人源化抗體或衍生物最大程度減少了誘導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明其它實(shí)施方式涉及作為抗體16D3或其片段同系物的抗原結(jié)合分子，即能結(jié)合16D3所結(jié)合的相同表位的抗原結(jié)合分子。在一實(shí)施方式中，所述同系物抗原結(jié)合分子通過免疫動(dòng)物(更具體為小鼠)產(chǎn)生，例如通過給小鼠注射PLGF，隨后將其脾淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合，然后鑒定產(chǎn)生抗PLGF抗體的培養(yǎng)細(xì)胞(例如通過篩選與PLGF的結(jié)合)并克隆它們。任選根據(jù)與16D3表位的反應(yīng)，或與16D3或其片段的競爭對鑒定的抗體作進(jìn)一步選擇。因此本發(fā)明還有一方面涉及產(chǎn)生本發(fā)明抗原結(jié)合分子的方法。這些方法包括但不限于本文實(shí)施例章節(jié)中所提供的人源化抗體16D3的方法。本發(fā)明還有一方面涉及提供編碼本發(fā)明的抗原結(jié)合分子，更具體說編碼其抗原結(jié)合區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明的具體實(shí)施方式涉及編碼分別由SEQIDNO:2和SEQIDNO:4序列所確定的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列，例如但不限于SEQIDNO:1和SEQIDNO:3的核苷酸序歹ij，此二序列對應(yīng)于細(xì)胞系16D3中編碼16D3抗體重鏈和輕鏈區(qū)的序列。在本發(fā)明上下文中還提供編碼如序列SEQIDNO:17-22所鑒定的單克隆抗體16D3的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明的具體實(shí)施方式包括編碼16D3的scFv和人源化scFv的(核苷酸)序列，例如但不限于分別為SEQIDNO:23和SEQIDNO:25的序列。本發(fā)明還提供編碼本文所述的16D3的衍生物及其片段的核苷酸。本發(fā)明還提供能特異性與上述核苷酸雜交的探針和引物，但不限于實(shí)施例章節(jié)中所述的引物。本發(fā)明還包括與編碼本文所述單克隆抗體，其衍生物或片段的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明還有一方面涉及本發(fā)明抗原結(jié)合分子的治療應(yīng)用。因此本發(fā)明提供本發(fā)明抗原結(jié)合分子作為藥物的應(yīng)用。在這方面，本發(fā)明提供包含至少一種或多種本發(fā)明抗原結(jié)合分子的藥物組合物，以預(yù)防或治療血管發(fā)生所導(dǎo)致的疾病或障礙。本發(fā)明治療和/預(yù)防血管發(fā)生所致疾病或障礙的方法，包括給予需要這種治療或預(yù)防的哺乳動(dòng)物治療有效量的含有本文所述至少一種或多種抗原結(jié)合分子的組合物。在這些疾病中，所述血管發(fā)生也稱為"病理性血管發(fā)生"。這種病理性血管發(fā)生的例子包括在以下器官組織中觀察到的血管發(fā)生血管(動(dòng)脈粥樣硬化、血管瘤、血管內(nèi)皮瘤)；骨和關(guān)節(jié)(類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、滑膜炎、骨和軟骨損傷、骨髓炎、血管翳生長、骨贅形成、贅生物和轉(zhuǎn)移性腫瘤)；皮膚(疣、化膿性肉芽腫、毛發(fā)生長、卡波齊氏肉瘤、傷疤瘢痕、過敏性水腫，贅生物)；肝；腎；肺；耳和其它上皮(這些器官的炎癥和感染，包括肝炎、腎小球腎炎、肺炎、哮喘、鼻息肉、中耳炎、移植、再生、贅生物和轉(zhuǎn)移性腫瘤灶)；某些子宮、卵巢和胎盤疾病(功能障礙性子宮出血，例如由于子宮內(nèi)避孕器具，毛囊囊腫形成、卵巢過度刺激綜合征、子宮內(nèi)膜異位、贅生物)；腦和神經(jīng)疾病(贅生物和轉(zhuǎn)移性腫瘤)；某些心肌和骨骼肌疼痛(例如由于勞累過度)；脂肪組織疾病(肥胖癥)和內(nèi)分泌器官疾病(甲狀腺炎、甲狀腺腫大、胰腺移植)。病理性血管發(fā)生還可導(dǎo)致血細(xì)胞生成疾病(AIDS、卡波齊氏肉瘤)，血液惡性腫瘤(白血病等)。許多眼科疾病中，認(rèn)為病理性血管發(fā)生是重要因素，因此可考慮用本發(fā)明的抗原結(jié)合分子治療。在視網(wǎng)膜缺血疾病中視網(wǎng)膜供血和供氧減少，視網(wǎng)膜外圍部分喪失了營養(yǎng)來源而停止了正常功能。視網(wǎng)膜疾病的共同原因是中央視網(wǎng)膜靜脈阻塞、頸動(dòng)脈狹窄、糖尿病(糖尿病性視網(wǎng)膜疾病)和貧血(鐮狀紅細(xì)胞視網(wǎng)膜病)。視網(wǎng)膜疾病也見于早產(chǎn)嬰兒(早產(chǎn)網(wǎng)膜疾病)。糖尿病性視網(wǎng)膜疾病是糖尿病病人失去視力的主要原因。在缺血的視網(wǎng)膜中，會(huì)長出新的血管(新生血管發(fā)生)。這些血管常生長在視網(wǎng)膜表面、視神經(jīng)、或眼睛的前部虹膜上。這種新血管不能提供所需的營養(yǎng)，反而可導(dǎo)致許多問題，例如玻璃體出血、視網(wǎng)膜剝離和失控性青光眼。這些問題的發(fā)生是由于新血管脆弱容易出血。假如在疾病早期階段，有時(shí)可用全視網(wǎng)膜光照凝固法阻止增殖性糖尿病視網(wǎng)膜疾病。但是，在一些病例中，玻璃體切除手術(shù)是唯一的選擇。認(rèn)為血管發(fā)生起關(guān)鍵作用的其它眼科疾病有脈絡(luò)膜和其它眼內(nèi)疾病、白軟化(leukomalacia)，和贅生物與轉(zhuǎn)移性腫瘤。脈絡(luò)膜新血管發(fā)生源自脈絡(luò)膜的新血管生長穿過布魯赫膜(脈絡(luò)膜基底膜)中的裂孔進(jìn)入視網(wǎng)膜下色素上皮或視網(wǎng)膜下空隙。CNV的位置、生長模式和類型(1或2)取決于患者年齡和所患疾病。隨著進(jìn)一步的生長導(dǎo)致的出血和滲出是視覺癥狀的原因。脈絡(luò)膜新血管發(fā)生(CNV)是視力喪失的主要原因。估計(jì)CNV可導(dǎo)致康復(fù)期5-10。/。的人發(fā)生近視和事實(shí)上所有的脈絡(luò)膜破裂；但15-30%患者中大多數(shù)發(fā)生自發(fā)性復(fù)發(fā)，CNV可能重新發(fā)生并導(dǎo)致出血或嚴(yán)重的黃斑剝離伴視力喪失。術(shù)語"肺動(dòng)脈高壓"指肺動(dòng)脈血壓異常升高的疾病。在沒有其它心肺疾病時(shí)，稱為原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓。由于病理性血管發(fā)生產(chǎn)生肺動(dòng)脈彌散狹窄，隨后發(fā)生的肺動(dòng)脈高壓是對血流阻力升高的一種反應(yīng)。其發(fā)生率為大于8/10萬人。然而，肺動(dòng)脈高壓也可以是慢性阻塞性肺病，例如肺氣腫、慢性支氣管炎、彌漫性間質(zhì)纖維化和哮喘樣COPD病人的并發(fā)癥。COPD的發(fā)生率約為大于5/l萬人。由于血管發(fā)生而導(dǎo)致的疾病考慮可用本發(fā)明抗原結(jié)合分子治療的例子是炎性疾病群。本文所用的"炎癥"指對活組織損傷(即物理、化學(xué)或由于感染)的局部不可控反應(yīng)，尤其是小血管、它們的內(nèi)含物和它們的相關(guān)結(jié)構(gòu)的局部反應(yīng)。血液成分通過血管壁進(jìn)入組織是炎癥標(biāo)志，形成的組織聚集定義為分泌物和水腫。任何傷害活組織的有害過程例如有但不限于細(xì)菌感染、過熱、過冷、機(jī)械損傷如擠壓、酸、堿、輻射或病毒感染都可導(dǎo)致炎癥，不論涉及到器官或組織。這種"炎性疾病"包括的反應(yīng)范圍從燒傷到肺炎、麻風(fēng)病、結(jié)核病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。術(shù)后粘連形成(POA)是婦科、骨盆、心臟病外科手術(shù)常見的外科并發(fā)癥。組織的外科創(chuàng)傷常導(dǎo)致創(chuàng)傷組織與其相連器官的永久性瘢痕形成。因此在這種創(chuàng)傷部位，正常情況下保持分離的內(nèi)部組織常粘連在一起。粘連形成(adhesionformation)產(chǎn)生的并發(fā)癥有腸梗阻、小腸梗阻、慢性盆腔疼痛和婦女不育。術(shù)語"粘連形成"的醫(yī)學(xué)含義指共凝結(jié)、兩表面或兩部分的粘連或合并過程。例如，傷口的相對表面或腹膜的相對表面結(jié)合在一起。粘連的復(fù)數(shù)詞還指連接相對漿膜表面的炎癥帶。本文所用術(shù)語"粘連"還包括纖維性粘連，這種粘連是由血漿或淋巴滲出，或血液外滲而產(chǎn)生的纖維蛋白細(xì)絲組成。瘢痕瘤，創(chuàng)傷區(qū)域偶然自發(fā)性生長過度的光滑纖維組織也是一種粘連形式。已證明抑制胎盤生長因子(PLGF)可導(dǎo)致明顯抑制手術(shù)后的粘連形成(W003063904)。此外，己證明以骨吸收為特征的疾病，例如但不限于骨質(zhì)疏松也可受益于抑制PLGF(W02004002524)。因此，根據(jù)具體實(shí)施方式本發(fā)明的抗原結(jié)合分子特別適合于治療和/或預(yù)防腫瘤生長和轉(zhuǎn)移、眼科疾病、炎癥、粘連形成和肺動(dòng)脈高壓。本發(fā)明另一具體實(shí)施方式涉及用本發(fā)明的抗原結(jié)合分子預(yù)防和/或治療癌癥，例如但不限于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、子宮癌和骨髓癌。更具體說，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的抗原結(jié)合分子預(yù)防和/或治療實(shí)體腫瘤，例如但不限于結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌和黑色素瘤。本文中還提供了更具體的數(shù)據(jù)證明本發(fā)明的抗體特別適合于消退人胰腺腫瘤。本發(fā)明的抗體還已證明能顯著地減少體內(nèi)腫瘤的大小，證明能減少腫瘤體積達(dá)50%。因此本發(fā)明提供了減少腫瘤至少20%，更具體至少30%，最具體至少50%的方法和藥物組合物。本發(fā)明另一具體實(shí)施還涉及用本發(fā)明的抗原結(jié)合分子治療或預(yù)防骨疾病，更具體說治療骨吸收增強(qiáng)疾病，例如骨質(zhì)疏松或骨軟化癥。因此，本發(fā)明涉及本發(fā)明的抗原結(jié)合分子在制備治療上述疾病的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明一個(gè)重要方面是用所述抗體、其片段和衍生物允許治療和/或預(yù)防上述疾病而不產(chǎn)生其它抗血管發(fā)生治療，更具體說，其它靶向血管發(fā)生因子的治療，例如VEGF所導(dǎo)致的或預(yù)期可導(dǎo)致的副作用。早在1999年用重組人抗VEGF抗體的臨床前安全試驗(yàn)已證明抑制VEGF可導(dǎo)致抑制生理性血管發(fā)生，更具體說縱向骨生長中的新血管發(fā)生和黃體形成(Ryan等，1999，Toxicologicpathology27(1):78-86)。近年研究報(bào)導(dǎo)VEGF抑制劑導(dǎo)致健康氣管和甲狀腺中的血管消退，這將導(dǎo)致器官功能障礙(Baffert等，2004，CircRes94:984-992;Inai等，2004AmJPathol165:35-52)。然而貝伐單抗(bevacizumab)，一種近年投放市場的作為血管發(fā)生抑制劑的抗人VEGF抗體，由于這種抗血管發(fā)生方法對腫瘤消退具有總體療效，盡管觀察到其對創(chuàng)傷愈合、血壓和血栓形成有危險(xiǎn)影響。本發(fā)明的抗PLGF抗體及其衍生物能抑制不良血管發(fā)生而對血壓、創(chuàng)傷愈合、血栓形成危險(xiǎn)和健康器官的血管消退沒有可見的副作用。本發(fā)明一具體實(shí)施方式涉及包含活性成分單克隆抗體16D3或其片段或衍生物，與藥物學(xué)上可接受的運(yùn)載體混合的藥物組合物。本發(fā)明的藥物組合物包括治療有效量的一種或多種抗原結(jié)合分子。類似地，本發(fā)明提供的治療和預(yù)防方法包括給予治療有效量的一種或多種本發(fā)明的抗原結(jié)合分子。本文所用的治療有效量指治療哺乳動(dòng)物的用量范圍為約每千克體重0.5mg(mg/kg)到約50mg/kg，更具體為約l-10mg/kg。應(yīng)知道，鑒于大多數(shù)人IgG抗體的半衰期較長，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子是這種類型的單克隆抗體，這將使患者享受舒服的定期治療。本發(fā)明另一個(gè)方面提供的藥物組合物包含本發(fā)明的抗原結(jié)合分子和其它抗血管發(fā)生藥，提供的治療方法是同時(shí)或依次給予本發(fā)明的抗原結(jié)合分子和其它抗血管發(fā)生藥。實(shí)際上，本發(fā)明證明了本發(fā)明的抗原結(jié)合分子和其它抗血管發(fā)生藥，例如抗VEGF抗體聯(lián)用對抑制腫瘤生長具有疊加效果。更具體說，證明了聯(lián)用本發(fā)明的16D3抗體和Avasth^能夠減少腫瘤體積約達(dá)70。/a，而不論增加單用的Avastir^還是增加單用的抗PLGF抗體劑量都不能在相同條件下達(dá)到腫瘤體積減少高于55。/。。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知適當(dāng)?shù)钠渌寡馨l(fā)生產(chǎn)品，它們的使用劑量也取決于它們所屬的種類。抗血管發(fā)生藥的例子包括直接作用于VEGF的VEGF抑制劑，例如商品名為AvastinTM的抗VEGF抗體或作用于VEGF受體的抗體。本發(fā)明的抗體使已知會(huì)誘導(dǎo)許多上述副作用的VEGF抑制性抗血管發(fā)生藥的用量減少成為可能。本發(fā)明的藥物組合物還包含治療有效量的其它抗所治療疾病的活性化合物/藥物，更具體說包含治療腫瘤生長、炎癥、眼科疾病和肺動(dòng)脈高壓的其它化合物和藥物。本發(fā)明藥物組合物中使用的適當(dāng)藥物運(yùn)載體在《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington'sPharmaceuticalSciences)第16版(1980)中有所描述，它們的配制是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。它們包括任何和所有的溶劑、分散劑、包衣、抗菌劑和抗真菌劑(例如酚，山梨酸，三氯叔丁醇)、等滲劑(例如糖或氯化鈉)等。也可包括其它成分以控制該組合物中單克隆抗體活性成分的持續(xù)作用時(shí)間。因此，通過選擇合適的聚合物載體，例如聚脂、聚氨基酸、聚乙烯吡咯垸酮、乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、甲基纖維素、羧甲基纖維素、硫酸魚精蛋白等而獲得控釋組合物。也可以通過將單克隆抗體活性成分摻入顆粒中，例如聚合物基質(zhì)，如水凝膠、聚乳酸、羥甲基纖維素、聚甲基丙烯酸甲酯和其它上述聚合物的微膠囊中來控制藥物釋放速率和作用持續(xù)時(shí)間。這些方法包括膠體藥物遞送系統(tǒng)，例如脂質(zhì)體、微球、微乳劑、毫米微球、毫米微乳液、納米顆粒、納米膠囊等等。根據(jù)給藥途徑，包含活性成分的該藥物組合物可能需要保護(hù)性包衣。適合注射用的藥物包括可即時(shí)制備制劑的無菌水溶液或分散劑和無菌粉劑。因此通常的運(yùn)載體包括生物相容的緩沖水溶液、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇和它們的混合物。本發(fā)明的抗原結(jié)合分子可以本領(lǐng)域熟知的任何方法提供給病人，即口服、鼻內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腸胃道外或插入導(dǎo)管方法。根據(jù)本發(fā)明的一具體方面，本發(fā)明的抗原結(jié)合分子通過基因治療給予?；诨蛑委煹目贵w可克服與給予抗體相關(guān)的許多可能的限制，例如大規(guī)模生產(chǎn)、生物學(xué)干擾、單價(jià)抗體的快速血液清除和低保留。體內(nèi)生產(chǎn)的抗體免疫原性弱更易耐受，能產(chǎn)生有效和持久水平的抗原結(jié)合分子或其片段。此外遺傳學(xué)方法有可能提供具有新功能的抗原結(jié)合分子。已證明用病毒載體體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因體內(nèi)不同的細(xì)胞或組織產(chǎn)生和全身性遞送單克隆抗體具有可行性(Pelegrin等，2004，GeneTher4:347-356)。還已證明經(jīng)用含有抗血管發(fā)生活性的抗層粘連蛋白抗體基因修飾纖維肉瘤細(xì)胞可以減少體外和體內(nèi)的腫瘤生長(Sanz等，2001，CancerImmunolImmunother50:557-565)。因此，根據(jù)這種實(shí)施方式，本發(fā)明提供治療以本文所述病理性血管發(fā)生為特征疾病的基因治療所用的抗原結(jié)合分子的編碼核苷酸。具體說，本發(fā)明提供了用于基因治療的包含編碼SEQIDNO:2序列所確定的重鏈可變區(qū)核苷酸序列和/或SEQIDNO:4序列所確定的輕鏈可變區(qū)核苷酸序列的組合物。更具體說，本發(fā)明提供的組合物包含細(xì)胞系16D3中與編碼抗體16D3重鏈和輕鏈區(qū)的序列相對應(yīng)的SEQIDNO:l和/或SEQIDNO:3的核苷酸序列。包含編碼SEQIDNO:17-22所確定的單克隆抗體16D3的一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)的核苷酸序列的本發(fā)明組合物也屬于本發(fā)明的內(nèi)容。本發(fā)明的具體實(shí)施方式包括編碼16D3的scFv和人源化scFv的序列，例如但不限于分別為SEQIDNO:23和SEQIDNO:25的序列。本發(fā)明的治療和/或預(yù)防方法可包括以藥物組合物名稱給予，優(yōu)選順序給予病人治療有效量的上述抗血管發(fā)生或抗腫瘤藥物以進(jìn)一步治療和或預(yù)防相同的病理性血管發(fā)生疾病。本文所用的順序給藥指將本發(fā)明的配體和已知的抗血管發(fā)生藥依次而不是同時(shí)給予患者。本發(fā)明還有一方面涉及用本發(fā)明的抗原結(jié)合分子免疫學(xué)檢測人樣品中的PLGF和作為適合于這種檢測的試劑盒成分?？乖拿庖邔W(xué)檢測方法是本領(lǐng)域所熟知的，包括但不限于ELA，ELISA和RIA和免疫組織化學(xué)方法?？梢蚤g接檢測本發(fā)明的鼠抗體與PLGF抗原的結(jié)合，例如通過標(biāo)記的抗鼠抗體檢測?；蛘?，可以直接標(biāo)記抗體或其片段。本發(fā)明這方面的具體實(shí)施方式涉及在鑒定對用抗PLGF治療敏感的病人中采用抗PLGF的抗體和其抗原結(jié)合片段。這在癌癥治療中特別有意義。本發(fā)明還有一方面涉及用本發(fā)明的抗原結(jié)合分子作為診斷工具。本領(lǐng)域已證明在許多疾病中PLGF表達(dá)上調(diào)。更具體說，已證明許多腫瘤過量表達(dá)PLGF?？捎帽景l(fā)明的人源化抗體或抗體片段來診斷這些疾病，例如通過標(biāo)記本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合片段使其在體內(nèi)可被觀察的成像技術(shù)。用于本發(fā)明抗原結(jié)合分子體內(nèi)結(jié)合成像的各種標(biāo)記是本領(lǐng)域熟知的，包括但不局于光(熒光)、金屬和磁性標(biāo)記，各需要專門的(輻射和)檢測儀器。本發(fā)明此方面的具體實(shí)施方式涉及用本發(fā)明的抗體來預(yù)測疾病發(fā)展和決定治療方案。本發(fā)明還有一方面涉及在動(dòng)物模型中用本發(fā)明的抗原結(jié)合分子篩選與抗PLGF治療聯(lián)用的化合物?？紤]這種模型包括但不限于人腫瘤細(xì)胞在nu/nu小鼠中的生長和發(fā)育的腫瘤模型。將待測化合物和本發(fā)明的抗體或片段聯(lián)合給藥可以鑒定所述化合物是否對本發(fā)明的抗體或片段單獨(dú)給藥時(shí)所觀察到的效果有加成作用。其它方面例如也可用這種方法檢測化合物與抗PLGF抗體聯(lián)用有無反作用或毒性。除上述治療應(yīng)用外，可用本發(fā)明的上述核苷酸序列來產(chǎn)生抗體和其它抗原結(jié)合分子，例如通過重組技術(shù)。因此，本發(fā)明還提供了產(chǎn)生重組抗體和抗體片段的方法，包括克隆和操作抗體基因，用上述核苷酸序列產(chǎn)生scFv和其它抗原結(jié)合分子。這些方法的程序本領(lǐng)域已有。另外，可采用能特異性與本發(fā)明核苷酸序列雜交的探針來篩檢本發(fā)明抗體和抗體片段的表達(dá)。本發(fā)明將通過以下實(shí)施例作進(jìn)一步描述，提供這些實(shí)施例的唯一目的是說明本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例l-鼠抗人PLGF抗體(16D3)的產(chǎn)生和鑒定1.小鼠免疫和融合抗人PLGF單克隆抗體的產(chǎn)生基本上如Galfre和Milstein所述(Galfr6F，MilsteinC.《單克隆抗體的制備策略和程序》(Preparationofmonoclonalantibodies:strategiesandprocedures).MethodEnzymol1981;73:3-46)。簡單說，給PLGF基因敲除小鼠(Lu加n等，2002，BiochemBiophysResComm295(2):428-34，Ca腦liet等，(2001)，NatMed7:575-593或WO01/85796)皮下注射50pg用弗氏完全佐劑配制的重組人PLGF-2(畢赤酵母菌生產(chǎn))進(jìn)行免疫，兩周后皮下注射50叫用弗氏不完全佐劑配制的重組人PLGF。10天后從老鼠尾部收集血樣品(約lOOfil)。用ELISA檢測血清中的抗PLGF抗體，用包被人PLGF抗原的的微量滴定板捕捉該抗體，采用稀釋血清(l/500-l/80000)和偶聯(lián)辣根過氧化物酶(HRP)的羊抗小鼠IgG檢測。在至少間隔6周之后，用鹽水配的50嗎重組人PLGF腹腔加強(qiáng)免疫小鼠(高陽性反應(yīng))，4-2天后進(jìn)行細(xì)胞融合。分離脾細(xì)胞與Sp2/0-Ag14骨髓瘤細(xì)胞融合。用含次黃嘌吟、氨四囈呤、胸腺嘧啶脫氧核苷的培養(yǎng)基選擇后，如上所述將陽性克隆的培養(yǎng)上清加入ELISA進(jìn)行篩選。2.在ProSepvAUltra上純化抗體按照制造商提供的程序在ProSepvAUltra(Milipore)上進(jìn)行親和層析純化細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體。簡單地說，將150mMNaCl加入上清中上樣到已用PBS預(yù)平衡的ProSepvAUltra柱上。用PBS洗滌層析柱和用0.1M甘氨酸pH2.8洗脫結(jié)合蛋白。用PBS透析洗脫蛋白。分別用還原和非還原條件的SDS-PAGE檢査純化的洗脫蛋白。3.16D3/hul6D3(如實(shí)施例2所述獲得)與PLGF的結(jié)合(參見圖1)4。C用PBS配的l嗎/mlhuPLGF-2(Pichia)包被ELISA板，100fil/孔。室溫用1%的BSA封閉1小時(shí)后，加入16D3/hul6D3的系列稀釋液，100^/孔，室溫使抗體結(jié)合1小時(shí)。室溫用羊抗人或羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)，腳l/孔，1小時(shí)檢測結(jié)合的16D3。該試驗(yàn)用OPD顯色。4.抑制PLGF與huFlt-l受體的結(jié)合(參見圖2)4。C用l嗎/mlhuPLGF-l(R&DSystems)包被ELISA板，2(K)(il/孔。室溫用1%的BSA封閉1小時(shí)后，加入16D3/hul6D3的系列稀釋液，10(^1/孔，并加入100^1/孔的huPLGF-2。室溫孵育2小時(shí)后，室溫用羊抗人huPLGF，180|_11/孔，1小時(shí)，隨后與RAG-HRP(DAKO)孵育1小時(shí)檢測結(jié)合的PLGF。該試驗(yàn)用OPD顯色。5.用Biacore試驗(yàn)進(jìn)一步鑒定16D3和Fab16D3*抑制:利用EDC/NHS化學(xué)試劑將rhuPLGF-2(Pichia，TX)固定于CM5芯片上，給予412RU。注入16D3后注入rhuFlt-l/Fc嵌合體(R&DSystems)。也用緩沖液替代鼠抗體實(shí)施此試驗(yàn)。在陰性對照流體通道中也注入此二種物質(zhì)并已扣除其值。此試驗(yàn)用pH9.6磷酸鹽緩沖液進(jìn)行。將rhuFlt-l和rhuPLGF-2的最大結(jié)合進(jìn)行比較，如果先注射16D3或16D3Fab則rhuFlt-I的信號(hào)減弱(圖3)。6.鼠16D3可變區(qū)的克隆和測序mRNA分離:用QuickPrep微小mRNA純化試劑盒(AmershamBiosciences)分離16D3雜交瘤細(xì)胞的mRNA。用第一鏈cDNA合成試劑盒(AmershamBiosciences)中的pd(N)6引物來制備該mRNA的cDNA。皿重鏈和輕鏈可變區(qū)的序列通過用以下引物的組合進(jìn)行PCR獲得8個(gè)引物開始于前導(dǎo)序列，2個(gè)引物開始于重鏈恒定區(qū)，ll個(gè)引物開始于前導(dǎo)序列，l個(gè)引物開始于輕鏈恒定區(qū)。用不同的引物組合進(jìn)行8次和11次PCR反應(yīng)。擴(kuò)增抗體16D3重鏈所用引物MHVR35'-ATGGRATGCJAGCTGKATCWTTHTC-3，(SEQIDNO:9)MHCR15，-CASACAGGGGCCAGTGGATAGAC-3，(SEQIDNO:10)擴(kuò)增抗體16D3輕鏈所用引物MKVR35'-ATGRAGTCACAKACYCAGGTCTTYRTA'3'(SEQIDNO:11)5'-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGG-3'(SEQIDNO:12)PCR設(shè)定94。C變性10分鐘，94"變性30秒，55。C退火30秒，72。C延伸1分鐘，72。C延伸5分鐘，30輪循環(huán)。SEQIDNO:9-11的序列中的豐余度用常規(guī)縮寫R=A或G，K=G或T，W=A或T，H^A或C或T，S^C或G，YK:或T，M-A或C表示?？寺『蜏y序:將PCR產(chǎn)物加到瓊脂糖凝膠上，選擇亮帶，純化(QIAquicl,凝膠抽提試劑盒，QiagenGmbH)并克隆入ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒提供的PCR⑧4Blunt-TOPO⑧載體中用于測序(InvitrogenTMlifetechnologies)。用高純度質(zhì)粒分離試劑盒(RocheDiagnosticsGmbH)制備質(zhì)粒DNA，插入序列用T7和M13反向引物在ABIPRISM310(PEAppliedBiosystems)上測序?？贵w16D3重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列在SEQIDNos1，2，3和4中列出(參見圖11)實(shí)施例2-人源化抗人PLGF抗體的產(chǎn)生和鑒定1.人源化16D3的構(gòu)建可變區(qū)的人源化制作以下突變以人源化鼠抗體16D3的可變區(qū)部分:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>用QuickChange⑧多點(diǎn)定向誘變試劑盒(Stratagene,制作突變。在1PCR中采用含突變的l-5個(gè)引物。挑出轉(zhuǎn)化的菌落測定其DNA序列確定含最多點(diǎn)突變的克隆。取此克隆重復(fù)此程序直至其序列中存在所有的突變。連接可變區(qū)與人IgG恒定區(qū)進(jìn)行PCR以獲得加入了適當(dāng)限制性位點(diǎn)的人源化重鏈和輕鏈可變區(qū)輕鏈可變區(qū)的引物ji,.、J、，(SEQIDNO:14)重鏈可變區(qū)的引物引物3:5'-CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTG-3,(SEQIDNO:15)弓I物4:5'-GATGGGCCCT丁GGTCGACGCTGAGGAGACTGTGAGCAGG((SEQIDNO:16)PCR設(shè)定94t:變性5分鐘，94。C變性30秒，6(TC退火30秒，72。C延伸30秒，72"C延伸5分鐘，25輪循環(huán)。將PCR產(chǎn)物加到瓊脂糖凝膠上，選擇條帶并純化(QIAquid^凝膠抽提試劑盒，QiagenGmbH)。用Sail消化16D3重鏈可變區(qū)的PCR產(chǎn)物，用Eco47IH和Sail酶切含人抗體(IgG4)重鏈完整恒定區(qū)的載體pKANEO-MCS50-Hleu-vartt24并連接。先將輕鏈可變區(qū)的PCR產(chǎn)物克隆入由ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒提供的PCR4Blunt-TOPO⑧載體中進(jìn)行測序(InvitrogenTMlifetechnologies)。用Agel和BsiWI酶切輕鏈可變區(qū)將其克隆入已含人k輕鏈恒定區(qū)的載體pKANEO-CM30-L-var井7中。用Pmel和Pacl酶切從該載體中取出輕鏈表達(dá)盒將其加入到含重鏈的載體從而將兩個(gè)載體裝配成一個(gè)載體人源化抗體16D3的重鏈和輕鏈可變區(qū)核苷酸和氨基酸序列在SEQIDNo5，6，7和8中列出(參見圖12)。2.Hul6D3的瞬時(shí)表達(dá)按制造商說明書用FreeStyle293表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen)在HEK293細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)hul6D3IgG4K。在proSepvAUltra儀上用親和層析純化上清液中的hul6D3。純化的hul6D3分別用還原和非還原條件的SDS-PAGE述核査純度。用ELISA進(jìn)一步檢測hul6D3與huPLGF的結(jié)合和對HuFLT-l/huFLT-l結(jié)合的抑制。實(shí)施例3-體內(nèi)研究抗PLGF抗體抑制腫瘤生長1.材料和方法概述細(xì)胞培養(yǎng)小鼠胰腺細(xì)胞系Panc02和人胰腺細(xì)胞系DanG為S.Rosewicz贈(zèng)送(Char股-UniversitatsmedizinBerlin,德國)。人乳腺M(fèi)DA-MB、結(jié)腸LOVO和黑色素瘤細(xì)胞系獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC;Manassas,VA，USA)。所有細(xì)胞都按推薦方法培養(yǎng)。在所有體內(nèi)試驗(yàn)中采用鼠16D3抗PLGF抗體以避免產(chǎn)生對該抗體的免疫應(yīng)答。動(dòng)物試驗(yàn)所有動(dòng)物試驗(yàn)程序完全獲得動(dòng)物保護(hù)和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)。雌性NMRInu/nu小鼠飼養(yǎng)在半無菌條件下，常規(guī)使用8-10周齡小鼠(大約體重25g)，為了制備腫瘤來源，用胰蛋白酶處理腫瘤細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌。將離心沉淀細(xì)胞重懸于200^1PBS并注射入小鼠右腹皮下。對于常位胰腺腫瘤模型，通過腹側(cè)剖腹將含1X106個(gè)腫瘤細(xì)胞的30|ilPBS注射入9-10周齡雌性C57B16小鼠胰腺頭部。在操作之前，用氯胺酮(卯mg/kg體重)和甲苯噻嗪(9mg/kg體重)麻醉小鼠。藥物給藥(例如抗體、運(yùn)載體等)當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約60mm3時(shí)開始用抗體或?qū)φ者\(yùn)載體治療。每隔一天按所示劑量腹膜內(nèi)給予抗體P15D11D4(W001/85796)、16D3、1C8或運(yùn)載體。每周兩次按所示劑量腹膜內(nèi)注射Avastin。腫瘤測量每隔一天用卡尺測量皮下生長的腫瘤，用公式p/6(wlXw2Xw3)計(jì)算腫瘤體積，此式中"wl"和"w2"分別代表腫瘤的最大和最小直徑。當(dāng)處死小鼠時(shí)，用相同方法測量腹膜剖腹后胰腺的常位生長腫瘤。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析為了成對觀測，利用GraphPad統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(GraphPadSoftwareInc.，San-Diego，CA)以雙尾斯氏t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。除非另有指明，所有數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM。除非另有指明，*p<0.5，**p<0.01。2.鼠抗-hPLGF抗體16D3抑制人胰腺DanG皮下異種移植腫瘤模型的腫瘤生長將1乂106個(gè)腫瘤細(xì)胞注射入11周齡雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約60mm3時(shí)，開始用抗-hPLGF(16D3，50mg/kg體重;n=10)、抗-mPLGF(PL5D11D4，按WO01/85796所述獲得，50mg/kg體重；n=10)、對照IgG(lC8;50mg/kg體重；n=10)、抗-hPLGF和抗-mPLGF聯(lián)用(各25mg/kg體重；11=10))和運(yùn)載體(11=10)治療。每隔一天腹膜內(nèi)(i.p.)注射抗體。(A)每隔一天測量腫瘤和用公式W1XW2XW2Xp/2計(jì)算腫瘤體積，此式中"W1"和"W2"代表腫瘤的最大和最小直徑。(B)腫瘤接種后18天處死小鼠，切下腫瘤并稱重。平均腫瘤體積運(yùn)載體915士卯mm3，IgG:士89mm3，PL5D11D4:832土118mm3，16D3:521士83mm3，PL5D11D4+16D3:497土86mm3。結(jié)果見圖4，表明給予抗人PLGF抗體16D3對腫瘤重量和大小有明顯的影響。3.抗-hPLGF以劑量依賴方式下抑制人胰腺DanG皮下異種移植腫瘤模型中的腫瘤生長將1乂106個(gè)腫瘤細(xì)胞注射入11周齡雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約60mm3時(shí)，用抗-hPLGF、IgG(lC8;50mg/kg)、16D3(50mg/kg、37.5mg/kg、25mg/kg、12.5mg/kg體重，對于各種濃度11=10)和運(yùn)載體(11=10)治療。(B)腫瘤接種后18天處死小鼠。結(jié)果見圖5，平均腫瘤體積值士SEM:16D3，50mg/kg體重450士37mm3;37.5mg/kg體重469±97mm3;25mg/kg體重493±107mm3;12.5mg/kg體重693±107mm3;IC8:865±109mm3;運(yùn)載體889±100mm3。4.抗-huPLGF抑制皮下人乳腺M(fèi)DA-MB異種移植腫瘤模型中的腫瘤生長將1乂107個(gè)腫瘤細(xì)胞注射入11周齡雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到約60mm3后，用抗-hPLGF、16D3(50mg/kg體重；11=10)和運(yùn)載體(11=10)治療。結(jié)果見圖6(和下表1)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>5.抗-huPLGF抑制人結(jié)腸LOVO皮下異種移植腫瘤模型中的腫瘤生長將1乂107個(gè)腫瘤細(xì)胞注射入11周齡雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到約60mm3后，用抗-hPLGF、16D3(50mg/kg體重；11=10)和運(yùn)載體(11=10)治療。結(jié)果見圖7和下表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>6.抗-huPLGF抑制人黑素瘤Mel2a皮下異種移植腫瘤模型中的腫瘤生長將2乂106個(gè)腫瘤細(xì)胞注射入11周齡雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到約60mm3后，用抗-hPLGF、16D3(50mg/kg體重；n-10)和運(yùn)載體(^10)治療。結(jié)果見圖8和下表3。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>實(shí)施例4:體內(nèi)研究用16D3抗體治療對體重減輕的影響材料和方法如實(shí)施例3所述將1乂106個(gè)腫瘤細(xì)胞注射入11周齡雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到約60mm3時(shí)，用抗-hPLGF(16D3，50mg/kg體重；每種濃度n=10)、抗-mPLGF(PL5D11D4;50mg/kg體重；n=10)、對照IgG(lC8;50mg/kg體重;n=10)、抗-hPLGF和抗-mPLGF聯(lián)用(每種25mg/kg體重；r^lO)和運(yùn)載體(『10)治療。每隔一天i.p.注射抗體。在抗體治療的第一天和最后一天測量小鼠體重。從體重中扣除腫瘤重量后再計(jì)算體重減輕的百分比。結(jié)果見圖9。表明抗-hPLGF能防止人胰腺DanG皮下異種移植腫瘤模型中的動(dòng)物體重減輕。實(shí)施例5:聯(lián)用抗-hPLGF和抗-VEGF抗體治療腫瘤生長材料和方法如實(shí)施例3所述。將1乂106個(gè)腫瘤細(xì)胞注射入11周齡雌性NMRInu/nu小鼠的右腹皮下。當(dāng)腫瘤大小達(dá)到約60mm3時(shí)，用抗-hPLGF(16D3，50mg/kg、37.5mg/kg、12.5mg/kg體重，每隔一天i.p.注射，各種濃度n40)、Avastin(各15mg/kg和5mg/kg體重，一周兩次i.p.注射，n-10)以及聯(lián)用抗-hPLGF(12.5mg/kg體重)與Avastin(5mg/kg體重，n-10)進(jìn)行治療。腫瘤接種后20天處死小鼠。結(jié)果見圖10。平均腫瘤體積土SEM:1C8，37;37.5mg/kg體重954il64mm3;12.5mg/kg體重1398±236mm3;IgG:1789±231mm3;Avastin:15mg/kg體重828±186mm3;5mg/kg體重926±202mm3;Avastin+16D3:569±94mm3;觀察到抗匿PLGF和Avastin對抑制人胰腺DanG皮下腫瘤的生長顯示了疊加作用。實(shí)施例6:產(chǎn)生16D3的scFv用含合適限制性結(jié)合位點(diǎn)和接頭的引物PCR擴(kuò)增重鏈和輕鏈可變區(qū)序列(按實(shí)施例1所述，分別獲得SEQIDNO:2和4)。在SOEPCR(通過重疊延伸進(jìn)行基因剪切)后將scFv克隆入pEE14.4(HindlII-EcorRI克隆位點(diǎn))(圖12)。以BamHI線性化后用Fugene6(BoehringerMannheim)和兩次稀釋亞克隆將scFvhpl6D3/pEE14.4轉(zhuǎn)染入CH-KI細(xì)胞。獲得并產(chǎn)生了單克隆scFvhpl6D3，6C5D4。將此克隆也用Producell與scFvhpl6D3/pKANEO-MCS50-dhfrl(Nhel-Notl克隆位點(diǎn))平行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞(圖13)。16D3scFv的核苷酸和氨基酸序列分別在序列SEQIDNO:23和SEQIDNO:24中列出。圖15還提供了重鏈和輕鏈可變區(qū)、接頭序列、HA-標(biāo)簽和His尾的氨基酸序列。實(shí)施例7:scFvl6D3的人源化如實(shí)施例2所述進(jìn)行scFv可變區(qū)的人源化。人源化16D3scFv的核苷酸和氨基酸序列分別在序列SEQIDNO:25和SEQIDNO:26中列出。圖15還提供了人源化scFv的重鏈和輕鏈可變區(qū)、接頭序列、HA-標(biāo)簽和His尾的氨基酸序列。實(shí)施例8:產(chǎn)生人源化的Fab16D31.擴(kuò)增人源化16D3scFv的VH和VL片段用于擴(kuò)增人源化16D3scFv的VH片段的引物—16.D3VhbackWunt5:-CAGGTCCAGCTGCAGCAGTCTG-3"(SEQIDNO:27)16D3VhforSal15，-GATGGGCCC丁TGGTCGACGCTGAGGAGAC丁G丁GAGCAGGG-3，(SEQIDNO:28)用于擴(kuò)增人源化scFvl6D3的VL片段的引物___16D3VLBackAgd5'-CCACCGGTCACATTGTGCTCACCCAGTC:TCC-3，(SEQIDNO:29)歸3VLForBsiW!5'-CACCGTACGTTTTATTTCCAACTTTGTCCCCGAG-3，(SEQIDNO:30)2.構(gòu)建重鏈和輕鏈載體先將輕鏈的PCR產(chǎn)物克隆入pCR4blunt-TOPO載體中，測序后用Agel和BsiWI消化取得輕鏈將其克隆入pKANEO-CM30-Lvar弁7載體中。將重鏈PCR產(chǎn)物消化后直接克隆入pKANEO-MCS50-Fabvar弁3載體中。3.連接重鏈與輕鏈構(gòu)建物用酶Pmel和Pad通過取出含輕鏈區(qū)段的表達(dá)盒將其加入到含重鏈區(qū)段的載體中，將含輕鏈和重鏈區(qū)段的兩個(gè)載體(上文所述)連接在一起獲得最終構(gòu)建物hpl6D3mutcmplFab/pKANEO-MCS50-Fabvar#3。(參見圖16)實(shí)施例9:分析scFv16D3和人源化scFv16D3與PLGF/flt-1的抗結(jié)合和抑制反應(yīng)(圖14)1.抗原結(jié)合ELISA4。C用含lpg/mlhuPLGF-l的PBS包被ELISA板，200|_11/孔。室溫用1。/。BSA封閉1小時(shí)后，加入scFv16D3/人源化scFv16D3的系列稀釋液，200pl/L，室溫讓抗體片段結(jié)合l小時(shí)。室溫與鼠抗HA然后與羊抗鼠IgG-HRP(Sigma)，170^1/孔培育1小時(shí)檢測結(jié)合的scFv16D3。此試驗(yàn)用OPD顯色。2.通過ELISA檢測對PLGF/Flt-1相互反應(yīng)的抑制4。C用l|ag/mlhuFlt-l(R&DSystems)包被ELISA板，200fil/孔，。室溫用1%BSA封閉1小時(shí)后，加入scFvl6D3/人源化scFvl6D3的系列稀釋液，100|11/孔，再另外加入100pl/孔的huPLGF-2。室溫培育2小時(shí)后，室溫用羊抗人PLGF(R&DSystems),180^1/孔，反應(yīng)1小時(shí)，然后室溫與RAG-HRP(DAKO)培育1小時(shí)，檢測結(jié)合的PLGF。此試驗(yàn)用OPD顯色。實(shí)施例10:分析人源化Fab16D3的抗原結(jié)合和對PLGF/flt-l相互反應(yīng)的抑制1.抗原結(jié)合ELISA4。C用含l嗎/mlhuPLGF-l的PBS包被ELISA板，腳l/孔。室溫用1%BSA封閉1小時(shí)后，加入人源化Fab16D3的系列稀釋液，100W/L，室溫讓抗體片段結(jié)合1小時(shí)。用抗-huIgG-HRP(Fab特異性)(100pl/孔，1小時(shí)，室溫)檢測結(jié)合的人源化Fab16D3。此試驗(yàn)用OPD顯色。結(jié)果見圖17A。2.通過ELISA檢測對PLGF/Flt-1相互反應(yīng)的抑制4。C用ljig/mlhuFlt誦l(R&DSystems)包被ELISA板，200^1/孔。室溫用1%BSA封閉1小時(shí)后，加入人源化Fab16D3的系列稀釋液，100lil/孔，再另外加入100^1/孔的huPLGF-2。室溫培育2小時(shí)后，室溫用羊抗人PLGF(R&DSystems),180^1/孔，反應(yīng)1小時(shí)，然后室溫與RAG-HRP(DAKO)培育1小時(shí)，檢測結(jié)合的PLGF。此試驗(yàn)用OPD顯色。結(jié)果見圖17B。實(shí)施例ll.檢測Kn值用Biacore檢測16D3、人源化16D3IgG4、人源化scFvl6D3和人源化Fabl6D3的Kd僮。結(jié)果見下表4。表4:Kd信小結(jié)表<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>16D3、人源化16D3IgG4、人源化scFvl6D3和人源化Fabl6D3的Kd信權(quán)利要求1.一種能結(jié)合PLGF的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述分子包含選自SEQIDNO17-22的至少兩個(gè)CDR或與其有至少90％序列相同性的至少兩個(gè)序列。2.如權(quán)利要求1所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述分子包含的CDR區(qū)對應(yīng)于序列SEQIDNO:17-SEQIDNO:22或與其有至少90%序列相同性的序列。3.如權(quán)利要求1或2所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述抗原結(jié)合分子選自Fab、Fab，或F(ab')2、至少兩個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的組合、可溶性或膜錨定單鏈可變區(qū)、或單鏈可變結(jié)構(gòu)域。4.如權(quán)利要求1或2所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述分子包含的重鏈可變區(qū)包含序列SEQIDNO:2或在其CDR區(qū)與其有至少90%序列相同性的序列，且該分子包含的輕鏈可變區(qū)包含序列SEQIDNO:4或在其CDR區(qū)與其有至少80%序列相同性的序列。5.如權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述分子是由保存號(hào)為LMBP6399CB的細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體16D3或其片段。6.如權(quán)利要求l-4中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述分子是人源化抗體或抗體片段。7.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述分子是人/小鼠雜交抗體或抗體片段。8.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述的CDR區(qū)嫁接在人抗體骨架上。9.如權(quán)利要求8所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述人抗體是IgGlK或IgG4K。10.如權(quán)利要求1或2所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述分子是結(jié)合PLGF的單鏈可變區(qū)片段，其包含選自序列SEQIDNO:17-22的至少兩個(gè)CDR或者與其有至少80。/。序列相同性的至少兩個(gè)序列。11.如權(quán)利要求10所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述分子包含氨基酸序列SEQIDNO:24。12.如權(quán)利要求11所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述分子是人源化抗原結(jié)合分子。13.如權(quán)利要求12所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于，所述分子包含氨基酸序列SEQIDNO:26。14.一種能產(chǎn)生權(quán)利要求1或2所述抗原結(jié)合分子的細(xì)胞系。15.如權(quán)利要求14所述的細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞系的保藏號(hào)為LMBP6399CB。16.—種用于預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物病理狀態(tài)中的不良血管發(fā)生的藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含作為活性成分的如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的PLGF結(jié)合分子與藥學(xué)上可接受的載體的混合物。17.如權(quán)利要求16所述的藥物組合物，其特征在于，還包含治療有效量的另一種抗血管發(fā)生藥。18.如權(quán)利要求17所述的藥物組合物，其特征在于，所述其它抗血管發(fā)生藥選自VEGF禾口bFGF抑帝'J齊U。19.如權(quán)利要求18所述的藥物組合物，其特征在于，所述VEGF抑制劑是抗VEGF抗體。20.—種編碼權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子的多核苷酸。21.—種治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物病理狀態(tài)中的不良血管發(fā)生的方法，其特征在于，所述方法包括給予需要這種治療或預(yù)防的哺乳動(dòng)物治療有效量的如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的一種或多種抗原結(jié)合分子作為活性成分。22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述病理狀態(tài)選自癌癥、炎癥、粘連形成、眼科疾病、肺動(dòng)脈高壓和血管滲漏。23.如權(quán)利要求22的所述的方法，其特征在于，所述癌癥選自結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌和黑色素瘤。24.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子在免疫學(xué)檢測人樣品PLGF中的應(yīng)用。25.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子在篩選癌癥治療對PLGF抑制具有加強(qiáng)作用的化合物中的應(yīng)用。26.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子作為體外診斷工具的應(yīng)用。27.如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子在制造用于治療和/或預(yù)防哺乳動(dòng)物病理狀態(tài)中的不良血管發(fā)生的藥物中的應(yīng)用。28.如權(quán)利要求27所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疾病選自癌癥、炎癥、粘連形成、眼科疾病、肺動(dòng)脈高壓和血管滲漏。29.如權(quán)利要求28所述的應(yīng)用，其特征在于，所述癌癥選自結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌和黑色素瘤。全文摘要本發(fā)明提供新型抗PLGF單克隆抗體及其片段和衍生物，更具體說提供人源化抗體及其片段，用于治療和/或預(yù)防病理性血管發(fā)生。文檔編號(hào)C07K16/22GK101184776SQ200680009327公開日2008年5月21日申請日期2006年3月24日優(yōu)先權(quán)日2005年3月24日發(fā)明者D·科倫,J·-M·斯塔森,P·卡姆雷特申請人:斯路姆基因公司;生命科學(xué)研究合伙有限公司;福拉姆斯大學(xué)生物技術(shù)研究所Vzw