專利名稱：：Cd20抗體變體及其用途的制作方法CD20抗體變體及其用途本申請要求2005年2月7日提交的美國臨時申請流水號60/651,111、2005年6月10日提交的美國臨時申請流水號60/689,404和2005年7月25日提交的美國臨時申請流水號60/702,571的權(quán)益，在此完整收入這些申請作為參考。發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及抗CD20抗體及其它們在治療B細(xì)胞相關(guān)疾病方面的用途。發(fā)明背景淋巴細(xì)胞是數(shù)種白細(xì)胞群之一；它們特異性識別并響應(yīng)外來抗原。有三大類淋巴細(xì)胞B淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)、T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)和天然殺傷(NK)細(xì)胞。B淋巴細(xì)胞是負(fù)責(zé)生成抗體和提供體液免疫的細(xì)胞。B細(xì)胞在骨髓中成熟，然后離開骨髓并在其細(xì)胞表面表達(dá)抗原結(jié)合抗體。當(dāng)幼稚B細(xì)胞初次遭遇其膜結(jié)合抗體對之特異的抗原時，該細(xì)胞開始快速分裂，且其后代分化成記憶B細(xì)胞和稱作"漿細(xì)胞"的效應(yīng)細(xì)胞。記憶B細(xì)胞具有較長的壽命，并繼續(xù)表達(dá)與最初的親代細(xì)胞具有相同特異性的膜結(jié)合抗體。漿細(xì)胞不生成膜結(jié)合抗體，改為生成分泌形式的抗體。分泌型抗體是體液免疫的主要效應(yīng)器分子。CD20抗原(也稱為人B淋巴細(xì)胞限制分化抗原，Bp35)是位于前B淋巴細(xì)胞(pre-B)和成熟B淋巴細(xì)胞上、分子量約35kD的疏水性跨膜蛋白質(zhì)(Valentine&a/"J腸/.C/ze肌264(19):11282-11287(1989);Einfeld"a/.,五Affi(9J7(3):711-717(1988))。該抗原還在超過90%的B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)上表達(dá)(Andersonda/.,S/ood63(6):1424-1433(1984))，但在造血干細(xì)胞、原B細(xì)胞(pro-B)、正常漿細(xì)胞或其它正常組織上沒有找到(Tedder"a/.,J/mm柳o/.135(2):973-979(1985))。認(rèn)為CD20調(diào)節(jié)細(xì)胞周期起始和分化的激活過程中的早期步驟(Tedder"a/.,swpra)，并可能發(fā)揮鈣離子通道的功能(Tedderefa/.，JCe〃.S/oc/zem.14D:195(1990))。考慮到CD20在B細(xì)胞淋巴瘤中表達(dá)，該抗原已經(jīng)成為治療此類淋巴瘤的有用治療靶。美國有超過300,000人患有B細(xì)胞NHL，而且每年新診斷超過56,000例。例如，作為針對人CD20抗原的遺傳工程嵌合鼠/人單克隆抗體，rituximab(RJTUXAN⑧)抗體(可以從Genentech,Inc.,SouthSanFrancisco,California,U.S.購買)用于治療患有復(fù)發(fā)性或頑固性^^級或濾泡性CD20陽性B細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤的患者。rituximab就是1998年4月7日公告的美國專利No.5,736,137(Andersona/.)和美國專利No.5,776,456中稱為"C2B8"的抗體。作用機制的體外研究表明RITUXAN⑧結(jié)合人補體并通過補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)溶解淋巴樣B細(xì)胞系(ReffWa/.,83(2):435-445(l"4))。此外，它在抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)測定法中具有顯著活性。體內(nèi)臨床前研究顯示RITUXAN⑧從獼猴的外周血、淋巴結(jié)和骨髓中消減B細(xì)胞，可能是通過補體和細(xì)胞介導(dǎo)的過程(Reffd"/.，5/ood83(2):435-445(1994))。指明用于治療NHL的其它抗CD20抗體包括連接有放射性同位素釔-90的鼠抗體Zevalin(IDECPharmaceuticals,SanDiego,CA)、偶聯(lián)有1-131的另一種完全鼠的抗體Bexxar(Corixa,WA)。CD20還是治療自身免疫病的有用靶抗原。也已在B細(xì)胞和自身抗體表現(xiàn)出在疾病病理生理學(xué)中發(fā)揮作用的多種非惡性自身免疫病中研究了rituximab。EdwardseZ1a/.,fi/oc/z倒.5bc.7><3肌30:824-828(2002)。rituximab據(jù)報道潛在減輕例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)(Leandroaa/.，j朋.W/zew肌ZXs.61:883-888(2002);EdwardsWa/.,^/znto臉訓(xùn).46(Suppl.9):S46(2002);Stahla/"j肌W/2e皿他62(SuppU):OP004(2003);Emerya/.,i/zew肌48(9):S439(2003》、狼皰(Eisenberg,爿W/zW"si仏77^r.5:157-159(2003);Leandroa/.，Jr^w7力Si/zewm.46:2673-2677(2002);Gormana/.,13:312-316(2004))、免疫性血小板減少性紫癥(D'ArenaW丄y—o腿44:561-562(2003);Stasi"a/.，腸oJ98:952-957(2001);Saleh"a/.,(9"co/.27(Supp.l2):99-103(2000);Zaiada/.，i/aemato/g/ca87:189-195(2002);Ratanatharathorne/a/.，j朋.TWed133:275-279(2000》、純紅細(xì)胞再生障礙(Auner"a/.,J.//aemato/.116:725-728(2002))、自身免疫性貧血(Zaja"/.,/Taewafo/og/ca87:189-195(2002),i力i吳見f/aemato/og/ca87:336(2002))、冷凝集素疾病(Layios15:187-8(2001);BerentsenWa/.，103:2925-2928(2004);BerentsenWa/"乂//aemato/.115:79-83(2001);Bauduer,//aewato/.112:1083-1090(2001》Damianiefa/"5r.7".//ae附ato/.114:229-234(2001》、重度胰島素耐受的B型綜合征(Coll&a/.,WJMed350:310-311(2004》、混合性冷球蛋白血癥(DeVita"a/.，JW/zr/fei/zew附.46(Suppl.9):S206/S469(2002))、重癥肌無力(Zaja"a/.，A^wrafogv55:1062-63(2000);Wylam"/尸e&a化143:674-677(2003))、韋格納氏肉芽腫(Specks""/.,KA函&臉畫"細(xì)44:2836-2840(2001))、頑固性尋常型天皰裔(Dupuye/1JrcA.Dermato/.140:91-96(2004))、il月幾炎(Levine，^W/^/zfei^ewm.46(Suppl.9):S1299(2002》、斯耶格倫氏綜合征(Somer"a/.,JW/zn'fe&i/7ewmatow49:394-398(2003))、活動性II型混合性冷球蛋白血癥(Zaja"a/.，腸W101:3827-3834(2003))、尋常型天皰癡(Dupay""/.，i/.D簡她/.140:91-95(2004))、自身免疫性神經(jīng)病(Pestronkda/"/7Vewra/.A^wmswrg.i^yc/^f^y74:485-489(2003))、瘤外視性眼陣攣-肌陣攣綜合征(Pranzatelli""/.，A^wro/o^60(Suppl.l)P05.128:A395(2003))、及復(fù)發(fā)-緩和型多發(fā)性石更化(RRMS)(Crossefa/"(abstract)"PreliminaryResultsfromaphaseIItrialofrituximabinMS",美國多發(fā)性硬化研究與治療委員會第八次年會，20-21(2003))的體征和癥狀。已在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者中進(jìn)行了II期臨床試驗，提供了有關(guān)rituximab的安全性和功效的48周5艮蹤it據(jù)。Emery"a/.,JW/zr/toW/2ewm.48(9):S439(2003);Szczepanski"a/.,y^/zn'to朋函.48(9):S121(2003)。將患者隨機平分為四個治療組曱氨蝶呤、僅rituximab、rituximab加曱氨蝶呤、以及rituximab加環(huán)磷酰胺(CTX)。rituximab的治療方案為第1天和第15天靜脈內(nèi)施用1克。關(guān)注用rituximab進(jìn)行治療的出版物包括PerottaandAbuel,"ResponseofchronicrelapsingITPof10yearsdurationtorituximab",Abstract#3360Blood10(1)(part1-2):p.88B(1998);Perottaetal.，"Rituxaninthetreatmentofchronicidiopathicthrombocytopenicpurpura(ITP)"，Blood94:49(abstract)(1999);Matthews,R.，"MedicalHeretics",NewScientist(7April,2001);Leandroetal""Clinicaloutcomein22patientswithrheumatoidarthritistreatedwithBlymphocytedepletion",AnnRheumDis，supra;Leandroetal""Lymphocytedepletioninrheumatoidarthritis:earlyevidenceforsafety,efficacyanddoseresponse",ArthritisandRheumatism44(9):S370(2001);Leandroetal.,"AnopenstudyofBlymphocytedepletioninsystemiclupuserythematosus",ArthritisandRheumatism,46:2673-2677(2002)，其中在2周期間，每名患者接受兩次500mgrituximab輸注、兩次750mg環(huán)石壽酰胺輸注、和高劑量口服皮質(zhì)類固醇，其中兩名接受治療的患者分別在第7和8個月時復(fù)發(fā)，且已經(jīng)用不同方案復(fù)治；^Veideetal.，"Successfullong-termtreatmentofsystemiclupuserythematosuswithrituximabmaintenancetherapy",Lupus12:779-782(2003)，其中用rituximab治療一名患者(375mg/m2x4,以一周為間隔)，且每5-6個月投遞更多的rituximab應(yīng)用，然后每三個月接受375mg/m2rituximab的維持療法，而且用rituximab成功的治療了患有頑固性SLE的第二名患者，且每三個月^妻受維持療法，兩名患者對rituximab療法都有4交好的響應(yīng)；EdwardsandCam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Grillo-LopezandWhite);WO00/27433(Grillo-LopezandLeonard);WO00/44788(Braslawskyetal.);WO01/10462(Rastetter,W.);WO01/10461(RastetterandWhite);WO01/10460(WhiteandGrillo-Lopez);US2001/0018041Al、US2003/0180292Al、WO01/34194(HannaandHariharan);美國申請US2002/0006404和WO02/04021(HannaandHariharan);美國申請US2002/0012665Al和WO01/74388(Hanna,N.);美國申請US2002/0058029Al(Ha腿,N.);美國申請US2003/0103971Al(HariharanandHanna);美國申請US2002/0009444Al和WO01/80884(Grillo-Lopez,A.);WO01/97858(White，C.);美國申請US2002/0128488Al和WO02/34790(Reff,M.);WO02/060955(Braslawskyetal.);WO02/096948(Braslawskyetal.);WO02/079255(ReffandDavies);美國專利6,171,586Bl和WO98/56418(Lametal.);WO98/58964(Raju,S.);WO99/22764(Raju，S.);WO99/51642、美國專利6,194,551Bl、美國專利6,242,195Bl、美國專利6,528,624Bl和美國專利6,538,124(Idusogieetal.);WO00/42072(Presta,L.);WO00/67796(Curdetal.);WO01/03734(Grillo-Lopezetal.);美國申請US2002/0004587Al和WO01/77342(MillerandPresta);美國申請US2002/0197256(Grewal,I.);美國申請US2003/0157108Al(Presta，L.);美國專利6,565,827Bl、6，090，365Bl、6,287,537B1、6,015,542、5,843,398和5,595,721(Kaminskietal.);美國專利5,500,362、5,677,180、5,721,108、6,120,767、6,652,852Bl(Robinsonetal.);美國專利6,410,391Bl(Raubitscheketal.);美國專利6,224,866Bl和WO00/20864(Barbera-Guillem,E.);WO01/13945(Barbera-Guillem，E.);WO00/67795(Goldenberg);美國申請US2003/0133930Al和WO00/74718(GoldenbergandHansen);WO00/76542(Golayetal.);WO01/72333(WolinandRosenblatt);美國專利6,368,596Bl(Ghetieetal.);美國專利6,306,393和美國申請US2002/0041847A1(Goldenberg，D.);美國申請US2003/0026801Al(WeinerandHartmann);WO02/102312(Engleman，E.);美國專利申請US2003/0068664(Albitaretal.);WO03/002607(Leung,S.);WO03/049694、US2002/0009427Al和US2003/0185796Al(Wolinetal.);WO03/061694(SingandSiegall);US2003/0219818Al(Bohenetal.);US2003/0219433Al和WO03/068821(Hansenetal.);US2002/0136719Al(Shenoyetal.);WO2004/032828(Wahletal.);WO2004/035607(Teelingetal.);US2004/0093621(Shitaraetal.)。還可參見美國專利5,849,898和歐洲申請330,191(Seedetal.);美國專利4,861,579和EP332,865A2(MeyerandWeiss);WO95/03770(Bhatetal.);US2001/0056066(Bugelskietal.);WO2004/035607(Teelingetal.);WO2004/056312(Lowmanetal.);US2004/0093621(Shitaraetal.);WO2004/103404(Watkinsetal.)。關(guān)注CD20抗體的出X反物包4舌Teeling,丄etal""CharacterizationofnewhumanCD20monoclonalantibodieswithpotentcytolyticactivityagainstnon陽Hodgkin'slymphomas",Blood,Jim2004;10.1182。發(fā)明概述本發(fā)明提供了表13和14中列出的結(jié)合人CD20并在體內(nèi)消減靈長類動物B細(xì)胞的人源化2H7變體抗體。在具體的實施方案中，hu2H7抗體是型式472、473、511、523和516。在本發(fā)明的組合物、方法、制品、配制劑的優(yōu)選實施方案中，所述人源化2H7抗體是hu2H7.v511或hu2H7.v114。所述抗體在體內(nèi)有效消減靈長類動物B細(xì)胞，該抗體包含SEQIDNO.25的輕鏈可變區(qū)(VO序列和SEQIDNO.8的重鏈可變區(qū)(Vn)序列，但VH-CDR2中有氨基酸替代D56A，且VH-CDR3中的N100用Y或W替代。在一個實施方案中，此抗體還包含VH-CDR3中的替代S100aR。在前述抗體的另一實施方案中，抗體還包含F(xiàn)c區(qū)中至少一處改善ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代。為了改善ADCC和/或CDC效應(yīng)器功能，在一個實施方案中，前述抗體還將包含IgGlFc且該IgGlFc包含氨基酸替代S298A、E333A、K334A、及K326A或K326W中任一。在一個實施方案中，前述實施方案的抗體展示出比2H7.vl6高至少20倍的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)，且展示出比2H7.vl6高至少25倍的補體依賴性細(xì)胞毒性?；蛘撸娲鶶100aR的抗體可具有Fc中至少一處改善ADCC活性但降低CDC活性的氨基酸改變或替代。在這點上，抗體可至少包含F(xiàn)c中的氨基酸替代K322A,且還可包含氨基酸替代S298A、E333A、K334A。在優(yōu)選的實施方案中，具有改良的ADCC和CDC活性的抗體還以相對于抗體2H7.vl6而言^是高至少3倍、優(yōu)選至少6倍的親和力結(jié)合人CD20,所述2H7.vl6具有分別為SEQIDNO.13和14的輕《連和重《連序列。NO.26的輕鏈序列和SEQIDNO.34的重鏈序列組成。本發(fā)明還提供了任何前述實施方案的抗體，它與細(xì)胞毒劑偶聯(lián)。在一個實施方案中，所述細(xì)胞毒劑是放射性同位素或毒素。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體在CHO細(xì)胞中生成。本發(fā)明還提供了編碼前述實施方案的抗體的分離核酸，包括表達(dá)載體。還提供了包含所述核酸而生成所述抗體的宿主細(xì)胞。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞是生成抗體2H7.v511的細(xì)胞。提供了用于生成任何前述抗體的方法，包括培養(yǎng)前述宿主細(xì)胞并從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收抗體。還提供了包含本發(fā)明的2H7抗體及載體的組合物。在一個實施方案中，所述載體是藥劑學(xué)可接受載體。另一實施方案是包含hu2H7.v511的組合物，其中組合物中大約80-100%的抗體缺乏海藻糖。另一方面是制品，包括容器及裝在該容器中的組合物，其中所述組合物包含任何前述實施方案的抗體。根據(jù)需要組合物的具體處理，所述制品還可包括指明該組合物用于治療非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤或該組合物用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的包裝插頁。本發(fā)明的另一方面是使用前述實施方案的人源化2H7抗體在體內(nèi)消減B細(xì)胞的方法。本發(fā)明還提供了治療CD20陽性癌癥的方法，包括對癌癥患者施用治療有效量的前述實施方案的人源化2H7抗體。所述CD20陽性癌癥優(yōu)選B細(xì)胞淋巴瘤或白血病。在具體的實施方案中，將結(jié)合hCD20的人源化2H7抗體及其功能性片段用于治療非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴細(xì)胞為主型的何杰金氏病(LPHD)、小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(SLL)、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)。在具體的實施方案中，將人源化CD20結(jié)合抗體或其功能性片段，特別是v511和v114，用于治療無痛(indolent)NHL，包括復(fù)發(fā)的無痛NHL和rituximab耐受(refractory)的無痛NHL。為了治療這些癌癥，在一個實施方案中，經(jīng)靜脈內(nèi)輸注施用所述抗體。經(jīng)輸注施用的劑量在每劑約12.5mg/m2至800mg/m2的范圍內(nèi)，通常每周一劑，共1、2、3或4劑。本發(fā)明還提供了減輕自身免疫病的方法，包括對自身免疫病患者施用治療有效量的任一前述實施方案的人源化2H7抗體。在優(yōu)選的實施方案中，所述抗體是靜脈內(nèi)或皮下施用的。所述抗體靜脈內(nèi)施用的劑量在每劑10mg至500mg的范圍內(nèi)，在具體的實施方案中，劑量是100mg/劑。在具體的實施方案中，所述自身免疫病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)包括狼瘡腎炎、韋格納(Wegener)氏病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少癥、多發(fā)性硬化、銀屑病、IgA腎病、IgM多神經(jīng)病、重癥肌無力、ANCA相關(guān)性血管炎、糖尿病、雷諾(Reynaud)氏綜合征、斯耶格倫(Sjogren)氏綜合征、視神經(jīng)脊髓炎(NeuromyelitisOptica,NMO)和腎小球腎炎。hu2H7.v511和hu2H7.v114抗體可用于治療或減輕自身免疫病或B細(xì)胞腫瘤的方法，其中所述抗體與第二種治療劑以同時、序貫施用或在交替方案中聯(lián)用。在一個實施方案中，所述第二種治療劑是BAFF拮抗劑。在某些實施方案中，所述BAFF拮抗劑是結(jié)合人BR3的抗體或BR3-Fc融合蛋白。在治療前述疾病的方法的一個優(yōu)選實施方案中，受試者或患者是靈長類動物，優(yōu)選人。還提供了液體配制劑，其在20mM乙酸鈉，4%二水合海藻糖，0.02%聚山梨醇酯20,pH5.5中含有約20mg/ml人源化2H7.v511抗體，供靜脈內(nèi)施用。還提供了液體配制劑，其在20mM乙酸鈉，240mM(8%)二水合海藻糖,0.02%聚山梨醇酯20,pH5.3中含有約20mg/ml人源化2H7.vl14抗體?？捎糜?H7.vl6的另一液體配制劑是在20mM乙酸鈉pH5.3,f/o二水合海藻糖，0.02%聚山梨醇酯20(Tween20頂)中含有約30mg/ml抗體。附圖簡述圖1A顯示了比較鼠2H7(SEQIDNO.1)、人源化2H7.vl6變體(SEQIDNO.2)和人k輕鏈亞類I(SEQIDNO.3)各自輕鏈可變區(qū)(VO氨基酸序列的序列比對。2H7和hu2H7.v16的VL的CDR如下.'CDRl(SEQIDNO.4)、CDR2(SEQIDNO.5)和CDR3(SEQIDNO,6)。圖IB顯示了比較鼠2H7(SEQIDNO.7)、人源化2H7.vl6變體(SEQIDNO.8)和人重鏈亞類III共有序列(SEQIDNO.9)各自重鏈可變區(qū)(VH)氨基酸序列的序列比對。2H7和hu2H7.v16的VH的CDR如下CDRl(SEQIDNO.10)、CDR2(SEQIDNO.ll)和CDR3(SEQIDNO.12)。在圖IA和圖IB中，如圖所示，每條鏈中的CDR1、CDR2和CDR3圍在括號中，側(cè)翼是框架區(qū)FR1-FR4。2H7指鼠2H7抗體。兩行序列之間的星號指明兩種序列間不同的位置。殘基編號依照KabatWa/.,o/7mw麗o/og/ca//"temst,第5版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991),插入顯示為a、b、c、d和e。圖2A顯示了比4支人源化2H7.vl6和v511輕鏈的蛋白質(zhì)序列比對。圖2B顯示了比較人源化2H7.vl6和v511重鏈的蛋白質(zhì)序列比對。圖3顯示了在溶解的CD20ELISA中2H7變體的相對結(jié)合。對抗體2H7.vl6(圓圏)、2H7.v511(正方形)和2H7.v588(三角形)進(jìn)行了比較(見實施例12)。圖4顯示了使用WIL2-S細(xì)胞和純化的人NK細(xì)胞測定的ADCC活性。對抗體2H7.vl6(圓圈)、2H7.v511(正方形)和2H7.v588(三角形)比較了它們在體外介導(dǎo)ADCC的能力(見實施例13)。圖5顯示了使用WIL2-S細(xì)胞和人補體測定的CDC活性。對抗體2H7.v16(圓圈)、2H7.v511(正方形)和2H7.v588(三角形)比較了它們在體外介導(dǎo)CDC的能力(見實施例14)。圖6顯示了注射抗體后的第2天2H7變體v16和v511在體內(nèi)對血液(左圖)和腹膜腔(右圖)中B細(xì)胞的消減(見實施例15)。圖7顯示了注射抗體后兩天2H7變體v16和v511對脾臟中B細(xì)胞的消減脾B細(xì)胞(左圖)、邊緣區(qū)B細(xì)胞(中圖)和濾泡B細(xì)胞(右圖)(見實施例15)。圖8比較了在表達(dá)人CD20和人CD16的hCD20Tg+/+/mCD16-/-/hCD16Tg+A轉(zhuǎn)基因小鼠中2H7.vl6和v511的體內(nèi)B細(xì)胞消減(見實施例15)。圖9顯示了用于在CHO細(xì)胞中表達(dá)2H7.v16的載體。圖10顯示了用WIL2-S細(xì)胞測定的2H7.v511與其它2H7變體vl6、v31、v114、v138和v488的CDC活性的比較(見實施例14)。圖11比較了用WIL2-S細(xì)胞和純化的人NK細(xì)胞測定的抗體變體2H7.v511、v16、v31、v114、v138和v488的ADCC活性(見實施例13和圖4)。圖12概括了在表達(dá)人CD20和人CD16的hCD20Tg+/+/mCD16-/-/hCD16Tg+A轉(zhuǎn)基因小鼠中2H7.v511和rituximab(Rituxan⑧)的體內(nèi)B細(xì)胞消減分析，兩種抗體的活性總結(jié)于表中(見實施例15)。圖13顯示了注射后第2天2H7.v511和rituximab在體內(nèi)對血液(左圖)和腹膜腔(右圖)中B細(xì)胞的消減(見實施例15)。圖14顯示了注射抗體后第2天2H7.v511和rituximab對脾臟中B細(xì)胞的消減脾B細(xì)胞(左圖)、邊緣區(qū)B細(xì)胞(中圖)和濾泡B細(xì)胞(右圖)(見實施例15)。圖15A、15B和15C顯示了純化自3名CLL患者的PBMC的體夕卜CDC活性比較，其中所述PBMC用2H7.vl14或RituxanTM，及人血清補體處理。圖16A、16B和16C顯示了來自3名CLL患者(患者與圖15中的相同)的PBMC的體夕卜CDC活性比專交，其中所述PBMC用2H7.v511或RituxanTM，及人血清補體處理。優(yōu)選實施方案的詳述"CD20"抗原是在超過90。/。來自外周血或淋巴樣器官的B細(xì)胞表面上找到的、分子量約35kD的非糖基化跨膜磷蛋白。CD20在早期前B(pre-B)細(xì)胞發(fā)育過程中表達(dá)，并保留至漿細(xì)胞分化；它在人干細(xì)胞、淋巴樣祖細(xì)胞或正常漿細(xì)胞上找不到。CD20存在于正常B細(xì)胞以及惡性B細(xì)胞二者上。CD20在文獻(xiàn)中的其它名稱包括"B淋巴細(xì)胞限制分化抗原"和"Bp35"。CD20抗原記載于例如ClarkandLedbetter,爿心.C朋.52:81-149(1989)和ValentineJ腸/.C7z亂264(19):11282-11287(1989)。術(shù)語"抗體"以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性或功能。本發(fā)明的人源化CD20結(jié)合抗體的生物學(xué)活性將至少包括抗體與人CD20的結(jié)合，更優(yōu)選與人和其它靈長類動物(包括獼猴、恒河猴、黑猩猩)CD20的結(jié)合。所述抗體將以不高于1x10—8的Kd值，優(yōu)選不高于約1x10—9的Kd值結(jié)合CD20,并且能夠在體內(nèi)殺死或消減B細(xì)胞，優(yōu)選與未用所述抗體處理的適宜陰性對照相比殺死或消減至少20%。B細(xì)胞消減可以是ADCC、CDC、凋亡或其它才幾制中的一種或多種造成的。在本文疾病治療的有些實施方案中，可能期望特定的效應(yīng)器功能或機制甚于其它的，而且優(yōu)選人源化2H7的某些變體以實現(xiàn)那些生物學(xué)功能，諸如ADCC。"抗體片段"包含全長抗體的一部分，通常是抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。"Fv"是包含完整抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。該片段由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。從這兩個結(jié)構(gòu)域的折疊結(jié)構(gòu)中散發(fā)出六個高變環(huán)(重鏈和輕鏈各3個環(huán))，貢獻(xiàn)出結(jié)合抗原的氨基酸殘基并賦予抗體以抗原結(jié)合特異性。然而，即使是單個可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(或是只包含對抗原特異的三個CDR的半個Fv)也具有識別和結(jié)合抗原的能力，只是親和力低于完整結(jié)合位點。術(shù)語"單克隆抗體"在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過程中可能產(chǎn)生的可能變體外，此類變體通常以極小量存在。此類單克隆抗體通常包括這樣的抗體，它包含結(jié)合靶物的多肽序列，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括如下步驟的過程獲得的，即從眾多多肽序列中選擇單一的靶物結(jié)合多肽序列。例如，所述選擇過程可以是從眾多克隆，諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重組DNA克隆的集合中選擇獨特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，選定的靶物結(jié)合序列可進(jìn)一步更改，例如為了提高對靶物的親和力，為了人源化靶物結(jié)合序列，為了提高其在細(xì)胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量，為了降低其在體內(nèi)的免疫原性，為了產(chǎn)生多特異性抗體，等等，而且包含更改的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā)明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性以外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢還在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語"單克隆"指明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生成抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來制備，包括例如雜交瘤方法(例如Kohlerefa/"7Va&re256:495(1975);Harlowa/.,JwriZ)o&M.'^丄a6oratorjvMw認(rèn)/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,第2版,1988;Hammerlinga/.,in:Momc/owa/爿w"70(i/es7^Ce〃場Zn,(iomas1563-681,Elsevier,N.Y.,1981)、重組DNA方法(參見例如美國專利No.4,816,567)、噬菌體展示技術(shù)(參見例如ClacksonWa/.，TVa^re352:624-628(1991);Marks"a/.，/Mo/.說o/.222:581-597(1991);Sidhu&a/.，乂Mo/.338(2):299-310(2004);Lee""/，乂M/.腸/.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,戶亂淑/.爿caJ.101(34):12467-12472(2004);Lee"a/.，J/mmwwo/.7WeAoA所述動物具有部分或全部的人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因(參見例如WO1998/24893;WO1996/34096;WO1996/33735;WO1991/10741;Jakobovits&a/.，尸rac.A/aA爿cadSc/.90:2551(1993);Jakobovitsa/.,A^wre362:255-258(1993);Bruggemann&a/.,lfear/mmw"o.7:33(993);美國專利No.5,545,806;5,569,825;5,591,669(都是GenPharm的)；5,545,807;WO1997/17852;美國專利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;和5,661,016;Marksez1"/.,腸/Tec/7"0/0gy10:779-783(1992);Lonberg"a/.,A^,e368:856-859(1994);Morrison,M似368:812-813(1994);Fishwild&a/.,7Va化refi/0&c/2"0fogy14:845-851(1996);Neuberger,A^wreS/otec/zwo/ogy14:826(1996);及LonbergandHuszar,i6v./mm麗o/.13^5-93(1995)。本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體的"功能性片段"是那些保持與衍生它們的完整全長分子以基本上相同的親和力結(jié)合CD20并且根據(jù)體外或體內(nèi)測定法諸如本文所述的那些測定法的測量顯示出包括消減B細(xì)胞在內(nèi)的生物學(xué)活性的片段。V結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)抗原結(jié)合并限定特定抗體對其特定抗原的特異性。然而，變異性并非均勻分布于可變區(qū)結(jié)構(gòu)域3爭越的110個氨基酸。事實上，V區(qū)由15-30個氨基酸，稱作框架區(qū)(FR)的相對不變異的區(qū)段及將框架區(qū)分開的每個長度為9-12個氨基酸，稱作"高變區(qū)"的極度變異的較短區(qū)域構(gòu)成。天然重鏈和輕鏈的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域各自包含四個FR,它們大多采取(3-折疊片構(gòu)象，通過形成環(huán)狀連接且在有些情況中形成(3-折疊片結(jié)構(gòu)一部分的三個高變區(qū)連接。每條鏈中的高變區(qū)通過FR非常接近的保持在一起，并與另一條鏈的高變區(qū)一起促成抗體的抗原結(jié)合位點的形成(參見Kabat等人，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD,1991)。恒定區(qū)不直4妄參與抗體與抗原的結(jié)合，但展現(xiàn)出多種效應(yīng)器功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)中抗體的參與。術(shù)語"高變區(qū)"在用于本文時指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。高變區(qū)通常包含來自"互補決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(例如VL中的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)附近及VH中的殘基31-35(HI)、50-65(H2)和95-102(H3)附近；Kabat等人，《SequencesofProteinsofImmunologicalInterest》,第5片反,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD，1991)和/或那些來自"高變環(huán)"的殘基(例如Vl中的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)及VH中的殘基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3);ChothiaandLesk,/Afo/.肌o/.196:卯1-917(1987))。在本文中提及時，"共有序列"或共有V結(jié)構(gòu)域序列是衍生自已知人免疫球蛋白可變區(qū)序列氨基酸序列比較的人工序列。基于這些比較，制備編碼V結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的重組核酸序列，所述V結(jié)構(gòu)域氨基酸序列是衍生自人K鏈和人H鏈亞類inv結(jié)構(gòu)域的共有序列。共有v序列不具有任何已知的抗體結(jié)合特異性或親和力。"嵌合"抗體(免疫球蛋白)中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利第4,816,567號；Morrison"a/.,Ato/.Jcad5W."&481:6851-6855(1984))。本文中所使用的人源化抗體是嵌合抗體的一個子集。非人(例如鼠)抗體的"人源化"形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈長類動物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒有找到的殘基。進(jìn)行這些修飾是為了進(jìn)一步改進(jìn)抗體的性能諸如結(jié)合親和力。一般而言，人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變區(qū)，其中整個或基本上整個高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且整個或基本上整個FR是人免疫球蛋白序列的FR，盡管FR可包含一處或多處改善結(jié)合親和力的氨基酸替代。FR中這些氨基酸替代的數(shù)目通常在重鏈中不超過6處，在輕鏈中不超過3處。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細(xì)節(jié)參見Jones"a/.，Atowre321:522-525(1986);Riechmann"a/.,A^wre332:323-329(1988);Presta，6>/.脂.2:593-596(1992)。抗體"效應(yīng)器功能"指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體Fc區(qū))的生物學(xué)活性。抗體效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合和補體依賴性細(xì)胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體)下調(diào)；和B細(xì)胞活化。"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"或"ADCC"指其中結(jié)合到某些細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、嗜中性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型Ig使得這些細(xì)胞毒性效應(yīng)細(xì)胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的耙細(xì)胞，隨后用細(xì)胞毒素殺死靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性形式。所述抗體"武裝"(arm)纟田胞毒性細(xì)胞，而且是此類殺傷作用絕對要求的。介導(dǎo)ADCC的主要細(xì)胞，NK細(xì)胞，只表達(dá)FcyRin,而單核細(xì)胞表達(dá)FcyRI、Fq/RII和FcyRIII。RavetchandKinet,ylmw.細(xì)./畫畫/.9:457-92(1991)第464頁表3總結(jié)了造血細(xì)胞上的FcR表達(dá)。為了評估目的分子的ADCC活性，可進(jìn)行體夕卜ADCC測定法，諸如美國專利第5,500,362或5,821,337號或Presta美國專利第6，737，056號中所記載的?？捎糜诖祟悳y定法的效應(yīng)細(xì)胞包括外周血單個核細(xì)胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細(xì)胞?；蛘?另外，可在體內(nèi)評估目的分子的ADCC活性，例如在動物才莫型中，諸如ClynesWa/.,iWJ5195:652-656(1998)中所披露的。若抗體是CD20結(jié)合抗體，則ADCC活性可如下所述在表達(dá)人CD20力口CD16的轉(zhuǎn)基因小鼠(hCD20+/hCD16+Tg小鼠)中測試。"人效應(yīng)纟田月包"指表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白纟田月包。優(yōu)選的是，該細(xì)胞至少表達(dá)FcYRHI并行使ADCC效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單個核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞可以從其天然來源分離，例如血液。"Fc受體"或"FcR"描述結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列人FcR。此外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體的FcR(y受體)，包括FcyRI、FcyRII和FcyRHI亞類的受體，包括這些受體的等位變體和可變剪接形式。FcyRII受體包括FcyRIIA("活化受體")和FcyRIIB("抑制受體")，它們具有相似的氨基S臾序列，區(qū)別主要在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中?；罨荏wFcyRIlA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受體FqRIIB在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中包含免疫受體基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見綜述Dagron,Jwm/.Aev./mmwwo/.15:203-234(1997))。FcR的綜述參見RavetchandKinet,Jmw.Wev.7mmwwo/.9:457-492(1991);Capel&a/.,Immunomethods4:25-34(1994);deHaasefa/.,J.丄a6.C7/w.她t/.126:330-41(1995)。術(shù)語"FcR"在本文中涵蓋其它FcR,包括那些未來將會鑒定的。該術(shù)語還包括新生兒受體，F(xiàn)cRn，它負(fù)責(zé)將母體IgG轉(zhuǎn)移給胎兒(Guyere/a/.，/附mw"o/.117:587(1976)和Kimefa/.,,/附m冊o/.24:249(1994))并調(diào)節(jié)免疫球蛋白的動態(tài)平衡。WO00/42072(Presta)記載了對FcR的結(jié)合提高或降低的抗體變體。在此明確收入該專利申請的內(nèi)容作為參考。還可參閱Shieldsetal.，J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。關(guān)于對FcRn的結(jié)合親和力，在一個實施方案中，抗體的EC50或表觀Kd(在pH6.0)是<=100nM,更優(yōu)選<=10nM。至于對FcyRIII(F158;即低親和力同種型)提高的結(jié)合親和力，在一個實施方案中，EC50或表觀Kd<=10nM,而對于FcyRin(V158;高親和力)，EC50或表觀Kd<=3nM。測量對FcRn的結(jié)合的方法是已知的(參閱例如Ghetie1997,Hinton2004)以及下文所述?？蓽y定人FcRn高親和力結(jié)合多肽與人FcRn的體內(nèi)結(jié)合和血清半衰期，例如在表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠或經(jīng)轉(zhuǎn)染人細(xì)胞系中，或者在施用了Fc變體多肽的靈長類動物中。在某些實施方案中，本發(fā)明的人源化2H7抗體還包含IgGFc中的氨基酸更改并展示出對人FcRn提高的結(jié)合親和力，比具有野生型IgGFc的抗體高至少60倍，至少70倍，至少80倍，更優(yōu)選至少100倍，優(yōu)選至少125倍，甚至更優(yōu)選至少150倍至約170倍。"補體依賴性細(xì)胞毒性"或"CDC"指存在補體時對靶細(xì)胞的溶解。經(jīng)典補體途徑的激活是由補體系統(tǒng)第一組分(Clq)結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原所結(jié)合的抗體(適宜亞類的)起始的。為了評估補體激活，可進(jìn)行CDC測定法，例如》口Gazzano-Santoroef/mmwwo/.202:163(1996)中戶斤i己載的。具有更改的Fc區(qū)氨基酸序列及提高或降低的Clq結(jié)合能力的多肽變體記載于美國專利第6,194,551Bl和WO99/51642中。在此明確收入那些專利出版物的內(nèi)容作為參考。還可參閱Idusogieetal.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)?？v觀本說明書和權(quán)利要求書，除非另有說明，免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)的殘基編號方式是依照Kabatea/,,。/Pr她/m17m附w"o/。g/ca//"femst,第5版,PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD(1991)的EU索引的編號方式，在此明確收入作為參考。"依照Kabat的EU索引"指人IgGlEU抗體的殘基編號方式。V區(qū)的殘基依照Kabat編號方式編號，除非明確指明順序或其它編號系統(tǒng)。CD20抗體的例子包括"C2B8"，現(xiàn)在稱作"rituximab"("RITUXAN")(美國專利5,736,137);釔[90]標(biāo)記的2B8鼠抗體，稱作"Y2B8"或"IbritumomabTiuxetan，，(ZEVALIN),可從IDECPharmaceuticals公司購買(美國專利5,736,137;2B8于1993年6月22日保藏于ATCC，編號HB11388);鼠IgG2a"B1",也稱作"Tositumomab"，任選用1311標(biāo)記以產(chǎn)生"1311-81"或"碘131tositumomab，，抗體(BEXXARtm，可從GlaxoSmithKline購買，還可參見美國專利5,595,721);鼠單克隆抗體"1F5"(Pressetal.,Blood,69(2):584-591(1987))及其變體，包括"框架修補"或人源化1F5(WO2003/002607,Leung,S.;ATCC保藏物HB-96450);鼠2H7和嵌合2H7抗體(美國專利5,677，180);人源化2H7(WO2004/056312(Lowmanetal.)及下文所列)；HUMAX-CD20完全人的^t體(Genmab，丹麥；參見例^口GlennieandvandeWinkel,DrugDiscoveryToday8:503-510(2003);Craggetal.，Blood101:1045-1052(2003));WO04/035607(Teeling等人)中所列的人單克隆抗體；US2004/0093621(Shitaraetal.)中所述Fc區(qū)結(jié)合有復(fù)雜N-糖苷連接的糖鏈的抗體；諸如AME系列抗體的CD20結(jié)合分子，例如WO2004/103404中所列AME-133tm抗體(Watkinsetal.，AppliedMolecularEvolution);A20抗體或其變體，諸如嵌合的或人源化的A20抗體(分別是cA20,IMMU-106a.k.a.hA20)(US2003/0219433，US2005/0025764;Immunomedics);及單克隆抗體L27、G28-2、93-lB3、B-C1或而-B2，可從國際白細(xì)胞分類研究組(InternationalLeukocyteTypingWorkshop)獲得(Valentine等人，《LeukocyteTypingIII》，McMichael編，p.440,OxfordUniversityPress,1987)。本文中優(yōu)選的CD20抗體是人源化的、嵌合的、或人的CD20抗體，更優(yōu)選人源化2H7抗體、rituximab、嵌合的或人源化的A20抗體(Immunomedics)、和HUMAX-CD20人CD20抗體(Genmab)。在用于本文時，"B細(xì)胞消減"指藥物或抗體治療后，與治療前的水平相比，動物或人體中B細(xì)胞水平降低。B細(xì)胞水平可使用眾所周知的測定法來測量，諸如通過獲得全血細(xì)胞計數(shù)、通過對已知B細(xì)胞標(biāo)志進(jìn)行染色的FACS分析、及通過諸如實驗性實施例中描述的方法。B細(xì)胞消減可以是部分的完全的。在一個實施方案中，表達(dá)CD20的B細(xì)胞的消減是至少25。/。。在接受B細(xì)胞消減劑的患者中，B細(xì)胞消減的持續(xù)時間通常是藥物在患者體內(nèi)的循環(huán)時間及B細(xì)胞恢復(fù)的時間。"月中瘤壞死因子a(TNFa)"指包含如Pennicaetal"Nature312:721(1984)或Aggarwaletal.,JBC260:2345(1985)中所述氨基酸序列的人TNFa分子。"TNFa抑制劑"在本文中是一定程度抑制TNFa的生物學(xué)功能的物質(zhì)，通常通過結(jié)合TNFa并中和其活性。本文中具體考慮的TNP抑制劑的例子是Etanercept(依那西普，ENBREL)、Infliximab(英夫利昔單抗，REMICADE)和Adalimumab(阿達(dá)木單抗，HUMIRATM)。表述"對TNFa抑制劑響應(yīng)不當(dāng)"指因為毒性和/或功效不足而對先前或當(dāng)前的TNFa抑制劑治療響應(yīng)不當(dāng)。不當(dāng)響應(yīng)可由對治療所討"i侖疾病熟悉的臨床醫(yī)師來評估。發(fā)生"功效不足"的哺乳動物在先前或當(dāng)前的TNFa抑制劑治療后病情繼續(xù)保持活躍狀態(tài)。例如，患者可能在用TNFa抑制劑治療3個月后仍具有活躍的疾病活動。術(shù)語"BAFF，、"BAFF多肽"、"TALL-l"或"TALL-1多肽"、"BLys"、"THANK"在用于本文時涵蓋"天然序列BAFF多肽"和"BAFF變體"。"BAFF，是給予下文所示任一氨基酸序列所編碼的那些多肽人BAFF序列(SEQIDNO:46)1mddstereqsrltsclkkreemkJkecvsilprkespsvrsskdgkl〗aatlllallscc61Uvvsfyqvaalqgdlaslraelqghhaeklpagagapkagleeapavtaglkifeppap121gegnssqnsTnkravqgpeetvtqdclqliadsetptiqkgsytfvpwllsfkrgsalee181icenkilvketgyffiygqvlytdktyamghliqrkicvhvfgdelsivtifrciqnmpetl241pnnscysagiakleegdelqlaiprenaqisldgdvtffgalkll(還可參閱US2005/0095243Al中圖3的序列)及其同源物和片段和變體的名稱，所述同源物和片段和變體具有天然序列BAFF的生物學(xué)活性。BAFF的生物學(xué)活性可選自促進(jìn)B細(xì)胞存活，促進(jìn)B細(xì)胞成熟和結(jié)合BR3。術(shù)語"BAFF，包括下列文獻(xiàn)中所記載的那些多肽Shuetal"J.LeukocyteBiol.65:680(1999);GenBank登記號AF136293;WO98/18921,公開于1998年5月7日；EP869,180,公開于1998年10月7日；WO98/27114，公開于1998年6月25日；WO99/12964,公開于1999年3月18日;WO99/33980，公開于1999年7月8日；Mooreetal"Science285:260-263(1999);Schneideretal.,J.Exp.Med.189:1747-1756(1999);Mukhopadhyayetal"J.Biol.Chem.274:15978-15981(1999)。術(shù)語"BAFF拮抗劑，，在用于本文時以最廣義使用，包括(l)結(jié)合天然序列BAFF多肽或結(jié)合天然序列BR3多肽以部分或完全阻斷BR3與BAFF多肽相互作用，及(2)部分或完全阻斷、抑制或中和天然序列BAFF信號傳導(dǎo)的任何分子。天然序列BAFF多肽信號傳導(dǎo)促進(jìn)B細(xì)胞存活和B細(xì)胞成熟等。BAFF信號傳導(dǎo)的抑制、阻斷或中和導(dǎo)致B細(xì)胞數(shù)目減少等。依照本發(fā)明的BAFF拮抗劑將在體外或在體內(nèi)部分或完全阻斷、抑制或中和BAFF多肽的一種或多種生物學(xué)活性。在一個實施方案中，生物學(xué)活性BAFF在體外或在體內(nèi)加強以下任一事件或其組合B細(xì)胞存活提高，IgG和/或IgM水平提高，漿細(xì)胞數(shù)目增力口，及脾B細(xì)月包中NF-Kb2/100加工成p52NF-Kb(例如Batten,M.etal"(2000)J.Exp.Med.192:1453-1465;Mooreetal"(1999)Science285:260-263;Kayagakietal.，(2002)10:515-524)。術(shù)語"BR3"、"BR3多肽"或"BR3受體"在用于本文時涵蓋"天然序列BR3多肽"和"BR3變體"(在本文中對其有進(jìn)一步限定)。"BR3"是給予包含如下任一氨基酸序列的多肽及其同源物的名稱。(a)人BR3序列(SEQIDNO:47)1MRRGPRSIjRGRDAPAPTPCVPAECFDliVRHCVACGLIjRTprpkpagasspaprtalqpq61ESVGAGAGEAALPLPGIiFGAPALLGLALVLALVLVGLVSWRRRQRRLRGASSAEAPDGD121KDAPEPIiDKVIILSPGISDATAPAWPPPGEDPGTTPPGHSVPVPATEUGSTELVTTKTAG181PEQQ(b)可變的人BR3序列(SEQIDNO:48)1MRRGPRSIjRGRDAPAPTPCVPAECFDLiVRHCVACGIjIjRTPRPKPAGAASSPAPRT虹QP61QESVGAGAGEAALPLPGLLFGAPALLGLALVLALVLVGLVSWRRRQRRLRGASSAEAPDG121DKDAPEPLDKviilspgisdATAPAWPPPGEDPGTTPPGHSVPVPATELGSTELVTTKTA181GPEQQ在有些實施方案中，依照本發(fā)明的BAFF拮抗劑包括抗BAFF抗體、BAFF結(jié)合多肽(包括免疫粘附素和肽)、及結(jié)合BAFF的小分子。BAFF拮抗劑包括WO02/02641中所記載的BAFF結(jié)合抗體(例如包含表1中SEQIDNO.1-46、321-329、834-872、1563-1595、1881-1905任何氨基酸序列的抗體)。在另一實施方案中，免疫粘附素包含BAFF受體的BAFF結(jié)合區(qū)(例如BR3、BCMA或TACI的胞外結(jié)構(gòu)域)。在又一實施方案中，所述免疫粘附素是BR3-Fc。結(jié)合BAFF的Fc蛋白質(zhì)的其它例子可參閱WO02/66516、WO00/40716、WO01/87979、WO03/024991、WO02/16412、WO02/38766、WO02/092620、WO01/12812。制備BAFF拮抗劑的方法加載于US2005/0095243Al,同上和US2005/0163775。"分離的"抗體指已經(jīng)鑒定且與/由其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的抗體。其天然環(huán)境的污染性成分指會干擾該抗體的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的溶質(zhì)。在優(yōu)選的實施方案中，將抗體純化至(1)根據(jù)Lowry法的測定，抗體重量超過95%,最優(yōu)選重量超過99%，(2)足以通過使用轉(zhuǎn)杯式測序儀獲得至少15個殘基的N-末端或內(nèi)部氨基酸序列的程度，或(3)根據(jù)使用考馬斯藍(lán)或優(yōu)選銀染色的還原性或非還原性條件下的SDS-PAGE，達(dá)到同質(zhì)。既然抗體天然環(huán)境的至少一種成分不會存在，那么分離的抗體包括重組細(xì)胞內(nèi)的原位抗體。然而，分離的抗體通常將通過至少一個純化步驟來制備。"分離的"核酸分子指已經(jīng)鑒定且與抗體核酸的天然來源中通常與之關(guān)聯(lián)的至少一種污染性核酸分子分開的核酸分子。分離的核酸分子不同于在自然界中發(fā)現(xiàn)它時的形式或背景。分離的核酸分子因此與存在于天然細(xì)胞中時的核酸分子有區(qū)別。然而，分離的核酸分子包括通常表達(dá)該抗體的細(xì)胞中所包含的核酸分子，例如當(dāng)所述核酸分子在所述細(xì)胞中的染色體定位不同于它在天然細(xì)胞中的染色體定位時。表述"控制序列"指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、和核糖體結(jié)合位點。已知真核細(xì)胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、和增強子。若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是"可操作連才妻"的。例i口，若前序歹寸(presequence)或分)必前導(dǎo)(secretoryleader)的DNA表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)(preprotein),則它與多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點的位置促進(jìn)翻譯，則它與編碼序列可操作連接。通常，"可操作連接，，意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強子不必相鄰。連接可以通過在方便的限制性位點處的連接反應(yīng)來實現(xiàn)。如果沒有此類位點，那么依照常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。"載體"包括穿梭載體和表達(dá)載體。典型的是，質(zhì)粒構(gòu)建物還將包含復(fù)制起點(例如ColEl復(fù)制起點)和選擇標(biāo)志(例如氨千青霉素或四環(huán)素抗性)，分別用于質(zhì)粒在細(xì)菌中的復(fù)制和選擇。"表達(dá)載體"指包含在細(xì)菌或真核細(xì)胞中表達(dá)抗體包括本發(fā)明的抗體片段所必需的控制序列或調(diào)控元件的載體。下文公開了合適的載體。生成人源化CD20結(jié)合抗體諸如本發(fā)明的人源化2H7抗體的細(xì)胞將包括其中已導(dǎo)入了編碼所述抗體的核酸的細(xì)菌和真核宿主細(xì)胞。下文公開了合適的宿主細(xì)胞。術(shù)語"標(biāo)記物"在用于本文時指與抗體直接或間接偶聯(lián)的可檢測化合物或組合物。標(biāo)記物自身可以是通過自身就可檢測的(例如放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。本發(fā)明的組合物和方法本發(fā)明提供了人源化2H7抗體，它們是2H7.v16的變體。在一個具體的實施方案中，所述變體是hu2H7.v511。在全長抗體中，本發(fā)明的人源化CD20結(jié)合抗體將包含相連的人源化的V結(jié)構(gòu)域和人免疫球蛋白的C結(jié)構(gòu)域。在一個優(yōu)選的實施方案中，H鏈C區(qū)來自人IgG,優(yōu)選IgGl或IgG3。L鏈C結(jié)構(gòu)域優(yōu)選來自人K鏈。為了本文的目的，"人源化2H7"指如下完整抗體或抗體片段，其包含輕鏈可變區(qū)(V。序列KVEIKR(SEQIDNO:2);和重鏈可變區(qū)(VH)序列RVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(SEQIDNO:8)。若人源化2H7抗體是完整抗體，優(yōu)選的是，它包含v16輕鏈氨基酸序列:KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNSPVTKSFNRGEC(SEQIDNO:13);和重鏈氨基酸序列SLSLSPGK(SEQIDNO:14)。前述人源化2H7mAb的一種變體是2H7.v31，它具有與上文SEQIDNO:13相同的L鏈序列及H鏈氨基酸序列SLSLSPGK(SEQIDNO:15)。另一種變體是2H7.v138,它具有SEQIDNO.26的重鏈氨基酸序列。前述人源化2H7抗體的另一種變體是這樣一種抗體，它包含2H7.v511的SEQIDNO.25的VL和SEQIDNO.33的VH(見表2)。hu2H7.v511是全長IgGl。在一個實施方案中，該抗體包含2H7.v511輕鏈(SEQIDNO.26):PVTKSFNRGEC;和2H7.v511重寺連(SEQIDNO.34):LSLSPGK?；趘16的所有其它變體的可變區(qū)將具有v16的氨基S臾序列，除了下文表1所示氨基酸替代的位置。除非另有說明，2H7變體將具有與vl6相同的L鏈。人源化抗體2H7.vl6也稱為rhuMAb2H7、PRO70769或Ocrelizumab。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>表22H7型式VLSEQIDNO.vHSEQIDNO.完整輕鏈SEQIDNO.完整重鏈SEQIDNO.<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>歹戔基纟扁號方式依月褒Kabat"/.,Se《we"cey/附ww"o/。g/c"http://"tereW，第片反，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md,(1991)，#i入以a、b、c、d和e表示，缺口在序列圖中以破折號表示。在包含F(xiàn)c區(qū)的CD20結(jié)合抗體中，F(xiàn)c區(qū)的C-末端賴氨酸(依照EU編號系統(tǒng)的殘基447)可去除，例如，在抗體純化期間或通過重組工程改造編碼抗體多肽的核酸。因此，本發(fā)明的人源化2H7抗體組合物可包含具有K447的抗體、去除了所有K447的抗體、或者具有和不具有K447殘基的抗體的混合物。IgG中的N-糖基化位點位于CH2結(jié)構(gòu)域中的Asn297。本發(fā)明的人源化2H7抗體組合物包括具有Fc區(qū)的任何前述人源化2H7抗體的組合物，其中組合物中大約80-100%(優(yōu)選大約90-99%)的抗體包含缺乏巖藻糖的成熟核心碳水化合物結(jié)構(gòu)，附著于糖蛋白的Fc區(qū)。此類組合物在本文中證實展現(xiàn)出與FcyRIIIA(F158)結(jié)合方面驚人的改善，在與人IgG相互作用方面FcyRfflA(F158)不象FcYRIIIA(V158)那樣有效。在正常的、健康的非洲裔美國人和高加索人中FcyRIIIA(F158)比FcyRIIIA(V158)更常見。參見Lehrnbecheretal"Blood94:4220(1999)。歷史上，在中國倉鼠卯巢細(xì)胞(CHO)，最常用的工業(yè)用宿主之一中生成的抗體包含大約2-6%的抗體是非巖藻糖化的。然而，YB2/0和Lecl3可生成具有78-98%非巖藻糖化類型的抗體。Shinkawa"a/.,J.所o.C7zem.278(5):3466-347(2003)!艮道了YB2/0和Lecl3細(xì)胞中所生成的具有較低FUT8活性的抗體在體外顯示出顯著升高的ADCC活性。巖藻糖含量降低的抗體的生成還記載于例如Li"a/.,(GlycoFi)"OptimizationofhumanizedIgGsinglycoengineeredPichiapastoris",inNatureBiologyonlinepublication22Jan.2006;NiwaR.a/.,Cawcer64(6):2127-2133(2004);US2003/0157108(Presta);US6,602,684和US2003/0175884(GlycartBiotechnology);US2004/0093621,US2004/0110704,US2004/0132140(都是KyowaHakkoKogyo的)。雙特異性人源化2H7抗體涵蓋這樣的抗體，其中抗體的一條臂至少具有本發(fā)明人源化2H7抗體H鏈和/或L鏈的抗原結(jié)合區(qū)，而另一條臂具有針對第二抗原的V區(qū)結(jié)合特異性。在具體的實施方案中，所述第二抗原選自CD3、CD64、CD32A、CD16、NKG2D或其它NK活4匕配體。在某些實施方案中，本發(fā)明的人源化2H7抗體進(jìn)一步包含IgGFc中的氨基酸更改，并且展現(xiàn)出較之具有野生型IgGFc的抗體提高的對人FcRn的結(jié)合親和力，纟是高至少60倍、至少70倍、至少80倍，更優(yōu)選至少100倍，優(yōu)選至少125倍，甚至更優(yōu)選至少150倍至大約170倍。抗體生產(chǎn)單克隆抗體可以使用最初由Kohler"Ato^e256:495(1975)記載的雜交瘤方法來生成，或者可以通過重組DNA方法(美國專利No.4,816,567)來生成。在雜交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它適宜的宿主動物，諸如倉鼠，以引發(fā)生成或能夠生成如下抗體的淋巴細(xì)胞，所述抗體將特異性結(jié)合用于免疫的蛋白質(zhì)?；蛘撸梢栽隗w外免疫淋巴細(xì)胞。免疫后，分離淋巴細(xì)胞，然后使用合適的融合劑諸如聚乙二醇與骨髓瘤細(xì)胞系融合，以形成雜交瘤細(xì)胞(Goding，Mowoc/cwa/Jw"Z)<%/Ze5v^PnVzc^/esiV"c"ce,pp.59-103，AcademicPress,1986)。將如此制備的雜交瘤細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中接種和培養(yǎng)，所述培養(yǎng)基優(yōu)選含有抑制未融合的親本骨髓瘤細(xì)胞(也稱為融合配偶體)生長或存活的一種或多種物質(zhì)。例如，若親本骨髓瘤細(xì)胞缺乏次黃嘌呤鳥噤呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT或HPRT),則用于雜交瘤的選擇性培養(yǎng)基典型的將含有次黃。票呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培養(yǎng)基)，這些物質(zhì)阻止HGPRT缺陷細(xì)胞生長。優(yōu)選的融合配偶體骨髓瘤細(xì)胞是那些高效融合、支持所選擇的抗體生成細(xì)胞穩(wěn)定的高水平的生成抗體、且對針對未融合的親本細(xì)胞進(jìn)行選擇的選擇性培養(yǎng)基敏感的骨髓瘤細(xì)胞。優(yōu)選的骨髓瘤細(xì)胞系是鼠骨髓瘤系，諸如那些可從索爾克研究所細(xì)胞分配中心(SalkInstituteCellDistributionCenter,SanDiego,California,USA)獲得的MOPC-21和MPC-ll小鼠腫瘤所衍生的及可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,Rockville，Maryland,USA)獲得的SP-2和衍生物例如X63-Ag8-653。人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細(xì)胞系也有用于生成人單克隆抗體的記載(Kozbor，/mm麗o/.133:3001(1984);Brodeura/.,Mwoc/cwa/J油7o辦/Vo(iMc/7'朋Tfec/w—esflwdjp—'cfl/iom1,pp.51-63,MarcelDekker,Inc.,NewYork,1987)?？蓪﹄s交瘤細(xì)胞正在其中生長的培養(yǎng)基測定針對抗原的單克隆抗體的生成。優(yōu)選的是，通過免疫沉淀或通過體外結(jié)合測定法，諸如放射性免疫測定法(RIA)或酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA),測定由雜交瘤細(xì)胞生成的單克隆抗體的結(jié)合特異性。單克隆4元體的結(jié)合親和力可通過例如MunsonWJ""/.S/oc/zew.107:220(1980)中記載的Scatchard分析來測定。一旦鑒定出生成具有期望特異性、親和力和/或活性的抗體的雜交瘤細(xì)胞，所述克隆就可通過有限稀釋流程進(jìn)行亞克隆，并通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行培養(yǎng)(Goding,M9wc/o腦"油,6o(i/w尸rz'"一/es1awJ尸raWce,pp.59-103，AcademicPress,1986)。適于這一目的的培養(yǎng)基包括例如D-MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基。另外，雜交瘤細(xì)胞可在動物中作為腹水瘤進(jìn)行體內(nèi)培養(yǎng)，例如通過將細(xì)胞腹膜內(nèi)注射到小鼠中。可通過常規(guī)抗體純化流程，諸如例如親和層析(例如使用蛋白A或蛋白G-Sepharose)、離子交換層析、羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析等，將由亞克隆分泌的單克隆抗體與培養(yǎng)基、腹水或血清適當(dāng)分開。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)流程分離和測序(例如通過使用能夠特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)。雜交瘤細(xì)胞是此類DNA的優(yōu)選來源。一旦分離，就可將DNA置于表達(dá)載體中，然后將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到不另外生成抗體蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞中，諸如大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞，以在重組宿主細(xì)胞中獲得單克隆抗體的合成。關(guān)于編碼抗體的DNA在細(xì)菌中的重組表達(dá)的綜述包4舌Skerra&a/.,Cm/t.C^/m'ow/mmwwo/.5:256-262(1993)及PlUckthun，/mm麗o/.130:151-188(1992)。在另一個實施方案中，可從使用McCafferty"a/.,A^w348:552-554(1990)中記載的技術(shù)構(gòu)建的噬菌體抗體庫中分離單克隆抗體或抗體片段。Clacksonea/.,7Vaft^e352:624-628(1991)^Marks"a/.,Mo/,fi/o/.222:581-597(1991)分別記載了使用噬菌體文庫進(jìn)行的鼠和人抗體的分離。后續(xù)出版物記載了通過鏈改組生成高親和力(nM范圍)的人抗體(Marks"a/.,&'o/rec/z"o/ogv10:779-783(l"2)),以及組合感染和體內(nèi)重組作為構(gòu)建非常大的謹(jǐn)菌體文庫的策略(Waterhouseda/.，21:2265-2266(1993))。如此，這些技術(shù)是用于分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可^^^4義方法?？梢孕揎椌幋a抗體的DNA以生成嵌合或融合抗體多肽，例如通過用人重^4和輕^i恒定區(qū)(CH和CO序列替代同源鼠序歹'K美國專利No.4,816,567;Morrison"a/.,尸roc.A^/.爿c"c.81:6851(1984))，或通過將免疫球蛋白編碼序列與非免疫球蛋白多肽(異源多肽)的整個或部分編碼序列融合?？梢杂梅敲庖咔虻鞍锥嚯男蛄刑娲贵w的恒定區(qū)，或者用它們替代抗體的一個抗原結(jié)合位點的可變區(qū)，以產(chǎn)生嵌合二價抗體，它包含對一種抗原具有特異性的一個抗原結(jié)合位點和對不同抗原具有特異性的另一個抗原結(jié)合位點。乂源化拔謬本領(lǐng)域已經(jīng)記載了用于人源化非人抗體的方法。優(yōu)選的是，人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常稱作"輸入"殘基，它們典型的取自"輸入"可變區(qū)。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法進(jìn)行(Jonesaa/.,7Va&re321:522-525(1986);Reichmanna/.,TVaZwre332:323-327(1988》Verhoeyen&a/.,5*c/ewce239:1534-1536(1988))，通過用高變區(qū)序列替代相應(yīng)的人抗體序列。因此，此類"人源化，，抗體是嵌合抗體(美國專利No.4,816,567),其中基本上少于整個人可變區(qū)用來自非人物種的相應(yīng)序列替代。在實踐中，人源化抗體典型的是這樣的人抗體，其中一些高變區(qū)殘基和可能的一些FR殘基用來自嚙齒類抗體中類似位點的殘基替代。將用于構(gòu)建人源化抗體的人可變區(qū)的選擇，包括輕鏈和重鏈二者，在抗體意圖用于人類治療性用途時對于降低抗原性和HAMA(人抗小鼠抗體)應(yīng)答非常重要。依照所謂的"最適"(best-fit)方法，用嚙齒類抗體的可變區(qū)序列對已知的人可變區(qū)序列的整個文庫進(jìn)行篩選。鑒定出與嚙齒類最接近的人可變區(qū)序列并接受其中的人框架區(qū)(FR)用于人源化抗體(SimsWa/.，/扁,/.151:2296(1993);Chothia"a/.,JMo/.編.196:901(1987))。另一種區(qū)。同一才匡架可用于l欠種不同的人源4匕^t體(Carter"a/.,/Voc.iV"f/.Jcad.5W.89:4285(1992);Presta"a/.,//mwimo/.151:2623(1993))。更為重要的是，抗體在人源化后保持對抗原的高結(jié)合親和力及其它有利的生物學(xué)特性。為了實現(xiàn)這一目標(biāo)，依照一種優(yōu)選的方法，通過使用親本和人源化序列的三維模型分析親本序列和各種概念性人源化產(chǎn)物的方法來制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型通常是可得到的，且為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟悉?？傻玫綀D解和顯示所選擇的候選免疫球蛋白序列的可能的三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機程序。檢查這些顯示圖像容許分析殘基在候選免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。這樣，可從受體和輸入序列中選擇出FR殘基并組合，從而實現(xiàn)期望的抗體特征，諸如對靶抗原的親和力提高。一般而言，高變區(qū)殘基直接且最實質(zhì)性的涉及對抗原結(jié)合的影響。人源化抗體可以是抗體片段，諸如Fab,它任選與一種或多種細(xì)胞毒劑偶l關(guān)以生成免疫偶4關(guān)物?；蛘?，人源化抗體可以是全長抗體，諸如全長IgGl抗體。乂戎謬/。^,謬j^才法夢作為人源化的替代方法，可生成人抗體。例如，現(xiàn)在有可能生成這樣的轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠)，它們在缺乏內(nèi)源性免疫球蛋白生成的情況下能夠在免疫時生成人抗體完整全集。例如，已經(jīng)記載了嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(Jh)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源性抗體生成的完全抑制。將大量人種系免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)移到此類種系突變小鼠中將導(dǎo)致在抗原攻擊時生成人^t體。參見侈'ji口JakobovitsW尸rac.A^/1/.爿cadSc/.OS^90:2551(1993);Jakobovits&a/.，TVa/we362:255-258(1993);Bmggemanna/"腸r/m附腦o.7:33(1993);美國專利No.5,545,806,5,569,825，5,591,669(都是GenPharm的)；5,545,807;WO97/17852。或者，噬菌體展示技術(shù)(McCaffertyWa/.，7W^w348:552-553(1990))可用于在體外從來自未免疫供體的免疫球蛋白可變區(qū)(V)基因全集生成人抗體和抗體片段。依照這種技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域基因以符合讀碼框的方式克隆到絲狀噬菌體諸如M13或fd的主要或次要外殼蛋白基因中，并在噬菌體顆粒表面上展示為功能性抗體片段。因為絲狀噬菌體顆粒包含噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，以抗體的功能特性為基礎(chǔ)進(jìn)行的選擇也導(dǎo)致編碼展示那些特性的抗體的基因得到選擇。如此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特性。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行，綜述參見例如Johnson,KevinS.andChiswell,DavidJ"Cwre"/Qp/m'朋/"5^w"wra/3:564-571(1993)。V基因區(qū),殳的數(shù)種來源可用于噬菌體展示。Clackson"a/.,Atow"352:624-628(1991)從衍生自經(jīng)免疫小鼠脾的小型V基因隨機組合文庫中分離出大量不同的抗d惡唑酮抗體。可基本上遵循Marks乂7kfo/.祝o/.222:581-597(1991)或Griffith"a/.五AffiOJ12:725-734(1993)所述技術(shù)，由未免疫人供體構(gòu)建V基因全集和分離針對大量不同抗原(包括自身抗原)的抗體。還可參見美國專利No.5,565,332和5，573，905。如上所述，還可通過體外激活B細(xì)胞來生成人抗體(參見美國專利No.5,567,610和5,229,275)。在某些情況中，使用抗體片段有優(yōu)勢，而不是完整抗體。片段的較小尺寸容許快速清除，而且可導(dǎo)致更易于接近實體瘤。已經(jīng)開發(fā)了用于生成抗體片段的多種技術(shù)。傳統(tǒng)上，通過蛋白水解消化完整抗體來書亍生這些片4殳(參見例如Morimotoefa/.，Jo^7a/o/5/oc/zem/ca/5/6//z>^/ca/A/e^zocis124:107-117(1992》Brennanefa/"5b/ewce229:81(1985))。然而，現(xiàn)在可直接由重組宿主細(xì)胞生成這些片^:。Fab、Fv和scFv抗體片段都可在大腸桿菌中表達(dá)及由大腸桿菌分泌，如此容許容易的生成大量的這些片段?？蓮纳衔挠懻摰氖删w抗體庫中分離抗體片段?；蛘?，可直接從大腸桿菌回收Fab'-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)以形成F(ab')2片段(Carter&a/.,所o/rec/z"o/ogv10:163-167(1992))。依照另一種方法，可直接從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物分離F(ab')2片段。包含補救受體結(jié)合表位殘基、具有延長的體內(nèi)半衰期的Fab和F(ab')2片段記載于美國專利No.5,869,046。用于生成抗體片段的其它技術(shù)對于熟練從業(yè)人員將是顯而易見的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。參見WO93/16185;美國專利No.5,571,894;及美國專利No.5,587,458。Fv和sFv是具有完整結(jié)合位點、缺乏恒定區(qū)的唯一類型；如此，它們適于在體內(nèi)使用時降低非特異性結(jié)合?？蓸?gòu)建sFv融合蛋白以生成效應(yīng)器蛋白質(zhì)在sFv的氨基或羧基末端的融合。參見^""^4五wg/ween'wg,5o;re6aec^:編,swpra?？贵w片l爻還可以是"線性抗體"，例如如美國專利No.5，641,870中所記載的。此類線性抗體片段可以是單特異性的或雙特異性的。雙特異性抗體指對至少兩種不同表位具有結(jié)合特異性的抗體。例示性的雙特異性抗體可結(jié)合CD20蛋白質(zhì)的兩種不同表位。其它此類抗體可將CD20結(jié)合位點與另一種蛋白質(zhì)的結(jié)合位點組合在一起?；蛘?，可將抗CD20臂與結(jié)合白細(xì)胞上觸發(fā)分子諸如T細(xì)胞受體分子(例如CD3)、或IgG的Fc受體(FcyR)諸如FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)、或NKG2D或其它NK細(xì)胞活化配體的臂組合在一起，使得細(xì)胞防御機制聚焦和定位于CD20表達(dá)細(xì)胞。雙特異性抗體還可用于將細(xì)胞毒劑定位于表達(dá)CD20的細(xì)胞。這些抗體擁有CD20結(jié)合臂和結(jié)合細(xì)胞毒劑(例如肥皂草毒蛋白、抗干擾素-a、長春花生物堿類、蓖麻毒蛋白A鏈、曱氨蝶呤或放射性同位素半抗原)的臂?？蓪㈦p特異性抗體制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab')2雙特異性抗體)。WO96/16673記載了一種雙特異性抗ErbB2/抗FcyRIII抗體，美國專利No.5,837,234披露了一種雙特異性抗ErbB2/抗FcyRI抗體。WO98/02463顯示了一種雙特異性抗ErbB2/Fca抗體。美國專利No.5,821,337教4受了一種雙特異性抗ErbB2/CD3抗體。用于構(gòu)建雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。全長雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)基于兩對免疫球蛋白重鏈-輕鏈的共表達(dá)，其中兩種鏈具有不同的特異性(Millstein"a/.,A^we305:537-539(1983))。由于免疫^求蛋白重《連和輕《連的隨4幾分配，這些雜交瘤(四源雜交瘤(quadroma))生成IO種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種具有正確的雙特異性結(jié)構(gòu)。通常通過親和層析步驟進(jìn)行的正確分子的純化相當(dāng)麻煩且產(chǎn)物產(chǎn)量低。類似的流程纟皮露于WO93/08829及Traunecker&a/"五MB(9J10:3655-3659(1991)。依照一種不同的方法，將具有期望結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點)的抗體可變區(qū)與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。優(yōu)選的是，與包含至少部分鉸鏈、Ch2和Ch3區(qū)的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)進(jìn)行融合。優(yōu)選在至少一種融合物中存在包含輕鏈結(jié)合所必需的位點的第一重鏈恒定區(qū)(CHl)。將編碼免疫球蛋白重鏈融合物和，在需要時，免疫球蛋白輕鏈的DNA插入分開的表達(dá)載體，并共轉(zhuǎn)染到合適的宿主細(xì)胞中。在用于構(gòu)建的三種多肽鏈比例不等時提供期望雙特異性抗體的最佳產(chǎn)量的實施方案中，這為調(diào)整三種多肽片段的相互比例提供了更大的靈活性。然而，在至少兩種多肽鏈以相同比例表達(dá)導(dǎo)致高產(chǎn)量時或在該比例對期望鏈組合的產(chǎn)量沒有顯著影響時，有可能將兩種或所有三種多肽鏈的編碼序列插入單一表達(dá)載體。在該方法的一個優(yōu)選實施方案中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結(jié)合特異性的雜合免疫球蛋白重鏈，和另一個臂上的雜合免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二結(jié)合特異性)構(gòu)成。由于免疫球蛋白輕鏈僅在半個雙特異性分子中的存在提供了便利的分離途徑，因此發(fā)現(xiàn)這種不對稱結(jié)構(gòu)便于將期望的雙特異性復(fù)合物與不想要的免疫球蛋白鏈組合分開。該方法披露于WO94/04690。關(guān)于生成雙特異性抗體的進(jìn)一步詳情參見例如Sureshda/.,iWe^2otfc五"zymo/ogy121:210(1986)。依照美國專利No.5,731,168中記載的另一種方法，可改造一對抗體分子間的界面，以將從重組細(xì)胞培養(yǎng)物回收的異二聚體的百分比最大化。優(yōu)選的界面包含至少部分Ch3結(jié)構(gòu)域。在該方法中，將第一抗體分子界面的一個或多個小氨基酸側(cè)鏈用較大側(cè)鏈(例如酪氨酸或色氨酸)替換。通過將大氨基酸側(cè)鏈用較小氨基酸側(cè)鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)替換，在第二抗體分子的界面上產(chǎn)生與大側(cè)鏈相同或相似大小的補償性"空腔"。這提供了較之其它不想要的終產(chǎn)物諸如同二聚體提高異二聚體產(chǎn)量的機制。雙特異性抗體包括交聯(lián)或"異源偶聯(lián)"抗體。例如，異源偶聯(lián)物中的一種抗體可與親合素偶聯(lián)，另一種抗體與生物素偶聯(lián)。例如，此類抗體已經(jīng)建議用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不想要的細(xì)胞(美國專利No.4,676,980)，及用于治療HIV感染(WO91/00360,WO92/200373和EP03089)?？蒦f吏用4壬何便利的交聯(lián)方法來制備異源偶聯(lián)抗體。合適的交聯(lián)劑是本領(lǐng)域眾所周知的，連同許多交聯(lián)技術(shù)一起披露于美國專利No.4,676,980。文獻(xiàn)中還記載了由抗體片段生成雙特異性抗體的技術(shù)。例如，可使用化學(xué)連接來制備雙特異性抗體。Brennan"a/.,5We"ce229:81(1985)記載了通過蛋白水解切割完整抗體以生成F(ab')2片段的流程。將這些片段在存在二硫醇絡(luò)合劑亞砷酸鈉的情況下還原，以穩(wěn)定鄰近的二硫醇并防止分子間二硫鍵的形成。然后將產(chǎn)生的Fab，片段轉(zhuǎn)變?yōu)榱虼趸綍跛狨?TNB)衍生物。然后將Fab'-TNB衍生物之一通過巰基乙胺的還原重新恢復(fù)成Fab'-硫醇，并與等摩爾量的另一種Fab'-TNB衍生物混合，以形成雙特異性抗體。產(chǎn)生的雙特異性抗體可用作酶的選擇性固定化試劑。最新的進(jìn)展便于從大腸桿菌直接回收Fab'-SH片段，這些片段可化學(xué)偶聯(lián)以形成雙特異性抗體。Shalabyaa/.,JExp.Met/.175:217-225(1992)記載了完全人源化的雙特異性抗體F(ab')2分子的生成。由大腸桿菌分開分泌每種特異性抗體能夠結(jié)合過表達(dá)ErbB2受體的細(xì)胞和正常人T細(xì)胞，以及觸發(fā)人細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞針對人乳瘤靶物的溶解活性。還記載了從重組細(xì)胞培養(yǎng)物直接生成和分離雙特異性抗體片段的多種寺支術(shù)。例如，已使用亮氨酸拉鏈生成雙特異性抗體。KostelnyWa/.，J/mm朋o/.M8(5):l547-1553(l"2)。將來自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉鏈肽通過基因融合與兩種不同抗體的Fab'部分連接。抗體同二聚體在4H連區(qū)還原以形成單體，然后重新氧化以形成抗體異二聚體。這種方法也可用于生成抗體同二聚體。Hollinger&a/"Ato/.Jc"d6W.L/SJ90:6444-6448(1993)記載的"雙抗體"技術(shù)提供了構(gòu)建雙特異性抗體片段的替代機制。該片段包含通過接頭相連的Vh和Vl,所述接頭太短使得同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域之間不能配對。因此，迫使一個片段上的Vh和V^結(jié)構(gòu)域與另一個片段上的互補Vl和Vh結(jié)構(gòu)域配對，由此形成兩個抗原結(jié)合位點。還報道了通過使用單鏈Fv(sFv)二聚體構(gòu)建雙特異性抗體片段的另一種策略。參見Gmbera/.,J./mmzmo/.152:5368(1994)。設(shè)想了具有超過兩個效價的抗體。例如，可制備三特異性抗體。Tutt&J./mm畫/.147:60(1991)。多價抗體可以比二價抗體更快的受到表達(dá)該抗體所結(jié)合抗原的細(xì)胞的內(nèi)在化(和/或異化)。本發(fā)明的抗體可以是可容易的通過編碼抗體多肽鏈的核酸的重組表達(dá)而生成的，具有三個或更多抗原結(jié)合位點(例如四價抗體)的多價抗體(IgM類別以外的)。多價抗體可包含二聚化結(jié)構(gòu)域和三個或更多抗原結(jié)合位點。優(yōu)選的二聚化結(jié)構(gòu)域包含(或由其組成)Fc區(qū)或鉸鏈區(qū)。在這種情況中，抗體將包含F(xiàn)c區(qū)及Fc區(qū)氨基末端的三個或更多抗原結(jié)合位點。本文中優(yōu)選的多價抗體包含(或由其組成)三個至約八個，但優(yōu)選四個抗原結(jié)合位點。多價抗體包含至少一條多肽鏈(且優(yōu)選兩條多肽鏈)，其中所述多肽鏈包含兩個或多個可變結(jié)構(gòu)域。例如，多肽鏈可包含VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可變結(jié)構(gòu)域，VD2是第二可變結(jié)構(gòu)域，F(xiàn)c是Fc區(qū)的一條多肽鏈，XI和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽鏈可包含VH-CH1-柔性接頭-VH-CH卜Fc區(qū)鏈；或VH-CH1-VH-CH1-Fc區(qū)鏈。本文中的多價抗體優(yōu)選進(jìn)一步包含至少兩條(且優(yōu)選四條)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽。本文中的多價抗體可包含例如約兩條至約八條輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽。本文設(shè)想的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域多肽包含輕鏈可變結(jié)構(gòu)域，且任選進(jìn)一步包含CL結(jié)構(gòu)域。:#它瘋差虔#/{/,#設(shè)想了本文所述CD20結(jié)合抗體的氨基S吏序列修飾。例如，可能希望改善抗體的結(jié)合親和力和/或其它生物學(xué)特性。通過將適宜的核苷酸變化引入抗CD20抗體核酸或者通過肽合成來制備抗CD20抗體的氨基酸序列變體。此類修飾包括例如抗CD20抗體氨基酸序列內(nèi)的殘基刪除和/或插入和/或替代。只要最終的構(gòu)建物具有期望特性，可進(jìn)行刪除、插入和替代的任意組合以獲得最終的構(gòu)建物。氨基酸變化還可改變抗CD20抗體的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點的數(shù)目或位置?？捎糜阼b定抗CD20抗體中作為優(yōu)選誘變位置的某些殘基或區(qū)域的一種方法稱作"丙氨酸掃描誘變"，如CunninghamandWells,6We"ce244:1081-1085(1989)中所記載的。這里，鑒定了一個殘基或一組輩巴殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷氨酸)，并用中性或帶負(fù)電荷的氨基酸(最優(yōu)選丙氨酸或聚丙氨酸)替換，以影響氨基酸與CD20抗原的相互作用。然后通過在或?qū)μ娲稽c引入更多或其它變體，推敲那些對替代展現(xiàn)出功能敏感性的氨基酸位置。如此，雖然引入氨基酸序列變異的位點是預(yù)先決定的，但是突變本身的性質(zhì)不需要預(yù)先決定。例如，為了分析給定位點處的突變的后果，在靶密碼子或區(qū)域進(jìn)行丙氨酸掃描或隨機誘變，并對所表達(dá)的抗CD20抗體變體篩選期望活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，長度范圍從一個殘基至包含上百個或更多殘基的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N-末端曱硫氨酰殘基的抗CD20抗體或與細(xì)胞毒性多肽融合的抗體?？笴D20抗體分子的其它插入變體包括在抗CD20抗體的N-或C-末端融合酶(例如用于ADEPT)或^是高抗體血清半衰期的多肽。另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗CD20抗體分子中有至少一個氨基酸殘基用不同殘基替換。最感興趣進(jìn)行替代誘變的位點包括高變區(qū)，但也設(shè)想了FR改變。保守替代在下表中顯示在標(biāo)題"優(yōu)選替代"下。如果此類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性的變化，那么可以引入表中稱為"例示替代"的更實質(zhì)性變化，或者如下文中關(guān)于氨基酸種類的進(jìn)一步描述，并篩選產(chǎn)物。氨基酸替代表<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>對抗體生物學(xué)特性的實質(zhì)性修飾通過選擇在保持以下方面的效果上顯著不同的替代來完成(a)替代區(qū)域的多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為折疊片或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點處分子的電荷或疏水性，或(c)側(cè)鏈的體積?；诠餐膫?cè)鏈特性，將天然存在殘基如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石威'I"生的Asn、Gln、His、Lys、Arg;(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro;和(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代將需要用這些類別之一的成員交換另一個類別的。任何不牽涉保持抗CD20抗體正確構(gòu)象的半胱氨酸殘基也可替代，通常用絲氨酸，以改善分子的氧化穩(wěn)定性和防止異常交聯(lián)。相反，可向抗體中添加半胱氨酸鍵以改善其穩(wěn)定性(特別是當(dāng)抗體是抗體片段諸如Fv片段時)。特別優(yōu)選的一類替代變體牽涉替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進(jìn)一步開發(fā)的所得變體相對于產(chǎn)生它們的親本抗體將具有改良的生物學(xué)特性。產(chǎn)生此類替代變體的一種便利方法牽涉使用噬菌體展示的親和力成熟。簡單的說，將數(shù)個高變區(qū)位點(例如6-7個位點)突變，在每個位點產(chǎn)生所有可能的氨基酸替代。如此產(chǎn)生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與每個顆粒內(nèi)包裝的M13基因III產(chǎn)物的融合物。然后如本文所公開的對噬菌體展示的變體篩選其生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點，可進(jìn)行丙氨酸掃描誘變以鑒定對抗原結(jié)合具有重要貢獻(xiàn)的高變區(qū)殘基。或者/另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定抗體和人CD20之間的接觸點可能是有益的。此類接觸殘基及鄰近殘基是依照本文詳述的技術(shù)進(jìn)行替代的候選位點。一旦產(chǎn)生此類變體，就如本文所述對該組變體進(jìn)行篩選，可選擇在一種或多種相關(guān)測定法中具有優(yōu)良特性的抗體用于進(jìn)一步的開發(fā)?？贵w的另一類氨基酸變體改變了抗體的原始糖基化樣式。改變意味著刪除在抗體中找到的一個或多個碳水化合物模塊，和/或添加抗體中不存在的一個或多個糖基化位點。抗體的糖基化典型的或是N-連接的或是O-連接的。N-連接指碳水化合物才莫塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。如此，多肽中這兩種三肽序列任一的存在產(chǎn)生了潛在的糖基化位點。O-連接的糖基化指將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附著于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗體中添加糖基化位點是通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個上述三肽序列而便利的完成的(用于N-連接的糖基化位點)。還可通過向原始抗體的序列中添加或替代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進(jìn)行改變(用于O-連接的糖基化位點)。編碼抗CD20抗體的氨基酸序列變體的核酸分子可通過本領(lǐng)域知道的多種方法制備。這些方法包括但不限于從天然來源分離(在天然存在氨基酸序列變體的情況中)，或者通過對早期制備的變體或非變體型式的抗CD20抗體進(jìn)行寡核香酸介導(dǎo)的(或定點)誘變、PCR誘變和盒式誘變來制備。可能希望在效應(yīng)器功能方面修飾本發(fā)明的抗體，例如增強抗體的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)。這可通過在抗體Fc區(qū)中引入一個或多個氨基酸替代來實現(xiàn)?；蛘?另外，可在Fc區(qū)中引入半胱氨酸殘基，從而容許在該區(qū)中形成鏈間二硫鍵。如此產(chǎn)生的同二聚體抗體可具有改良的內(nèi)在化能力和/或提高的補體介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。參見Caronetal.,J.Exp.Med.176:1191-1195(1992)和Shopes,B.,J.Immunol.148:2918-2922(1992).具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可如WolffWa/.,Ca"ceri^化wc/z53:2560-2565(1993)中所記載的使用異雙功能交聯(lián)劑來制備?；蛘?，抗體可改造成具有雙重Fc區(qū)，由此可具有增強的補體介導(dǎo)的溶解和ADCC能力。參見Stevenson&a/"勘"-C認(rèn)eri>wgDe—3:219-230(1989)。為了延長抗體的血清半衰期，可如例如美國專利No.5,739,277中所記載的將補救受體結(jié)合表位摻入抗體(尤其是抗體片段)。在用于本文時，術(shù)語"補;故受體結(jié)合表位"指IgG分子(例如IgG!、IgG2、IgG3或IgG4)的Fc區(qū)中負(fù)責(zé)延長IgG分子體內(nèi)血清半衰期的表位。^它我謬滲謬本文還設(shè)想了抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)聚合物之一連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。還可將抗體包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)、在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米"交嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)纟皮露于Wem/"gto"kP/2a，acew/C(3/5We"ces,第16版，Osol,A.編,1980。謬遂的炎#可以如實驗性實施例中所述選擇具有某些生物學(xué)特性的抗體。例如4吏用內(nèi)源性的或在用CD20基因轉(zhuǎn)染后表達(dá)CD20的細(xì)胞。例如，可將腫瘤細(xì)胞系和CD20轉(zhuǎn)染細(xì)胞用多種濃度的本發(fā)明抗CD20單克隆抗體處理幾天(例如2-7天)，并用結(jié)晶紫或MTT染色，或者通過一些其它比色測定法進(jìn)行分析。測量增殖的另一種方法將是通過比較在存在或缺乏本發(fā)明抗CD20抗體時處理的細(xì)胞的3H-胸苷攝取?？贵w處理后，收獲細(xì)胞并在閃爍計數(shù)器中對摻入DNA的放射性的量定量。適宜的陽性對照包括用已知抑制選定細(xì)胞系生長的生長抑制性抗體處理該細(xì)胞系。為了選擇誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體，可相對于對照評估通過例如碘化丙啶(PI)、錐蟲藍(lán)或7AAD攝取顯示的膜完整性喪失。PI攝取測定法可在缺乏補體和免疫效應(yīng)細(xì)胞時進(jìn)行。在單獨的培養(yǎng)基或含有濃度為例如約10lag/ml的適宜單克隆抗體的培養(yǎng)基中溫育表達(dá)CD20的腫瘤細(xì)胞。將細(xì)胞溫育3天的時限。每次處理后，將細(xì)胞清洗并等分到35mm蓋有濾網(wǎng)(strainer-capped)的12x75管中(每管lml,每個處理組3管)以除去細(xì)胞團(tuán)塊。然后向管中加入PI(10ng/ml)?？梢允褂肍ACSCANTM流式細(xì)胞儀和FACSCONVERTTMCellQuest軟件(BectonDickinson)分析樣品?？梢詫⒛切└鶕?jù)PI攝取的測定誘導(dǎo)統(tǒng)計學(xué)顯著水平的細(xì)胞死亡的抗體選作誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抗體。為了篩選結(jié)合CD20上目的抗體所結(jié)合的表位的抗體，可進(jìn)行常規(guī)交叉P且斷觀l)定法，諸^口爿w/7'6od/es,」丄aZonator少Afa"wa/,ColdSpringHarborLaboratory,EdHarlow和DavidLane,1988中所記載的。此測定法可用于測定通過本領(lǐng)域知道的方法進(jìn)行表位作圖。例如，可對抗體序列進(jìn)行誘變，諸如通過丙氨酸掃描，以鑒定接觸殘基。首先對突變型抗體測試多克隆抗體的結(jié)合以確保正確折疊。在一種不同的方法中，可將對應(yīng)于CD20不同區(qū)域的肽與測試抗體或者與測試抗體及具有已表征或已知表位的抗體一起用于竟?fàn)帨y定法。載體、宿主細(xì)胞和重組方法本發(fā)明還提供了編碼人源化2H7變體抗體的分離的核酸、包含所述核酸的載體和宿主細(xì)胞、及用于生產(chǎn)所述抗體的重組技術(shù)。為了重組生產(chǎn)抗體，分離編碼抗體的核酸，并插入可復(fù)制載體，用于進(jìn)一步克隆(DNA擴增)或表達(dá)。編碼單克隆抗體的DNA易于使用常規(guī)流程分離和測序(例如通過使用能夠與編碼抗體重鏈和輕鏈的基因特異性結(jié)合的寡核苷酸探針)。可以獲得許多載體。載體構(gòu)件通常包括但不限于下列一種或多種信號序列、復(fù)制起點、一種或多種標(biāo)記基因、增強子元件、啟動子、和轉(zhuǎn)錄終止序列。本發(fā)明的人源化2H7抗體不僅可以直接重組生產(chǎn)，而且可以作為與異源多肽的融合多肽，所述異源多肽優(yōu)選是成熟蛋白質(zhì)或多肽的N-末端處的信號序列或具有特異性切割位點的其它多肽。所選擇的異源信號序列優(yōu)選是受到宿主細(xì)胞識別并加工(即受到信號肽酶切割)的。對于不識別和加工天然CD20結(jié)合抗體信號序列的原核宿主細(xì)胞，所述信號序列用例如選自堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列的原核信號序列取代。為了酵母分泌，天然信號序列可以用例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、oc因子前導(dǎo)序列(包括糖酵母屬和克魯維氏酵母屬CC因子前導(dǎo)序列)、酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色假絲酵母葡萄糖淀粉酶前導(dǎo)序列、或WO90/13646中記載的信號取代。在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)中，可以利用哺乳動物信號序列以及病毒分泌前導(dǎo)序列，例如單純皰滲gD信號。將此類前體區(qū)(precursorregion)的DNA以符合讀碼框的方式與編碼人源化2H7抗體的DNA連接。問復(fù)翔趟^溝伴表達(dá)和克隆載體都包含能夠使載體在一種或多種所選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這種序列是能夠使載體不依賴于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，包括復(fù)制起點或自主復(fù)制序列。眾所周知多種細(xì)菌、酵母和病毒的此類序列。來自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2)1質(zhì)粒起點適合于酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動物細(xì)胞中的克隆載體。通常，哺乳動物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點構(gòu)件(SV40起點的使用通?？赡苤皇且驗樗缙趩幼?。&》逸脊差^溝伴表達(dá)和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)志。典型的選擇基因編碼如下蛋白質(zhì)(a)賦予對抗生素或其它毒素的抗性，例如氨千青霉素、新霉素、曱氨蝶呤或四環(huán)素；(b)補足營養(yǎng)缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由復(fù)合培養(yǎng)基獲得的必需營養(yǎng)物，例如用于芽孢桿菌的編碼D-丙氨酸消旋酶的基因。選擇方案的一個例子利用藥物來阻滯宿主細(xì)胞的生長。用異源基因成功轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞生成賦予藥物抗性的蛋白質(zhì)，因而幸免于選4奪方案。此類顯性選^^的例子使用藥物新霉素、霉酚酸和潮霉素。適于哺乳動物細(xì)胞的選擇標(biāo)志的另一個例子是那些能夠鑒定有能力攝取編碼人源化2H7抗體的核酸的細(xì)胞的選擇標(biāo)志，諸如DHFR、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和-II優(yōu)選靈長類金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。例如，首先通過將所有轉(zhuǎn)化子在含有曱氨蝶呤(Mtx)，DHFR的一種竟?fàn)幮赞卓箘┑呐囵B(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來鑒定經(jīng)DHFR選擇基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在采用野生型DHFR時，適宜的宿主細(xì)胞是DHFR活性缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)月包系(例如ATCCCRL-9096)?；蛘?，可以通過細(xì)胞在含有針對選擇標(biāo)志的選擇劑諸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418的培養(yǎng)基中的生長來選擇經(jīng)編碼人源化2H7抗體、野生型DHFR蛋白質(zhì)、和另一種選擇標(biāo)志諸如氨基糖苷3'-磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)的DNA序列轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞(特別是包含內(nèi)源DHFR的野生型宿主)。參閱美國專利No.4,965,199。適用于酵母的選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的基因(Stinchcomb&a/.,Atoww282:39(1979))。基因為缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變抹，例如ATCCNo.44076或PEP4-1提供了選4奪標(biāo)志。Jones，85:12(1977)。酵母宿主細(xì)胞基因組中存在損傷隨之提供了用于通過在缺乏色氨酸時的生長來檢測轉(zhuǎn)化的有效環(huán)境。類似的，用攜帶丄ew2基因的已知質(zhì)粒補足丄ew2缺陷型酵母菌林(ATCC20,622或38,626)。此外，衍生自1.6(im環(huán)狀質(zhì)粒pKDl的載體可用于轉(zhuǎn)化克魯維氏酵母屬酵母。或者，報導(dǎo)了用于在乳酸克魯維氏酵母中大規(guī)模生產(chǎn)重組小牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)。VandenBerg,S/o/Tec/"o/o"8:135(1990)。還披露了用于由克魯維氏酵母屬的工業(yè)用菌林分泌成熟重組人血清清蛋白的穩(wěn)定多拷貝表達(dá)載體。Fleer&,6/0/7fec/2"o/ogv9:968-975(1991)。"v」y^動子溝伴表達(dá)和克隆載體通常包含受到宿主生物體識別的啟動子，而且它與編碼人源化2H7抗體的核酸可操作連接。適用于原核宿主的啟動子包括p/za4啟動子、P-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)、堿性磷酸酶啟動子、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)、和雜合啟動子諸如tac啟動子。然而，其它已知的細(xì)菌啟動子也是合適的。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動子還將包含與編碼CD20結(jié)合抗體的DNA可操作連接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。已知真核細(xì)胞的啟動子序列。事實上，所有真核基因都具有富含AT區(qū)，它位于起始轉(zhuǎn)錄的位點上游大約25至30個堿基處。在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點上游70至80個堿基處找到的另一種序列是CNCAAT區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向編碼序列的3'端添加聚腺苷酸尾的信號。所有這些序列合適的插入真核表達(dá)載體。適用于酵母宿主的啟動子序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子，諸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氬酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和葡糖激酶。作為具有通過生長條件控制轉(zhuǎn)錄的額外優(yōu)點的誘導(dǎo)型啟動子的其它酵母啟動子是醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子區(qū)。適用于酵母表達(dá)的載體和啟動子進(jìn)一步記載于EP73,657。酵母增強子也可以有利的與酵母啟動子一起使用。在哺乳動物宿主細(xì)胞中由載體轉(zhuǎn)錄人源化2H7抗體受到例如從病毒諸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙肝病毒和最優(yōu)選的猿猴病毒40(SV40)基因組，從異源哺乳動物啟動子例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子，及此熱休克啟動子獲得的啟動子的控制，倘若此類啟動子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話。方便的以SV40限制性片段的形式獲得SV40病毒的早期和晚期啟動子，該片段還包含SV40病毒復(fù)制起點。方便的以HindIIIE限制性片段的形式獲得人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動子。美國專利No.4,419,446中披露了使用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)。美國專利No.4,601,978中記載了該系統(tǒng)的一種改良。關(guān)于在小鼠細(xì)胞中在來自單純皰滲病毒的胸苷激酶啟動子的控制下表達(dá)人P-干擾素cDNA還可參閱Reyes"a/.,iVa似"297:598-601(1982)?；蛘撸梢允褂脛谑先饬霾《鹃L末端重復(fù)序列作為啟動子。W增強子無伴溝伴常常通過將增強子序列插入載體來提高高等真核細(xì)胞對編碼本發(fā)明人源化2H7抗體的DNA的轉(zhuǎn)錄?，F(xiàn)在知道來自哺乳動物基因(球蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白和胰島素)的許多增強子序列。然而，通常使用來自真核細(xì)胞病毒的增強子。例子包括SV40復(fù)制起點晚期一側(cè)的增強子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒復(fù)制起點晚期一側(cè)的增強子、和腺病毒增強子。關(guān)于激活真核啟動子的增強元件還可參閱Yaniv,Atowe297:17-18(1982)?？梢詫⒃鰪娮蛹艚拥捷d體中，位于CD20結(jié)合抗體編碼序列的5'或3'位置，但是優(yōu)選位于啟動子的5'位點。(vi)轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件用于真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人或來自其它多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)的表達(dá)載體還將包含終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定mRNA所必需的序列。此類序列通?？梢詮恼婧嘶虿《綝NA或cDNA非翻i,區(qū)的5'端和偶爾的3'端獲得。這些區(qū)域包含在編碼CD20結(jié)合抗體的mRNA的非翻譯部分中轉(zhuǎn)錄成聚腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止構(gòu)件是牛生長激素聚腺苷酸化區(qū)。參閱WO94/11026及其中披露的表達(dá)載體。"諒i勿應(yīng)適于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞。適于此目的的原核生物包括真細(xì)菌，諸如革蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬C&c/7en'c/z/a)例如大腸埃希氏菌(￡.co//)、腸桿菌屬(&7&ra/7acte。、歐文氏菌屬0Erw/m'a)、克雷伯氏菌屬(《/efe/e〃fl)、變形菌屬(尸rafew力、沙門氏菌屬(/Sa/wowe〃a)i"列^口鼠4另寒沙、門氏菌(5"a/wowe〃azyp/n'mwr/ww)、沙、雷氏菌屬(Serra"o)例^口粘質(zhì)沙雷氏菌(》Serra"<3marcavcam)、志賀氏菌屬(57z/ge〃(2)、以及芽孢桿菌屬(Sa"7//)諸如枯草芽孢桿菌wto7/力和地衣芽孢桿菌(6.//c/7em/w7w》(例如1989年4月12日公布的DD266,710中披露的地衣芽孢桿菌41P)、假單胞菌屬CP化w^wo"a。諸如銅綠假單胞菌OPaen^/wwa)、和鏈霉菌屬(5^印tomyce力。一種優(yōu)選的大腸桿菌克隆宿主是大腸桿菌294(ATCC31,446)，盡管其它菌抹諸如大腸桿菌B、大腸桿菌Xl776(ATCC31,537)和大腸桿菌W3110(ATCC27,325)也是合適的。這些例子是例示性的，而不是限制性的。可以在細(xì)菌中生產(chǎn)全長抗體、抗體片段和抗體融合蛋白，特別是在不需要糖基化和Fc效應(yīng)器功能時，諸如在將治療用抗體與細(xì)胞毒劑(例如毒素)偶聯(lián)及免疫偶聯(lián)物自身顯示出破壞腫瘤細(xì)胞方面的效力時。全長抗體在循環(huán)中具有更長的半衰期。在大腸桿菌中的生產(chǎn)更快速且更低廉。關(guān)于在細(xì)菌中表達(dá)抗體片段和多肽，參見例如U.S.5,648,237(Carter"/)，U.S.5,789,199(JolyWa/.)和U.S.5,840,523(SimmonsWa/.)，它們記載了用于優(yōu)化表達(dá)和分泌的翻譯起始區(qū)(TIR)和信號序列，在此收入這些專利作為參考。表達(dá)后，在可溶性級分中從大腸桿菌細(xì)胞糊分離抗體，可以通過例如根據(jù)同種型選擇蛋白A或G柱進(jìn)行純化。最終的純化可以與用于純化例如在CHO細(xì)胞中表達(dá)的抗體的過程類似的進(jìn)行。在原核生物以外，真核微生物諸如絲狀真菌或酵母也是編碼CD20結(jié)合抗體的載體的合適克隆或表達(dá)宿主。釀酒^唐酵母(Sacc/zaramycascemWWae)或常用的面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。然而，通?？色@得許多其它屬、種和菌抹且可用于本發(fā)明，諸如粟酒裂殖糖酵母(6b/n'zosacc/z(2rawyces/om6e);克魯維酵母屬(A7t/yveramyc&s)宿主，諸如例如乳酸克魯維酵母(K/ac&)、脆壁克魯維酵母(K/rag/fo)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維酵母(AT.6w/gan'cw)(ATCC16，045)、威克克魯維酵母(I.w/cfera脂7)(ATCC24,178)、Iw"/"/(ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母(K.t/mw/^//aram)(ATCC36,906)、耐熱克魯維酵母(IAermoto/erara)和馬克思克魯維酵母(Imarx/awM》；亞羅酵母屬(r"mw/a)(EP402,226);巴斯德畢赤酵母(尸/c/z/a/似ton'力(EP183,070);41絲酵母屬(C朋;瑞氏木霉(7h'c/zofiferma(EP244,234);粗糙月永孑包菌(7Vewras;oracro^a);許旺酵母屬(5b/2vra朋/om^yce力，諸如許旺酵母(Sc/wa朋z.o/^yces1occ/<ietoto);和絲狀真菌，諸如例如脈孢菌屬(7Vewm^ora)、青霉屬(尸em'c/〃/wm)、彎頸霉屬(7b/y;oc/a力^m)、和曲霉屬0^perg/〃w)宿主諸如構(gòu)巢曲霉(AmV/w/ara)和黑曲霉(Am'ger)。適于表達(dá)糖基化人源化2H7抗體的宿主細(xì)胞衍生自多細(xì)胞生物體。無脊推動物細(xì)胞的例子包括植物和昆蟲細(xì)胞。已經(jīng)鑒定了許多桿狀病毒抹和變體及相應(yīng)的允許昆蟲宿主細(xì)胞，它們來自諸如草地夜蛾SpoJopfera/rag^eWfl(毛蟲)、埃及伊蚊(蚊子)、白纟丈伊蚊/c加(蚊子)、,繁、腹果蟲黽Z>aop/z//<3me/awogaster(果蟲雖)禾口家蠶Bow6ja附on'等宿主。公眾可獲得多種病毒抹用于轉(zhuǎn)染，例如苜蓿尺蠖/^tograp/2aca/z/orm'cflNPV的L-l變體和家蠶SomxNPV的Bm-5抹，而且此類病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。還可利用棉、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、番茄和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物作為宿主。然而，脊推動物細(xì)胞得到最多關(guān)注，而且培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中脊推動物細(xì)胞的繁殖已經(jīng)成為常規(guī)流程。有用哺乳動物宿主細(xì)胞系的例子是用SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CV1系(COS-7,ATCCCRL1651);人胚腎系(293或為了在懸浮培養(yǎng)中生長而亞克隆的293細(xì)胞，Graham"a/.，36:59(1977));幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK,ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細(xì)胞ADHFR(CHO，Urlaubwa/"戶rac.胸/.固77:4216(1980))或CHO-OP-12系;小鼠塞托利(sertoli)細(xì)胞(TM4，Mather,所o/.W印rad23:243-251(1980》；猴腎細(xì)胞(CV1，ATCCCCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HELA，ATCCCCL2);犬腎細(xì)胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(BRL3A，ATCCCRL1442);人肺細(xì)胞(W138,ATCCCCL75);人肝細(xì)胞(HepG2,HB8065);小鼠乳瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI細(xì)胞(Mathera/.，TV.K^cad383:44-68(1982);MRC5纟田月包；FS4細(xì)胞；和人肝瘤系(HepG2)。用上文所述用于生產(chǎn)CD20結(jié)合抗體的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在為了誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化子或擴增編碼期望序列的基因而適當(dāng)更改的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。潛^諒i勿應(yīng)可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于生產(chǎn)本發(fā)明CD20結(jié)合抗體的宿主細(xì)胞。商品化培養(yǎng)基諸如Ham氏F10(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM,Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏更改的Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM,Sigma)適于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，可以使用下列文獻(xiàn)中記載的任何培養(yǎng)基作為宿主細(xì)月包的3咅養(yǎng)基Hama/.，Me仇五"z.58:44(1979);Barnes&a/.,所0c/2e肌102:255(1980);美國專利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美國專利復(fù)審30,985。任何這些培養(yǎng)基可以根據(jù)需要補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(諸如氯化鈉、鈣、鎂和磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸苷)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍的終濃度存在的無機化合物)、和葡萄糖或等效能源。還可以以適宜濃度包含本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的任何其它必需補充物。培養(yǎng)條件，諸如溫度、pH等，就是先前為表達(dá)而選擇用于宿主細(xì)胞的，這對于普通技術(shù)人員而言是顯而易見的。在使用重組技術(shù)時，可以在細(xì)胞內(nèi)、在周質(zhì)空間中生成抗體，或者直接分泌到培養(yǎng)基中。如果在細(xì)胞內(nèi)生成抗體，那么作為第一步，通過例如離心或超濾除去宿主細(xì)胞或裂解片段的微粒碎片。Carter""/.,S/o/rec/z朋/ogy10:163-167(1992)記載了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間的抗體的流程。簡單的說，在存在乙酸鈉(pH3.5)、EDTA和苯曱基磺酰氟(PMSF)時使細(xì)胞糊融化約30分鐘?？赏ㄟ^離心除去細(xì)胞碎片。如果將抗體分泌到培養(yǎng)基中，那么通常首先使用商品化蛋白質(zhì)濃縮濾器，例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元濃縮來自此類表達(dá)系統(tǒng)的上清液。在任何上述步驟中，可以包括蛋白酶抑制劑諸如PMSF來抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素來防止外來污染物的生長?？梢允褂美缌u磷灰石層析、凝膠電泳、透析和親和層析來純化由細(xì)胞制備的抗體組合物，優(yōu)選的純化技術(shù)是親和層析。蛋白A作為親和配體的適宜性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc區(qū)的種類和同種型。蛋白A可用于純^b基于人yl、或y4重《連的^L體(Lindmarkea/.，/7mmwwo/.Me仇62:1-13(1983))。蛋白G推薦用于所有小鼠同種型和人y3(GussWa/.，五MSO/5:1567-1575(1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最常用的是瓊脂糖，但是可以使用其它基質(zhì)。物理穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能夠獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。若抗體包含Ch3結(jié)構(gòu)域，則可使用BakerbondABXtm樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,NJ)進(jìn)行純化。根據(jù)待回收的抗體，也可使用其它蛋白質(zhì)純化技術(shù)，諸如離子交換柱上的分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如聚天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、和石克酸4妄沉淀。在任何預(yù)備性純化步驟后，包含目的抗體和污染物的混合物可進(jìn)行低pH疏水相互作用層析，使用pH大約2.5-4.5之間的洗脫緩沖液，優(yōu)選在低鹽濃度進(jìn)行(例如大約0-0.25M鹽)?？贵w偶聯(lián)物抗體可以與細(xì)胞毒劑諸如毒素或放射性同位素偶聯(lián)。在某些實施方案中，所述毒素是力口利車霉素(calicheamicin)、美登木素生物石咸類(maytansinoid)、多4i司他汀(dolastatin)、auristatinE及其類似物或書亍生物。優(yōu)選的藥物/毒素包括DNA損傷劑、微管聚合或解聚的抑制劑、及抗代謝物。細(xì)胞毒劑的優(yōu)選類別包括例如酶抑制劑諸如二氫葉酸還原酶抑制劑和胸苷酸合酶抑制劑、DNA嵌入劑、DNA切割劑、拓樸異構(gòu)酶抑制劑、蒽環(huán)類抗生素(anthracycline)藥物家族、長春類(vinca)藥物、絲裂霉素(mitomycin)、博來霉素(bleomycin)、細(xì)胞毒性核苷、蝶啶(pteridine)藥物家族、二炔類抗生素(diynenes)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)和分化誘導(dǎo)物。那些類別特別有用的成員包括例如曱氨喋呤(methotrexate)、曱氨蝶呤(methopterin)、二氯曱氨口菜口令(dichloromethotrexate)、5-氟尿。密口定(fluorouracil)、6-3危基口票口令(mercaptopurine)、阿4唐月包苦(cytosinearabinoside)、美法倉(melphalan)、〉各"i若生(leurosine)、洛諾西丁(leurosidine)、放線菌素(actinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxombicin)、N-(5，5-二乙酰氧基戊基)多柔比星、嗎啉代-多柔比星、1-(2-氯乙基)-1,2-二曱基磺酰肼(l-(2-choroehthyl)-l,2-dimethanesulfonylhydrazide)、N8-乙?；鶃喗蚯喟?N8-acetylspermidine),氨基蟲萊p令(aminopterin)、曱氨蟲菜卩令(methopterin)、埃斯波霉素(esperamicin)、絲裂霉素C(mitomycinC)、絲裂霉素A(mitomycinA)、放線菌素(actinomycin)、博來霉素(bleomycin)、洋紅霉素(carminomycin)、氛基蟲萊口令(aminopterin)、J也利霉素(tallysomycin)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)及鬼臼毒素衍生物諸如依托泊苦(etoposide)或磷酸依托泊苦、長春堿(vinblastine)、長春新械(vincristine)、長春地辛(vindesine)、泰素(taxol)、泰索帝(taxotere)、一見黃酸(retinoicacid)、丁酸(butyricacid)、N8-乙?；鶃?青胺(N8-acetylspermidine)、喜杉于石咸(camptothecin)、力口利車霉素(calicheamicin)、苔蘚才中素(bryostatin)、cephalostatins、安絲菌素(ansamitocin)、actosin、美登木素生物石咸類(maytansinoid)諸如DM-1、美登素(maytansine)、美登醇(maytansinol)、N-去曱基-4,5-去環(huán)氧美登醇、C-19-脫氯美登醇、C-20-羥基美登醇、C-20-脫曱氧基美登醇、C-9-SH美登醇、C-14-烷氧曱基美登醇、C-14-羥基或乙酰氧曱基美登醇、C-15-羥基/乙酰氧基美登醇、C-15-曱氧基美登醇、C-18-N-脫曱基美登醇和4,5-脫氧美登醇；auristatin,諸如auristatinE、M、PHE禾口PE;dolostatin,諸i口dolostatinA、dolostatinB、dolostatinC、dolostatinD、dolostatinE(20-表和ll-表)、dolostatinG、dolostatinH、dolostatinI、dolostatin1、dolostatin2、dolostatin3、dolostatin4、dolostatin5、dolostatin6、dolostatin7、dolostatin8、dolostatin9、dolostatin10、deo-dolostatin10、dolostatin11、dolostatin12、dolostatin13、dolostatin14、dolostatin15、dolostatin16、dolostatin17禾口dolostatin18;cephalostatin，諸^口cephalostatin1、cephalostatin2、cephalostatin3、cephalostatin4、cephalostatin5、cephalostatin6、cephalostatin7、25'-表-cephalostatin7、20-表-cephalostatin7、cephalostatin8、cephalostatin9、cephalostatin10、cephalostatin11、cephalostatin12、cephalostatin13、cephalostatin14、cephalostatin15、cephalostatin16、cephalostatin17、cephalostatin18禾口cephalostatin19。美登木素生物堿類是通過抑制微管蛋白聚合來發(fā)揮作用的有絲分裂抑制劑。美登素最初從東非灌木齒葉美登木(M，fem^化rrato)分離得到(美國專利No.3,896,111)。隨后發(fā)現(xiàn)某些微生物也生成美登木素生物堿類，諸如美登醇和C-3美登醇酯(美國專利No.4,151,042)。合成的美登醇及其4汙生物和類似物披露于例如美國專利No.4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371,533,在此明確收入其公開內(nèi)容作為參考。已經(jīng)將美登素和美登木素生物堿類與特異性結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原的抗體偶聯(lián)。包含美登木素生物堿類的免疫偶聯(lián)物及其治療用途披露于例如美國專利No.5,208,020;5,416,064及歐洲專利EP0425235Bl，在此明確收入其公開內(nèi)容作為參考。Liu"a/.,Prac.Ato/.Jcad5W.93:8618-8623(1996)記載了包含與針對人結(jié)腸直腸癌的單克隆抗體C242連接的稱為DM1的美登木素生物堿類的免疫偶聯(lián)物。發(fā)現(xiàn)該偶聯(lián)物具有針對培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞的高度細(xì)胞毒性，而且在體內(nèi)腫瘤生長測定法中顯示出抗腫瘤活性。Chari&a/.,QwcerWe化arc/252:127-131(1992)記載了其中美登木素生物堿類經(jīng)二硫化物接頭與結(jié)合人結(jié)腸癌細(xì)胞系上抗原的鼠抗體A7或結(jié)合HER-2/wew癌基因的另一種鼠單克隆抗體TA.l偶聯(lián)的免疫偶聯(lián)物。本領(lǐng)域知道許多連接基團(tuán)可用于制備抗體-美登木素生物堿類偶聯(lián)物，包括例如美國專利No.5,208,020或歐洲專利0425235Bl及ChariWa/.,Ca"ceri^earc/z52:127-131(1992)中所披露的。連接基團(tuán)包括二硫化物基團(tuán)、硫醚基團(tuán)、酸不穩(wěn)定基團(tuán)、光不穩(wěn)定基團(tuán)、肽酶不穩(wěn)定基團(tuán)、或酯酶不穩(wěn)定基團(tuán)，正如上述專利中所4皮露的，優(yōu)選二硫化物和硫醚基團(tuán)?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和美登木素生物堿類的偶聯(lián)物，諸如N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡。定基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞氨基-4-(N—馬來酰亞氨基曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二曱酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯甲?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯曱?；?乙二胺)、二異氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。特別優(yōu)選的偶聯(lián)劑包括N-琥珀酰亞氨基-3-(2-吡咬基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson"J173:723-737(1978))和N-琥珀酰亞氨基-4-(2-吡咬基硫代)戊酸酯(8),由此提供二硫鍵連接。根據(jù)連接的類型，可將接頭附著于美登木素生物堿類分子的多個位置。例如，可使用常規(guī)偶聯(lián)技術(shù)通過與羥基的反應(yīng)來形成酯鍵。反應(yīng)可發(fā)生在具有羥基的C-3位置、經(jīng)羥曱基修飾的C-14位置、經(jīng)羥基修飾的C-15位置、和具有羥基的C-20位置。在一個優(yōu)選的實施方案中，在美登醇或美登醇類似物的C-3位置形成鍵連接。另一種感興趣的免疫偶聯(lián)物包含與一個或多個加利車霉素分子偶聯(lián)的CD20結(jié)合抗體。加利車霉素抗生素家族能夠在亞皮摩爾濃度產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂。關(guān)于加利車霉素家族偶聯(lián)物的制備參見美國專利No.5,712,374;5,714,586;5,739,116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;5,877,296(都是美國Cyanamid公司的)。可用的加利車霉素結(jié)構(gòu)類似物包括但不限于Y」、a2'、a、N-乙酰基,1、PSAG和0、(Hinman&7eearc/253:3336-3342(1993);Lode"a/.，Ca"cerWe化arc/z58:2925-2928(1998);及上述授予美國Cyanamid公司的美國專利)?？膳c抗體偶聯(lián)的另一種抗腫瘤藥物是QFA,它是一種抗葉酸藥物。加利車霉素和QFA都具有胞內(nèi)作用位點，且不易穿過質(zhì)膜。因此，這些藥劑經(jīng)由抗體介導(dǎo)的內(nèi)在化的細(xì)胞攝取大大增強了它們的細(xì)胞毒性效果。放射^/^位素為了選擇性破壞腫瘤，抗體可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用于生成放射偶聯(lián)的抗CD20抗體。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb^和Lu的放射性同位素。在將偶聯(lián)物用于檢測時，它可包含放射性原子用于閃爍照相研究，例如Tc"""或I123,或是包含自旋標(biāo)記物用于核磁共振(NMR)成像(也稱為磁共振成像，mri)，諸如碘-123、缺-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵?？梢砸砸阎绞綄⒎派湫詷?biāo)記物或其它標(biāo)記物摻入偶聯(lián)物。例如，可生物合成肽，或是通過化學(xué)氨基酸合成法合成肽，其中使用牽涉例如氟-19代替氫的合適氨基酸前體?？梢越?jīng)肽中的半胱氨酸殘基來附著標(biāo)記物，諸如Tc"m或I123、Re186、Re哪和In111?？梢越?jīng)賴氨酸殘基來附著釔-90。IODOGEN法(Fraker""/，&oc/zem.祝o//i^.Commw",80:49-57(1978))可用于4參入石典-123。M9woc/o憩/v4w"6o(i/es1/mm朋osc/油'gra//z乂Chatal,CRCPress,1989詳細(xì)記載了其它方法?？墒褂枚喾N雙功能蛋白質(zhì)偶聯(lián)劑來制備抗體和細(xì)胞毒劑的偶聯(lián)物，諸如N-琥詢酰亞氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亞氨基-4-(N-馬來酰亞氨基曱基)環(huán)己烷-l-羧酸酯、亞氨基硫烷(IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸己二酰亞氨酸二甲酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞氨基酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙(對疊氮苯曱?；?己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯曱?；?-乙二胺)、二異硫氰酸酯(諸如曱苯2,6-二異氰酸酯)和雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)的雙功能衍生物。例如，可以如Vitettae/1a/.,Sc/e"ce238:1098(1987)中所記載的來制備蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14標(biāo)記的l-異硫氰酸苯甲基-3-曱基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于將放射性核苦酸與抗體偶聯(lián)的例示性螯合劑。參見WO94/11026。接頭可以是便于在細(xì)胞中釋放細(xì)胞毒藥物的"可切割接頭"。例如，可使用酸不穩(wěn)定接頭、肽酶敏感接頭、光不穩(wěn)定接頭、二曱基接頭、或含二硫化物接頭(Chariefa/.,C朋cerie化wr/52:127-131(1992);美國專利No.5,208,020)。治療用途本發(fā)明的人源化2H7CD20結(jié)合抗體可用于治療許多惡性和非惡性疾病包括CD20陽性癌癥諸如B細(xì)胞淋巴瘤和白血病，及自身免疫病。骨髓中的干細(xì)胞(B細(xì)胞前體)缺乏CD20抗原，使得健康B細(xì)胞能在處理后再生并在數(shù)月內(nèi)回到正常水平。hu2H7.v511是將用于本文中的治療方法的優(yōu)選抗體。CD20陽性癌癥指這樣的癌癥，其中在細(xì)胞表面上表達(dá)CD20的細(xì)胞異常增殖。CD20陽性B細(xì)胞腫瘤包括CD20陽性何杰金氏(Hodgkin)病，包括淋巴細(xì)胞為主型的何杰金氏病(LPHD);非何杰金氏淋巴瘤(NHL);濾泡中心細(xì)胞(FCC)淋巴瘤；急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL);慢性淋巴細(xì)胞性白血病CCLL);毛細(xì)胞性白血病。術(shù)語"非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤"或"NHL"在用于本文時指何杰金氏淋巴瘤以外的淋巴系統(tǒng)癌癥。通?？赏ㄟ^何杰金氏淋巴瘤中存在里-施(Reed-Sternberg)細(xì)胞而非何杰金氏淋巴瘤中不存在所述細(xì)胞將何杰金氏淋巴瘤與非何杰金氏淋巴瘤區(qū)分開來。非何杰金氏淋巴瘤在該術(shù)語用于本文時所涵蓋的例子包括本領(lǐng)域技術(shù)人員(例如肺瘤學(xué)家或病理學(xué)家)依照本領(lǐng)域已知的分類表將鑒定為此類的任何淋巴瘤，諸如Co/orq/"C7/m'ca///ewato/ogy,第3版，VictorA.Hoffbrand和JohnE.Pettit編,HarcourtPublishersLtd.,2000中i己載的RevisedEuropean-AmericanLymphoma(REAL)scheme(歐美淋巴瘤修正表)。具體參見圖11.57、11.58和11.59中的表。更具體例子包括但不限于復(fù)發(fā)性或頑固性NHL、前線(frontline)低級NHL、階段III/IVNHL、化療耐受性NHL、前體B成淋巴細(xì)胞性白血病和/或淋巴瘤、小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病和/或前淋巴細(xì)胞性白血病和/或小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、B細(xì)胞前淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、免疫細(xì)胞瘤和/或淋巴漿細(xì)胞性(lymphoplasmacytic)淋巴瘤、淋巴漿細(xì)胞性淋巴瘤、邊緣區(qū)B細(xì)月包淋巴瘤、月年邊緣區(qū)淋巴瘤、節(jié)夕卜邊緣區(qū)(extranodalmarginalzone)-MALT淋巴瘤、節(jié)邊緣區(qū)(nodalmarginalzone)淋巴瘤、毛細(xì)胞性白血病、漿細(xì)胞瘤和/或漿細(xì)胞骨髓瘤、低級/濾泡淋巴瘤、中級/濾泡NHL、套細(xì)胞淋巴瘤、濾泡中心淋巴瘤(濾泡的)、中級彌漫性NHL、彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、攻擊性(agressive)NHL(包括攻擊性前線NHL和攻擊性復(fù)發(fā)性NHL)、自體干細(xì)胞移植后復(fù)發(fā)性或頑固性NHL、原發(fā)性縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤、原發(fā)性滲出性淋巴瘤、高級成免疫細(xì)胞NHL、高級成淋巴細(xì)胞NHL、高級小無核裂細(xì)胞NHL、貯積病(bulkydisease)NHL、伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤、前體(外周)大粒狀淋巴細(xì)胞白血病、蕈樣肉芽腫病和/或塞扎里(Sezary)綜合征、皮膚淋巴瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤。在具體的實施方案中，將人源化CD20結(jié)合抗體及其功能性片段用于治療非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、淋巴細(xì)胞為主型的何杰金氏病(LPHD)、小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(SLL)和慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)，包括這些疾患的復(fù)發(fā)。無痛淋巴瘤是一種生長緩慢的、不能治愈的疾病，其中患者在多次病情消退和復(fù)發(fā)后平均存活6至10年。在一個實施方案中，將人源化CD20結(jié)合抗體或其功能性片段用于治療無痛NHL,包括復(fù)發(fā)性無痛NHL和Rituximab耐受性無痛NHL。復(fù)發(fā)性無痛NHL患者可以是先前接受過一個療矛呈的Rituximab且響應(yīng)6個月以上的Rituximab響應(yīng)者。本發(fā)明的人源化2H7抗體或其功能性片段可作為單一藥劑治療(單一療法)用于例如復(fù)發(fā)性或頑固性低級或濾泡性CD20陽性B細(xì)胞NHL,或者可以與其它藥物聯(lián)合成多藥物方案施用于患者。本發(fā)明的人源化2H7抗體或其功能性片段可用作第一線療法。本發(fā)明還設(shè)想了將這些抗體用于治療對使用以下任一藥物的治療沒有響應(yīng)或響應(yīng)不足或在用這些藥物治療后復(fù)發(fā)的CD20陽性B細(xì)胞肺瘤患者rituximab(Genentech);ocrelizumab(Genentech,Inc.);ibritumomabtiuxetan(Zevalin,BiogenIdee);tosit腿omab(Bexxar,GlaxoSmithKline);HuMAX-CD20TM(GenMab);IMMU-106(—種人源化抗CD20,也稱作hA20或90Y-hLL2,Immunomedics);AME-133(AppliedMolecularEvolution/EliLilly);gentuzumabozogamicin(MylotargTM,—種人源^匕抗CD33抗體，Wyeth/PDL);alemtuzumab(Campath,—種抗CD52抗體，ScheringPlough/Genzyme);epratuzumab(IMMU-103TM,—種人源化抗CD22抗體，Immunomedics)。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用本發(fā)明的人源化2H7抗體治療CLL患者的方法，所述患者包括使用氟達(dá)拉濱的療法失敗了的患者，在具體的實施方案中用2H7.v511和2H7.vl14進(jìn)4亍治療。"自身免疫病"在本文中指因個體自身組織引起的和針對個體自身組織的疾病或病癥或其共分離(co-segregate)或表現(xiàn)或者由此產(chǎn)生的疾患。自身免炎、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、慢性炎性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、感染性關(guān)節(jié)炎、萊姆(Lyme)關(guān)節(jié)炎、增生性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、脊推關(guān)節(jié)炎和幼發(fā)型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎，慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)炎(arthritischronicaprogrediente),變形性關(guān)節(jié)炎，慢性原發(fā)性多關(guān)節(jié)炎，反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，和強直性脊柱炎)，炎性過度增殖性皮膚病，銀屑病諸如斑塊狀銀屑病、滴狀銀屑病、膿皰性銀屑病和指曱銀屑病，特應(yīng)性包括特應(yīng)性疾病諸如干草熱和喬布氏(Job)綜合征，皮炎包括接觸性皮炎、慢性接觸性皮炎、變應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、皰疹樣皮炎和特應(yīng)性皮炎，x連鎖的高IgM綜合征，蕁麻滲諸如慢性變應(yīng)性蕁麻滲和慢性特發(fā)性蕁麻滲包括慢性自身免疫性蕁麻疹，多肌炎/皮肌炎，青少年型皮肌炎，中毒性表皮壞死松解癥，硬皮病(包括系統(tǒng)性硬皮病)，硬化諸如系統(tǒng)性硬化、多發(fā)性硬化(MS)諸如脊髓-眼(spino-optical)MS、原發(fā)性進(jìn)行性MS(PPMS)和復(fù)發(fā)性消退性(relapsingremitting)MS(RRMS)、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化、動脈粥樣硬化、動脈硬化、播散性硬化(sclerosisdisseminata)和共濟失調(diào)性(ataxic)石更化，炎性腸病(IBD)(例如克羅恩氏(Crohn)病，自身免疫介導(dǎo)的胃腸病，結(jié)腸炎諸如潰瘍性結(jié)腸炎(colitisulcerosa),微觀(microscopic)結(jié)腸炎、膠原性結(jié)腸炎、息肉狀結(jié)腸炎、壞死性小腸結(jié)腸炎和透壁性結(jié)腸炎，和自身免疫性炎性腸病)，壞疽性膿皮癥，結(jié)節(jié)性紅斑，原發(fā)性硬化性膽管炎，鞏膜外層炎，呼吸窘迫綜合征包括成人型或急性呼吸窘迫綜合征(ARDS),腦膜炎，整個或部分葡萄膜的炎癥，虹膜炎，脈絡(luò)膜炎，自身免疫性血液學(xué)病癥，類風(fēng)濕性脊推炎，突發(fā)性聽覺喪失，IgE介導(dǎo)的疾病諸如過敏反應(yīng)和變應(yīng)性和特應(yīng)性鼻炎，腦炎諸如拉斯默森氏(Rasmussen)腦炎和邊緣系和/或腦干腦炎，葡萄膜炎諸如前葡萄膜炎、急性前葡萄膜炎、肉芽腫性葡萄膜炎、非肉芽腫性葡萄膜炎、晶狀體抗原性葡萄膜炎、后葡萄膜炎或自身免疫性葡萄膜炎，具有和沒有腎病綜合征的腎小球腎炎(GN)諸如慢性或急性腎小球腎炎諸如原發(fā)性GN、免疫介導(dǎo)的GN、膜性GN(膜性腎病)、特發(fā)性膜性GN或特發(fā)性膜性腎病、膜增殖性或膜性增殖性GN(MPGN)包括I型和II型、和急進(jìn)性GN，變應(yīng)性疾患和應(yīng)答，變應(yīng)性反應(yīng)，濕滲包括變應(yīng)性或特應(yīng)性濕滲，哞喘諸如支氣管嗜喘(asthmabronchiale)和自身免疫性孝喘，涉及T細(xì)胞浸潤和慢性炎性應(yīng)答的疾患，針對外來抗原諸如妊娠期間胎兒A-B-O血型的免疫反應(yīng)，慢性肺部炎性疾病，自身免疫性心肌炎，白細(xì)胞粘附缺陷，系統(tǒng)性紅斑狼裔(SLE)(systemiclupuserythematodes)諸如皮膚SLE、亞急性皮膚紅斑《良裔、新生兒狼瘡綜合征(NLE)、播散性紅斑狼瘡、狼瘡(包括狼瘡腎炎、狼瘡腦炎、兒科狼瘡、非腎狼瘡、腎外狼瘡、盤狀狼瘡、狼瘡脫發(fā))，幼發(fā)型(I型)糖尿病包括兒科胰島素依賴性糖尿病(IDDM)、成人期發(fā)作的糖尿病(II型糖尿病)、自身免疫性糖尿病、特發(fā)性尿崩癥，與細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)型超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答，結(jié)核病，結(jié)節(jié)病，肉芽腫病包括淋巴瘤樣肉芽腫病、韋格納氏(Wegener)肉芽月中病,粒纟田月包擊夾乏,血管炎病包4舌血管炎(包括大血管血管炎(包括風(fēng)濕性多肌痛和巨細(xì)胞(高安氏(Takayasu))動脈炎)，中血管血管炎(包括川崎氏(Kawasaki)病和結(jié)節(jié)性多動脈炎/結(jié)節(jié)性動脈周圍炎)，微觀(microscopic)多動脈炎，CNS血管炎，壞死性、皮膚性或超每文感性血管炎，系統(tǒng)性壞死性血管炎，和ANCA相關(guān)血管炎諸如丘-施二氏(Churg-Strauss)血管炎或綜合征(CSS)),顳動脈炎，再生障礙性貧血，自身免疫性再生障礙性貧血，庫姆斯(Coombs)陽性貧血，戴-布二氏(DiamondBlackfan)貧血，溶血性貧血或免疫性溶血性貧血包括自身免疫性溶血性貧血(AIHA),惡性貧血(anemiapemiciosa)，阿狄森氏(Addison)病，單純紅細(xì)胞性貧血或再生障礙(PRCA)，因子vin缺乏，血友病A,自身免疫性嗜中性粒細(xì)胞減少癥，全血細(xì)胞減少癥，白細(xì)胞減少癥，涉及白細(xì)月包滲出的疾病，CNS炎性病癥，多器官損傷綜合征諸如那些敗血癥、外傷或出血繼發(fā)的，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基底膜病，抗磷脂抗體綜合征，變應(yīng)性神經(jīng)炎，貝切特氏(Bechet或Behcet)病，卡斯?fàn)柭?Castleman)綜合征，古德帕斯丘氏(Goodpasture)綜合征，雷諾氏(Reynaud)綜合征，斯耶格倫氏(Sjogren)綜合征，史-約二氏(Stevens-Johnson)綜合征，類天皰瘙諸如大皰性類天皰癡和皮膚類天皰瘡，天皰瘡(包括尋常型天皰瘡、落葉型天皰瘡、粘膜類天皰瘡型天皰瘡和紅斑性天皰瘡)，自身免疫性多內(nèi)分泌病，萊特氏(Reiter)病或綜合征，免疫復(fù)合物腎炎，抗體介導(dǎo)的腎炎，視神經(jīng)脊髓炎，多神經(jīng)病，慢性神經(jīng)病諸如IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神經(jīng)病，血小板減少癥(例如心肌梗死患者發(fā)生的)包括血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、輸血后紫癜(PTP)、肝素誘發(fā)的血小板減少癥、和自身免疫或免疫介導(dǎo)的血小板減少癥諸如特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)包括慢性或急性ITP,睪丸和卯巢的自身免疫病包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎，原發(fā)性曱狀腺功能減退癥，曱狀旁腺功能減退，自身免疫性內(nèi)分泌病包括曱狀腺炎諸如自身免疫性曱狀腺炎、橋本氏(Hashimoto)病、慢性曱狀腺炎(橋本氏(Hashimoto)曱狀&泉炎)或亞急性曱狀腺炎，自身免疫性曱狀腺病，特發(fā)性曱狀腺功能減退癥，格雷夫斯氏(Graves)病，多腺性綜合征諸如自身免疫性多腺體綜合征(或多腺性內(nèi)分泌病綜合征)，瘤外綜合征包括神經(jīng)學(xué)瘤外綜合征諸如蘭伯特一尹頓(Lambert-Eaton)肌無力綜合征或伊頓-蘭伯特(Lambert-Eaton)綜合征，僵體或僵人綜合征，腦脊髓炎諸如變應(yīng)性腦脊髓炎(encephalomyelitisallergica)和實驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE),重癥肌無力諸如胸腺瘤相關(guān)重癥肌無力，小腦變性，神經(jīng)性肌強直，視性眼陣攣或視性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS)，和感覺神經(jīng)病，多病灶運動神經(jīng)病，席漢氏(Sheehan)綜合征，自身免疫性肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細(xì)胞性肝炎、慢性活動性肝炎或自身免疫性慢性活動性肝炎，淋巴樣間質(zhì)性肺炎(LIP)，梗阻性細(xì)支氣管炎(非移植)對NSIP,格-巴二氏(Guilkin-Bar^)綜合征，貝格爾氏(Berger)病(IgA腎病)，特發(fā)性IgA腎病，線性IgA皮膚病，原發(fā)性膽汁性肝硬化，肺硬變，自身免疫性腸病綜合征，乳糜瀉，腹部疾病，口炎性腹瀉(麩質(zhì)腸病)，頑固性口炎性腹瀉，特發(fā)性口炎性腹瀉，冷球蛋白血癥、肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)(盧格里克氏(LouGehrig)病)，冠狀動脈病，自身免疫性耳病諸如自身免疫性內(nèi)耳病(AIED)、自身免疫性聽覺喪失，視性眼陣攣肌陣攣綜合征(OMS),多軟骨炎諸如頑固性或復(fù)發(fā)性多軟骨炎，肺泡蛋白沉著癥，淀粉樣變，鞏膜炎，非癌性淋巴細(xì)胞增多，原發(fā)性淋巴細(xì)胞增多包括單克隆B細(xì)胞淋巴細(xì)胞增多(例如良性單克隆丙種球蛋白病和性質(zhì)未確定的單克隆丙種球蛋白病(MGUS))，周圍神經(jīng)病，瘤外綜合征，通道病諸如癲癇、偏頭痛、心率失常、肌肉病癥、失聰、失明、周期性癱瘓和CNS的通道病，孤獨癥，炎性肌病，局灶性節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)，內(nèi)分泌性眼病，葡萄膜視網(wǎng)膜炎，脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜炎，自身免疫性肝臟病學(xué)病癥，纖維肌痛，多發(fā)性內(nèi)分泌衰竭，施密特氏(Schmidt)綜合征，腎上腺炎，胃萎縮，早老性癡呆，脫髓鞘病諸如自身免疫性脫髓鞘病和慢性炎性脫髓鞘性多神經(jīng)病，糖尿病腎病，德雷斯勒氏(Dressler)綜合征，斑禿，CREST綜合征(鈣質(zhì)沉著癥、雷諾氏(Raynaud)現(xiàn)象、食道運動功能障礙、指端硬化和毛細(xì)管擴張)，男性和女性自身免疫性不孕不育，混合性結(jié)締組織病，恰加斯氏(Chagas)病，風(fēng)濕熱，習(xí)慣性流產(chǎn)，農(nóng)民肺，多形紅斑，心臟切開術(shù)后綜合征，柯興氏(Cushing)綜合征，養(yǎng)鳥者肺，變應(yīng)性肉芽腫性血管炎，良性淋巴細(xì)胞性血管炎，阿爾波特氏(Alport)綜合征，肺泡炎諸如變應(yīng)性肺泡炎和纖維化肺泡炎，間質(zhì)性肺病，輸血反應(yīng)，麻風(fēng)，瘧疾，利什曼病，錐蟲病(kypanosomiasis),血吸蟲病，蟲回蟲病，曲霉病，Sampter氏綜合征，卡普蘭氏(Caplan)綜合征，登革，心內(nèi)膜炎，心內(nèi)膜心肌纖維化，彌漫性肺間質(zhì)纖維化，間質(zhì)性肺纖維化，肺纖維化，特發(fā)性肺纖維化，嚢性纖維化，目艮內(nèi)炎，持久隆起性紅斑(erythemaelevatumetdiutinum),月臺兒成紅細(xì)月包增多癥，嗜曙紅細(xì)胞性筋膜炎(faciitis)、舒爾曼氏(Shulman)綜合征，費爾提氏(Felty)綜合征，flariasis,睫狀體炎諸如慢性睫狀體炎、異時性睫狀體炎、虹膜睫狀體炎(急性或慢性)或Fuch氏睫狀體炎，亨諾-許蘭二氏(Henoch-Schonlein)紫癜，人免疫缺陷病毒(HIV)感染，艾柯病毒感染，心肌病，阿爾茨海默氏(Alzheimer)病，細(xì)小病毒感染，風(fēng)瘆病毒感染，種痘后綜合征，先天性風(fēng)滲感染，愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒感染、腮腺炎，埃文斯(Evans)綜合征，自身免疫性性腺衰竭，西登哈姆氏(Sydenham)舞蹈病，鏈球菌后腎炎，閉塞性血栓血管炎(thromboangitisubiterans),甲狀腺毒癥，脊髓癆，脈絡(luò)膜炎，巨細(xì)胞性多肌痛，內(nèi)分泌性眼病，慢性超敏感性肺炎，干燥性角膜結(jié)膜炎，流行性角膜結(jié)膜炎，特發(fā)性腎炎綜合征，微小病變腎病，良性家族性和缺血-再灌注損傷，視網(wǎng)膜自身免疫，關(guān)節(jié)炎癥，支氣管炎，慢性阻塞性氣道疾病，珪沉著病，口癡，口掩性口炎，動脈硬化性病癥，無精子發(fā)生(aspermiogenese)，自身免疫性溶血，伯克氏(Boeck)病，冷球蛋白血癥，杜普伊特倫氏(Dupuytren)攣縮，晶體過敏性目艮內(nèi)炎(endophthalmiaphacoanaphylactica),變應(yīng)性小腸炎(enteritisallergica),麻風(fēng)節(jié)結(jié)性紅斑，特發(fā)性面癱，l曼性疲乏綜合征，風(fēng)濕熱(febrisrheumatica),口合-里二氏(Hamman-Rich)病，感覺神經(jīng)性聽覺喪失，陣發(fā)性血紅蛋白尿(haemoglobinuriaparoxysmatica)，寸生A泉功能減退，局卩艮'l"生回腸炎(ileitisregionalis)，白細(xì)月包減少癥，傳染性單核細(xì)胞增多癥，橫貫性(traverse)脊髓炎，原發(fā)性特發(fā)性粘液水月中，腎病，交感性目艮炎(ophthalmiasymphatica),肉芽月中性睪丸炎(orchitisgranulomatosa)，胰腺炎，急性多神經(jīng)根炎，壞疽性膿皮癥，查爾萬氏(Quervain)甲狀腺炎，獲得性脾萎縮，由于抗精蟲抗體的不育癥，非惡性胸腺瘤，白癜風(fēng)，SCID和愛潑斯坦-巴爾(Epstein-Barr)病毒相關(guān)疾病，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS),寄生蟲病諸如利什曼蟲病，中毒性休克綜合征，食物中毒，涉及T細(xì)胞浸潤的疾患，白細(xì)胞粘附缺陷，與細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和遲發(fā)性超敏感性有關(guān)的免疫應(yīng)答，涉及白細(xì)胞滲出的疾病，多器官損傷綜合征，抗原-抗體復(fù)合物介導(dǎo)的疾病，抗腎小球基底膜病，變應(yīng)性神經(jīng)炎，自身免疫性多內(nèi)分泌病，卵巢炎，原發(fā)性粘液水腫，自身免疫性萎縮性胃炎，交感性眼炎，風(fēng)濕病，混合性結(jié)締組織病，腎病綜合征，胰島炎，多內(nèi)分泌衰竭，周圍神經(jīng)病，自身免疫性多腺性綜合征I型，成人期發(fā)作的特發(fā)性曱狀旁腺功能減退(AOIH),全禿，擴張型心肌病，獲得性大皰性表皮松解(epidermolisisbullosaacquisita，EBA),血色素沉著，心月幾炎，腎病綜合4正，原發(fā)性硬化性膽管炎，化膿性或非化膿性鼻竇炎，急性或慢性鼻竇炎，篩竇炎，額竇炎，上頜竇炎或蝶竇炎，嗜曙紅細(xì)胞相關(guān)病癥諸如嗜曙紅細(xì)胞增多癥、肺嗜曙紅細(xì)胞增多性浸潤、嗜曙紅細(xì)胞增多-肌痛綜合征、呂弗勒氏(Loffler)綜合征、慢性嗜曙紅細(xì)胞性肺炎、熱帶肺嗜曙紅細(xì)胞增多、支氣管肺曲霉病、曲霉胂、或含有嗜曙紅細(xì)胞的肉芽腫，過敏反應(yīng)，血清陰性脊推關(guān)節(jié)炎病，多內(nèi)分泌自身免疫病，硬化性膽管炎，鞏膜、鞏膜外層、慢性粘膜皮膚假絲酵母病，布魯頓氏(Bruton)綜合征，嬰兒期一過性低丙種球蛋白血癥，威斯科特-奧爾德里齊(Wiskott-Aldrich)綜合征，共濟失調(diào)性毛細(xì)管擴張，與以下各項有關(guān)的自身免疫性病癥膠原病、風(fēng)濕病、神經(jīng)病學(xué)疾病、'淋巴結(jié)炎、在夬血再灌注紊^L、血壓應(yīng)答降寸氐(reductioninbloodpressureresponse)、血管功能障礙、毛細(xì)管擴張(antgiectasis)、組織損傷、心血管缺血、痛覺過敏、腦缺血和伴隨血管化的疾病，變應(yīng)性超敏感性病癥，腎小球腎炎病，再灌注損傷，心肌或其它組織的再灌注損傷，具有急性炎性成分的皮膚病，急性化膿性腦膜炎或其它中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性病癥，眼和眶炎性病癥，粒細(xì)胞輸血相關(guān)綜合征，細(xì)胞因子誘發(fā)的中毒，急性重度炎癥，慢性頑固性炎癥，腎盂炎，肺硬變，糖尿病性視網(wǎng)膜病，糖尿病性大動脈病癥，動脈內(nèi)增生，消化性潰瘍，心瓣炎，和子宮內(nèi)膜異位癥。在具體的實施方案中，將人源化2H7抗體及其功能性片段用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)包括狼瘡腎炎、韋格納氏(Wegener)病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少癥、多發(fā)性硬化包括復(fù)發(fā)緩和性MS、4艮屑病、IgA腎病、IgM多神經(jīng)病、重癥肌無力、ANCA相關(guān)血管炎、糖尿病、雷諾氏(Reynaud)綜合征、斯耶格倫氏(Sjogren)綜合征、視神經(jīng)脊髓炎(NMO)和腎d、球腎炎。"處理"或"治療"或"減輕"指治療性處理，其中目標(biāo)是若不能治愈則減緩(減輕)所針對的病理學(xué)疾患或病癥或者預(yù)防疾患的復(fù)發(fā)。如果在依照本發(fā)明的方法接受治療量的本發(fā)明人源化CD20結(jié)合抗體后，患者在特定疾病的一項或多項體征和癥狀中顯示出可觀察和/或可測量的降低或消失，那么受試者成功"治療，，了自身免疫病或CD20陽性B細(xì)胞惡性腫瘤。例如，對于癌癥，顯著的癌細(xì)胞數(shù)減少或癌細(xì)胞消失；腫瘤體積縮小；腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)；腫瘤生長受到一定程度的抑制；消退期延長；和/或與特定癌癥有關(guān)的一種或多種癥狀得到一定程度的減輕；發(fā)病率和死亡率降低；及生命質(zhì)量提高。疾病的體征或癥狀的減輕還可以由患者感受到。治療可實現(xiàn)完全響應(yīng)，定義為癌癥的所有體征消失，或者部分響應(yīng)，其中腫瘤體積縮小，優(yōu)選超過50%,更優(yōu)選75%。若患者的病情得到穩(wěn)定，也認(rèn)為患者得到治療。在一項標(biāo)準(zhǔn)中，本發(fā)明的h2H7抗體實現(xiàn)〉95。/。的外周血B細(xì)胞消減且B細(xì)胞回到基線的25%。在優(yōu)選的實施方案中，用本發(fā)明抗體進(jìn)行的治療有效導(dǎo)致癌癥患者的癌癥在治療后4個月沒有發(fā)展，優(yōu)選治療后6個月，更優(yōu)選l年，甚至更優(yōu)選2年或更多年。用于評估疾病的成功治療和改善的這些參數(shù)易于通過本領(lǐng)域勝任的內(nèi)科醫(yī)師所熟悉的常M^流程來測量。"治療有效量"指抗體和藥物有效"治療"受試者中的疾病或病癥的量。就癌癥而言，藥物的治療有效量可減少癌細(xì)胞的數(shù)目；縮小腫瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上減緩，優(yōu)選阻止)癌細(xì)胞浸潤到周圍器官中；抑制(即在一定程度上減緩和優(yōu)選阻止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕一種或多種與癌癥有關(guān)的癥狀。參見前述"治療"的定義。就自身免疫病而言，治療有效量的抗體或其它藥物有效減輕疾病的體征禾口癥狀。用于評估瘤的治療功效或成果的參數(shù)將是在相應(yīng)疾病方面勝任的內(nèi)科醫(yī)師所知道的。通常，勝任的內(nèi)科醫(yī)師將期待特定疾病的體征和癥狀的減輕。參數(shù)可包括到病情穩(wěn)定、消退時間、疾病發(fā)展的中值時間。以下參考文獻(xiàn)記載了淋巴瘤和CLL、它們的診斷、治療和用于測量治療功效的標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)流程CanellosGP，Lister,TA,SklarJL，TTzeZ^mp/owos，W.B.SaundersCompany,Philadelphia,1998;vanBesienKandCabanillas,F,Chap.70,pp1293-1338，in://emao/ogy,6as7,c尸r/"c^/eaJ/Vac/7.ce,第3片反,Hoffmana/.(編),ChurchillLivingstone,Philadelphia,2000;及Rai,KandPatel,D,C7^o"/cZ3;mp/zoc3^/c丄eMA:e/w/a,Chap.72，pp1350-1362,in://emato/ogy,Sos7'c尸n'"一/es尸r"cdce,第3版，Hoffmana/.(編),ChurchillLivingstone,Philadelphia,2000。用于評估自身免疫病或自身免疫相關(guān)疾病的治療功效或成果的參數(shù)將是在相應(yīng)疾病方面勝任的內(nèi)科醫(yī)師所知道的。通常，勝任的內(nèi)科醫(yī)師會期待特定疾病的體征和癥狀的減輕。舉例如下。在一個實施方案中，將人源化2H7抗體和具體的hu2H7.v511及其功能性片段用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。RA是影響超過兩百萬美國人且阻礙受害者日常活動的虛弱性自身免疫病。當(dāng)身體的自身免疫系統(tǒng)不當(dāng)攻擊關(guān)節(jié)組織并引起破壞健康組織的慢性炎癥和關(guān)節(jié)內(nèi)損傷時發(fā)生RA。癥狀包括關(guān)節(jié)發(fā)炎、腫脹、僵硬和疼痛。另外，由于RA是系統(tǒng)性疾病，它可能對其它組織諸如肺、眼和骨髓有影響。還不知道有治愈的。治療包括多種類固醇和非類固醇抗炎藥、免疫抑制劑、減輕疾病的抗風(fēng)濕藥(DMARD)和生物制劑。然而，許多患者繼續(xù)對治療響應(yīng)不足?？贵w可用作早期RA(即未用過曱氨喋呤(MTX))患者中的一線療法，作為單一療法，或者聯(lián)合或在例如MTX或環(huán)磷酰胺之后。或者，抗體可作為二線療法用于治療DMARD和/或MTX耐受性患者，作為單一療法或者4關(guān)合例如MTX。人源化CD20結(jié)合抗體可用于預(yù)防和控制關(guān)節(jié)損傷，延遲結(jié)構(gòu)損傷，減輕與RA中的炎癥有關(guān)的疼痛，且通常減輕中度至重度RA中的體征和癥狀。RA患者可在用治療RA所用的其它藥物(參見下文的聯(lián)合療法)治療之前、之后或者與它們一起用人源化CD20抗體治療。在一個實施方案中，用本發(fā)明的人源化CD20結(jié)合抗體治療先前減輕疾病的抗風(fēng)濕藥失敗了和/或?qū)为毜臅醢编┻薯憫?yīng)不足的患者。在這種治療的一個實施方案中，患者在17天治療方案中接受單獨的人源化CD20結(jié)合抗體(第1天和第15天靜脈內(nèi)輸注lg);CD20結(jié)合抗體+環(huán)磷酰胺(第3天和第17天靜脈內(nèi)輸注750mg);或者CD20結(jié)合抗體+曱氨喋呤。因為身體在RA期間產(chǎn)生肺瘤壞死因子oc(TNFa)，所以TNFa抑制劑已用于治療該疾病。然而，TNFa抑制劑諸如依那西普(Etanercept,ENBREL)、英夫利昔單抗(Infliximab,REMICADE)和阿達(dá)木單抗(Adalimumab,HUMIRATM)可產(chǎn)生消極的副作用，諸如感染、心力衰竭和脫髓鞘。因此，在一個實施方案中，人源化CD20結(jié)合抗體或其生物學(xué)功能片段可作為例如一線療法用于治療RA患者以降低使用TNFa抑制劑藥物產(chǎn)生這些消極副作用的風(fēng)險，或者用于治療認(rèn)為傾向于發(fā)生中毒例如心臟中毒的患者。人源化CD20結(jié)合抗體或其生物學(xué)功能片段還可用于治療以下RA患者的方法已用TNFa抑制劑治療但沒有響應(yīng)的，對TNFa抑制劑響應(yīng)不足的(TNF-IR患者)，或者在響應(yīng)一段時間后病情復(fù)發(fā)的，或者確定為不太可能響應(yīng)TNFa抑制劑療法的RA患者。在一個實施方案中，在用TNFa抑制劑治療前先用低劑量諸如低于1OOmg治療TNF-IR。評估RA中的治療功效的一種方法以美國風(fēng)濕病學(xué)學(xué)會(AmericanCollegeofRheumatology,ACR)的標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，它測量觸痛和腫脹關(guān)節(jié)的改善百分比等。與無抗體處理(例如處理前的基線)或安慰劑處理相比，RA患者可評分為例如ACR20(20%改善)。評估抗體治療功效的其它方式包括X射線評分諸如用于對結(jié)構(gòu)損傷諸如骨侵蝕和關(guān)節(jié)腔變窄評分的SharpX射線評分。還可基于治療期間或之后各時期的健康評估問巻(HealthAssessmentQuestionnaire,HAQ)得分、AIMS得分、SF-36對患者評估失能的預(yù)防或改善。ACR20標(biāo)準(zhǔn)可包括觸痛(疼痛)關(guān)節(jié)數(shù)和胂脹關(guān)節(jié)數(shù)二者的20%改善+如下5項額外測量中至少3項的20%改善1.依據(jù)直觀類比標(biāo)度的患者疼痛評價(VAS)，2.疾病活性的患者整體評價(VAS),3.疾病活性的醫(yī)師整體評1介(VAS),4.由健康評估問巻測量的患者自我評價失能，和5.急性期反應(yīng)物，CRP或ESR。ACR50和70定義類似。優(yōu)選的是，對患者施用一定量的本發(fā)明CD20結(jié)合抗體，其足以實現(xiàn)至少ACR20的得分，優(yōu)選至少ACR30，更優(yōu)選至少ACR50，甚至更優(yōu)選至少ACR70,最優(yōu)選至少ACR75和更高。銀屑病關(guān)節(jié)炎具有唯一的和獨特的放射線照相特征。對于銀屑病關(guān)節(jié)炎，也可通過Sharp得分來評估關(guān)節(jié)侵蝕和關(guān)節(jié)空間變窄。本發(fā)明的人源化本發(fā)明的另一個方面是通過對患有SLE或狼瘡腎炎的患者施用治療有效量的本發(fā)明人源化CD20結(jié)合抗體來治療病癥的方法。SLEDAI得分提供了疾病活性的翁^直量化。SLEDAI是已知與疾病活性有關(guān)的24項臨床和實驗室參數(shù)的加權(quán)指數(shù)，數(shù)值范圍0-103。參見BryanGescuk&JohnDavis,"Noveltherapeuticagentforsystemiclupuserythematosus",in:Ciwe"f(9//m'ow/"i^ewmato/o^2002，14:515-521。其它評分方法包括BILAG評分。認(rèn)為針對雙鏈DNA的抗體引起腎發(fā)紅(renalflares)和狼瘡的其它表現(xiàn)?？蓪邮芸贵w治療的患者監(jiān)測到達(dá)腎發(fā)紅的時間(timetorenalflare)，這定義為血清月幾酸酐、尿液蛋白質(zhì)或尿液中血的顯著的、可重現(xiàn)的升高?；蛘?另外，可對患者監(jiān)測抗核抗體和針對雙鏈DNA的抗體的水平。SLE的治療包括高劑量的皮質(zhì)類固醇和/或環(huán)磷酰胺(HDCC)。在此，狼瘡的成功治療將減輕發(fā)紅(flare)，即降低嚴(yán)重性和/或減少到下一次發(fā)紅(flare)的時間。脊推關(guān)節(jié)病是一組關(guān)節(jié)病癥，包括強直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和克羅恩氏(Crohn)病。治療成果可通過經(jīng)過驗證的患者和醫(yī)師整體評估測量工具來測定。至于血管炎，大約75%的系統(tǒng)性血管炎病患者具有抗嗜中性粒細(xì)胞胞質(zhì)抗體并分屬于影響小的/中等大小血管的三種疾患之一韋格納氏肉芽腫(Wegener'sgranulomatosus，WG)、孩i觀多血管炎(microscopicpolyangiitis,MPA)和丘施二氏綜合征(ChurgStrausssyndrome,CSS),統(tǒng)稱ANCA相關(guān)血管炎(AAV)。銀屑病的治療功效通過監(jiān)測疾病的臨床體征和癥狀較之基線狀況的變化來評估，包括醫(yī)師整體評價(PGA)變化和銀屑病面積和嚴(yán)重性指數(shù)(PASI)得分、銀屑病癥狀評價(PSA)。可在整個治療期間在用于指示特定時間點經(jīng)受的發(fā)癢程度的直觀類比標(biāo)度上定期測量用本發(fā)明的人源化CD20結(jié)合抗體諸如hu2H7.v511治療的銀屑病患者。患者可能在他們首次輸注治療用抗體時經(jīng)受輸注反應(yīng)或輸注相關(guān)癥狀。這些癥狀的嚴(yán)重程度有所不同且通?？赏ㄟ^醫(yī)學(xué)干預(yù)逆轉(zhuǎn)。這些癥狀包括但不局限于流感樣發(fā)熱、寒戰(zhàn)/僵直、惡心、蕁麻滲、頭痛、支氣管痙攣、血管性水腫。對于本發(fā)明的疾病治療方法而言期望輸注反應(yīng)降至最低。為了減輕或最小化此類不利事件，患者可接受初始適應(yīng)或耐受劑量的抗體，隨后才是治療有效劑量。適應(yīng)劑量(conditioningdose)將低于治療有效劑量以使患者適應(yīng)而耐受更高劑量。^/量發(fā)一多根據(jù)待治療的適應(yīng)癥和本領(lǐng)域熟練內(nèi)科醫(yī)師所熟悉的與劑量給藥有關(guān)的因素，將以有效治療該適應(yīng)癥同時毒性和副作用降至最^^的劑量施用本發(fā)明的抗體。理想的劑量可能取決于疾病和疾病的嚴(yán)重程度、疾病的階段、期望的B細(xì)胞調(diào)控水平，及本領(lǐng)域熟練內(nèi)科醫(yī)師所熟悉的其它因素。對于自身免疫病的治療，可能希望根據(jù)疾病和/或個體患者中疾患的嚴(yán)重程度通過調(diào)整人源化2H7抗體的劑量來調(diào)控B細(xì)胞消減的程度。B細(xì)胞消減可以而非必須是完全的。或者，在最初的治療中可能期望全部B細(xì)胞消減，但在后續(xù)治療中可調(diào)整劑量以達(dá)到只有部分消減。在一個實施方案中，B細(xì)胞消減是至少20%,即與治療前的基線水平相比保留80%或更少的CD20陽性B細(xì)胞。在其它實施方案中，B細(xì)胞消減是25%、30%、40%、50%、60%、70%或更多。優(yōu)選的是，B細(xì)胞消減足以阻止疾病的發(fā)展，更優(yōu)選減輕處于治療中的具體疾病的體征和癥狀，甚至更優(yōu)選治愈疾病。Genentech和BiogenIdec的臨床調(diào)查評估了使用多劑范圍從低達(dá)10mg至高達(dá)lg—劑的抗CD20(hu2H7.v16和Rituximab)治療自身免疫病的治療效力(見關(guān)于Rituximab研究的背景部分；及WO04/056312,實施例16)。一般而言，在這些臨床調(diào)查中施用兩劑抗體，間隔約兩周。臨床調(diào)查中所研究的治療方案的例子包括人源化CD20抗體2H7.vl6用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時為2xl0mg(即2劑，每劑10mg;對于體重70kg、身高67英寸的患者，總劑量10.1mg/m2)、2x50mg(對于體重70kg、身高67英寸的患者，總劑量55mg/m2)、2x200mg(對于體重70kg、身高67英寸的患者，總劑量220mg/m2)、2x500mg(對于體重70kg、身高67英寸的患者，總劑量550mg/m2)、和2xl000mg(對于體重70kg、身高67英寸的患者，總劑量1100mg/m2);而Rituxan為2x500mg(對于體重70kg、身高67英寸的患者，總劑量550mg/m2)、2xl000mg(對于體重70kg、身高67英寸的患者，總劑量1100mg/m2)。在每個這些劑量，在施用第一劑抗體后觀察到實質(zhì)性的循環(huán)中B淋巴細(xì)胞消減。目前，還探索了通過1次或2次靜脈內(nèi)輸注施用的1Omg至2000mg的劑量范圍。在自身免疫病患者中治療自身免疫病和消減B細(xì)胞的本發(fā)明方法中，在一個實施方案中，以范圍為O.lmg至1000mg的1劑平劑量施用人源化2H7.v511抗體。我們發(fā)現(xiàn)在低于300mg,甚至10mg的平劑量實現(xiàn)了實質(zhì)性B細(xì)胞消減。如此，在本發(fā)明的B細(xì)月包消減和治療方法中，在不同的實施方案中，以O(shè).l、0.5、1、5、10、15、20、25、30、40、50、75、100、125、150、200或250mg的劑量施用hu2H7.v511抗體。如果目標(biāo)是部分或短期B細(xì)胞消減，那么可以使用較低劑量，例如20mg、10mg或更低。對于CD20陽性癌癥的治療，可能希望將作為本發(fā)明抗CD20抗體靶物的B細(xì)胞的消減最大化。如此，對于CD20陽性B細(xì)胞胂瘤的治療，希望B細(xì)胞消減至少足以阻止疾病的發(fā)展，這可以由本領(lǐng)域熟練內(nèi)科醫(yī)師來評估，例如通過監(jiān)測腫瘤生長(大小)、癌性細(xì)胞類型的增殖、轉(zhuǎn)移、具體癌癥的其它體征和癥狀。優(yōu)選的是，B細(xì)胞消減足以在至少2個月的時間里阻止疾病的發(fā)展，更優(yōu)選3個月，甚至更優(yōu)選4個月，更優(yōu)選5個月，甚至更優(yōu)選6個月或更多個月。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，B細(xì)胞消減足以將消退時間延長至少6個月，更優(yōu)選9個月，更優(yōu)選1年，更優(yōu)選2年，更優(yōu)選3年，甚至更優(yōu)選5年或更多年。在一個最優(yōu)選的實施方案中，B細(xì)胞消減足以治愈疾病。在優(yōu)選的實施方案中，癌癥患者中的B細(xì)胞消減是治療前基線水平的至少約75%且更優(yōu)選80%、85%、90%、95%、99%和甚至100%。hu2H7抗體包括vl6和v511用于治療NHL的臨床試驗的劑量用藥方案和劑量的例子記載于下文實驗性實施例18-20。以mg/劑計的劑量50、75、100、125、150、200、250、300、350mg/劑也可用于B細(xì)胞惡性腫瘤諸如NHL的維持療法。給藥頻率可隨若千因素變化。一般而言，通常將對患者施用至少2劑人源化2H7CD20結(jié)合抗體，在不同的實施方案中可接受2-4劑、2-8劑、2-10劑。通常，在一個月內(nèi)施用2劑，一般間隔l、2或3周。在針對腫瘤學(xué)的一種治療方案中，設(shè)想了8次靜脈內(nèi)輸注200mg/m2至750mg/m2之間的劑量。在針對RA的一種劑量給藥方案中，每6個月對患者施用2次各500mg人源化抗體諸如vl6、vll4或v511。針對RA的另一種劑量給藥方案是每9個月2次各1000mg。針對RA的第三種劑量給藥方案是每6個月2次各10mgvl6、v114或v511。根據(jù)疾病改善的水平或復(fù)發(fā)，可在整個患病期間施用更多劑或者作為疾病的維持療法。一種或多種現(xiàn)行療法無效、耐受不良或禁忌的自身免疫病或B細(xì)胞惡性腫瘤患者可以用任何本發(fā)明劑量給藥方案來治療。例如，本發(fā)明設(shè)想了將本發(fā)明的治療方法用于對腫瘤壞死因子(TNF)抑制劑療法或?qū)p輕疾病的抗風(fēng)濕藥(DMARD)療法響應(yīng)不足的RA患者。"長期"施用指與短期模式相反，以連續(xù)模式施用藥劑，從而將初始治療效果(活性)維持較長一段時間。"間歇"施用指不是無間斷連續(xù)進(jìn)行的治療，而是本質(zhì)上周期性的。人源化2H7抗體依照已知方法施用于人類患者，諸如通過靜脈內(nèi)施用，例如推注或通過連續(xù)灌注一^a時間，通過皮下、月幾肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)或吸入路徑，通常通過靜脈內(nèi)或皮下施用。通常，對于腫瘤學(xué)適應(yīng)癥，人源化2H7抗體配制劑通過靜脈內(nèi)路徑諸如輸注來施用。在一個實施方案中，人源化2H7抗體以0.9%氯化鈉溶液作為輸注媒介通過靜脈內(nèi)輸注來施用。在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的I/II期臨床試驗中，抗體配制劑通過靜脈內(nèi)輸注來施用(見實施例20)。在另一個實施方案中，人源化2H7抗體具體通過皮下注射來施用。在治療上述B細(xì)胞腫瘤時，患者可以用本發(fā)明的人源化2H7抗體與一種或多種治療劑諸如化療劑聯(lián)合的多藥物方案來治療。人源化2H7抗體可以與化療劑同時、序貫或交替施用，或者在其它療法無響應(yīng)后施用。用于淋巴瘤治療的標(biāo)準(zhǔn)化療可包括環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、美法侖(melphalan)、和米托蒽醌(mitoxantrone)+美法侖。CHOP是用于治療非何杰金氏淋巴瘤的最常用化療方案之一。以下是用于CHOP方案的藥物環(huán)磷酰胺(商標(biāo)Cytoxan,neosar);阿霉素(多柔比星/羥基多柔比星)；長春新堿(Oncovin);和潑尼松龍(有時稱為Deltasone或Orasone)。在具體的實施方案中，CD20結(jié)合抗體與一種或多種以下化療劑聯(lián)合施用于有所需要的患者多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼松龍。在一個具體的實施方案中，用本發(fā)明的人源化2H7抗體與CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新;咸和潑尼4公龍)療法聯(lián)合來治療淋巴瘤(諸如非何杰金氏淋巴瘤)患者。在另一個實施方案中，癌癥患者可以用本發(fā)明的人源化2H7CD20結(jié)合抗體聯(lián)合CVP(環(huán)磷酰胺、長春新堿和潑尼+〉龍)化療來治療。在一個具體的實施方案中，CD20陽性NHL患者施用人源化2H7.v511或v114聯(lián)合CVP，例如每三周一次進(jìn)行8個循環(huán)。在治療CLL的一個具體實施方案中，hu2H7.v511抗體與利用氟達(dá)拉濱(fludarabine)和環(huán)磷酰胺(cytoxan)之一或二者的化療聯(lián)合施用。"化療劑"指可用于治療癌癥的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?alkylatingagents),諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);石黃酉臾》克基酉旨類(alkylsulfonates),i者如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)禾口。底泊舒凡(piposulfan);氮丙。定類(aziridines)，^者3口苯佐替〉泉(benzodepa)、卡;皮酉昆(carboquone)、美妥替;泉(meturedepa)禾口烏5離替;泉(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemdamine)、三乙撐磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙才掌石克"f戈石舞酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);TLK286(TELCYTA);番荔枝內(nèi)酯類(acetogenins)(尤其是布4立4也辛(bullatacin)禾口布^立j也辛酉同(bullatacinone));S-9匿四氫大麻酚(tetrahydrocannabino1)(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL);p-4i帕酉昆(lapachone);^立帕醇(lapachol);一火7K仙素類(colchicines);白樺月旨酸(betulinicacid);喜沖對石咸(camptothecin)(包i舌合成類似、物4乇泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜樹石威、東莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹石成)；苫蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(pod叩hyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苦(teniposide);隱'蓬素類(cryptophycins)(凈+另ll是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;海纟帛抑素(spongistatin);氮芥類(nitrogenmustards),諸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、茶氮芥(chlornaphazine)、月旦石壽醜胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、鹽酉臾氧氮齊(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥月旦甾酉孚(phenesterine)、潑尼莫司〉'丁(prednimustine)、曲碌胺(trofosfamide)、尿嘧口足氮芥(uracilmustard);亞竭脲類(nitrosoureas),諸如卡莫司^丁(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(mnimustine);二騰酉史鹽類(bisphosphonates)，i者i口氣騰酉炱鹽(clodronate);it生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(例如加利車霉素(calicheamicin)，尤其是加利車霉素yll和加利車霉素coll(參見例如Agnew,C/zem.￡d33:183-186(1994))和蒽環(huán)類抗生素(anthracyclines)諸如annamycin、AD32、alcarubicin、柔紅霉素(daunorubicin)、右雷佐生(dexrazoxane)、DX-52-l、表柔比星(epirubicin)、GPX-IOO、伊達(dá)比星(idarubicin)、KRN5500、美諾立爾(menogaril)、dynemicin包4舌dynemicinA、^矣其斤;皮霉素(esperamicin)、壽斤制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團(tuán)和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團(tuán)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放線菌素(actinomycin)、氛茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氛酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、;改線菌素D(dactinomycin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN⑧多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎淋代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、多柔比星脂質(zhì)體和脫氧多柔比星)、依索比星(esorubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、噤吟霉素(puromycin)、三4失阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、《連黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)和佐柔比星(zorubicin);葉酸類似、物，i者如二曱葉酸(denopterin)、蝶羅呤(pteropterin)和三曱曲沙(trimetrexate);噪呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基。票呤(mercaptopurine)、辟b咪噤呤(thiamiprine)和石克鳥噤呤(thioguanine);嘧"定類似物，^"如安西4也濱(ancitabine)、阿4L月包苦(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苦(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿芬(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)和氟尿苦(floxuridine);雄激素類，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他力#酮(dromostanolonepropionate)、表石危名食醇(epitiostanol)、美雄坑(mepitiostane)和睪內(nèi)酉旨(testolactone);抗腎上&泉類，i者如氨魯米特(aminoglutethimide)、4U乇坦(mitotane)和曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑，如亞葉酸(folinicacid)(leucovorin);醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone);抗葉酸抗瘤劑，諸如ALIMTA、LY231514培美曲塞(pemetrexed)、二氫葉酸還原酶抑制劑諸如曱氨喋呤(methotrexate),抗代謝物類，諸如5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)及其前藥諸如UFT、S-l和卡培他濱(capecitabine),及胸苷酸合酶抑制劑和甘氨酰胺核糖核苷酸甲?；D(zhuǎn)移酶抑制劑諸如雷替曲塞(raltitrexed)(TOMUDEX,TDX);二氫嘧啶脫氫酶抑制劑諸如恩尿嘧啶(eniluracil);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氛基乙酰丙酸(aminolevulinicacid);安吖口定(amsacrine);bestrabucil;比生群(bisantrene);依達(dá)曲沙(edatraxate);地石夕,酰胺(defosfamide);;也美可辛(demecolcine);J也口丫酉昆(diaziquone);elfornithine;依利醋銨(elliptiniumacetate);埃坡霉素(epothilone);依托格魯(etoglucid);硝酸4家；羥脲(hydroxyurea);香恭多斗唐(lentinan);氯尼達(dá)明(lonidamine);美登木素生物石威類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米4乇脈月宗(mitoguazone);米4乇蒽酉昆(mitoxantrone);莫派達(dá)醇(mopidamol);二胺硝吖口定(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);處柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖復(fù)合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);才艮審素(rhizoxin);西佐喃(sizofiran);螺》炎4者(spirogermanium);纟田交《連孑包菌酮酸(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2，2'，2"-三氯三乙胺；單端孑包菌素類(trichothecenes)(尤其是T畫2毒素、祝孑包菌素(verrucarin)A、^f干孑包菌素(roridin)A禾口蟲它4亍菌素(anguidin));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);達(dá)卡巴口秦(dacarbazine);甘露莫司';丁(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛酉享(mitolactol);口底泊；臭》克(pipobroman);gacytosine;阿斗唐月包香(arabinoside)("Ara-C");環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);塞替派(thiotepa);類紫杉醇類(taxoids)和紫杉烷類(taxanes),例如TAXOL⑧紫杉醇(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄)、ABRAXANEtm不含克列莫佛(Cremophor),清蛋白改造的納米顆粒劑型紫杉醇(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg，Illinois)和TAXOTERE多西他塞(docetaxel)(Rh6ne陽PoulencRorer,Antony,France);苯丁酸氮芬(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR);6-碌b鳥噤呤(thioguanine);巰基噤呤(mercaptopurine);柏(platinum);鉑類似物或基于鉑的類似物，諸如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)禾口卡4白(carboplatin);長春石威(vinblastine)(VELBAN);依^乇泊苦(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長春新石咸(vincristine)(ONCOVIN);長春花生物堿類(vincaalkaloid);長春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE);能滅瘤(novantrone);依達(dá)曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氨基蝶呤(aminopterin);希羅達(dá)(xeloda);伊本膦酸鹽(ibandronate);拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);類視黃酸(retinoid)，諸如一見黃酸(retinoicacid);任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新石威和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)聯(lián)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。該定義還包括作用為調(diào)節(jié)或抑制激素對腫瘤作用的抗激素劑，諸如抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑類(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON⑧托瑞米芬(toremifene);抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE醋酸曱地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN⑧依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唾(fadrozole)、RIVISOR伏氯唑(vorozole)、FEMARA來曲唑(letrozole)和ARIMIDEX阿那曲唑(anastrozole);抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、比卡米特(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin);以及曲沙他濱(troxacitabine)(1，3-二氧戊環(huán)核苷胞嗜啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是那些抑制涉及粘附細(xì)胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達(dá)的，諸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID⑧疫苗；PROLEUKINrlL-2;LURTOTECAN⑧拓樸異構(gòu)酶1抑制劑；ABARELIXrmRH;及任何上述物質(zhì)的藥劑學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。此外，hu2H7抗體及其功能性片段可以與抗腫瘤血管發(fā)生劑諸如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)拮抗劑聯(lián)合用于治療表達(dá)CD20的B細(xì)胞腫瘤(例如NHL)。"抗血管發(fā)生劑"或"血管發(fā)生抑制劑，，指或直接或間接的抑制血管發(fā)生(angiogenesis,vasculogenesis)、或不想要的血管通透'1"生的小分子量物質(zhì)、多核苷酸、多肽、分離的蛋白質(zhì)、重組蛋白、抗體、或其偶聯(lián)物或融合蛋白。VEGF的抗體、VEGF受體的抗體、阻斷VEGF受體發(fā)信號的小分子(例如PTK787/ZK2284,SU6668)。"VEGF拮抗劑"指能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF活性，包括其與一種或多種VEGF受體結(jié)合的分子。在一個實施方案中，患有此類B細(xì)胞肺瘤的患者用2H7.v511或2H7.vll4聯(lián)合Avastin(bevacizumab;Genentech)進(jìn)4亍治療。4元VEGF4元體"貝4戈單抗，，(bevacizumab,BV)，又稱為"rhuMAbVEGF"或"Avastin⑧"，是依照Presta"a/"C""ceriw.57:4593-4599(1997)產(chǎn)生的重組人源化抗VEGF單克隆抗體。hu2H7抗體及其功能性片段，在特定實施方案中是2H7.v511和2H7.vl14,也可與TNF細(xì)胞因子家族的成員諸如Apo-2配體(Apo2L)又稱為TRAIL耳關(guān)合用于治療表達(dá)CD20的B細(xì)胞肺瘤的方法。全長天然序列人Apo-2配體是長度為281個氨基酸的，腫瘤壞死因子細(xì)胞因子家族的II型跨膜蛋白質(zhì)?？扇苄问降腁po-2配體，諸如包含胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)或其部分的那些，已發(fā)現(xiàn)在哺乳動物癌細(xì)胞中具有多種活性，包括凋亡活性。Apo2L/TRAIL(記載于WO97/01633和WO97/25428)是作為ECD的片^殳的可溶性人蛋白質(zhì)，包含全長Apo-2L蛋白質(zhì)的氨基酸114-281。在治療上文所述自身免疫病或自身免疫相關(guān)疾患時，患者可以用一種或多種hu2H7抗體諸如hu2H7.v511聯(lián)合第二種治療劑諸如免疫抑制劑，諸如以多藥物方案進(jìn)行治療。hu2H7抗體可以與免疫抑制劑同時、序貫或交替施用，或者在其它療法無響應(yīng)后施用。免疫抑制劑可以以與本領(lǐng)域所列相同或較低的劑量施用。優(yōu)選的輔助免疫抑制劑取決于許多因素，包括所治療病癥的類型以及患者的病史。"免疫抑制劑"在本文中用于輔助療法時指作用為抑制或掩蓋患者的免疫系統(tǒng)的物質(zhì)。此類藥劑將包括抑制細(xì)胞因子生成、下調(diào)或抑制自身抗原表達(dá)、或掩蓋MHC抗原的物質(zhì)。此類藥劑的例子包括類固醇，諸如糖皮質(zhì)類固醇，例如潑尼;^(prednisone)、曱潑尼龍(methylprednisolone)和J也塞米^"(dexamethasone);2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧咬(參見美國專利No.4,665,077);碌b口坐噤口令(azathioprine)(或環(huán)石舞酰胺(cyclophosphamide),長口果只十碌^坐噤口令有不良反應(yīng)的話)；溴隱亭(bromocryptine);戊二醛(它掩蓋MHC抗原，如美國專利No.4,120,649中記載的)；針對MHC抗原和MHC片段的抗獨特型抗體；環(huán)孢菌素A;細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體拮抗劑，包括抗干擾素，、-(3或-a抗體；抗腫瘤壞死因子-a抗體；抗腫瘤壞死因子-p抗體；抗白介素-2抗體和抗IL-2受體抗體；抗L3T4抗體；異源抗淋巴細(xì)胞球蛋白；泛(pan)T抗體，優(yōu)選抗CD3或抗CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結(jié)合域的可溶性肽(WO90/08187，公布于90年7月26日)；鏈激酶；TGF-卩；鏈道酶；來自宿主的RNA或DNA;FK506;RS-61443;脫氧精胍菌素(deoxyspergualin);雷帕霉素(rapamycin);T細(xì)胞受體(美國專利No.5,114,721);T細(xì)胞受體片段(Offner5We"ce251:430-432(1991);WO90/11294;WO91/01133);及T細(xì)胞受體抗體(EP340,109),諸如T10B9。對于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，患者可以用CD20結(jié)合抗體(諸如rituximab或ocrelizumab或其變體)耳關(guān)合一種或多種以下藥物進(jìn)行治療DMARD(減輕疾病的抗風(fēng)濕藥)(例如曱氨喋呤)、NSAI或NSAID(非類固醇抗炎藥)、免疫抑制劑(例如碌^唑嘌呤(azathioprine);霉酚酸嗎乙酯(mycophenolatemofetil,CellCept;Roche))、鎮(zhèn)痛藥、糖皮質(zhì)類固醇、環(huán)磷酰胺、HUMIRA(阿達(dá)木單抗，adalimumab;AbbottLaboratories)、ARAVA(來氟米特，leflunomide)、REMICADE(英夫利昔單抗，infliximab;CentocorInc.,Malvern,Pa)、ENBREL(依那西普，etanercept;Immunex,WA)、ACTEMRA(tocilizumab;Roche,Switzerland),COX-2抑制劑。通常用于RA的DMARD是羥氯喹(hydroxychloroquine)、柳氮石黃。比口定(sulfasalazine)、曱氨口萊"^(methotrexate)、來氟米特(leflunomide)、依那西普(etanercept)、英夫利昔單抗(infliximab)、石克唑噤呤(azathioprine)、D-青霉胺、金(Gold)(口服)、金(GoW)(肌肉內(nèi))、米諾環(huán)素(minocycline)、環(huán)孢霉素(cyclosporine)、葡萄球菌蛋白A免疫吸附。阿達(dá)木單抗(Adalimumab)是結(jié)合TNFa的人單克隆抗體。英夫利昔單抗(Infliximab)是結(jié)合TNFa的嵌合小鼠-人單克隆抗體。它是治療RA和克羅恩氏病的免疫抑制性藥物，處方藥。已經(jīng)將英夫利昔單抗與致死性反應(yīng)聯(lián)系起來，諸如心力衰竭和感染，包括結(jié)核病，以及導(dǎo)致MS的脫髓鞘。Actemra(tocilizumab)是人源化抗人白介素-6(IL-6)受體。依那西普(Etanercept)是"免疫粘附素"融合蛋白，由人75kD(p75)腫瘤壞死因子受體(TNFR)的胞外配體結(jié)合部分與人IgGl的Fc部分相連而組成。依那西普(ENBREL⑧)是在美國批準(zhǔn)用于活動性RA療法的可注射藥物。依那西普結(jié)合TNFa并承擔(dān)從關(guān)節(jié)和血液中除去大部分TNFa,由此阻止TNFa促進(jìn)炎癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的其它癥狀的作用。已經(jīng)將該藥與負(fù)面副作用聯(lián)系起來，包括嚴(yán)重的感染和膿毒癥、神經(jīng)系統(tǒng)病癥諸如多發(fā)性硬化(MS)。參見i"列i口www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel—embrel.html。只十于RA的常夫見治療，參見例如"Guidelinesforthemanagementofrheumatoidarthritis",JW/zn'toi/ewma^ym46(2):328-346(February,2002)。在一個具體的實施方案中，用本發(fā)明的hu2H7CD20抗體耳關(guān)合曱氨喋呤(MTX)來治療RA患者。MTX的例示劑量是大約7.5-25mg/kg/周。MTX可通過口服和皮下施用。在一個實施例中，患者還接受伴隨的MTX(10-25mg/周，口服或腸胃外)，以及組成如下的皮質(zhì)類固醇方案曱潑尼龍，100mg，靜脈內(nèi)，輸注CD20抗體前30分鐘及潑尼松，60mg，口服，第2-7天；30mg，口服，第8-14天；回到基線劑量，到第16天?；颊哌€可以接受葉酸(5mg/周)，或是作為單劑或是作為分開的日劑量?；颊呷芜x在整個治療期間繼續(xù)接受任何背景皮質(zhì)類固醇(10mg/天潑尼松或等效物)。對于強直性脊柱炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎和克羅恩氏病的治療，可以用本發(fā)明的CD20結(jié)合抗體聯(lián)合例如Remicade(英夫利昔單抗infliximab;CentocorInc.,Malvern,Pa)、ENBREL(依那西普etanercept;Immunex,WA)來治療患者。SLE的治療包括CD20抗體與高劑量皮質(zhì)類固醇和/或環(huán)磷酰胺(HDCC)的聯(lián)合?；加蠸LE、AAV和NMO的患者可以用本發(fā)明的2H7抗體耳關(guān)合任何以下藥物進(jìn)行治療皮質(zhì)類固醇、NSAID、鎮(zhèn)痛藥、COX-2抑制劑、糖皮質(zhì)類固醇、常規(guī)DMARD(例如曱氨喋呤、柳氮磺吡啶、羥氯喹、來氟米特)、生物的DMARDi!4口^tBlys(例j口belimumab)、4元IL6R例力口tocilizumab、CTLA4-Ig(abatacept)、抗CD22例如依帕珠單抗(epratuzumab)、免疫抑制劑(例如硫唑。票呤；霉酚酸嗎乙酯(CdlCept⑧；Roche))、及細(xì)胞毒劑(例如環(huán)磷酰胺)。對于銀屑病的治療，患者可施用人源化2H7抗體聯(lián)合局部治療，諸如局部類固醇、蒽啉(anthralin)、卡泊三烯(calcipotriene)、氯倍他索(clobetasol)和他扎羅汀(tazarotene),或者聯(lián)合曱氨喋呤、類視黃酸、環(huán)孢霉素、PUVA和UVB療法。在一個實施方案中，序貫或同時用人源化2H7抗體和環(huán)孢霉素治療銀屑病患者。本發(fā)明的hu2H7抗體，特別是hu2H7.v511和hu2H7.vl14可聯(lián)合BAFF拮抗劑同時、序貫或在交替的方案中用于治療自身免疫病或B細(xì)胞腫瘤。BAFF和BAFF拮抗劑定義如上。在一個實施方案中，BAFF拮抗劑是結(jié)合人BR3的抗體，該抗體優(yōu)選是人源化的、人的或嵌合的。在另一個實施方案中，BAFF拮抗劑是BR3-Fc融合蛋白?？笴D20抗體與BAFF拮抗劑在消減B細(xì)胞方面的協(xié)同作用已有報道(參見例如WO05/000351，s甲ra;Gong"a/"乂/畫畫/.174:817-826(2005))。為了將毒性降至最低，可以以輪回的、序貫的、聯(lián)合的或間歇的治療方案施行傳統(tǒng)的系統(tǒng)性療法，或者是hu2H7CD20結(jié)合抗體組合物釆用當(dāng)前劑量的較低劑量聯(lián)合方案。藥用配制劑依照本發(fā)明使用的hu2H7CD20結(jié)合抗體的治療用配制劑通過將具有期望純度的抗體與任選的藥劑學(xué)學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑CRem/"gto"'si^armace幼'ca/5We"ce，第16版，Osol,A.編(1980))混合，以凍千配制劑或水溶液的形式制備?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二曱基千基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；對羥基苯曱酸烷基酯，諸如對羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(少于約IO個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEENTM、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。例示性的hu2H7抗體配制劑記載于WO98/56418中，在此明確收入作為參考。另一種配制劑是液態(tài)多劑配制劑，包含40mg/mLhu2H7抗體，25mM乙酸鹽，150mM海藻糖，0.9%苯曱醇，0.02%聚山梨醇酉旨20pH5.0，最小保存期是在2-8。C保存兩年。另一種感興趣的抗CD20抗體配制劑在9.0mg/mL氯化鈉，7.35mg/mL二水合檸檬酸鈉，0.7mg/mL聚山梨醇酯80，和注射用無菌水pH6.5中包含10mg/mL抗體。還有一種含水藥用配制劑包含10-30mM乙酸鈉，大約pH4.8至大約pH5.5優(yōu)選pH5.5,作為表面活性劑的大約0.01-0.1%v/v量的聚山梨醇酯，大約2-10。/。w/v量的海藻糖,和作為防腐劑的苯曱醇(U.S.6,171,586)。適于皮下施用的凍干配制劑記載于WO97/04801。此類凍干配制劑可用合適的溶劑重建至高蛋白質(zhì)濃度，重建的配制劑可皮下施用于本文中待治療的哺乳動物。在一個具體的實施方案中，人源化2H7.vl6的一種靜脈內(nèi)配制劑是20mM乙酸鈉，4%二水合海藻糖，0.02。/。聚山犁醇酯20(Tween20)pH5.3中的30mg/ml抗體。該靜脈內(nèi)配制劑可施用于腫瘤學(xué)適應(yīng)癥諸如NHL以及用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。人源化2H7.v511變體的一種配制劑是10mM硫酸組氨酸，60mg/ml蔗糖(6%),0.2mg/ml聚山犁醇酯20(0.02%)，和注射用無菌水pH5.8中的15-30mg/ml抗體，優(yōu)選20mg/mL抗體。在另一個實施方案中，2H7變體，具體是2H7.v511的配制劑是20mg/ml2H7，20mM乙酸鈉，4%二水合海藻糖，0.02%聚山犁醇酯20pH5.5,供靜脈內(nèi)施用。該配制劑可用于單一靜脈內(nèi)輸注。2H7.vl14的一種配制劑是20mM乙酸鈉，240mM(8%)二水合海藻糖，0.02%聚山犁醇酯20pH5.3中的15-25mg/ml抗體，優(yōu)選20mg/ml。本文中的配制劑還可含有超過一種所治療具體適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選那些活性互補且彼此沒有不利影響的化合物。例如，可能希望進(jìn)一步提供細(xì)胞毒劑、化療劑、細(xì)胞因子或免疫抑制劑(例如作用于T細(xì)胞的免疫抑制劑，諸如環(huán)孢霉素或結(jié)合T細(xì)胞的抗體，例如結(jié)合LFA-1的抗體)。此類其它藥劑的有效量取決于配制劑中存在的抗體的量、疾病或病癥或治療的類型、及上文討論的其它因素。這些通常是以與本文所述相同的劑量，以本文所述施用路徑而使用的，或是迄今所采用的劑量的大約1-99%?；钚猿煞诌€可包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠嚢中(例如分別是羥甲基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酉旨)微膠嚢)，在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)，或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)披露于例如Wew/"gto"k戶/2(armacew"ca/iSc/ec&,第16片反,Osol,A.纟扁(1980)?？芍苽涑掷m(xù)釋放制劑。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有拮抗劑的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，該基質(zhì)是定型產(chǎn)品的形式，例如薄膜或微膠嚢。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酉旨(美國專利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞;沐構(gòu)成的可注射孩i球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可容易的通過使用無菌濾膜過濾來實現(xiàn)。制品和試劑盒本發(fā)明的另一個實施方案是包含可用于治療自身免疫病和相關(guān)疾患和CD20陽性癌癥諸如非何杰金氏淋巴瘤的物質(zhì)的制品。所述制品包括容器及容器上或與容器相關(guān)的標(biāo)簽或包裝插頁。合適的容器包括例如藥瓶、藥管、注射器等。所述容器可以用多種材料制成，諸如玻璃或塑料。所述容器裝有有效治療所述疾患的組合物，可以具有無菌存取口(例如所述容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或帶有皮下注射針可刺穿的塞子的藥瓶)。所述組合物中的至少一種活性藥劑是hu2H7抗體，例如本發(fā)明的hu2H7.v511。所述標(biāo)簽或包裝插頁指明該組合物用于治療所述具體疾患。所述標(biāo)簽或包裝插頁進(jìn)一步包含關(guān)于對患者施用所述抗體組合物的說明書。包裝插頁指通常包括在治療用產(chǎn)品商品化包裝中的說明書，它包含有關(guān)此類治療用產(chǎn)品使用的適應(yīng)癥、用法、劑量、施用、禁忌和/或警告信息。在一個實施方案中，包裝插頁指明該組合物用于治療非何杰金氏淋巴瘤。另外，所述制品可進(jìn)一步包括第二容器，其中裝有藥劑學(xué)可接受緩沖液，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩沖鹽水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它可進(jìn)一步包括從商業(yè)和用戶立場出發(fā)需要的其它物質(zhì)，包括其它緩沖液、稀釋劑、濾器、針和注射器。還提供了可用于各種目的的試劑盒，例如用于B細(xì)胞殺傷測定法，用作凋亡測定法的陽性對照，用于從細(xì)胞中純化或免疫沉淀CD20。為了分離和純化CD20,所述試劑盒可包含與珠子(例如sepharose珠子)偶聯(lián)的hu2H7.v511抗體?？商峁┌糜贑D20體外檢測和定量的抗體，例如在ELISA或Western印跡中進(jìn)行的。與制品一樣，所述試劑盒包括容器及容器上或與容器相關(guān)的標(biāo)簽或包裝插頁。所述容器裝有包含至少一種本發(fā)明抗CD20抗體的組合物?？砂ㄑb有例如稀釋劑和緩沖液、對照抗體的別的容器。所述標(biāo)簽或包裝插頁可提供該組合物的描述以及意圖體外或診斷使用的說明書。實驗性實施例小鼠人CD20(hCD20)+小鼠的產(chǎn)生是通過使用摻入了hCD20基因座的細(xì)菌人工染色體(BAC)實現(xiàn)的。將陽性BAC克隆注入衍生自FVB小鼠的胚泡以產(chǎn)生表達(dá)hCD20的轉(zhuǎn)基因(Tg)建立者品系。參閱Gongetal.(2005)J.Immunol.174:817-826中有關(guān)hCD20Tg+小鼠的產(chǎn)生和表征的詳細(xì)描述。hCD20Tg+小鼠隨后與hCD16Tg+mCD16^交配以產(chǎn)生hCD20Tg+mCD16一hCD16Tg+小鼠，用于下文所述的研究?？贵w用于FACS分析的所有抗體均購自BDPharMingen。設(shè)備/軟件FACS分析使用FACScan或FACSCalibur機器并利用購自BectonDickinson的CellQuest軟件進(jìn)行。單細(xì)胞懸浮液的制備用裝有EDTA的管子自眼眶收集50^1小鼠血液，隨后用ACK溶胞緩沖液(購自Biosource)溶解紅細(xì)胞。將它們?nèi)コ?，用毛玻璃載玻片(frostedglassslide)將小鼠脾臟顆?；蓡渭?xì)胞懸浮液。然后洗滌細(xì)胞沉淀物，重懸并過濾。用5ml冷的PBS清洗每只小鼠的腹腔。用5ml注射器回收灌洗液隨后離心。然后洗滌來自小鼠血液、脾臟和腹膜的白細(xì)胞并計數(shù)，然后染色供FACS分析。FACS染色將大約lxl(^個細(xì)胞在100(11磷酸鹽緩沖鹽水+1%清蛋白(Sigma)中針對各種細(xì)胞表明標(biāo)記物(參見FACS分析中的定義)進(jìn)行染色。在冰上放置30分鐘后，將已染色細(xì)胞洗滌并重懸，然后進(jìn)行FACS分析。FACS分析FACS分析是使用FACScan或FACSCalibur及CellQuest軟件進(jìn)行的。血液B細(xì)胞限定為CD21+CD23+;腹膜B細(xì)胞限定為CD19+;脾臟B細(xì)胞限定為B220+;MZ(邊緣區(qū))B細(xì)胞限定為CD21*CD23及FO(濾泡)B細(xì)月包限定為CD21+CD23*。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(11=5)。統(tǒng)計學(xué)分析采用雙軌不成對T檢驗(two-tailunpairedTtest)來進(jìn)行。實施例1:2H7抗CD20鼠單克隆抗體的人源化鼠抗人CD20抗體2H7(在本文中也稱為m2H7，m指小鼠)的人源化是以一系列定點誘變步驟而進(jìn)行的。鼠2H7抗體可變區(qū)序列及具有小鼠V區(qū)和人C區(qū)的嵌合2H7已有記載，參見例如美國專利5，846，818和6,204,023。通過比較鼠2H7可變域的氨基酸序列(披露于U.S.5，846，818)與已知抗體的序歹寸(Kabatetal.,Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,Ed.5.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD(1991》鑒定了2H7的CDR殘基。基于序列高變性(Kabatetal.,同上文)P艮定了輕鏈和重鏈的CDR區(qū)并分別如圖1A和圖1B所示。利用合成的寡核苦酸(表1)，通過定點誘變(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.82:488-492(1985))將所有6個鼠2H7CDR區(qū)導(dǎo)入質(zhì)粒pVX4(參見WO04/056342的圖2，在此完整收入該PCT出版物作為參考)中所包含的、與共有序列vj、VHm(VtK亞型i，VH亞型ni)相對應(yīng)的完整人Fab框架。噬菌粒pVX4用于"i秀變及在大腸桿菌中表達(dá)F(ab)s。以噬菌粒pb0720,pB0475(Cunninghametal.，Science243:1330-1336(1989))的一種衍生物為基礎(chǔ)，pVX4包含編碼人源化共有K亞型I輕鏈(VLKl-CO和人源化共有亞型III重鏈(VHlII-CHl)抗IFN-a(干擾素a)抗體的DNA片段。pVX4還具有堿性磷酸酶啟動子和Shine-Dalgamo序列，二者均衍生自先前記載的另一種基于pUC119的質(zhì)粒pAK2(Carteretal"Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285(1992))。在編碼F(ab)輕鏈和重鏈的DNA之間引入唯一的Spel限制性位點?？笽FN-a重鏈和輕鏈二者的前23個氨基酸是5m分泌信號序列(Changetal.,Gene55:189-196(1987》。為了構(gòu)建CDR交換型式的2H7(2H7.v2)，用含脫氧尿苷的pVX4模板進(jìn)行定點誘變；抗IFN-a的所有6個CDR均變成鼠2H7CDR。所得分子稱為人源化2H7型式2(2H7.v2)或者2H7的"CDR交換型式"；它具有圖1A和IB所示的m2H7CDR殘基及共有人FR殘基。將人源化2H7.v2用于進(jìn)一步的人源化。表3顯示了用于創(chuàng)建H和L鏈中每一個鼠2H7(m2H7)CDR的寡核苦酸序列。例如，CDR-H1寡核苷酸用于重建m2H7H鏈CDR1。CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3分別指H鏈CDR1、CDR2和CDR3;同樣的，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3指各個L鏈CDR。CDR-H2中的替代是用兩種寡核苷酸CDR-H2A和CDR-H2B以兩步進(jìn)行的。表3:用于將鼠2H7CDR通過CDR交換摻入pVX4中的人框架的寡核苷酸序列。由每個寡核苷酸改變的殘基以下劃線標(biāo)示。替代寡核苷酸序列CDR畫HlCTACACCTTCACGAGCTATAACATGCACTGGGTCCG(SEQIDNO.35)CDR-H2AGATTAATCCTGACAACGGCGACACGAGCTATAACCAGAAGTTCAAGGGCCG(SEOIDNO,36)CDR-H2BGACAC(SEQIDNO.37)CDR-H3ATTATTGTGCTCGAGTGGTCTACTATAGCAACAGCTACTGGTACTTCGACGTCTGGGGTCAA<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>為了與人源化構(gòu)建體比較，通過定點誘變(Kunkel,同上文)構(gòu)建了表達(dá)嵌合2H7Fab(包含鼠V^和Vh結(jié)枸域及人Cl和Ch1結(jié)構(gòu)域)的質(zhì)粒，其中利用合成的寡核苷酸將鼠框架殘基引入2H7.v2。所得質(zhì)粒構(gòu)建體用于表達(dá)稱為2H7.v6.8的嵌合Fab,如WO04/056342中圖3所示。Fab的每一條所編碼的鏈具有上文關(guān)于pVX4所描述的23個氨基酸的分泌信號序列。根據(jù)鼠2H7框架殘基與人VKI、VHIII共有框架(圖1A和IB)及先前的人源化抗體(Carteretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285-4289(1992))的比較，通過定點誘變將若干框架突變引入2H7.v2Fab構(gòu)建體。這些突變導(dǎo)致在可能影響CDR構(gòu)象或抗原接觸的位點某些人共有框架殘基改變成在鼠2H7框架中找到的那些殘基。型式3包含VH(R71V,N73K),型式4包含VH(R71V),型式5包含VH(R71V,N73K)和Vl(L46P)，而型式6包含VH(R71V，N73K)和VL(L46P,L47W)。m2H7抗體的人源化和嵌合Fab型式如下在大腸桿菌中表達(dá)并純化。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸才干菌菌才朱XL-lBlue(Stratagene,SanDiego,CA),用于制備雙鏈和單鏈DNA。對于每種變體，輕鏈和重鏈二者都用雙脫氧核苷酸法(Sequenase，U.S.BiochemicalCorp.)進(jìn)行完整測序。將質(zhì)4立轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌抹16C9,MM294的一種衍生林，鋪于含5嗎/ml羧芐青霉素的LB平板上，挑選單菌落用于蛋白質(zhì)表達(dá)。將單菌落在5mlLB-100(ig/ml羧芐青霉素中于37。C培養(yǎng)5-8小時。將5ml培養(yǎng)物加入500mlAP5-100|jg/ml羧芐青霉素并使其在4L帶擋板搖瓶中于37。C生長16小時。AP5培養(yǎng)基的組成為1.5g葡萄糖，11.0HycaseSF，0.6g酵母提取物(經(jīng)檢定的)，0.19g無水MgS。4,1.07gNH4C1,3.73gKC1,1.2gNaCl,120ml1M三乙醇胺，pH7.4,加水至1L，然后通過0.1|amSealkeen濾器無菌過濾。通過在1L離心瓶(Nalgene)中以3000xg離心來收獲細(xì)胞并除去上清液。冷凍1小時后，^!奪沉淀物重懸于25ml冷的lOmMMES-10mMEDTA,pH5.0(緩沖液A)。加入250)al0.1MPMSF(Sigma)以抑制蛋白水解，并加入3.5ml儲液10mg/ml雞卵清溶菌酶(Sigma)以幫助細(xì)菌細(xì)胞壁溶解。冰上溫和搖動1小時后，將樣品以40,000xg離心15分鐘。用緩沖液A將上清液調(diào)至50ml并加到以緩沖液A平衡的2mlDEAE柱上。然后將流出液加到以緩沖液A平tf的蛋白G-SepharoseCL-4B(Pharmacia)柱(0.5ml床體積)上。用10ml纟爰沖液A清洗柱子并用1.25mllMTris,pH8.0中的3ml0.3M甘氨酸，pH3.0洗脫。然后用Centricon-30(Amicon)將F(ab)緩沖液交換到PBS中并濃縮至終體積0.5ml。所有F(ab)s進(jìn)行SDS-PAGE以確定純度，并通過電噴射質(zhì)i普證實各個變體的分子量。在基于細(xì)胞的ELISA結(jié)合測定法(下文有描述)中，F(xiàn)ab,包括嵌合2H7Fab對CD20的結(jié)合是難以4全測的。因此，將2H7Fab型式重建成全長IgGl抗體，供測定和進(jìn)一步的誘變。通過將嵌合2H7(v6.8)Fab以及人源化Fab型式2至6的VL和VH結(jié)構(gòu)域亞克隆入先前記載的用于哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的pRK載體(Gormanetal.，DNAProt.Eng.Tech.2:3-10(1990))，構(gòu)建了用于表達(dá)全長IgG的質(zhì)粒。簡而言之，用￡coiV和消化每種Fab構(gòu)建體以切出VL片段，將其克隆入用于表達(dá)完整輕鏈(VrCL結(jié)構(gòu)域)的質(zhì)粒pDRl(WO04/056312的圖4)的￡co^V/i5//I位點。此外，用PvwII和jpal消化每種Fab構(gòu)建體以切出VH片段，將其克隆入用于表達(dá)完整重鏈(VH-CHl-鉸鏈-CH2-CH3結(jié)構(gòu)域)的質(zhì)粒pDR2(WO04/056312的圖5)的尸vwll"/al位點。對于每種IgG變體，通過將輕鏈表達(dá)質(zhì)粒和重鏈表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入腺病毒轉(zhuǎn)化的人胚胎腎細(xì)胞系293(Grahametal.,J.Gen.Virol.36:59-74,(1977》進(jìn)行了瞬時轉(zhuǎn)染。簡而言之，在轉(zhuǎn)染前一天分配293細(xì)胞，并鋪于含血清的培養(yǎng)基中。次日，加入制備成磷酸4丐沉淀的雙鏈DNA,然后力口入pAdVAntageDNA(Promega，Madison,WI),細(xì)胞于37。C保溫過夜。在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞并在4天后收獲。用蛋白A-SepharoseCL-4B從培養(yǎng)物上清液中純化抗體，然后緩沖液交換到10mM琥珀酸鈉，140mMNaCl，pH6.0中，并用Centricon-10(Amicon)濃縮。通過定量氨基酸分析測定蛋白質(zhì)濃度。為了測量與CD20抗原的相對結(jié)合親和力，開發(fā)了基于細(xì)胞的ELISA測定法。將人B淋巴母細(xì)胞樣WIL2-S細(xì)胞(ATCCCRL8885,美國典型培養(yǎng)物保藏中心AmericanTypeCultureCollection,Rockville，MD)在補充有2mML-谷氨酰胺，20mMHEPES,pH7.2和10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640中在潮濕的5%C02培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。用含1%FBS的PBS(測定緩沖液)清洗細(xì)胞并以250-300,000個細(xì)胞/孔接種于96孔圓底板(Nunc,Roskilde,Denmark)中。將在測定緩沖液中兩倍連續(xù)稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品(15.6-1000ng/ml2H7v6.8嵌合IgG)和三倍連續(xù)稀釋的樣品(2.7-2000ng/ml)加到板上。將板埋于冰中放置45分鐘。為了去除未結(jié)合的抗體，將0.1mL測定緩沖液加到孔中。將板離心并去除上清液。用0.2mL測定緩沖液再清洗細(xì)胞兩次。通過將過氧化物酶偶if關(guān)的山羊#元人Fc4元體(JacksonImmunoResearch,^VestGrove,PA)力口到斗反上來斗企測與板結(jié)合的抗體。保溫45分鐘后，如前所述清洗細(xì)胞。將TMB底物(3，3',5，5'-四曱基耳關(guān)苯胺；Kirkegaard&PerryLaboratories,Gaithersburg,MD)力口到板上。通過加入1M磷酸來終止反應(yīng)。用四參數(shù)非線性回歸曲線擬合程序(KaleidaGraph,Synergysoftware,Reading,PA)擬合滴定曲線。測定標(biāo)準(zhǔn)品在滴定曲線中點處的吸光度(mid-OD)及其對應(yīng)的濃度。然后測定每種變體在此mid-OD處的濃度，并將標(biāo)準(zhǔn)品的濃度除以每個變體的濃度。因此該數(shù)值是各個變體相對于標(biāo)準(zhǔn)品的結(jié)合比率。實驗之間相對親和力(等效濃度)的標(biāo)準(zhǔn)偏差通常是+/-10%。如表4中所示，CDR交換變體(v.2)的CD20結(jié)合與嵌合2H7(v.6.8)相比有極大降低。然而，型式3至6顯示出結(jié)合有所改善。為了測定將結(jié)合親和力恢復(fù)成嵌合2H7的結(jié)合親和力可能需要的最小突變數(shù)目，通過定點誘變構(gòu)建了另外的突變和突變的組合，產(chǎn)生如表5所示的變體7至17。具體而言，這些包括VH突變A49G、F67A、I69L、N73K和L78A;及VL突變M4L、M33I和F71Y。型式16和17顯示出最好的相對結(jié)合親和力，在嵌合型式的親和力的2倍之內(nèi)，二者之間無顯著差異(s.d.=+/-10%)。為了使突變數(shù)目降至最低，因此選擇只有4個人框架殘基突變成鼠框架殘基的型式16(表5)作為人源化形式供另外的表征。表4:用基于細(xì)胞的ELISA比較人源化2H7IgG變體與嵌合2H7對CD20的相對結(jié)合親和力。相對結(jié)合表示為嵌合2H7濃度相對于等效結(jié)合所需變體濃度的比率；因此比率<1表示所述變體的親和力較弱。相對親和力測定中的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10%?？勺冇蛑械目蚣芴娲窍鄬τ贑DR交換型式的，依照Kabat編號系統(tǒng)(Kabatetal.，同上文)。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表5:用于構(gòu)建人源化2H7型式16(2H7.vl6)中的突變VH(A49G,R71V,N73K)和KL46P)的寡核苷酸序列。加下劃線的密碼子編碼指示的氨基酸替代。對于VH(R71V,N73K)和VL(L46P),寡聚物顯示為有義鏈，因為這些是用于Fab模板上的誘變的，而對于VH(A49G),寡聚物顯示為反義鏈，因為這是與pRK(IgG重鏈)模板一起使用的。型式16的蛋白質(zhì)序列見上文"組合物"部分。<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>實施例2:2H7CDR區(qū)內(nèi)的另外的突變還對通過丙氨酸掃描鑒定為重要的CDR位置測試了另外的殘基替代及替代組合。若干組合變體，特別是v.96表現(xiàn)出比v.l6結(jié)合更緊密。表6:用基于細(xì)胞的ELISA(WIL2-S細(xì)胞)測量人源化2H7.vl6的CDR區(qū)中突變和非丙氨酸替代組合的影響。與CD20的相對結(jié)合表示為2H7.vl6親本濃度相對于等效結(jié)合所需變體濃度的比率；因此比率<1表示所述變體的親和力較弱；比率>1表示所述變體的親和力較高。相對親和力測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10%?？勺冇蛑械目蚣芴娲窍鄬τ?H7.vl6的，依照Kabat編號系統(tǒng)(Kabatetal.，同上文)。<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>實施例3:具有增強的效應(yīng)器功能的人源化2H7變體因為2H7可通過補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)二者介導(dǎo)B細(xì)胞的溶解，我們試圖生成具有改良的CDC和ADCC活性的人源化2H7.vl6的變體。已經(jīng)記載了為了通過增強與補體組分Clq的結(jié)合來改善CDC而進(jìn)行的其它抗體Fc區(qū)內(nèi)某些殘基的突變(Idusogieetal.,J.Immunol.166:2571-2575(2001))。還已經(jīng)記載了為了通過增強IgG與活化性Fq受體結(jié)合并削弱IgG與抑制性Fcy受體結(jié)合來改善ADCC的突變(Shieldsetal.，J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001》Prestaetal"Biochem.Soc.Trans.30:487-490(2002))。具體而言，如文獻(xiàn)所述(Idusogieetal.，同上文(2001);Shieldsetal.,同上文)已經(jīng)鑒定了用于改善CDC和ADCC活性的三處突變S298A/E333A/K334A(在本文中又稱為三聯(lián)丙氨酸突變體或變體；Fc區(qū)內(nèi)的編號依照EU編號系統(tǒng)；Kabatetal.,同上文)。為了增強2H7的CDC和ADCC活性，構(gòu)建了2H7Fc的三聯(lián)丙氨酸突變體。生成了抗HER2抗體4d5的人源化變體，它具有突變S298A/E333A/K334A并稱為4D5Fcl10(即抗p185HER2IgGl(S298A/E333A/K334A);Shieldsetal.,同上文)。用^pal和歷>76/111消化編碼抗體4D5Fc110的質(zhì)粒p4D5Fcl10(Shieldsetal.,同上文)，將Fc片段(包含突變S298A/E333A/K334A)連入2H7重鏈載體pDR2-vl6的^al/歷"c/in位點，生成pDR2-v31。型式31完整H鏈的氨基酸序列見上文組合物部分。L鏈與v16的相同。盡管IgGl抗體Fc區(qū)的恒定域在給定物種內(nèi)相對保守，然而仍然存在等位基因變異(見綜述LefrancandLefranc,in:ThehumanIgGsubclasses:molecularanalysisofstructure,fbnction,andregulation,pp.43-78,F.Shakib(ed.),PergammonPress,Oxford(1990》。表7:Fc區(qū)內(nèi)的替代對CD20結(jié)合的影響。以框架替代的基于細(xì)胞(WIL2-S)的測定法測量對CD20的相對結(jié)合。Fc突變(*)以EU編號方式表示(Kabat,同上文)而且是相對于2H7.vl6親本的。v.31Fc區(qū)中的三個丙氨酸變化的組合記載為"FcllO"。IgG變體顯示了相對于2H7.vl6背景的突變。相對結(jié)合表示為2H7.v6.8嵌合體濃度相對于等效結(jié)合所需變體濃度的比率；因此比率<1表明所述變體的親和力較弱。相對親和力測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10%。<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table>實施例4:具有增強的穩(wěn)定性的人源化2H7變體為了開發(fā)成治療用蛋白質(zhì)，希望選擇在合適的配制緩沖液中對于氧化、脫酰胺或可能影響產(chǎn)品質(zhì)量的其它過程保持穩(wěn)定的變體。在2H7.vl6中，鑒定出若干殘基可能是不穩(wěn)定性的來源VL(M32)和VH(M34,N100)。因此，在這些位點引入突變，與vl6進(jìn)行比較。表8:在基于細(xì)胞(WIL2-S)的測定中，為提高穩(wěn)定性和/或效應(yīng)器功能而設(shè)計的2H7變體對CD20的相對結(jié)合。IgG變體顯示出相對于2H7.vl6背景的突變。相對結(jié)合表示為2H7.v6.8嵌合體濃度相對于等效結(jié)合所需變體濃度的比率；因此比率<1表示所述變體的親和力較弱。相對親和力測定的標(biāo)準(zhǔn)偏差平均為+/-10%?？勺冇虻目蚣芴娲窍鄬τ?H7.vl6的，依照Kabat編號系統(tǒng)，而Fc突變(*)以EU編號系統(tǒng)(Kabatetal.，同上)指示。(**)以2H7.vl6作為標(biāo)準(zhǔn)參比物對變體進(jìn)行測量；相對數(shù)值以所述嵌合體的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化。基于先前所才艮道的突變(Idusogieetal.(2000);Idusogieetal.(2001);Shieldsetal.(2001))，將另外的Fc突變與提高穩(wěn)定性或親和力的突變組合以改變或增強效應(yīng)器功能。這些改變包括如上所述的S298、E333A、K334A;降低CDC活性的K322A;降低ADCC活性的D265A;提高CDC活性的K326A或K326W;及用于測試Fc區(qū)內(nèi)同種異型變化的影響的E356D/M358L。這些突變均未引起CD20結(jié)合親和力的顯著差異。<table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table>(**)以2HTvl6作為參比物測量的變體；相對結(jié)合值對嵌合體的數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)化。為了測試穩(wěn)定性突變對蛋白質(zhì)降解速率的影響，將2H7.vl6和2H7.v73以12-14mg/mL配制于10mM組氨酸，6%蔗糖，0.02%聚山梨醇酯20,pH5.8中并于40°C保溫16天。然后測定保溫后的樣品，通過離子交換層析測定變體的電荷變化，通過大小排阻層析測定聚集和斷裂變化，以及通過基于細(xì)胞(WIL2-S)的測定法測定相對結(jié)合變化。結(jié)果顯示2H7v.73與2H7v.16相比在加速穩(wěn)定性條件下通過離子交換層析測定的主峰級分丟失方面具有更高的穩(wěn)定性。在聚集、斷裂或結(jié)合親和力方面沒有觀察到顯著差異。實施例5:補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)測定法基本上如文獻(xiàn)所述(Idusogieetal"J.Immunol.164:4178-4184(2000);Idusogieetal.，J.Immunol.166:2571-2575(2001))，對2H7IgG變體測定它們介導(dǎo)WIL2-S細(xì)胞，一種表達(dá)CD20的淋巴母細(xì)胞樣B細(xì)胞系的補體依賴性溶解的能力。將抗體自O(shè).lmg/mL的儲液進(jìn)行1:3連續(xù)稀釋。將每個稀釋度的0.05mL等分試樣加入裝有0.05mL正常人補體溶液(Quidel，SanDiego,CA)的96孔組織培養(yǎng)板。向此混合物中加入0.05mL體積的50,000個WIL2-S細(xì)胞。于37。C保溫2小時后，加入0.05mLAlamarblue溶液(AccumedInternational,Westlake,OH),繼續(xù)于37。C另外保溫18小時。然后拿走平板的封蓋，將它們在軌道搖床上于室溫?fù)u動15分鐘。用530nm激發(fā)濾光器和590nm發(fā)射濾光器讀取相對熒光單位(RFU)。對于每種抗體用KaleidaGraph軟件將RFU擬合成濃度的函數(shù)，由此計算EC50。結(jié)果(表9)顯示出人源化2H7抗體的CDC有驚人的改善，其中v.73具有與Rituxan⑧相似的相對效力，v.75的效力比Rituxan⑧高3倍，而v.16的效力比Rit畫n⑧弱3倍。表9:2H7抗體與Rituxan的CDC活性比較。數(shù)字>1表明CDC活性弱于Rituxan,而數(shù)字<1表明活性強于Rituxan。抗體由穩(wěn)定的CHO細(xì)胞系生成，除了那些以(*)指示的是瞬時生成的之外。<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>實施例6:抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)測定法基本上如文獻(xiàn)所述(Shieldsetal.,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)),利用乳酸脫氫酶(LDH)讀數(shù)，對2H7IgG變體測定它們介導(dǎo)WIL2-S細(xì)胞，一種表達(dá)CD20的淋巴母細(xì)胞樣B細(xì)胞系的天然殺手細(xì)胞(NK細(xì)胞)溶解的能力。從用100mLPBS(磷酸鹽緩沖鹽水)稀釋的100mL肝素化血液制備NK細(xì)月包，所述血液獲自對于FcyRin，又稱為CD16(Koeneetal.,Blood90:1109-1114(1997))已鑒定同種型的正常人供體。在此實驗中，NK細(xì)胞來自CD16雜合(F158/V158)的人供體。將稀釋的血液加到15mL淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)基(ICNBiochemical,Aurora,Ohio)上成層，并以2000RPM離心20分鐘。將兩層之間界面的白細(xì)胞分裝入4個干凈的50mL管，管中裝有含15%胎牛血清的RPMI培養(yǎng)基。將管子以1400RPM離心5分鐘后丟棄上清液。將沉淀物重懸于MACS緩沖液(0.5%BSA,2mMEDTA)，依照制造商的方案(MiltenyiBiotech)用珠子(NKCellIsolationKit,130-046-502)純化NK細(xì)胞。NK細(xì)胞在MACS緩沖液中稀釋至2xl()6個細(xì)胞/mL。將在測定培養(yǎng)基(F12/DMEM50:50無甘氨酸，lmMHEPES緩沖液pH7.2,青霉素/鏈霉素(100單位/mL;Gibco),谷氨酰胺，和1%熱滅活胎牛血清)中連續(xù)稀釋的抗體(0.05mL)加入96孔圓底組織培養(yǎng)板。將WIL2-S細(xì)胞在測定緩沖液中稀釋至濃度4x10VmL。在96孔板中將WIL2-S細(xì)胞(0.05mL每孑L)與稀釋抗體混合并于室溫保溫30分鐘以使抗體結(jié)合CD20(調(diào)理作用)(opsonization)。通過向每個孔中加入O.lmLNK細(xì)胞起始ADCC反應(yīng)。在對照孔中，加入2%TritonX-IOO。然后將平板于37。C保溫4小時。用細(xì)胞毒性(LDH)檢測試劑盒(Kit弁1644793,RocheDiagnostics,Indianapolis,Indiana.)依照制造商的說明書測量釋放的LDH水平。向每個孔中加入0.1mLLDH顯影劑，隨后混合10秒。然后用鋁箔覆蓋平板并于室溫黑暗中放置15分鐘。然后讀取4卯nm的光密度并通過除以對照孔中測得的總LDH而用于計算溶解百分比。將溶解情況作為抗體濃度的函數(shù)作圖，用4參數(shù)曲線擬合(KaleidaGraph)來測定EC50濃度。結(jié)果顯示出人源化2H7抗體在ADCC中有活性，其中v.31和v.75的相對效力比Rituxan高20倍，v.16的效力比Rituxan高5倍，而v.73的效力比Rituxan高幾乎44咅。表10:以n次實驗為基礎(chǔ)，比較了2H7抗體與2H7.vl6對WIL2-S纟田月包的ADCC活性(數(shù)值>1表示效力弱于2H7.vl6低，數(shù)值<1表示效力強于2H7.vl6)。<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>進(jìn)行另外的ADCC測定以比較2H7變體組合與Rituxan。這些測定的結(jié)果表明2H7.vl14和2H7.vl15的ADCC效力比Rituxan⑧提高大于10倍(表11)。表11:以n次實驗為基礎(chǔ)，比較了2H7抗體與Rituxan⑧對WIL2-S纟田月包的ADCC活性(數(shù)值>1表示效力弱于Rituxan,數(shù)值<1表示效力強于Rituxan)。<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table>實施例7:FcRn結(jié)合測定法將Fc中具有氨基酸改變的可溶性Fc變體(例如N434W,N434Y，N434F,N434A,N434H,N434A+E380A+T307A)表達(dá)，純化，并在BIAcore結(jié)合測定法中測定它們對人、獼猴、大鼠和小鼠FcRn的親和力。還通過大小排阻層析分析Fc變體以測定它們的聚集趨勢。為了表達(dá)變體Fc片段，用突變型pW0437噬菌粒轉(zhuǎn)化34B8大腸桿菌細(xì)胞，在無磷酸鹽培養(yǎng)基中于30。C培養(yǎng)24小時以誘導(dǎo)Fc基因的表達(dá)，然后收獲細(xì)胞。將細(xì)胞漿冷凍過夜，然后在10mMTris,lmMEDTA中通過滲壓震擾(osmoticshock)來溶解。將溶解液通過離心而澄清并加到蛋白A柱上。用PBS洗柱，用蛋白A檸檬酸鹽洗脫緩沖液(0.1M檸檬酸鹽，pH3.0)洗脫可溶性Fc,并用TrispH7.5中和。用AmiconCentriprep濃縮可溶性Fc。來自人、獼猴、大鼠或小鼠的FcRn通過NHS化學(xué)法以不同密度(100-3000RU)固定在BiacoreCM5芯片上。將Fc變體在pH6.0的PBS中從10pM連續(xù)稀釋至lnM，隨時間監(jiān)測結(jié)合。對于親本無4交鏈Fc(即野生型)，huFcRn幾乎立即達(dá)到平衡結(jié)合，表明它具有非?？斓慕Y(jié)合和解離速率，平衡分析測定的Kd大約為700nM。對于N434W變體，結(jié)合速率顯著減慢，解離速率極其慢。通過以較慢流速較長時間注入N434W，平衡分析是有可能的，且Kd大約是4nM。變體N434W、N434F、N434A和三聯(lián)突變體N434A+E380A+T307A在pH6.0時親和力相對于野生型Fc分別明顯增加大約170倍、大約9倍、大約2.7倍和大約14倍。相反，在pH7.4,N434變體對huFcRn的親和力實在太低以至于不能在此測定法中測量。N434W對獼猴FcRn的結(jié)合相對于野生型的改善不是如此顯著，比對大鼠FcRn的結(jié)合只顯示出高大約10倍，而對小鼠FcRn的結(jié)合則實際上與野生型的一樣。因此通過此突變獲得的改善是對人FcRn特異的。用生物素化FcRn在ELISA中分析2H7.vl38的人IgGl變體對人FcRn的pH依賴性結(jié)合。將MaxiSorp96孔孩i孔4反(Nunc,Roskilde,Denmark)用100^1/孔配制于50mM碳酸鹽緩沖液pH9.6中的2|ig/mlNeutrAvidin(Pierce,Rockford，IL)于4°C包被過夜。用含0.05%聚山梨醇酯的PBS(洗滌緩沖液)pH7.4洗滌，并用含0.5%BSA的PBSpH7.4以150jil/孔進(jìn)行封閉。于室溫保溫1小時后，用洗滌緩沖液pH7.4洗滌平板。用生物素-X-NHS(ResearchOrganics，Cleveland,OH)將人FcRn生物素化。將生物素化的FcRn以2(xg/ml，100pl/孔加到平板上,其配制于含0.5%BSA,0.05%聚山犁醇酯20的PBS(樣品緩沖液)pH7.4中。將平板保溫1小時并用洗滌緩沖液pH6.0洗滌。將在樣品緩沖液pH6.0中7次兩倍連續(xù)稀釋的IgG抗體(3.1-200ng/ml)加至平板上。保溫2小時后，用洗滌緩沖液pH6.0洗滌平板。通過力口入100jil/孑L酉己制于樣品緩沖液pH6.0中的過氧化物酶標(biāo)記的山羊F(ab，)2抗人IgGF(ab，)2(JacksonImmunoResearch,WestGrove,PA)來4全測所結(jié)合的IgG。保溫1小時后，用洗滌緩沖液pH6.0洗滌平板，加入100)!l/孔底物3，3',5,5'-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)(Kirkegaard&PerryLaboratories)。通過加入100(!l/孑L1M磷酸來終止反應(yīng)。在multiskanAscentreader(ThermoLabsystems，Helsinki,Finland)上讀取450nm處的吸光度。計算標(biāo)準(zhǔn)曲線中點處的吸光度(mid-OD)。使用四參數(shù)非線性回歸曲線擬合程序(KaleidaGraph,Synergysoftware,Reading,PA)從滴定曲線測定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在此mid-OD處的相應(yīng)濃度。通過用標(biāo)準(zhǔn)品的mid-OD濃度除以樣品的來計算相對活性。為了評估所結(jié)合IgG與FcRn在pH6.0或pH7.4的解離，類似的進(jìn)行所述測定，只是在樣品保溫步驟后及在洗滌平板時加入100(!l/孔樣品緩沖液pH6.0或7.4。將平板保溫45分鐘并洗滌。然后繼續(xù)如上所述進(jìn)行測定。實施例8:具有FcRn突變的人源化抗CD20IgGl變體的表征還對通過噬菌體展示鑒定的人Fc突變測試了它們在完整抗體2H7.vl38的背景中的效果。2H7.vl38是人源化的抗CD20抗體，其中Fc通過以下突變進(jìn)行了修飾以提高ADCC和CDC活性S298A、K326A、E333A、K334A。向此背景中引入位置N434的突變，如前所述通過瞬時轉(zhuǎn)染293細(xì)胞制備IgG(表12)。在每種情況中，根據(jù)如上所述的大小排阻層析，純化的IgG變體顯示出具有低水平的蛋白質(zhì)聚集。表12:人源化抗CD20抗體2H7.vl38的變體2H7變體FcRn突變<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table>用生物素化的FcRn在ELISA中分析2H7.v138的人IgGl變體對人FcRn的pH依賴性結(jié)合。將MaxiSorp96孔微孔板(Nunc,Roskilde,Denmark)用100jil/孔配制于50mM碳酸鹽緩沖液pH9.6中的2嗎/mlNeutrAvidin(Pierce,Rockford,IL)于4°C包被過夜。用含0.05%聚山梨醇酯的PBS(洗滌緩沖液)pH7.4洗滌，并用含0.5%BSA的PBSpH7.4以150^1/孔進(jìn)行封閉。于室溫保溫1小時后，用洗滌緩沖液pH7.4洗滌平板。用生物素-X-NHS(ResearchOrganics,Cleveland,OH)將人FcRn生物素化。將生物素化的FcRn以2|ig/ml,100)!l/孔加到平板上，其配制于含0.5%BSA,0.05%聚山犁醇酯20的PBS(樣品緩沖液)pH7.4中。將平板保溫1小時并用洗滌緩沖液pH6.0洗滌。將在樣品緩沖液pH6.0中7次兩倍連續(xù)稀釋的IgG抗體(3.1-200ng/ml)加至平板上。保溫2小時后，用洗滌緩沖液pH6.0洗滌平板。通過加入100^1/孔配制于樣品緩沖液pH6.0中的過氧化物酶標(biāo)記的山羊F(ab，)2抗人IgGF(ab，)2(JacksonImmunoResearch,WestGrove，PA)來4全測所結(jié)合的IgG。保溫1小時后，用洗滌緩沖液pH6.0洗滌平板，加入100nl/孔底物3,3',5,5'-四曱基聯(lián)苯胺(TMB)(Kirkegaard&PerryLaboratories)。通過加入100jil/孔1M磷酸來終止反應(yīng)。在multiskanAscentreader(ThermoLabsystems,Helsinki,Finland)上讀取450nm處的吸光度。計算標(biāo)準(zhǔn)曲線中點處的吸光度(mid-OD)。使用四參數(shù)非線性回歸曲線擬合程序(KaleidaGraph,Synergysoftware,Reading,PA)從滴定曲線測定標(biāo)準(zhǔn)品和才羊品在此mid-OD處的相應(yīng)濃度。通過用標(biāo)準(zhǔn)品的mid-OD濃度除以樣品的來計算相對活性。為了評估所結(jié)合IgG與FcRn在pH6.0或pH7.4的解離，類似的進(jìn)^t所述測定，只是在樣品保溫步驟后及在洗滌平板時加入100lal/孔樣品緩沖液pH6.0或7.4。將平板保溫45分鐘并洗滌。然后繼續(xù)如上所述進(jìn)行測定。結(jié)果表明相對結(jié)合親和力類似于對Fc變體所觀察到的。在pH6.0，相對結(jié)合親和力是v477>v478=v479〉v364>v138。在pH7.4，相對結(jié)合親和力一致的弱于在pH6.0時的相對結(jié)合親和力，具有相同的相對結(jié)合v477>v478=v479>v364>vl38。這些Fc突變可廣泛應(yīng)用于人IgG抗體。實施例9:2H7變體在初步研究中在獼猴中的體內(nèi)效果在正常雄性獼猴(iWacaca/oyc/cw/an》中測試通過瞬時轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞生成的2H7變體以評估它們的體內(nèi)活性。其它抗CD20抗體，諸如C2B8(Rituxan⑧)證實了在正常靈長類動物中消減B細(xì)胞的能力(Reffetal.，Blood83:435-445(1994》。在一項研究中，比較了人源化的2H7變體。在平行研究中，也在獼猴中測試了Rituxan⑧。5個劑量給藥組，每組使用4只猴子(1)媒介，(2)0.05mg/kghu2H7.v16,(3)10mg/kghu2H7.v16，(4)0.05mg/kghu2H7.v31，和(5)10mg/kghu2H7.v31。抗體以靜脈內(nèi)施用，濃度為0、0.2或20mg/mL，總共兩劑，一劑在研究的第l天，另一劑在第8天。劑量給藥的首日指定為第1天，而前一天指定為第-l天；回收(每組兩只動物)的首日指定為第11天。在第-19、-12、1天(劑量給藥前)和第一劑后6、24和72小時收集血液樣品。在第8天(劑量用藥前)、第10天(處死每組兩只動物前)、及第36和67天(對于回收動物)采集另外的樣品。通過對CD3VCD40+細(xì)胞計數(shù)的FACS方法來測定外周B細(xì)胞濃度。猴樣品中總淋巴細(xì)胞的CD3-CD40+B細(xì)胞的百分比通過以下門控策略獲得。在前向散射/側(cè)向散射的散點圖上標(biāo)記淋巴細(xì)胞群，限定為區(qū)域1(R1)。利用Rl中的事件，展示CD40和CD3標(biāo)志物的熒光強度點圖。用焚光標(biāo)記的同種型對照來測定CD40和CD3陽性的各自截留點。結(jié)果表明2H7.vl6和2H7.v31二者都能夠在10mg/kg劑量產(chǎn)生完全的外周B細(xì)胞消減，以及在0.05mg/kg劑量產(chǎn)生部分的外周B細(xì)胞消減。兩種抗體在劑量給藥后的前72小時期間測量到的B細(xì)胞消減的時間進(jìn)程和程度相似。隨后的回收動物分析表明與服用2H7.vl6的動物相比，用2H7.v31處理的動物顯示出B細(xì)胞消減延長。具體而言，對于用10mg/kg2H7.vl6處理的回收動物，B細(xì)胞在第IO天和第36天采樣之間的有些時間顯示出實質(zhì)性的B細(xì)胞恢復(fù)。然而，對于用10mg/kg2H7.v31處理的回收動物，B細(xì)胞直到第36天和第67天之間的有些時間才顯示出恢復(fù)。這說明與2H7.vl6相比，2H7.v31的完全消減持續(xù)時間更長，大約為1個月。在低或高劑量的猴子研究中沒有觀察到毒性，而且總體病理學(xué)(grosspathology)是正常的。在其它研究中，在這些猴子中遵循間隔兩周靜脈內(nèi)施用兩劑，直到所評估的最高劑量(100mg/kgx2=1200mg/m2x2)，v16都得到很好的耐受。獼猴中2H7.vl6較之于Rituxan⑧的數(shù)據(jù)表明，CDC活性下降5倍對效力沒有不利的影響。具有強ADCC活性但CDC活性降低的抗體在首次輸注方面可能比具有更高CDC活性的抗體具有更有利的安全性特征。實施例10:腫瘤生長的體內(nèi)抑制在Balb/c棵(無胸腺)小鼠中評估rhuMAb2H7.vl6抑制Raji人B細(xì)胞，一種淋巴瘤細(xì)胞系(ATCCCCL86)生長的能力。Raji細(xì)胞表達(dá)CD20，而且拒報道在棵鼠中生長，產(chǎn)生轉(zhuǎn)移性疾病；腫瘤生長受到Rituxan⑧的抑制(Clynesetal.,NatureMedicine6:443-446(2000))。將56只8-10周齡Balb/c棵鼠分成7組(A-G),每組由8只小鼠組成。在第O天，每只小鼠在側(cè)面接受皮下注射5x1(^個RajiB淋巴瘤細(xì)胞。從第0天開始，每只小鼠接受100uL陰性對照溶液(PBS;磷酸鹽緩沖鹽水)、Rituxan⑧或2H7.vl6。劑量由體重決定，而且藥物經(jīng)尾靜脈以靜脈內(nèi)遞送。A組小鼠接受PBS。B-D組分別接受5.0mg/kg、0.5mg/kg和0.05mg/kgRituxan。E-G組小鼠分別才妄受5.0mg/kg、0.5mg/kg和0.05mg/kg2H7.vl6。每周重復(fù)注射，共6周。在治療期間以一周為間隔對每只小鼠檢查注射部位可觸知肺瘤的存在情況，如果存在就測量并記錄肺瘤的體積。在第8周(在沒有處理的兩周間隔后)進(jìn)行最后的檢查。此研究的結(jié)果顯示rhuMAb2H7.vl6和Rituxan⑧二者都有效抑制棵鼠中皮下Raji細(xì)胞肺瘤生長。從第4周開始在PBS對照組中觀察到腫瘤生長。然而，在研究的8周持續(xù)時間在用5mg/kg或0.5mg/kgRituxan⑧或2H7.vl6處理的組中沒有觀察到肺瘤生長。在低劑量0.05mg/kg處理組中，在2H7組的一只動物和Rituxan組的一只動物中觀察到腫瘤。實施例11:rhuMAb2H7(2H7.vl6)在中度至重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的I/II期研究《的此項研究的主要目的是評估在中度至重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者中逐步增大rhuMAb2H7靜脈內(nèi)(IV)劑量的安全性和耐受性。這是在中度至重度RA受試者中聯(lián)合MTX逐步增大rhuMAb2H7(PRO70769)劑量的安全性研究，是隨機的、以安慰劑為對照的、多中心的、盲試I/II期的、調(diào)查人員和受試者盲試的。此研究由劑量逐步增大階段和募集更多數(shù)目受試者的第二階段組成。主辦者對于治療安排仍然知情(unblinded)。募集患有中度至重度RA、1-5種減輕疾病的抗風(fēng)濕藥或生物制劑失敗了、目前對MTX治療具有不滿意的臨床應(yīng)答的受試者。要求受試者在進(jìn)入研究之前每周接受10-25mg范圍內(nèi)的MTX至少12周，并且在接受他們的初始劑量研究藥物(PRO70769或安慰劑)之前MTX的劑量穩(wěn)定至少4周。受試者還可接受穩(wěn)定劑量的口服皮質(zhì)類固醇(高達(dá)每天10mg，或強的松等效物)和穩(wěn)定劑量的非類固醇抗炎藥(NSAID)。受試者在第1天和第15天依照如下劑量逐步增大計劃接受兩次靜脈內(nèi)輸注指定劑量的PRO70769或安慰劑等同物。依照特定的標(biāo)準(zhǔn)、經(jīng)內(nèi)部安全性數(shù)據(jù)檢查委員會檢查安全性數(shù)據(jù)并評估每組中治療的最后一名受試者第二次輸注后72小時的急性毒性后進(jìn)行劑量逐步增大。如果劑量水平在劑量逐步增大階段證實是可耐受的，在劑量逐步增大階段后，在以下每個劑量水平隨機追加40名受試者(32名接受活性劑，8名接受安慰劑)2x50mg、2x200mg、2x500mg和2x1000mg。研究中募集大約205名受試者。獲取并記錄B細(xì)胞計數(shù)。在6個月的功效評估后，在48周跟蹤期中用流式細(xì)胞術(shù)評估B細(xì)胞計數(shù)。B細(xì)胞消減不會認(rèn)為是劑量限制性毒性(DLC),而是PR070769處理的預(yù)期藥效結(jié)果。在子研究中，在各個時間點從受試者獲取用于血清和RNA分析的血液以及尿樣。這些樣品可用于鑒定可能預(yù)示中度至重度RA受試者對PR070769治療的響應(yīng)的生物標(biāo)志物。研《義、理各組受試者在第1天和第15天依照以下逐步增大計劃接受兩次靜脈內(nèi)輸注指定劑量的PRO70769或安慰劑同等物-10mgPRO70769或安慰劑同等物4名受試者接受活性劑，1名對照-50mgPRO70769或安慰劑同等物8名受試者接受活性劑，2名對照-20011^11070769或安慰劑同等物8名受試者接受活性劑，2名對照-50011^尺070769或安慰劑同等物8名受試者接受活性劑，2名對照-1000mgPRO70769或安慰劑同等物8名受試者接受活性劑，2名對照^效PRO70769的功效通過ACR響應(yīng)來測量。通過治療組總結(jié)獲得ACR20、ACR50和ACR70響應(yīng)的受試者的百分率，并且產(chǎn)生每組的95%置信區(qū)間。通過治療和訪問總結(jié)這些響應(yīng)的組成及其距基線的變化。實施例12根據(jù)對2H7.v16晶體結(jié)構(gòu)的檢查聯(lián)合丙氨酸掃描數(shù)據(jù)，看起來包括NIOO(VH)和鄰近殘基的CDR-H3區(qū)可能涉及抗原結(jié)合。我們因此聚焦于N100(Vh)，在2H7.vl6的背景中生成了許多氨基酸替代。結(jié)果(表13)表明Tyr或Trp替代相對于v16改善了結(jié)合情況。表13:為增強對CD20的結(jié)合親和力而設(shè)計的2H7變體的相對結(jié)合，以基于細(xì)胞(WIL2-S)的測定法用轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中產(chǎn)生的IgG變體測定。指出了IgG變體相對于2H7.vl6背景的突變(Kabat編號)。相對結(jié)合表示為2H7.vl6濃度相對于等效結(jié)合所需變體濃度的比率；因此，比率>1表明所述變體與型式16相比對CD20的結(jié)合親和力提高了。<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table>為了測定通過S100a(VH)處的替代是否能獲得另外的親和力提高，在此位置進(jìn)行了許多突變，在此案中是以2H7.v472(表13)為背景的?；诩?xì)胞的結(jié)合比較的結(jié)果(表14)表明2H7.v511對細(xì)胞上CD20的結(jié)合有大于3倍的提高。通過定點誘變構(gòu)建了2H7.v511重鏈的基因，其中使用編碼2H7.vl38重鏈的質(zhì)粒ssDNA作為模板，及命名為CA1568的5'-磷酸化脫氧寡核苷酸5'-CCAGACGTCGAAGTACCAGTAGCGGTA^￡1GTATACGACGCG-3'(SEQIDNO.45)。標(biāo)下劃線的核苷酸對應(yīng)于反義DNA鏈中編碼CDR-H3變化N100Y、S100aR的密碼子。2H7.v511的輕鏈與2H7.vl38的相同，使用相同的質(zhì)粒來表達(dá)所述輕鏈。hu2H7變體諸如v138和v511可以在CHO細(xì)胞中表達(dá)，使用圖9所示用于表達(dá)2H7.v16的載體。表14:為增強對CD20的結(jié)合親和力而設(shè)計的2H7變體的相對結(jié)合，以基于細(xì)胞(WIL2-S)的測定法用轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中產(chǎn)生的IgG變體測定。指出了IgG變體相對于2H7.vl6背景在CDR位點處的突變(Kabat編號)。此外，與2H7.vl6相比，所有變體均包含F(xiàn)c變化S298A、K326A、E333A和K334A(EU編號)。相對結(jié)合表示為2H7.vl6濃度相對于等效結(jié)合所需變體濃度的比率；因此，比率>1表明該變體與型式16相比對CD20的結(jié)合親和力提高了。<table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table>因為這些變體還包含F(xiàn)c改變，我們另外測量了竟?fàn)幮許catchard測定法中的結(jié)合情況以測定表觀平衡解離常數(shù)(Kd)。對于結(jié)合WIL2s-S細(xì)胞的人源化抗CD20單克隆抗體，用放射性標(biāo)記的抗體2H7.v511和2H7.vl38IgG測定平衡解離常數(shù)(Kd)。抗CD20單克隆抗體在CHO細(xì)胞中生成。所有稀釋均在結(jié)合測定緩沖液(含0.5%牛血清清蛋白，25mMHEPESpH7.2和0.01%疊氮化鈉的DMEM培養(yǎng)基)中進(jìn)行。將濃度為O.lnM的125I-2H7.v511和125I-2H7.vl38(用乳過氧化物酶石典化)的等分試樣(0.05mL)分配入V底96孔微量滴定板的孔。加入未標(biāo)記抗體的連續(xù)稀釋液(0.05mL)并混合。向每個孔中加入0.05mL體積的30,000個WIL2-S細(xì)胞。密封平板并于室溫放置24小時，然后以2，500RPM離心15分鐘。然后吸出上清液，并將細(xì)胞沉淀物清洗和離心。再次吸出上清液，將沉淀物溶于INNaOH并轉(zhuǎn)移至管中供伽馬計數(shù)。將凄t據(jù)用于Scatchard分析(MunsonandRodbard,Anal.Biochem.107:220-239(1980))，其中使用Ligand程序(McPherson,Comput.ProgramsBiomed.17:107-114(1983》。下表15所示結(jié)果表明抗CD20單克隆抗體2H7.v511和2H7.vl38以高親和力結(jié)合WIL2-S細(xì)胞上表達(dá)的CD20，而且2H7.v511的結(jié)合親和力比2H7.vl6高2.2倍至7.3倍。用已標(biāo)記125I-2H7.v511和^I-2H7.vl38得到的數(shù)值間的差異可能反映了2H7.v511的CDR-H3中新的Tyr碘化導(dǎo)致的抗原結(jié)合的擾動。因此看起來有可能125I-2H7.vl38的結(jié)果更準(zhǔn)確的反映了相對結(jié)合親和力。表15:來自Scatchard分析的抗CD20人源化單克隆抗體的平衡結(jié)合親和力(+/-擬合的標(biāo)準(zhǔn)誤差)。竟?fàn)幙贵w標(biāo)記抗體表觀Kd(nM)相對親和力<table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table>作為2H7變體結(jié)合親和力的補充比較，用溶解的CD20進(jìn)行ELISA。為了進(jìn)行比較，構(gòu)建了CDR區(qū)與2H7.vl6相同且Fc區(qū)與2H7.v511相同的另一變體2H7.v588。用溶于PBS的2.5|ig/ml可溶性CD20(Genentech;如前所述制備)將NUNCMaxisorpTM平板于4°C包被過夜，然后用0.5%BSA于室溫封閉1小時。將在0.5%BSA中連續(xù)稀釋的樣品在平板上保溫2小時。洗滌后，用HRP偶聯(lián)的抗人Fab抗體(山羊抗人Ig,Fab'2-HRP偶聯(lián)物，來自NB)檢測所結(jié)合的抗體，其中以3,3',5，5'-四曱基聯(lián)苯胺(KirkegaardandPerryLaboratories,Gaithersburg，MD)作為底物。讀取450nm的吸光度。使用四參數(shù)非線性回歸曲線擬合程序(KaleidaGraph;SynergySoftware,Reading,PA)擬合滴定曲線。計算與標(biāo)準(zhǔn)品滴定曲線中點吸光度對應(yīng)的抗體變體的濃度。結(jié)果(圖3)顯示2H7.v588和2H7.vl6具有相似的結(jié)合親和力；然而，在此測定法中2H7.v511表現(xiàn)出對可溶性CD20的結(jié)合提高了大約90倍。實施例13:ADCC活性如前所述用WIL2-S細(xì)胞和從正常人供體純化的NK細(xì)胞評估ADCC活性，圖4的效應(yīng)器:靶物的比率是大約4，而圖11測定法的比率是5:1。圖4和圖11所示結(jié)果表明與2H7.vl6和其它2H7變體相比，2H7.v511的ADCC效力和最大活性提高了。2H7.v588顯示出與2H7.v511相似的效力和最大活性(圖4)，表明進(jìn)一步的CD20親和力改善可能不會顯著提高ADCC活性。實施例14:CDC活性還如上所述用WIL2-S細(xì)胞和人補體評估了CDC活性。圖5所示結(jié)果表明與2H7.v588相比，2H7.v511的CDC效力提高了，與2H7.vl6相比，2H7.v511的效力大大提高了。正如用先前所述變體觀察到的，提高CD20親和力看起來增強了體外CDC活性。在比較2H7.v511與其它2H7變體的分開的CDC測定中，v511也展示出高于v31、v488和v114的CDC活性，如圖10所示。圖10中的CDC測定法基本上如上所述以96微孔板格式進(jìn)行，修改如下。將50(iL自300-1000nM開始的連續(xù)稀釋的2H7.v511(及實施例15圖12中總結(jié)的實驗中的Rituxan)與50jiL正常B細(xì)胞(lxl06/ml,每孔50,000個細(xì)胞)或50(iLWIL2-S細(xì)胞(30,000個)連同50|iL1:4稀釋的正常人血清補體(Quidel)—起保溫。用負(fù)選4奪(Rosettesep,StemCellTechnologies)和Ficoll畫PaquePlus(AmershamBiosciences)梯度分離從力口有肝素抽耳又的全血中分離正常B細(xì)胞。于37。C保溫2小時后，加入50|iLAlamarBlue(BiosourceInternational)并于37°C再保溫18小時。將平板輕輕搖動15分鐘，然后在焚光平板讀數(shù)器(激發(fā)535，發(fā)射595)上讀數(shù)以測定相對熒光單位(RFU)。將觀察到的RFU值相對于mAb濃度在KaleidaGraph中作圖，并用4參數(shù)擬合畫出曲纟戔。實施例15:體內(nèi)B細(xì)胞消減在B細(xì)胞消減的轉(zhuǎn)基因小鼠模型中比較2H7.v511與2H7.vl6的體內(nèi)活性。給轉(zhuǎn)基因小鼠(hCD20Tg倍mCD16;hCD16TgW-)，每組5只，每只小鼠靜脈內(nèi)注射125嗎或12.5嗎(相當(dāng)于5和0.5mg/kg)抗體。圖6、7、13和14中每個的hlgGl(空心條)是同種型對照抗體。第2天，通過FACS分析對血液和選定組織區(qū)室中的B細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)。結(jié)果(圖6)顯示2H7.v511在低劑量和高劑量都比2H7.vl6更有效的消減血液和腹腔中的B細(xì)胞。在脾中(圖7),2H7.v511在低劑量顯示出微弱至顯著更多的消減，但此差異在高劑量沒有觀察到。圖8顯示了實驗的示意圖并總結(jié)了vl6和v511之間的CD20結(jié)合和Fc功能的水平。還在小鼠模型中比較了2Hlv511與rituximab(Rituxan⑧)的B細(xì)胞消減情況；實驗概述于圖12。如圖13所示，2H7.v511在低劑量和高劑量都顯示出比rituximab更高的血液和腹腔B細(xì)胞消減。圖14顯示了脾中的B細(xì)胞消減情況。在0.5mg/kg(圖中的12.5(ig)的低劑量，用v511比用rituximab更有效的消減總的和濾泡脾B細(xì)胞；然而，v511表現(xiàn)出在介導(dǎo)邊緣區(qū)B細(xì)胞消減方面與rituximab相比效率相似或稍低。還基本上如上文實施例9所述在獼猴中研究了2H7.v511的體內(nèi)效果。實施例16:腫瘤生長的體內(nèi)抑制依照上文實施例10所述流程在Balb/c棵(無胸腺)鼠中評估了2H7.v511抑制Raji人B細(xì)胞，一種淋巴瘤細(xì)胞系(ATCCCCL86)生長的能力。實施例17:FcRn結(jié)合對藥動學(xué)影響的體內(nèi)試驗為了測定提高FcRn結(jié)合對這些Fc變體抗體體內(nèi)藥動學(xué)的影響，給獼猴(Macaca/oyc/cM/an》或其它靈長類物種靜脈內(nèi)注射每種抗體變體，隨時間推移收集血樣以監(jiān)測抗體的清除。在一個或多個劑量水平注射數(shù)只動物。在一個實驗中，在時間零點和第1天單劑靜脈內(nèi)注射l-20mg/kg。在劑量給藥前和劑量給藥后6小時、24小時和72小時收集血液(血清)樣品。在第8天、第10天、第30天和第60天收集另外的樣品。用ELISA測定血清樣品中的抗體濃度。用標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)技術(shù)(ShargelandYu,AppliedPharmaceuticsandPharmacokinetics,Fourthedition,pp.67-98,AppletonandLange,Stamford,CT(1999))對血清中抗體濃度的時間依賴性降低建模。使用二室模型(two-compartmentmodel)來說明抗體在組織間的最初分布(a階段)，隨后是終止或消除階段((3階段)。如此計算的消除半衰期(tv/)揭示了FcRn結(jié)合提高的效果，因為FcRn起到了維持循環(huán)中的IgG的作用。實施例18:對來自CLL患者的細(xì)胞的ADCC、CDC活性在此項研究中，測試了抗體2H7.v511和v114對來自CLL患者的B細(xì)胞的補體活性。PBMC分離自三名CD20陽性的CLL患者(在CLL患者中，在PBMC級分中找到的大多數(shù)細(xì)胞是B細(xì)胞)。在96孔微孔板格式中，將來自每名患者的50,000個PBMC與50pl自lOOOnM開始并1:3倍連續(xù)稀釋的抗體的滴定mAb(vl14、v511或Rituxan)混合。每個孔接受50(il已經(jīng)1:4稀釋的正常人血清補體。將混合物于37。C保溫2小時，然后加入50)il代謝染料指示劑AlamarBlue(細(xì)胞溶解的指示劑)并繼續(xù)于37°C保溫過夜(約16小時)。將96孔板于室溫?fù)u動1分鐘并在熒光平板讀數(shù)器上于535nm/590nm讀數(shù)。相對熒光單位相對于抗體濃度作圖，得到EC50。從比較v114與Rituxan的CDC活性的圖15和比較v511與Rituxan的圖16顯示的結(jié)果可見，v511和vll4二者對所有3名患者的效力大致相當(dāng)，但顯著優(yōu)于Rituxan禾口vl6。在分開的研究中，比較了2H7.v511與Rituxan在體外測定法中對MEC1B-CLL細(xì)胞系(Stacchini,Aetal.(1999)LeukemiaRes.23:127-136)和來自B-CLL(B細(xì)胞相關(guān)CLL)患者的B細(xì)胞的ADCC效力。實'驗如下進(jìn)行。依照制造商(RosetteSep,StemCellTechnologies)推薦的方案用負(fù)選擇從lOOmL正常人全血中分離NK細(xì)胞。全血供體在NK細(xì)胞上CD16的表型表達(dá)方面有所變化。等位基因差異發(fā)生于第158位，包括纈氨酸-纈氨酸、纈氨酸-苯丙氨酸和苯丙氨酸-苯丙氨酸表型。典型的是，用纈氨酸-苯丙氨酸表型進(jìn)行測定。如下在圓底96孔微孔板中進(jìn)行測定。將50^L自10-100nM開始連續(xù)稀釋的mAb與50(iL靶細(xì)胞一起保溫。靶細(xì)胞包括B-CLLMEC1細(xì)月包系(10,000個每50jiL)及來自B-CLL患者的PBMC(30,000個每50jiL)。PBMC用標(biāo)準(zhǔn)Ficoll-PaquePlus梯度分離從CLL供體的全血分離。與連續(xù)稀釋的抗體于室溫保溫30分鐘后，加入50(iLNK細(xì)胞(50,000個)并繼續(xù)于37°C保溫4小時。將平板以1500rpm離心10分鐘并除去lOOuL細(xì)胞培養(yǎng)基。通過測量由溶解的細(xì)胞所釋;故的乳酸脫氫酶的量(LDH試劑盒，Roche)來測定細(xì)胞溶解水平。測定相對于mAb濃度的溶解百分率并用4參數(shù)曲線擬合在KaleidaGraph中作圖。報告使用MEC1細(xì)胞系得到的1(35()值。用點至點的線圖繪制CLLPBMC數(shù)據(jù)并報告在30、5和0.8nM的殺傷百分率。結(jié)果顯示在所有三名患者的樣品中2H7.v511的ADCC活性均高于Rituxan。在30nM、5nM和0.8nM抗體時，2H7.v511較之Rituxan的提高分別是2.8倍、6.2倍和5.4倍。NK細(xì)胞是VF表型的。在介導(dǎo)MEC1細(xì)胞的細(xì)胞溶解方面，2H7.v511的ADCC活性也高于Rituxan。2H7.v511的活性比Rituxan高大于13倍，2H7.v511的ICso是0.95pM而Rituxan的是0.012nM。NK細(xì)胞是VV表型的。結(jié)論總之，與2H7.vl6相比，2H7.v511和v114顯示出升高的CD20結(jié)合親和力、升高的CDC活性、升高的ADCC活性和升高的對于B細(xì)胞體內(nèi)消減的體內(nèi)#丈力。實施例19依照下表所示的研究設(shè)計用2H7.v511和vll4在獼猴中進(jìn)行研究以評估安全性、在靈長類動物中的PK及體內(nèi)正常B細(xì)胞消減。所述動物在每個劑量水平接受4次每周一次的劑量用藥。對2.5或50mg/kgx4劑量給藥的動物進(jìn)行的分析顯示v511和v114都消減外周B細(xì)胞。在用v511進(jìn)行的初步研究中，在50mg/kg時外周B細(xì)胞迅速且完全消減。才艮據(jù)尸檢發(fā)現(xiàn)，組織B細(xì)胞在此劑量也有顯著消減。<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table>實施例20:NHL的I/II期臨床研究下表顯示了關(guān)于治療非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的一項I/II期臨床研究設(shè)計，其中在一項研究中使用抗體hu2H7.v16而在平行研究中使用hu2H7.v511?？贵w經(jīng)靜脈內(nèi)輸注來施用。此劑量給藥方案也可用于上文所述本發(fā)明的其它hu2H7變體。非何杰金氏淋巴瘤的2H7I/II期研究-劑量/輸注速率<table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>實施例21:NHL的I期臨床研究2下表顯示了關(guān)于治療非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的另一項I期臨床研究設(shè)計，其中在一項研究中使用抗體hu2H7.v16而在平行研究中使用hu2H7.v511?？贵w經(jīng)靜脈內(nèi)輸注來施用。此劑量給藥方案也可用于上文所述本發(fā)明的其它hu2H7變體。每劑相隔3周給藥，總共8劑。3組(10名患者/組)q3wksx8<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>實施例22:NHL的I/II期劑量逐步增大分組下表顯示了關(guān)于使用抗體hu2H7.v511治療非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的另一項I/II期臨床研究設(shè)計。患者每周一次用藥，共4周。通過例如CT掃描看肺瘤收縮來測量功效。(每組3-6名患者)<table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>頁實施例23:NHL的I/II期劑量逐步增大分組下表顯示了關(guān)于使用抗體hu2H7.v511治療非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的另一項MI期臨床研究設(shè)計?；颊呙恐芤淮斡盟帲?周。通過例如CT掃描看腫瘤收縮來測量功效。<table>tableseeoriginaldocumentpage110</column></row><table>實施例24:2H7.v511在中度至重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的I/II期研究^f兌^理的沒f各組受試者按照如下逐步增大計劃在第1天和第15天以指定劑量接受兩次靜脈內(nèi)輸注hu2H7.v511或安慰劑同等物-10mghu2H7.v511或安慰劑同等物8名受試者接受活性劑，2名對照-50mghu2H7.v511或安慰劑同等物8名受試者接受活性劑，2名對照-100mghu2H7.v511或安慰劑同等物8名受試者接受活性劑，2名對照-200mghu2H7.v511或安慰劑同等物8名受試者接受活性劑，2名對照-300mghu2H7.v511或安慰劑同等物8名受試者接受活性劑，2名對照-500mghu2H7.v511或安慰劑同等物8名受試者接受活性劑，2名對照《放2H7.v511的功效通過ACR響應(yīng)來測量。通過治療組總結(jié)獲得ACR20、ACR50和ACR70響應(yīng)的受試者的百分率，并且產(chǎn)生每組的95%置信區(qū)間。參考文獻(xiàn)本申請中引用的參考文獻(xiàn)，包括專利、已公布的申請及其它出版物，均在此收入作為參考。除非另有說明，本發(fā)明的實行中將采用分子生物學(xué)等的常規(guī)技術(shù)，這些均在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)。這樣的技術(shù)在文獻(xiàn)中有完整的闡述。參閱例如MolecularCloning:ALaboratoryManual(J,Sambrooketal"ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y"1989》CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.Ausubeletal"eds.，1987updated);^E^ew"'a/iVfo/ecw/ar(T.Browned"IRLPress1991);GeneExpressionTechnology(Goeddeled.,AcademicPress1991);MethodsforCloningandAnalysisofEukaryoticGsnes(A.Bothwelletal.eds.,BartlettPubl.1990》GeneTransferandExpression(M.Kriegler,StocktonPress1990);RecombinantDNAMethodologyII(R.Wuetal.eds"AcademicPress1995);PCR:APracticalApproach(M.McPhersonetal.,IRLPressatOxfordUniversityPress1991);OligonucleotideSynthesis(M.Gaited"1984);CellCultureforBiochemists(R.Adamsed"ElsevierSciencePublishers1990);GeneTransferVectorsforMammalianCells(丄Miller&M.Caloseds"1987);MammalianCellBiotechnology(M.Butlered"1991);AnimalCellCulture(J.Pollardetal.eds"HumanaPress1990);CultureofAnimalCells,2ndEd.(R.Freshneyetal.eds.,AlanR.Liss1987);FlowCytometryandSorting(M.Melamedetal.eds.,Wiley-Liss1990);叢書MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.,WirthM.andHauserH.(1993);ImmunochemistryinPractice'3rdedition,A.Johnstone&R.Thorpe,BlackwellScience,Cambridge,MA，1996;TechniquesinImmunocytochemistry(G.Bullock&P.Petruszeds"AcademicPress1982,1983,1985,1989);HandbookofExperimentalImmunology(D.Weir&C.Blackwell,eds.);CurrentProtocolsinImmunology(J.Coliganetal.eds.1991);Immunoassay(E.RDiamandis&T.K.Christopoulos,eds.，AcademicPress,Inc.,1996);Goding(1986)MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice(2ded)AcademicPress,NewYork;EdHarlowandDavidLane,AntibodiesAlaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NewYork,1988;AntibodyEngineering,2ndedition(C.Borrebaeck,ed.,OxfordUniversityPress,1995);叢書AnnualReviewofImmunology;及叢書AdvancesinImmunology。權(quán)利要求1.結(jié)合人CD20的人源化2H7抗體或其抗原結(jié)合片段，所述抗體包含SEQIDNO.25的輕鏈可變區(qū)(VL)序列和SEQIDNO.8的重鏈可變區(qū)(VH)序列，但VH-CDR2中有氨基酸替代D56A，且VH-CDR3中的N100用Y或W替代。2.權(quán)利要求1的抗體，其中N100用Y替代。3.權(quán)利要求1的抗體，其中N100用W替代。4.權(quán)利要求1的抗體，還包含VH-CDR3中的替代S1OOaR。5.權(quán)利要求4的抗體，還包含IgGFc區(qū)中至少一處改善ADCC和/或CDC活性的氨基酸替代。6.權(quán)利要求5的抗體，包含IgGlFc且該IgGlFc包含氨基酸替代S298A、E333A、K334A、K326A。7.權(quán)利要求4的抗體，還包含F(xiàn)c區(qū)中至少一處改善ADCC活性但降低CDC活性的氨基酸替代。8.權(quán)利要求7的抗體，至少包含氨基酸替代K322A。9.權(quán)利要求8的抗體，還包含氨基酸替代S298A、E333A、K334A。10.權(quán)利要求6的抗體，包含SEQIDN0.26的輕鏈序列和SEQIDNO.34的重鏈序列。11.權(quán)利要求4的抗體，它以相對于抗體2H7.vl6而言提高至少3倍的親和力結(jié)合人CD20。12.權(quán)利要求4的抗體，它以相對于抗體2H7.vl6而言才是高至少6倍的親和力結(jié)合人CD20。13.權(quán)利要求6的抗體，它展示出比2H7.vl6高至少20倍的抗體依賴性細(xì)胞的細(xì)胞毒性(ADCC)。14.權(quán)利要求6的抗體，它展示出比2H7.vl6高至少25倍的補體依賴性細(xì)胞毒性。15.權(quán)利要求l-14任一項的抗體，它與細(xì)胞毒劑偶聯(lián)。16.權(quán)利要求15的抗體，其中所述細(xì)胞毒劑是放射性同位素或毒素。17.權(quán)利要求l-14任一項的抗體，所述抗體在CHO細(xì)胞中生成。18.編碼權(quán)利要求1的抗體的分離的核酸。19.編碼權(quán)利要求1或權(quán)利要求10的抗體的表達(dá)載體。20.包含權(quán)利要求18的核酸的宿主細(xì)胞。21.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，它生成權(quán)利要求1-14任一項的抗體。22.權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞，它生成抗體且該抗體包含SEQIDNO.26的輕鏈序列和SEQIDNO.34的重《連序列。23.權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，它是CHO細(xì)胞。24.生成權(quán)利要求l-14任一項的抗體的方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求21的宿主細(xì)月包并從細(xì)胞培養(yǎng)物中回收抗體。25.包含權(quán)利要求1的抗體及載體的組合物。26.權(quán)利要求25的組合物，包含權(quán)利要求10的抗體及藥學(xué)可接受載體。27.制品，包括容器及裝在該容器中的組合物，其中所述組合物包含權(quán)利要求l-17任一項的抗體。28.權(quán)利要求27的制品，還包括指明該組合物用于治療非何杰金氏淋巴瘤的包裝插頁，其中所述抗體包含SEQIDNO.26的輕鏈序列和SEQIDNO.34的重《連序列。29.權(quán)利要求27的制品，還包括指明該組合物用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的包裝插頁。30.治療CD20陽性癌癥的方法，包括給癌癥患者施用治療有效量的權(quán)利要求1-17任一項的人源化2H7抗體。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述CD20陽性癌癥是B細(xì)胞淋巴瘤或白血病。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述CD20陽性癌癥是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述癌癥是慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)或SIX。34.權(quán)利要求32或權(quán)利要求33的方法，其中所述抗體包含SEQIDNO.26的輕鏈氨基酸序列和SEQIDNO.34的重鏈氨基酸序列。35.權(quán)利要求31的方法，其中所述抗體經(jīng)靜脈內(nèi)輸注施用。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述抗體以每劑約100mg/m2至375mg/m2范圍內(nèi)的劑量施用。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述抗體以每劑375mg/m2的劑量施用至少4劑。38.權(quán)利要求30的方法，還包括對患者施用至少一種化療劑。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述癌癥是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)且所述化療劑選自多柔比星、環(huán)磷酰胺、長春新^4和潑尼+>龍。40.減輕自身免疫病的方法，包括對自身免疫病患者施用治療有效量的權(quán)利要求1-14任一項的人源化2H7抗體。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述抗體包含SEQIDNO.26的輕鏈氨基酸序列和SEQIDNO.34的重鏈氨基酸序列。42.權(quán)利要求41的方法，其中所述自身免疫病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)包括狼瘡性腎炎、韋格納氏病、炎性腸病、潰瘍性結(jié)腸炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性血小板減少癥、多發(fā)性硬化、銀屑病、IgA腎病、IgM多神經(jīng)病、重癥月幾無力、ANCA相關(guān)性血管炎、糖尿病、雷諾氏綜合征、斯耶格倫氏綜合征、視神經(jīng)脊髓炎(NMO)和腎小球腎炎。43.權(quán)利要求42的方法，44.^又利要求43的方法，45.權(quán)利要求44的方法，46.權(quán)利要求45的方法，47.權(quán)利要求43的方法，48.權(quán)利要求43的方法量l爭月永內(nèi)施用。49.權(quán)利要求48的方法，50.權(quán)利要求40的方法，51.;f又利要求50的方法，52.權(quán)利要求51的方法融合蛋白。53.^又利要求30的方法，54.液體配制劑，其在20mM乙酸鈉pH5.5，4%二水合海藻糖，0.02%聚山梨醇酯20中含有約20mg/ml人源化2H7.v511抗體，供靜脈內(nèi)施用。55.液體配制劑，其在20mM乙酸鈉pH5.3,240mM(8%)二水合海藻糖,其中所述自身免疫病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。還包括對患者施用第二種治療劑。其中所述第二種治療劑是免疫抑制劑。其中所述免疫抑制劑是曱氨蝶呤。其中所述抗體靜脈內(nèi)或皮下施用。其中所述抗體以每劑10mg至500mg范圍內(nèi)的劑其中所述抗體以100mg/劑的劑量施用。還包括對患者施用第二種治療劑。其中所述第二種治療劑是BAFF拮抗劑。其中所述BAFF拮抗劑是抗BR3抗體或BR3-Fc還包括給患者施用VEGF拮抗劑。0.02o/0聚山梨醇酯20中含有約20mg/ml人源化2H7.vl14抗體。56.液體配制劑，其在20mM乙酸鈉pH5.3,4%二水合海藻糖，0.02%聚山梨醇酯20中含有約30mg/ml人源化2H7.vl6抗體，供靜脈內(nèi)施用。全文摘要本發(fā)明提供了改良的人源化CD20結(jié)合抗體，用于治療B細(xì)胞惡性腫瘤和自身免疫病。文檔編號C07K16/28GK101151278SQ200680010720公開日2008年3月26日申請日期2006年2月6日優(yōu)先權(quán)日2005年2月7日發(fā)明者亨利·B·洛曼,卡梅利亞·W·亞當(dāng)斯,杰拉爾德·R·納卡穆拉申請人:健泰科生物技術(shù)公司