專利名稱：：結(jié)合epha2的抗體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物學(xué)和免疫治療的領(lǐng)域。更具體的，其與結(jié)合EphA2的抗體家族的發(fā)現(xiàn)相關(guān)。本發(fā)明還提供了使用抗EphA2家族的抗體對(duì)與EphA2相關(guān)的多種人類疾病和癌癥的i貪斷和/或治療。
背景技術(shù)：
：除了在診斷學(xué)中已知的應(yīng)用，抗體已經(jīng)表現(xiàn)出可以用作治療劑。例如，免疫治療，或者近年來出于治療目的已經(jīng)使用抗體來治療癌癥。在癌癥治療中的被動(dòng)免疫治療涉及單克隆抗體的使用。見例如Cancer:PrinciplesandPracticeofOncology,第六版(2001)第20章，第495-508頁。通過直接抑制腫瘤細(xì)胞生長或存活，以及通過它們恢復(fù)機(jī)體免疫系統(tǒng)中天然細(xì)胞殺傷活性的能力，這些抗體具有固有治療生物學(xué)活性。這些物質(zhì)可以單獨(dú)施用，或與放射治療或化療劑聯(lián)合施用。批準(zhǔn)分別用于治療非霍奇金淋巴瘤和乳腺癌的利妥昔單抗(Rituximab)和曲妥單抗(Trastuzumab)是此類療法的兩個(gè)實(shí)例。備選的，抗體可以用于制備抗體綴合物，其中抗體連接著毒劑并通過特異性結(jié)合腫瘤將物質(zhì)引導(dǎo)到腫瘤。吉妥單抗(Gemtuzumabozogamicin)是批準(zhǔn)用于白血病治療的抗體綴合物的實(shí)例。結(jié)合癌細(xì)胞，并具有潛在的診斷和治療用途的單克隆抗體已經(jīng)在文獻(xiàn)中被公開。見，例如，下列專利申請(qǐng)?zhí)貏e公開了一些靶蛋白的分子量美國專利號(hào)6,054,561(200KDc-erbB-2(Her2)，及其他未知的大小為40-200KD的抗原)以及美國專利號(hào)S力5《"4(50KD和5510),癌胚蛋白質(zhì))。臨床試驗(yàn)中和/或批準(zhǔn)用于治療實(shí)體瘤的抗體實(shí)例包括曲妥單抗(抗原180kD，HER2/neu)、依決洛單抗(Edrecolomab)(抗原40-50kD，Ep-CAM)、抗人乳脂肪球(HMFG1)(抗原〉200KD，HMW黏蛋白)、西妥昔單抗(Cetuximab)(抗原150KD和170KD,EGF受體)、阿侖單抗(Alemtuzumab)(抗原21-28KD，CD52)以及利妥昔單抗(抗原35KD，CD20)。用于治療乳腺癌的曲妥單抗的抗原靶標(biāo)(Her-2受體)，以及臨床試驗(yàn)中用于治療一些癌癥的西妥昔單抗的抗原靶標(biāo)(EGF受體)，在多種正常人類成體組織(包含皮膚、結(jié)腸、肺、卵巢、肝臟、及胰腺)中都存在可檢測的水平。使用上述治療的安全差異可能是由表達(dá)水平、進(jìn)入途徑或抗體在這些部位的活性之間的差異導(dǎo)致的。免疫治療的另一種類型是用抗原的主動(dòng)免疫治療或接種，所述抗原存在于特定癌癥或者指導(dǎo)該抗原表達(dá)的DNA構(gòu)建體中，隨后引起個(gè)體的免疫應(yīng)答，即，誘導(dǎo)個(gè)體主動(dòng)產(chǎn)生抗其自身癌癥的抗體。主動(dòng)免疫尚不及被動(dòng)免疫治療或免疫毒素常用。已經(jīng)提出了一些疾病(包含癌癥)進(jìn)展的模型。理論范圍是從單一感染/轉(zhuǎn)化事件的起因，到由"疾病類似"或"癌癥類似"組織類型逐步進(jìn)化導(dǎo)致為最終具有完全病理性或惡性能力的組織類型。一些學(xué)說認(rèn)為對(duì)于癌癥，例如，單一突變事件足以引起惡性腫瘤，而另一些學(xué)說則認(rèn)為后繼的改變也是必需的。另一些學(xué)說則提出不斷增加的突變負(fù)荷和腫瘤級(jí)別通過細(xì)胞水平的突變選擇事件連續(xù)體，對(duì)于瘤形成的起始和發(fā)展都是必須的。一些癌癥靶標(biāo)^皮發(fā)現(xiàn)僅存在肺瘤組織中，而其他則是存在于正常組織中并在腫瘤組織中是表達(dá)上調(diào)和/或過量表達(dá)的。在這類情況下，一些研究員主張過量表達(dá)與惡性腫瘤的獲得相關(guān)，同時(shí)另一些研究員則主張過量表達(dá)僅僅是作為導(dǎo)致病狀加重的趨勢標(biāo)志物。理想的診斷和/或治療抗體所需要的一個(gè)方面在于開發(fā)和表征與多種癌癥相關(guān)的抗原。只有極少數(shù)的抗原在多種類型的癌癥中均表達(dá)(例如，"泛癌(pan-cancer)"抗原)，而在非癌性細(xì)胞中只有有限的表達(dá)。此類抗原的分離和純化將可用于制備靶向該抗原的抗體(例如，診斷抗體或治療抗體)。與抗單一特定類型癌癥的相關(guān)抗原的抗體相比，結(jié)合"泛癌，，抗原的抗體能夠靶向在不同組織中發(fā)現(xiàn)的多種癌癥。該抗原也將用于藥物發(fā)現(xiàn)(例如，小分子)和進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞調(diào)控、生長和分化的鑒定。位于病態(tài)細(xì)胞和/或癌細(xì)胞表面的新型靶標(biāo)是需要的，所述新型耙標(biāo)與可以特異性識(shí)別細(xì)胞表面靼標(biāo)的抗體和其他物質(zhì)結(jié)合，可以用于治療此類疾病和/或癌癥?；诒疚墓_的發(fā)現(xiàn)，存在對(duì)特異性識(shí)別位于細(xì)胞表面的耙標(biāo)的新型抗體和其他物質(zhì)的進(jìn)一步的需要，所述抗體和物質(zhì)可以調(diào)控(通過降低或增強(qiáng))EphA2的疾病促進(jìn)活性。EphA2，以前已知為ECK，是在成人上皮細(xì)胞中表達(dá)的130KD的跨膜受體酪氨酸激酶。見Lindberg等人(19卯)Mol.Cell.Biol.10:6316-6324。EphA2是受體酪氨酸激酶Eph家族的一名成員，該家族的獨(dú)特之處在于它們識(shí)別錨定在相鄰細(xì)胞細(xì)胞膜上的配體，已知為肝配蛋白。見Bartley等人(1994)Nature368:558-560。人受體EphA2的序列在文獻(xiàn)中所知。其包含534個(gè)氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域、24個(gè)氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域，以及418個(gè)氨基酸的含有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。EphA2在多種癌細(xì)胞中過量表達(dá)，例如，在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、以及結(jié)腸癌和浸潤性黑色素瘤(aggressivemelanomas)中，但是在這些相同組織的非癌性損傷中沒有過量表達(dá)的報(bào)道。見，例如，Rosenberg等人(1997)Am.J.Physiol.273:G824-G832;Easty等人(1995)Int.J.Cancer60:129-136;Walker-Daniels等人(1999)Prostate41:275-280;Zantek等人(1999)CellGrowth&Differ.10:629-638;Zantek等人(2001)Clin.CancerRes.7:3640-3648;Zelniski等人(2001)CancerRes.61:2301-2306;WO01/121172;和WO01/12840。此外，被轉(zhuǎn)化而過量表達(dá)EphA2的細(xì)胞表現(xiàn)出惡性增長和配體結(jié)合，導(dǎo)致EphA2被內(nèi)化和降解，逆轉(zhuǎn)了EphA2過量表達(dá)的原癌基因效應(yīng)。見Zelniski等人(2001)CancerRes.61:2301-2306;和Walker-Daniels等人(2002)Mol.CancerRes.1:79-87。本領(lǐng)域的其他人已經(jīng)提議使用EphA2作為治療靶標(biāo)。一名作者建議使用EphA2的配體例如肝配蛋白Al與人類免疫球蛋白G融合。將表達(dá)EphA2的細(xì)胞暴露于肝配蛋白Al-Fc融合蛋白質(zhì)會(huì)導(dǎo)致EphA2表達(dá)的下調(diào)。見Duxbury等人(2004)BBRC320:1096-1102?？筫ck/EphA2的抗體是已知的，見例如Lindberg等人(1990)Mol.Cell.Biol.10:6316-6324。其他人已經(jīng)描述過4吏用抗EphA2抗體進(jìn)行基于抗體的靶向作用，見例如Charles-Kinch等人(2002)CancerRes.62:2840-2847，其描述了使用EphA2的胞外結(jié)構(gòu)域與人類免疫球蛋白融合，產(chǎn)生抗EphA2的單克隆抗體。用這些抗EphA2的單克隆抗體處理癌細(xì)胞導(dǎo)致在軟瓊脂上生長的細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變和抑制。已經(jīng)制備抗EphA2的抗體并計(jì)劃用于癌癥的治療(見例如，美國專利6,927,203;國際專利公布號(hào)WO01/12840和WO01/12172;美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/379,322和60/379,368;美國專利5，824，303)。WO2003US15044描述的方法包含施用有效量的結(jié)合EphA2并激活(agonize)EphA2的抗體，從而增加EphA2的磷酸化并降低EphA2的水平。在其他實(shí)施方案中，本申請(qǐng)描述了施用有效量的抗體，所述抗體結(jié)合EphA2并抑制癌細(xì)胞在軟瓊脂中的集落形成、抑制在三維基膜或胞外基質(zhì)制品中管狀網(wǎng)絡(luò)的形成，優(yōu)選與EphA2表位結(jié)合，所述EphA2表位暴露在癌細(xì)胞上而不在非癌細(xì)胞表面，和/或具有低Koff,因此抑制腫瘤細(xì)胞生長和/或轉(zhuǎn)移。美國專利6,927,203描述了使用增加EphA2磷酸酪氨酸含量的抗體，阻止腫瘤細(xì)胞增殖。PCT專利申^青WO200391383描述了矛汙生自EphA2的肽及其在抗腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。其描述了基于EphA2表位的肽疫苗接種或免疫治療，所述肽疫苗接種或免疫治療可用于誘導(dǎo)或^f莫擬細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞對(duì)過量表達(dá)EphA2的腫瘤細(xì)胞的應(yīng)答。雖然EphA2抗體是已知的，但是仍然需要特殊的抗EphA2抗體，所述抗體特別有效的抑制腫瘤細(xì)胞生長，高于現(xiàn)有^t術(shù)顯示的EphA2抗體所表現(xiàn)出的效率水平。本文公開的所有文獻(xiàn)、出版物和專利申請(qǐng)都在本文中以其全文引用作為參考。
發(fā)明內(nèi)容本文公開的發(fā)明涉及結(jié)合抗原EphA2的抗體，該抗原在多種人類癌癥中表達(dá)。因此，一方面，本發(fā)明是優(yōu)選結(jié)合抗原EphA2的抗體家族，或抗體或多肽(其可以是或不是抗體)。本發(fā)明中要求保護(hù)的抗體在抑制腫瘤細(xì)胞生長方面驚人而非常有效，超過了現(xiàn)有技術(shù)中EphA2抗體所表現(xiàn)的效率水平。其中一些抗體在本文中稱作LUCA19、SPL1、LUCA40或SG5。在本發(fā)明的一些方面中，已發(fā)現(xiàn)某些抗體具有阻礙腫瘤細(xì)胞增殖的能力，同時(shí)并不增加EphA2的磷酸酪氨酸含量。另一方面，本發(fā)明是下列宿主細(xì)胞系中任一個(gè)產(chǎn)生的抗EphA2的單克隆抗體2003年3月20日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的PTA-5070、2004年6月8日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的PTA-6056、2004年6月8日4呆藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的PTA-6059以及2006年2月2日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的SG5產(chǎn)生宿主細(xì)胞系(SG,3.15.B4.1F9)。另一方面，本發(fā)明是竟?fàn)幮砸种瓶笶phA2抗體與EphA2之間特異性結(jié)合的抗體或多肽(可以是或不是抗體)。另一方面，本發(fā)明是優(yōu)選結(jié)合EphA2上LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40優(yōu)選結(jié)合的相同表位的抗體或多肽(可以是或不是抗體)。另一方面，本發(fā)明是含有抗EphA2抗體的片段或區(qū)域的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，片段是抗EphA2抗體的輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段是抗EphA2抗體的重鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段包含來自抗EphA2抗體的輕鏈和/或重鏈的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段包含來自抗EphA2抗體的輕鏈和/或重鏈的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。另一方面，本發(fā)明提供包含任意下列區(qū)域的多肽(可以是或不是抗體)抗EphA2抗體的a)—個(gè)或多個(gè)CDR;b)來自輕鏈的三個(gè)CDR;c)來自重鏈的三個(gè)CDR;d)來自輕鏈的三個(gè)CDR和來自重鏈的三個(gè)CDR;e)輕鏈的可變區(qū)；f)重鏈的可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明是衍生自LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的人源化抗體。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體包含抗EphA2抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR。另一方面，本發(fā)明提供人源化抗體，其與抗EphA2抗體所結(jié)合的表位相同。通常，本發(fā)明的人源化抗體包含一個(gè)或多個(gè)(一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè))CDR，其與抗EphA2抗體的CDR相同和/或衍生自抗EphA2抗體的CDR。另一方面，本發(fā)明提供人抗體，其結(jié)合與抗EphA2抗體在EphA2上的表位相同的表位。另一方面，本發(fā)明是包含從抗EphA2抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)衍生的可變區(qū)，以及^^A抗體的重鏈和輕鏈的恒定區(qū)衍生的恒定區(qū)的嵌合抗體。另一方面，本發(fā)明是產(chǎn)生單克隆抗EphA2抗體的宿主細(xì)胞(ATCC編號(hào)PTA-5070、PTA-6056、PTA-6059或SG.3.15.B4.1F9(ATCC編號(hào)PTA-XXXX))或其后代。另一方面，本發(fā)明是編碼抗EphA2抗體的分離的多核苷酸，所述抗體是由ATCC保藏編號(hào)為PTA-5070、PTA-6056或PTA-6059的宿主細(xì)胞或者由宿主細(xì)胞SG,3.15.B4.1F9(ATCC編號(hào)PTA-XXXX)及其后代產(chǎn)生。另一方面，本發(fā)明提供了編碼本文中描述的任意抗體(包含抗體片段)以及任意其他多肽的多核苷酸。另一方面，本發(fā)明是本文中描述的任意抗體或多肽與EphA2結(jié)合的復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中，EphA2出現(xiàn)在黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌或前列腺癌的細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明是抗EphA2抗體或優(yōu)選結(jié)合抗EphA2抗體所優(yōu)選結(jié)合表位的抗體與EphA2結(jié)合的復(fù)合體。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗EphA2抗體或任意優(yōu)選結(jié)合抗EphA2抗體所優(yōu)選結(jié)合表位的抗體上連接了治療劑(例如毒素)。另一方面，本發(fā)明是任意本文中描述的抗體或多肽與表達(dá)EphA2的癌細(xì)胞結(jié)合的復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞為黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌或前列腺癌的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，抗體為SPL1、LUCA19、SG5或LUCA40或優(yōu)選結(jié)合任意這些抗EphA2抗體所優(yōu)選結(jié)合表位的任意抗體。在一些實(shí)施方案中，SPL1、LUCA19、SG5或LUCA40抗體或優(yōu)選結(jié)合任意這些抗EphA2抗體所優(yōu)選結(jié)合表位的任意抗體連接了治療劑(例如毒素)。另一方面，本發(fā)明是EphA2上SPLl、LUCA19、SG5或LUCA40所優(yōu)選結(jié)合的表位的復(fù)合體，其反過來被任意本文中描述的抗體或多肽結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，表位位于黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌或前列腺癌的細(xì)胞上。在一些實(shí)施方案中，抗體為SPL1、LUCA19、SG5或LUCA40或優(yōu)選結(jié)合任意這些抗EphA2抗體所優(yōu)選結(jié)合表位的任意抗體。在一些實(shí)施方案中，SPL1、LUCA19、SG5或LUCA40抗體或任意優(yōu)選結(jié)合任意這些抗EphA2抗體所優(yōu)選結(jié)合表位的抗體上連接了治療劑(例如毒素)。另一方面，本發(fā)明是包含本文中描述的任意多肽(包含任意抗體例如抗EphA2抗體)或多核苷酸的藥物組合物，例如藥物組合物包含抗EphA2抗體、連接治療劑的抗EphA2抗體、含有抗EphA2抗體片段的抗體、抗EphA2抗體的人源化抗體、含有衍生自抗EphA2抗體可變區(qū)的可變區(qū)和衍生自人抗體的恒定區(qū)的嵌合抗體，或具有一個(gè)或多個(gè)抗EphA2抗體性質(zhì)的人抗體，以及可藥用賦形劑。另一方面，本發(fā)明是產(chǎn)生與病態(tài)和/或癌變細(xì)胞反應(yīng)的抗EphA2單克隆抗體的方法，其包括下列步驟(a)用免疫原免疫哺乳動(dòng)物宿主；(b)從該哺乳動(dòng)物獲得淋巴細(xì)胞；(c)將(b)中的淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系融合產(chǎn)生雜交瘤；(d)培養(yǎng)(c)中的雜交瘤以產(chǎn)生單克隆抗體；以及(e)篩選抗體。只挑選那些結(jié)合病態(tài)和/或癌變細(xì)胞或細(xì)胞系，卻不結(jié)合非癌變或正常細(xì)胞或細(xì)胞系的抗體，或與正常細(xì)胞的結(jié)合水平更低或結(jié)合方式不同的抗體。另一方面，本發(fā)明是產(chǎn)生抗EphA2家族抗體的方法，其包含在允許產(chǎn)生抗體的條件下培養(yǎng)編碼此類抗體的宿主細(xì)胞及其后代，以及純化抗EphA2抗體。另一方面，本發(fā)明是產(chǎn)生抗EphA2家族抗體的方法，其包括在允許產(chǎn)生抗體的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞及其后代，以及純化抗EphA2抗體。另一方面，本發(fā)明還提供產(chǎn)生本文中描述的任意抗體(或多肽)的方法，其通過在合適的細(xì)胞中表達(dá)編碼抗體(可以分別表達(dá)單獨(dú)的輕鏈或重鏈，或從一個(gè)載體表達(dá)輕鏈和重鏈)的一個(gè)或多個(gè)多核苷酸，一般常隨后是回收和/或分離目的抗體或多肽。另一方面，本發(fā)明是竟?fàn)幮砸种瓶笶phA2抗體優(yōu)選結(jié)合EphA2的抗EphA2抗體或肽(可以是或不是抗體)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明是優(yōu)肽(可以是或不是抗體)。另一方面，本發(fā)明是包含結(jié)合EphA2表位的特異性抗體的EphA2的組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是抗EphA2。在另一些實(shí)施方案中，施用了兩種或多種抗EphA2抗體，此類抗體定位在EphA2的兩個(gè)或多個(gè)不同表位上。在一些實(shí)施方案中，抗EphA2抗體連接了治療劑或可檢測的標(biāo)簽。另一方面，本發(fā)明是包含抗EphA2抗體的片段或區(qū)域的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，片段是抗體的輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段是抗體的重鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段包含來自抗體的輕鏈和/或重鏈的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，片段包含來自抗體輕鏈和/或重鏈的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。另一方面，本發(fā)明還提供包含任意下列各區(qū)域的多肽(可以是或不是抗體)抗EphA2抗體的a)輕鏈或重鏈的一個(gè)或多個(gè)CDR(或其片段)；b)輕鏈的三個(gè)CDR;c)重鏈的三個(gè)CDR;d)輕鏈的三個(gè)CDR以及重鏈的三個(gè)CDR;e)輕鏈的可變區(qū)；f)重鏈的可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明是人源化抗體。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體包含非人抗EphA2抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR。在一些實(shí)施方案中，人源化抗體結(jié)合與其他抗EphA2抗體相同或不同的表位。通常，本發(fā)明的人源化抗體包含與最初的非人抗EphA2抗體的CDR相同和/或來自其的一個(gè)或多個(gè)(一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)，或其片段)CDR。在一些實(shí)施方案中，人抗體結(jié)合與其他抗EphA2抗體相同或不同的表位。另一方面，本發(fā)明是包含衍生自非人的抗EphA2抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的可變區(qū)，以及衍生人抗體的重鏈和輕鏈恒定區(qū)的恒定區(qū)的嵌合抗體。另一方面，本發(fā)明是分離的多核苷酸，其編碼由保藏號(hào)分別為ATCCNo.PTA-5070、PTA-6056或PTA-6059的宿主細(xì)胞，以及宿主細(xì)胞SG.3.15.B4.1F9(ATCCNo.PTA-XXXX)及其后代產(chǎn)生的抗體SPL1、LUCA19、SG5或LUCA40中的任意一個(gè)。本發(fā)明包含具有任意上述特異性抗體的內(nèi)在結(jié)合活性或生物學(xué)活性的抗體多肽。另一方面，本發(fā)明還提供編碼本文描述的任意抗體(包括抗體片段)以及任意其他多肽的多核苷酸。另一方面，本發(fā)明是包含本文描述的任意多肽(包含本文描述的任意抗體)或多核苷酸的藥物組合物，例如藥物組合物，其包含連接化療劑的抗EphA2抗體、含有抗EphA2抗體片段的抗體、非人抗EphA2抗體的人源的恒定區(qū)的恒定區(qū)的嵌合抗體，或具有非人的抗EphA2抗體的一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)的人抗體，或連接了化療劑(例如放射性部分)的本文描述的任意抗EphA2抗體，以及可藥用賦形劑。一方面，本發(fā)明是包含結(jié)合呈現(xiàn)在病態(tài)或癌變細(xì)胞表面的EphA2的抗EphA2抗體的組合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，癌細(xì)胞選自卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌的癌細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞是分離的。在一些實(shí)施方案中，癌細(xì)胞位于生物學(xué)樣品中。通常，該生物學(xué)樣品來自個(gè)體，例如人類。另一方面，本發(fā)明是通過檢測來自個(gè)體的細(xì)胞上的EphA2的個(gè)體疾病診斷方法，特別是與炎癥反應(yīng)或自身免疫應(yīng)答相關(guān)的個(gè)體疾病或病癥。在本發(fā)明的另一些方面中，提供的方法用于調(diào)控個(gè)體的炎癥反應(yīng)或自身免疫應(yīng)答?？?吏用本發(fā)明的組合物和方法治療、由炎癥或自身免疫病癥導(dǎo)致的疾病和癥狀包括(作為說明而非限制)多發(fā)性硬化、腦膜炎、腦炎、中風(fēng)、其他腦外傷、包括潰瘍性結(jié)腸炎和局限性回腸炎的炎性腸病、重癥肌無力、狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、急性幼年型糖尿病、艾滋病癡呆、動(dòng)脈粥樣硬化、腎臟炎、視網(wǎng)膜炎、特應(yīng)性皮炎、牛皮蘚、心肌缺血和急性白細(xì)胞介導(dǎo)的肺損傷。本發(fā)明的抗體和其他治療劑的治療性用途的其他啟示還包括對(duì)有器官或移植排斥風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體進(jìn)行施用。在近年，在移植例如皮膚、腎臟、肝臟、和器官的外科技術(shù)效率上已有巨大的改善。最關(guān)鍵的問題可能是缺乏用于誘導(dǎo)接受者對(duì)被移植的同種異體移植物或器官產(chǎn)生免疫耐受的滿意物質(zhì)。當(dāng)同種異型的細(xì)胞或器官被移植進(jìn)入宿主(即，供者和受者是同一物種的不同個(gè)體)后，宿主的免疫系統(tǒng)很可能增加對(duì)移植物中外源抗原的免疫應(yīng)答(宿主抗移植物病)從而導(dǎo)致被移植組織的破壞。另一方面，本發(fā)明是用于診斷個(gè)體是否患有癌癥的方法，其包括確定EphA2是否在從個(gè)體中選擇的細(xì)胞上表達(dá)，其中在所述細(xì)胞中EphA2的表達(dá)指示所述癌癥。在一些實(shí)施方案中，用抗EphA2抗體確定EphA2的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，方法包括從細(xì)胞檢測EphA2表達(dá)的水平。本文使用的術(shù)語"檢測"包含在參考或不參考對(duì)照的條件下，定性的和/或定量的檢測(測量水平)。另一方面，本發(fā)明是通過檢測個(gè)體細(xì)胞上或從細(xì)胞中釋放的EphA2來診斷個(gè)體癌癥的方法，其中癌癥選自，包括但不限于腎臟上腺瘤、艾滋病相關(guān)癌癥、軟組織腺泡狀肉瘤、星狀細(xì)胞腫瘤、膀胱癌(鱗狀細(xì)胞癌和移行細(xì)胞癌)、骨癌(釉質(zhì)瘤、動(dòng)脈瘤性骨嚢腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦和脊髓癌、轉(zhuǎn)移性腦腫瘤、乳腺癌、頸動(dòng)脈體瘤、頸癌、軟骨肉瘤、脊索瘤、腎臟嫌色細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細(xì)胞瘤、結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞肺瘤、室管膜細(xì)胞瘤、尤因瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、骨纖維發(fā)育不全、骨纖維性結(jié)構(gòu)不良、膽嚢和膽管癌、妊娠滋養(yǎng)層成瘤性疾病、胚細(xì)胞瘤、頭頸癌、胰島細(xì)胞瘤、卡波西肉瘤、腎臟癌(腎臟母細(xì)月包瘤、乳頭狀腎臟細(xì)胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌(肝母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小細(xì)胞癌、腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌等)、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑素瘤、腦(脊)膜瘤、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀旁腺腫瘤、小兒癌癥、周圍神經(jīng)鞘腫瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、后代目艮色素層黑素瘤(posteriousunvealmelanoma)、罕見血液性疾病、轉(zhuǎn)移性腎臟癌、橫玟肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀細(xì)胞癌、胃癌、滑嚢肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、甲狀腺轉(zhuǎn)移性癌和子宮癌(子宮頸癌((carcinomaofthecervix)、子宮內(nèi),膜癌和平滑肌瘤)。另一方面，本發(fā)明是在個(gè)體中診斷癌癥(例如但不限于卵巢癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)腸癌或乳腺癌)的輔助方法，其包括確定在來自個(gè)體的生物學(xué)樣品中EphA2的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，用抗EphA2抗體確定EphA2的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，抗EphA2抗體是本文中特別提到的家族成員。在一些實(shí)施方案中，方法是從細(xì)胞檢測EphA2表達(dá)的水平。另一方面，本發(fā)明是通過施用結(jié)合EphA2以有效降低癌變細(xì)胞生長的有效量抗體的治療癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，抗體是抗EphA2抗體。在一些實(shí)施方案中，癌變細(xì)胞選自，包括但不限于腎臟上腺瘤、艾滋病相關(guān)癌癥、軟組織腺泡狀肉瘤、星狀細(xì)胞腫瘤、膀胱癌(鱗狀細(xì)胞癌和移行細(xì)胞癌)、骨癌(釉質(zhì)瘤、動(dòng)脈瘤性骨嚢腫、骨軟骨瘤、骨肉瘤)、腦和脊髓癌、轉(zhuǎn)移性腦腫瘤、乳腺癌、頸動(dòng)脈體瘤、頸癌、軟骨肉瘤、脊索癌、腎臟嫌色細(xì)胞癌、透明細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、皮膚良性纖維組織細(xì)胞瘤、結(jié)締組織增生性小圓細(xì)胞肺瘤、室管膜細(xì)胞瘤、尤因瘤、骨外粘液樣軟骨肉瘤、骨纖維發(fā)育不全、骨纖維性結(jié)構(gòu)不良、膽嚢和膽管癌、妊娠滋養(yǎng)層成瘤性疾病、胚細(xì)胞瘤、頭頸癌、胰島細(xì)胞瘤、卡波西肉瘤、腎臟癌(腎臟母細(xì)胞瘤、乳頭狀腎臟細(xì)胞癌)、白血病、脂肪瘤/良性脂肪瘤、脂肉瘤/惡性脂肪瘤、肝癌(肝母細(xì)胞瘤、肝細(xì)胞癌)、淋巴瘤、肺癌(小細(xì)胞癌、腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、大細(xì)胞癌等)、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、黑素瘤、腦〔脊〕膜瘤、多發(fā)性內(nèi)分泌腺瘤形成、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓增生異常綜合征、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、曱狀旁腺腫瘤、小兒癌癥、神經(jīng)鞘膜腫瘤、嗜鉻細(xì)胞瘤、垂體瘤、前列腺癌、后代眼色素層黑素瘤、罕見性血液性疾病、轉(zhuǎn)移性腎臟癌、橫紋肌樣瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、皮膚癌、軟組織肉瘤、鱗狀上皮細(xì)胞癌、胃癌、滑嚢肉瘤、睪丸癌、胸腺癌、胸腺瘤、曱狀腺轉(zhuǎn)移性癌和子宮癌(子宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌和平滑肌瘤)。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，癌變細(xì)胞選自實(shí)體瘤，包括但不限于乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、肺癌、肉瘤、轉(zhuǎn)移性腎臟癌、曱狀腺轉(zhuǎn)移性癌和透明細(xì)胞癌。另一方面，本發(fā)明是包括施用有效量的特異性結(jié)合EphA2的抗體家族中的至少一個(gè)成員來延遲患有癌癥的個(gè)體轉(zhuǎn)移發(fā)展的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體是抗EphA2抗體。另一方面，本發(fā)明是體外或個(gè)體內(nèi)抑制癌細(xì)胞生長和/或增殖的方法，其包括向細(xì)胞培養(yǎng)物或樣品，或者向個(gè)體施用有效量的包含結(jié)合了(包含連接了)化療劑的抗EphA2抗體的組合物。在另一方面，本發(fā)明是通過向個(gè)體施用有效量的特異性結(jié)合EphA2的抗體家族的至少一種成員，向個(gè)體中的癌變細(xì)胞遞送治療劑的方法。在另一些實(shí)施方案中，抗EphA2抗體是與其他治療劑結(jié)合(包含連接)而遞送至個(gè)體中的。在一些實(shí)施方案中，抗EphA2抗體是衍生自本文中提到的抗體家族成員的人源化抗體(通常，但并非必需，含有一個(gè)或多個(gè)部分或完整的抗體CDR)。在一些實(shí)施方案中，抗EphA2抗體是具有提到的抗體家族成員的一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)的人抗體。在一些實(shí)施方案中，化療劑(例如毒素或放射性分子)被遞送至到癌細(xì)胞內(nèi)0皮內(nèi)化)。在一些實(shí)施方案中，物質(zhì)為肥皂草毒蛋白(saporin)。另一方面，本發(fā)明是治療個(gè)體癌癥的方法，其包括向個(gè)體施用有效量的包含結(jié)合了(包含連接了)化療劑的抗EphA2抗體的組合物。本發(fā)明還提供了用于調(diào)控(增強(qiáng)或者減弱)EphA2與胞質(zhì)信號(hào)伴侶的結(jié)合的方法。通過〗吏調(diào)節(jié)信號(hào)伴侶與EphA2結(jié)合的物質(zhì)接觸呈現(xiàn)在細(xì)胞表面的EphA2分子，可以影響EphA2與胞質(zhì)信號(hào)伴侶間的結(jié)合。能阻斷或減少EphA2與其結(jié)合伴侶和/或信號(hào)伴倡的結(jié)合的物質(zhì)可用于調(diào)控在EphA2介導(dǎo)的炎癥或免疫應(yīng)答中涉及到的生物學(xué)和病理學(xué)過程。涉及到這一作用的病理學(xué)過程包含與肺瘤相關(guān)的細(xì)胞生長?？梢詸z測物質(zhì)，例如抗EphA2抗體，在阻斷、減弱、增強(qiáng)或調(diào)控EphA2與其結(jié)合伴侶間的結(jié)合方面的能力。具體來說，檢測物質(zhì)調(diào)控此類相互作用的能力可以通過將含有EphA2相互作用位點(diǎn)(一般是在完整活細(xì)胞上存在的天然構(gòu)型)的肽與結(jié)合伴倡和檢測劑共同賻育，并且確定檢測劑是否能減弱或增強(qiáng)結(jié)合伴侶與EphA2肽的結(jié)合。激動(dòng)劑、拮抗劑，及其他調(diào)節(jié)劑是特別值得考慮的。在一些方面，本發(fā)明是在個(gè)體中診斷疾病的輔助方法，其包括步驟(i)測定從個(gè)體獲得的血液或組織樣品中EphA2的存在情況；(ii)與正常的(非病態(tài)的)血液或組織樣品相比，檢測上述樣品是否具有升高的EphA2標(biāo)記量；以及(iii)揭示上述標(biāo)記升高的量與疾病的陽性診斷間的相關(guān)性，或揭示上述標(biāo)記未升高的量與疾病的陰性診斷間的相關(guān)性。在一些實(shí)施方案中，使用抗EphA2抗體檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方案中，方法受到選自放射性核素顯像、流式細(xì)胞術(shù)及免疫組織化學(xué)的技術(shù)的影響。另一方面，本發(fā)明是通過使用本文中描述的抗EphA2抗體或任意EphA2結(jié)合部分(多肽，包括但不限于多種抗體和抗體衍生物)，檢測來自個(gè)體的細(xì)胞上的EphA2，而在個(gè)體中診斷癌癥或轉(zhuǎn)移性癌癥的方法。在一些實(shí)施方案中，癌癥是黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌和前列腺癌。在一些實(shí)施方案中，方法是從細(xì)胞檢測EphA2的水平。EphA2的存在是通過檢測EphA2與EphA2結(jié)合部分間形成的復(fù)合體而檢測出來的。本文使用的術(shù)語"檢測"包含在參考或不參考對(duì)照的條件下，定性的和/或定量的檢測(測量水平)。另一方面，本發(fā)明是通過施用能有效降低癌變細(xì)胞生長的有效量的組合物來治療癌癥的方法，所述組合物包含抗EphA2抗體，或本文中描述的任意抗體(包括多肽)或多核苷酸的實(shí)例，包括但不限于結(jié)合了治療劑的抗EphA2抗體、含有抗EphA2抗體的片段或區(qū)域的抗體、人源化抗體(通常，但非必需，含有抗EphA2抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR)、含有衍生自抗EphA2有抗EphA2抗體一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)的人抗體。在一些實(shí)施方案中，癌癥是黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌或前列腺癌。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明是治療患者癌癥的方法，該方法包括對(duì)所述患者施用治療有效量的特異性結(jié)合EphA2的EphA2抗體，該抗體具有SPL1、LUCA19、SG5或LUCA40的至少一個(gè)，優(yōu)選兩個(gè)或多個(gè)下列特征a.結(jié)合癌細(xì)月包上的EphA2的能力；b.在體外或體內(nèi)結(jié)合暴露在活的癌細(xì)胞表面的EphA2—部分的能力；c.阻礙腫瘤細(xì)胞增殖，但不增加EphA2磷酸酪氨酸含量的能力；d.將治療劑或可檢測的標(biāo)記遞送至表達(dá)EphA2的癌細(xì)胞的能力；以及e.將治療劑或可檢測的標(biāo)記遞送至表達(dá)EphA2的癌細(xì)胞內(nèi)部的能力。另一方面，本發(fā)明是通過向個(gè)體施用能有效降低癌變細(xì)胞生長的有效量的組合物，抑制個(gè)體中的癌變細(xì)胞生長和/或增殖的方法，所述組合物包含抗EphA2抗體，或本文中描述的任意抗體(包括多肽)或多核苷酸的實(shí)例，其包括但不限于結(jié)合了治療劑的抗EphA2抗體、含有抗EphA2抗體的片段或區(qū)域的抗體、人源化抗體(通常，但非必需，含有抗EphA2抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR)、含有衍生自抗EphA2抗體可變區(qū)衍生自的可變區(qū)和衍生自人抗體的恒定區(qū)的恒定區(qū)的嵌合抗體，或者具有抗EphA2抗體一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)的人抗體。在一些實(shí)施方案中，癌癥是黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌或前列腺癌。另一方面，本發(fā)明是通過施用能有效降低癌變細(xì)胞生長的有效量的組合物，在患有癌癥的個(gè)體中阻止或延緩轉(zhuǎn)移發(fā)展、治療轉(zhuǎn)移性癌癥，或抑制轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞增殖的方法，所述組合物包含抗EphA2抗體，或本文中描述的任意抗體(包括多肽)或多核苷酸的實(shí)例，其包括但不限于結(jié)合了治療劑的抗EphA2抗體、含有抗EphA2抗體的片段或區(qū)域的抗體、人源化抗體(通常，但非必需，含有抗EphA2抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR)、含有衍生自抗EphA2抗體可變區(qū)的可變區(qū)和衍生自人抗體的恒定區(qū)的恒定區(qū)的嵌合抗體，或具有抗EphA2抗體一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)的人抗體。在一些實(shí)施方案中，癌癥是黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌或前列腺癌。另一方面，本發(fā)明是通過向個(gè)體施用有效量的連接了治療劑(例如毒素或放射性分子)的、本文中描述的結(jié)合EphA2的抗體或任意結(jié)合EphA2的部分(多肽，包括^旦不限于抗體或抗體衍生物)，向個(gè)體中的癌變細(xì)胞遞送治療劑(例如毒素或放射性分子)的方法。EphA2結(jié)合部分包括，但不限于抗EphA2抗體、含有抗EphA2抗體的片段或區(qū)域的抗體、人源化抗體(通常，但非必需，含有抗EphA2抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR)、含有衍生自抗EphA2抗體可變區(qū)的可變區(qū)和衍生自人抗體的恒定區(qū)的恒定區(qū)的嵌合抗體，或具有抗EphA2抗體一個(gè)或多個(gè)性質(zhì)的人抗體。在一些實(shí)施方案中，癌變細(xì)胞來自黑素瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌或前列腺癌。在另一個(gè)實(shí)施方案中，治療劑(例如毒素或放射性分子)被遞送至癌變細(xì)胞內(nèi)部(被內(nèi)化)。因此，本發(fā)明提供了將治療劑遞送至上述癌細(xì)胞內(nèi)部，抑制癌細(xì)胞生長和/或增殖的方法。圖1顯示了A549腫瘤異種移植物接受SPL1皮下治療的結(jié)果，以及在中止投藥后它們緩慢的再生長的結(jié)果。具體實(shí)施方式本文公開的發(fā)明提供了與抗原EphA2結(jié)合的抗體和多肽，以及制備和使用這些抗體和多肽診斷和治療多種與EphA2的表達(dá)和/或過量表&目關(guān)的人類癌癥疾病的方法。在多種人類癌癥中已經(jīng)出現(xiàn)EphA2的存在及其表達(dá)的升高。抗EphA2抗體，例如通過任意一個(gè)在下文中鑒定的宿主細(xì)胞產(chǎn)生的那些，已經(jīng)產(chǎn)生并表現(xiàn)出與EphA2的特異性結(jié)合。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，產(chǎn)生mLUCA19的雜交瘤已經(jīng)于1993年3月20日儲(chǔ)存在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)10801UniversityBlvd.,ManassasVA20110-2209，專利保藏編號(hào)為PTA-5070,產(chǎn)生SPLl的雜交瘤于2004年6月8日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，專利保藏編號(hào)為PTA-6059;產(chǎn)生LUCA40的雜交瘤于2004年6月8日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，專利保藏編號(hào)為PTA-6056;產(chǎn)生SG5的雜交瘤于2006年2月2日保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC),專利保藏編號(hào)為PTA-XXXX。I.常規(guī)技術(shù)除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)踐將運(yùn)用本領(lǐng)域技術(shù)中的分子生物學(xué)(包含重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)說明,例如，MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版(Sambrook等人，1989),ColdSpringHarborPress;OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait編著，1984);MethodsinMolecularBiology,HumanaPress;CellBiology:ALaboratoryNotebook(J.E.Cellis編著，1998)，AcademicPress;AnimalCellCulture(R丄Freshney編著，1987);IntroductiontoCellandTissueCulture(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998)，PlenumPress;CellandTissueCulture:LaboratoryProcedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,和D.G.Newell編著，1993-8),J.Wiley和Sons;MethodsinEnzymology(AcademicPress,Inc.);HandbookofExperimentalImmunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell編著》GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.Miller和M.P.Calos編著，1987》CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人編著，1987);PCR:ThePolymeraseChainReaction,(Mullis等人編著，1994);CurrentProtocolsinimmunology(J.E.Coligan等人編著，1991);ShortProtocolsinMolecularBiology(Wiley和Sons,1999》Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:apracticalapproach(D.Catty.編著，IRLPress,1988-1989);Monoclonalantibodies:apracticalapproach(P.Shepherd和C.Dean編著，OxfordUniversityPress,2000);Usingantibodies:alaboratorymanual(E.Harlow和D.Lane(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999);TheAntibodies(M.Zanetti和J.D.Capra編著，HarwoodAcademicPublishers,1995);以及Cancer:PrinciplesandPracticeofOncology(V.T.DeVita等人編著，J.B.LippincottCompany,1993)。II.定義EphA2是分子量約為130KD的多肽抗原，能與本發(fā)明所使用的抗體反應(yīng)。如本文中更詳細(xì)描述的，該抗原具有一個(gè)以上不同的表位。本發(fā)明的一些優(yōu)選抗體實(shí)例是直接針對(duì)EphA2抗原上的兩個(gè)或多個(gè)特殊表位中的一個(gè)。目前認(rèn)為，與它們的正常組織對(duì)應(yīng)物相比，EphA2在某些癌細(xì)胞中是過量表達(dá)的。"抗體"是通過位于免疫球蛋白分子可變區(qū)的至少一個(gè)的抗原識(shí)別位點(diǎn)，能夠特異性結(jié)合靶標(biāo)，例如糖類、多核苷酸、脂類、多肽等的免疫球蛋白分子。如本文用到的，該術(shù)語不僅包含完整的多克隆或單克隆抗體，而且還包含它們的片段(例如Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、天然存在的變體、含有具有必需特異性抗原識(shí)別位點(diǎn)的抗體部分的融合蛋白質(zhì)、人源化抗體、嵌合抗體，以及包含具有必需特異性抗原識(shí)別位點(diǎn)的免疫球蛋白分子的任意其他被修飾的構(gòu)型。術(shù)語"單克隆抗體"不僅包含完整的單克隆抗體和全長的單克隆抗體，而且還包含它們的片段例如Fab、Fab，、F(ab，)2、Fv)、單鏈(ScFv)、其突變體、含有抗體部分的融合蛋白質(zhì)、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體，以及包含必需特異性抗原識(shí)別位點(diǎn)并且能夠結(jié)合抗原的免疫球蛋白分子的任意其他被修飾的構(gòu)型。對(duì)于抗體的來源或其制備方法(例如，通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等)的說明并非出于限制的意圖。"人源化"抗體指具有本質(zhì)上衍生自非人類物種的免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)，并且保留著基于人類免疫球蛋白分子的結(jié)構(gòu)和/或序列的免疫球蛋白分子結(jié)構(gòu)的分子?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可以含有融合在恒定結(jié)構(gòu)域上的完整可變結(jié)構(gòu)域，或者僅有被移植到可變結(jié)構(gòu)域中的正確讀碼框區(qū)域的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？乖Y(jié)合位點(diǎn)可以是野生型或者經(jīng)過例如一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代的修飾，例如修飾使其更類似人類免疫球蛋白。一些形式的人源化抗體保留了全部的CDR序列(例如，含有全部六個(gè)來自小鼠抗體的CDR的人源化的小鼠抗體)。另一些形式的人源化抗體有一個(gè)或多個(gè)(一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè))在原始抗體上進(jìn)行了改變的CDR，它們也被定義為是從LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40中的一個(gè)或多個(gè)CDR"衍生來的"一個(gè)或多個(gè)CDR。"嵌合抗體"指這樣一類抗體，它們的每一條重鏈和輕鏈的氨基^列中都有一部分與其衍生自的特定物種或所屬的特定綱的抗體的相應(yīng)序列同源，同時(shí)鏈的剩余部分則與另一物種的相應(yīng)序列同源。通常，在這些嵌合抗體中，輕鏈和重鏈的可變區(qū)模擬從一個(gè)哺乳動(dòng)物物種來源的抗體的可變區(qū)，而恒定區(qū)則與來自另一個(gè)物種的抗體序列同源。上述嵌合形式的一個(gè)明顯優(yōu)勢在于，例如，可以從目前已知的來源，使用來自非人宿主生物的現(xiàn)成的雜交瘤或B細(xì)胞方便的衍生出可變區(qū)，再結(jié)合來自(例如)人類細(xì)胞制品的恒定區(qū)。盡管可變區(qū)具有易于制備的優(yōu)點(diǎn)，并且特異性又不會(huì)受到其來源的影響，人類的恒定區(qū)比從非人類來源的恒定區(qū)在抗體被注射時(shí)，更不易對(duì)人類對(duì)象引發(fā)免疫應(yīng)答。但是，該定義并不限于這一特定的實(shí)例。"特異性的結(jié)合"或"優(yōu)選結(jié)合，，(本文中互換使用)抗體或多肽的表位是本領(lǐng)域普遍理解的術(shù)語，而且用于確定此類特異性或優(yōu)選結(jié)合的方法也是本領(lǐng)域已知的。如果分子與特定的細(xì)胞或物質(zhì)間，比它與其他細(xì)胞或底物能更頻繁、更迅速的締合且具有更持久和/或更大的親和力(affinity)，就可以認(rèn)為上述分子表現(xiàn)出了"特異性的結(jié)合，，或"優(yōu)選結(jié)合，，。如果抗體與靶標(biāo)的結(jié)合比它與其他物質(zhì)的結(jié)合具有更大的親和力、親合力(avidity)、更穩(wěn)定，和/或更長的持續(xù)時(shí)間，該抗體就是與靶標(biāo)"特異性的結(jié)合"或"優(yōu)選結(jié)合"。例如，特異性的或優(yōu)選結(jié)合EphA2表位的抗體是這樣的抗體，其在結(jié)合這一EphA2表位時(shí)，比它結(jié)合其他EphA2表位或非EphA2表位時(shí)，具有更大的親和力、親合力、更穩(wěn)定，和/或更長的持續(xù)時(shí)間。通過閱讀該定義后也可以了解，例如，特異性的或優(yōu)選結(jié)合第一個(gè)靶標(biāo)的抗體(或部分或表位)，可以或不可以再特異性的或優(yōu)選結(jié)合第二個(gè)靶標(biāo)。同樣的，"特異性的結(jié)合"或"優(yōu)選結(jié)合"不需要(雖然它可以包含)排它性的結(jié)合。通常，但并非必須，提到的結(jié)合表示優(yōu)選結(jié)合。關(guān)于表位的術(shù)語"免疫學(xué)活性"存在或"維持免疫學(xué)的活性，，指抗體(例如抗EphA2抗體)在不同條件下結(jié)合表位的能力，例如，在表位經(jīng)歷過還原性和變性的條件后。本文所用的術(shù)語"LUCA19、SPL1、LUCA40或SG5"、"抗EphA2抗體"和"單克隆抗EphA2抗體"可以互換4吏用，指由任意的保藏編號(hào)為ATCCNo.PTA-5070、PTA-6056或PTA-6059的宿主細(xì)胞，或者宿主細(xì)胞SG丄15B4.1F9(ATCC編號(hào)PTA-XXXX)及其后代產(chǎn)生的免疫球蛋白。LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40與不同的生物學(xué)功能相關(guān)，包括但不限于，結(jié)合EphA2的能力；結(jié)合EphA2胞外結(jié)構(gòu)域的能力；在體外或體內(nèi)在癌細(xì)胞上結(jié)合暴露在活細(xì)胞表面的EphA2的能力；將化療劑遞送至表達(dá)EphA2的癌變細(xì)胞(例如卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或乳腺癌細(xì)胞)的能力；將治療劑或可檢測的標(biāo)記遞送至表達(dá)EphA2的癌細(xì)胞內(nèi)部的能力。如本文中所討論的，本發(fā)明中的多肽(包含抗體)可以具有任意一個(gè)或多個(gè)這些特征。"抗EphA2等價(jià)抗體"或"抗EphA2等價(jià)多肽"指具有與抗EphA2抗體相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)生物學(xué)功能的抗體或多肽，例如，結(jié)合的特異性。在本文中，"物質(zhì)"指生物學(xué)、藥物或化學(xué)化合物。非限制性實(shí)例包括簡單或復(fù)雜的有機(jī)或無機(jī)分子、肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、抗體、抗體衍生物、抗體片段、維生素衍生物、糖類、毒素，或化療化合物?？梢院铣啥喾N化合物，例如，小分子和寡聚物(例如寡肽和寡核苷酸)，以及基于多種核心結(jié)構(gòu)的合成有機(jī)化合物。此外，多種天然來源可以提供用于篩選的化合物，例如植物或動(dòng)物的提取物等。技術(shù)人員可以容易認(rèn)識(shí)到對(duì)本發(fā)明的物質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)是沒有限制的。本發(fā)明的方法中使用的物質(zhì)可以是隨機(jī)挑選的，或理性選擇或設(shè)計(jì)的。如本文用到的，當(dāng)物質(zhì)是在沒有考慮EphA2與其天然結(jié)合伴侶或未知抗體結(jié)合時(shí)所涉及的特異性序列的情況下被選擇的，認(rèn)為該物質(zhì)是隨機(jī)選擇的。隨機(jī)選擇物質(zhì)的實(shí)例是使用化學(xué)文庫或肽結(jié)合文庫。如本文用到的，當(dāng)物質(zhì)的選擇是在非隨機(jī)的基礎(chǔ)上、將靶標(biāo)位點(diǎn)的序列和/或其構(gòu)型與物質(zhì)的作用聯(lián)系起來考慮的時(shí)候，可以認(rèn)為該物質(zhì)是理性的選擇或設(shè)計(jì)的。對(duì)于抗EphA2的物質(zhì)，目前認(rèn)為在EphA2上至少存在三個(gè)表位能夠激發(fā)針對(duì)其的抗體，因此對(duì)于物質(zhì)存在阻斷EphA2/抗EphA2間的相互作用的至少三個(gè)作用位點(diǎn)。該發(fā)明也包含了作用在EphA2及其天然結(jié)合伴倡間的相互作用位點(diǎn)上的物質(zhì)，而且其他的配體和它們的活性EphA2-相互作用位點(diǎn)也包含在該發(fā)明的范圍內(nèi)，不論是目前已知的或還有待以后鑒定的。通過利用組成受體/配體和/或EphA2/抗EphA2抗體復(fù)合物的接觸位點(diǎn)的肽序列可以合理選擇或合理設(shè)計(jì)物質(zhì)。例如，合理選擇的肽物質(zhì)可以是那些M酸序列與天然環(huán)境下暴露在活細(xì)胞表面的EphA2上出現(xiàn)的表位相同的肽。根據(jù)需要，通過與抗EphA2抗體或天然配體結(jié)合，此類物質(zhì)將減弱或阻斷抗EphA2抗體與EphA2間，或EphA2與其天然配體間的結(jié)合。如本文用到的，對(duì)于抗體，術(shù)語"標(biāo)記的"意在包含通過偶聯(lián)(即，物理性的連接)可檢測的物質(zhì)，例如在抗體上偶聯(lián)j文射性物質(zhì)或焚光團(tuán)(例如，異硫氰酸熒光素(FITC)或藻紅蛋白(PE)),來直接標(biāo)記抗體，也包含通過與可檢測的物質(zhì)的反應(yīng)來間接的標(biāo)記探針或抗體。如本文用到的，對(duì)于抗體，術(shù)語"結(jié)合"包含與物質(zhì)(例如，化療劑)共價(jià)和非共價(jià)的附著或結(jié)合?？贵w可以通過連接常用平臺(tái)，以直接結(jié)合或間接結(jié)合來結(jié)合物質(zhì)(例如，化療劑)，從而抗體指導(dǎo)了該物質(zhì)定位到癌變細(xì)胞，所述的癌變細(xì)胞結(jié)合抗體并且其中抗體和物質(zhì)不會(huì)在生理?xiàng)l件下顯著解離，因此物質(zhì)不會(huì)靶向該抗體結(jié)合的相同的癌變細(xì)胞，或者因此該物質(zhì)的效力不會(huì)降低。"生物學(xué)樣品"包含從個(gè)體獲得的多種樣品類型，并且可用于診斷或監(jiān)控分析。該定義包含生物來源的血液和其他液體樣品、實(shí)體組織樣品例如活組織檢查標(biāo)本或組織培養(yǎng)物或來自其的細(xì)胞，以及其后代，例如，從懷疑患有癌癥的個(gè)體收集的組織樣品中獲得的細(xì)胞，在優(yōu)選實(shí)施方案中細(xì)胞來自卵巢、肺、前列腺、胰腺、結(jié)腸和乳房組織。該定義還包含在獲得后以任意方式處理過的樣品，例如使用物質(zhì)治療、增溶，或富集某些組分(例如蛋白質(zhì)或多肽)，或出于切片目的被包埋在半固體或固體基質(zhì)中。術(shù)語"生物學(xué)樣品，，包括臨床樣品，還包括培養(yǎng)中的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞裂解物、血清、血漿、生物流體，以及組織樣品。術(shù)語"多肽"、"寡肽"，"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，指任意長度的氨基酸聚合物。該聚合物可以是線性的或分支的，其可包含修飾過的氨基酸，并且可以被非氨基酸中斷。該術(shù)語還包含天然或干涉修飾的氨基酸聚合物；例如，二硫鍵的形成、糖基化、酰基化、乙?；?、磷酸化，或任意其他的操作或修飾，例如接合標(biāo)記的成分。該定義中還包含，例如含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸等)以及其他本領(lǐng)域已知的修飾的多肽。要理解因?yàn)楸景l(fā)明的多肽U于抗體的，其中的肽可以以單鏈或結(jié)合的鏈存在。抗體的"可變區(qū)"指抗體輕鏈的可變區(qū)或抗體重鏈的可變區(qū)，其單獨(dú)存在或者組合存在?？贵w的"恒定區(qū)"指抗體輕鏈的恒定區(qū)或抗體重鏈的恒定區(qū)，其單獨(dú)存在或者組合存在。如本文用到的，"基本純"指物質(zhì)至少達(dá)到50%純度(即，沒有污染物)，更優(yōu)選達(dá)到至少90%純度，更優(yōu)選達(dá)到至少95%純度，更優(yōu)選達(dá)到至少98%純度，更優(yōu)選達(dá)到至少99%純度。"宿主細(xì)胞"包括單個(gè)的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，其可以是或已經(jīng)是栽體的受體，用于整合多核苷酸插入片段。宿主細(xì)胞包括單個(gè)宿主細(xì)胞的后代，并且因?yàn)樘烊坏?、偶然的或?jì)劃的突變，其后代可以不必與原始親本細(xì)胞完全一致(在形態(tài)學(xué)或基因組DNA互補(bǔ)鏈上)。宿主細(xì)胞包括用本發(fā)明的多核苷酸體內(nèi)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。如本文用到的，"延遲轉(zhuǎn)移發(fā)展，，意味著推遲、阻礙、放緩、延緩、穩(wěn)定，和/或延期轉(zhuǎn)移發(fā)展。上述延遲可以依據(jù)癌癥病史和/或待治療的個(gè)體而在時(shí)間長度上不同。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，有效或顯著的延遲可以有效的包含預(yù)防，即個(gè)體不出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。藥物、化合物或藥物組合物的"有效量"是足以產(chǎn)生有益或理想結(jié)果的量，所述結(jié)果包括但不限于，臨床結(jié)果中例如腫瘤的尺寸縮小(在癌癥的范圍內(nèi)，例如，乳腺癌或前列腺癌)、阻滯癌變細(xì)胞生長、延緩轉(zhuǎn)移發(fā)展、減弱疾病導(dǎo)致的一個(gè)或多個(gè)癥狀、增加患病患者的生活質(zhì)量，降低治療疾病時(shí)所需的其他藥物劑量、增強(qiáng)其他藥物的效力例如通過乾向作用和/或內(nèi)化作用、延緩疾病的發(fā)展，和/或延長個(gè)體的存活?？梢栽谝淮位蚨啻谓o藥中施用有效量。出于本發(fā)明的目的，藥物、化合物或藥物組合物的有效量是足以直接或間接、降低(或破壞)贅生性細(xì)胞的增殖，和/或降低和/或延遲贅生性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移發(fā)展或轉(zhuǎn)移生長的量。根據(jù)癌癥臨床背景內(nèi)的理解，藥物、化合物或藥物組合物的有效量可以是在聯(lián)合或不聯(lián)合使用另一種藥物、化合物或藥物組合物的情況下實(shí)現(xiàn)。因此，在施用一種或多種治療劑的情況下都可以考慮"有效量"，并且如果可以或已經(jīng)取得理想的結(jié)果，單獨(dú)一種物質(zhì)在與一種或多種其他物質(zhì)聯(lián)合使用時(shí)也可以認(rèn)為以有效量給藥。如本文用到的，"治療"是獲得有益的或理想的結(jié)果(包括優(yōu)選臨床結(jié)果)的方法。出于本發(fā)明的目的，有益的或理想的臨床結(jié)果包括但不限于一種或多種下列情況降低(或破壞)贅生性細(xì)胞的增殖、減少癌癥中發(fā)現(xiàn)的贅生性細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、縮小腫瘤的尺寸、減少疾病導(dǎo)致的癥狀、增加患病患者的生活質(zhì)量、減少用于治療疾病所需的其他藥物劑量、延緩疾病的發(fā)展，和/或延長患者的存活。如本文用到的，"延遲轉(zhuǎn)移發(fā)展"意味著推遲、阻礙、放緩、延緩、穩(wěn)定，和/或延期轉(zhuǎn)移發(fā)展。這一延遲可以依據(jù)癌癥病史和/或待治療的個(gè)體，在時(shí)間長度上有所差異。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚，有效或顯著的延遲可以有效的包含預(yù)防，即個(gè)體不出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。"生物樣品"包含從個(gè)體獲得的多種樣品類型，并且可用于診斷或監(jiān)控分析。該定義包含生物學(xué)來源的血液及其他液體樣品、實(shí)體組織樣品例如活組織檢查標(biāo)本或組織培養(yǎng)物或來自其的細(xì)胞及其后代。該定義還包含在獲得后以任意方式處理過的樣品，例如使用物質(zhì)治療、增溶，或富集某些成分、例如蛋白質(zhì)或多核苷酸，或出于切片目的包埋在半固體或固體基質(zhì)中。術(shù)語"生物學(xué)樣品"包含臨床樣品，還包含培養(yǎng)中的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞裂解物、血清、血漿、生物流體、以及組織樣品。"個(gè)體"是脊推動(dòng)物，優(yōu)選是哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選是人。哺乳動(dòng)物包括但不限于，家畜、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物(sportanimals)、寵物(例如貓、狗、馬)、靈長類動(dòng)物、小鼠和大鼠。"毒素"或"細(xì)胞毒素"指任意引起細(xì)胞內(nèi)不良反應(yīng)的物質(zhì)。例如，靶向癌變細(xì)胞的毒素可以對(duì)癌變細(xì)胞產(chǎn)生不良的、有時(shí)是有害的影響。如本文用到的，"物質(zhì)"指生物學(xué)、藥物或化學(xué)化合物。非限制性實(shí)例包括簡單或復(fù)雜的有機(jī)或無機(jī)分子、肽、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、抗體、抗體衍生物或抗體片段?？梢院铣啥喾N化合物，例如，小分子和寡聚物(例如寡肽和寡核苷酸)，以及基于多種核心結(jié)構(gòu)的合成有機(jī)化合物。此外，多種天然來源也可以提供用于篩選的化合物，例如植物或動(dòng)物的提取物等。如本文用到的，"治療劑"意指任意對(duì)治療(本文中，通常在癌癥的范圍)有用的物質(zhì)，包括抗腫瘤藥、毒素或細(xì)胞毒素、細(xì)胞毒素劑，以及放射性物質(zhì)。"主動(dòng)免疫應(yīng)答，，指產(chǎn)生，并持續(xù)產(chǎn)生在體內(nèi)直接針對(duì)抗原的抗體，以應(yīng)答向宿主施用該抗原或編碼該抗原的DNA栽體，所述施用可以通過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下或者其他使用或未使用佐劑的施用方式。主動(dòng)免疫應(yīng)答也可以包含免疫應(yīng)答的其他方面，例如細(xì)胞免疫應(yīng)答。制備組合物的組分和方法本發(fā)明包含包括藥物組合物的組合物，其含有可結(jié)合EphA2的抗體、多肽和蛋白質(zhì)，以及含有編碼結(jié)合EphA2的抗體、多肽和蛋白質(zhì)的序列的多核苷酸。如本文用到的，組合物包含結(jié)合EphA2的一種或多種抗體、多肽和/或蛋白質(zhì)，和/或含有編碼結(jié)合EphA2的一種或多種抗體、多肽和蛋白質(zhì)的序列的一種或多種多核苷酸。這些組合物可以進(jìn)一步包含合適的賦形劑，例如包括本領(lǐng)域熟知的緩沖液在內(nèi)的可藥用賦形劑。本發(fā)明還包含LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40，以及等價(jià)抗體或多肽片段(例如，F(xiàn)ab、Fab，、F(ab，)2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、單鏈(ScFv)、它們的突變體、含有抗體部分的融合蛋白質(zhì)、人源化抗體，以及含有具有必需特異性的抗原(EphA2)識(shí)別位點(diǎn)的LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的任意其他修飾過的構(gòu)型。本發(fā)明還提供表現(xiàn)出LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的一種或多種生物學(xué)特征的人源化抗體。LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的等價(jià)抗體(包括人源化抗體和人抗體)，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的肽片段，以及含有任意這些片段的多肽通過LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的一種或多種特征鑒定和表征。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明結(jié)合EphA2的抗體、多肽和蛋白質(zhì)是竟?fàn)幮砸种芁UCA19、SPL1、SG5或LUCA40與EphA2優(yōu)選結(jié)合的抗體、多肽和蛋白質(zhì)，或者是優(yōu)選結(jié)合EphA2與抗EphA2抗體優(yōu)選結(jié)合的相同表位的抗體、多肽和蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明提供任意下列選項(xiàng)(或組合物，包括藥物組合物)(a)由保藏編號(hào)為ATCCNo.PTA-5070、PTA-6056或PTA-6059,或者宿主細(xì)胞SG3.15B4.1F9(PTA-XXXX)或其后代產(chǎn)生的抗EphA2抗體；(b)抗EphA2抗體的人源化形式；(c)含有抗EphA2抗體的一個(gè)或多個(gè)輕鏈和/或重鏈可變區(qū)的抗體；(d)包含與抗EphA2抗體的重鏈和輕鏈的可變區(qū)同源或4汙生自其的可變區(qū)，以及與人抗體的重鏈和輕鏈的恒定區(qū)同源或衍生自其的恒定區(qū)的嵌合抗體；(e)含有LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的輕鏈和/或重鏈的一個(gè)或多個(gè)CDR(至少一個(gè)、二個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè))的抗體；(f)含有LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的重鏈和/或輕鏈的抗體；(g)等價(jià)于LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的人抗體?？贵w的人源化形式可以具有或沒有與LUCA19、SPL1、LUCA40或SG5,或者由保藏編號(hào)為ATCCNo.PTA-5070、PTA-6056或PTA-6059或宿主細(xì)月包SG3.15B4.1F9(ATCCNo.PTA-XXXX)產(chǎn)生的抗體相同的CDR。對(duì)CDR區(qū)域的確定是本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有至少一個(gè)CDR的抗體，所述CDR與LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40,或者與由保藏編號(hào)為ATCC編號(hào)PTA-5070、PTA-6056、PTA-6059的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞SG3.15B4.1F9(ATCC編號(hào)PTA-XXXX)產(chǎn)生的抗體的至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)CDR基本同源(或者，在一些實(shí)施方案中，與LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的全部6個(gè)CDR基本同源，或者衍生自LUCA19、SPL1、LUCA40或SG5)。其他實(shí)施方案包括具有至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)CDR的抗體，所述CDR與LUCA19、SPL1、LUCA40或SG5，或者與LUCA19、SPL1、LUCA40或SG5衍生的，或者與由保藏編號(hào)為ATCC編號(hào)PTA-5070，PTA-6056或PTA-6059的宿主細(xì)胞或宿主細(xì)胞SG3.15B4.1F9產(chǎn)生的抗體的至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)或六個(gè)CDR基本同源。要理解出于本發(fā)明的目的，結(jié)合的特異性和/或整體活性(可以指降低癌變細(xì)胞的生長和/或增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡性細(xì)胞死亡、推遲轉(zhuǎn)移發(fā)展和/或姑息治療)通常是被保留的，盡管與LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40相比其活性程度可以變化(可以更大或更小)。本發(fā)明還提供了制備任意這些抗體的方法。制備抗體的方法是本領(lǐng)域已知的并在本文中進(jìn)行了描述。本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的抗體(例如LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40)的氨基酸序列的多肽。在一些實(shí)施方案中，多肽含有抗EphA2抗體的輕鏈和/或重鏈的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)。在一些實(shí)施方案中，多肽含有LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的輕鏈和/或重鏈的一個(gè)或多個(gè)CDR。在一些實(shí)施方案中，多肽含有LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的輕鏈和/或重鏈的三個(gè)CDR。在一些實(shí)施方案中，多肽含有具有任意下列選項(xiàng)的LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的氨基^列LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的序列中的至少5個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少8個(gè)連續(xù)的氨基酸、至少IO個(gè)左右連續(xù)的氨基酸、至少15個(gè)左右連續(xù)的氨基酸、至少20個(gè)左右連續(xù)的氨基酸、至少25個(gè)左右連續(xù)的氨基酸、至少30個(gè)左右連續(xù)的氨基酸，其中至少3個(gè)氨基酸來自LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的可變區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，可變區(qū)來自LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的輕鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可變區(qū)來自LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的重鏈。在另一個(gè)實(shí)施方案中，5個(gè)(或更多)連續(xù)的氨基酸來自LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？贵w可以是多克隆的(例如，非同源的)或單克隆的。制備單克隆抗體的方法是本領(lǐng)j威已知的。可以〗吏用的一種方法是在Kohler和Milstein，Nature256:495-497(1975)中的方法及其修正。通常，用于免疫接種的是小鼠或大鼠，但是也可以使用其他動(dòng)物。免疫原可以是，但不限于，原代細(xì)胞、培養(yǎng)的細(xì)胞系、癌變細(xì)胞、核酸、組織或肽。全長EphA2或EphA2的任意片段(例如，胞外結(jié)構(gòu)域)，或表達(dá)EphA2的癌細(xì)胞用作免疫原。用作免疫原的細(xì)胞，例如，表達(dá)EphA2的癌細(xì)胞在作為免疫原使用以前可以培養(yǎng)一段時(shí)間(至少24小時(shí))。細(xì)胞可以單獨(dú)作為免疫原使用，或者與非變性的佐劑，例如Ribi，組合使用。通常，在作為免疫原使用時(shí)細(xì)胞應(yīng)該保持完整及優(yōu)選是活的。使用完整細(xì)胞作為免疫原生成抗體的方法在WO00/37503中描述。與破裂的細(xì)胞相比，完整的細(xì)胞可以使抗原被更好的檢測。此外，使用完整細(xì)胞作免疫原生成的單克隆抗體最有可能抗細(xì)胞表面的抗原決定簇或抗跨膜受體的胞外結(jié)構(gòu)域。使用變性的或苛性佐劑，例如弗氏佐劑(Freud，s)，會(huì)破壞細(xì)胞，因此不提倡使用。免疫原可以周期性間隔多次施用，例如雙周或單周，或者可以用維持其在動(dòng)物體內(nèi)活力的方式施用(例如以組織重組的方式)。為了監(jiān)控抗體反應(yīng)，可以從動(dòng)物體內(nèi)獲取少量生物學(xué)樣品(例如，血液)，并檢測抗該抗原的抗體滴度?？梢匀〕銎⑴K和/或一些大的淋巴結(jié)并將其分離成單個(gè)細(xì)胞。如果需要，脾臟細(xì)胞可以通過將細(xì)胞懸液加入被抗原包被的平板或孔中進(jìn)行篩選(在去掉非特異的貼壁細(xì)胞后)。表達(dá)抗原特異性的膜結(jié)合免疫球蛋白的B細(xì)胞將與平板結(jié)合，不會(huì)隨其余的懸液被漂洗掉。之后，獲得的B細(xì)胞或所有被分離的脾臟細(xì)胞都可以與骨髓瘤細(xì)胞融合(例如，X63-Ag8.653以及來自SalkInstitute,CellDistributionCenter,SanDiego,CA的細(xì)胞)。聚乙二醇(PEG)可以用于將脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤。然后，雜交瘤在選擇性培養(yǎng)基(例如，次黃噤呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶培養(yǎng)基，即已知的"HAT培養(yǎng)基")中培養(yǎng)。之后將得到的雜交瘤經(jīng)過有限稀釋后鋪平板，并使用FACS、免疫組織化學(xué)(IHC篩選)和Western印跡，測定特異性結(jié)合免疫原(例如，癌細(xì)胞系表面EphA2等)的抗體產(chǎn)生。所選擇的分泌單克隆抗體的雜交瘤再進(jìn)行體外(例如，組織培養(yǎng)瓶或中空纖維反應(yīng)器)或體內(nèi)(例如，小鼠的腹7JC)培養(yǎng)。在生成抗EphA2抗體的條件下培養(yǎng)雜交瘤，并純化抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。可以選擇上述分泌單克隆抗體的雜交瘤，以產(chǎn)生優(yōu)選結(jié)合EphA2上抗EphA2抗體所優(yōu)選結(jié)合的表位的抗體。挑選此類抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，結(jié)合竟?fàn)帨y定可用于確定抗體是否結(jié)合與LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40相同的表位?？贵w與LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40竟?fàn)幗Y(jié)合EphA2表示該抗體優(yōu)選結(jié)合LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40結(jié)合的表位。結(jié)合竟?fàn)帨y定是本領(lǐng)域熟知的?？梢耘渲贸啥喾N不同形式的結(jié)合竟?fàn)帨y定使用被標(biāo)記的抗原或被標(biāo)記的抗體。通常，抗原固定在96孔板上，用放射性或酶標(biāo)記測量未標(biāo)記抗體阻斷標(biāo)記抗體結(jié)合的能力。優(yōu)選結(jié)合測試和鑒定。作為另一個(gè)細(xì)胞融合技術(shù)，EBV無限增殖化B細(xì)胞可用于產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體。擴(kuò)大并亞克隆雜交瘤，根椐需要，可以通過常規(guī)測定方法(例如，F(xiàn)ACS、IHC、放射免疫測定、酶免疫測定、熒光免疫測定等)測定上清液中的抗免疫原活性。在另一種備選方案中，抗體可以重組制備。制備重組抗體的方法是本領(lǐng)域熟知的。單克隆抗體LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40及任意其他等價(jià)抗體可以被測序并在體外重組產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40被測序，然后多核苷酸序列被克隆到載體中用于表達(dá)或增殖。編碼目標(biāo)抗體的序列可以保持在宿主細(xì)胞內(nèi)的載體中，并且之后宿主細(xì)胞可以被擴(kuò)增和冷凍以備將來使用。在另一個(gè)備選方案中，抗體可以通過噬菌體展示技術(shù)重組制備。見例如，美國專利號(hào)5,565,332、5,580,717、5,733,743、6,265,150和Winter等人，Annu.Rev.Immunol.(1994)12:433-455。在另一個(gè)備選方案中，抗EphA2抗體或任意其他目標(biāo)抗體或蛋白質(zhì)可以通過Edman降解法測序，這是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。從質(zhì)鐠或Edman降解法產(chǎn)生的肽信息可以用來設(shè)計(jì)^笨針或引物，用于克隆目標(biāo)蛋白質(zhì)。另一個(gè)克隆目標(biāo)蛋白質(zhì)的備選方法是通過用EphA2"淘選"表達(dá)目標(biāo)抗體或蛋白質(zhì)的細(xì)胞。"淘選"方法的實(shí)施是通過從表達(dá)目標(biāo)抗體或蛋白質(zhì)的組織或細(xì)胞中獲得cDNA文庫，在另一種細(xì)胞類型中過量表達(dá)cDNA，并篩選與EphA2特異性結(jié)合的另一種細(xì)胞類型的被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在"淘選"于本領(lǐng)域。見例如，Aruffo,A.和Seed，B.,Proc.Natl.Acad.Sci.美國，84，8573-8577(1987)以及Stephan,J.等人，Endocrinology140:5841-5854(1999)。根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，cDNA可以通過逆轉(zhuǎn)錄特定細(xì)胞類型的mRNA獲得。具體的，可以按照如上所述的Sambrook等人提出的方法，使用多種水解酶或化學(xué)溶液分離mRNA，或用可商購的核酸結(jié)合樹脂，按照產(chǎn)生商(例如，Qiagen、Invitrogen、Promega)提供的相應(yīng)說明書提取mRNA。然后，合成的cDNA被引入表達(dá)載體以在另一種類型的細(xì)胞中產(chǎn)生目標(biāo)抗體或蛋白質(zhì)。認(rèn)為表達(dá)載體必須能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)以游離體或染色體DNA整合部分復(fù)制。合適的表達(dá)載體包括但不限于質(zhì)粒、病毒載體(包括腺病毒、腺伴隨病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒)和黏粒。含有目標(biāo)多核苷酸的載體可以用任意多種合適的方法引入宿主細(xì)胞，包括電穿孔；4吏用氯化鈣、氯化銣、磷酸鉤、DEAE-葡聚糖或其他物質(zhì)轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；和感染(例如，其中載體是感染性劑例如痘苗病毒)。引入載體或多肽的選擇通常取決于宿主細(xì)胞的特征。任何能夠過量表達(dá)異源DNA的宿主細(xì)胞都可以用于分離編碼目標(biāo)抗體、多肽或蛋白質(zhì)基因的目的。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的非限制性實(shí)例包括但不限于COS、HeLa和CHO細(xì)胞。優(yōu)選，如果宿主細(xì)胞中存在對(duì)應(yīng)的內(nèi)源目標(biāo)抗體或蛋白質(zhì)的表達(dá)，宿主細(xì)胞以高于該表達(dá)5倍左右的水平表達(dá)cDNA，更優(yōu)選高于10倍，甚至更優(yōu)選高于20倍。篩選特異性結(jié)合EphA2的宿主細(xì)胞會(huì)受到免疫測定或FACS的影響。過量表達(dá)目標(biāo)抗體或蛋白質(zhì)的細(xì)胞是可以鑒定的。本發(fā)明包括含有本發(fā)明抗體，例如LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多肽可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備。多肽可以通過抗體的蛋白酶水解或其他降解方法，上述重組方法(即，單一或融合的多肽)或化學(xué)合成來制備?？贵w的多肽，特別是上至約50個(gè)氨基酸的較短多肽，可以用化學(xué)合成方便的制備?；瘜W(xué)合成方法是本領(lǐng)域已知的并可以商購。例如，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的多肽可以通過使用固相方法的自動(dòng)多肽合成儀產(chǎn)生。本發(fā)明還包括本發(fā)明抗體，例如LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的單鏈可變區(qū)片段(，，scFv")。單鏈可變區(qū)片段是用短的連接肽將輕鏈和/或重鏈的可變區(qū)連接制備的。Bird等人(1988)Science242:423-426。例如連接肽可以橋接間隔大約3.5nm的一個(gè)可變區(qū)的氛基端和另一個(gè)可變區(qū)的氨基端。隨后，連接體可以被修飾用于額外的功能，例如連接藥物或連接固體支持體。單鏈變體可以重組或合成產(chǎn)生。為了合成產(chǎn)生scFv，可以使用自動(dòng)合成儀。為了重組產(chǎn)生scFv，可以將含有編碼scFv的多核苷酸的適當(dāng)質(zhì)粒引入合適的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞可以是真核的宿主細(xì)胞，例如酵母、植物、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或者是原核的宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌(E.coli)。編碼目標(biāo)scFv的多核苷酸可以用常規(guī)操作方法制備，例如多核苷酸的連接。得到的scFv可以用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)分離。本發(fā)明包括對(duì)抗體(例如抗EphA2抗體)的修飾，所述抗體包括性質(zhì)沒有受到顯著影響的LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的多肽及其功能性等價(jià)抗體，以及活性增強(qiáng)或減弱的變體。多肽的修飾是本領(lǐng)域的常規(guī)實(shí)踐，不需要在本文中詳細(xì)描述。修飾的多肽實(shí)例包括具有氨基酸殘基保守取代的多肽；非顯著不良改變功能活性的氨基酸的一個(gè)或多個(gè)缺失或添加；或者使用化學(xué)類似物?？梢员涣硪粋€(gè)氨基酸殘基保守取代的氨基酸殘基包括但不限于甘氨^/丙氨酸；纈氨^/異亮氨^/亮氨酸；天冬酰胺/谷氨酰胺；天冬氨^/谷氨酸；絲氨l蘇氨酸；賴氨^/精氨酸；和苯丙氨l酪氨酸。這些多肽也包括糖基化和非糖基化的多肽，以及具有其他翻譯后修飾的多肽，例如，不同糖的糖基化，乙?；土姿峄?。優(yōu)選，氨基酸取代是保守的，即取代的氨基酸具有和原始氨基酸相似的化學(xué)性質(zhì)。此類保守取代是本領(lǐng)域已知的，并且上文已經(jīng)提供了實(shí)例。M酸修飾的范圍可以從一個(gè)或多個(gè)氨基酸的改變或修飾到區(qū)域(例如可變區(qū))的完全重新設(shè)計(jì)。可變區(qū)的變化可以改變結(jié)合的親和力和/或特異性。其他的修飾方法還包括使用本領(lǐng)域已知的偶聯(lián)技術(shù)，包括但不限于，酶促方法、氧化取代和螯合作用?？梢允褂眯轍:牟，例如，用于免疫測定的標(biāo)簽連接，如用于放射性免疫測定的放射性部分的連接。制備被修飾的LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40多肽4吏用本領(lǐng)域已建立的方法，并可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)測定進(jìn)行篩選，其中一些描述在下文和實(shí)施例中。本發(fā)明還包括包含來自本發(fā)明的抗體，例如LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40，的一個(gè)或多個(gè)片段或區(qū)域的融合蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供的融合多肽含有可變輕鏈區(qū)域的至少10個(gè)連續(xù)的氨基酸，以及可變重鏈區(qū)域的至少IO個(gè)氨基酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合多肽含有異源的免疫球蛋白恒定區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，融合多肽含有LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。出于本發(fā)明的目的，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的融合蛋白質(zhì)含有一個(gè)或多個(gè)LUCA19、SPL1、SG5或LIJCA40多肽，以及不連接天然分子的另一段氨基,歹^，例如，異源的序列或來自另一區(qū)域的同源序列。LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的多肽可以用本領(lǐng)域已知的方法制備，例如合成或重組方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的嵌合體，其中重鏈和/或輕鏈?zhǔn)侨诤系鞍踪|(zhì)。在一些實(shí)施方案中，鏈的恒定結(jié)構(gòu)域來自一個(gè)特定的種和/或綱，并且可變結(jié)構(gòu)域來自不同的種和/或綱。例如，嵌合抗體(在一些實(shí)施方案中)中的恒定區(qū)來自人類來源，并且可變區(qū)則與LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40(即，小鼠的)同源或從中衍生。本發(fā)明中還包涵了具有人源化可變區(qū)的抗體，在所述可變區(qū)中(在一些實(shí)施方案中)CDR區(qū)域含有LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的氨基斷歹寸，而構(gòu)架區(qū)卻衍生自人的序列。人源化抗體的其他形式是本領(lǐng)域已知的并描述在本文中。還包涵了嵌合體的功能片段。一個(gè)實(shí)例是人源化的Fab片段，其含有人的鉸鏈區(qū)、人的第一恒定區(qū)、人的Kappa輕鏈或重鏈恒定區(qū)，以及來自LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的輕鏈和/或重鏈的可變區(qū)。人源化的LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的Fab片段可以隨后制成Fab二聚體。通常，制備本發(fā)明中的LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的融合蛋白質(zhì)以及LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的嵌合體是通過使用本文中描述的重組方法，制備表達(dá)編碼它們的多核苷酸來進(jìn)行的，但是它們也可以通過本領(lǐng)域已知的其他方法制備，包括例如化學(xué)合成。見，例如，美國專利號(hào)5,807,715、4,816,567和6,331,415。本發(fā)明還包括人源化抗體?？贵w例如LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40或者其他的等價(jià)抗體的多核苷酸序列可以用于遺傳操作以產(chǎn)生"人源化"抗體，或改善抗體的親和力或其他特征。人源化抗體的一般原則包括維持抗體的抗原結(jié)合部分的基本序列，同時(shí)用人抗體序列替換抗體中非人的剩佘部分。人源化單克隆抗體有四個(gè)基本步驟。它們是(l)確定核苷酸并預(yù)測起始抗體輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(2)設(shè)計(jì)人源化抗體，即，決定在人源化過程中使用哪一段抗體構(gòu)架區(qū)；(3)實(shí)際的人源化方法/技術(shù)和(4)轉(zhuǎn)染和表達(dá)人源化抗體。例如，如果抗體是用于臨床診斷和人體治療，為了避免免疫應(yīng)答，恒定區(qū)就可以被改造得更類似人的恒定區(qū)。見，例如，美國專利號(hào)5,997,867和5,866,692。已經(jīng)描述了多種含有從非人免疫球蛋白衍生的抗原結(jié)合位點(diǎn)的"人源化"抗體分子，包括由嚙齒類的V區(qū)以及其融合人恒定區(qū)的相關(guān)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的嵌合抗體。見，例如，Winter等人，Nature349:293-299(1991);Lobuglio等人Proc.Nat.Acad.Sci.美國86:4220-4224(1989);Shaw等人JImmunol.138:4534-4538(1987)和Brown等人CancerRes.47:3577-3583(1987)。其他文獻(xiàn)描述了在與合適的人抗體恒定區(qū)融合之前，移植到人支持構(gòu)架區(qū)(FR)的嚙齒類CDR。見，例如Riechmann等人Nature332:323-327(1988);Verhoeyen等人，Science239:1534-1536(1988)和Jones等人，Nature321:522-525(1986)。另一份文獻(xiàn)描述了用重組的鑲邊(veneered)嚙齒類構(gòu)架區(qū)支持的嚙齒類CDR。見，例如，歐洲專利公開號(hào)519,596。這些"人源化的"分子被設(shè)計(jì)為使對(duì)嚙齒類抗人抗體分子的有害免疫應(yīng)答最小化，所述免疫應(yīng)答限制了在人受者中那些部分的治療應(yīng)用的持續(xù)時(shí)間和效力。其他可使用的人源化抗體的方法公開在Daugherty等人，Nucl.AcidsRes"19:2471-2476(1991)和美國專利號(hào)6,180,377、6,054,297、5，997，867、5,866,692、6,210,671、6,350,861和PCTWO01/27160中。在另一個(gè)備選方案中，完整的人抗體可以通過可商購的、被改造表達(dá)特異性人免疫5求蛋白的小鼠獲得。設(shè)計(jì)用來產(chǎn)生更理想的(例如完整的人抗體)或更強(qiáng)效的免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也可以用于產(chǎn)生人源化的或人的抗體。此類4支術(shù)的實(shí)例是Abgenix，Inc.(Fremont,CA)的XenomouseTM和Medarex，Inc.(Princeton,NJ)的HuMAb-Mouse⑧和TCMouseTM。本發(fā)明還提供含有接合(例如，連接)了治療劑或化療分子，或者脂質(zhì)體或其他含有化療化合物的小泡的LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40或者LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的等價(jià)抗體或多肽的組合物，所述治療劑例如放射性分子、毒素(例如，加利車霉素)。當(dāng)施用到個(gè)體時(shí)，這些組合物，可以將這些物質(zhì)粑向到表達(dá)被抗體或多肽識(shí)別的EphA2的癌細(xì)胞并且因此可以例如消除癌變細(xì)胞和/或抑制癌變細(xì)胞的增殖和/或生長。為了簡明起見，通常為LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40或者抗體制備對(duì)照，要理解這些方法可應(yīng)用于本文描述的任意結(jié)合EphA2的實(shí)施方案。對(duì)于這些方法，接合作用通常指連接本文描述的這些化合物。連接(通常至少在施用時(shí)是以緊密連接固定這些組分)可以用下文描述的任意方式實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的放射性分子包括任意有效摧毀癌變細(xì)胞的放射性同位素。實(shí)例包括但不限于，鈷-60和X射線。此外，天然存在的放射性元素例如通常表現(xiàn)為放射性同位素混合物的鈾、鐳和釷是放射性分子的合適實(shí)例。本發(fā)明的毒素包括，但不限于，紫杉醇、松胞菌素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根喊、絲裂霉素、表鬼臼毒素吡喃葡糖苷、替尼泊苦、長春花新堿、長春花堿、秋水仙堿、阿霉素、柔紅霉素、二羥基炭疽菌素二酮(dihydroxyaiithracindione)、二幾蔥、西同、光一申審素、》丈線菌素D、1-去氫睪丸酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、心得安和嘌呤霉素及它們的類似物或同系物。本發(fā)明的抗體可以被內(nèi)化到它們結(jié)合的癌變細(xì)胞內(nèi)，并且因此對(duì)治療應(yīng)用特別有用，例如，把由于其不利活性而需要內(nèi)化的毒素遞送至細(xì)胞內(nèi)。此類毒素的實(shí)例包括但不限于，肥皂草毒蛋白、加利車霉素、阿娃斯汀(auristatin)，和美登素類(maytansinoid)。本發(fā)明的抗體或多肽可以直接或間接的、共價(jià)的或非共價(jià)的接合(連接)放射性分子、毒素，或其他治療劑，或其他含有治療劑的脂質(zhì)體或小泡。放射性分子、毒素或治療分子可以連接到抗體的任意位置，只要抗體能夠與其乾標(biāo)EphA2結(jié)合。毒素或治療劑可以直接的或間接的(例如，通過連接基團(tuán)，或備選的，通過具有合適連接位點(diǎn)的連接分子，例如在美國專利5,552,391中描述的平臺(tái)分子)偶聯(lián)(例如，共價(jià)結(jié)合)到合適的單克隆抗體上。本發(fā)明的毒素和治療劑可以用本領(lǐng)域已知的方法直接偶聯(lián)到特定的靶蛋白上。例如，當(dāng)物質(zhì)和抗體都具有能夠與對(duì)方反應(yīng)的取代基時(shí)，物質(zhì)和抗體之間就可以直接反應(yīng)。例如，一個(gè)上有親核基團(tuán)，如氨基和巰基，能夠與另一個(gè)上含有羰基的基團(tuán)，如酐或?；辗磻?yīng)，或與含有良好離去基團(tuán)(例如，卣化物)的烷基反應(yīng)?？贵w或多肽也可以通過微載體連接治療劑。微載體指生物可降解或不可降解的、不溶于水的顆粒，其尺寸小于約150、120或100jim，更常見的小于約50-60nm，優(yōu)選小于約10、5、2.5、2或1.5pm。微載體包含"納米栽體"，其是尺寸小于約1nm的微載體，優(yōu)選小于約500nm。此類顆粒是本領(lǐng)域已知的。固相的微載體可以是用生物相容性的、天然存在的聚合物，合成聚合物或合成共聚物構(gòu)成的顆粒，其包括或排除了由瓊脂糖或交聯(lián)的瓊脂糖，以及其他本領(lǐng)域已知的生物可降解的材料構(gòu)成的微載體。生物可降解的固相^f效載體可以由聚合物構(gòu)成，該聚合物是在哺乳動(dòng)物的生理?xiàng)l件下可降解的(例如，聚(乳酸)、聚(乙醇酸)及其共聚物)或易腐蝕的(例如，聚(原酸酯如3,9-二亞乙基-2,4，8，10-四氧雜螺[5，5]十一烷(DETOSU))或聚(酐)，例如聚癸二酸(酐))。微載體也可以是液相的(例如，基于油或脂類的)，如脂質(zhì)體、不帶抗原的iscoms(免疫刺激復(fù)合體，是膽固醇、磷脂和佐劑活化的皂苷的穩(wěn)定復(fù)合體)，或者存在于水包油或油包水乳劑中的液滴或微團(tuán)，如果液相微載體是生物可降解的。生物可降解的液相微載體通常包括了生物可降解的油類，其中多種都是本領(lǐng)域已知的，包括角鯊烯和植物油。微載體的形狀通常是球形的，但是偏離球形的微載體也是可以接受的(例如，橢球形、桿狀，等)。由于它們(對(duì)于7jC)不溶性，微載體可以從水和基于水(含7K)的溶液中過濾出。本發(fā)明的抗體或多肽的接合物可以包含雙功能的連接體，其既含有能夠偶聯(lián)有毒物質(zhì)或治療劑的基團(tuán)，又含有能夠偶聯(lián)抗體的基團(tuán)。連接體可以行使間隔區(qū)的功能，以拉開抗體和物質(zhì)的距離從而避免干擾結(jié)合能力。連接體可以是可分割的或不可分割的。連接體也可以用來增加物質(zhì)或抗體上的取代基的化學(xué)反應(yīng)活性，從而增加偶聯(lián)效率?；瘜W(xué)反應(yīng)活性的增加也可以有利于物質(zhì)或物質(zhì)上的官能團(tuán)的使用，否則是不可能的。雙功能的連接體可以通過本領(lǐng)域已知的方法偶聯(lián)到抗體上。例如，含有活性酯部分的連接體，如N-羥基琥珀酰亞胺酯，可以通過酰胺鍵偶聯(lián)到抗體的賴氨酸殘基上。在另一個(gè)實(shí)施例中，含有親核的胺或肼殘基的連接體可以偶聯(lián)到由抗體糖類殘基的糖酵解氧化所產(chǎn)生的醛基上。除了這些直接的偶聯(lián)方法，連接體可以通過中間載體例如氨基葡聚糖間接的偶聯(lián)到抗體上。這些實(shí)施方案中是通過賴氨酸、糖類或中間載體修飾鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，連接體位點(diǎn)選擇性偶聯(lián)蛋白質(zhì)中的游離硫醇?xì)埢?。適合與蛋白質(zhì)中的硫醇基選擇性偶聯(lián)的部分是本領(lǐng)域已知的。實(shí)例包含二巰化合物、a-卣化羰基和a-閨化M化合物，和順丁烯二酰亞胺。當(dāng)親核胺的官能團(tuán)與a-鹵化皿和a-卣化羧基出現(xiàn)在同一個(gè)分子內(nèi)時(shí)，存在通過胺的分子內(nèi)烷基化而發(fā)生環(huán)化的可能。預(yù)防這一問題的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的，例如通過制備用剛性基團(tuán)(如芳香基或反式鏈烯基)分隔胺和a-鹵化物官能團(tuán)的分子，使不希望環(huán)化作用在立體化學(xué)上難以生長。見，例如，美國專利號(hào)6,441,163，通過二巰化物部分制備美登素類和抗體的接合物。可以用于制備抗體-藥物接合物的可分割的連接體之一是基于順式烏頭酸的酸不穩(wěn)定的連接體，其可以利用不同細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的酸性環(huán)境，所述區(qū)室例如在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用中遇到的內(nèi)體和溶酶體。見，例如，Shen等人，Biochein.Biophys.Res.Commun.102:1048-1054(1981)中制備柔紅霉素和大分子載體的接合物；Yang等人，J.Natl.Canc.Inst.80:1154-1159(1988)中制備柔紅霉素和抗黑素瘤抗體的接合物；Dillman等人，CancerRes.48:6097-6102(1988)中用酸不穩(wěn)定的連接體以類似的方式制備柔紅霉素和抗T細(xì)胞抗體的接合物；Trouet等人，Proc.Nati.Acad.Sci.79:626-629(1982)中通過肽間隔臂連接柔紅霉素和抗體。本發(fā)明的抗體(或多肽)可以用本領(lǐng)域已知的任意方法接合(連接)放射性分子。對(duì)i文射性標(biāo)記抗體方法的"i寸論見"CancerTherapywithMonoclonalAntibodiesT，，D.M.Goldenberg編著(CRCPress,BocaRaton,1995)。本發(fā)明的抗體(或多肽)可以連接標(biāo)簽物質(zhì)(或者稱為"標(biāo)簽")，例如熒光分子、》文射性分子或任意其他本領(lǐng)域已知的標(biāo)簽。本領(lǐng)域已知的標(biāo)簽通常(直接或間接的)提供信號(hào)。本發(fā)明的抗體、多肽和蛋白質(zhì)的能力，例如抑制表達(dá)EphA2的癌變細(xì)胞生長的能力、延遲患有表達(dá)EphA2癌癥的個(gè)體的轉(zhuǎn)移發(fā)展的能力、遞送治療劑例如毒素或放射性化合物到表達(dá)EphA2的癌變細(xì)胞的能力(包括將治療劑遞送至表達(dá)EphA2的癌變細(xì)胞內(nèi)部的能力)，可以用本領(lǐng)域已知的方法來檢測，其中一些描述在實(shí)施例中。本發(fā)明還提供了含有抗EphA2抗體或LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的等價(jià)抗體(如本公開中更清楚的，其包括本文描述的全部抗體)或多肽和治療劑的組合物(包括藥物組合物)。篩選單克隆抗體的方法一些方法可用于另外篩選與癌變細(xì)胞上的EphA2結(jié)合的單克隆抗體。可用的方法之一是免疫組織化學(xué)(IHC)。標(biāo)準(zhǔn)的免疫組織化學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域4支術(shù)人員已知的4支術(shù)。見例如，AnimalCellCultureMethods(J.P.Mather和D.Barnes編著，AcademicPress,第57巻，第18和19章，第314-350頁，1998)。生物學(xué)樣品(例如，組織)可以取自活體解剖、尸體解剖或尸檢。為了確定EphA2是否只出現(xiàn)在癌變細(xì)胞上，可以使用LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40檢測患有癌癥的個(gè)體組織中EphA2的存在，同時(shí)使用取自患有癌癥的個(gè)體中其他非癌變組織以及取自沒有癌癥的個(gè)體中的組織作為對(duì)照。組織可以包埋在固體或半固體的物質(zhì)(例如，瓊脂糖凝膠或OCT)中，防止其在冷凍及其后的染色切片過程中受到損壞。可以使用取自不同器官和不同階段的癌癥篩選單克隆抗體。可以用于篩選目的的組織實(shí)例包括但不限于卵巢、乳房、肺前列腺、結(jié)腸、腎臟、皮膚、甲狀腺、腦、心、肝、胃、神經(jīng)、血管、骨、上消化道以及胰腺?？梢杂糜诤Y選目的的不同癌癥類型的實(shí)例包括但不限于癌、腺癌、肉瘤、腺肉瘤、淋巴瘤和白血病。在另一種備選方案中，癌變細(xì)胞系例如SK-Ov-3(ATCC#HTB77)、LnCap(ATCC#CRL1740)、COLO205(ATCC#CCL222)、A549(ATCC#CCL185)、PANC-1(ATCC#CRL1469)、SK-BR-3(ATCC#HTB30)、SK畫MES國l(ATCC#HTB58)、HT29(HTB-38)、SW480(ATCC#CCL228)、AsPC-1(ATCC#CRL1682)、Capan-1(ATCC#HTB79)、CFPAC-1(ATCC#CRL1918)、HPAF隱II(ATCC#CRL-1997)、HS-700T(ATCC#HTB-147)、Du-145(ATCC#HTB81)、CaLu-1(ATCC#HTB-54)、786-0(ATCC#CRL-1932)。CaKi-2(ATCC#HTB-47)、A498(ATCC#HTB44)、BT474(ATCC弁HTB-20)和PC畫3(ATCC#CRL1435)和分別來自它們相應(yīng)組織的正常細(xì)胞可用于篩選癌變組織特異性的單克隆抗體。來自不同器官的正常組織(包括但不限于卵巢、乳房、肺、前列腺、結(jié)腸、腎臟、皮膚、曱狀腺、主動(dòng)脈平滑肌以及內(nèi)皮細(xì)胞)的原代細(xì)胞，較早的傳代細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物可以作為陰性對(duì)照。癌變的或非癌變的細(xì)胞可以生長在載玻片或蓋玻片上或在塑料表面，或制備在CellArray(見WO01/43869中的描述)上，并用上文描述過的IHC篩選組織中抗體的結(jié)合。備選的，細(xì)胞可以用非蛋白水解的方式從生長表面上移除并且離心成沉淀再進(jìn)行包埋，并且作為組織按上文描述的進(jìn)行IHC分析。在另一種備選中，用與第一抗體、連接了熒光分子的第二"報(bào)告"抗體與單細(xì)胞一起孵育，并且之后使用熒光活化細(xì)胞分選(FACS)儀器分析來篩選所述單個(gè)細(xì)胞。一些不同的檢測系統(tǒng)可以用來檢測抗體與組織切片的結(jié)合。通常，免疫組織化學(xué)包括第一抗體與組織的結(jié)合，以及之后針對(duì)第一抗體來源物種的第二抗體產(chǎn)生并且與可檢測的標(biāo)記(例如，辣根過氧化物酶(HRP)或二氨基聯(lián)苯胺(DAB))綴合?？梢葬娪玫囊环N備選方法是多克隆鏡像互補(bǔ)抗體或聚MICA。在D.C.Mangham和P.G.Isaacson(Histopathology(1999)35(2):129-33)中所描述的聚MICA(多克隆鏡像互補(bǔ)抗體)技術(shù)，可以用來檢測第一抗體(例如，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40)與正常的和癌變組織的結(jié)合。從TheBindingSiteLimited(P.O.Box4073BirminghamB296ATEngland)可商購一些類型的聚MICATM檢測試劑盒。商品編號(hào)HK004.D是使用DAB發(fā)色團(tuán)的聚MICATM檢測試劑盒。商品編號(hào)HK004，A是使用AEC發(fā)色團(tuán)的聚MICATM檢測試劑盒。備選的，第一抗體可以用可檢測的標(biāo)記直接進(jìn)行標(biāo)記。IHC篩選以選擇合適的抗體的第一步是在小鼠中產(chǎn)生的第一抗體(例如，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40)與一個(gè)或多個(gè)免疫原(例如，細(xì)胞或組織樣品)結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，組織樣品是來自不同器官的水凍組織切片。細(xì)胞或組織樣品可以是癌變或非癌變的。制備、切片冰凍組織(固定或不固定)以及IHC可以使用本領(lǐng)域熟知的多種方法中的任意一種進(jìn)行。見，例如，Stephan等人Dev.Biol.212:264-277(1999)和Stephan等人，Endocrinology140:5841-54(1999)。選擇這樣的單克隆抗體，其與人類細(xì)胞交叉反應(yīng)并且結(jié)合癌變的細(xì)胞或組織，但是不以相同的程度結(jié)合正常細(xì)胞或組織。與一種或多種癌癥類型中表達(dá)的抗原相結(jié)合，但是不結(jié)合正常細(xì)胞的單克隆抗體也被挑選出來。LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40就是結(jié)合出現(xiàn)在多種不同癌癥中的抗原EphA2，但與正常組織結(jié)合有限的抗體實(shí)例。表位作圖可用于另外表征抗體特征?？缮藤彽姆?wù)器(例如，PepscanSystems,P.O.Box2098,8203ABLelystad,TheNetherlands)可以用來確定抗原EphA2上抗體，例如LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40結(jié)合的表位。使用LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40,結(jié)合EphA2的等價(jià)抗體或多肽診斷癌癥的方法出于診斷的目的，根據(jù)本文公開的方法制備的單克隆抗EphA2抗體和從LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40衍生的與EphA2結(jié)合的等價(jià)抗體或多肽，可以用來鑒別或檢測多種組織中癌變細(xì)胞的存在與否，所述組織包括但不限于，卵巢、乳房、肺、前列腺、結(jié)腸、腎臟、皮膚、甲狀腺、腦、心、肝、胃、神經(jīng)、血管、骨、上消化道和胰腺。為了簡明起見，在理解了這些方法應(yīng)用于本文描述的任意結(jié)合EphA2的實(shí)例下，通常對(duì)LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40或者抗體制備對(duì)照。檢測通常包括用本文描述的結(jié)合EphA2的抗體或多肽接觸細(xì)胞，以及在EphA2和特異性結(jié)合EphA2的抗體(例如LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的人源化抗體，人類抗體或任意其他結(jié)合EphA2的部分)之間形成復(fù)合物。此類復(fù)合物的形成可以在體外或體內(nèi)。不局限于理論，單克隆抗EphA2抗體可以通過EphA2的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合EphA2。如本文用到的，檢測可以包含定性的和/或定量的檢測，并且可以包括將測量的水平與正常細(xì)胞比較，確定癌變細(xì)胞中EphA2表達(dá)水平的升高。使用抗體進(jìn)行診斷的一種方法是在體內(nèi)進(jìn)行肺瘤成像，通過將抗體連接標(biāo)記部分(例如，熒光劑、放射性的或不透射線的物質(zhì))，向患者施用該抗體并使用X射線或其他成像儀器顯現(xiàn)標(biāo)記的抗體在表達(dá)抗原的癌細(xì)胞表面的定位。標(biāo)記部分是本領(lǐng)域已知的。在另一種方法中，通過本領(lǐng)域熟知的方法取出癌變細(xì)胞并制備用于免疫組織化學(xué)的組織(例如，包埋在水凍的化合物中、冰凍并切片(固定或不固定)；固定并石蠟包埋，使用或不使用抗原修復(fù)和對(duì)比染色的多種方法)。單克隆抗體也可以用來鑒定處于不同發(fā)展階段的贅生物?？贵w也可以用來確定哪個(gè)患者腫瘤在其表面以預(yù)先確定的水平表達(dá)抗原，從而確定可以用直接抗所述抗原的抗體進(jìn)行免疫治療的候選者。識(shí)別抗原的抗體(或多肽)也可以建立診斷免疫測定，其用于檢測從活或死的癌細(xì)胞中釋放或分泌到體液中的抗原，所述體液包括但不限于，血液、唾液、尿、肺部積液或腹水。根據(jù)實(shí)施例中深入詳細(xì)的討論，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40可以結(jié)合組織中處于不同階段的多種癌癥，所述癌癥包括但不限于黑素瘤、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌。使用LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40用于診斷目的的方法在任意形式的抗癌治療(例如化療或放射性療法)前后，都可以用來確定哪種腫瘤對(duì)給定治療、患者預(yù)后、轉(zhuǎn)移性疾病的腫瘤亞型或起源以及疾病的發(fā)展或?qū)χ委煹姆磻?yīng)最有反應(yīng)。為了治療目的使用LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40，或者等價(jià)抗體或多肽的方法使用本文公開的方法制備的單克隆抗EphA2抗體及等價(jià)抗體(以及本發(fā)明其他多肽實(shí)例)可以用于患有癌癥個(gè)體的治療目的，所述癌癥包括但不限于黑素瘤、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或前列腺癌。這些治療方法也用于上述相關(guān)的實(shí)施方案。為了簡明起見，在理解了這些方法應(yīng)用于本文描述的任意結(jié)合EphA2的實(shí)例下，通常對(duì)LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40或者抗體制備對(duì)照，包括但不限于本文描述的包括相關(guān)實(shí)例的人源化抗體和人抗體。使用LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的療法可以包括上述在體外和/或體內(nèi)EphA2和此類抗體間復(fù)合物的形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗EphA2抗體可以結(jié)合癌變細(xì)胞并降低其生長和/或增殖。在一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗EphA2抗體可以結(jié)合癌變細(xì)胞并誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡性細(xì)胞死亡。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗EphA2抗體可以結(jié)合癌變細(xì)胞并延遲轉(zhuǎn)移發(fā)展。在另一個(gè)實(shí)施方案中，單克隆抗EphA2抗體可以結(jié)合癌變細(xì)胞并向癌變細(xì)胞遞送連接在LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40上的治療劑(例如毒素或放射性化合物)。對(duì)于一些實(shí)施方案，治療劑(例如毒素)被引入了細(xì)胞內(nèi)部(即，被內(nèi)化)。特別適合這些方法的物質(zhì)包括在細(xì)胞內(nèi)部具有活性的物質(zhì)。這些物質(zhì)的實(shí)例包括但不限于肥皂草毒蛋白、加利車霉素、阿娃斯汀和美登素類。通常，在這些實(shí)施方案中對(duì)個(gè)體施用有效量(將治療劑有效遞送至靶標(biāo)癌變細(xì)胞和/或其內(nèi)部的量)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，患有癌癥個(gè)體用LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40進(jìn)行姑息治療。癌癥患者的姑息治療包括治療或減輕疾病的不良癥狀，或者治療或減輕對(duì)疾病的其他治療產(chǎn)生的醫(yī)源性癥狀，但是不直接影響癌癥進(jìn)程。這包括減輕疼痛、營養(yǎng)支持、性問題、精神性痛苦、抑郁、疲勞、精神性疾病、惡心、嘔吐等的治療。本發(fā)明還提供了使用LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40抗體，或者優(yōu)選結(jié)合與任意LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40所優(yōu)選結(jié)合表位相同的表位的抗體來抑制癌細(xì)胞生長和/或增殖的方法。在另一個(gè)實(shí)施方案中，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40或者本文描述的任意EphA2實(shí)例可以結(jié)合表達(dá)EphA2的癌變細(xì)胞，并誘導(dǎo)抗表達(dá)EphA2的癌變細(xì)胞的主動(dòng)免疫應(yīng)答。在一些情形中，主動(dòng)免疫應(yīng)答可以引起癌變細(xì)胞的死亡(例如，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40結(jié)合癌細(xì)胞，_秀導(dǎo)凋亡性或腫脹性細(xì)胞死亡)，或抑制其生長(例如，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程)。在另一些情形中，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40或本文描述的任意EphA2抗體可以與癌變細(xì)胞結(jié)合，并且抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)可以消滅LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40所結(jié)合的癌變細(xì)胞。因此，本發(fā)明提供了包括施用本文描述的任意組合物的刺激免疫應(yīng)答的方法?？笶phA2抗體可以與能增強(qiáng)或指導(dǎo)個(gè)體自身免疫應(yīng)答的物質(zhì)(例如能強(qiáng)化ADCC的物質(zhì))一起施用。在一個(gè)實(shí)施方案中，從抗EphA2抗體寡糖上移除了出現(xiàn)在該抗體中的至少一個(gè)巖藻糖殘基，該修飾可以增強(qiáng)ADCC。在類似的實(shí)施方案中，出現(xiàn)在抗EphA2抗體中的巖藻糖殘基^皮修飾以將其組成改變到比原始的、未修飾的抗體增強(qiáng)了ADCC的程度。在一些情形中，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的結(jié)合也可以激活細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，并可以募集更多的天然殺傷細(xì)胞或增加細(xì)胞因子(例如，IL-2、IFN-g、IL-12、TNF-a、TNF-b等)產(chǎn)生，從而進(jìn)一步激活個(gè)體的免疫系統(tǒng)，以摧毀癌變細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40可以結(jié)合癌變細(xì)胞，并且巨噬細(xì)胞或其他的吞噬細(xì)胞可以調(diào)理癌變細(xì)月包。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生^L動(dòng)免疫的方法，其包括施用任意本文描述的組合物。JitspCt丄曰Altir^.，.iA二乂—AOI,—，J"n，i,A丄，r^乂,g、g個(gè)久b/j代w、口j承aiLpiiAzfr、j湖/j。，，jLpnAztrj煩湖肥,通逸任意本文描述的組合物(包含接合物)的方法。這些方法需要向個(gè)體施用本文中描述的組合物(包含接合物)。例如，在一些實(shí)施方案中，方法被用于向靶細(xì)胞中引入綴合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40可以綴合到治療劑(例如訪文射性分子、毒素，如肥急草毒蛋白、加利車霉素、阿娃斯汀或美登素類，或其他化療分子)或脂質(zhì)體或其他含有化療化合物的小泡，并施用到個(gè)體以將這些化合物定向到含有抗體所識(shí)別的抗原的癌細(xì)胞，從而消滅癌變細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，為了延遲轉(zhuǎn)移發(fā)展，抗體可以在手術(shù)移除表達(dá)抗原的癌時(shí)作為輔助療法使用?？贵w也可以在患有表達(dá)抗原的腫瘤的患者術(shù)前進(jìn)行施用(新輔助療法)，從而縮小腫瘤尺寸并因此^f吏得手術(shù)能夠進(jìn)行或簡化手術(shù)，在手術(shù)中節(jié)省組織，和/或減少導(dǎo)致的損形。LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40和等價(jià)的抗體或片段(例如，F(xiàn)ab、Fab，、F(ab，)2、Fv、Fc等)的多種制劑都可用于施用，所述抗體或片段例如嵌合抗體、單鏈(ScFv)、其突變體、含有抗體部分的融合蛋白質(zhì)、人源化抗體，以及LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的任意被修飾過的但仍含有必需特異性的抗原EphA2識(shí)別位點(diǎn)的構(gòu)型。在一些實(shí)施方案中，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40抗體或LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的多種制劑可以^L單獨(dú)使用。在另一些實(shí)施方案中，施用了LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40或LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40的多種制劑(包括本文描述的任意組合物實(shí)施方案)和可藥用的賦形劑，并可以以多種制劑形式施用。可藥用賦形劑是本領(lǐng)域已知的，是有利于藥物有效物質(zhì)施用的相對(duì)惰性的物質(zhì)。例如，賦形劑可以賦予形態(tài)或稠度，或作為稀釋劑。合適的賦形劑包括但不限于穩(wěn)定劑、潤濕劑和乳化劑、改變滲透性的鹽、包嚢劑、緩沖液和皮膚滲透增強(qiáng)劑。Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy第20版，MackPublishing(2000)中闡述了在腸胃外的和非腸胃外藥物遞送中使用的賦形劑和制劑。通常，這些物質(zhì)都^皮配制用于注射給藥(例如，腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)等)，盡管也可以使用其他形式的給藥(例如，口服、黏膜等)。因此，LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40抗體及其等價(jià)物優(yōu)選結(jié)合可藥用的載體，例如鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液等等。特定的劑量方案(即劑量、時(shí)間選擇和重復(fù))將取決于特定個(gè)體及該個(gè)體的給藥史。通常，可以使用任意下列選項(xiàng)的劑量施用至少約50mg/kg體重的劑量；至少約10mg/kg體重的劑量；至少約3mg/kg體重的劑量；至少約lmg/kg體重的劑量；至少約750ng/kg體重的劑量；至少約500jig/kg體重的劑量；至少約250fig/kg體重的劑量；至少約100^ig/kg體重的劑量；至少約50fig/kg體重的劑量；至少約10jig/kg體重的劑量；至少約lng/kg體重的劑量；或更多。出于經(jīng)驗(yàn)考慮，例如半衰期，通常將幫助確定劑量。與人免疫系統(tǒng)相容的抗體，例如人源化抗體或完整人抗體，可以用來延長抗體的半衰期，并且防止抗體被宿主的免疫系統(tǒng)攻擊。一些個(gè)體需要一種以上的劑量。給藥的頻率可以在整個(gè)治療過程中確定和調(diào)整，這基于降低癌變細(xì)胞數(shù)目、維持癌變細(xì)胞減少、降低癌變細(xì)胞的生長和/或增殖，或延遲轉(zhuǎn)移發(fā)展。癌變細(xì)胞的存在可以用任意本領(lǐng)域技術(shù)員已知的或本文中討論的方法(例如，通過免疫組織化學(xué)或流式細(xì)胞術(shù)或活組織檢查或生物學(xué)樣品檢測)鑒定。在一些情形中，維持持續(xù)釋放LUCA19、SPLI、SG5或LUCA40抗體的制劑是適當(dāng)?shù)?。用于產(chǎn)生持續(xù)釋放的多種制劑和4義器是本領(lǐng)域已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，在進(jìn)行過一次或多次給藥的個(gè)體中可以經(jīng)驗(yàn)性的確定LUCA19、SPLI、SG5或LUCA40抗體的劑量。個(gè)體被給與增加劑量的LUCA19、SPLI、SG5或LUCA40。為了評(píng)估LUCA19、SPLI、SG5或LUCA40或者其他等價(jià)抗體的效率，可以監(jiān)控特定癌癥疾病狀態(tài)的標(biāo)記。這些標(biāo)記包括通過觸診或視覺觀察直接測量腫瘤尺寸；通過X射線或其他成像技術(shù)間接測量胂瘤尺寸；通過直接腫瘤活組織檢查和腫瘤樣品顯微鏡檢評(píng)估的改善；測量間接的腫瘤標(biāo)記(例如，前列腺癌的PSA)，疼痛或麻痹的減少；語言、視力、呼吸或其他與腫瘤有關(guān)的殘疾的改善；食欲增加；或用可接受的測試來檢測生活質(zhì)量的改善或生存期延長。本領(lǐng)域技術(shù)人員很清楚劑量將根據(jù)個(gè)體、癌癥類型、癌癥階段、癌癥是否已經(jīng)開始向個(gè)體的其他部位轉(zhuǎn)移以及過去和同期的治療進(jìn)行變動(dòng)。其他制劑方案包含本領(lǐng)域已知的合適的遞送方式，包括但不限于，載體例如脂質(zhì)體。見例如，Mahato等人(1997)Pharm.Res.14:853-859。月旨質(zhì)體制品包含但不限于，cytofectin、多層小泡和單層小泡。[00151在一些實(shí)施方案中，出現(xiàn)了一種以上的抗體?？贵w可以是單克隆的或多克隆的。這樣的組合物可以包含至少一個(gè)、至少兩個(gè)、至少三個(gè)、至少四個(gè)、至少五個(gè)與癌、腺癌、肉瘤或lr泉肉瘤反應(yīng)的不同的抗體。LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40抗體可以混合一個(gè)或多個(gè)與器官中的癌、腺癌、肉瘤或腺肉瘤反應(yīng)的抗體，所述器官包括但不限于卵巢、乳房、肺、前列腺、結(jié)腸、腎臟、皮膚、甲狀腺、骨、上消化道和胰腺?？贵w的混合物，如它們?cè)诒绢I(lǐng)域中通常所示的，對(duì)治療大范圍的群體特別有效。使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行疾病評(píng)估，例如成像方法和監(jiān)控合適的標(biāo)記。含有本發(fā)明的結(jié)合EphA2的抗體和多肽的試劑盒本發(fā)明還提供含有本文描述的合EphA2的抗體或結(jié)任意組合物的試劑盒，用于診斷和/或治療。因此，試劑盒含有能夠優(yōu)選結(jié)合EphA2和/或與EphA2形成復(fù)合物的抗體(可用于例如檢測乳房、結(jié)腸、肺或前列腺的癌變細(xì)胞)。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含抗EphA2抗體或優(yōu)選結(jié)合與LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40所優(yōu)選結(jié)合表位相同的表位的抗體。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含連接了治療劑或標(biāo)記物質(zhì)的抗EphA2抗體，或優(yōu)選結(jié)合與LUCA19、SPL1、SG5或LUCA40所優(yōu)選結(jié)合表位相同的表位的抗體。這些試劑盒可以另外包括說明書和/或試劑，用于將抗體或本文描述的任意抗體或多肽實(shí)例與一種或多種治療劑或標(biāo)記劑連接。在一些方面，抗體(例如，單克隆、多克隆、人的、人源化的等)與EphA2的結(jié)合被用于診斷個(gè)體癌癥，例如檢測癌變細(xì)胞存在與否的試劑盒，和檢測乳房、結(jié)腸、肺或前列腺的癌變細(xì)胞存在與否的試劑盒。在另一些方面，例如，試劑盒可以用來治療患有癌癥或擁有癌癥家族病史的個(gè)體。用于治療癌癥個(gè)體的試劑盒包括^旦不限于抑制癌細(xì)胞生長和/或增殖、用于遞送治療劑到癌變細(xì)胞、用于遞送治療劑到癌變細(xì)胞內(nèi)部的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒是包裝合適的，可以任選的提供附加組分，例如用緩沖液和于確定與EphA2結(jié)合的說明書，例如俘獲試劑、顯色試劑、標(biāo)簽、反應(yīng)表面、檢測方法、對(duì)照樣品和解釋信息。說明書可以用于任意對(duì)抗原結(jié)合的測量方法，包括但不限于，本文描述的那些測定。在另一些實(shí)施方案中，說明書可以用于任意本文描述的方法，包含抑制癌變細(xì)胞，例如乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌或前列腺癌的生長和/或增殖的說明書，用于向癌變細(xì)胞遞送治療劑的說明書、用于向癌變細(xì)胞內(nèi)部施用治療劑的說明書。在一些實(shí)施方案中，使用上述物質(zhì)來進(jìn)行多種測量，例如可以允許在同一個(gè)體隨著時(shí)間或多個(gè)個(gè)體中測量。可以使用任意檢測抗體結(jié)合的合適方法(試劑盒提供的)，例如帶標(biāo)簽的抗人類抗體，其中標(biāo)簽可以是酶、焚光基團(tuán)、化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素或輔酶。通常，使用酶作為標(biāo)簽。下列實(shí)施例僅出于解釋性目的提供，而不限制本發(fā)明。實(shí)施例實(shí)施例l制備癌細(xì)胞系作為免疫原。使用從組織或細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的完整細(xì)胞作為免疫原，產(chǎn)生典型細(xì)胞類型表面抗原特異性的單克隆抗體。美國專利#6，541,225描述了適合本發(fā)明實(shí)踐的此類方法。通常，為了產(chǎn)生抗特定細(xì)胞類型細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體，希望用活的和完整的該類型細(xì)胞免疫未轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞，優(yōu)選使用那些表面沒有血清的細(xì)胞。適合用于產(chǎn)生抗EphA2抗原的單克隆抗體(例如但不限于LUCA19、LUCA40或SPL1)的細(xì)胞系，包括BT-474(ATCC#HTB-20)、MDA-MB-175VII(ATCC#HB-25)、MDA國MB國361(ATCC#HB-27)、SKBR3(ATCC#HTB-30)、SKMES誦l(ATCC#HTB畫58)、ES誦2(ATCC#CRL-1978)、SKOV3(ATCC#HTB-77)、HPAFII(ATCC#CRL-1997)、Hs700T(ATCC#HTB-147)、Colo205(ATCC#CCL-222)、HT-29(ATCC#HTB-38)、SW480(ATCC#CCL-228)、SW948(ATCC#CCL隱237)、A498(ATCC#HTB-44)和Caki-2(ATCC#HTB-47)。細(xì)胞生長在補(bǔ)充了生長因子的合適的無血清營養(yǎng)培養(yǎng)基中。使用在補(bǔ)充血清的培養(yǎng)基中增殖的細(xì)胞進(jìn)行免疫具有嚴(yán)重的缺陷。血清含有不明確活性的大小生物分子的復(fù)雜混合物。這些生物分子可以附著在細(xì)胞表面，因此導(dǎo)致產(chǎn)生與不代表特定細(xì)胞類型的分子的抗體交叉反應(yīng)。此外，血清生物分子與細(xì)胞表面的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致遮蔽所需的細(xì)胞表面抗原靶標(biāo)。多種無血清培養(yǎng)基制品是商業(yè)已知并可以公開購買的，例如，具有下列補(bǔ)充物的F12/DME(1:1)營養(yǎng)培養(yǎng)基胰島素(IOfig/ml終濃度)、表皮生長因子(EGF)(5ng/ml終濃度)、亞硒酸(2.5xl(T8M終濃度)、和豬垂體提取物(PPE)(5nl/ml終濃度)。為了收獲細(xì)胞，用不含鉤和鎂的Hanks鹽溶液漂洗單細(xì)胞層一次，在含10mMEDTA的Hanks鹽溶液中37。C孵育15分鐘。輕柔吹打使細(xì)胞從培養(yǎng)表面脫落。lOOOxg離心細(xì)胞懸液5分鐘以沉淀。棄去上清液并根據(jù)需要用含有非變性佐劑的無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。實(shí)施例2產(chǎn)生單克隆抗體非變性佐劑(Ribi,R730,Corixa，HamiltonMT)在磷酸緩沖的鹽溶液中再水化到2ml。然后將100nl此再7JO化的佐劑與一些實(shí)施例1中的細(xì)胞沉淀輕柔混合，用于免疫。按每只鼠約106個(gè)細(xì)胞從足墊注射Balb/c小鼠，每周注射約一到兩次。精確的免疫時(shí)間表如下第0天，加Ribi免疫。第3天，加Ribi免疫。第7天，加Ribi免疫。第24天，去Ribi免疫。第29天，去Ribi免疫。第32天，去Ribi免疫。第36天，去Ribi免疫。第44天，去Ribi免疫。第51天，去Ribi免疫。第69天，取血作滴度測試。第71天，加Ribi免疫。第74天，加Ribi免疫。第81天，加Ribi免疫。第91天，融合前加強(qiáng)(無Ribi)。第104天，收獲淋巴結(jié)用于融合。在第69天，從每只被免疫動(dòng)物的尾部取一滴血，用FACS分析檢測針對(duì)用于免疫的細(xì)胞系的抗體滴度。當(dāng)?shù)味冗_(dá)到至少1:2000時(shí)，該小鼠用C02麻醉，隨后頸推脫臼處死。收獲用于制備雜交瘤的淋巴結(jié)。來自小鼠的淋巴細(xì)胞與小鼠骨髓瘤系X63-Ag8.653用35%聚乙二醇4000融合。在融合后的第10天，用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)篩選雜交瘤上清液中的免疫細(xì)胞特異性單克隆抗體的存在。取自每抹雜交瘤的條件培養(yǎng)基與人胚腎臟細(xì)胞的整分試樣一起孵育30分鐘。孵育后，洗滌細(xì)胞樣品，重懸于O.lml稀釋劑中并與ljig/ml接合山羊抗小鼠IgG的F(ab，)2片段的FITC在4'C孵育30分鐘。洗滌細(xì)胞，重懸于0.2mlFACS稀釋劑中并用FACScan細(xì)胞分析儀(BectonDickinson;SanJose，CA)分析。通過FACS，基于雜交瘤克隆對(duì)人胚腎臟細(xì)胞表面的結(jié)合，選擇人胚腎臟細(xì)胞用于另外的擴(kuò)增、克隆和表征。選擇產(chǎn)生結(jié)合抗原(名為Ag-SPL1)和在該抗原上的表位(名為Ag-SPLl.l)的單克隆抗體(名為mu-SPLl)的雜交瘤。選擇產(chǎn)生結(jié)合抗原(名為Ag-LUCA19)和在該抗原上的表位(名為Ag-LUCA19.1)的單克隆抗體(mu-LUCA19)的雜交瘤。選擇產(chǎn)生結(jié)合抗原(名為Ag-LUCA40)和在該抗原上的表位(名為Ag-LUCA40.1)的單克隆抗體(mu-LUCA40)的雜交瘤。選擇產(chǎn)生結(jié)合抗原(名為Ag-SG5)和在該抗原上的表位(名為Ag-SG5.1)的單克隆抗體(mu-SG5)的雜交瘤。為了在足以支持單克隆抗體生長和抗體純化的培養(yǎng)基中純化單克隆抗體，培養(yǎng)擴(kuò)大產(chǎn)生單克隆抗體mu-SPL-l、mu-LUCA19、mu-LUCA40和mu-SG5的雜交瘤。實(shí)施例3純化抗EphA2抗體在10mMEDTA的存在下，從組織培養(yǎng)瓶分離人類癌細(xì)胞(例如但不限于SKMES-1、786-O和Colo205細(xì)胞系)，1400轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘并重懸于含有1%BSA和2mMEDTA的PBS(FACS稀釋劑)中。計(jì)數(shù)細(xì)胞并調(diào)整為107細(xì)胞/ml。約0.1ml細(xì)胞與lOOfilFACS稀釋劑在37。C孵育30分鐘。用G蛋白親和層析從組織培養(yǎng)上清液中純化出與人癌細(xì)胞系結(jié)合的單克隆抗體。如果需要，可以在抗體純化前將組織培養(yǎng)上清液通過牛IgG柱，以除去過量的牛IgG。下列物質(zhì)被用于抗體純化過程雜交瘤組織培養(yǎng)上清液、Immun叩ure(G)IgG結(jié)合緩沖液(Pierce#21011Rockford，IL)、ImmunopureIgG洗脫緩沖液(Pierce#21009)、濃縮的HC1(用于調(diào)整pH值)、Corning的1升PES(聚醚砜)、0.22jim濾器(Corning#431098，Corning,NY)、AmershamPharmaciaAKTAExplorerSystem(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ)、Protein-GSepharose4FastFlow(AmershamBiosciences#17-0618-03)、由3M硫氰酸鉀/50mMTrispH7.8和PBS(磷酸緩沖的鹽液)、3MTrispH9.0組成的的抽提緩沖液。為了純化小鼠抗人SPL1、小鼠抗人LUCA19和小鼠抗人LUCA40抗體(即本文分別提及的mu-SPLl、mu-LUCA19和mu-LUCA40),測量上清液的體積并向其中添加等體積的結(jié)合緩沖液。讓該混合物在室溫下平衡。上清液經(jīng)過0.22nm濾器澄清。上清液使用AKTAExplorer系統(tǒng)(AmershamBiosciences)上樣到G蛋白瓊脂糖柱，然后用5-10倍柱體積的結(jié)合緩沖液洗滌。用洗脫緩沖液洗脫單克隆抗體，并收集相應(yīng)的組分。向空管中添加3MTris，pH9.0(l/60體積的組分)中和洗脫的組分。合并含有單克隆抗體的峰組分。合并的樣品被注入預(yù)濕潤的slidealyzer盒(截留分子量10，000MW;Pierce#66810)中,在1xPBS中4X:透析(換3次緩沖液，每次更換后透析時(shí)間為4小時(shí))。純化的單克隆抗體經(jīng)過無菌過濾(0.2jimAcrodisc)，儲(chǔ)存在2-8。C。被純化的抗體樣品用UV吸光度(A28o)和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定濃度。在非還原和還原條件都進(jìn)運(yùn)行SDS-PAGE，用于分析分子量、鑒定單克隆抗體的典型條帶圖并且評(píng)估純度。從雜交瘤上清液中純化了單克隆抗體mu-SPLl、muLUCA19和mu-LUCA40以后，重新測試它們分別與目標(biāo)免疫細(xì)胞或耙細(xì)胞的結(jié)合。細(xì)胞樣品按上述方法制備，并與多種濃度的純化抗體孵育。孵育細(xì)胞洗滌后，重懸在0.1ml稀釋劑中并與ljig接合了山羊抗小鼠IgG的F(ab，)2片段的FITC在4'C孵育30分鐘。洗滌細(xì)胞，重懸于0.5mlFACS稀釋劑中，并用FACScan細(xì)胞分選儀(BectonDickinson;SanJose，CA)分析。在FACScan直方圖中的右移表示純化的抗體仍然結(jié)合細(xì)胞。在另一些實(shí)驗(yàn)中，用活細(xì)胞ELISA檢測并證實(shí)了抗體mu-SPLl、mu-LUCA19和mu-LUCA40分別與SPL1、LUCA19和LUCA40結(jié)合。盡管也可以使用本領(lǐng)域已知的其他方法，但(本發(fā)明)使用下列方法。細(xì)胞(HT國29、SKOV3、SKMES-1、SW480、SKBR-3和HPAFII)在含有10%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基中生長，直到在經(jīng)過組織培養(yǎng)處理的96孔板(Falcon)上匯合。用PBS洗滌細(xì)胞，然后與用50jil所需濃度在含有1%BSA和0.1%疊氮化鈉的Hank，s平衡鹽溶液(HBSS)中的所需抗體一起在室溫孵育1小時(shí)。用每孔100nlHBSS洗滌細(xì)胞三次，之后與辣根過氧化物酶(HRP)第二抗體(每孔50jtl稀釋在HBSS中)一起室溫孵育30分鐘。最后用HBSS洗滌細(xì)胞三次，每孔加入每孔100nl變色底物(TMB底物，KPL)。用每孔100nllM磷酸終止變色反應(yīng)。在O.D.450nm讀取平板。實(shí)施例4Western印跡分析SPL1、LUCA19和LUCA40在癌細(xì)胞系SW480中的表達(dá)腎臟癌細(xì)l包系SW480(ATCC#CCL-228)在175cm2的培養(yǎng)皿生長到匯合。匯合的單層細(xì)胞用Hank，s平衡鹽溶液(HBSS+不含碳酸氬鈉或酚紅；用10mMHEPES，pH7.4緩沖；SigmaChemicals)洗滌三次，在室溫下用200pg硫代-NHS-LC-生物素(PierceEndogen)生物素酰化30分鐘。然后用含有0.1MTris,pH7.4(SigmaChemicals)的HBSS+洗滌細(xì)胞，并用含有0.1MTris，pH7.4的HBSS+在室溫下孵育15分鐘。最后，用HBSS+洗滌細(xì)胞三次，并在裂解緩沖液(含有2%TritonX-100、2mMPMSF、0.1%疊氮化鈉的HBSS+和每5ml裂解緩沖液加1片無EDTA的全小蛋白酶混合物片劑(RocheMolecularBiochemicals))中在冰上孵育5分鐘，裂解細(xì)胞。將細(xì)胞刮入裂解緩沖液中并收集裂解液。裂解液在14,000xg4'C離心一小時(shí)。然后澄清的裂解液用5^1接合了CNBr4MB瓊脂糖小珠(AmershamPharmacia)(lmg/ml)的人IgG在4'C預(yù)清除2小時(shí)。離心并移去人類IgG小珠，然后，預(yù)清除的裂解液與接合了CNBr4MB瓊脂糖小珠(以lmg/ml接合)的單克隆抗體mu-SPLl、muLUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40在4"C孵育2小時(shí)。孵育2小時(shí)后離心并移出mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40小珠。人IgG的小珠和mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40小珠都用lml裂解緩沖液單獨(dú)洗滌三次，并且再用lmlHBSS+洗滌三次。洗滌后的小珠通過加入30[ilSDS-PAGE樣品緩沖液洗脫，并在99C沸騰加熱5分鐘。然后，樣品用4-20%的Novex梯度凝膠(Invitrogen)分離，并轉(zhuǎn)移到0.2nm的硝化纖維膜(Invitrogen)上，用綴合了的鏈霉抗生物素(PierceEndogen)的馬辣根過氧化物酶(HRP)顯色，或用5嗎/印跡的mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5或mu畫LUCA40進(jìn)行Western印跡。為了檢測綴合了鏈霉抗生物素的HRP，先用封閉緩沖液(在含有0.05%Tween-20的Tris緩沖鹽溶液(TBST)中的5%脫脂奶粉)封閉硝化纖維膜1小時(shí)。綴合了鏈霉抗生物素的HRP按ljig/ml稀釋于TBST中，并在室溫下暴露于硝化纖維膜30分鐘。硝化纖維膜用TBST洗滌三次再用ECL+(Amersham)顯色。為了用mu陽SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40進(jìn)行Western印跡，硝化纖維膜在封閉緩沖液中類似封閉1小時(shí)。然后，硝化纖維膜在熱封的塑料袋中孵育，其中含有l(wèi)ml在封閉緩沖液中按5jig/ml稀釋的mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40。硝化纖維用TBST洗滌三次，再與10mllng/ml的綴合驢抗小鼠IgG(特異性、針對(duì)牛、雞、山羊、豚鼠、金黃倉鼠、馬、人、大鼠、綿羊的血清蛋白質(zhì)交叉吸附的重鏈和輕鏈；JacksonImmunoresearch目錄號(hào)#709-035-149)的HRP在室溫賻育1小時(shí)。最后，用TBST洗滌硝化纖維三次，并用ECL+(Amersham)顯色。實(shí)施例5免疫組織化學(xué)方法癌癥患者的冰凍組織樣品被包埋在OCT化合物中，并在異戊烷中用干冰速凍。用Leica3050CM切片機(jī)低溫切片，厚度為8-10nm，解凍封固在SuperFrostPlus載玻片(VWR#48311-703)上。切片用75%丙酮/25%乙醇在10"C固定，并且在室溫空氣干燥2-4小時(shí)。固定好的切片在使用前儲(chǔ)存在-80。C。對(duì)于免疫組織化學(xué)，組織切片用Tris緩沖的0.05。/。Tween(TB-T)洗滌復(fù)蘇，并用封閉緩沖液(TB-T，5%普通山羊血清和100jig/ml抗生物素蛋白)在室溫封閉30分鐘。然后，載玻片與在封閉緩沖液中稀釋的mu-LUCA19、muLUCA40、mu-SG5或mu-SPLl以及對(duì)照單克隆抗體(ljig/ml)在室溫孵育60-90分鐘。再用封閉緩沖液洗滌切片三次。用0.1M醋酸鈉-爰沖液pH5.05和0.003。/。過氧化氫(Sigma目錄號(hào)H1009)中的山羊抗小鼠IgG+IgM(H+L)F(ab，)2-過氧化物酶綴合物和過氧化物酶底物二氨基聯(lián)苯(lmg/ml，Sigma目錄號(hào)D5637)的檢測結(jié)合的單克隆抗體。染過色的載波片用蘇木精對(duì)比染色并用Mkon顯^效鏡檢查。在一些情況下，石蠟包埋的曱醛固定的組織可以在用適當(dāng)?shù)目乖瓘?fù)蘇方法后用于免疫組織化學(xué)。一種上述抗原復(fù)活方法描述在Mangham和Isaacson,Histopathology35:129-33(1999)中。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以4吏用其他的抗原復(fù)蘇方法和/或檢測的方法。從使用了水凍組織或根據(jù)需要，固定的組織經(jīng)過抗原復(fù)活和polyMICA檢測的類似實(shí)驗(yàn)獲得結(jié)果。評(píng)估了抗LUCA19、抗LUCA40和抗SPL1抗體與多種正常組織和癌組織的結(jié)合情況。在所有情形中，抗體在對(duì)照的固定組織中的結(jié)合情況與在冰凍組織中的結(jié)合情況具有相關(guān)性。僅當(dāng)對(duì)照中的兩種情況不匹配時(shí)才使用來自冰凍組織的結(jié)果。方便起見，對(duì)使用不同來源的冰凍外科組織的一些實(shí)驗(yàn)所獲得的綜合結(jié)果總結(jié)在下表l-7中。表l-4總結(jié)了LUCA19、LUCA40、SPL1和SG5抗原在正常人體組織中的分布。表5-7總結(jié)了LUCA19、LUCA40和SPL1在多種人體腫瘤組織中的分布。表1.LUCA19抗原在正常人體組織中的分布<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表2.LUCA40抗原在正常人體組織中的分布<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>表3.SPL1抗原在正常人體組織中的分布<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>實(shí)施例6免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果用單克隆抗體mu-LUCA19、mu-LUCA40和mu-SPLl檢測了與不同組織類型來源的多種細(xì)胞系的反應(yīng)性。結(jié)果的評(píng)分為'+，表示弱陽性染色，'++，表示中等陽性染色，'+++，表示強(qiáng)陽性染色和'-，表示陰性染色。免疫組織化學(xué)結(jié)果的獲得使用了WO01/43869中描述的CellArrayTM技術(shù)。不用蛋白酶消化，將來自不同建立的細(xì)胞系的細(xì)胞從生長表面移出、聚集并包埋在OCT化合物中。細(xì)胞經(jīng)過冷凍和切片，然后使用標(biāo)準(zhǔn)的IHC方法染色。方^^見，在表8-10中匯集了mu-LUCA19、mu-LUCA40和mu-SPLl抗體與多種建立的人正常細(xì)胞系和肺瘤細(xì)胞系結(jié)合的結(jié)果。表8代表的實(shí)驗(yàn)包括用本文描述的方法使用mu-LUCA19進(jìn)行的活細(xì)胞ELISA、肉瘤測定(SarcomaArray)和CellArray結(jié)合實(shí)驗(yàn)。表9代表的實(shí)驗(yàn)包括用本文描述的方法，使用mu-LUCA40進(jìn)行的活細(xì)胞ELISA、肉瘤測定和CellArray結(jié)合實(shí)驗(yàn)。表10代表的實(shí)驗(yàn)包含用本文描述的方法，使用mu-SPLl進(jìn)行的活細(xì)胞ELISA、肉瘤測定和CellArray結(jié)合實(shí)驗(yàn)。表8.Mu-LUCA19的結(jié)合<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>200680011089.5<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>*CC-2251BioWhitaker方便起見，表11中匯總了使用本文描述的方法，mu-LUCA19、mu-LUCA40和mu-SPLl抗體與多種來自國立癌癥研究中心(NationalCancerInsitute,NCI)的建立的腫瘤細(xì)胞系結(jié)合的結(jié)果。表11.NCI細(xì)胞系陣列LUCA19LUCA40SPL1<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>單克隆抗體mu-LUCA19、mu-LUCA40和mu-SPLl被用于檢測與神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源的細(xì)胞系的反應(yīng)性。免疫細(xì)胞化學(xué)的結(jié)果獲得自使用與上述CellArrayTM技術(shù)類似的方法。不用蛋白酶，使神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源的細(xì)胞系從生長表面移出、集中并包埋在OCT化合物中。細(xì)胞經(jīng)過冷凍和切片，然后用標(biāo)準(zhǔn)IHC方法染色。在25個(gè)被篩選的神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源的細(xì)胞系中，17個(gè)顯示mu-LUCA19陽性。染色強(qiáng)度范圍從+/-到3+染色。在25個(gè)^皮篩選的神經(jīng)自瘤起源的細(xì)胞系中，18個(gè)顯示mu-LUCA40陽性。染色強(qiáng)度范圍從+/-到3+染色。在25個(gè)被篩選的神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源的細(xì)胞系中，14個(gè)顯示mu-SPLl陽性。染色強(qiáng)度范圍從+/-到3+染色。實(shí)施例7分離和鑒定抗原Ag-SPL1、Ag-LUCA19、Ag-SG5和Ag-LUCA40為了鑒定SPL1、LUCA19、SG5和LUCA40反應(yīng)的抗原，進(jìn)行了免疫沉淀(Ippt)實(shí)驗(yàn)。對(duì)于免疫沉淀，30個(gè)175cm2培養(yǎng)瓶的SW480細(xì)胞用30ml裂解緩沖液裂解。裂解緩沖液由添加了2。/。TritonX-100的Hanks平衡鹽溶液(HBSS+)、蛋白酶抑制劑混合物(每5ml裂解液加1片RocheMolecularBiochemicals的無EDTA全蛋白酶混合物小片劑)、0.1%疊氮化鈉和2mMPMSF組成。細(xì)胞裂解液在通過由lmlG蛋白(AmershamPharmacia)組成的柱之前，先在4。C下24,000xg澄清30分鐘。經(jīng)過預(yù)清除的SW480裂解液再與吸附了mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40的G蛋白(5plG蛋白與10ngmu誦SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40在室溫預(yù)將育了30分鐘)在4。C孵育2小時(shí)。小珠(經(jīng)過預(yù)清除的G蛋白小珠和吸附了mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40的G蛋白小珠)之后用裂解緩沖液洗滌三次，再用30plSDS樣品緩沖液(3。/。SDS、20%甘油、10mMDTT、2%溴酚蘭、0.1MTris,pH8.0)洗脫。25jil洗脫物用SDS-PAGE分離并且用考馬斯染色顯色。5jil洗脫物用SDS-PAGE分離，再轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上進(jìn)行Western印跡。印跡使用mu-SPLl、mu畫LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40探針檢測并用Western印跡試劑盒(Invitrogen目錄號(hào)WB7103)顯色，驗(yàn)證抗原識(shí)別。通過mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40和抗mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40的小鼠IgG洗脫物的Western印跡，觀察到對(duì)于mu-SPLl、mu畫LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40洗脫物獨(dú)特的蛋白質(zhì)。用干凈的手術(shù)刀片將染色的蛋白質(zhì)條帶從NuPAGE凝膠上切下，并放置在干凈的Eppendorf管中。切下來的條帶直到用于質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)以前都儲(chǔ)存在-20C。實(shí)施例8用串聯(lián)質(zhì)鐠(MS/MS)鑒定mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40結(jié)合的抗原mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40結(jié)合的抗原按照實(shí)施例7中描述的分離，并按照Kane等人，JBioChem.2002年6月21日；277(25):22115-8，EpubMay06中描述的方法進(jìn)行串城譜。蛋白質(zhì)用SDS-PAGE分離，并用膠狀考馬斯藍(lán)試劑(Invitrogen)染色。目標(biāo)蛋白質(zhì)用胰酶在膠內(nèi)消化。胰酶消化的肽通過在離子阱質(zhì)譜儀(Thermo-FinniganLCDQDECAXP)的微細(xì)管液相層析MS/MS測序，見Wu等人，Nature405:477-482(2000)中的描述。備選的，其他常規(guī)已知的質(zhì)譜方法，例如MALDI質(zhì)譜法，也可以在本發(fā)明的實(shí)踐中使用。質(zhì)"i普分析的結(jié)果顯示mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5和mu-LUCA40的抗原是EphA2。實(shí)施例9夾層ELISA用于mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5和mu-LUCA40的表4立作圖使用竟?fàn)幮詩A層ELISA評(píng)估EphA2上mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5和mu-LUCA40結(jié)合的特異表位。mu-SPLl、mu畫LUCA19、mu-SG5或mu-LUCA40按10jig/ml的濃度50nl/孔稀釋在HBSS(不含碳酸氫鈉和酚紅的Hank平衡鹽溶液)中，并與96孔Maxisorb孩i量滴定板在室溫下結(jié)合2小時(shí)。隨后被包被的平板用含有1。/。BSA(W/V)的HBSS封閉30分鐘。HT-29細(xì)胞如實(shí)施例7所述裂解。裂解液按每孔150pl的體積加在封閉過的微量滴定孔中。裂解液在室溫下孵育1小時(shí)。在孵育后，平板用封閉緩沖液徹底洗滌。生物素酰化的mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5和mu-LUCA40按50fil/孔、lng/ml的濃度，加入孩史量滴定孔并在室溫下孵育1小時(shí)。生物素酰化的mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5和mu-LUCA40是用每lmg純化的抗體與稀釋在DMSO中的200mg/ml的硫代-NHS-LC-生物素在室溫下孵育2小時(shí)制備的。然后，用終濃度0.1M的Tris，pH7.4在室溫下驟冷生物素?；目贵w30分鐘。然后通過30kDa分子量截留濾器的濃縮，將生物素?；目贵w與生物素分離。與生物素酰化抗體孵育1小時(shí)后，平板用HBSS徹底洗滌。按I:IO，OOO的濃度將綴合了鏈霉抗生物素的辣根過氧化物酶(SA-HRP)稀釋到HBSS中。稀釋后的SA-HRP按50jil/孔加入到洗滌過的微量滴定孔中，并在室溫孵育30分鐘。在孵育了SA-HRP后，平板最后用HBSS徹底洗滌并用添加100jil/孔的一步TMB底物進(jìn)行變色反應(yīng)來顯色。用100nl/孔稀釋在Milli-Q水中的1M磷酸終止顯色。然后用ThermoMax微量滴定板讀數(shù)器在450nm分析顯色的平板。根據(jù)竟?fàn)幮詩A層ELISA的結(jié)果，我們可以得出結(jié)論，mu-SPLl、mu-LUCA19、mu-SG5和mu-LUCA40代表三種通過兩個(gè)不同的表位結(jié)合EphA2的抗體，mu-LUCA40代表了一種，mu-SPLl代表了另一種。Mu-LUCA19似乎共享了mu-SPLl代表的表位，但兩者沒有完全重疊。重疊的部分沒有伸展到mu-LUCA40代表的表位上。實(shí)施例10對(duì)mu-LUCA19和mu-SG5的進(jìn)一步表征用mu-LUCA19和mu-SG5研究了在表達(dá)內(nèi)源性EphA2的神經(jīng)l^t瘤細(xì)胞系G55細(xì)胞中EphA2的刺激作用。細(xì)胞用濃度遞增到30ng/ml的mu-LUCA19或mu-SG5處理，并用磷酸酪氨酸特異性抗體(4G10，UpstateCellSignalingSolutions,NewYork)通過Western印跡分析測量了免疫沉淀的EphA2中的磷酸酪氨酸含量。在用mu-LUCA19或mu-SPLl處理過的G55細(xì)胞免疫沉淀下來的EphA2中，沒有發(fā)現(xiàn)磷酸酪氨酸含量上的差異。進(jìn)4亍了總EphA2含量的對(duì)照Western印跡，保證了對(duì)于每種處理?xiàng)l件，免疫沉淀的總EphA2蛋白質(zhì)是相等。使用A549細(xì)胞和mu-LUCA19和mu-SG5抗體也觀察到類似的結(jié)果。這些結(jié)果表明，用mu-LUCA19或mu-SG5處理表達(dá)內(nèi)源性EphA2的細(xì)胞不會(huì)增加或降低EphA2的磷酸酪氨酸的含量。實(shí)施例11mu-SPLl、mu-LUCA19和mu-LUCA40對(duì)癌細(xì)胞系的影響抗體在體外減少單層生長的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量的能力，可以使用不同量的測試或?qū)φ占兓目贵w存在或缺失時(shí)生長的細(xì)胞單層來評(píng)估，并用MTT評(píng)估細(xì)胞數(shù)量的變化。MTT是用于測量線粒體酶活性的染料并且與相對(duì)活細(xì)胞數(shù)量相關(guān)。將目標(biāo)細(xì)胞在96孔平板中接種并且生長在補(bǔ)充了10%胎牛血清的F12/DMEM(1:l)生長培養(yǎng)基中。細(xì)胞系按1500-2500細(xì)胞/孔的密度范圍一式三份接種在96孔板培養(yǎng)皿中。接種完后立即加入mu-SPLl、mu-LUCA19或mu-LUCA40。細(xì)l包在5%<:02/空氣的潮濕培養(yǎng)箱中37。C孵育5天。在評(píng)估最后，將MTT溶解在PBS(5mg/ml)中并且按l:IO的稀釋直接加入各孔。平板重新放回培養(yǎng)箱中4小時(shí)。孵育后，除去培養(yǎng)基，加入100jdDMSO溶解MTT沉淀。在0.D.540nm下讀取平板。在這些實(shí)驗(yàn)中，mu-LUCA40抑制786-0、A549、Caki-2、ES-2、SKMES-1和SKOV3細(xì)胞系的生長，而SPL1和LUCA19則沒有。實(shí)施例12mu-LUCA19、mu-SG5和mu-LUCA40以及綴合毒素的抗小鼠IgG的內(nèi)化作用Mab-ZAP(AdvancedTargetingSystems,SanDiego，CA)是綴合了月巴皂草毒蛋白的抗小鼠IgG，所述肥皂草毒蛋白是抑制蛋白合成的毒素。該毒素不能通過細(xì)胞膜。如果單克隆抗體結(jié)合可內(nèi)化的細(xì)胞表面抗原，毒素綴合物可以結(jié)合所結(jié)合的單克隆抗體，并且因此被內(nèi)化而最終殺死細(xì)胞。由于依賴內(nèi)化作用證明毒性，Mab-ZAP可以用于評(píng)估給定的表面抗原是否可以用作依賴內(nèi)化作用表達(dá)細(xì)胞毒性效應(yīng)的任何毒素合適的靶標(biāo)。因此，Mab-ZAP可以作為此類依賴內(nèi)化作用的毒素例如美登素類和加利車霉素的模型。為了測試mu-LUCA19和mu-LUCA40和接合肥皂草毒蛋白的抗小鼠IgG在腫瘤細(xì)胞的內(nèi)化作用，以及肥皂草毒蛋白內(nèi)化后殺傷腫瘤細(xì)胞的效果，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞G130用10mMEDTA從儲(chǔ)存瓶中移出并離心。細(xì)胞以50，000/ml重懸在合適的培養(yǎng)基中，并按每孔100nl接種在96孔板中?？贵wMu-SPLl、mu-LUCA19或mu-LUCA40以10x濃度立即添加到合適的孔中，使得終濃度為10ng/ml。室溫15分鐘后，Mab-ZAP(目錄號(hào)IT-04,AdvancecedTargetingSystems,SanDiegoCA)按10x濃度添加到合適的孔中，使得終濃度從O.OOlnM到10nM。經(jīng)過4天生長，加入MTT(5mg/ml儲(chǔ)存PBS中，每孔l:10稀釋)37。C4小時(shí)。然后去掉所有孔的培養(yǎng)基，并且加入100nl/孔DMSO。輕柔旋轉(zhuǎn)平板使藍(lán)色的MTT沉淀溶解，并在O.D.540nm下讀取平板。當(dāng)mu-LUCA19和mu-LUCA40存在時(shí)，G130細(xì)胞中MTT染色比這些抗體不存在時(shí)的染色減少。這表明G130細(xì)胞的生長在mu-LUCA19和mu-LUCA40和Mab-ZAP存在時(shí)受到抑制，這些結(jié)果還表明mu-LUCA19和mu-LUCA40和接合了毒素的抗小鼠IgG在G130細(xì)胞中被內(nèi)化。使用一種卵巢癌細(xì)胞系ES-2細(xì)胞和mu-SG5抗體也觀察到類似的結(jié)果。當(dāng)mu-SG5存在時(shí)，ES-2細(xì)胞中MTT染色比不存在此抗體時(shí)的染色減少。這表明mu-SG5和Mab-ZAP的存在抑制了ES-2細(xì)胞的生長。這一結(jié)果表明mu-SG5和接合了毒素的抗小鼠IgG被ES-2細(xì)胞內(nèi)化。實(shí)施例13抗EphA2抗體SPL1和LUCA40對(duì)棵鼠中人細(xì)胞的效應(yīng)人肺瘤細(xì)胞被移植到棵小鼠(nu/nu)的腎包膜下。使用了三種腫瘤細(xì)胞系。從ATCC獲得ES-2和SKOV3-3(卵巢腫瘤來源的細(xì)胞系)以及Caki-2(腎臟胂瘤來源的細(xì)胞系)。在一些研究中，雙側(cè)腎臟都接受了異種移植物。在接受處理的動(dòng)物中，在腎包膜中制備移植物(膠原凝膠中500k細(xì)胞)。腹膜內(nèi)注射濃度為50mg/kg以及體積為O.OlmL/g體重的抗EphA2單克隆抗體SPL1或LUCA40。在植入后第二天開始給藥，SPLl、LUCA40或PBS的劑量以每周三次的快速單次注射施用。對(duì)照小鼠只注射PBS。末次注射三天后，動(dòng)物安樂死，檢查腎臟和移植物。腫瘤中的人DNA的量用AppliedBiosystems(FosterCity,CA)SDS7000系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR定量，使用的引物和探針根據(jù)公開的方法特異性針對(duì)人類核糖體基因RPL19。每個(gè)腫瘤樣品用PCR反應(yīng)一式三份分析并確定平均DNA濃度。對(duì)于每組腫瘤樣品都確定了平均DNA濃度和均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性用學(xué)生T檢驗(yàn)(雙尾，類型l)確定。腫瘤生長抑制通過[(處理組平均腫瘤體積/PBS對(duì)照組平均腫瘤體積)xl00的絕對(duì)值-100來計(jì)算。在未顯示的數(shù)據(jù)中，使用細(xì)胞系Caki-2和ES-2，視測和手工檢測中顯示SPL1相對(duì)于對(duì)照減少了腫瘤尺寸。在用LUCA40處理的、移植Caki-2腫瘤的小鼠中也觀察到類似的結(jié)果。LUCA40抗體處理小鼠的Caki-2腫瘤的DNA定量證實(shí)了LUCA40處理小鼠的腫瘤比對(duì)照更小。表12顯示了用SPL1抗體的其他亞腎包膜異種移植物研究設(shè)計(jì)，以及這些研究的DNA定量結(jié)果。表12.SPL1亞腎包膜異種移植物模型研究設(shè)計(jì)和結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>TGI—目對(duì)于PBS對(duì)照組的腫瘤生長抑制；p值由非成對(duì)學(xué)生T檢驗(yàn)確定。實(shí)施例14SPL1在人卵巢腫瘤皮下才莫型中的抗腫瘤效應(yīng)^研究設(shè)計(jì)為測試SPL1抗體在卵巢癌和肺癌的皮下才莫型中的劑量應(yīng)答性抗胂瘤數(shù)據(jù)。卵巢腫瘤來源的ES-2細(xì)胞系是從中試皮下胂瘤模型研究中鑒定的快速生長腫瘤中重新得到的。A549肺腫瘤來源的細(xì)胞獲自ATCC。培養(yǎng)的細(xì)胞用胰酶消化、在培養(yǎng)基中洗滌、離心并按每毫升培養(yǎng)基l億個(gè)細(xì)胞的密度(每0.05ml體積5百萬個(gè)細(xì)胞)重懸在培養(yǎng)基中，然后，與等體積的Matrigel⑥混合成O.lmL最終注射體積。使用雌性CRL.nu/nu純合小鼠。細(xì)胞被皮下注射接種在小鼠頸部背側(cè)。給藥從移植當(dāng)天開始，或者從腫瘤已經(jīng)成型并可測量的時(shí)候開始。對(duì)于第0天給藥，在上午接種腫瘤，當(dāng)天下午開始向動(dòng)物給藥。對(duì)于肺瘤成型后給藥，按照下述將動(dòng)物隨機(jī)分組確定肺瘤體積，一艮據(jù)腫瘤體積分選動(dòng)物，確定均值并選擇合適數(shù)量的、高于和低于均值的動(dòng)物(根據(jù)模型，每組12-15只)，從研究中去掉那些腫瘤太大或太小的。剩下的動(dòng)物根據(jù)耳簽號(hào)碼隨機(jī)化為處理組和對(duì)照組。用T檢驗(yàn)證實(shí)最終分組的隨機(jī)分布(PX).l可以認(rèn)為是隨機(jī)的)。對(duì)于每一個(gè)治療給藥組，SPL1用PBS稀釋到合適的濃度劑量(ES-2細(xì)胞研究為50mg/kg,A549細(xì)胞研究中濃度范圍為10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg)，以及PBS對(duì)照，并且以0.01mL/g體重的體積給藥。SPL1或PBS的劑量為每周兩次單次快速注射到腹膜內(nèi)腔中來施用。對(duì)照小鼠只注射PBS。在12-15只小鼠的組中，給藥開始于腫瘤成長到合適的尺寸，這根據(jù)研究而定。在開始腫瘤測量前允許腫瘤生長約6天。之后將胂瘤每周用數(shù)顯卡尺三維測量兩次，肺瘤的體積是作為三種測量結(jié)果的二分之一來計(jì)算的。隨時(shí)間變化的腫瘤體積是所有上述研究的主要目的。臨床觀察每天都進(jìn)行。每只動(dòng)物每周測量兩次體重。每次測量都確定每組的平均肺瘤體積和均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。用學(xué)生T檢驗(yàn)(雙尾，類型l)確定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。腫瘤生長抑制通過[(處理組平均胂瘤體積/PBS對(duì)照組平均肺瘤體積)x100的絕對(duì)值-100來計(jì)算。表13顯示了皮下異種移植物的研究設(shè)計(jì)和結(jié)果。表13.SPL1SC異種移植物模型研究設(shè)計(jì)和結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>PBS對(duì)照組的腫瘤生長抑制。如圖1中顯示，用SPL1治療A549腫瘤異種移才直物的子集在中止給藥后出現(xiàn)了緩慢的再生長，其中腫瘤再生長被定義為在中止給藥后體積增大兩倍及兩倍以上。在100mg/kg處理組中的16只小鼠中有7只出現(xiàn)了腫瘤再生長，同時(shí)100mg/kg處理組的16只小鼠中有9只在中止給藥后維持無瘤。類似的，在30mg/kg處理組的15只小鼠中有3只出現(xiàn)了胂瘤再生長，而30mg/kg處理組的15只小鼠中有12只在中止給藥后維持無瘤。圖l在"中止給藥"點(diǎn)后的圖形結(jié)果只顯示了出現(xiàn)腫瘤再生長的小鼠中的腫瘤尺寸。要理解本文中描述的實(shí)施例和實(shí)施方案都是僅出于說明的目的，并且種根據(jù)其的修改或變化將給本領(lǐng)域的技術(shù)人員啟示，并且將包含在本申請(qǐng)的精神和法律范圍以內(nèi)。本文引用的所有的出版物、專利和專利申請(qǐng)都以其相同程度的目的，全文引用作為參考，所述程度類似每一個(gè)獨(dú)立的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)都是具體而獨(dú)立的如此引用作為參考。權(quán)利要求1.基本純化的免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段，其為SPL1、LUCA19、SG5或LUCA40。2.基本純化的免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段，其特異性結(jié)合EphA2，并具有SPL1、LUCA19、SG5或LUCA40的至少一個(gè)下列特征a.結(jié)合癌細(xì)胞上EphA2的能力；b.在體外或體內(nèi)結(jié)合EphA2暴露在活癌細(xì)胞表面的部分的能力；c.阻礙腫瘤細(xì)胞增殖，但不增加EphA2的磷酸酪氨酸含量的能力；d.將治療劑或可檢測的標(biāo)記遞送至表達(dá)EphA2的癌細(xì)胞的能力；以及e.將治療劑或可檢測的標(biāo)記遞送至表達(dá)EphA2的癌細(xì)胞內(nèi)部的能力。3.分離的核M列，其編碼權(quán)利要求l的免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段。4.權(quán)利要求3的核酸，其中核酸與啟動(dòng)子有效連接。5.權(quán)利要求4的核酸，其中啟動(dòng)子和核酸包含在表達(dá)載體中。6.權(quán)利要求3的核酸，其中免疫球蛋白是單克隆抗體。7.細(xì)胞系，其用包含權(quán)利要求3的核酸的栽體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或感染。8，產(chǎn)生基本純化的免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段的方法，其包括以下步驟a.在表達(dá)免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段的條件下培養(yǎng)用權(quán)利要求3的核酸轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系；以及b.收獲表達(dá)的免疫球蛋白或片段。9，權(quán)利要求8的方法，其中細(xì)胞系是雜交瘤。10.權(quán)利要求9的方法，其中雜交瘤是ATCCNo.PTA-5070、PTA-6056或PTA-6059，或是雜交瘤SG3.15B4.1F9。11.權(quán)利要求8的方法，其中免疫球蛋白是單克隆抗體。12.藥物組合物，其包含治療有效劑量的權(quán)利要求1的純化的免疫球2蛋白或抗原結(jié)合片段，以及可藥用載體。13.雜交瘤，其保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為PTA-5070、PTA-6056或PTA-6059,或雜交瘤SG3.15B4.1F9(PTA-XXXX)。14.雜交瘤產(chǎn)生的抗體，所述雜交瘤保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為PTA-5070、PTA-6056或PTA-6059,或雜交瘤SG3.15B4.1F9(PTA-XXXX)。15.權(quán)利要求l的免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段，其是人源化的。16.權(quán)利要求l的免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段，其是嵌合的。17.權(quán)利要求l的免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段，其是人抗體。18.權(quán)利要求l的免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段，其是衍生物。19.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中所述純化的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段是LUCA19、LUCA40、SG5或SPL1。20.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中純化的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段與LUCA19、LUCA40、SG5或SPL1竟?fàn)幗Y(jié)合EphA2。21.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中純化的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段是人源化的。22.權(quán)利要求12的藥物組合物，其中純化的免疫球蛋白或抗原結(jié)合片段是嵌合的。23.治療所需患者癌癥的方法，所述方法包括對(duì)所述患者施用治療有效量的EphA2抗體，所述EphA2抗體特異性結(jié)合EphA2，并具有SPL1、LUCA19、SG5或LUCA40的至少一個(gè)下列特征a.結(jié)合癌細(xì)月包上EphA2的能力；b.在體外或體內(nèi)結(jié)合EphA2暴露在活癌細(xì)胞表面的部分的能力；c.阻礙腫瘤細(xì)胞增殖，但不增加EphA2的磷酸酪氨酸含量的能力；d.將治療劑或可檢測的標(biāo)記遞送至表達(dá)EphA2的癌細(xì)胞的能力；以及e.將治療劑或可檢測的標(biāo)記遞送至表達(dá)EphA2的癌細(xì)胞內(nèi)部的能力。全文摘要本文提供關(guān)于結(jié)合到抗原EphA2的抗體的開發(fā)和表征的公開，所述抗原EphA2存在于多種來自乳房、肺、前列腺和結(jié)腸的人類癌癥。本文也公開了通過使用直接抗此抗原的此類抗體來診斷和治療多種癌癥的方法。文檔編號(hào)C07K16/00GK101155830SQ200680011089公開日2008年4月2日申請(qǐng)日期2006年2月6日優(yōu)先權(quán)日2005年2月4日發(fā)明者J·P·馬瑟,P·E·羅伯茨申請(qǐng)人:雷文生物技術(shù)公司