專利名稱：：用于lps脫毒的多粘菌素b類似物的制作方法用于LPS脫毒的多粘菌素B類似物本發(fā)明涉及用于LPS脫毒的多粘菌素B的肽類似物。在藥學領域，這些肽類似物(i)本身可用于治療致死性疾病，如由革蘭氏陰性細菌感染所致的敗血癥性休克；或(ii)可以與LPS非共價地結合，因而使LPS脫毒；該肽類似物與LPS的復合體用作抗革蘭氏陰性細菌感染的疫苗藥物。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細菌的細胞壁外膜的主要成分。LPS對于哺乳動物、特別是人類是強毒性的，并且就其生物學活性而言稱作內(nèi)毒素。它導致敗血癥性休克中由內(nèi)毒素中毒引起的結果，敗血癥性休克是在革蘭氏陰性細菌所致的急性感染(敗血癥)時發(fā)生的致命事件。LPS結構由稱作脂質A的脂質部分共價連接于多糖部分構成。脂質A是LPS毒性效應的原因，尤其通過與B細胞及巨噬細胞相互作用導致毒性效應。這種相互作用誘導促炎細胞因子分泌。炎性病癥可達到內(nèi)毒素性休克的致命狀態(tài)。脂質A是高度疏水的并且固定LPS于細菌細胞壁外層內(nèi)。脂質A由具有(ii)脂肪酸的(i)保守的二磷酸化二糖區(qū)域(最經(jīng)常地是N,O-酰基P-l,6-D-葡糖胺1，4'-二磷酸酯)組成，其中所述的脂肪酸取代屬于二糖羥基的不同氫原子。脂肪酸的數(shù)目及其組成是種間可變的。例如，腦膜炎奈瑟氏球菌.(^Vdssen'flwte附'"g幼V/的脂質A的兩個對稱性葡糖胺(GlcNl和GlcN2)的每一個均攜帶如下脂肪酸2N-C14,30H;C12和30-C12,30H。LPS多糖部分由引起抗原性的糖鏈構成。糖鏈結構本身包含(i)稱作KDO(2-酮,3-脫氧辛酮糖酸)區(qū)的結合于脂質A的保守內(nèi)核和(ii)通常定義為包括各種糖的結合于KDO區(qū)的可變外核，以及(iii)外部O-特異性鏈的第一重復單元(其可以包含多達10個糖)。在革蘭氏陰性的非腸內(nèi)細菌如奈瑟氏菌屬(A^wenVw)、鮑特氏菌屬、嗜血桿菌屬(/Tfle/wo/7/w'ftw)和莫拉氏菌屬(M/me/to)中不存在0-特異性鏈(所定義的第一重復單元實際上不重復)。因此常常將這些細菌的LPS稱作脂寡糖(LOS)。LPS不僅有毒，而且免疫原性高。在哺乳動物中，抗LPS抗體在感染和攜帶期間被誘導，并且該抗體是保護性抗體。鑒于此，已經(jīng)建議使LPS脫毒并將其脫毒的形式用于預防革蘭氏陰性細菌感染和相關疾病。數(shù)種脫毒方法已經(jīng)是已知的。尤其有可能在使用多粘菌素B或更適當?shù)卦谑褂闷潆念愃莆飼r使LPS脫毒。多粘菌素B是以高親和力結合脂質A以使LPS顯著脫毒的分子。當在動物模型中治療性給予時，多粘菌素B可以預防敗血癥性休克，然而多粘菌素B是可能對人有某種程度毒性的聚陽離子抗生素，其原因是多粘菌素B的生物不可降解性和隨之而來的腎臟內(nèi)蓄積傾向。因此在預防性或治療性產(chǎn)品中不推薦使用它。為克服這種限制，已經(jīng)開發(fā)多粘菌素B的肽類似物。這些肽類似物不保留多粘菌素B的毒性，而僅才莫擬多粘菌素B的一級結構和二級結構并在如多粘菌素B結合的相同位點結合脂質A，以形成LPS-肽復合體。因此，LPS被脫毒。肽類似物具體描述于US5,358，933、WO93/14115、WO95/03327、WO96/38163,EP842666和EP976402。肽類似物之一，式KTKCKFLKKC的環(huán)狀單體SAEP2(合成抗內(nèi)毒素肽2)已經(jīng)得到更細致地研究(Rustici等，l993,Science259:361和Velucchi等，1997,J.Endotox.Res.4(4):26])?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)SAEP2肽以及相似的肽(下文中統(tǒng)稱作SAEPII肽)在它們處于二聚體形式時尤其有意義，其中所述的肽在其序列中包含大量的不帶電荷的極性氨基酸，所述極性氨基酸由兩個鄰近的半胱氨酸殘基環(huán)繞，并由陽離子氨基酸組成的外部短尾所平衡，所述二聚體的構象由半胱氨酸殘基間的一對二疏鍵形成并由其維持。實際上，SAEPII肽二聚體表現(xiàn)出勝過相應單體的增強的脫毒特性。因此，本發(fā)明涉及式(I)的SAEPII肽二聚體NH2-A-Cysl國B-Cys2誦C畫COOHNH2-A'-Cysl-B'-Cys2-C'-COOH其中兩個Cysl殘基經(jīng)二硫鍵連接在一起并且兩個Cys2殘基經(jīng)二石克鍵連接在一起；或式(II)的SAEPII肽二聚體NH2-A-Cysl-B-Cys2-C-COOHCOOH國C'隱Cys2-B'國Cysl-A'-NH2其中Cysl殘基經(jīng)二硫鍵與Cys2殘基連接；其中A和A'獨立地是有2至5個氨基酸殘基、優(yōu)選3或4個氨基酸殘基的肽部分，其中至少2個氨基酸殘基獨立地選自Lys、Hyl(羥基賴氨酸)、Arg和His;其中B和B'獨立地是有3至7個氨基酸殘基、優(yōu)選4或5個氨基酸殘基的肽部分，其包含獨立選自Val、Leu、Ile、Phe、Tyr和Trp的至少2個、優(yōu)選3個氨基酸殘基；并且其中C和C'是任選的(這些位置可以為空或不空)，并且獨立地是氨基酸殘基或有2至3個氨基酸殘基的肽部分；前提是陽離子氨基酸殘基/疏水性氨基酸殘基比率(陽離子殘基/疏水殘基比)是0.4至2,有利地是0.5至1.2或至1.5，優(yōu)選地是0.6至l，最優(yōu)選地是0.6至0.8，例如0.75。有利地，A和A'獨立地是有2至5個氨基酸殘基、優(yōu)選3或4個氨基酸殘基的肽部分，其中至少1個、優(yōu)選2個氨基酸殘基獨立地選自Lys、Hyl、Arg和His;非選自Lys、Hyl、Arg和His的那些氨基酸殘基("剩余的氨基酸殘基")(若存在)選自不帶電荷的極性或非極性氨基酸殘基，優(yōu)選Thr、Ser和Gly;最優(yōu)選Thr。當A和A'肽部分包含3個氨基酸殘基時，它們中每一個可以是陽離子殘基，或三個殘基中的兩個是陽離子氨基酸，而剩余殘基選自不帶電荷的極性或非極性氨基酸殘基，優(yōu)選Thr、Ser和Gly;最優(yōu)選Thr。當A和A'肽部分包含4個氨基酸殘基時，優(yōu)選四個殘基中的2個或3個殘基選自如上所定義的陽離子氨基酸殘基，而剩余殘基選自如上所定義的不帶電荷的極性或非極性氨基酸殘基。當A和A'肽部分包含5個氨基酸殘基時，優(yōu)選五個殘基中的3個或4個殘基選自如上所定義的陽離子氨基酸殘基，而剩余殘基選自如上所定義的不帶電荷的極性或非極性氨基酸殘基。有利地，B和B'獨立地是有3至7個氨基酸殘基、優(yōu)選4或5個氨基酸殘基的肽部分，其包含至少2個、優(yōu)選3個氨基酸殘基，所述氨基酸殘基獨立地選自Val、Leu、Ile、Phe、Tyr和Trp;優(yōu)選選自Leu、lie和Phe;非選自Val、Leu、Ile、Phe、Tyr和Trp的那些氨基酸殘基("剩余的氨基酸殘基")(若存在)獨立地選自Lys、Hyl、Arg和His。正如可以輕易理解的是，B和B'肽部分可以包含獨立地選自Val、Leu、Ile、Phe、Tyr和Trp的多達7個氨基酸殘基。有利地，B和B'肽部分包含序列-Xl-X2-X3-,在其中X1和X2;X2和X3;或X1、X2及X3獨立地選自Val、Leu、Ile、Phe、Tyr和Trp;優(yōu)選選自Leu、lie和Phe。在優(yōu)選的實施方案中，序列-Xl-X2-X3-包含Phe-Leu基序。肽部分B和B'的具體實施方案包括(i)-Xl-X2-X3-序列，其中Xl是Lys、Hyl、His或Arg、優(yōu)選Lys或Arg;更優(yōu)選Lys;X2是Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp或Val;優(yōu)選Phe或Leu;更優(yōu)選Phe;并且X3是Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp或Val;優(yōu)選Phe或Leu;更優(yōu)選Leu;和(ii)氨基酸殘基(若存在)，其分別獨立地選自Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Hyl、Arg和His;優(yōu)選Val、Leu、Ile、Phe、Tyr和Trp;更優(yōu)選Leu、lie和Phe。當B和B'包含多于4個非極性氨基酸殘基時，A和A'選地包含至少3個帶正電荷的氨基酸殘基。在C和C'肽部分中，氨基酸殘基可以是任何氨基酸殘基，前提是陽離子氨基酸殘基/疏水性氨基酸殘基比率保持在規(guī)定范圍內(nèi)。有利地，它們獨立地選自不帶電荷的極性或非極性氨基酸殘基，優(yōu)選不帶電荷的非極性氨基酸殘基。然而，在優(yōu)選的方式下，C和C'是空位置。-因此，優(yōu)選的一類二聚體是式(m)NH2-A-Cysl-B-Cys2-COOHNH2-A'-Cys1-B'-Cys2-COOH或式(IV)NH2-A-Cysl-B-Cys2-COOHHOOC-Cys2-B'-Cysl-A'-NH2其中A、A'、B和B'如上所述，前提是陽離子氨基酸殘基/疏水性氨基酸殘基比率是0.4至2，有利地是0.5至1.2或至1.5,優(yōu)選0.6至l,最優(yōu)選0.6至0.8;例如0.75。肽處于平行方向的式(i)或(in)的二聚體稱作平行二聚體。肽處于反平行方向的式(n)或(iv)的二聚體稱作反平行二聚體d在式(I)至(IV)中，A和A'優(yōu)選完全相同。B和B'，C和C同樣如此。其中A和A'、B和B'以及C和C'兩兩完全相同的式(I)、(11)、(m)或(iv)的肽二聚體稱作同源二聚體。實際上，在此情況下，二聚體內(nèi)所包含的肽亞單位是完全相同的。例如，如下肽適合用于本發(fā)明二聚體NH2-Lys-Arg-His-Hyl-Cys-Lys-Arg-Ile-Val-Leu-Cys-COOH;NH2-Lys-Arg-His-Cys-Val-Leu-Ile-Trp-Tyr-Phe-Cys-COOH;NH2-Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys-COOH;和NH2-Hyl-Arg-His-Lys-Cys-Phe-Tyr-Trp-Val-Ile-Leu-Cys-COOH。相應的同源二聚體各自的陽離子殘基/疏水殘基比是2.00、0.50、0.75和0.67。以上所述二聚體的具體實例由式(V)肽構成NH2-Lys-Thr-Lys-Cys1-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH。此肽下文中稱作SAEP2-L2肽。如上所述，此肽也可以處于平行二聚體形式或反平行二聚體形式。本發(fā)明二聚體中所涉及的肽可以使用例如計算機控制的自動合成儀，通過經(jīng)典方法常規(guī)地合成。了解如何設計方法以便得到特定的肽處在肽合成領域技術人員的能力范圍內(nèi)。不言自明的是合成期間，半胱氨酸的巰基可以是受保護的。一旦合成完成，半胱氨酸的巰基被脫保護，并且完成巰基的氧化以生成環(huán)狀單體、平行二聚體或反平行二聚體。當肽內(nèi)存在的兩個半胱氨酸殘基同時進行脫保護時，理論上可能在氧化時生成三種形式中的每一形式。隨后三種形式中的每一形式可以通過常規(guī)生物化學純化方法彼此分開。制備性反相高效液相色i普(RP-HPLC)為合適的實例。實際上，可以期望三種形式中的每一形式以不同的保留時間被洗脫。因此含有純化的環(huán)狀單體或純化的平行及反平行二聚體的制備物可以通過將各自的峰餾分匯集在一起而輕易得到。在氧化時所生成的三種形式中每一形式各自的比例取決于具體氨基酸序列，并且重要的是，取決于肽的濃度。優(yōu)勢地產(chǎn)生三種形式中一種或兩種形式是可能的；并且一種或兩種形式的優(yōu)勢可以達到使其它形式根本不形成的程度。例如，SAEP2-L2肽自然地氧化成環(huán)狀單體和反平行二聚體，其比例取決于溶液內(nèi)肽的濃度。反平行二聚體"側鏈"(NH2-Lys-Thr-Lys-部分)的內(nèi)在空間位阻明顯比平行二聚體側鏈的內(nèi)在空間位阻更低，并且可以預期，與平行二聚體相比較低的最小能量是含水溶劑中優(yōu)先形成反平行二聚體的原因。作為這種受濃度驅動過程的直接結果，促進了反平行二聚體的形成，同時較低程度地促進了環(huán)狀單體的形成，直至從該平衡中排除平行二聚體。當平行二聚體不能在氧化時自然地形成時，需要采用特定措施以使肽在平行方向結合。這些措施處于肽合成領域技術人員的技能范圍內(nèi)。然而并且僅作為舉例，人們指出差異性地保護Cysl和Cys2氨基酸，隨后進行選擇性脫保護是實現(xiàn)以平行方向進行二聚化的便捷途徑。二聚體P逸后可通過常規(guī)方法純化，包括RP-HPLC?；瘜W合成并純化的肽通常以鹽形式獲得，其原因在于化學合成和純化步驟中使用了酸和鹽。乙酸鹽是常用的鹽。因此，應當理解的是術語"肽"如本描述中所用還包括鹽形式。用于本發(fā)明二聚體中的肽可以通過多種技術表征，所述技術包括離子回旋共振(ICR)、質量輔助激光解吸電離-飛行時間(MALDI-ToF)能譜法和核磁共振(NMR)分光光度法。尤其可通過NMR分析法區(qū)分三種形式中的每一形式(環(huán)狀單體、平行二聚體和反平行二聚體)。MALDI-ToF質i普法只能在單體和二聚體間作區(qū)分。本發(fā)明化合物的純度可以通過RP-HPLC評估。簡而言之，化合物的制備物由RP-HPLC分析。相對純度通過峰面積積分進行計算。相對純度表示為化合物的峰面積/所有峰的面積。通常所制備的本發(fā)明化合物各自具有的純度至少為95%、常常至少為97%。本發(fā)明還涉及組合物，其包含-SAEPII肽，所述肽基本上處于二聚體平行形式；-SAEPII肽，所述肽基本上處于二聚體反平行形式；-或其混合物。"基本上"，意指在組合物中，特定形式的純度至少是95%、優(yōu)選地是至少97%、更優(yōu)選地是98%。其中SAEPII肽以數(shù)種形式(二聚體平行形式、二聚體反平行形式和/或單體形式)存在的混合的組合物可以由包含單一實體(例如二聚體平行形式)的組合物在適宜溫度下保持一段時間后經(jīng)演化自然產(chǎn)生。這可以通過例如RP-HPLC分析顯示。各種肽形式各自的量可以通過相同的表征進行定量。SAEPII二聚體例如可在體外及體內(nèi)用作革蘭氏陰性細菌LPS的脫毒劑。因此，它們可以用來預防或治療由于革蘭氏陰性細菌感染而使LPS釋放進入全身循環(huán)(例如進入血液)所致的病癥。這些病癥包括例如內(nèi)毒素中毒、細菌性敗血癥和敗血癥性休克。因此，本發(fā)明包含-本發(fā)明的化合物或組合物的藥學用途；-包含本發(fā)明的化合物或組合物連同藥學可接受的稀釋劑或載體的藥物組合物；休克的藥劑中的用途；和-用于治療或預防敗血癥性休克的方法，該方法包括施用治療有效量或預防有效量的本發(fā)明化合物或組合物至有此需求的個體。當可以導致內(nèi)毒素中毒、細菌性敗血癥和/或敗血癥性休克的革蘭氏陰性細菌感染得到診斷時，本發(fā)明的化合物或組合物可以施用至哺乳動物，如人?？赡芤疬@些致死性疾病的革蘭氏陰性細菌包括例如腦膜炎奈瑟氏球菌、大腸埃希氏菌、傷寒沙門氏菌、百日咳鮑特氏菌和銅綠假單胞菌。本發(fā)明的化合物或組合物可以通過全身途徑、優(yōu)選通過靜脈內(nèi)途徑施用至有需求的個體。待施用的劑量取決于多種因素，包括例如患者的年齡、體重、生理狀況以及感染狀態(tài)?？梢允┯靡淮位驍?shù)次直至避免致命事件的風險。因為SAEPII二聚體和SAEP2-L2肽也能夠在體外使LPS脫毒，因此本發(fā)明還涉及包含(i)革蘭氏陰性細菌的LPS部分和(ii)SAEPII肽二聚體或SAEP2-L2肽的LPS-肽復合體；其中LPS部分和SAEPII肽二聚體或SAEP2-L2肽彼此非共價地結合。LPS脫毒可以歐洲藥典內(nèi)提到的多種測定法評估。測定法包括鱟阿米巴樣細胞裂解物(LAL)測定法；兔熱原試驗和D-半乳糖胺致敏小鼠的急性中毒測定法。這些測定法在下文實施例中說明。在每種測定法中，平行測量LPS的效果和LPS-肽復合體的效果以確立脫毒率。在LAL測定法中，脫毒率通過LPS/LPS-肽復合體比率表述。在熱原試驗和急性中毒測定法中，脫毒率通過LPS-肽復合體/LPS比率表述。當測量的脫毒率是如下時，實現(xiàn)顯著的脫毒(i)在LAL測定法中至少是100，優(yōu)選地是500，更優(yōu)選地是1000;(ii)在熱原試驗中至少是50，優(yōu)選地是IOO，更優(yōu)選地是500;或(iii)在D-半乳糖胺小鼠試驗中至少是50,優(yōu)選地是IOO,更優(yōu)選地是200。也可以當在體外或體內(nèi)測定法中比較LPS和LPS-肽復合體對促炎細胞因子如IL6、IL8和TNFa釋放的影響時，評估脫毒。這些測定法在下文實施例中說明。當LPS-肽復合體在如實施例部分5.4.1內(nèi)所述的體內(nèi)測定法中造成IL6分泌至少減少至1/25，優(yōu)選至少減少至1/50、更優(yōu)選至少減少至1/75、最優(yōu)選至少減少至1/100時，實現(xiàn)顯著的脫毒。有利的是，本發(fā)明的LPS-肽復合體特征在于LPS:肽摩爾比為1:1.5至1:0.5、伊G選1:1.2至1:0.8、更伊二選1:1.1至1:0.9、最伊乙選l:l。對于本發(fā)明復合物中的應用，LPS有利地是腦膜炎奈瑟氏球菌；大腸埃希氏菌；傷寒沙門氏菌；副傷寒沙門氏菌；弗氏志賀氏菌；流感嗜血桿菌；幽門螺旋桿菌；沙眼衣原體；百曰咳鮑特氏菌；布魯氏桿菌；嗜肺軍團菌；霍亂弧菌；卡他莫拉氏菌；銅綠假單胞菌；耶爾森氏菌(yerwm'a)和肺炎克雷伯氏菌的LPS。如導言中提及，脫毒的LPS可以用作抗革蘭氏陰性細菌感染的疫苗藥物.腦膜炎是病毒源或細菌源性致命疾病。流感嗜血桿菌和腦膜炎奈瑟氏球菌分別引起約40%和50%的細菌性腦膜炎。雖然抗流感嗜血桿菌疫苗已經(jīng)銷售超過10年，仍需要抗腦膜炎奈瑟氏球菌疫苗。腦膜炎球菌侵入性疾病可以表現(xiàn)為腦膜和脊髓膜的炎癥(腦膜炎)或全身性血液感染(腦膜炎球菌性敗血癥或腦膜炎球菌血癥(meningoccaemia》。使用基于多糖莢膜結構的血清學方法將腦膜炎球菌分類。已經(jīng)描述了13種抗原性和化學性不同的多糖莢膜。幾乎全部的腦膜炎球菌侵入性疾病都由5個血清群引起A、B、C、Y和W-135。每一血清群的相對重要性取決于地理位置的不同。血清群B是溫帶國家大部分腦膜炎球菌性疾病的原因。已經(jīng)存在抗血清群A、C、Y和W-135的綴合多糖疫苗，然而目前沒有可用的抗流行于美國和歐洲的血清群的疫苗。實際上，莢膜多糖作為疫苗藥物用于預防腦膜炎球菌B疾病的用途是有問題的。.因此，利用具有完全抗原性且特別(adhoc)為脫毒形式的腦膜炎奈瑟氏球菌LPS作為疫苗藥物是有前景的替代，其可以提供所需要的疫苗覆蓋范圍，尤其對于血清群B。如以上在導言中提及，革蘭氏陰性的非腸內(nèi)細菌如奈瑟菌、博德特氏菌、嗜血桿菌和莫拉氏菌的細胞壁主要成分是脂寡糖(LOS),而非真正的LPS。然而，為本申請的目的，術語LPS應當理解為包含LOS。LOS構成LPS的特殊亞類。在下文中可交換地使用術語"腦膜炎球菌LPS"和"腦膜炎球菌LOS"。圖1顯示腦膜炎奈瑟氏球菌LOS的結構示意圖。LOS由5至10個單糖組成的分支寡糖通過KDO連接于脂質A所構成。脂質A和由兩個KDO、兩個庚糖(HepI和II)及N-乙酰化葡糖胺(GlcNAc)構成的內(nèi)核是種內(nèi)保守的。構成外核(結合于Hepl的a-鏈；結合于HepII的3位置的P-鏈和結合于HepII的2位置的？鏈)的寡糖鏈的其它部分可隨免疫型(IT)變化。腦膜炎奈瑟氏球菌LPS可以基于它們與一系列單克隆抗體的反應性分類成13個免疫型(Achtman等，1992,JInfect.Dis.165:53-68)。免疫型間的差異來自寡糖鏈的組成和構象的不同。這將在下文表中看到。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>如上表中所示，在LOSLl、L3、L7和L8中，磷酸乙醇胺(PEA)在HepII的位置3處替代卩-鏈的Glc。在LOSL2、L4和L6中，PEA結合至位置6或7。LOSL2、L3、L4、L5、L5、L7還可以用N-乙?；窠?jīng)氨酸在a-鏈的末端半乳糖(Gal)上進行唾液酸化。免疫型Ll-L8主要與血清群B和C有關，而免疫型L9-L12主要存在于血清群A內(nèi)。.雖然任何LOS可以被同等脫毒，但可以有利地在本發(fā)明復合體中采用LOSL8，以進一步用于疫苗用途。實際上，LOSL8a-鏈的全1988,Crit.Rev.Microbiol.24:281)。腦膜炎球菌菌林經(jīng)常表達數(shù)種免疫型，這些免疫型的存在可以受到培養(yǎng)條件影響。如果對LOSL8有特別需要，則可能需要從已知主要表達L8免疫型的菌抹或更好的是從已知只表達L8免疫型的菌林提取這種LOS。血清群A的菌林Al(又稱2E)、血清群B的菌株M978(Mandre11和Zollinger,1977,Infect.Immun.16:471;Gu等，1992,J.Clin.Microbiol.30:2047-2053;Zhu等，2001,FEMSMicrobiol.Lett.203:173),血清群B的菌抹8680(DominiqueCaugeantcollection)和菌抹8532(US6,476,201)適合用于此目的。這些菌抹是可從科學團體獲得的(US6,531,131)。對LOSL8呈特異性的單克隆抗體包括Mab2-l-18(Moran等，1994/"/ec〃m淤w".62:5290-5295;Mandrell等，1986,/"/e"/www".54:63-69)、Mab6E7-10(Braun等，2004,Fbc""e22:898-908)、Mab4387A5和4385G7(Andersen等，1995,A^cra6.P加/zog.19:159-168;Gu等(上述》。為用于本發(fā)明的復合體內(nèi)，LPS可以通過常規(guī)方法得到；尤其LPS可以從革蘭氏陰性細菌培養(yǎng)物中提取并隨后根據(jù)經(jīng)典方法純化?？梢栽谖墨I中找到對此類方法的眾多描述。這包括例如Gu&Tsaii,1993,Infect.Immun.61(5):1873,Wu等，1987,Anal.Biochem.160:281和US6,531，131，所有文獻僅作為例證提及。LPS制備物還可以根據(jù)本領域眾所周知的方法定量。便利方法是用高效陰離子交換色譜(HPAEC)PAD的KDO定量法。LPS可以原始形式或綴合形式與本發(fā)明的化合物復合。LPS綴合物可以按常規(guī)方法，通過將LPS經(jīng)直接共價鍵或使用化學間隔/連接分子共價地連接至載體分子(例如多肽或肽)加以制備。載體分子的實例包括百曰咳類毒素、白喉類毒素或破傷風類毒素和外膜蛋白(OMP)如腦膜炎奈瑟氏球菌的OMP1或OMP2/3?？梢栽谖墨I中找到對此類綴合方法的眾多描述。US6,531,131僅為例證。當以綴合形式利用時，有利的是，LPS在同本發(fā)明的化合物復合前進行綴合，也就是說，非綴合的LPS也是適合的。本發(fā)明還涉及-用于脫毒革蘭氏陰性細菌LPS的方法，該方法包括將(i)革蘭氏陰性細菌的LPS與(ii)本發(fā)明的化合物混合在一起；以及-用于制備LPS-肽復合體的方法，該方法包括將(i)革蘭氏陰性細菌的LPS與(ii)本發(fā)明的化合物混合在一起。為用于本發(fā)明的方法，兩種成分有利地處在液體介質內(nèi)，合適的是處于水中。有利的是，LPS和化合物溶液在混合前進行滅菌。有利的是，制備過程在無菌條件下完成?；旌虾?，形成含有復合體的沉淀。該沉淀可以通過離心回收并根據(jù)需要接受一個或數(shù)個洗滌步驟的處理。如上提及，本發(fā)明的LPS-肽復合體的用途在于，它們可以安全地施用至哺乳動物。實際上，將LPS脫毒至在施用后不會發(fā)生不良事件的程度。例如，在兔熱原測定法中顯示超過lng/mL/kglV劑量、優(yōu)選超過10ng/mL/kgIV劑量的熱原閾值的LPS-肽復合體是適合的。備選地或另外地，可以參考LAL測定法。因為含有3,000-5,000LAL內(nèi)毒素單位LPS的疫苗已經(jīng)批準用于人類(Frederiksen等，NIPHAnnals14(2):67)，可預測本發(fā)明疫苗的劑量可以安全地具有5,000LAL內(nèi)毒素單位或更少，例如少于3,000、2,000、1,000或500LAL內(nèi)毒素單位。例如，因此可接受在LAL測定法中顯示例如100個內(nèi)毒素單位(EU)4ig的復合體以20jug的劑量施用。這用本發(fā)明的復合體是可實現(xiàn)的，因為該復合體可以顯示低于50EU/貼，經(jīng)常低于20EU/貼的LAL活性。此外，本發(fā)明的LPS-肽復合體是穩(wěn)定的，即便在生理條件下也是如此。"穩(wěn)定"意指復合體中LPS的脫毒狀態(tài)在一段時間內(nèi)保持穩(wěn)定，所述時間是至少3個月、6個月、12個月或18個月。這可以通過定期評估(即在以上所列測定法的至少一種測定法中評估)脫毒率進行監(jiān)測。未觀察到脫毒率隨時間的顯著差異。本發(fā)明的LPS-肽復合體的用途還在于它們能夠誘導抗革蘭氏陰性細菌的免疫反應。這可以通過將復合體施予哺乳動物例如兔、小鼠或人，隨后通過血清的ELISA分析以揭示存在LPS特異性抗體(例如免疫球蛋白G或M)而得到證實。有利地，免疫反應(誘導的抗體)可以具有殺菌活性和/或調理活性。由本發(fā)明復合體所誘導的免疫反應的抗革蘭氏陰性細菌感染的保護能力可以在適宜的動物模型內(nèi)評估，所述的動物模型當前對細菌種類或疾病呈特異性。就特定細菌或疾病而選擇已知動物模型處于疫苗領域中技術人員的技能范圍內(nèi)。例如，由本發(fā)明復合體所誘導的免疫反應的抗腦膜炎奈瑟氏球菌的保護能力可以在小鼠腹膜內(nèi)感染模型中進行評估(Schryvers等，1989,Infect.Immun.57(8):2425和Danve等，1993,Vaccine11(12):1214)。此能力還可以在人類中通過在施用復合體后測量人血清的殺菌活性進行評估。實際上，已經(jīng)提議本測試作為保護替代試驗，至少用于腦膜炎奈瑟氏球菌血清群B(Holst等，20(B,Vaccine,21:734)。已經(jīng)表明高于或等于4的人血清殺菌活性(SBA)滴度與保護相關。鑒于此，本發(fā)明還涉及(i)本發(fā)明的LPS-肽復合體用于治療或預防革蘭氏陰性細菌感染的用途；(ii)包含本發(fā)明的LPS-肽復合體和藥學上可接受的稀釋劑或載體的(疫苗)藥物組合物；(iii)本發(fā)明的LPS-肽復合體在制備用于治療或預防革蘭氏陰性細菌感染的藥劑中的用途；(iv)用于誘導哺乳動物抗革蘭氏陰性細菌LPS或革蘭氏陰性細菌的免疫反應的方法，該方法包括施用有效量的本發(fā)明LPS-肽復合體至哺乳動物；和(v)用于治療或預防革蘭氏陰性細菌感染的方法，該方法包括施用治療有效量的本發(fā)明LPS-肽復合體至有需求的個體。本發(fā)明的疫苗組合物可以通過任何的常規(guī)途徑施用，尤其是通過全身途徑或肌內(nèi)途徑施用，可以單次劑量施用，或以重復劑量施用，所述重復劑量可以例如1、2、3、6、10、12個月的間隔重復一次或幾次(例如2次或3次)。本發(fā)明的疫苗組合物可以常頭見地進行配制，有利地以液體形式配制。根據(jù)需要，佐劑可以添加至本發(fā)明的疫苗組合物內(nèi)；然而，在此指出，本發(fā)明復合體可以具有足夠的免疫原性以致不需要在疫苗組合物內(nèi)存在佐劑。合適的劑量取決于可以由本領域技術人員確定的多種參數(shù)，例如接受治療的個體(成人或兒童)、施用的方式和頻率以及LPS脫毒狀態(tài)。通常，用于成年人的劑量不應當超過10,000個LAL內(nèi)毒素單位；有利地是不超過8,000個LAL內(nèi)毒素單位；優(yōu)選地是不超過5,000個LAL內(nèi)毒素單位；更優(yōu)選地是不超過1,000個LAL內(nèi)毒素單位；最優(yōu)選地是不超過500個LAL內(nèi)毒素單位。在LAL測定法中，本發(fā)明復合體測得的值通常可以低至10-20EU/昭。因此，劑量可以含有1至500嗎、有利地含有2.5貼至100貼、優(yōu)選含有10嗎至50叫、更優(yōu)選含有15嗎至30昭。要提醒的是復合體的量通?？偸潜硎鰹長PS含量。因此，僅舉例"50貼復合體，，實際上意指復合體制備物內(nèi)的50ngLPS。在下文中所導艮道的實例通過參考如下附圖進一步說明圖1A顯示腦膜炎奈瑟氏球菌的LPSL8的結構。Kdo代表2-酮,3-脫氧辛酮糖酸；Hep代表庚糖；Glc代表葡萄糖；Gal代表半乳糖并且GlcNAc代表N-乙酰化葡糖胺。圖1B顯示用乙酸處理LPS時發(fā)生的反應。(ii)氨基酸殘基(若存在)，其分別獨立地選自Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Hyl、Arg和His;優(yōu)選Val、Leu、Ile、Phe、Tyr和Trp;更優(yōu)選Leu、lie和Phe。當B和B'包含多于4個非極性氨基酸殘基時，A和A'選地包含至少3個帶正電荷的氨基酸殘基。在C和C'肽部分中，氨基酸殘基可以是任何氨基酸殘基，前提是陽離子氨基酸殘基/疏水性氨基酸殘基比率保持在規(guī)定范圍內(nèi)。有利地，它們獨立地選自不帶電荷的極性或非極性氨基酸殘基，優(yōu)選不帶電荷的非極性氨基酸殘基。然而，在優(yōu)選的方式下，C和C'是空位置。-因此，優(yōu)選的一類二聚體是式(m)NH2-A-Cysl-B-Cys2-COOHNH2-A'-Cys1-B'-Cys2-COOH或式(IV)NH2-A-Cysl-B-Cys2-COOHHOOC-Cys2-B'-Cysl-A'-NH2其中A、A'、B和B'如上所述，前提是陽離子氨基酸殘基/疏水性氨基酸殘基比率是0.4至2，有利地是0.5至1.2或至1.5,優(yōu)選0.6至l,最優(yōu)選0.6至0.8;例如0.75。肽處于平行方向的式(i)或(in)的二聚體稱作平行二聚體。肽處于反平行方向的式(n)或(iv)的二聚體稱作反平行二聚體d在式(I)至(IV)中，A和A'優(yōu)選完全相同。B和B'，C和C同樣如此。其中A和A'、B和B'以及C和C'兩兩完全相同的式(I)、(11)、(m)或(iv)的肽二聚體稱作同源二聚體。實際上，在此情況下，二聚體內(nèi)所包含的肽亞單位是完全相同的。例如，如下肽適合用于本發(fā)明二聚體NH2-Lys-Arg-His-Hyl-Cys-Lys-Arg-Ile-Val-Leu-Cys-COOH;NH2-Lys-Arg-His-Cys-Val-Leu-Ile-Trp-Tyr-Phe-Cys-COOH;NH2-Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys-COOH;和合成循環(huán)根據(jù)報道的線形序列逐步進行。合成循環(huán)在純?nèi)軇┒谆鶗貂０?DMF)內(nèi)進行。使用側鏈受保護的活化的氨基酸。位置10的Cys殘基(Cys-10)的巰基用易酸解基團三苯曱基(三苯曱基衍生物，Trt)保護。位置4的Cys殘基(Cys-10)的巰基用抗酸基團S-乙酰胺基-甲基(Acm)保護。所有氨基酸被O-五氟苯基磷酸酯(O-Pfy-衍生物)在羧基側活化。它們在氨基側被9-芴曱氧羰基酯(Fmoc-衍生物)臨時保護。合成后，使用95%TFA在2-5。/。(v/v)的清除劑乙二硫醇存在下自樹脂支持體切下受保護的肽。在這些條件下，Cys-lO的巰基脫保護，而Cys-4的巰基仍受Acm<呆護。游離的，受Acm保護的肽通過真空蒸發(fā)濃縮并隨后用終濃度80%(v/v)的醚沉淀回收。Cys-4受保護、Cys-lO脫保護的肽在真空下干燥，隨后以濃度1至10mg/mL溶解于水，并用0.1M氨水調節(jié)至pH7.50。為通過Cys10殘基完成二聚化，隨后通過在4°C,1大氣壓下劇烈攪拌該水溶液18-24小時，進行氧化。巰基的完全氧化經(jīng)Elman比色分析法確定。溶液中部分氧化的濃度為lmg/mL至10mg/mL的肽隨后經(jīng)處理，使剩余的Cys-4S-Acm官能團脫保護。為此目的，向肽溶液中添加終濃度為0.1M的乙酸汞，使用2-5。/。(v/v)的苯酚作為清除劑。溶液在20。C,1大氣壓下再次劇烈攪拌18-24小時。巰基的完全氧化通過Elman比色分析法確定。1.2.純化為除去肽制備物內(nèi)所含的的低分子量分子(清除劑、乙酸汞等)，將肽制備物施加至在1Atm壓力下操作的反向柱Sep-Pack(Millipore)上。在含水溶劑中，肽通過疏水力滯留在柱上，而全部水溶性低分子量分子隨流動液流走。肽隨后由甲醇-水50-70。/。(v/v)的混合物洗脫。洗脫在醇溶劑內(nèi)的肽通過真空濃縮回收并再次以所需要的濃度溶解于水內(nèi)。最終純化在HPLC-操作的反向。18柱(尺寸=250x4mm)上，使用線性梯度0-100%的溶劑A(0.iy。TFA(三氟乙酸)/水)和溶劑B(80%的乙酸硝基酯/水)完成。在這些條件下，洗脫的平行二聚體為單個尖銳的峰。峰餾分進行回收。將制備物以凍干形式在+2—+6°C保存于中性氣體、氬氣或氮氣下。1.3.純化肽的表征U.l.氨基酸組成氨基酸組成通過Pico-Tag方法(Millipore)分析。結果報道于下文表內(nèi)。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>1.3.2.分子質量分子質量通過離子回旋共振(ICR)測量。測定的值是2,387.33士0.3AMU,該值與肽式C11()H19Q024N26S4的元素結構一致。實施例2:SAEP2-L2單體和反平行二聚體的制備2丄合成線形單體的合成如實施例1中所述，但使用不同方法學來保護半胱氨酸殘基的巰基Cys-4和Cys-10均由易酸解基團三苯甲基(三苯曱基，Trt)保護其-SH基。受保護的肽使用95o/。TFA在2-5o/。(v/v)的清除劑乙二硫醇存在下自樹脂支持體切下。在這些條件下，Cys-4和Cys-10的巰基均脫保護。已切下并已脫保護的肽隨后在真空蒸發(fā)下濃縮并用80%(v/v)的醚沉淀回收。24脫保護的肽以濃度1至10mg/mL溶解于水并且用0.1M氨水調節(jié)pH至7.50。隨后通過在4°C,1大氣壓下劇烈攪拌水溶液18-24小時進行氧化。巰基的完全氧化通過Elman比色分析法測定2.2.肽的純化溶液內(nèi)的肽實際上形成環(huán)狀單體(約40%)和反平行二聚體(約60%)的混合物。每一形式通過制備性反向HPLC色譜進行純化。由于這些形式的肽在不同的保留時間洗脫(分別為單個尖銳的峰)，故可將反平行二聚體與環(huán)狀單體分離。反平行二聚體以較短的保留時間被洗脫。這與這兩種二聚體的不同分子對稱性符合。反平行肽可以因其側鏈的較低內(nèi)部空間位阻而在水溶劑內(nèi)表現(xiàn)出較低的最小能量(類似于任何其它異構體的"順式"及"反式"構象的對比)。全部制備物在凍干形式下，在+2一6。C,在中性氣體、氬氣或氮氣下保存。2.3.反平行二聚體的表征2.3丄氨基酸組成氨基酸組成通過Pico-Tag方法(Millipore)分析。結果報道于下文表內(nèi)。氨基酸理論(摩爾/摩爾)測定(摩爾/摩爾)賴氨酸6.06.10蘇氨酸2.01.95苯丙氨酸2.01.90亮氨酸6.06.05半胱氨酸4.03.902.3.2.分子質量分子質量通過離子回旋共振(ICR)測量。測定的值是2,387.30士0.3AMU,該值與肽式C。H19Q024N26S4的元素結構一致。如實施例1中所制備的二聚體平行肽以及如實施例2中所制備的單體肽和二聚體反平行肽通過反向HPLC(圖2A-2C)和NMR(圖4A-4C和5A-5C)進一步表征。3.1.通過反向HPLC表征實驗條件本方法使用Millenium軟件32V30501(WatersTM)以獲取數(shù)據(jù)，在HPLC鏈(WatersTM)上進行。分析性柱MachereyNagelTMref720014.6(Nucleosil5pmC18100Angstr6m250x4.6mm)在25。C操作。首先將30-40昭的每種凍干的肽分別溶解于30ltd水內(nèi)，向其中添加30p10.1%的三氟乙酸(TFA)/水。單體肽、二聚體平行肽和反平行肽的混合物也通過在60pl水中混合40]Lig的每種肽的粉狀制備物進行制備，向其添加60一.1%的TFA/水。柱使用20%流動相B(TFA0.1%,CH3CN80%/水)進行平衡。一旦將樣品施加至已平衡的柱上，則流動相B梯度在40分鐘內(nèi)從20%增至60%(1%B/分鐘)，流速為1mL/分鐘。在214nm檢測。結果見圖2A-2C。結果每種肽以不同保留時間被洗脫。在如上所述的實驗條件下，洗脫在如下保留時間(RT)發(fā)生-單體RT-28.283分鐘-平行二聚體RT=29.708分鐘-反平行二聚體RT=22.059分鐘。使用HPLC-RP方法來驗證每種肽制備物的純度。每種肽的相對純度通過峰表面積積分進行計算。相對純度表述為肽峰表面積/所有峰的表面積。在圖2A-2C中可以看到單體制備物和平行二聚體制備物和反平行二聚體制備物分別顯示98%、96.9%和97%的純度。圖3顯示混合物的HPLC色譜3.2.通過NMR表征實驗條件NMR分析(500MHz,25°C,HOD預飽和)使用稀釋于H20/D20混合物內(nèi)(90/10v/v)的肽樣品進行。使用BrukerTMDRX500攝譜儀和附帶用于數(shù)據(jù)獲取的軟件。更詳細地說，保存在-70。C的肽制備物用于分析。將1.33g二聚體肽稀釋在1mLH20內(nèi)，制備0.5mM的二聚體肽溶液。144^該溶液與16)LilD20(99.9。/。D)在3mmNMR管內(nèi)混合。為校準，使用溶于H20/D20混合物(90/10v/v)中的0.075。/。(w/w)的TSP-d4(3-(三曱基甲硅烷基)丙酸-2,2,3,3,-d4酸鈉鹽；Aldrichref29304-0)的外部溶液，校準攝譜儀，使TSP-d4獨特的共振信號在0ppm處。結果在所用的實驗條件下，單體和二聚體的'HNMR譜覆蓋0至9.5ppm的范圍并且由3個主要區(qū)域組成一6.5至7.5ppm;一5.5至2.5ppm;和-2至0.3ppm。在圖4A-4C內(nèi)可見該結果。單體的NMR譜在以上所報道的實驗條件下的特征是NMR圖中在7.25和7.45ppm之間預期有5個芳香族質子。在圖5A所報道的實驗結果中，此NMR圖本身由7.25至7."ppm的第一多重i普線(積分曲線對應于3H)和中心在7.39ppm處的笫二多重譜線(偽三重峰)(積分曲線對應2H)組成。后一個信號是僅單體才具有的特征。平行二聚體的^NMR譜的特征是對應于4個芳香族質子的在7.10和7.25ppm之間的雙重信號和具有6H積分曲線的在7.25和7.40ppm之間的多重譜線。在圖5B所報道的實驗結果中，發(fā)現(xiàn)4H雙重峰的中心在7.185ppm處(雙重峰在7.18和7.19ppm處)。反平行二聚體的^NMR譜的特征是在6.95和7.10ppm之間的4個芳香族質子的雙重信號和具有6H積分曲線的在7.10和7.30ppm之間的多重譜線。在圖5C所報道的實驗結果中，發(fā)現(xiàn)4H雙重峰的中心在7.025ppm處(雙重峰在7.02和7.03ppm處)。如圖4C中所示，反平行二聚體的^NMR譜的特征還在于(i)0.40和0.65ppm之間(雙重峰)及(ii)0.70和0.85ppm之間(雙重峰)的兩個高磁場曱基共振。在一個實驗中，發(fā)現(xiàn)這些雙重峰的中心在0.42和0.68ppm處。單體或平行二聚體均觀察不到該特征。3.3.通過MALDI-ToF質譜的鑒定通過MALDI-ToF(質量輔助激光解吸電離-飛行時間)質譜的分析允許測量肽的單同位素質量。該技術不區(qū)分反平行二聚體和平行二聚體。實驗條件MALDI-ToF分析使用BiflexIII質譜儀(BrukerTM)和附帶軟件以正反射器模式(positivereflectormode)完成。肽與吸收激光能量的基質(a氰基-4-羥基肉桂酸)混合。質譜儀用合成肽(ACTH18-39(促腎上腺皮質激素片段18-39)、鈴蟾肽和生長抑素28的混合物外部校準。將50mgHCCA稀釋在300pl70%ACN(乙腈)和0.1。/oTFA(三氟乙酸)的水溶液中，制成飽和HCCA基質溶液。再與30%ACN和0.1%TFA的水溶液按等體積稀釋，制成Vi飽和的HCCA溶液。為校準，首先在0.1%TFA中制備如下的初級標準溶液-促腎上腺皮質激素片段18-39(ACTH18-39):100皮摩爾,.247mg/mL);-鈴蟾肽100皮摩爾/pl(0.160mg/mL);和-生長抑素28:100皮摩爾&1(0.31mg/mL)。二級標準溶液制備如下-ACTH100皮摩爾/V1-鈴蟾肽100皮摩爾/pl-生長抑素100皮摩爾/jul2^150|nlACN30%,TFAO.1%將水中的1mg/mL肽溶液用30%ACN和0.1%TFA的水溶液稀釋至0.02mg/mL。校準樣品和肽樣品用'/2飽和的HCCA溶液等體積稀釋。將約1^的液滴滴于鋼質耙(BrukerTM)上并通過蒸發(fā)進行干燥。結果結果見圖7A-7C。通過軟件基于氨基酸序列所計算的理論單同位素質量是ACTH28M+H+=2465.199Da鈴蟾肽M+H+=1619^22Da生長抑素28M+H+=3147.471DaSAEP2-L2M+H+=2388.35Da.監(jiān)測標準定為相當于理論質量的±2Da如圖7A中所示，對校準肽測出的實驗值分別是2465.225Da、1619.814Da和3147.454Da。內(nèi)部測量偏差(0.026+0.009+0.0〗7)/7232.493=7.2ppm(認可<50ppm)。如圖7B和7C中所示，對于平行二聚體制備物和反平行二聚體制備物所測定的實驗值是2388,449Da和2388.532Da。這些值處在以理論值范圍為中心的同一性范圍內(nèi)(+2Da)。這意味著樣品含有預期的物質。實施例4:LPSL8/肽I"復合體/聚集物的制備4.1.LPS的制備4丄1.腦膜培養(yǎng)預培養(yǎng)物:來自腦膜炎奈瑟氏球菌A菌抹的工作種子(workingseed)的2mL水凍樣品用來在含有已補加4ml葡萄糖水溶液(500g/1)的200mLMueller-Hinton肉湯(Merck)的2L錐形瓶內(nèi)接種，已知所述的腦膜炎奈瑟氏球菌A菌抹排他性表達處于L8形式下的LPS。該操作重復四次。錐形瓶在攪拌的同時(每分鐘100轉)在36土1。C溫育10±1小時。培養(yǎng):將錐形瓶內(nèi)容物收集在一起并且預培養(yǎng)物補加400ml葡萄糖水溶液(500g/l)和800ml氨基酸溶液。此制備物用來在30L發(fā)酵罐(B.BraunTM)內(nèi)接種Mueller-Hinton肉湯，初始OD謹目接近0.05。發(fā)酵在36。C、pH6.8±0.2、100rpm、卩0230%和空氣初始流速0.75升/每分鐘/每升培養(yǎng)物條件下進行過夜。在7±1小時后(OD,nm約達到3),培養(yǎng)物通過流速440g/h的MH肉湯進料。葡萄糖濃度低于5g/1時，停止發(fā)酵。通常，終末0D6。。nm為20和40之間。細胞在4°C通過以7000g離心1小時30分鐘收集。粒狀沉淀在-35。C冷凍保存。4.1.2.LPS的純化初次苯酚提取粒狀沉淀解凍并以3倍體積4.5。/。(v/v)苯酚懸浮，并在約5°C劇烈攪拌最少4小時。將細菌混懸液在65°C加熱并隨后在65°C與90%苯酚等體積混合?；鞈乙涸?5°C劇烈攪拌50-70分鐘并隨后冷卻至約20。C。混懸液在約20°C以11000g離心20分鐘。收集并保存水相。酚相和中間相進行回收并接受第二次提取。二次苯酚提取將酚相和中間相在65。C加熱并與體積等于前面所收集水相體積的水混合?；旌衔镌?5°C劇烈攪拌50-70分鐘并隨后冷卻至約20°C?；旌衔镌诩s20。C以11000g離心20分鐘。收集并保存水相。酚相和中間相進行回收并接受第三次4是取。第三次苯酚提取:重復第二次提取的方法。透析將3份水相分別對40L水透析過夜。將透析液匯集在一起。透析液匯集物用Tris20mM、MgCl22mM調節(jié)(每9體積透析液匯集物使用1體積)。用4N的NaOH調節(jié)pH至8.0±0.2。DNA酶處理每克已處理的細菌粒狀沉淀(濕重)添加250UI的DNA酶。將制備物在37i2。C攪拌55-65分鐘。調節(jié)pH至6.8士0.2。制備物在0.22jam膜上過濾。凝膠過濾制備物在S印hacrylS-3004主(5.0x90cm;PharmaciaTM)上純化。首次乙醇沉淀將MgCl2.6H20的粉末添加至匯集在一起的含有LPS的餾分，至達到0.5MMgCl2濃度，并攪拌溶解。在5土3。C下攪拌的同時，添加脫水純乙醇至55。/。終濃度(v/v)。在5士3。C攪拌過夜，隨后在5士3。C以5000g離心！30分鐘。棄去上清液并且將粒狀沉淀進行第二次提取。第二次乙醇沉淀粒狀沉淀以至少100mL的0.5MMgCl2重懸，同時攪拌。重復先前方法。沉淀以至少150mL水重懸。終末步驟:重復進行凝膠過濾并且將匯集在一起的含有LPS的餾分最終經(jīng)過濾(0.8-0.22nm)除菌并保存在5±3°C。作為初級控制，LPS制備物通過SDS-PAGE電泳分析。在硝酸銀染色后，顯示單一的大條帶。這至少表明制備物除LPSL8之外不含《壬《可實體。所述的純化過程可使每升培養(yǎng)物含有約150mgLPSL8(產(chǎn)率約50%)。4。1。3.LPSL8定量用HPAEC-PAD的KDO劑量測定對此方法的文獻參考是Kiang等，(1997)Determ/"a"drt/;^ra/;;/7cco"cfe/o似(以高效陰離子交換色語(HPAEC)測定2-S同-3-脫氧辛酮糖酸(KDO):對KDO穩(wěn)定性和最優(yōu)水解條件的研究)Anal.Biochem.245:7。如圖1A-1B中所示，LPS在其結構中包含2個KDO單元，其中一個KDO單元位于側向位置。LPS定量通過柔和酸水解所釋放的側向KDO單元的劑量測定而完成(見圖IB)。酸水解將4丄2部分中最后透析過濾后所得的LPS制備物的樣品回收并在Dionex1.5mL燒瓶內(nèi)用水在400pi終體積下稀釋，以致樣品的LPS濃度落入基準范圍(1.4-72.1昭/mL)。待定量的樣品以及KDO基準范圍樣品如下繼續(xù)進行添加100pi水解溶液(乙酸5%;葡糖醛酸(GlcA)20|tig/mL)。在100°C水解1小時。隨后燒瓶在40°C在氮氣下干燥并充以400Jul水。劑量測定本方法使用ChromeleonDionexTM軟件用來獲取數(shù)據(jù)，在HPAEC鏈(DionexTM)上進行。分析柱CarbopacPA14x250mm(DionexTM)在30。C操作。柱用洗脫溶液(NaOH75mM,AcONa90mM)進行平衡。將100^樣品注入柱。隨后柱以1mL/分鐘的洗脫液流速洗脫22分鐘。LPS樣品的色譜見圖8。樣品中存在的KDO量通過KDO峰的積分進行測量。由于通過水解所釋放的1摩爾KDO對應于1摩爾LPS,因此可測定初始制備物中的LPS濃度。4.2.肽的制備肽根據(jù)以上實施例1和2中所述的方法制備。4.3.LPSL8/肽I"復合體/聚集物的制備純化的LPS以無菌、無熱原的水(MilliQ質量，調節(jié)至pH7.2，鱟陰性)中的1mg/mL的假溶液使用。半透明的假溶液使用0.22pm膜過濾除菌。.在無菌、無熱原的水(MilliQ質量，調節(jié)至pH7.2，鱟陰性)內(nèi)的1mg/mL的肽SAEP2-L2溶液也在0.22pm膜上經(jīng)過濾除菌。全部如下步驟在無菌條件下完成。一體積LPS^^溶液添加至一體積肽SAEP2-L2的溶液內(nèi)。沉淀物(類內(nèi)毒素復合體)立即出現(xiàn)。在室溫實施攪拌5分鐘。制備物在+4。C靜置過夜。沉淀物(類內(nèi)毒素)隨后通過每分鐘3000轉離心10分鐘回收。棄去上清液。粒狀沉淀用一體積無菌、無熱原的水(MilliQ質量，調節(jié)至pH7.2，鱟陰性)洗滌。離心/洗滌步備t重復5次。最后，粒狀沉淀基于沉淀物濕重以約111^/11^的濃度重懸于口1"1=7.2的無菌、無熱原的水(milliQ質量)內(nèi)?；鞈乙涸?々。C儲存。完成KDO劑量測定以確定LPS含量，并將混懸液調節(jié)至例如0.50mg/mL復合體(表述為LPS含量)的濃度。在隨后實施例內(nèi)所測試的LPS-肽復合體是LPS-反平行二聚體復合體，如4.3部分中所得到的復合體，除非另外說明。因此，將這種具體的復合體簡單地稱作LPS-肽復合體。以類似方式，將如4.2部分中所得的LPS簡單地稱作LPS。.LPS與LPS-肽復合體的比較使用也用于制備該復合體的LPS份(LPSlot)完成。實施例5:LPS-肽復合體脫毒作用的評估。數(shù)種測定法用于評估脫毒。5丄鱟阿米巴樣細胞裂解物(LAL)測定法在本測定法中，比較SAEP2-L2反平行二聚體和平行二聚體與SAEP2-L2環(huán)狀單體的LPS脫毒能力。為此目的，包含平行二聚體或單體的LPS-肽復合體完全如在實施例4中所報道的LPS-反平行肽復合體的制備方法進行制備。LAL是用來檢測和定量革蘭氏陰性細菌內(nèi)毒素的極靈敏的試驗。該試驗以來自鱟(美洲鱟(丄/mw/t^/70/^^eww勻)的阿米巴樣細胞裂解物蛋白在內(nèi)毒素存在下誘導凝集的特性為基礎。LPS內(nèi)毒素活性的評估根據(jù)歐洲藥典(如歐洲藥典方法(第五版，2.6.14段落)中所述)通過使用終點生色方法進行。為此目的，使用試劑盒QCL-1000ref50-647U(Cambrex-BioWhittakerTM)(試劑盒的線性范圍是0.1至lUI/mL)及陽性對照(大腸埃希氏菌內(nèi)毒素，4xl03EU/mL，Sigma)。用稀釋緩沖液(Cambrex-BioWhittakerTM)將(i)待測試的樣品、(ii)標準物和(iii)陽性對照稀釋，濃度分別覆蓋以下范圍1/10至1/105;0.5至0.031EU/mL和1/104至1.8x104。在96孔平底ELISA平板每孔內(nèi)分配50pl的樣品稀釋物、標準物稀釋物和陽性對照稀釋物用。每孔添加50^1裂解物。溫育在"。C進行10分鐘。隨后添加100pl對硝基苯胺生色底物。溫育在37°C進行6分鐘。生色反應通過添力口100的25%冰乙酸/水終止。平板通過分光光度法在405nm讀數(shù)。結果以復合體的內(nèi)毒素單位(EU)/昭表述。它們在下文表中顯示。脫毒率可以通過LPS/LPS-肽復合體比率建立并以對數(shù)單位表述。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>可見，SAEP2-L2肽的二聚體形式在脫毒LPS方面比環(huán)狀單體形式更有效。5.2.兔熱原試驗已知兔是對LPS的熱原作用具有與人等同敏感性的動物。熱原試驗通過測量三只兔子因靜脈內(nèi)(IV)注射待檢驗物質的無菌溶液所引起的體溫升高進行。試驗、讀數(shù)和計算根據(jù)歐洲藥典(第五版，2.6.8)進行。溫度升高根據(jù)總的溫度反應進行解釋當總的反應沒有超過1.15°C時，符合要求，而當總的反應超過2.65°C時，不符合要求。在本例子中，以下在1.15。C和2.65。C之間確定熱原閾值。發(fā)現(xiàn)兔的界限熱原劑量(IV)對應于0.025ng/kg(LPS)和10-25ng/kg(LPS-肽復合體)。這些結果顯示當通過靜脈內(nèi)途徑給予時，LPS-肽復合體的熱源性低于LPS。.如本試驗中所測量，脫毒率(LPS-肽復合體/LPS)在400和1,000之間。5.3.急性中毒測定法D-半乳糖胺致敏小鼠的LD50。本測定法的參考文獻包括z.".Galanos等，1979,PNAS16:5939;Baumgartner等,1990，J.Exp.Med.171(3):889和US6,531,131。八周齡雌性近親交配小鼠組在通過腹膜內(nèi)(IP)途徑注射D-半乳糖胺(15mg/0.2mL)后，立即以LPS或LPS-肽復合體的遞增劑量通過腹膜內(nèi)(IP)途徑進行注射(0.5mL)(LPS的毒性被使得本模型變得極敏感的D-半乳糖胺增加大約1,000倍)。隨后四日期間追蹤死亡率。用LPS所觀察到的LD5。是3.6ng/小鼠(1.91-6.70ng/小鼠);而用LPS-肽復合體所觀察到的LDs。是1嗎/小鼠(0.2-5嗎/小鼠)，這表明脫毒率(LPS-肽復合體/LPS)是約250(100-1000)。5.4.LPS與肽復合時減弱促炎效應為了評估LPS-肽復合體可以減弱LPS誘導的毒性效應至何種程度，在體外和體內(nèi)測定法中監(jiān)測(評估)LPS-肽復合體對促炎細胞因子釋放的影響。,體內(nèi)通過ELISA比較用LPS或LPS-肽復合體免疫的小鼠血清中的細胞因子(IL6和TNFa)釋放。在SC免疫后90分鐘回收血液樣品，其中所述的時間是對這些細胞因子釋放的最佳時間。測試了C3應eOuJ、TLR4—/—、C3腿eN和CD1小鼠品系。前兩個小鼠品系對LPS或LPS-肽復合體均不敏感。發(fā)現(xiàn)第三和第四種小鼠品系均是LPS敏感的。發(fā)現(xiàn)CD1小鼠比其它小鼠品系對LPS-肽復合體更敏感并且因此選擇CD1小鼠用于保留最嚴格條件的其它實驗?！鲶w外比較了來自人全血細胞培養(yǎng)物的細胞因子(IL6、IL8和TOFa)釋放，其中所述的人全血細胞培養(yǎng)物以不同濃度的LPS或LPS-肽復合體在37°C刺激24小時。5.4.1.體內(nèi)測定法CD1小鼠皮下(SC)施用(i)lO嗎LPS或(ii)10昭LPS-肽復合體。它們在注射后90分鐘進行采血。TL6和TNFa釋放通過ELISA在血清內(nèi)測量。細胞因子分泌的ELISA檢測ELISA使用OpffiIA小鼠IL6和TNFa套裝(Pharmingen)進行，每一套裝均包括捕獲抗體(抗小鼠細胞因子)、檢測抗體(生物素化抗小鼠細胞因子)、抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶綴合物和標準物(重組細胞因子)，它們均來自Pharmingen?？剐∈驣L6和TNFa抗體1/250稀釋于pH9.5的0.1M碳酸鹽緩沖液(Sigma)。對于每一測定，將100抗體稀釋物分配至MaxisorpNUNC96孔平底ELISA平板的每孔內(nèi)。平板在+4。C溫育過夜。平板在含0.05。/。Tween20的PBS內(nèi)洗滌。隨后每孔添加200pl的PBS、0.5。/。牛血清白蛋白(BSA)飽和緩沖液。繼續(xù)在室溫溫育1小時。平板在含0.05%Tween20的PBS內(nèi)洗滌。重組IL6或TNFa細胞因子稀釋物在RPMI培養(yǎng)基(l%FCS10%)內(nèi)制備，標準物處于(i)4,000pg/mL-62.5pg/mL的范圍內(nèi)。每孔分配每種稀釋物100pl以建立標準曲線。血清稀釋物在RPMI培養(yǎng)基(P.S.glu1%FCS10%)內(nèi)制備。用LPS注射的小鼠的血清作1/25和1/125稀釋。用LPS-肽復合體注射的小鼠的血清作1/5和1/25稀釋。每孔分配每種稀釋物100^。繼續(xù)在室溫進行溫育2小時.平板在含0.05%Tween20的PBS內(nèi)洗滌。生物素化的抗小鼠細胞因子抗體和酶均在含10%胎牛血清的PBS內(nèi)進行1/250稀釋。每孔添加100)Lll每種稀釋物。溫育繼續(xù)在室溫進^于1小時。平板在含0.05。/。Tween20的PBS內(nèi)洗滌。100pl四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物(等體積混合的TMB溶液A和B(KPL))分配于孔內(nèi)。溫育繼續(xù)在室溫進行10-30分鐘。反應通過每孔添加lOOpl的1M&04終止。平板在450nm處讀數(shù)。結果見下文表中。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>單獨的肽不誘導IL6或TNFa。LPS-肽復合體產(chǎn)生約100倍的脫毒(IL6分泌下降至1/100)。5.4.2.體外測定法試驗物質的制備LPS制備物(lmg/mL)和LPS-肽復合體(500昭/mL)各自在10mMTns、150mMNaCl、0.05%Tween20、5%蔗糖內(nèi)稀釋至50嗎/mL濃度。它們進一步在生理鹽水內(nèi)稀釋至5昭/mL濃度。連續(xù)的1/5稀釋在AIM-V培養(yǎng)基(Gibco(Invitrogen))內(nèi)進行，對每種試驗物質稀釋至2.5610-3pg/mL濃度。刺激在肝素鈉(25,000U/5mL;sanofi-synthelabo)上收集的人血液在AIM-V培養(yǎng)基中按l:4(vol:vol)稀釋，并分配于MicronicsTM管內(nèi)(400^1/管)。添加試驗物質的100pl稀釋物。肽及緩沖液對照在1/20稀釋后進行測試。管在37°。在含5%。02的潮濕空氣內(nèi)溫育24小時。.血漿回收管隨后以500g離心10分鐘。從每一管內(nèi)收集至少200pl上清液并在-80。C冷凍保存直至滴定。細胞因子分泌的ELISA才企測ELISA使用來自Pharmingen的OptEIA人IL6、IL8和TNFa套裝進行，每一套裝均包括捕獲抗體(小鼠抗人細胞因子)、檢測抗體(生物素化小鼠抗人細胞因子)、抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶綴合物以及標準物(重組細胞因子)?？谷薒6、IL8和TNFa抗體1/250稀釋于pH9.5的0.1M碳酸鹽緩沖液(Sigma)。對于每一測定，將100)xl的抗體稀釋物分配至MaxisorpNUNC96孔平底ELISA平板的每一孔內(nèi)。平板在+4。C溫育過夜。平板在含0.05u/。Tween20的PBS內(nèi)洗滌。隨后每孔添加200pl的PBS、0.5。/。牛血清白蛋白(BSA)飽和緩沖液。溫育在室溫繼續(xù)進行1小時。平板在含0.05%Tween20的PBS內(nèi)洗滌。重組IL6、IL8或TNFa細胞因子稀釋物在AIM-V培養(yǎng)基內(nèi)制備，標準物分別處于(i)1,200pg/mL-18.75pg/mL;(ii)800pg/mL-12.5pg/mL和(iii)1,000pg/mL-15.87pg/mL的范圍內(nèi)。每孔分配每種稀釋物100|LlI以建立標準曲線.血漿稀釋物在AIM-V內(nèi)制備。從用LPS刺激的血液中回收的血漿進行1/25和1/125的稀釋。從與LPS-肽復合體接觸的血液中回收的血漿進行1/5和1/25的稀釋。每孔分配每種稀釋物100^d。溫育繼續(xù)在室溫進行2小時。平板在含0.05。/。Tween20的PBS內(nèi)洗滌。生物素化抗人細胞因子抗體和酶各自在含10%胎牛血清的PBS內(nèi)作1/250的稀釋。每孔添加100Ml每種稀釋物。溫育繼續(xù)在室溫進行1小時。平板在含0.05%Tween20的PBS內(nèi)洗滌。100pl四曱基聯(lián)苯胺(TMB)底物(等體積混合的TMB溶液A和B(KPL))分配于孔內(nèi)。溫育繼續(xù)在室溫進行10-30分鐘。反應通過每孔添加100^1的1MH3P04終止。平板在450nm處讀數(shù)。.結果原始結果和細胞因子釋放曲線=f(LPS或復合體濃度)不允許比較不同樣品。計算脫毒率可以消除血液供體間和試驗間的變異性。脫毒率計算僅考慮曲線的線性部分。確定了最大IL6釋放，超出所述的最大IL6釋放后不再觀察到線性變化，并且通過線性回歸計算為誘導所述最大值的50%所需要的物質的量。脫毒率表述為誘導50%最大IL6釋放的LPS-肽復合體濃度(以pg/mL表述的EDs。)相對于誘導50%最大IL6釋放的LPS濃度的比率。該比率越高，脫毒作用越強。由于脫毒率使用數(shù)個獨立供體的全血進行系統(tǒng)測量，故將結果進行平均。數(shù)次測量用LPS-肽復合體所觀察到的脫毒率。從IL6釋放測定中所得的六個值的平均^t:64±20。IL6釋放與TNFa和IL8分泌相關。因此選擇IL6釋放測定來例行評估用LPS-肽復合體所觀察到的炎癥減弱。5.5.結論<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>(ED5。:引起50。/。最大IL6釋放的產(chǎn)物濃度)半乳糖胺致敏小鼠的LD5。4ng/sourisl(xg/souris(0.2-5)250實施例6:LPS肽復合體穩(wěn)定性研究LPS-肽復合體的穩(wěn)定性進行6個月研究，并通過在兩種測定法(LAL和體外通過huPBMC的IL-6釋放)中測量的脫毒率進行評估。也可以進行兔熱原試驗。6丄已配制的LPS肽復合體的體外穩(wěn)定性在5°C下追蹤考察已配制的LPS肽復合體的穩(wěn)定性6個月。在第0、90和MO日(6個月)進行測量。結果如下。<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>C*:符合規(guī)定IL6釋放試驗中的脫毒率在3個月和6個月后沒有顯著不同，表明LPS-肽復合體的穩(wěn)定性與肽復合的LPS在5°C下6個月后仍是脫毒的。6.2.在生理液體內(nèi)的LPS^tl合體的體外穩(wěn)定性本實驗的目的是驗證當施用復合體時LPS沒有釋放，并且脫毒率在接觸生理液體后沒有下降。與1mL人血清混合的lmLLPS-肽復合體在37。C溫育。在1小時和24小時后評估脫毒率。如4.3部分中制備的人血清和LPS-肽復合體也進行平4于測^式。在LPS-肽復合體與人血清于37°C接觸1小時和24小時后，通過兩種測定法未觀察到脫毒作用存在顯著差異，并且結果類似于LPS-肽復合體對照。實施例7:LPS-肽復合體的免疫原性7丄LPS-肽復合體誘導兔產(chǎn)生的抗LPS抗體的殺菌活性。用100昭LPS-肽復合體在佐劑存在下通過肌內(nèi)(IM)和皮下(SC)途徑(分別為2x0.5mL和5x0.2mL)對三只成年新西蘭兔進行免疫；它們間隔3周接受三次注射免疫；首次免疫用弗氏完全佐劑(FA)，二次免疫和三次免疫用弗氏不完全佐劑。兔在最后注射后兩星期進行采血。對照組使用相同方案用具有佐劑的肽(71嗎，等效于100嗎LPS-肽復合體內(nèi)肽的量)進行免疫。血清(SBA)樣品的殺菌活性在作為補體外源的幼兒兔血清存在下，對用于如實施例5所述產(chǎn)生LPS的腦膜炎奈瑟氏球菌菌抹進行評估。SBA測定法血清在56。C經(jīng)30分鐘熱滅活。在％孔孩t量平板的各孔內(nèi)，熱滅活的血清隨后在含有Ca"和！VIg2+的Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水內(nèi)進行二倍系列稀釋(IO次)(體積每孔50W)。將25pl生長于Mueller-Hinton肉湯內(nèi)的腦膜炎奈瑟氏球菌的對數(shù)期培養(yǎng)物(4.1(^CFU/mL)和25pl幼兔血清添加至各孔。平板在"。C振搖下溫育1小時。將50|Lil來自各孔的混合物固定(plate)于Mueller-Hinton瓊脂上。培養(yǎng)皿在+37。C在含10%C02的空氣內(nèi)溫育過夜。在每一實驗內(nèi)，對照包括(i)無抗體的細菌和補體源(補體對照)、(ii)細菌和熱滅活的補體和(iii)抗體存在下的細菌和熱滅活的補體。將殺菌滴度報道為最高的相應血清稀釋度，在所述的血清稀釋度下，與補體對照相比，觀察到》50%的細菌殺死現(xiàn)象。SBA結果結果見于下表。復合體得到高SBA滴度。SBA反應的特異性以血清(第3次注射免疫之后)吸附至LPS上時該反應的消失加以證實。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>7.2.對小鼠用LPS-肽復合體誘導的免疫反應10只六周齡雌性遠系雜交CD1小鼠通過皮下途徑(0.2ml)用10|iig劑量的LPS-肽復合體進行免疫。它們間隔3周接受兩次注射。在每次注射前對它們?nèi)⊙⒃谧詈笞⑸浜?4日對它們?nèi)⊙φ战M用緩沖液注射。在第一次實驗中，抗體應答通過ELISA進行評估，并且第二次免疫后的血清樣品的殺菌活性，針對用于如實施例4所述產(chǎn)生LPS的腦膜炎奈瑟氏球菌菌抹(同源菌抹)，和異源腦膜炎奈瑟氏球菌菌抹[腦膜炎奈瑟氏球菌B組菌抹RH873(L4、7、8免疫型)]進行評估。在笫二次實驗中，抗體應答通過ELISA評估，并且第二次免疫后的血清樣品的調理活性通過FACS進行評估。7.2丄LPS-肽復合體對小鼠的免疫原性抗LPS抗體的ELISA滴定96-孔微量平板的各孔用100^溶于緩沖液1(PBS+10mMMgCl2)中的10pg/mL的LPS溶液涂布。平板在+37。C溫育2小時，隨后在+5°(3溫育過夜。將LPS溶液移出平板，并用150^緩沖液2(PBS+l。/o乳+0.050/0Tween20)填滿各孔。平板在+37。C溫育1小時，隨后用緩沖液3(PBS+0.05%Tween20)洗滌。血清直接在孔內(nèi)使用緩沖液2連續(xù)稀釋12倍(體積每孔100W)。平板在+37。C溫育90分鐘；隨后用緩沖液3洗滌。每孔添加100^經(jīng)稀釋的山羊抗小鼠IgG(Y鏈特異性)或IgM(p鏈特異性)過氧化物酶綴合物。平板在37。C溫育90分鐘并隨后用緩沖液3洗滌。反應通過各孔內(nèi)添加100gl四曱基聯(lián)苯胺底物溶液顯色。平板在37°C溫育20分鐘。反應通過添加1MHC1終止，并且在450nm處測量吸收度。ELISA結果結果通過與參考血清比較，以任意ELISA單位/mL(EU/mL)表述。在初級免疫實驗中，ELISA測定法利用IO份血清的匯集物完成。如下表中所示，LPS-肽復合體能夠在一次注射后誘導小鼠產(chǎn)生抗LPSIgG高滴度和抗LPSIgM(ELISA)。在二次注射后觀察到顯著的IgG增加，而沒有觀察到顯著的IgM增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>在另外的免疫實-瞼中，獨立地完成ELISA測定。在第二次注射后，10只小鼠中的7只表現(xiàn)出IgG和IgM高滴度。以對數(shù)表述的整體平均滴度分別是約3.7和2.8。7.2.2.小鼠血清的殺菌活性殺菌活性如7.1部分中所述進行測量。40%第2次免疫后的血清表現(xiàn)抗同源腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的殺菌活性(SBA滴度^16)。4%具有抗異源菌株的殺菌性。7.2.3.小鼠血清的調理活性調理作用測定法調理活性使用人早幼粒細胞分化的HL60細胞作為效應器，使用LPS覆蓋的乳膠熒光珠(latexfluorescentbeads)作為耙，通過流式血細胞計數(shù)方法(FACS)測量。效應細胞在用100mM二甲基曱酰胺處理后分化成顆粒細胞。將得到的細胞洗滌、重懸于Hanks氏平衡鹽溶液內(nèi)，并且將它們的濃度調節(jié)至2.5x107個細胞/mL。血清在56°C經(jīng)30分鐘熱滅活。在96深孔微量平板內(nèi)，熱滅活的血清在含有Ca^和Mg^的Hanks氏平衡鹽緩沖液內(nèi)連續(xù)地進行5倍的稀釋(3次)(每孔體積300pl)。將20^1LPS覆蓋的乳膠熒光珠和作為外來補體源的10^幼兔血清添加至各孔。平板在37。C^展搖下溫育30分鐘。將50|ul效應器細胞混懸液添加至各孔。平板在37°C振搖下溫育30分鐘。將來自各孔的150pl混合物轉移至第二深孔，并且通過添加400pi的PBS+0.02%EDTA終止反應。將平板離心并用PBS+BSA緩沖液洗滌兩次。在抗血清和外來補體源存在下，通過FACS測量效應器細胞對LPS覆蓋的珠子的吞噬。調理活性表述為產(chǎn)生吞噬產(chǎn)物(PP)=200的血清稀釋度的倒數(shù)。PP為珠子/吞噬細胞的比數(shù)x熒光細胞數(shù)。在每一實驗中包含缺少抗血清的對照孔和缺少陽性單克隆抗血清的對照孔。調理作用結果10只小鼠中的8只小鼠表現(xiàn)出高的調理活性(^350)。權利要求1.一種SAEPII肽二聚體，該肽二聚體具有式(I)結構NH2-A-Cys1-B-Cys2-C-COOHNH2-A′-Cys1-B′-Cys2-C′-COOH其中兩個Cys1殘基經(jīng)二硫鍵連接在一起并且兩個Cys2殘基經(jīng)二硫鍵連接在一起；或具有式(II)結構NH2-A-Cys1-B-Cys2-C-COOHHOOC-C′-Cys2-B′-Cys1-A′-NH2其中Cys1殘基經(jīng)二硫鍵與Cys2殘基連接；其中A和A′獨立地是有2至5個氨基酸殘基，優(yōu)選有3或4個氨基酸殘基的肽部分，其中至少2個氨基酸殘基獨立地選自Lys、Hyl(羥基賴氨酸)、Arg和His；其中B和B′獨立地是有3至7個氨基酸殘基、優(yōu)選有4或5個氨基酸殘基的肽部分，其包含至少2個，優(yōu)選3個獨立選自Val、Leu、Ile、Phe、Tyr和Trp的氨基酸殘基，并且其中C和C′是任選的，并且獨立地是氨基酸殘基或有2至3個氨基酸殘基的肽部分；前提是陽離子氨基酸殘基/疏水性氨基酸殘基比率(陽離子殘基/疏水殘基比)是0.4至2。2.權利要求1的SAEPII肽二聚體，該肽二聚體是式(I)或(II)的肽二聚體，其中陽離子殘基/疏水殘基比是0.5至1.2或至1.5。3.權利要求2的SAEPII肽二聚體，該肽二聚體是式(I)或(II)的肽二聚體，其中陽離子殘基/疏水殘基比是0.6至1。4.權利要求3的SAEPII肽二聚體，該肽二聚體是式(I)或(II)的肽二聚體，其中陽離子殘基/疏水殘基比是0.6至0.8。5.權利要求1至4中任一項的SAEPII肽二聚體，該肽二聚體是式(I)或(II)的肽二聚體，其中B和B'肽部分包含序列-Xl-X2-X3-,其中XI與X2;X2與X3;或XI、X2及X3獨立地選自Val、Leu、Ile、Phe、Tyr和Trp;優(yōu)選選自Leu、lie和Phe。6.權利要求5的SAEPII肽二聚體，該肽二聚體是式(I)或(II)的肽二聚體，其中B和B'肽部分包含(i)序列-Xl-X2-X3-,其中XI是Lys、Hyl、His或Arg,優(yōu)選Lys或Arg;更優(yōu)選Lys;X2是Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp或Val;優(yōu)選Phe或Leu;更優(yōu)選Phe;并且X3是Phe、Leu、Ile、Tyr、Trp或Val;優(yōu)選Phe或Leu;更優(yōu)選Leu;和(ii)氨基酸殘基，該氨基酸殘基若有，則分別獨立地選自Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Hyl、Arg和His;優(yōu)選Val、Leu、Ile、Phe、Tyr和Trp;更優(yōu)選Leu、lie和Phe。7.權利要求1至6中任一項的SAEPII肽二聚體，該肽二聚體是式(m)的肽二聚體，NH2-A-Cysl-B-Cys2-COOHNH2-A'-Cysl-B'-Cys2-COOH其中兩個Cysl殘基經(jīng)二石危鍵連接在一起，并且兩個Cys2殘基經(jīng)二硫鍵連接在一起；或該肽二聚體是式(IV)的肽二聚體NH2-A-Cys1-B-Cys2-COOHCOOH-Cys2-B'-Cys1-A'-NH2其中Cysl殘基經(jīng)二硫鍵與Cys2殘基連接；并且其中A、A'、B和B'如前面的權利要求中所定義。8.權利要求1至7中任一項的SAEPII肽二聚體，該肽二聚體是同源肽二聚體。9.權利要求1至8中任一項的SAEPII肽二聚體，該肽二聚體是式(VI)NH2-Lys-Thr-Lys-Cysl-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOHCOOH-Cys2-Leu'Leu-Leu國Phe-Lys-Cys1-Lys-Thr-Lys-NH2.的反平行二聚體形式，其中Cysl殘基經(jīng)二硫鍵與Cys2殘基連接。10.權利要求1至8中任一項的SAEPII肽二聚體，該肽二聚體是式(VII)NH2-Lys-Thr-Lys-Cys1-Lys畫Phe-Leu-Leu-Leu誦Cys2-COOHNH2-Lys-Thr-Lys-Cys1-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH的平行二聚體，其中兩個Cysl殘基經(jīng)二^5克鍵連接在一起，并且兩個Cys2殘基經(jīng)二硫鍵連接在一起。11.一種組合物，所述組合物包含權利要求1至10中任r項的肽二聚體，其中所述的肽基本上為二聚體平行形式。12.—種組合物，所述組合物包含權利要求1至10中任一項的肽二聚體，其中所述的肽基本上為二聚體反平行形式。13.權利要求1至10中任一項的肽二聚體作為革蘭氏陰性細菌脂多糖(LPS)的脫毒劑的用途。14.一種藥物組合物，所迷藥物組合物包含(i)權利要求1至10中任一項的肽二聚體或權利要求1或12的組合物；以及(ii)藥學可接受的稀釋劑或載體。15.權利要求1至10中任一項的肽二聚體或權利要求11或12的組合物在制備治療或預防敗血癥性休克的藥劑中的用途。16.—種用于治療或預防敗血癥性休克的方法，所述方法包括對有需求的個體施用治療有效量的權利要求1至10中任一項的肽二聚體或治療有效量的權利要求11或12的組合物。17.—種LPS-肽復合體，所述復合體包含(i)革蘭氏陰性細菌的LPS實體(部分)和(ii)權利要求1至10中任一項的SAEPII肽二聚體，其中所述的LPS部分和SAEPII肽二聚體彼此非共價地結合在一起。18.權利要求17的LPS-肽復合體，其中所述LPS是腦膜炎奈瑟氏球菌；大腸埃希氏菌；傷寒沙門氏菌；副傷寒沙門氏菌；弗氏志賀氏菌；流感嗜血桿菌；幽門螺旋桿菌；沙眼衣原體；百日咳鮑特氏菌；布魯氏桿菌；嗜肺軍團菌；霍亂弧菌；卡他莫拉氏菌銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯氏菌的LPS。19.權利要求18的LPS-肽復合體，其中所述LPS是腦膜炎奈瑟氏球菌的LPS。20.權利要求19的LPS-肽復合體，其中所述的LPS是LPSL8。21.權利要求17至20中任一項的LPS-肽復合體，其特征在于LPS:肽摩爾比為1:1.5至1:0.5,優(yōu)選1:1.2至1:0.8。22.權利要求21的LPS-肽復合體，其特征在于LPS:肽摩爾比為1:1。23.權利要求17至22中任一項的LPS-肽復合體在治療或預防革蘭氏陰性細菌感染中的用途。24.—種藥物組合物，所述組合物包含權利要求7至22中任一項的LPS-肽復合體和藥學可接受的稀釋劑或載體。25.權利要求17至22中任一項的LPS-肽復合體在制備治療或預防革蘭氏陰性細菌感染的藥劑中的用途。26.—種治療或預防革蘭氏陰性細菌感染的方法，該方法包括對有需求的個體施用治療有效量的權利要求17至22中任一項的LPS-肽復合體。27.—種用于制備LPS/肽復合體的方法，該方法包括將(i)革蘭氏陰性細菌的LPS與(ii)權利要求1至10中任一項的肽二聚體混合在一起。28.權利要求27的方法，其中所述LPS和肽或其鹽以LPS:肽1:1.2至1:0.8的摩爾比混合。29.權利要求29的方法，其中所述LPS和肽或其鹽以LPS:肽1:1的摩爾比混合.30.—種用于使革蘭氏陰性細菌LPS脫毒的方法，所述方法包括將(i)LPS與(ii)權利要求1至10中任一項的肽二聚體混合在一起。31.權利要求30的方法，其中所述LPS和肽或其鹽以LPS:肽1:1.2至1:0.8的摩爾比混合。32.權利要求31的方法，其中所述LPS和肽或其鹽以LPS:肽1:1的摩爾比混合。全文摘要本發(fā)明涉及SAEPII肽二聚體，所述的肽二聚體能模擬多粘菌素B，以高親和力非共價地結合革蘭氏陰性細菌脂多糖(LPS)，從而象多粘菌素B一樣使LPS脫毒。二聚體結構通過一對二硫鍵得以維持，在肽序列內(nèi)包含兩個半胱氨酸殘基，所述肽序列不超過17個氨基酸，并且主要包含陽離子氨基酸殘基和疏水性氨基酸殘基。在本發(fā)明的二聚體中，肽可以具有平行取向或反平行取向。例如，本發(fā)明的二聚體由處于平行或反平行二聚形式的式NH₂-Lys-Thr-Lys-Cys1-Lys-Phe-Leu-Leu-Leu-Cys2-COOH的肽構成。SAEPII二聚體用于治療或預防因革蘭氏陰性細菌感染所致的敗血癥性休克及相關疾病。本發(fā)明還涉及其中LPS和SAEPII二聚體非共價結合在一起的LPS-肽復合體。這些復合體用作抗革蘭氏陰性細菌感染的疫苗藥物。文檔編號C07K7/08GK101160319SQ200680011014公開日2008年4月9日申請日期2006年4月10日優(yōu)先權日2005年4月11日發(fā)明者A·魯斯迪西,M·弗盧奇,M·波羅,M·莫羅,N·米斯特雷塔,T·克雷爾申請人:賽諾菲巴斯德有限公司;生物合成公司