專利名稱：使用倉鼠igf-1的蛋白質(zhì)制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新型的倉鼠IGF- 1多肽。本發(fā)明進一步涉及利用上述 新型IGF-l多肽有效且廉價地制備期望的重組蛋白質(zhì)的方法。
背景技術(shù)：
使用基因重組技術(shù)生產(chǎn)用作藥品的蛋白質(zhì)的時候，由于使用動物 細胞可以實現(xiàn)在細菌細胞中無法完成的復雜的翻譯后修飾或折疊，因 此動物細胞多作為生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的宿主細胞進行使用。目前，在培養(yǎng)動物細胞以獲得該動物細胞生產(chǎn)的天然蛋白質(zhì)時， 或者培養(yǎng)導入了編碼期望的蛋白質(zhì)的基因的動物細胞以制備期望的蛋白質(zhì)等時，除了鹽類、糖類、氨基酸類及維生素類等基礎(chǔ)營養(yǎng)物質(zhì)以 外，為了該動物細胞的增殖，還必須在培養(yǎng)基中添加5~20%的范圍 的常規(guī)動物來源的提取物，具體而言如胎牛血清等血清。但是，上述 操作具有以下的缺點1)相關(guān)的哺乳動物來源的血清昂貴；2)由于 每批次間存在品質(zhì)差異無法獲得穩(wěn)定的增殖；3)存在受到病毒或者支 原體污染的可能性；及4)由培養(yǎng)基中分離、純化作為細胞產(chǎn)物的期 望蛋白質(zhì)的復雜化。因此，期待有一種在不含有血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 動物細胞、能夠廉價地生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的技術(shù)。為了在無血清的培養(yǎng)基中制備蛋白質(zhì)，必須添加在血清中含有的 增殖因子，例如培養(yǎng)CHO細胞時，通過添加人IGF-1 (胰島素樣生長 因子1: insulin-like growth factor 1)，可改善細月包增殖及存活 率，使長期培養(yǎng)或大量培養(yǎng)成為可能。IGF-1是作為具有與胰島素相類似的活性的多肽而表達的70個 氨基酸的單鏈多肽，具有類似于胰島素前體的結(jié)構(gòu)。IGF-l在具有細 胞增殖的作用同時還具有胰島素樣的代謝活性，是個體成長中最重要
的生長因子之一。認為IGF-1受到由腦下垂體分泌的生長激素 (Growth Hormone; GH )的作用由肝臟產(chǎn)生，在促進比較遠的目標的 骨骼組織的生長同時，還在肌肉或脂肪細胞中顯示出代謝活性。近年來，除了上述內(nèi)分泌的作用之外，還報道了在各種細胞培養(yǎng) 系統(tǒng)中生產(chǎn)IGF-1,且IGF-1除了具有對這些細胞的增殖作用以外 還有著各種生理活性。另外，著眼于IGF-1具有的細胞增殖作用，還 提出了在生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中導入編碼IGF-1等 具有增殖促進作用的多肽的DM的重組蛋白質(zhì)的制備方法(US 2002 / 0102650 Al)。由于IGF-1等各種增殖因子使用人源性的重組體，價格非參昂 貴，從制備成本的觀點出發(fā)，期望減少IGF-1的添加量。發(fā)明內(nèi)容發(fā)明欲解決的課題本發(fā)明的目的為得到制備成本低廉的、且具有強力的細胞增殖促 進作用的新型IGF-1多肽。本發(fā)明的進一步的目的為利用編碼上述新 型IGF-1多肽的DNA，有效且廉價地制備能夠生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的宿主 動物細胞。本發(fā)明另一目的為提供一種使用相關(guān)宿主動物細胞以制備 重組蛋白質(zhì)的方法。解決課題的方法本發(fā)明者們?yōu)閷崿F(xiàn)上述目的進行了深入的研究，結(jié)果開發(fā)了倉鼠 來源的新型胰島素樣生長因子1 (IGF-1)多肽，并發(fā)現(xiàn)該新型IGF -l多肽在動物細胞的培養(yǎng)中具有顯著的細胞增殖促進作用，從而完 成了本發(fā)明。也即，本發(fā)明提供以下內(nèi)容。1.多肽，其選自以下多肽(1) 具有序列編號1中記栽的氨基酸序列的多肽，以及(2) 具有在序列編號1中記載的氨基酸序列中，笫3位的氨基酸 被其它氨基酸置換的氨基酸序列，且具有胰島素樣生長因子l (IGF-
1)活性的多肽。2. 上述l所述的多肽，其第3位的氨基酸被絲氨酸所置換。3. 上述l所述的多肽，其第3位的氨基酸被賴氨酸所置換。4. 編碼上述1所述的多肽的DNA。5. 含有上述4所述的DM的栽體。6. 含有上述5所述的載體的宿主細胞。7. 上述6所述的宿主細胞，其為CH0細胞。8. 制備上述1所述的多肽的方法，其使用上述6或7中記載的宿 主細月包。9. 與上述1所述的多肽相結(jié)合的抗體。10. 細胞，其中導入了編碼上述1所述的多肽的DNA和編碼期望 的蛋白質(zhì)的DNA，以用于生產(chǎn)所期望的蛋白質(zhì)。11. 上述10所述的細胞，其中編碼上述1所述的多肽的DNA和編 碼期望的蛋白質(zhì)的DM通過單個載體同時進行導入。12. 上述10所述的細胞，其中編碼上述1所述的多肽的DM和編 碼期望的蛋白質(zhì)的DNA通過多個栽體分別進行導入。13. 上述10~ 12任一項所述的細胞，其為CH0細胞。14. 制備期望的蛋白質(zhì)的方法，該方法包含培養(yǎng)上述10~ 13任一 項所述的細月包。15. 含有上述1所述的多肽的培養(yǎng)基。16. 上述15所述的培養(yǎng)基，上述1所述的多肽通過在培養(yǎng)基中進 行添加而含有在培養(yǎng)基中。17. 上述15所述的培養(yǎng)基，上述1所述的多肽通過從宿主細胞分 泌而含有在培養(yǎng)基中。18. 上述15~ 17中任一項所述的培養(yǎng)基，是無血清培養(yǎng)基、或者 不含有除了上述1所述的多肽以外的哺乳動物來源的成分的培養(yǎng)基。19. 期望的蛋白質(zhì)的制備方法，包括使用上述15 18中任一項所 述的培養(yǎng)基進行CH0細胞的培養(yǎng)。20. 用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的制備方法，包含以下步驟(a) 在CH0細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA的步驟；(b) 在(a)制備的細胞中導入編碼IGF-l的DM的步驟。21. 用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的制備方法，包含以下步驟(a) 在CHO細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DM的步驟；(b) 從(a)制備的細胞中選擇表達期望蛋白質(zhì)的細胞的步驟；(c) 在(b)選擇的細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟。22. 用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的制備方法，包含以下步驟(a) 在CHO細胞中同時導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA和編碼 IGF-1的DNA的步驟；(b )從(a )制備的細胞中選擇表達期望的蛋白質(zhì)的細胞的步驟。23. 上述22所述的方法，使用含有編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA和編 碼IGF-1的DNA的單個載體，在CHO細胞中同時導入編碼期望的蛋白 質(zhì)的DNA和編碼IGF-1的DM。24. 用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的制備方法，包含以下步驟 (a )在CHO細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟；(b) 在(a)制備的細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DM的步驟。25. 用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的制備方法，包含以下步驟(a) 在CHO細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟；(b) 在(a)制備的細胞中導入編碼期望蛋白質(zhì)的DNA的步驟；(c )從(b )中制備的細胞中選擇表達期望蛋白質(zhì)的細胞的步驟。26. 上述20~ 25中任一項所述的制備方法，IGF-1為上述l所述 的多肽。27. 用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的篩選方法，包含以下步驟(a) 在CHO細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA的步驟；(b) 在(a)制備的細胞中選擇表達期望的蛋白質(zhì)的細胞的步驟；(c) 在(b)選擇的細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟；(d) 從(c)中制備的細胞中選擇表達期望蛋白質(zhì)及IGF-1的細 胞的步驟。28. 上述27中所述的篩選方法，IGF-1為上述1所述的多肽。


圖l:表示本發(fā)明中CH0細胞來源的倉鼠IGF - 1基因的堿基序列及氨基酸序列的圖。圖2:表示本發(fā)明中CH0細胞來源的倉鼠IGF - 1和人IGF - 1之間的氨基酸序列的比較的圖。圖3:將倉鼠IGF- 1的70氨基酸的N末端開始的第3位的具有負電荷的E變換為K及S，使電荷向正性一側(cè)移動的活性型倉鼠IGF - 1的示意圖。(+ )為帶有正電荷的氨基酸，(-)為帶有負電荷的氨基酸，(± )為不帶電荷的氨基酸。圖4:表示用于表達導入變異的倉鼠IGF - 1的質(zhì)粒的圖。圖5:表示天然型及變異型倉鼠IGF- 1對增殖能力的效果的圖。圖6:表示天然型及變異型倉鼠IGF- 1對存活率的效果的圖。圖7:表示導入倉鼠及人IGF - 1 (E3S )的抗IL6R抗體產(chǎn)生細胞的Fed-Batch培養(yǎng)基中抗體產(chǎn)生量的比較的圖。圖8:表示導入倉鼠、小鼠及人IGF - 1 (E3S)的抗IL6R抗體產(chǎn)生細胞的Fed-Batch培養(yǎng)基中抗體產(chǎn)生量的圖。圖9:表示導入倉鼠、小鼠及人IGF - 1 (E3S)的抗IL6R抗體產(chǎn)生細胞的3種細胞林中產(chǎn)生量最高的最高產(chǎn)細胞林的抗體產(chǎn)生量的比較的示意圖。圖IO:導入倉鼠、小鼠及人IGF - 1 (E3S)的抗IL6R抗體產(chǎn)生細 胞的Fed-Batch培養(yǎng)基中抗體產(chǎn)生量的圖。
具體實施方式
本發(fā)明的多肽優(yōu)選具有圖l及序列編號l所示的氨基酸序列的成 熟的分泌型倉鼠IGF-1,但也可以為前體型倉鼠IGF-1。另外，本發(fā)明的多肽包含具有在序列編號1所示的倉鼠IGF-1 的氨基酸序列中，在第3位的氨基酸被其他的氨基酸置換的氨基酸序 列，且具有胰島素樣生長因子1 (IGF-1)活性的多肽。置換的氨基酸
并無特別限定，可被任意種氨基酸置換，但是優(yōu)選被絲氨酸、賴氨酸、 或天冬氨酸置換，特別優(yōu)選被絲氨酸或賴氨酸置換。在本發(fā)明中，"具有胰島素樣生長因子1 (IGF-1)活性"這一 用語是指，對動物細胞具有增殖促進活性和/或提高存活率的活性。 在本發(fā)明中，"多肽"與"蛋白質(zhì)"以同樣含義使用。 本發(fā)明中的多肽，可通過本領(lǐng)域人員公知的方法，可以作為重組 多肽或天然多肽的形式進行制備。如果為重組多肽可如下制備，將編 碼本發(fā)明的多肽的DNA重組至適當?shù)谋磉_載體中，對將其導入至適當 的宿主細胞中而得到的轉(zhuǎn)化體進行回收，獲得提取物后，可以通過離 子交換、反相、凝膠過濾等色譜層析法、或?qū)⒖贡景l(fā)明的多肽的抗體 固定化的親合色語層析法、或者將這些層析柱進行多種組合來進行純 化、制備。另外，本發(fā)明的多肽作為與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)的融合蛋白、 或添加多個組氨酸的重組蛋白質(zhì)在宿主細胞(例如，動物細胞或大腸 桿菌等)內(nèi)進行表達時，表達的重組蛋白質(zhì)可使用谷胱甘肽柱或者鎳 柱進行純化。融合的蛋白質(zhì)在純化后，還可根據(jù)需要在融合蛋白之內(nèi)通過凝血 酶或者因子Xa等切斷、除去目的多肽以外的區(qū)域。如果是天然多肽，可通過本領(lǐng)域人員公知的方法，例如可對表達 本發(fā)明的多肽的組織或細胞的提取物，使用后述的與倉鼠IGF - 1多肽 結(jié)合的抗體相結(jié)合的親合柱層析進行純化而進行分離?？贵w可以為多 克隆抗體也可為單克隆抗體。另外，本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的倉鼠IGF - 1的DNA。本發(fā)明的DNA 可用于如上所述的本發(fā)明的多肽的體內(nèi)(in vivo)或體外(in vitro) 的生產(chǎn)中。本發(fā)明的DNA，只要編碼本發(fā)明的多肽即可，可為任一種 形態(tài)。即，可為從mRM合成的cDM或基因組DNA、或化學合成DNA 等。另外，只要能編碼本發(fā)明的多肽，包含具有基于遺傳密碼的簡并 的任一的堿基序列的DNA。本發(fā)明的DNA可通過本領(lǐng)域人員公知的方法進行制備。例如，可
以通過表達本發(fā)明的多肽的細胞制備cDNA文庫，將本發(fā)明的DM的序 列(例如序列編號2)的一部分作為探針進行雜交而制備。cDNA文庫 可通過例如Sambrook， J. et al. ， Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)中記載的方法進行制備，也可使用 市售的DNA文庫。另外，可通過表達本發(fā)明的多肽的細胞制備RNA, 基于本發(fā)明的DM序列合成寡聚DNA，將其作為引物使用進行PCR反 應，擴增編碼本發(fā)明的多肽的cDNA進行制備。具體而言，可以如下進行操作。首先，從表達本發(fā)明的多肽的細 胞、組織、器官等分離mRNA。 mRNA的分離可使用公知的方法、例如胍 超速離心法(Chirgwin， J.M. et al. ， Biochemistry (1979) 18， 5294-5299 )、AGPC法(Chomczynski, P. andSacchi， N. ， Anal. Biochem. (1987) 162， 156-159 )等制備總RNA ，使用mRNA純化試劑盒 (Pharmacia )等從總RNA中純化mRNA。另外，還可使用QuickPrep mRNA 純化試劑盒(Pharmacia)直接制備mRNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶從得到的mRNA合成cDNA。 cDNA的合成可使用AMV 反轉(zhuǎn)錄酶第一鏈cDNA合成試劑盒(生化學工業(yè))等進行。另外，可使 用本說明書中記栽的引物等，按照使用5， -Ampli FINDER RACE Kit (Clontech制)及聚合酵鏈式反應(polymerase chain reaction; PCR)的5' — RACE法(Frohman， M. A. et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85， 8998—9002; Belyavsky， A. etal.， Nucleic Acids Res. (1989) 17， 2919-2932 )，進4亍cDNA的合成及擴增。在后述的本發(fā)明的實施例中，編碼倉鼠IGF - 1多肽的cDNA通過 PCR克隆獲得。PCR引物的設(shè)計，可使用已知的大鼠/小鼠/人IGF-l 之間基因序列保守的區(qū)域來進行。從獲得的PCR產(chǎn)物制備目的DNA片段，與載體DNA相連接。進一 步，通過此方法制備重組載體，導入至大腸桿菌中選擇菌落制備期望 的重組載體。目的的DNA的堿基序列可通過公知的方法、例如雙脫氧 核苷鏈終止法進行確認。另外，通過將獲得的cDNA作為探針對DNA文庫進行篩選，可以分
離基因組DNA。另外，在本發(fā)明的DNA中，考慮用于表達的宿主的密碼子的使用 頻率，可以設(shè)計表達效率更高的堿基序列(Grantham, R. et al.， Nucleic Acids Research (1981)9, r43-74 )。另外，本發(fā)明的DNA 可通過市售的試劑盒或公知的方法進行改變。改變可舉出例如通過限 制性酶消化、合成寡聚核苷酸或適當?shù)腄M片段的插入、連接子的添 加、起始密碼子(ATG)及/或終止密碼子(TAA、 TGA或TAG)的插入 等。另外，本發(fā)明提供一種插入了本發(fā)明的DM的載體。本發(fā)明的載 體可以用于在宿主細胞內(nèi)保持本發(fā)明的DM，或者進一步用于表達本 發(fā)明的多肽。作為載體例如以大腸桿菌為宿主時，為了使栽體在大腸桿菌(例 如JM109、 DH5a、 DH10a、 HBIOI、 XL1 - blue )等中大量擴增大量制 備，只要具有用于在大腸桿菌中擴增的"ori"，進一步具有轉(zhuǎn)化的大 腸桿菌的選擇性基因(例如能夠通過任 一 種藥物(氨千西林或四環(huán)素、 卡那霉素、氯霉素)進行選擇的藥物抗性基因)就并無特別限定。作 為載體可舉出例如M13類載體、pUC類栽體、pBR322、 pBluescript、 pCR-Script等。另外，在以切取cDNA亞克隆為目的時，除了可舉出 上述栽體以外，可舉出pGEM-T、 pDIRECT、 pT7等。在以生產(chǎn)本發(fā)明的 多肽為目的使用載體時，特別優(yōu)選表達載體。作為表達載體，除了例 如以在大腸桿菌中的表達為目的時，載體具有能在大腸桿菌中擴增的 上述特征以外，在以JM109、 DH5a、 DH10a、 HBIOI、 XL1-blue等大 腸桿菌為宿主時，必須具有在大腸桿菌內(nèi)能有效表達的啟動子、例如 lacZ啟動子(Ward等，Nature (1989) 341， 544-546; FASEB J. (1992) 6， 2422-2427 )、araB啟動子(Better等，Science (1998) 240， 1041-1043 ) 或T7啟動子等。此類啟動子除了上述啟動子以外，還可舉出pGEX-5X-l (Pharmacia公司制備)、"QIAexpress system" (Qiagen公司制 備)、pEGFP或pET (此時宿主優(yōu)選是表達T7 RM聚合酶的BU1 )等。 另外，栽體中還可以含有用于多肽分泌的信號肽序列。用于多肽
分泌用的信號肽序列，在大腸桿菌的外周胞質(zhì)中生產(chǎn)時，可以使用pelB信號肽序列(Lei， S.P.etal.， JBacteriol. (1987) 169， 4379 )。 向宿主細胞中導入載體可使用例如氯化鉤法、電穿孔法等進行。除了大腸桿菌以外，用于本發(fā)明的多肽的制備的載體，可舉出例 如來源于哺乳動物的表達載體(例如pcDNA3 ( Invitrogen公司)、或 pEF-B0S (Nucleic Acids. Res. 1990，18，p5322 ) 、 pEF、 pCDM8 )、 昆蟲細胞來源的表達載體(例如"BAC-to-BAC baculovairus expression system" ( Invitrogen公司制備、pBacPAK8 )、植物來 源的表達載體(例如pMHl、 pMH2 )、動物病毒來源的栽體(例如pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、逆轉(zhuǎn)錄病毒來源的表達載體(例如pZIpneo)、酵 母來源的表達載體(例^口， "Pichia Expression Kit，， ( Invitrogen 公司制備)、pNVll、 SP-Q01 )、枯草桿菌來源的表達載體(例如pPL608、 pKTH50)等。在以CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等動物細胞中表達為目的 時，必須具有在細胞內(nèi)表達所必需的啟動子、例如SV40啟動子 (Mulligan等，Nature ( 1979 ) 277， 108) 、 MMLV-LTR啟動子、EF1 oc啟動子(Mizushima等，Nucleic Acids Res. ( 1990 ) 18， 5322 )、 RSV啟動子、CMV啟動子等，優(yōu)選具有用于選擇轉(zhuǎn)化細胞的基因(例如 可以通過藥物(新霉素、G418、潮霉素、嘌呤霉素等)進行選擇的藥 物抗性基因)。具有上述特性的載體可舉出例如pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 pBK-CMV、 p0PRSV、 p0P13等。進一步，以穩(wěn)定的表達基因、且在細胞內(nèi)的基因的拷貝數(shù)的擴增 為目的時，可舉出在缺失核酸合成途徑的CH0細胞內(nèi)導入具有與其互 補的DHFR基因的載體(例如pCHOI等)，通過氨曱喋呤(MTX)進行 擴增的方法，另外，在以基因的瞬時性表達為目的時，可舉出使用在 染色體上具有表達SV40 T抗原的基因的COS細胞，以具有SV40的復 制起點的栽體(pCD等)進行轉(zhuǎn)化的方法。復制起始點可使用 polyomaviruse、腺病毒、牛乳突淋瘤病毒(BPV )等來源的序列。進 一步，為了在宿主細胞系中擴增基因的拷貝數(shù)，表達栽體的選擇標記
可含有氨基糖甙轉(zhuǎn)移酶(APH )基因、胸腺嘧啶激酶(TK )基因、大腸 桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原 酶(dhfr)基因等。另一方面，在動物生物體內(nèi)表達本發(fā)明的DNA的方法，可舉出將 本發(fā)明的DNA重組至適當?shù)妮d體中，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒、脂質(zhì)體法、陽 離子脂質(zhì)體法或腺病毒法等導入至生物體內(nèi)的方法等。使用的載體可 舉出例如腺病毒載體(pAdexlw)或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如pZIPneo) 等，但并不限定于此。在載體中插入本發(fā)明的DNA等的常規(guī)的基因操 作，可按照常規(guī)方法進行(Molecular Cloning， 5.61-5.63)。在生 物體內(nèi)的給藥可為離體(ex vivo )法，也可為在體(in vivo )法。另外，本發(fā)明提供導入了本發(fā)明的載體的宿主細胞。導入了本發(fā) 明的載體的宿主細胞并無特別限定，可以使用例如大腸桿菌或CH0細 胞等各種動物細胞等。本發(fā)明的宿主細胞可作為例如用于制備或表達 本發(fā)明的多肽的生產(chǎn)體系進行使用。用于多肽的制備的生產(chǎn)體系有體 外及體內(nèi)的生產(chǎn)體系。體外生產(chǎn)體系可舉出使用真核細胞的生產(chǎn)體系 或使用原核細胞的生產(chǎn)體系。使用真核細胞時，可使用例如動物細胞、植物細胞、真菌細胞作 為宿主。動物細胞已知有哺乳類細胞、例如CHO(J. Exp. Med. ( 1995 ) 1 08,945 )、 C0S、 3T3、骨髓瘤、BHK ( baby hamster kidney ) 、 HeLa、 Vero、兩棲類細胞、例如爪蟾卵母細胞(Valle， et al. , Nature( 1981 ) 291， 358 - 340 )或昆蟲細胞，例如已知有Sf9、 Sf21、 Tn5。 CH0細胞 可特別優(yōu)選使用缺失DHFR基因的CH0細胞的CH0 dhfr- (Pro. Natl. Acad. Sci. USA ( 1980 ) 77， 4216 - 4220 )或CH0 K -1 (Pro. Natl. Acad. Sci. USA ( 1968 ) 60， 1275 )。在動物細胞中，在以大量表 達為目的時特別優(yōu)選CH0細胞。向宿主細胞中導入栽體例如可按照磷 酸鈣法、DEAE糊精法、使用陽離子脂質(zhì)體D0TAP( Boehringer Mannheim 公司制備)的方法、電穿孔法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法等進行。植物細胞已知有例如煙草(Nicotiana tabacum)來源的細胞作為 多肽生產(chǎn)體系，也可將其作為愈傷組織培養(yǎng)。另外，也可使用利用水
草的培養(yǎng)(Biolex公司)。真菌細胞已知有酵母、例如釀酒酵母 (Saccharomyces )屬、例如絮凝酵母(saccharomyces cerevisiae )、 絲狀菌、例如曲霉菌(Aspergillus )屬、例如黑曲霉菌(Aspergillus niger )。使用原核細胞時，有使用細菌的生產(chǎn)體系。細菌細胞可舉出大腸 桿菌(E. coli)，例如JM109、 DH5a、 DH10a、 HB101等，其他的已 知有枯草桿菌。以這些細胞為目標，進行DNA轉(zhuǎn)化，通過將轉(zhuǎn)化后的細胞進行體 外培養(yǎng)獲得多肽。培養(yǎng)可按照公知的方法進行。例如，動物細胞的培 養(yǎng)液可使用例如DMEM、 MEM、 RPMI1640、 IMDM。此時可合并使用胎牛 血清(FCS)等血清補充液，也可進行無血清培養(yǎng)。培養(yǎng)時的pH優(yōu)選 約為6~8。培養(yǎng)通常在約30~ 40。C下進行15 ~ 240小時，根據(jù)必要加入培養(yǎng)基的交換、通氣、攪拌等。另一方面，在體內(nèi)生產(chǎn)多肽的體系可舉出例如使用動物的生產(chǎn)體 系或使用植物的生產(chǎn)體系。以上述動物或植物為目標導入DM，在動 物或植物體內(nèi)生產(chǎn)、回收多肽。本發(fā)明中的"宿主"包含這些動物、 植物。使用動物的時候有使用哺乳類動物、昆蟲的生產(chǎn)體系。哺乳類動 物可使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛(Vicki Glaser， SPECTRUM Biotechnology Application, 1993 )。另夕卜，l吏用哺乳類動物時， 可使用轉(zhuǎn)基因動物。例如將目的DM與編碼山羊P酪蛋白等此類乳汁中固定產(chǎn)生的多 肽的基因制成融合基因。然后將含有該融合基因的DNA片段注入至山 羊胚胎中，將該胚胎移植至雌性山羊中。從接受胚胎的山羊生育的轉(zhuǎn) 基因山羊或其后代產(chǎn)生的乳汁中，獲得目的多肽。為了增加從轉(zhuǎn)基因 山羊生產(chǎn)的含有多肽的乳汁量，也可對轉(zhuǎn)基因山羊使用適當?shù)募に?(Ebert, K. M. et al. ， Bio/Technology ( 1994 ) 12， 699 - 702 )。另外，昆蟲可使用例如蠶。使用蠶的時候，可以通過使用插入了 編碼目的多肽的DNA的桿狀病毒(baculovirus)感染蠶，從該蠶的體液
中獲得目的多肽(Susumu， M. etal.， Nature ( 1985 ) 315, 592-594 )。 進一步，使用植物時，可以使用例如煙草。使用煙草時，將目的 基因的編碼多肽的DNA插入至植物表達用載體、例如pMON53G中，將 該載體導入至根癌土壤桿菌(Agrobacterium t腸faciens)等此類細 菌中?？墒褂迷摷毦腥緹煵荨⒗鐭煵?Nicotiana tabacum)，通過 本煙草的葉子獲得期望的多肽(Julian K.-C. Ma et al. ， Eur. J. Immunol. ( 1994 ) 24， 131-138)。如上述得到的本發(fā)明的多肽，可從宿主細胞內(nèi)或細胞外(培養(yǎng)基 等)分離，可純化得到基本上純粹而均一的多肽。多肽的分離和純化 使用多肽的純化中常用的分離、純化的方法即可，并無任何限定。例 如，可適當選擇、組合使用層析色譜、過濾、超濾、鹽析、溶劑沉淀、 溶劑提取、蒸餾、免疫沉降、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點電泳、 透析、重結(jié)晶等，對多肽進行分離、純化。層析色譜可舉出例如親合層析色譜、離子交換層析色譜、疏水性 層析色譜、凝膠過濾、反相層析色譜、吸附層析色譜等(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al. ， Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996 )。上述層析色i普可使用液相層析色譜、例 如HPLC、 FPLC等液相層析色譜進行。本發(fā)明包含使用上述純化方法，以高度純化多肽。并且，在純化多肽之前或純化之后，通過適當?shù)亩嚯男揎椕傅淖?用，可加入任意的4務飾或部分除去多肽。多肽^"飾酶可^f吏用例如月夷蛋 白酶、胰凝乳蛋白酶、肽鏈內(nèi)切酶、蛋白激酶、葡萄糖苷酶等。另外，本發(fā)明提供與本發(fā)明的多肽相結(jié)合的抗體。本發(fā)明的抗體 的形態(tài)并無特別限定，除了多克隆抗體還可包含單克隆抗體。另外，所有等級的多克隆抗體以及單克隆抗體、以及人抗體或通過基因重組 獲得的人源化抗體。作為獲得抗體的致敏抗原使用的本發(fā)明的多肽，可使用本說明書中公開的基因序列或氨基酸序列而獲得。在本發(fā)明中，作為致敏抗原而使用的多肽，可以是完整的多肽也 可以是多肽的部分肽。系中，通過該載體對本說明書所述的宿主細胞進行轉(zhuǎn)化，可以用公知 的方法從該宿主細胞內(nèi)或外獲得目的多肽或其片段，將它們作為致敏 抗原使用。另外，還可以將表達多肽的細胞或其溶解物或化學合成的 本發(fā)明的多肽作為致敏抗原使用。作為經(jīng)致敏抗原免疫的哺乳動物，并無特別限定，但優(yōu)選考慮與 在細胞融合中使用的母細胞之間的適應性而進行選擇， 一般而言可使 用嚙齒類動物、兔類動物、靈長類動物。嚙齒類動物可使用例如小鼠、大鼠、倉鼠等等。兔類動物可使用 例如兔子。靈長類動物可使用例如猴子。猴子可使用狹鼻下目Catarrhini (舊世界猴)，例如獼猴、恒河猴、狒狒、黑猩猩。使用致敏抗原對動物進行免疫可采用公知的方法進行。 一般的方 法有將致敏抗原注射至哺乳動物的腹腔內(nèi)或皮下。具體而言，以PBS (磷酸緩沖液)或生理鹽水等將致敏抗原稀釋至適當?shù)牧?，對于混選 體系，根據(jù)需要與常用的佐劑、例如弗氏完全佐劑適量混合、乳化后， 對哺乳動物進行給藥。進一步優(yōu)選將與弗氏完全佐劑適量混合后的致 敏抗原在4~21日內(nèi)每天進行數(shù)次的給藥。另外，進行致敏抗原進行 免疫時使用適當?shù)妮d體。如上所述進行免疫，通過常用方法確認血清 中期望抗體水平的上升。此處，為了獲得針對本發(fā)明的多肽的多克隆抗體，在確認血清中 期望的抗體水平上升以后，取出經(jīng)抗原致敏后的哺乳動物的血液。通 過公知的方法從該血液中分離血清。多克隆抗體可使用含有多克隆抗 體的血清，也可根據(jù)需要從該血清中分離含有多克隆抗體的組份，并 進行使用。例如，使用本發(fā)明的多肽進行偶聯(lián)的親合層析色謙，獲得 僅識別本發(fā)明的多肽的組分，進一步利用A蛋白或G蛋白柱對該組分 進行純化，可制備免疫球G蛋白或M。
為了獲得單克隆抗體，在確認經(jīng)上述抗原致敏后的哺乳動物的血 清中期望的抗體水平上升以后，從哺乳動物中取出免疫細胞并用于細 胞融合即可。此時，優(yōu)選用于細胞融合的免疫細胞特別可舉出脾臟細 胞。作為與上述免疫細胞融合的其他的母細胞優(yōu)選哺乳動物的骨髓瘤 細胞，更優(yōu)選獲得通過藥物選擇融合細胞的特性的骨髓瘤細胞。上述免疫細胞與骨髓瘤細胞的細胞融合為基本上公知的方法，例如可按照Milstein等的方法(Galfre， G. andMilstein， C. , Methods Enzymol. ( 1981 ) 73， 3 - 46 )進行。通過細胞融合得到的雜交瘤可通過通常的選擇培養(yǎng)液，例如HAT 液(含有次黃噤呤、氨喋呤、胸腺嘧啶的培養(yǎng)液)進行選擇。使用該HAT培養(yǎng)液的培養(yǎng)，可持續(xù)進行至能夠使作為目的的雜交瘤細胞以外 的細胞(非融合細胞)死亡所需的足夠的時間，通常為數(shù)天或數(shù)周的 時間。然后實施常用的限制性稀釋法，并進行生產(chǎn)目的抗體的雜交瘤 的篩選。還可以人淋巴細胞、例如經(jīng)EB病毒感染的人淋巴細胞在體外條件下， 以多肽、多肽表達細胞或其溶解物進行致敏，使致敏淋巴球蛋白與人 來源的具有永久分裂能力的骨髓瘤細胞、例如U266相融合，可生產(chǎn)具 有與多肽結(jié)合活性的期望的人抗體的雜交瘤(特開昭63 - 17688號公 報)。然后，將得到的雜交瘤移植至小鼠的腹腔內(nèi)，對相同小鼠進行腹 水回收，可通過例如石克酸銨沉淀A蛋白柱、G蛋白柱、DEAE離子交換 層析色鐠、偶聯(lián)了本發(fā)明的多肽的親合層析色譜對得到的單克隆抗體 進行純化而制備。本發(fā)明的抗體，除了用于本發(fā)明的多肽的純化、檢 測之外，還可用于本發(fā)明的多肽的激動劑或阻斷劑的侯選。另外，該體對人體進行給藥為目的進行使用時(抗體療法)，為了降低免疫原 性，優(yōu)選人抗體或人源性抗體。例如，可對具有人抗體基因譜(repertoires )的轉(zhuǎn)基因動物以作
為抗原的多肽或多肽表達細胞或其溶解物進行免疫，取得抗體產(chǎn)生細 胞，使用其與骨髓瘤細胞相融合的雜交瘤，可獲得抗多肽的人抗體(參照國際7^開編號贈2 - 03918、 W093 - 2227、 W094 - 02602、 W094 -25585、 W096 - 33735及W096"" 34096 )。除了使用雜交瘤生產(chǎn)抗體以外，還可以使用通過癌基因 (oncogene )對生產(chǎn)抗體的免疫淋巴細胞等的免疫細胞永生化后得到 的細胞。如上述得到的單克隆抗體，還可以作為使用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的 重組型抗體而獲得(例如參照Borrebaeck, C丄K. andLarrick， J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 )。重組型抗體可如 下進行生產(chǎn)，將編碼其的DM從雜交瘤或產(chǎn)生抗體的免疫淋巴細胞等 免疫細胞中克隆，重組至適當?shù)妮d體中，并將其導入至宿主中進行生 產(chǎn)。本發(fā)明包含該重組型的抗體。此外，本發(fā)明的抗體只要能與本發(fā)明的多肽進行特異性結(jié)合，也 可為該抗體的片斷或抗體修飾物。例如，抗體片段可舉出Fab、 F (ab， ) 2、Fv或H鏈和L鏈的Fv通過適當?shù)倪B接子連接的單鏈Fv( scFv ) (Huston, J.S. et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. ( 1988 ) 85， 5879 - 5883 )。具體而言，抗體在經(jīng)酶、例如木瓜蛋白酶、胰蛋 白酶處理之后生成片段，或者構(gòu)建編碼該片段的基因，將其導入至表 達栽體后，在適當?shù)乃拗骷毎羞M行表達(例如參照Co， M. S. etal.， J. Immunol. ( 1994 ) 152， 2968 - 2976; Better, M. and Horwitz， A. H., Methods Enzymol. ( 1989 ) 178, 476 - 496; Pluckthun， A. and Skerra， A. ， Methods Enzymol. ( 1989 ) 178， 497 - 515; Lamoyi， E. ， Methods Enzymol. ( 1986 ) 121, 652 - 663; Rousseaux， J. et al. ， Methods Enzymol.( 1986 )121， 663 — 669; Bird, R. E. and Walker, B. W. ， Trends Biotechnol. ( 1991 ) 9， 132 - 137 )。作為抗體修飾物，可使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合的抗 體。本發(fā)明的"抗體"中也包含上述抗體的修飾產(chǎn)物。為了獲得上述
抗體的修飾產(chǎn)物?？赏ㄟ^對得到的抗體進行化學修飾而獲得。這些方 法在本領(lǐng)域中早已被建立。另外，本發(fā)明的抗體可如下獲得，使用公知技術(shù)得到的由非人抗人抗體來源的CDR(互補性決定區(qū)域)與人抗體來源的FR(框架區(qū)域) 以及恒定區(qū)域共同構(gòu)成的人源化抗體。如上所述得到的抗體可以純化至均一。本發(fā)明中使用的抗體的分 離、純化采用通常的蛋白質(zhì)中使用的分離、純化方法即可。例如可適 當?shù)倪x擇、組合使用親合層析色譜等層析色語柱、過濾、超濾、鹽析、 透析、SDS聚丙烯酸凝膠電泳、等電點電泳等，進行抗體的分離、純 化(Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane， Cold Sprig Harbor Laboratory, 1988 ),但不限定于:t匕。如上述獲(Enzyme-1 inked immunosorbent assay; ELISA)等進行。使用親和柱層析色譜法的柱可舉出A蛋白柱、G蛋白柱。例如， 使用A蛋白質(zhì)柱的柱子可舉出Hyper D， P0R0S， Sepharose F. F. (Pharmacia )等。作為親合層析色鐠以外的層析色語法，可舉出例如離子交換色語、 疏水性色鐠、凝膠過濾、反相色譜、吸附色譜等(Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996 )。上述層析色i普法可采用HPLC、 FPLC等 液相色i普法進4亍。另外，作為測定本發(fā)明的抗體的抗原結(jié)合活性的方法，可使用吸 光度測定、酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 、 RU (放射免疫測定法)或熒光抗體法。使用ELISA 的時候，將本發(fā)明的多肽添加至已固定化本發(fā)明的抗體的多孔板上， 然后添加含有目的抗體的樣品、例如抗體產(chǎn)生細胞的培養(yǎng)上清或純化 抗體。添加識別以酶、例如堿性磷酸酶標記的抗體的第二抗體，與多
孔板溫育，然后洗凈后，加入p-硝苯基磷酸等酶底物，并通過測定吸 光度可以評價抗原結(jié)合活性。多肽可使用多肽的片段、例如可使用其C末端構(gòu)成的片斷或N末端構(gòu)成的片段。本發(fā)明的抗體的活性評價中 可使用BIAcore ( Pharmacia制備)。本發(fā)明提供導入了編碼本發(fā)明的多肽的DNA和編碼所期望的蛋白 質(zhì)的DM的生產(chǎn)所期望的蛋白質(zhì)的細胞。該細胞可用于所期望的蛋白 質(zhì)的制備。本發(fā)明中所期望的蛋白質(zhì)并無特別限定，可以為抗體(天然抗體、 低分子化抗體、嵌合抗體、人源化抗體等)或生理活性蛋白質(zhì)(粒細 胞集落刺激因子(G-CSF )、粒細胞-巨嗜細胞集落刺激因子(GM-SCF )、 促紅素、干擾素、IL-1或IL-6等白介素、t-PA、尿激酶、血清白蛋 白、凝血因子等)等中的任一種蛋白質(zhì)，但優(yōu)選為抗體。編碼本發(fā)明的多肽的DNA和編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA的導入可通 過單個載體同時導入，也可使用多個栽體分別導入。導入了編碼本發(fā)明的多肽的DNA和編碼期望的蛋白質(zhì)的DM的細 胞并無特別限定，可為任意種細胞，優(yōu)選CHO細胞、特別優(yōu)選CHO dhfr-細胞。本發(fā)明進一步提供含有本發(fā)明的多肽的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中的本發(fā) 明的多肽的含量可根據(jù)使用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)的細胞及欲制備的期望的 蛋白質(zhì)的種類等等進行適當?shù)倪x擇決定，通常為0. lmg/L~ 5mg/L、 優(yōu)選為0. 2mg / L ~ ltng / L、進一步優(yōu)選為0. 5mg / L。含有本發(fā)明的多肽的培養(yǎng)基可用于使用動物細胞、特別是CH0細 胞以制備蛋白質(zhì)的情況。本發(fā)明的培養(yǎng)基只要含有本發(fā)明的多肽即可，可添加本發(fā)明的多 肽，也可從宿主細胞中分泌。本發(fā)明中使用的培養(yǎng)基的成分可適當使用通常在細胞(優(yōu)選為動 物細胞)培養(yǎng)基中使用的各成分，它們通常含有氨基酸、維生素類、 脂質(zhì)因子、能量源、滲透壓調(diào)節(jié)劑、鐵源、pH緩沖劑。上述成分的含 量通常在下述適當?shù)姆秶鷥?nèi)氨基酸0. 05 ~ 1500mg / L,維生素0. 001 ~ 10mg/L，脂質(zhì)因子0~ 200mg/L，能量源1 ~ 20g/L，滲透壓 調(diào)節(jié)劑0. 1 ~ 10000mg/L,鐵源0. 1 500mg/L，pH緩沖劑l~ 10000mg /L,微量金屬元素0. 00001 ~ 200mg/L,表面活性劑0 ~ 5000mg / L, 增殖輔助因子0. 05 ~ IOOOOm g/L及核苷0. 001 ~ 50mg/L，但并不限 定于此，可根據(jù)培養(yǎng)的細胞的種類，期望的蛋白質(zhì)的種類等進行適當 的決定。上述成分之外，還可添加例如微量金屬元素、表面活性劑、增殖 輔助因子、核苷等。具體而言可舉出例如含有下述物資的培養(yǎng)基L-丙氨酸、L-精氨 酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨 酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L -賴氨酸、L-曱硫氨酸、L-鳥氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L -絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸等氨基酸 類，優(yōu)選為L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨 酸、L 一亮氨酸、L 一賴氨酸、L -甲石克氨酸、L 一苯丙氨酸、L 一月甫氨酸、 L -絲氨酸、L -蘇氨酸、L -色氨酸、L -酪氨酸、L -纈氨酸等氨基酸 類；異肌醇、生物素、葉酸、硫辛酸、煙酰胺、煙酸、對氨基苯甲酸、 泛酸鈣、鹽酸吡噴醛、鹽酸吡噴辛、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素B12、 抗壞血酸等，優(yōu)選為生物素、葉酸、疏辛酸、煙酰胺、泛酸4丐、鹽酸 吡哆醛、核黃素、鹽酸硫胺素、維生素B12、抗壞血酸等維生素類； 氯化膽堿、酒石酸膽堿、亞油酸、油酸、膽固醇等，優(yōu)選為氯化膽堿 等脂類因子；葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖等，優(yōu)選為葡萄糖等能 量源；氯化鈉、氯化鉀、硝酸鉀等，優(yōu)選為氯化鈉等滲透壓調(diào)節(jié)劑； EDTA鐵、檸檬酸鐵、氯化鐵、氯化亞鐵、硫酸鐵、硫酸亞鐵、硝酸亞 鐵等，優(yōu)選為氯化亞鐵、EDTA鐵、檸檬酸鐵等鐵源類；碳酸氫鈉、氯 化鈣、磷酸氫鈉、HEPES、 M0PS等，優(yōu)選為碳酸氬鈉等pH緩沖劑。除了上述成分以外，還可以添加下述物質(zhì)例如石危酸銅、石克酸錳、 硫酸鋅、硫酸鎂、氯化鎳、氯化錫、氯化鎂、亞硅酸鈉等，優(yōu)選為硫
酸銅、硫酸鋅、硫酸鎂等微量金屬元素；Tween80、 Pluronic F68等 表面活性劑；以及重組型胰島素、重組型IGF-1、重組型EGF、重組 型FGF、重組型PDGF、重組型TGF- oc、鹽酸乙醇胺、亞硒酸鈉、視 黃酸、鹽酸腐胺，優(yōu)選為亞硒酸鈉、鹽酸乙醇胺、重組型IGF-1、鹽 酸腐胺等增殖輔助因子；脫氧腺苷、脫氧胞嘧啶、脫氧鳥苷、腺苷、 胞嘧啶、鳥苷、尿嘧啶等核苷等。并且在上述本發(fā)明的優(yōu)選的例子中， 還可以含有鏈霉素、青霉素G鉀及慶大霉素等抗生素、或酚紅等pH 指示劑。另外，還可在培養(yǎng)基中添加魚肉提取物或魚肉的酶分解物。培養(yǎng)基的pH根據(jù)培養(yǎng)的細胞而不同， 一般而言為pH6. 8~ 7. 6, 大多數(shù)情況為pH7. 0 ~ 7. 4為宜。培養(yǎng)基可采用市售的動物細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基、例如以D-MEM (Dulbecco' s Modified Eagle Medium) 、 D-MEM/F-12 1: 1 Mixture (Dulbecco' s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)、 RPMI1640、 CH0-S-SFMII( Introvigen公司)、CHO-SF ( Sigma-Aldrich 公司)、EX-CELL 301 ( JRH bioscience公司)、CD-CHO ( Introvigen 公司)、IS CHO-V ( Irvine Scientific公司)PF-ACE-CHO (Sigma-Aldrich公司)等培養(yǎng)基進行制備。另外，本發(fā)明的培養(yǎng)基優(yōu)選為無血清培養(yǎng)基、或者不含有除本發(fā) 明的多肽之外的哺乳動物來源的成分的培養(yǎng)基。本發(fā)明提供包含使用含有本發(fā)明的多肽的培養(yǎng)基進行CHO細胞培 養(yǎng)，制備期望的蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明進一步通過培養(yǎng)導入了編碼本發(fā)明的多肽的DM和編碼期 望的蛋白質(zhì)的DM的CHO細胞，以制備所期望的蛋白質(zhì)的方法。CHO細胞的培養(yǎng)可使用本領(lǐng)域人員公知的方法進行。例如，通常 可在氣相的COr濃度為0~ 40% ，優(yōu)選在2~ 10%的氣體環(huán)境下，30~ 39°C，優(yōu)選在37。C左右，培養(yǎng)1 28天。另外，動物細胞培養(yǎng)用的各種培養(yǎng)裝置可使用例如發(fā)酵型罐裝培 養(yǎng)裝置、氣升型培養(yǎng)裝置、培養(yǎng)基培養(yǎng)瓶培養(yǎng)裝置、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶培養(yǎng)
裝置、微載體型培養(yǎng)裝置、流動層型培養(yǎng)裝置、中空纖維培養(yǎng)裝置、 轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)裝置、填充槽型培養(yǎng)裝置等。本發(fā)明進一步提供包含下述步驟的用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的方法(a) 在CHO細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA的步驟，(b) 在(a)中制備的細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟。 本發(fā)明進一步提供包含下述步驟的用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的制備方法(a) 在CHO細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA的步驟，(b) 從(a)中制備的細胞中選擇表達期望的蛋白質(zhì)的細胞的步驟(c) 在(b)選擇的細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟。 本發(fā)明進一步提供包含下述步驟的用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的方法(a) 在CHO細胞中同時導入編碼期望的蛋白質(zhì)和IGF-1的DNA 的步驟，(b) 在(a)中制備的細胞中選擇表達期望的蛋白質(zhì)的細胞的步驟。在上述方法中，在CHO細胞中同時導入編碼所期望的蛋白質(zhì)的DNA 和編碼IGF-1的DNA時，也可通過不同的載體同時導入編碼期望的蛋 白質(zhì)的DM和編碼IGF - 1的DNA，或者使用含有編碼期望的蛋白質(zhì)的 DNA和編碼IGF - 1的DM的單一載體進行同時導入。優(yōu)選使用單個載 體同時進行導入的方法。本發(fā)明進一步提供包含下述步驟的用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞 的方法(a) 在CHO細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟，(b) 在(a)中制備的細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA的步驟。本發(fā)明進一步提供包含下述步驟的用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞
的方法(a )在CH0細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟，(b) 在(a)制備的細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA的步驟，(c) 從(b)中制備的細胞中選擇表達期望的蛋白質(zhì)的細胞的步驟。即，在CHO細胞中導入編碼所期望的蛋白質(zhì)的DNA和編碼IGF-1 的DM時，可將它們按照任意順序進行導入，從易于控制期望蛋白質(zhì) 的表達量的角度出發(fā)，優(yōu)選編碼IGF-1的DNA與編碼期望蛋白質(zhì)的 DNA同時導入，或者在導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA以后，導入編碼 IGF - 1的DNA。在用于上述各種期望的蛋白質(zhì)的制備中的細胞的制備方法中，優(yōu) 選IGF - 1為本發(fā)明的多肽。本發(fā)明進一步提供包含下述步驟的用于篩選期望的蛋白質(zhì)的細胞 的方法(a) 在CHO細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA的步驟，(b) 在(a)制備的細胞中選擇表達期望的蛋白質(zhì)的細胞的步驟，(c) 在(b)中選擇的細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟，(d) 在(c)中制備的細胞中選擇表達期望的蛋白質(zhì)和IGF-1的 細胞的步驟。上述篩選方法中優(yōu)選IGF-1為本發(fā)明的多肽。本發(fā)明中的用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的制備法或用于制備期 望的蛋白質(zhì)的細胞的篩選方法中采用的編碼IGF-1的基因并無特別限 定，可為人、小鼠、大鼠、倉鼠等任一種動物來源的IGF-1,優(yōu)選為 倉鼠IGF-1。并且，倉鼠IGF-1以外的IGF-1序列記栽于Nucleic Acids Res. 14 ( 20 ), 7873 - 7882 ( 1986 )及J. Biol. Chem 262 (16) ， 7894 - 7900 ( 1978 )。本發(fā)明者們?nèi)绾笫龅膶嵤├?，確認了通過在為了產(chǎn)生抗體而 構(gòu)建的細胞中導入編碼本發(fā)明的多肽的DNA，使之表達活性型的IGF - 1,可以在IGF- 1無添加培養(yǎng)中構(gòu)建了具有理想的培養(yǎng)行為的抗體
生產(chǎn)用細胞。本發(fā)明的導入了多肽的抗體生產(chǎn)細胞的增殖能力和存活 率優(yōu)良，且在抗體產(chǎn)生量方面顯示出非常優(yōu)異的效果。本發(fā)明可用于 任一種期望的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生細胞、特別是抗體產(chǎn)生細胞的用途中，在 工業(yè)上具有極其巨大的利用價值。通過實施例對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明并不局限于此。 本領(lǐng)域人員可進行各種變更和修飾，但這些變更與修飾也包含于本發(fā) 明中。實施例實施例1:編碼倉鼠IGF - 1的cDM的克隆 (1 ) cDNA的合成從在CH0-DXB11細胞中導入抗白介素6受體(IL-6R)抗體基因的 抗IL-6R抗體產(chǎn)生細胞(特開平8 - 99902號公報，參考例2)進行總 RNA的提取。從得到的mRNA合成cDNA。具體按照以下方法進行。通過將傳代后經(jīng)過72小時的處于細胞增 殖期的約5 x 106個CHO細胞在4°C、 1000rpm條件下離心5分鐘，在 不含培養(yǎng)液的離心管底部獲得沉淀狀態(tài)的細胞，加入在65。C預熱的 Sepasol-RNAI 4ml，然后使用移液管操作使其快速溶解，在室溫下放 置5分鐘。進一步加入O. 8ml氯仿，以Voltex充分攪拌后，在室溫下 放置3分鐘。通過冷卻離心機Avanti J25 (BECKMAN制備)在4。C、 7000rpm下離心5分鐘后，小心釆取上層，移至新的15ml管中。加入 4ral的2-丙醇，以Voltex充分攪拌，在室溫下放置IO分鐘。在4°C、 7000rpm下離心IO分鐘后，完全除去上清液，得到RM塊狀物。貼著 離心管壁注射入4ml 75%的乙醇，在4。C、 7000rpm下離心5分鐘。 完全除去上清后，再次注射入4ml 100%的乙醇。在4。C、 7000rpm下 離心5分鐘后得到RM塊狀物，于室溫放置30分鐘。空氣干燥的RNA 塊狀物通過加入IOOU 1 DEPC水，移液管操作使其完全溶解。進一步 按照RNeasy MiNi Kit的操作方法對總RM進行純化。得到的30 n 1 總RNA濃度的測定使用分光光度計DU640進行，按照波長260nra的吸 光度10D = 40 ia g/ml計算出RNA濃度。將5 jj g高純度總RNA用于cDNA合成。5 u g高純度總RNA以DEPC水配制成10 u 1后，通過移液管加 入1 |a 1HPLC級別的100pmo1/ ju 1 T7- (T)"引物，完全混合后旋轉(zhuǎn)匯 集(spun down)。在70。C下加熱10分鐘使引物退火，快速旋轉(zhuǎn)匯集 后放置于冰上。在冰上放置2分鐘后，通過移液管加入4 ja 1 5 x第一 條鏈緩沖液、2 m 1的0. 1M DTT、 1 p 1的10mM dNTP Mix,在4'C下旋 轉(zhuǎn)匯集，放置于冰上。在42。C的加熱器上開始進行溫育，經(jīng)過2分鐘 時通過移液管加入2(il的SuperScriptII逆轉(zhuǎn)錄酶混合物，開始進行 第一鏈合成反應。經(jīng)過60分鐘后，快速進行旋轉(zhuǎn)匯集，放置于冰上。 繼續(xù)進行第二條鏈的合成反應，通過移液管按順序加入91 )j 1的DEPC 水、30|u 1的5 x第二條鏈緩沖液、3jul的10mM dNTP混合物、1 ja 1 的E. coli DNA連接酶、4 ju 1的E, Coli DNA聚合酶、1 ju 1的E. coli RNaseH，在4。C下》走轉(zhuǎn)匯集，放置于冰上。在16°C下溫育120分鐘， 進行第二條鏈的合成。2小時后，加入2m 1的T4 DNA聚合酶，進一 步溫育5分鐘，快速旋轉(zhuǎn)匯集，放置于冰上。加入152jj1的25: 24: l的苯酚氯仿異戊醇，進行30秒鐘旋轉(zhuǎn)振蕩后旋轉(zhuǎn)匯集，使用移 液管進一步混合，移入預先離心1分鐘的Phase Lock Gei管中并與膠 共沉淀。在4。C下離心15000rpm 2分鐘后，將水層通過移液管移至新 的1. 5ml Eppendorf管中，按順序力口入0. 5 p 1的Pel let Paint、 76 iu 1乙酸銨7. 5M溶液，充分旋轉(zhuǎn)振蕩。加入600 m1 99. 5%的乙醇， 振蕩30秒后，于室溫下》文置5分鐘。在4。C、 15000rpm下離心10分 鐘，獲得除去未反應dNTP的cDNA沉淀。cDNA中加入500 p 1 75 %乙 醇，在4。C、 15000rpm下離心3分鐘。重復洗凈2次進行脫鹽，進一 步加入100 m 1的99. 5%乙醇在4'c、 15000rpm下離心分離5分鐘后， 完全除去乙醇。進行約5分鐘的空氣干燥，溶解于1. 5 m 1的無RNase 的水中，將cDNA保存于-20'C。將50分之一的量用作PCR模板。 (2 )編碼倉鼠IGF - 1的cDNA的克隆倉鼠IGF-1基因通過PCR克隆獲得。PCR引物的設(shè)計使用已知的 大鼠/小鼠/人IG F -1之間的基因序列保守的區(qū)域進行。具體而言可按照如下方法進行。將編碼從成熟型大鼠IGF- 1的N
末端第13位的Ala至19位的Gly的基因序列5， -gctcttcagttcgtgtgtgg (序列編號3)作為正向引物，將編碼從N末 端第50位的Arg至56位的Arg的基因的互補序列5， -ctcctcagatcacagctccg (序列編號4 )作為反向引物進4亍4吏用，以上 述cDM為模板進行PCR反應。在95。C、 5分鐘的前處理后，重復進行 35次98。C、 5秒鐘的變性，53°C、 30秒鐘的退火，72°C、 30秒鐘的 延伸反應，擴增目的基因后，再次進行72'C、 IO分鐘的延伸反應，得 到131bp的倉鼠IGF- 1 PCR片段。通過測定得到的PCR片段的堿基序列確認了為擴增IGF-1的 DNA,使用該序列信息繼續(xù)進行PCR反應。將編碼從N末端第29位的 Thr至35 <立6勺lie的基因序歹'J: 5， 一acaggctatggctccagcatt (序歹'J 編號5)作為正向引物，將編碼從N末端第85位的Gln至77位的Arg 的基因的互補序列5， -tgagtcttgggcatgtcagtg (序列編號6 )作為 反向引物進行使用，以上述cDNA作為模板進行PCR反應。在進行95 。C、 5分鐘的前處理后，重復進行35次98。C、 5秒鐘的變性，53°C、 40秒鐘的退火，72°C、 90秒鐘的延伸反應，擴增目的基因后，再次進 行72匸、IO分鐘的延伸反應，得到170bp的倉鼠IGF-1 PCR片段。 以上結(jié)果獲得了成熟型倉鼠IGF - 1從N末端13位的Ala至C末端70 位的Ala的堿基序列。進一步為了獲得N末端一側(cè)的序列，將編碼包含有從成熟型大鼠 IGF-1的N末端的5，對應的堿基的g至5，側(cè)-33位的t開始至第 14 4立的g的序歹寸5， 一tgcttgctcacctttaccag (序歹寸編號7 )作為正 向引物，將編碼從N末端笫50位的Arg至56位的Arg的基因的互補 序列5， -ctcctcagatcacagctccg (序列編號8)作為反向引物進行 使用，以上述cDNA作為模板進行PCR反應。在進行95。C、 5分鐘的前 處理后，重復進行35次95。C、 30秒鐘的變性，44°C、 60秒鐘的退火， 72°C、 90秒鐘的延長反應，擴增目的基因后，再次進行72。C、 10分 鐘的延伸反應，得到185bp的含有倉鼠IGF- 1的N末端區(qū)域的片段。實施例2:編碼倉鼠IGF-1的cDNA的堿基序列及氨基酸序列的確
定克隆的基因通過DNA測序儀確定了基因序列，進一步確定了氨基 酸序列，確認其編碼了倉鼠IGF-1。得到的氨基酸序列在圖l及序列 編號1中表示，DNA序列在序列編號2中表示。各個種的成熟的分泌型IGF-1均由70個氨基酸構(gòu)成，但倉鼠IGF -l基因具有特異的序列，與人IGF-1比較，第20位的P (人D)， 第35位的I(人S)，第67位的T(人A )的三個氨基與人不同酸(圖 2)實施例3:變異型倉鼠IGF - 1基因的制備及其IGF-1的活性 (1 )變異型倉鼠IGF - 1基因的制備分泌型倉鼠IGF-1基因具有在基因N末端第3位具有負電荷的E (谷氨酸)。制備了將該部位的氨基酸變更為使電荷朝正電荷方向移 動的氨基酸的變異型IGF-l基因。IGF-1基因的變異的導入通過定點 突變法進行。天然型倉鼠IGF- 1基因及獲得的變異型倉鼠IGF- 1基因分別稱 為E3E (天然型)、E3K (第3位的谷氨酸置換為賴氨酸)、E3S (第3 位的谷氨酸置換為絲氨酸)(參照圖3)。(2)天然型及變異型倉鼠IGF-1的增殖能力及存活率的效果構(gòu)建表達變異型倉鼠IGF - 1的質(zhì)粒(圖4 )，并導入至親代細胞 抹的抗IL-6R抗體產(chǎn)生CHO細胞中，選擇耐受潮霉素的抗藥性細胞抹， 獲得穩(wěn)定表達的細胞林。得到的細胞林進一步通過限制性稀釋進行單 細胞克隆，在IGF-1無添加的無血清培養(yǎng)基中得到增殖能力高的克隆 細胞。從分別帶有不同電荷的E3E、E3K、E3S得到的克隆細胞中選擇ME45 (E3E) 、 MK44 (E3K) 、 MS19 ( E3S )，放置于IGF - 1無添加的無血 清培養(yǎng)基中，在100ml的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中比較細胞的增殖能力及生存能 力。對于親代細胞林的抗IL-6R抗體產(chǎn)生細胞，通過在JRH^^司購進 的人IGF-1 (Long R3IGF-1)添加培養(yǎng)基和無添加培養(yǎng)基中培養(yǎng)進 行比較。在S100旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶中加入lOOmlMRA傳代用無血清培養(yǎng)基，
在37。C的C02溫育器內(nèi)保持溫度，然后3x 106個細胞被離心后加入。 分別取1mL培養(yǎng)液測定開始的細胞數(shù)及存活率。定時以lmL分別取樣 測定第3天以后至第7天的細胞數(shù)及存活率。得到的結(jié)果在圖5(增殖能力)和圖6(生存能力)中顯示。確定 MS19 (E3S)的增殖能力、生存能力均為最優(yōu)。然后是MK44 (E3K)顯 示良好結(jié)果。而作為親代細胞抹的抗IL-6R抗體產(chǎn)生細胞在IGF-1 無添加培養(yǎng)基中不能增殖。MS19的增殖能力從培養(yǎng)第3日至第6日呈 現(xiàn)顯著，特別是從第4日至第5日的倍增時間(Msl9; 26.5小時，MK44 33. O小時，Me45;47. O小時，抗IL-6R親代細月包林；86. 7小時)、及 最高到達細胞數(shù)(MS19; 25.8xl05個細胞/ml， MK44; 20. 3xl(T個 細胞/ml， ME45; 7. 98 x 1 05個細胞/ml，抗IL-6R親代細胞抹；21.7 x 105個細胞/ml)考慮MS19的優(yōu)越性明顯。細胞的增殖上升平緩，一 直延伸至其后的培養(yǎng)末期的MS19的培養(yǎng)特性，可作為理想的抗體生產(chǎn) 細胞使用。另外，在存活率的比較中如在培養(yǎng)第7日非常顯著(MS19; 86.2%, MK44 66.4%， ME45; 58.1%,抗IL-6R親代細胞才朱；76. Ohr%) 顯示，MS19—直至培養(yǎng)后期仍為穩(wěn)定的細胞。實施例4:倉鼠IGF-1 (E3S)導入細胞的抗體產(chǎn)生量為了證明倉鼠IGF _ 1具有等同或高于人IGF-1的抗體產(chǎn)生量的潛 力，將導入了倉鼠IGF- 1 (E3S)與人IGF-1 (E3S)至親代細胞林中 的細胞中培養(yǎng)特性最佳的單克隆的抗IL - 6R抗體產(chǎn)生量進行了比較。 人IGF-1 (EM)表達質(zhì)粒通過以倉鼠IGF-1 (E3S)為模板按順序?qū)?用于P"D、 I35S、 T67A置換的變異而構(gòu)建。按照與實施例1同樣的方 法在親代細胞林IL - 6R抗體產(chǎn)生CHO細胞抹中進行導入，選擇潮霉素 抗性細胞，通過使IGF - 1 ( E3S )穩(wěn)定的表達選擇在IGF - 1無添加培 養(yǎng)基中獲得增殖能力的細胞抹。通過對細胞進行限制性稀釋獲得單克 隆，進一步進行使用增殖方面優(yōu)良的導入了 IGF-1 (E3S)的細胞的 Fed-Batch培養(yǎng)，比較抗體的產(chǎn)生量。得到的結(jié)果如圖7所示。導入了倉鼠IGF - 1 (E3S)的細胞的抗 體產(chǎn)生量在培養(yǎng)第8天為973mg/L，親代細胞抹為(843mg/L)，比
人IGF-1 (E3S)導入細胞(821mg/L)更為優(yōu)越。確認了無論釆用何 種培養(yǎng)方法，相對于親代細胞林倉鼠基因?qū)爰毎目贵w生產(chǎn)量均為 最高。實施例5:倉鼠IGF-1 (E3S)導入細胞的抗體產(chǎn)生量在實施例4中顯示了倉鼠IGF- 1具有與IGF- 1等同或更高的抗 體產(chǎn)生量的能力，進一步比較了包含小鼠IGF - 1的3種IGF- 1的抗 體產(chǎn)生量能力。小鼠IGF-1 (E3S)表達質(zhì)粒通過以倉鼠IGF - 1 (E3S) 為模板導入了用于S69A的置換的變異而構(gòu)建。為了比較3種天然型 IG-1 (E3E)以及變異體IGF-1 (E3S)的抗體產(chǎn)生量，以倉鼠、人、 小鼠IGF-1 (E3S)為模板在E3E中導入變異，分別構(gòu)建天然型IGF -1 (E3E)表達質(zhì)粒。得到的6種IGF-1表達質(zhì)粒以電穿孔法導入至同時制備的親代細 胞林中，選擇潮霉素的抗性細胞后，通過使IGF - 1穩(wěn)定的表達選擇在 IGF - 1無添加培養(yǎng)基中獲得增殖能力的細胞林增殖能力最好的3抹細 胞(11=3)。在擴增過程中人IGF-1 (E3E) 1抹為增殖不良株，僅對 IGF-1 (E3E) n=2繼續(xù)進行試驗，將合計17個細胞抹在100ml旋轉(zhuǎn) 培養(yǎng)中進行擴大后，通過Fed-Batch培養(yǎng)比較抗體產(chǎn)生量。圖8表示倉鼠、小鼠及人IGF - 1 ( E3S )導入細胞的Fed - Batch 培養(yǎng)中的抗體產(chǎn)生量。增殖良好的各種3株(11=3)的平均生產(chǎn)量優(yōu)良， 順序為倉鼠>小鼠>人。圖9表示倉鼠、小鼠及人IGF-1 (E3S)導入 細胞的3林中具有最大的抗體生產(chǎn)量的細胞林的比較。不僅平均生產(chǎn) 量，在最大生產(chǎn)量中倉鼠IGF-1 (E3S)導入林更優(yōu)越。圖10表示倉 鼠、小鼠及人IGF - 1 (E3E)導入細胞的Fed-Batch培養(yǎng)中的抗體產(chǎn) 生量。增殖良好的各種平均生產(chǎn)量在天然型IGF-1 (E3E)導入抹中 順序仍然為倉鼠〉小鼠〉人。
權(quán)利要求
1.多肽，其選自以下多肽(1)具有序列編號1中記載的氨基酸序列的多肽，以及(2)具有在序列編號1中記載的氨基酸序列中，第3位的氨基酸被其它氨基酸置換的氨基酸序列，且具有胰島素樣生長因子1(IGF-1)活性的多肽。
2. 如權(quán)利要求l所述的多肽，第3位的氨基酸被絲氨酸所置換。
3. 如權(quán)利要求l所述的多肽，第3位的氨基酸被賴氨酸所置換。
4. 編碼如;^又利要求1所述的多肽的DNA。
5. 含有如權(quán)利要求4所述的DNA的載體。
6. 含有如權(quán)利要求5所述的載體的宿主細胞。
7. 如權(quán)利要求6所述的宿主細胞，其是CH0細胞。
8. 制備如權(quán)利要求1所述的多肽的方法，其使用如權(quán)利要求6 或7中記載的宿主細胞。
9. 與權(quán)利要求1所述的多肽相結(jié)合的抗體。
10. 細胞，其中導入了編碼如權(quán)利要求1所述的多肽的DNA以及 編碼期望的蛋白質(zhì)的DM，以用于生產(chǎn)所期望的蛋白質(zhì)。
11. 如權(quán)利要求IO所述的細胞，其中編碼如權(quán)利要求1所述的多 肽的DM和編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA通過單個載體同時進行導入。
12. 如權(quán)利要求10所述的細胞，其中編碼權(quán)利要求1所述的多肽 的DM和編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA通過多個載體分別進行導入。
13. 如權(quán)利要求10~ 12中任一項所述的細胞，其是CH0細胞。
14. 制備期望的蛋白質(zhì)的方法，包含培養(yǎng)權(quán)利要求10~ 13中任一 項所述的細胞。
15. 含有如權(quán)利要求1所述的多肽的培養(yǎng)基。
16. 如權(quán)利要求15所述的培養(yǎng)基，其中權(quán)利要求1所述的多肽通過在培養(yǎng)基中進行添加而含有在培養(yǎng)基中。
17. 如權(quán)利要求15所述的培養(yǎng)基，其中權(quán)利要求1所述的多肽通過從宿主細胞分泌而含有在培養(yǎng)基中。
18. 如權(quán)利要求15~17中任一項所述的培養(yǎng)基，其是無血清培養(yǎng) 基或者不含有除了權(quán)利要求1所述的多肽以外的哺乳動物來源的成分 的培養(yǎng)基。
19. 期望的蛋白質(zhì)的制備方法，包含使用如權(quán)利要求15~ 18中任 一項所述的培養(yǎng)基進行CH0細胞的培養(yǎng)。
20. 用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的制備方法，包含以下步驟(a) 在CH0細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA的步驟；(b) 在(a)制備的細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟。
21. 用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的制備方法，包含以下步驟(a) 在CH0細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA的步驟；(b) 從(a)制備的細胞中選擇表達期望的蛋白質(zhì)的細胞的步驟；(c) 在(b)選擇的細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟。
22. 用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的制備方法，包含以下步驟(a) 在CH0細胞中同時導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA和編碼 IGF-1的DNA的步驟；(b) 從(a)制備的細胞中選擇表達期望的蛋白質(zhì)的細胞的步驟。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，使用含有編碼期望的蛋白質(zhì)的 DNA和編碼IGF-1的DM的單個栽體，在CH0細胞中同時導入編碼期 望的蛋白質(zhì)的DNA和編碼IGF-1的DNA。
24. 用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的制備方法，包含以下步驟(a) 在CH0細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟；(b) 在(a)步驟制備的細胞中導入編碼期望蛋白質(zhì)的DM的步驟。
25. 用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的制備方法，包含以下步驟 (a )在CH0細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟；(b) 在(a)制備的細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA的步驟；(c) 從(b)中制備的細胞中選擇表達期望的蛋白質(zhì)的細胞的步驟。
26. 如權(quán)利要求20~25中任一項所述的制備方法，IGF-l為權(quán)利 要求1所述的多肽。
27. 用于制備期望的蛋白質(zhì)的細胞的篩選方法，包含以下步驟(a) 在CH0細胞中導入編碼期望的蛋白質(zhì)的DNA的步驟；(b) 在(a)制備的細胞中選擇表達期望的蛋白質(zhì)的細胞的步驟；(c) 在(b)選擇的細胞中導入編碼IGF-1的DNA的步驟；(d) 從(c)中制備的細胞中選擇表達期望的蛋白質(zhì)及IGF-1 的細胞的步驟。
28. 權(quán)利要求27中所述的篩選方法，IGF- 1為權(quán)利要求1所述 的多肽。
全文摘要
通過本發(fā)明提供一種多肽，其選自以下多肽(1)具有序列編號1中記載的氨基酸序列的多肽，以及(2)具有在序列編號1中記載的氨基酸序列中，第3位的氨基酸被其它氨基酸置換的氨基酸序列，且具有胰島素樣生長因子1(IGF-1)活性的多肽；編碼所述多肽的DNA；含有所述DNA的載體；含有所述載體的宿主細胞、以及使用所述多肽制備重組蛋白質(zhì)的方法。
文檔編號C07K14/62GK101151276SQ200680010298
公開日2008年3月26日 申請日期2006年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月21日
發(fā)明者田中佐依子, 田淵久大 申請人:中外制藥株式會社