專利名稱：：用于治療mcp-1/ccr2相關(guān)疾病的分子及其使用方法用于治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病的分子及其使用方法本發(fā)明的領(lǐng)域和背景本發(fā)明涉及新的分子，更具體地，涉及治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病，例如炎癥性疾病和癌癥的方法。在過去的幾年，描述了越來越多的白細(xì)胞化學(xué)吸引劑/活化因子(趨化因子)[Oppenheim，J.J."Annu.Rev.Immunol.,9:617-648(1991);SchallandBacon,Curr.Opm.Immunol.,6:865-873(1994);Baggiolmi,M.,""/.,Adv.Im腸l.,55:97-1-79(1994)]。應(yīng)答早期炎癥性介導(dǎo)物例如IL-1卩或TNF-a，各種各樣的細(xì)胞類型產(chǎn)生和分泌了趨化因子。趨化因子超家族包括兩個主要的分支a-趨化因子(也稱為CXC趨化因子)和(3-趨化因子(也稱為CC趨化因子)。這種分類基于氨基酸序列中的前兩個半胱氨酸是被單個氨基分隔(CXC)還是相鄰的(CC)。a-趨化因子分支包括蛋白質(zhì)例如IL-8、嗜中性粒細(xì)胞活化肽-2(NAP-2)、黑素瘤生長刺激活性(MGSA/gro或GROa)和ENA-78,它們每一種都主要對嗜中性粒細(xì)胞和T、淋巴細(xì)胞具有吸引和活化效應(yīng)。P-趨化因子分支的成員影響其他血細(xì)胞類型，例如單核細(xì)胞、淋巴纟田月包、p耆石咸'(i細(xì)月包禾口p耆曙纟工細(xì)月包[Oppenheim,J.J.a/"Annu.Rev.Immunol.,9:617-648(1991);Baggiolmi,M.,e/1a/.,Adv.Imunol.,55:97-179(1994);MillerandK腦gel,CntRev.Immunol.,12:17-46(1992);Jose,P.J.,"a/.,J.Exp.Med.,179:881-118(1994);Ponath,P.D.,""/.,J.Clm.Invest,97:604-612(1996)]，包括蛋白質(zhì)例如單核細(xì)胞趨化性蛋白1-4(MCP-l、MCP-2、MCP-3和MCP-4)、RANTES和巨噬細(xì)胞炎癥性蛋白(MlP-la和MIP-l卩)。趨化因子超家族的第三個較小的分支包括膜結(jié)合趨化因子。這種類型的成員被稱為CX3C趨化因子[Bazan,J.F.，""/.,Nature385:640-644(1997)]。趨化因子可以介導(dǎo)針對白細(xì)胞的一系列前炎癥性影響，例如趨化性的觸發(fā)、脫粒作用、脂質(zhì)介導(dǎo)物的合成以及整聯(lián)蛋白活化[Oppenheim，J.J.e/1a/.,Annu.Rev.Immunol.,9:617-648(1991);Baggiolini,M,a/.,Adv.Imunol.,55:97-179(1994);Miller,M.D.andKrangel,M.S.,Cnt.Rev.Immunol.,12:17-46(1992)]。趨化因子結(jié)合屬于G-蛋白偶聯(lián)七跨膜結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)家族的特定的纟田月包表面受體[Murphy,P.M.,Annu.Rev.Immunol.,12:593-633(1994)],其被稱為"趨化因子受體"。在結(jié)合它們的同源配體時，趨化因子受體通過相關(guān)的三聚G蛋白來轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號，引起細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的快速提高、細(xì)胞形狀的改變、細(xì)胞粘附分子表達(dá)的提高、脫粒作用和細(xì)胞遷移的促進(jìn)，等等。已經(jīng)暗示趨化因子是過敏性、炎癥性和自體免疫性失調(diào)和疾病，如。孝喘、動脈粥樣硬化、血管球性腎炎、胰腺炎、再狹窄、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病性腎病、肺纖維化和移植排斥的重要的介導(dǎo)物。特別地，作用于其受體CC趨化因子受體2(CCR-2)的單核細(xì)胞化學(xué)吸引物-l(MCP-1)在各種癥候中起作用。在與它的受體結(jié)合時，MCP-1誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)4丐濃度的快速提高，其引起細(xì)胞粘附分子表達(dá)提通過使用遺傳修飾的小鼠的實驗已經(jīng)提供了MCP-l/CCR-2相互作用的重要性的證明。MCP-1-A小鼠具有正常數(shù)量的白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，但是在幾種不同類型的免疫激發(fā)之后不能將單核細(xì)胞征募到炎癥的位點內(nèi)[BaoLu,e/J.Exp.Med.1998,187,601]。同樣地，當(dāng)用各種外源試劑激發(fā)時，CCR-2-A小鼠不能征募單核細(xì)胞或產(chǎn)生干擾素此外，無CCR-2小鼠的白細(xì)胞不應(yīng)答MCP-1而遷移[LandinBormg,"a/.,J.Clin.Invest.1997,100,2552],從而證實了MCP-1/CCR-2相互作用的特異性。兩個其他的小組已經(jīng)獨立地報道了使用CCR-2V-小鼠不同才朱系的相同結(jié)果[WillmmA.Kuziel,〃"/.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1997，94，12053,和TakaoKurihara,"a/.，J.Exp.Med.1997,186,1757]。MCP-1-/-和CCR-2-Z-動物的生存力和一般的正常健康狀態(tài)是值得注意的，因為破壞MCP-l/CCR-2相互作用不引起生理學(xué)的危機(jī)。結(jié)合起來，這些數(shù)據(jù)表明阻斷MCP-1的作用的分子將在治療一系列炎癥性和自體免疫性失調(diào)中有用。已知的是，MCP-1在患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中被上調(diào)[AlisaKoch,da/,,J.Clm.Invest.1992,90,772-779]。此外，幾項研究已經(jīng)證實了MCP-1/CCR2相互作用的拮抗在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的潛在治療價值。編碼MCP-1的DNA疫苗近來顯示了在大鼠中改善慢性的多佐劑i秀導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎[SawsanYoussef，"a/.,J.Clm.Invest.2000,106,361]。類似地，通過向患有膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎[HiroomiOgata,Wa/.,J.Pathol.1997,182,106]或鏈球菌細(xì)胞壁誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎[RalphC.Schimmer,"《J.Immunol.1998,160,1466]的大鼠直接施用MCP陽l的抗體可以控制炎性疾病癥狀?；蛟S最顯著地，MCP-1的肽拮抗劑，MCP-1(9-76)在關(guān)節(jié)炎的MRL-lpr小鼠模型中顯示了預(yù)防疾病發(fā)作和卩爭j氐疾病癥習(xí)夫(取決于施用的時間)[Jiang-HongGong,"a/.,J.Exp.Med.1997,186,131]。MCP-1也在動脈粥樣石更化病變中被上調(diào)，已經(jīng)證實了MCP-1的循環(huán)水平在疾病發(fā)展中起作用[AbdolrezaRezaie-Majd,W"/.,Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.2002,22,1194-1199]。如通過富含巨噬細(xì)胞的動脈壁的免疫組織化學(xué)[Yla-Herttuala"c//.,ProcNatlAcadSciUSA88:5252-5256(1991);NelkenWJClmInvest88:1121-1127(1991)]和抗MCP-1抗體沖僉測[TakeyaWa/.,HumanPathol24:534-539(1993)]所顯示的，MCP-1負(fù)責(zé)征募單核細(xì)胞進(jìn)入動脈粥樣硬化區(qū)域。與野生型MCP-1抹系相比，LDL-受體/MCP-]缺陷和叩oB轉(zhuǎn)基因/MCP-1缺陷小鼠顯示了在它們的整個主動脈中顯著較低的脂質(zhì)沉積和巨p藍(lán)細(xì)月包積累[Alcami"a/.,JImmunol160:624-633(1998);Gosling"a/.,JClinInvest103:773-778(1999);GuWa/.,Mol.Cell.2:275-281(1998);Boringe^/.，Nature394:894-897(1998)]。已知的是，MCP-1在人類多發(fā)性硬化中被上調(diào)，已經(jīng)顯示了使用干擾素卩-l卩的有效治療降低了外周血單核細(xì)胞中的MCP-1表達(dá)，表明MCP-1在疾病發(fā)展中起作用[CarlaIarlon,""/,J.Neuroimmunol.2002,123,170-179]。其他研究已經(jīng)表明MCP-l/CCR-2相互作用的拮抗在治療多發(fā)性硬化中的潛在治療價值；所有這些研究已經(jīng)在多發(fā)性硬化的常規(guī)動物模型實驗性自體免疫腦脊髓炎(EAE)中被證明。向患有EAE的動物施用MCP-1的抗體顯著地減小了疾病復(fù)發(fā)[K.J.Kennedy,"a/.,J.Neuroimmunol.1998,92,98]。jt匕夕卜，兩項更誶斤近的報道現(xiàn)在已經(jīng)顯示了CCR-2-A小鼠對EAE有抗性[BrianT.Fife,""/.,丄Exp.Med.2000,192,899;LeonidIzikson，a/.,J.Exp.Med.2000,192,1075]。已知的是，MCP-1在肺移值之后出現(xiàn)了閉塞性細(xì)支氣管炎綜合癥的患者中被上調(diào)[MartineReynaud-Gaubert,W，J.ofHeartandLungTransplant.,2002,21,721-730;JohnBelperio,"《J.Clin.Invest.2001,108,547-556]。在閉塞性細(xì)支氣管炎綜合癥的鼠模型中，施用MCP-1的抗體引起氣道閉塞的減弱；類似地，CCR2-A小鼠在這個相同模型中對氣道閉塞有抗性[JohnBelperio,""/.,J.Clin.Invest2001,108,547-556]。這些數(shù)據(jù)表明，MCP-1/CCR2的拮抗可能在治療移植后的器官排斥中是有益的。其他研究已經(jīng)表明了MCP-1/CCR2相互作用的拮抗在治療哮喘中的潛在治療價值。在卵清蛋白激發(fā)的小鼠中中和抗體對MCP-1的隔離引起了支氣管超反應(yīng)性和炎癥的顯著降低[Jose-AngelGonzalo,""/.,J.Exp.Med.1998,188,157]。證明了通過施用MCP-1的抗體有可能在曼氏裂頭吸蟲(Schistosomamansoni)卵激發(fā)的小鼠中降低過敏性氣道炎癥[NicholasW.Lukacs,""/，J.Immunol.1997,158,4398]。與此一致，MCP-1-/-小鼠顯示了對曼氏裂頭吸蟲卵攻擊的減弱的應(yīng)答[BaoLu,Wa/.,J.Exp.Med.1998,187,601]。其他研究已經(jīng)表明了MCP-1/CCR2相互作用的拮抗在治療腎病中的潛在治療價值。在血管球性腎炎的鼠模型中施用MCP-1的抗體引起了腎小球新月體形成和I型膠原沉積的顯著降低[ClareM.Lloyd，"a/.,J.Exp.Med.1997,185,1371]。此外，與它們的MCP誦l十/+對應(yīng)小鼠相比，患有誘導(dǎo)的腎中毒血清腎炎的MCP-l-A小鼠顯示了顯著更低的腎管損傷[GregoryH.Tesch,""/.,J.Clin.Invest.1999,103,73]。一項研究已經(jīng)表明了MCP-1/CCR2相互作用的拮抗在治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的潛在治療價值。MCP-lV-小鼠與MRL-FAS.sup.lpr小鼠雜交(后者具有類似于人類系統(tǒng)性紅斑狼瘡的致死性自體免疫疾病)導(dǎo)致比野生型MRL-FAS.sup.lpr小鼠更少的疾病和更久的存活[GregoryH.Tesch,Wa/.,J.Exp.Med.1999,190,1813]。MCP-1/CCR2相互作用在結(jié)腸炎的病變中也是相關(guān)的，因為。01-2-/-小鼠免于葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的影響[^1"0G.Andres,""/"J.Immunol.2000,164,6303]。一項研究已經(jīng)表明了MCP-1/CCR2相互作用的拮抗在治療牙槽炎中的潛在治療價值。當(dāng)使用針對大鼠MCP-1(JE)產(chǎn)生的抗體靜脈內(nèi)地治療患有IgA免疫復(fù)合物肺損傷的大鼠時，牙槽炎的癥狀被部分地減輕了[MichaelL.Jones，W"/.,J.Immunol.1992,149,2147]。MCP-1/CCR2在癌癥中也是相關(guān)的。當(dāng)帶有人類乳腺癌細(xì)胞的免疫缺陷小鼠用抗MCP-l抗體治療時，觀察到了肺部微轉(zhuǎn)移的抑制和存活的提高[RosalbaSalcedo,a/.,Blood2000,96,34-40]。特別地，如本發(fā)明人在PCTWO2004/080273中詳細(xì)描述的，MCP-l被指明在前列腺癌癥中。Restmosis是涉及MCP-l的又一種癥候。CCR2缺陷的小鼠顯示了股動脈損傷后內(nèi)膜面積和內(nèi)膜/中膜比例的降低(相對于野生型同窩)[MerceRoque,"a/.Arterioscler.Thromb.Vase.Biol.2002,22,554-559)。其他研究已經(jīng)提供了證據(jù)，MCP-l在以上未才是及的各種疾病狀態(tài)中被過量表達(dá)。這些報道提供了相關(guān)的證明，MCP-1拮抗劑可能是這些疾病的有用的治療劑。MCP-l已經(jīng)被證明在患有炎癥性腸病的患者的腸上皮細(xì)胞和腸粘膜中過表達(dá)[H.C.Remecker,W"/.，Gastroenterology1995,108,40;MichaelC.Grimm,da/.，J.Leukoc.Biol.1996,59,804]。兩項報道描述了患有誘導(dǎo)的腦外傷的大鼠MCP-l的量表達(dá)[丄S.Kmg,"a/.,J.Neuroimtmmol.1994，56,127;JoanW.Berman,""/.,J.Immunol.1996,156,3017]。MCP-l還顯示了在嚙齒動物心臟同種異體移植中的過量表達(dá)，暗示了MCP-l在移植動脈^^化的發(fā)病中的作用[MaryE.Russell，"a/.Proc.Natl.Acad.Sci.USA1993，90，6086]。已經(jīng)在患有特發(fā)性肺纖維化的患者的肺內(nèi)皮細(xì)月包中注意到MCP-l的過表達(dá)[HarryN.Antomades,e/1/"Proc.Natl.Acad.Sci.USA1992,89,5371]。類似地，在患有銀屑病的患者的皮膚中注意到MCP-1的過量表達(dá)[M.Deleuran,""/,J.Dermatol.Sci.1996,13,228,andR.Gillitzer,Wfl/"J.Invest.Dermatol.1993,101,127]。最后，新近的才艮道已經(jīng)顯示了，在患有HIV-1相關(guān)性癡呆的患者的腦和腦脊液中MCP-l被過量表達(dá)[AlfredoGarzmo-Demo,WO99/46991]。迄今報道的大多數(shù)趨化因子拮抗劑不是針對特定趨化因子的中和#元體才尤是小分子4吉#元劑[Howard""/.，TrendBiotechnol14:46-51(1996)]?？筂CP-l抗體已經(jīng)在如上所述的許多小鼠疾病模型中被有效地使用。然而，與使用抗體來拮抗趨化因子功能相關(guān)的主要難題是它們在慢性人類疾病中使用之前必需被人源化。此外，多種趨化因子結(jié)合和活化單個受體的能力促使了多種抗體策略的開發(fā)或使用交叉反應(yīng)性抗體以完全阻斷或防止病理狀況。在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中已經(jīng)報道了幾種趨化因子受體功能的小分子拮抗劑[White,JBiolChem273:10095-10098(1998);Hesseigesser,JBiolChem273:15687-15692(1998);Bright""/.,BioorgMedChemLett8:771-774(1998);Lapierre,26thNatlMedChemSymposium,June14-18，Richmond(Va.)5USA(1998);Forbes《B畫rgMedChemLett10:1803-18064(2000);Kato"a/.,WO97/24325;Shiotaa/.,WO97/44329;NayaWa/.,WO98/04554;TakedaIndustries,JP09-55572(1998);Schwender"a/.,WO98/02151;Hagmann"a/.,WO98/27815;Connor"a/.,WO98/06703;Wellington""/.，U.S.Pat.No.6,288,103]。然而，趨化因子受體拮抗劑的特異性意味著，以多種或冗余的趨化因子表達(dá)譜為特征的炎癥性失調(diào)將相對更難以通過這些試劑治療。因而，克服了上述局限性的用于治療CCR-2相關(guān)疾病的組合物及其使用方法，是廣泛公認(rèn)亟需的，并且將是高度有益的。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種包含異源氨基酸序列的分子，所述異源氨基酸序列結(jié)合到缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域的CCR2氨基酸序列，所述CCR2氨基酸序列能夠結(jié)合MCP-],并且其中所述分子是無免疫原性的。根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種分子，其包含附著于非蛋白質(zhì)部分的CCR2氨基酸序列，其中所述CCR2氨基酸序列能夠結(jié)合MCP-1,而且所述分子在受試者中是無免疫原性的。根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，提供了一種分子，其包含至少兩種CCR2氨基酸序列，每種都能夠結(jié)合MCP-l。根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供了一種包含標(biāo)簽的分子，所述標(biāo)簽附著于缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域的CCR2氨基酸序列，所述CCR2氨基酸序列能夠結(jié)合MCP-1。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，4是供了一種如SEQIDNO:14或15所列的分子。根據(jù)本發(fā)明的其他方面，提供了包含所述分子和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明的其他的方面，提供了包含特定分子和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，所述特定分子包含缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域并能夠結(jié)合MCP-1的CCR2氨基酸序列，所述藥物組合物是無免疫原性的。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了在有需要的受試者中治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病的方法，包括向所述受試者施用治療有效量的所述分子，從而治療所述受試者中MCP-1/CCR2相關(guān)疾病。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了所述分子在制備藥物中的用途，所述藥物被鑒定為治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了從生物樣品分離MCP-1的方法，所述方法包括(a)使所述生物樣品與權(quán)利要求4的分子接觸，從而MCP-1和權(quán)利要求4的分子形成復(fù)合物；和(b)分離所述復(fù)合物從而從所述生物樣品中分離MCP-1。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了在有需要的受試者中治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病的方法，包括向所述受試者施用治療有效量的分子，所述分子包含缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域并能夠結(jié)合MCP-1的CCR2氨基酸序列，從而在所述受試者中治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病。根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供了特定分子在制備藥物中的用途，所述特定分子包含缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域并能夠結(jié)合MCP-1的CCR2氨基酸序列，所述藥物被鑒定為用于治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病。根據(jù)如下所述的本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中進(jìn)一步的特征，所述異源氨基酸序列包含免疫球蛋白氨基酸序列。根據(jù)所描迷的優(yōu)選實施方式中進(jìn)一步的特征，所述缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域的CCR2氨基酸序列是如SEQIDNO:2中所示的。根據(jù)所描述的優(yōu)選實施方式中再進(jìn)一步的特征，所述MCP-1/CCR2相疾病選自由炎癥性疾病、壞死、動"永粥才羊石更化、癌癥、多發(fā)性石更化、斗分瘤、單核細(xì)胞性白血病、腎臟疾病(例如，血管球性腎炎)、hamman-rich綜合癥、子宮內(nèi)膜異位、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、細(xì)支氣管炎、譯喘、系統(tǒng)性紅斑狼掩、炎癥性腸病(例如，結(jié)腸炎)、牙槽炎、再狹窄、腦外傷、銀屑病、特發(fā)性肺纖維化和移植動脈硬化構(gòu)成的組。根據(jù)所描述的優(yōu)選實施方式中又進(jìn)一步的特征，所述標(biāo)簽是表位標(biāo)簽。根據(jù)所描述的優(yōu)選實施方式中又進(jìn)一步的特征，所述分子附著于固相支持物。根據(jù)所描述的優(yōu)選實施方式中又進(jìn)一步的特征，所述分子附著于非蛋白質(zhì)部分。根據(jù)所描述的優(yōu)選實施方式中又進(jìn)一步的特征，所述非蛋白質(zhì)部分選自由聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、笨乙烯馬來酐共聚物(SMA)以及二乙烯基醚與順丁烯二酸酐共聚物(DIVEMA)構(gòu)成的組。才艮據(jù)所描述的優(yōu)選實施方式中又進(jìn)受的載體被配制為用于腸胃外施用。才艮據(jù)所描述的優(yōu)選實施方式中又進(jìn)受的載體基本上是無免疫原性的。才艮據(jù)所描述的優(yōu)選實施方式中又進(jìn)受的載體包含脂氨基酸(lipoammeacid)。才艮據(jù)所描述的優(yōu)選實施方式中又進(jìn)受的載體包括碳水化物。才艮據(jù)所描述的優(yōu)選實施方式中又進(jìn)受的載體包括微球體。才艮據(jù)所描述的優(yōu)選實施方式中又進(jìn)受的載體包括脂質(zhì)體。才艮據(jù)所描述的優(yōu)選實施方式中又進(jìn)受的載體包括聚合物微球體。通過提供用于治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病的新的分子及其使用方法，本發(fā)明成功地克服了當(dāng)前已知的配置的缺點。除非另外定義，此處使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。雖然類似于或等同于在此描述的那些的方法和材料可以被用于本發(fā)明的實踐和測試，^f旦以下描述了適合的方法和材料。在矛盾的情況下，以本專利說明書(包步的特征，所述藥學(xué)上可接括定義)為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實施例僅是說明性的，而無意限制。附圖的簡要說明參考附圖，在此僅以舉例的方式描述本發(fā)明。現(xiàn)在詳細(xì)地具體參考附圖，要強(qiáng)調(diào)的是，所顯示的細(xì)節(jié)是通過實例的方式，目的僅是說明本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的說明性論述，為了提供被認(rèn)為是最有用的和易于理解本發(fā)明的原則和概念觀點的內(nèi)容而存在。對此來說，不進(jìn)行嘗試來顯示比基本理解本發(fā)明所必需的更詳細(xì)的本發(fā)明結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，附圖的說明使得本領(lǐng)域技術(shù)人員明白本發(fā)明的幾種形式可以如何在實踐中體現(xiàn)。圖la-b是顯示前列腺癌癥患者選擇性地發(fā)展針對MCP-1的高度顯著的自身抗體滴度的圖表。圖la——來自23位前列腺癌癥患者、患有良性前列腺肥大(BPH)的患者和10名對照受試者的人類血清，所有年齡匹配的對象(mails),被監(jiān)視針對以下13種趨化因子的自身抗體的可能的出現(xiàn)SDF-1(CXCL12,GenBankAccessionNo.NM199168)、M1F(GenBankAccessionNo.LI9686)、MIP-la(CCL3,GenBankAccessionNo.NM002983)、MEP-l卩(CCL4,GenBankAccessionNo.NM002984)、IL-8(CXCL8，GenBankAccessionNo.M2813)、IP-IO(CXCL10,GenBankAccessionNo.NM001565)、MIP-3a(CCL20,GenBankAccessionNo.BC020698)、MIP-3卩(CCL-19，GenBankAccessionNo.BC027968)、Lymphotactm(XCLl，GenBankAccessionNo.NM002995)、MIG(CXCL9,GenBankAccessionNo.NM002416)、RANTES(CCL5,GenBankAccessionNo.NM002985)、MCP-3(CCL7,GenBankAccessionNo.NM006273)和MCP-1(CCL2，GenBankAccessionNo.NM002982)。在大多數(shù)前列腺癌癥患者中觀察到針對僅一種上述趨化因子，MCP-1，的顯著的抗體滴度(p<0.01)。圖lb——在上述圖la中描述的每個臨床樣品中對MCP-1的Log2Ab滴度。約82%的前列腺癌癥患者(19/23)和僅約4.7%(1/21)患有BPH的患者顯示了對MCP-1的顯著(p<0.01)反應(yīng)(1og2Ab滴度〉10)。圖2是描繪編碼本發(fā)明的Ig-CCR2肽(Ig-E3)的表達(dá)構(gòu)建體的產(chǎn)生的示意圖。圖3是描繪CCR2的E3結(jié)構(gòu)域與MCP-1的特異性結(jié)合的柱形圖。圖4是描述人類CCR2(E3)-IgG抑制MCP-1誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞(ATCCAccessionNO.TIB-202)的遷移的能力的柱形圖。進(jìn)行了體外穿孔遷移分析。簡言之，將THP-1細(xì)胞(106個細(xì)胞/孔)添加到轉(zhuǎn)移孔平板的上室，CCL2(重組人類MCP-1,RHMCP-1;(20ng/ml)添加到下孔，其也補(bǔ)充有如圖所示的不同濃度的CCR2(E3)-IgG。在37。C孵育2小時之后，通過FACS對遷移的THP-1細(xì)胞計數(shù)。結(jié)構(gòu)顯示為三個副本的平均數(shù)土SE。圖5a-d是描繪在施用CCR2(E3)-IgG的細(xì)胞和對照(施用IgG的或PBS處理的)細(xì)胞之間所比較的原發(fā)肺瘤的發(fā)展和它的轉(zhuǎn)移性散布的圖表。圖5a-b是描繪當(dāng)與PC-3細(xì)胞的施用一同開始(圖5a)或在之后18天(圖5b)施用CCR2(E3)-IgG時，CCR2(E3)-IgG隨著時間降低腫瘤生長的能力的圖表。在所標(biāo)出的各個時間重復(fù)地測量來自施用CCR2(E3)-IgG(藍(lán)色表示)、施用同種型匹配的對照IgG(綠色表示)或施用PBS(褐色或黃色表示)的小鼠的腫瘤體積(mm3)。圖5c是顯示在PC3細(xì)胞施用后8天注射的CCR2(E3)-IgG的抗腫瘤活性的圖表。在所標(biāo)出的各個時間重復(fù)地測量來自施用PC-3細(xì)胞和CCR2(E3)-IgG(藍(lán)色表示)、施用同種型匹配的對照IgG(綠色表示)或PBS(粉色表示)的小鼠的腫瘤的體積(mm3)。這些結(jié)果證明了圖5a-b所示CCR2(E3)-IgG的預(yù)防和治療活性。圖5d是描繪與對照細(xì)胞比較、通過所標(biāo)明的CCR2(E3)-Ig對表達(dá)熒光素酶的PC-3細(xì)胞的骨和肺轉(zhuǎn)移的抑制作用的圖表。圖6a-f是顯示在肺瘤位點使用CCR2(E3)-Ig阻斷CCL-2完全地抑制VEGF產(chǎn)生的照片。顯示了使用CCR2(E3)-Ig(圖6a、d)、同種型匹配的對照IgG(圖6b、e)或PBS(對照細(xì)胞；圖6c、f)的治療。處死動物，取出腫瘤/組織。洗滌組織、固定并滲透化，通過免疫染色使用共焦顯微鏡檢測VEGF。在x10(附圖6a-c)或x40(附圖6d-f)放大率下顯示顯微圖。圖7是描述通過光密度測定的CCL2處理的PC3細(xì)胞的細(xì)胞遷移的柱形圖。用CCL2(MCP-1)、CCL2連同針對CCL2的抗體(MCP-l+抗MCP-1)、CCL2連同CCR2(E3)-IgG(MCP-1+CCR2(E3)-IgG)以及未被配體處理的對照細(xì)胞來處理PC3細(xì)胞。優(yōu)選實施方式的說明本發(fā)明是用于治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病例如癌癥的分子、包含所述分子的組合物以及使用所述分子的方法。參考附圖和附隨的說明可以更好地理解本發(fā)明的原理和操作。在詳細(xì)地解釋本發(fā)明的至少一個實施方式之前，要理解的是，本發(fā)明不將它的應(yīng)用限于以下說明所闡述的或通過實施例所例示的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能有其他的實施方式或者能以各種方式實踐和進(jìn)行。并且，要理解的是在此釆用的用語和術(shù)語是為了說明的目的而不應(yīng)認(rèn)為是限制性的。單核細(xì)胞化學(xué)吸引物劑蛋白(MCP)-l,也稱為CCL2,特異性地吸引單核細(xì)胞和記憶T細(xì)胞。它的表達(dá)出現(xiàn)于以細(xì)胞遷移為特征的多種疾病中，對于它在癌癥、心血管疾病和炎癥性疾病中的關(guān)4建作用，存在著相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)和遺傳學(xué)證據(jù)。盡管有密集的篩選，至今還沒有MCP-1/CCL2的受體CCR2的拮抗劑。當(dāng)還原本發(fā)明至實踐時，本發(fā)明人揭示了MCP-1對CCR2的結(jié)合是由CCR2的第三個細(xì)胞夕卜區(qū)域(E3)(GenBankAccessionNo.NP000639.1的氨基酸坐標(biāo)273-292)專有地介導(dǎo)的。這與DattaMannan禾口Stone的早先的凈艮告[Datta-MannanAndStone(2004)Biochemistry43:14602-11]形成鮮明對比，他們表明MCP-1與CCR2的結(jié)合取決于CCR2的N-末端結(jié)構(gòu)域(N-ter)和第三個細(xì)^^卜環(huán)體(E3)兩者。這些結(jié)果表明，通過大量地隔離MCP-1，包含CCR2的E3區(qū)域的肽可以用作抑制性試劑。因而，本發(fā)明設(shè)想包含CCR2E3結(jié)構(gòu)域并優(yōu)選缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域的任何CCR2氨基酸序列，以及包含所述CCR2氨基酸序列的組合物在治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病例如癌癥中的用途。重要地，本發(fā)明的組合物是無免疫原性的以實現(xiàn)最大的療效。因而，本發(fā)明設(shè)想，例如，在復(fù)合物中包含CCR2序列，其中所述CCR2序列附著于蛋白質(zhì)(例如，異源氨基酸序列)或非蛋白質(zhì)(例如，PEG)部分，它們每一種都能夠延長所述組合物在循環(huán)中的半衰期。因而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了包含與CCR2氨基酸序列結(jié)合的至少一種異源氨基酸序列的無免疫原性分子，所述CCR2氨基酸序列優(yōu)選地缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域(例如，翻譯的GenBankAccessionNo.NM—000647/NP—000638的氨基酸坐標(biāo)1-41,或GenBankAccessionNo.NM—000648/NP—000639的相應(yīng)氨基酸坐標(biāo))，所述CCR2氨基酸序列能夠結(jié)合MCP-1。如接下來的實施例部分所顯示的，包含新近揭示的MCP-1結(jié)合結(jié)構(gòu)域(E3-IgG)的本發(fā)明這個方面的嵌合分子，即使在腫瘤細(xì)胞施用長達(dá)18天之后，還抑制肺瘤發(fā)展。令人驚訝地，相同的嵌合分子甚至顯著地抑制了肺瘤向骨和肺組織的轉(zhuǎn)移?？偠灾?dāng)前的發(fā)現(xiàn)支持了本發(fā)明的分子在治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病例如癌癥中的用途。應(yīng)當(dāng)注意到，本發(fā)明這個方面的嵌合分子顯著地不同于WO97/31949中描述的那些，其教導(dǎo)了使用嵌合的E3(即，KLH-E3)肽來產(chǎn)生針對CCR2的E3區(qū)域的抗體，從而抑制CCR2受體的配體結(jié)合。本發(fā)明的無免疫原性肽被用于靶向CCR2的配體，MCP-l,從而抑制所述配體的受體結(jié)合。因此，本發(fā)明的分子容許精巧的治療控制和特異性，它們可以被容易地合成和施用，并且以高度的生物有效性為特征。在此使用時，與CCL2可互換使用的MCP-l,是指哺乳動物(例如，人類)MCP-1蛋白，例如在GenBankAccessionNos.NM—002982或NP一002973中列出的。在此使用時，術(shù)語"無免疫原性的"是指一種物質(zhì)，其在被施用該物質(zhì)的受試者中基本上不能產(chǎn)生免疫應(yīng)答。例如，在人體內(nèi)無免疫原性是指，在使本發(fā)明這方面的嵌合分子接觸人的適合組織時，在適合的潛伏期(例如，8到14天)之后在第二次施用所述嵌合分子時，、。在此使用時，:'CCR2氨基酸^列""是指具有對MCP-1的親和性結(jié)合的哺乳動物(例如，人類)趨化因子C-C受體2蛋白質(zhì)的肽部分。應(yīng)當(dāng)注意到，單個的CCR2氨基酸序列可以被包括在本發(fā)明的分子中，但是包括至少兩個CCR2氨基酸序列、每一個都能夠結(jié)合CCR2(優(yōu)選以高親和性，例如SEQIDNO:9)可能是優(yōu)選的。由于提高的親合力，這些多肽可以被用作MCP-1活性的強(qiáng)力抑制物，可以使用更低的劑量。在此使用時，"親和性結(jié)合"是指至少10-6M的最小KD值。在GenBankAccessionNos.NM—000647和NP—000639.1中提供了CCR2蛋白的實例。如所提及的，本發(fā)明這方面的CCR2優(yōu)選缺少N-末端結(jié)構(gòu)域，但是保留了E3結(jié)構(gòu)域(即，GenBankAccessionNo.NM—000647的氨基酸坐標(biāo)273-292，SEQIDNO:2)或其模擬物。在此使用時，術(shù)語"模擬物"當(dāng)涉及肽時是指分子結(jié)構(gòu)，其在與MCP-1的相互作用中充當(dāng)了本發(fā)明的肽的替代物[關(guān)于肽模擬物的綜述，參見Morgan"(1989)Ann.ReportsMed.Chem.24:243-252]。在此使用時，肽模擬物包括合成的結(jié)構(gòu)(已知的和尚未知的)，其可以或可以不含有氨基酸和/或肽鍵，但保持了肽配體的結(jié)構(gòu)和功能特征。以下進(jìn)一步描述了可以利用來產(chǎn)生模擬物的氨基酸的種類。術(shù)語"肽模擬物"還包括類肽和寡類肽，其是N-取代的氨基酸的肽或寡fi體[SimonW/,(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:9367-9371]。進(jìn)一步作為肽模擬物包括的是肽庫，其是被設(shè)計以具有給定氨基酸長度并代表與之相應(yīng)的所有可想像的氨基酸序列的肽的集合。以下描述了用于肽模擬物的產(chǎn)生的方法。包括SEQIDNO:2的氨基酸序列，并且可以由SEQIDNO:1所歹'J的核酸序列編碼。才艮據(jù)本發(fā)明的這個方面的另一個優(yōu)選實施方式，本發(fā)明的這個方面的分子是如SEQIDNO:14或15中所示的。在此使用時，術(shù)語"肽"涵蓋天然的肽(降解產(chǎn)物、合成性合成的肽或重組肽)以及如上文中提及的擬肽(一般地，合成性合成的肽)、以及是肽類似物的類肽和半類肽，其可能具有，例如，修飾，使得所述肽在體內(nèi)更為穩(wěn)定或更能透入細(xì)胞中。這種修飾包括，但不限于N末端修飾、C末端修飾、肽鍵修飾，包括但不限于，CH2-NH、CH2-S、CH2-SO、0=C-NH、CH2-0、CH2-CH2、S=C-NH、CH=CH或CF=CH，主干修飾以及殘基修飾。制備肽模擬化合物的方法是本領(lǐng)域公知的，例如，在QuantitativeDrugDesign,C.A.RamsdenGd.,Chapter17.2,F.ChoplmPergamonPress(]992)中詳細(xì)i兌明了，通過引用將其合并在此，如同完全在此列出一樣。以下提供了關(guān)于此方面的進(jìn)一步的細(xì)節(jié)。肽中的肽鍵(-CO-NH-)可以被例如N-曱基化的鍵(-N(CH3)-CO-)、酯鍵(-C(R)H-C-O-O隱C(R)-N陽)、酮亞曱基鍵(-CO-CH2-)、a-氮雜鍵(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任何烷基，例如曱基，carba鍵(-CH2-NH-)、鞋亞乙基鍵(-CH(OH)-CH2-)、硫胺鍵(畫CS-NH-)、烯雙鍵(-CH=CH-)、逆酰胺鍵(retroamide)(畫NH-CO陽)、肽衍生物(-N(R)-CH2-C0-),其中R是天然存在于碳原子上的"正常的"側(cè)鏈。這些修飾可以出現(xiàn)在肽鏈上的任何鍵上，甚至同時在幾個(2_3個)上。天然的芳香族氨基酸，Trp、Tyr和Phe可以被合成的非天然酸，例如苯基甘氨酸、TIC、naphthylelanme(Nol)、Phe的環(huán)甲基化的衍生物、Phe的卣化衍生物或鄰曱基-Tyr。除了上述的之外，本發(fā)明的肽還可以包括一個或多個修飾的氨基酸或一個或多個非氨基酸單體(例如，脂肪酸、復(fù)雜的碳水化物等等)。在說明書和以下的權(quán)利要求部分使用時，術(shù)語"氨基酸"被理解為包括20種天然產(chǎn)生的氨基酸；在體內(nèi)常常翻譯后修飾的那些氨基酸，包括，例如，羥脯氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸；和其他稀有的氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、羥基賴氨酸、異鎖鏈賴氨素、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸。此外，術(shù)語"氨基酸"包括D-和L-氨基酸。1)和非常規(guī)的或修飾的氨基酸(表2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>由于當(dāng)前的肽優(yōu)選在需要肽處于可溶形式的治療或診斷中使用，本發(fā)明的肽優(yōu)選包括一個或多個非天然的或天然的極性氨基酸，包括但不限于絲氨酸和蘇氨酸，由于它們的含羥基側(cè)鏈能夠提高肽的溶解度。本發(fā)明的肽優(yōu)選以線性形式利用，然而要理解的是，在環(huán)化不嚴(yán)重地影響肽性質(zhì)的情況下，也可以使用環(huán)狀形式的肽。如上文描述的，肽模擬物的產(chǎn)生可以使用各種方法實現(xiàn)，包括，例如展示技術(shù)。因而，本發(fā)明關(guān)注包含多種展示載體(例如，噬菌體、病毒或細(xì)菌)的展示庫，每一種展示了來自CCR2的E3(例如，SEQIDNO:2)的多肽序列的至少2個、至少3個、至少5個、至少7個、至少11個、至少15個連續(xù)氨基酸。構(gòu)建這種展示庫的方法是本領(lǐng)域7>知的。在例如YoungAC,"Thethree-dimensionalstructuresofapolysaccharidebindingantibodytoCryptococcusneoformansanditscomplexwithapeptidefromaphagedisplaylibrary:implicationsfortheidentificationofpeptidemimotopes"JMolBiol1997Dec12;274(4):622-34;GiebelLBe,a/."Screeningofcyclicpeptidephagelibrariesidentifiesligandsthatbindstreptavidmwithhighaffinities"Biochemistry1995Nov28;34(47):15430-5;DaviesELW/.,"Selectionofspecificphage-displayantibodiesusinglibrariesderivedfromchickenimmunoglobulingenes"JImmunolMethods1995Oct12;186(1):125-35;JonesCRTal."Currenttrendsinmolecularrecognitionandbioseparat薩"JChromatogrA1995Jul14;707(1):3-22;DengSJ"a/."Basisforselectionofimprovedcarbohydrate-bindingsingle-chainantibodiesfromsyntheticgenelibraries"ProcNatlAcadSciUSA1995May23;92(11):4992-6;以及DengSJ""Selectionofantibodysingle-chamvariablefragmentswithimprovedcarbohydratebindingbyphagedisplay"JBiolChem1994Apr1;269(13):9533-8中描述了這些方法，通過引用將它們合并在此。肽模擬物也可以使用計算生物學(xué)來揭示。可以利用對于顯示三維結(jié)構(gòu)才莫型有用的軟件程序，例如RIBBONS(Carson,M.,1997.MethodsmEnzymology277,25)、〇(Jones,TA."a/.,1991.ActaCrystallogr.A47,110)、DINO(DINO:VisualizmgStructuralBiology(2001)http:〃www.dino3d.org);和QUANTA、INSIGHT、SYBYL、MACROMODE、ICM、MOLMOL、RASMOL以及GRASP(在Kraulis,J.,1991.ApplCrystallogr.24,946中綜述)來模擬MCP-1和預(yù)期的肽模擬物之間的相互作用從而鑒定顯示了結(jié)合特定的MCP-1區(qū)域的最高可能性的肽。蛋白質(zhì)-肽相互作用的計算機(jī)建模已經(jīng)被成功地用于合理藥物設(shè)計，對于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見Lam"1994.Science263,380;WlodawerWa/"1993.AnnRevBiochem.62,543;Appelt,1993.PerspectivesinDrugDiscoveryandDesign1，23;Erickson,1993.PerspectivesmDrugDiscoveryandDesign1,109和MauroMJ.2002.JClmOncol.20,325-34。如所提及的，本發(fā)明的這個方面的嵌合分子包括異源的氨基酸序列。在此使用時，用語"異源氨基酸序列"是指不構(gòu)成CCR2氨基酸序列的一部分的無免疫原性氨基酸序列。這種序列優(yōu)選的為本發(fā)明的這個方面的分子賦予了溶解性，優(yōu)選的提高所述嵌合分子在血清中的半衰期。所述異源氨基酸序列一般定位于本發(fā)明的CCR2肽的氨基或羧基末端。如所提及的，至少一個異源氨基酸序列可以結(jié)合到本發(fā)明的CCR2氨基酸序列上。例如，至少一個CCR2氨基酸序列可以插入兩個異源序歹'j之間，如Hoogenboom(1991)Mol.Immunol.28:1027-1037所描述的。所述異源氨基酸序列可以通過任何肽或非肽的4建附著于所述CCR2氨基酸序列上。CCR2氨基酸序列對所述異源氨基酸序列的附著可以通過直接的共價結(jié)合(肽鍵或取代的肽鍵)或間接的結(jié)合例如通過使用具有功能基團(tuán)的接頭來實現(xiàn)。功能基團(tuán)包括但不限于，游離羧酸(C(=0)OH)、游離氨基(NH2)、酯基(C(=0)OR，其中R是烷基、環(huán)烷基或芳基)、酰鹵基團(tuán)(C(=0)A，其中A是氟化物、氯化物、溴化物或石典化物)、卣素(氟化物、氯化物、溴化物或碘化物)、羥基基團(tuán)(OH)、硫醇基團(tuán)(SH)、氰基(C^N)、游離C-氨基曱酸基團(tuán)(NR"-C(=0)-OR',其中每個R'和R"獨立地是氫、烷基、環(huán)烷基或芳基)?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明的這個方面使用的異源氨基酸序列的實例是免疫球蛋白序列，例如免疫球蛋白重量結(jié)構(gòu)域的鉸鏈和Fc區(qū)域(參見美國專利No.6,777，196)。本發(fā)明的這個方面的嵌合體中的免疫球蛋白部分可以從IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞型、IgA、IgE、IgD或IgM獲得，以下將進(jìn)一步討論。從與適合的免疫球蛋白恒定區(qū)序列(免疫粘附素)連接的受體序列構(gòu)建的嵌合體是本領(lǐng)域已知的。文獻(xiàn)中報道的免疫粘附素包括T細(xì)月包受體[Gascoigne""/"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:2936-2940(1987)]、CD4[Caponetal.，Nature337:525-531(1989);Traunecker""/"Nature,339:68-70(1989);Zettmeissle"/.,DNACellBiol.USA,9:347-353(1990);Byrn""/.,Nature,344:667-670(1990)];L-選擇蛋白(歸巢受體)[(WatsonJ.Cell.Biol.,110:2221-2229(1990);Watson""/.,Nature,349:164-167(1991)]、CD44[Aruffo""/.,Cell,61:1303-1313(19卯)]、CD28和B7(LmsleyW"/，J.Exp.Med.,173:721-730(1991)];CTLA-4[Lisley"a/.,丄Exp.Med.174:561-569(1991)];CD22[Stamenkovic"a/"Cell,66:1133-1144(1991)];TNF受體[Ashkenazi"Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10535-10539(1991);Lesslauer,Eur.J.Immunol.,27:2883-2886(1991);Peppele/1a/.,J.Exp.Med.,174:1483-1489(1991)];NP受體[Bennette,"/.,J.Biol.Chem.266:23060-23067(1991)]和IgE受體a[Ridgway""/,,J.Cell.Biol.,115:abstr.1448(1991)]的融合物。一般地，在這種融合物中，嵌合分子將保持至少功能上活性的免疫球蛋白重鏈的恒定區(qū)的鉸鏈和CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。融合物也可產(chǎn)生于恒定區(qū)的Fc部分的C-末端，或緊^接重鏈的CHI的N-末端或輕《連的相應(yīng)區(qū)域。在異源序列和CCR2氨基酸序列之間融合(接合)的確切位點不是關(guān)鍵的。特定的位點是本領(lǐng)域公知的，可以選擇以優(yōu)化本發(fā)明的這個方面的嵌合分子的生物學(xué)活性、分泌或結(jié)合特征(參見以下的實施例部分的實施例3)。雖然有可能將完整的重鏈恒定區(qū)結(jié)合到本發(fā)明的CCR2氨基酸序列，優(yōu)選的是融合較短的序列。例如，剛好在絞鏈區(qū)中木瓜蛋白酶切割位點上游開始的序列被用于融合物中，所述木瓜蛋白酶裂解位點化學(xué)上劃定了IgGFc;當(dāng)重鏈恒定區(qū)的第一個殘基為114時是殘基216，或其它免疫球蛋白的類似位點。在特別優(yōu)選的實施方式中，CCR2氨基酸序列被融合到IgGl、IgG2或IgG3重鏈的絞鏈區(qū)和CH2和CH3，或CH1、鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域(參見美國專利NO.6,777，196)。進(jìn)行融合的確切位點不是關(guān)鍵的，可以通過常規(guī)的實驗確定最佳位點。如所提及的，用于構(gòu)建本發(fā)明的這個方面的嵌合分子的免疫球蛋白序列可以來自IgG免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)。使用人類IgGl和IgG3免疫球蛋白序列是優(yōu)選的。使用IgGl的主要優(yōu)點是IgGl可以在固定化的蛋白A上有效地純化。相比之下，IgG3的純化需要蛋白G，一種顯然較不方便的介質(zhì)。然而，當(dāng)選擇Ig融合配偶體用于特定的嵌合體構(gòu)建時，應(yīng)當(dāng)考慮免疫球蛋白的其他結(jié)構(gòu)和功能部分。例如，IgG3鉸鏈?zhǔn)歉L和更柔性的，從而它可以適應(yīng)更大的CCR2氨基酸序列，而其與IgGl融合時可能不折疊或不能正確地起作用。另一種考慮可能是化合價；IgG是二價的同二聚體，而諸如IgA和IgM的Ig亞型可以分別產(chǎn)生基本的Ig同二聚體單位的二聚或五聚結(jié)構(gòu)。在選擇本發(fā)明的這個方面的嵌合分子的免疫球蛋白部分時的其他考慮在美國專利NO.6,77,196中描述了。因而，本發(fā)明的這個方面的分子可以包括異源氨基酸序列，如上所述。作為上文提及的補(bǔ)充或選擇，本發(fā)明的CCR2氨基酸序列(能夠結(jié)合MCP-1)可以附著于非蛋白質(zhì)部分，選擇在受試者中為無免疫原性的這種分子。這種分子是高度穩(wěn)定的(可能由于非蛋白質(zhì)部分賦予的位阻而對體內(nèi)蛋白水解活性有抗性)，并且可以使用常用的固相合成方法來生產(chǎn)，這是便宜的和高效的，下文中進(jìn)一步說明。然而，要理解的是，仍然可以使用重組技術(shù)，從而借此重組肽產(chǎn)物經(jīng)歷體外修飾(例如，下文進(jìn)一步描述的PEG化)。如所提及的，CCR2氨基酸序列附著于非蛋白質(zhì)部分。如在此使用的用語"非蛋白質(zhì)部分"是指附著于上述CCR2氨基酸序列的、不包括氨基酸(肽鍵)的分子。根據(jù)當(dāng)前優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的這個方面的非蛋白質(zhì)部分是聚合物或共聚物(合成的或天然的)。本發(fā)明的非蛋白質(zhì)部分的非限制性實例包括聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、二乙烯醚和順丁烯二酸酐共聚物(DIVEMA;參見，移寸^口，KanedaY,e/a/.,1997,Biochem.Biophys.Res.Commun.239:160-5)以及苯乙烯馬來酐共聚物(SMA;參見例如，MuY,"a/.,1999,BiochemBiophysResCommun.255:75-9)。這種非蛋白質(zhì)部分的生物結(jié)合為CCR2氨基酸序列賦予了穩(wěn)定性(例如，對抗蛋白酶活性)和/或溶解性(例如，在生物液體，例如血液、胃液內(nèi))，而保持了它的生物學(xué)活性并延長了它的半衰期。在表現(xiàn)出短的半衰期和血液的快速清除的治療性蛋白質(zhì)的情況下，生物結(jié)合是特別有益的。生物結(jié)合的蛋白質(zhì)在血漿中提高的半衰期是來自蛋白質(zhì)結(jié)合物的增加的大小(其限制了它們的腎小球濾過作用)以及由于聚合物位阻而降低的蛋白水解作用。一般地，每個肽附著的聚合物鏈越多，半衰期延長越大。然而，采取方法來不降低本發(fā)明的CCR2氨基酸序列的特定活性(即，MCP-1結(jié)合)。CCR2氨基酸序列與PEG的生物結(jié)合(即，PEG化)可以使用PEG衍生物來實現(xiàn)，所述PEG衍生物例如PEG羧酸的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酉旨、單曱氧基PEG2-NHS、羧曱基化的PEG的琥珀酰亞胺基酯(SCM-PEG)、PEG的笨三唑石炭酸酯書f生物、PEG的縮水甘油醚、PEG對硝基苯基碳酸酯(PEG-NPC，例如曱氧基PEG-NPC)、PEG酪、PEG-正吡咬基-二硫化物、羰基二咪唑基(carbonyldimidazol)-活化的PEGs、PEG-硫醇、PEG-馬來酰亞胺。這些PEG衍生物是以各種分子量商業(yè)上可獲4尋的[參見，例i口Catalog,PolyethyleneGlycolandDerivatives,2000(ShearwaterPolymers,Inc.，Huntsvlle,Ala.)]。如果希望，許多上述衍生物是可以以單功能的單曱氧基PEG(mPEG)形式獲得的。一般地，添加到本發(fā)明的CCR2氨基酸序列的PEG應(yīng)當(dāng)從分子量(MW)數(shù)百道爾頓到約100kDa(例如，在3-30kDa之間)?？梢允褂酶驧W的PEG,但可能引起PEG化的肽的產(chǎn)量的一些損失。也應(yīng)當(dāng)監(jiān)視較大的PEG分子的純度，因為難以獲得象較低分子量PEG可獲得的那樣高純度的較高分子量PEG。優(yōu)選的是使用至少85%純度、更優(yōu)選的至少90%純度、95%純度或更高純度的PEG。在例如Hermanson,BioconjugateTechniques,AcademicPressSanDiego，Calif.(1996),atChapter15andmZalipsky""/.,"SuccimmidylCarbonatesofPolyethyleneGlycol,"mDunnandOttenbrite,eds.，PolymericDrugsandDrugDeliverySystems,AmericanChemicalSociety,Washington,D.C.(1991)中進(jìn)一步討論了分子的PEG化。方便地，PEG可以通過位點特異性誘變附著于CCR2氨基酸序列的選定位置，只要保持了結(jié)合物的活性(即，MCP-1結(jié)合)。例如，在SEQIDNO:1所列CCR2氨基酸序列的5位的半胱氨酸殘基可以是PEG化的耙點。作為補(bǔ)充或選4奪，其他半胱氨酸殘基可以一皮添加到CCR2氨基酸序列(例如，在N-末端或C-末端)以借此充當(dāng)PEG化的靶點?？梢赃M(jìn)行計算分析來選擇誘變而不損害活性的優(yōu)選的位置。可以采用活化的PEG的各種結(jié)合化學(xué)作用，活化的PEG例如PEG-馬來酰亞胺、PEG-乙烯砜(VS)、PEG-丙烯酸酯(AC)、PEG-正吡啶基二硫化物。制備活化的PEG分子的方法是本領(lǐng)域已知的。例如，PEG-VS可以在氬氣下通過PEG-OH的二氯甲烷(DCM)溶液與NaH反應(yīng)，然后與二乙烯砜反應(yīng)(摩爾比OH1:NaH5:二乙烯基砜50，以0.2克PEG/mLDCM)來制備。PEG-AC可以在氬氣下通過PEG-OH的DCM溶液與丙烯酰氯和三乙胺反應(yīng)(摩爾比OHl:丙烯酰氯1.5:三乙胺2，0.2克PEG/mLDCM)來制備。這些化學(xué)基團(tuán)可以附著于線性化的、2臂、4臂或8臂PEG分子。雖然結(jié)合到半胱氨酸殘基是可以借助來PEG化本發(fā)明的CCR2氨基酸的一種便利的方法，如果希望也可以使用其他的殘基。例如，乙酸酐可以用于與NH2和SH基團(tuán)反應(yīng)，而不是COOH、S--S或-SCHg基團(tuán)，而過氧化氳可以用于與-SH和-SCH3基團(tuán)反應(yīng)，而不是NH2。反應(yīng)可以在適合于與所述肽中期望的殘基結(jié)合的條件下采用利用了公知的反應(yīng)性的化學(xué)作用來進(jìn)行。對于本發(fā)明的CCR2氨基酸序列與PVP的生物結(jié)合，借助于4，4'-偶氮雙(4-氰戊酸)作為基團(tuán)起始劑以及3-巰基丙酸作為鏈轉(zhuǎn)移劑，通過在二甲基甲酰胺中的游離基聚合來從N-乙烯基-2-吡咯烷酮合成帶有末端COOH-的PVP。產(chǎn)生的具有Mr6,000平均分子量的PVP可以通過高性能液相色譜分離和純化，合成的PVP的末端COOH基團(tuán)通過N-羥基琥珀酰亞胺/二環(huán)己基碳二亞胺法來活化?；旧先缤ㄟ^引用合并在jt匕的HaruhikoKamada,"/.,2000,CancerResearch60:6416-6420中所描述的，CCR2氨基酸序列與60倍摩爾過量的活化的PVP反應(yīng)，用氨基caploic酸(相對于活化的PVP5倍摩爾過量)終止反應(yīng)。使用例如高性能液相色譜(HPLC)來分離、純化和鑒定產(chǎn)生的結(jié)合的CCR2分子(例如，PEG化的或PVP結(jié)合的CCR2)。此外，與其受體(例如CCR2)的結(jié)合特異性，基本上如對于其他趨化因子所描述的[例如，MCP-la，參見，例如HesselgesserJ,1998(同上)，通過引用將其完全合并在此]。本發(fā)明的這個方面的分子可以是生物化學(xué)合成的，例如使用標(biāo)準(zhǔn)的固相技術(shù)合成的。這些方法包括排阻固相合成、部分固相合成法、片段縮合和經(jīng)典的溶液合成。當(dāng)肽相對短(即，10kDa)時和/或當(dāng)它不能通過重組技術(shù)產(chǎn)生(即，不由核酸序列編碼，例如下文進(jìn)一步描述的"標(biāo)簽")并由此涉及不同的化學(xué)作用時，優(yōu)選的使用這些方法，固相肽合成步驟是本領(lǐng)域7^知的，由JohnMorrowStewartandJamsDillahaYoung,SolidPhasePeptideSyntheses(2ndEd"PierceChemicalCompany,1984)進(jìn)一步描述了。合成的肽可以通過制備高效液相層析法[CreightonT.(19")■Proteins,structuresandmolecularprinciples.WHFreemanandCo.N.Y.]來純化，其組成可以通過氨基酸測序來確i人。在期望大量本發(fā)明肽的情況下，本發(fā)明的肽可以使用例如由Bitter""/.,(1987)MethodsinEnzymol.153:516-544，Studier"a/.(1990)MethodsmEnzymol.185:60-89,Brisson"a/.(1984)Nature310:511-514,TakamatsuWa/.(1987)EMBOJ.6:307-311,CoruzziW(1984)EMBOJ.3:1671-1680以及Brogli"a/.,(1984)Science224:838-843,Gurley"a/.(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565andWe'ssbach&Weissbach,1988,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademicPress,NY,SectionVIII,pp421-463所描述的重組技術(shù)來產(chǎn)生。筒言之，將表達(dá)構(gòu)建體(即，表達(dá)載體)導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，所述表達(dá)構(gòu)建體包括分離的多核苷酸(即，從其天然產(chǎn)生來源分離的，例如SEQIDNO:10)，所述多核苷酸包含位于調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)錄控制之下的編碼本發(fā)明CCR2(任選地與編碼異源氨基酸序列的核酸序列按讀碼同框融合)的核酸序列。例如，編碼本發(fā)明的CCR2肽的核酸序列(例如，SEQIDNO:1)同框連接到免疫球蛋白cDNA序列(例如，SEQIDNO:3和5)。要理解的是，也可以使用基因組免疫球蛋白片段的連接。在這種情況下，融合需要存在用于表達(dá)的免疫球蛋白調(diào)節(jié)序列。編碼IgG重鏈恒cDNA庫分離，通過雜交或通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。編碼CCR2氨基酸序列和免疫球蛋白的核酸序列可以串聯(lián)地連接到表達(dá)構(gòu)建體(載體)中，其指導(dǎo)在選定的宿主細(xì)胞中的有效表達(dá)，以下進(jìn)一步說明。對于在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)，可以使用基于pRK5的載體[Schall""/.，Cell,61:361-370(1990)]和基于CDM8的載體[Seed,Nature,329:840(1989)]。確切的4妄點可以通過使用寡核苷酸指導(dǎo)的秀變[Zoller"《NucleicAcidsRes.,10:6487(1982);Capon"a/,,Nature,337:525-531(1989)]在設(shè)計的接點密碼子之間除去額夕卜的序列來創(chuàng)建?？梢允褂煤铣傻墓押塑账?，其中每一半與期望的接點兩側(cè)的序列互補(bǔ)；理想地，這些寡核苷酸是11到48mer。做為選擇，PCR技術(shù)可以用于與適合的載體同框地連接分子的兩個部分。將表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的，包括電穿孔、脂轉(zhuǎn)染和化學(xué)轉(zhuǎn)染(例如，磷酸鈣)。還參見隨后的實施例部分的實施例2。將"轉(zhuǎn)化的"細(xì)胞在適合的條件下培養(yǎng)，其容許由所述核酸序列編碼的嵌合分子的表達(dá)。在預(yù)定的時間之后，從所述細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物回收表達(dá)的嵌合分子，根據(jù)重組多肽的最終用途進(jìn)行純化。取決于使用的宿主/載體系統(tǒng)，許多適合的的轉(zhuǎn)錄和翻i奪元件，包括組成型和可誘導(dǎo)的啟動子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件、轉(zhuǎn)錄終止子等等，可以用于表達(dá)載體中[參見，如J^口Bitter""/.，(1987)MethodsmEnzymol.153:516-544]。除了含有用于插入的編碼序列[編碼嵌合體]的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件之外，本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體也可以包括被設(shè)計來優(yōu)化表達(dá)的融合蛋白的穩(wěn)定性、生產(chǎn)、純度、產(chǎn)量或毒性的序列。編碼序列。這些包括但不限于，微生物，例如用含有嵌合體編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；用含有嵌合體編碼序列的重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；用含有嵌合體編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV;煙草花葉病毒，TMV)感染的或用重組質(zhì)粒表達(dá)載體例如Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)。哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)是優(yōu)選地用于表達(dá)本發(fā)明的嵌合體。用于分子表達(dá)的宿主細(xì)胞系的選擇主要取決于表達(dá)載體。真核表達(dá)系統(tǒng)是優(yōu)選的(例如，哺乳動物和昆蟲)，因為它們?nèi)菰S翻-斧后的修飾(例如，糖基化)。另一種考慮是所需要的蛋白質(zhì)的量。毫克量通?？梢酝ㄟ^瞬時轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生。例如，腺病毒EIA轉(zhuǎn)化的293人類胚腎細(xì)胞系可以用基于pRK5的載體通過磷酸鈣方法改良法來瞬時轉(zhuǎn)染以容許有效的表達(dá)?；贑DM8的載體可以用于通過DEAE-葡聚糖法來轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞(AruffoCell，61:1303-1313(1990);ZettmeisslDNACellBiol.US,9:347-353(1990))。如果希望更大量的蛋白質(zhì)，可以在宿主細(xì)胞系的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染之后表達(dá)分子(參見，例如實施例小節(jié)的實施例2)。要理解的是，分子的N-末端的疏水性前導(dǎo)序列的存在將確保轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對分子的加工和分泌。要理解的是，可以優(yōu)選的使用細(xì)菌或酵母宿主系統(tǒng)來降低生產(chǎn)成本。然而，由于細(xì)菌宿主系統(tǒng)缺少蛋白質(zhì)糖基化機(jī)制，生產(chǎn)之后的糖基化可能是需要的。在任何情況下，在有效的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其容許大量的重組多肽的表達(dá)。有效的培養(yǎng)條件包括，但不限于，有效的培養(yǎng)基、生物反應(yīng)器、溫度、pH值和允許蛋白質(zhì)生產(chǎn)的氧條件。有效的培養(yǎng)基是指任何培養(yǎng)基，在其中培養(yǎng)細(xì)胞來產(chǎn)生本發(fā)明的重組嵌合分子。這種培養(yǎng)基一般包括具有可同化碳、氮和磷酸鹽源，以及合適的鹽、礦物質(zhì)、金屬和其他營養(yǎng)物例如維生素的水溶液。本發(fā)明的細(xì)胞可以在常規(guī)的發(fā)酵生物反應(yīng)器、搖瓶、試管、微滴定平皿和陪氏平皿中培養(yǎng)。培養(yǎng)可以在適合于重組細(xì)胞的溫度、pH值和氧含量下進(jìn)4于。這些培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的專門技能之內(nèi)的。取決于用于生產(chǎn)的載體和宿主系統(tǒng)，產(chǎn)生的本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以保留在重組細(xì)胞之內(nèi)、分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中、分泌到兩層細(xì)胞膜的間隔中，例如E.coli中的周質(zhì)間隙中；或保留在細(xì)胞或病毒膜的外表面上。在培養(yǎng)預(yù)定時間之后，進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的回收。用語"回收重組蛋白質(zhì)"是指收集含有蛋白質(zhì)的完整的發(fā)酵培養(yǎng)基，并且不必暗指其他的分離或純化步驟。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以使用各種標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化技術(shù)來純化，例如但不限于，親和層析、離子交換層析、過濾、電泳、疏水性相互作用層析、凝膠過濾層析、反相層析、伴刀豆凝集素A層析、層析聚焦和差異溶解。本發(fā)明的分子優(yōu)選的以"基本上純的"形式獲得。如在此使用的，"基本上純的"是指容許所述蛋白質(zhì)在以下描述的各種應(yīng)用中有效使用的純度。包含免疫球蛋白氨基酸序列的嵌合分子可以通過親和層析方便地純化。蛋白A作為親和配體的適用性取決于在嵌合體中使用的免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型?？梢允褂玫鞍譇來純化基于人類yl、或了4重4連的嵌合分子[Lmdmark""/.,丄Immunol.Meth.,62:1-13(1983)]。蛋白G優(yōu)選地用于所有的小鼠同種型和用于人類y3[Guss""/，EMBOJ.,5:1567-1575(1986)]。親和配體所附著的固相支持物最常見的是瓊脂糖，但其他固相支持物也是可用的。與瓊脂糖可以實現(xiàn)的相比，機(jī)械穩(wěn)定的固相支持物，例如受控的孔隙玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯容許更快的流速和更短的處理時間。將嵌合分子與蛋白A或G親和柱結(jié)合的條件完全由Fc結(jié)構(gòu)域的特征，即它的種類和同種型來確定。一般地，當(dāng)選擇了適合的配體時，直接從未條件化的培養(yǎng)液發(fā)生有效的結(jié)合。本發(fā)明的這個方面的嵌合分子一個區(qū)別特征是，對于人類yl分子，對蛋白A的結(jié)合能力相對于相同的Fc型的抗體有些減弱。在含有溫和的離液鹽的酸性pH值(在3.0或3.0以上)或在中性pH值緩沖液中，結(jié)合的本發(fā)明的這個方面的嵌合分子可以被有效地洗脫。這種親和層析步驟可以產(chǎn)生>95%純度的嵌合分子制備物。醫(yī)學(xué)級純度是治療性應(yīng)用必需的。本領(lǐng)域已知的其他方法可以用于替代或補(bǔ)充在蛋白A或G上的親和層析來純化包括免疫球蛋白部分的嵌合分子。這種嵌合分子在親硫凝膠層析[Hutchens""/"Anal.Biochem.,159:217-226(1986)]和固定的金屬螯合物層析[Al-Mashikhie"/.,J.DairySci.,71:1756-1763(1988)]中的表現(xiàn)類似于抗體。然而，與抗體相比，它們對離子交換柱的表現(xiàn)不僅由它們的等電點決定，還由可能由由于它們的嵌合性質(zhì)而存在于分子中的電荷偶極決定。要理解的是，本發(fā)明的分子可以被用于結(jié)合任何配體，所述配體例如通過E3結(jié)構(gòu)域來結(jié)合CCR2。這些可以包括CCL7、CCL8和CCL13[D'Ambrosi。(2003)J.Immunol.Methods273:3-13]。本發(fā)明的這個方面的分子可以用于治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病。因而，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了在有需要的受試者中治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病的方法。所述方法包括向所述受試者施用治療有效量的本發(fā)明的分子，從而在所述受試者中治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病。在此使用時，術(shù)語"受試者"是指哺乳動物，優(yōu)選人類受試者。在此使用時，術(shù)語"治療"是指防止、治愈、逆轉(zhuǎn)、減弱、減輕、最小化、抑制或停止MCP-1/CCR2相關(guān)疾病的有害影響。在此使用時，用語"MCP-1/CCR2相關(guān)疾病"是指發(fā)作或進(jìn)展取決于MCP-1和其受體CCR2間的相互作用的疾病。動脈粥樣硬化、癌癥(例如，前列腺癌、乳房癌、乳腺癌、成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、食道癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤)、多發(fā)性石更化、粉瘤、單核細(xì)胞性白血病、腎臟疾病(例如，血管球性腎炎)、hamman-nch綜合癥、子宮內(nèi)膜異位、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、細(xì)支氣管炎、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病(例如，結(jié)腸炎)、牙槽炎、再狹窄、腦外傷、銀屑病、特發(fā)性肺纖維化和移植動脈硬化構(gòu)成的組。本發(fā)明的分子可以直接地或在藥物組合物中施用給受試者，在所述藥物組合物中它與適合的載體或W武形劑混合。在此使用時，"藥物組合物"是指一種或多種在此描述的活性成分與其他化學(xué)成分例如生理學(xué)適合的載體和賦形劑的制品。藥物組合物的目的是促進(jìn)化合物向有機(jī)體的施用。優(yōu)選的，所述藥物組合物是無免疫原性的。在此使用時，術(shù)語"活性成分"是指本發(fā)明的分子責(zé)任產(chǎn)生預(yù)期的生物學(xué)效果。下文中，可互換使用的用語"生理學(xué)上可接受的載體"和"藥學(xué)上可接受的載體"是指不對有機(jī)體引起的顯著刺激以及不消除施用的化合物的生物學(xué)活性和性質(zhì)的載體或稀釋劑。佐劑包括在這些用語中。因而，例如，本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的載體可以包括脂氨基酸。做為選擇，本發(fā)明使用的藥學(xué)上可接受的載體可以包括包埋材料，例如多元醇(即，碳水化物)。適合于用作賦形劑的碳水化物的非限制性實例包括麥芽糊精(例如，GlucidexRoquette)、海藻糖(例如，TrehaloseMerck)、纖維二糖、葡萄糖、果糖、麥芽酮糖、異麥芽酮糖、乳果糖、麥芽糖、龍膽二糖、乳糖、異麥芽糖、麥芽糖醇(例如，MaltisorbRoquette)、乳辟唐醇、赤薛醇、異麥芽酉同斗唐醇(palatimtol)、木糖醇、甘露醇、山梨醇、半乳糖醇和核糖醇、蔗糖、棉子糖、龍膽糖、車前糖、毛蕊糖、水蘇糖、松三糖、葡聚糖和環(huán)己六醇。然而做為選擇，本發(fā)明使用的藥學(xué)上可接受的載體是適合于口服施用的孩史球體。例如，農(nóng)義球體可以包括在胃中的pH值水平(例如，低于4的pH值水平)下對溶解或酸降解有抗性的有機(jī)材料的水不溶性基質(zhì)，基本上如Vaghefi等人的美國專利No.6,849,271所描述的，通過引用將其合并在此。這種有機(jī)基質(zhì)材料可以是，例如，甘油三酯、氪化植物油、蠟或蠟的混合物、聚烷氧基烷基醚、聚烷氧基烷基酯和水不溶性的部分降解的蛋白質(zhì)。要理解的是，所述生物結(jié)合的聚合物(例如，本發(fā)明的PEG化的CCR2肽)可以用在藥學(xué)上可接受的載體中并作為其一部分，因而充當(dāng)用于遞送CCR2氨基酸序列的載體分子，而同時充當(dāng)遞送載體的成分。這種雙重用途的優(yōu)選的實施方式是脂質(zhì)體載體，例如，PEG結(jié)合的脂質(zhì)體，如例如George等人的美國專利申請No.20030186869中所描述的，通過引用將其完全合并在此。在此，術(shù)語"賦形劑"是指添加到藥物組合物中來進(jìn)一步促進(jìn)活性成分的施用的惰性物質(zhì)。賦形劑的非限定性實例包括碳酸鈣、磷酸4丐、各種糖類和淀粉種類、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。酉己制和施用藥物的#支術(shù)可以最新X反本的"Remington'sPharmaceuticalSciences,"MackPublishingCo.,Easton,PA中找到，通過引用將其完全合并在此。適合的施用途徑可包括例如，口服、直腸的、穿粘膜的，特別是經(jīng)鼻、腸的或胃腸外的遞送，包括肌肉內(nèi)的、皮下的和髓內(nèi)的注射，以及鞘內(nèi)的、直接心室內(nèi)的、靜脈的、腹膜內(nèi)的、鼻內(nèi)的或眼球內(nèi)注射。作為選擇，人們可以以局部而不是全身性方式來施用藥物組合物，例如，直接將藥物組合物注射進(jìn)患者的組織區(qū)域。本發(fā)明的藥物組合物可以通過本領(lǐng)域7>知的過程，例如通過常夫見的混合、溶解、?；?、制成糖衣、研磨、乳化、密封、捕集或凍千過程來制備。因而本發(fā)明的藥物組合物可以使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體按常規(guī)的方式來配制，所述載體包括便于將活性成分加工成可以藥學(xué)上使用的制品的賦形劑和輔助劑。適當(dāng)?shù)呐浞饺Q于給藥途徑的選擇。對于注射，可將藥物組合物的活性成分配制在水溶液中，優(yōu)選的在生理學(xué)相容的緩沖液例如Hanks'溶液、Rmger's溶液或生理鹽水li沖液中。對于穿粘膜施用，將適合于需透過的障礙物的滲透劑用在配方中。這種滲透劑是本領(lǐng)域公知的。對于口力良施用，所述藥物組合物可以通過卩吏活性化合物與本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體混合來容易地配制。這些載體使得所述藥物組合物能被配制為片劑、丸劑、錠劑、膠嚢、液體、凝膠劑、糖漿、漿液、懸浮液等等，用于由患者口服攝取?？诜褂玫乃幚韺W(xué)制品可以在添加所希望的輔助劑之后，使用固體賦形劑、任選的研磨所述產(chǎn)生的混合物、以及加工農(nóng)么粒的混合物以獲得片劑或糖衣丸核，來制備。特別地，適合的賦形劑是填充物，例如糖類，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制品，例如玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍樹膠、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素和碳酰胺纖維素鈉；和/或生理學(xué)上可接受的聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果希望，可以添加崩解劑，例如交聯(lián)的聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂或藻酸或其鹽，例如海藻酸鈉。錠劑核心提供有適合的包衣。為了這個目的，可以使用濃縮的糖溶液，其可以任選含有阿拉伯樹膠、滑石粉、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羧乙烯凝膠、聚乙二醇、二氧化鈦、漆溶液和適合的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。染料或色素可以添加到所述片劑或糖衣丸包衣中用于鑒別或表征不同的活性化合物劑量組合?？梢钥诜褂玫乃幬锝M合物包括由明力交制成的push-fit力史嚢，以及由明膠和成形劑，例如甘油或山梨醇制成的軟的密封的膠嚢。push-fit膠嚢可以含有與填料例如乳糖、粘合劑例如淀粉、潤滑劑例如滑石粉或硬脂酸鎂以及任選的穩(wěn)定劑混合的活性成分。在軟膠嚢中，活性成分可以溶解或懸浮在適合的液體中，例如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇。此外，可以添加穩(wěn)定劑。用于口服施用的所有制劑應(yīng)當(dāng)是適合于所選給藥途徑的劑量。對于口腔施用，所述組合物可采用按常井見方式配制的片劑、錠劑的形式。對于吸入施用，使用適合的推進(jìn)劑，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟曱烷或二氧化碳，以氣溶膠噴霧呈現(xiàn)的形式從密封的包裝物或噴霧器方便地遞送根據(jù)本發(fā)明使用的活性成分。對于加壓的氣霧劑來說，劑量可以通過提供遞送計量量的閥門來確定。例如，在分配器中使用的明膠的膠嚢和藥筒可以配制為含有化合物的粉末混合物和適當(dāng)?shù)姆勰┗鶆?，例如乳糖或淀粉。在此描述的藥物組合物可以配制為通過注射用于腸胃外施用，例如，通過彈丸注射(bolusmjection)或連續(xù)的輸注。用于注射的制劑可以以單位劑型存在，例如，在任選地帶有添加的防腐劑的安魯瓦瓶或多劑量容器中。所述組合物可以是在油或水賦形劑中懸浮液、溶液或乳劑的形式，可以含有配方試劑，例如懸浮、穩(wěn)定和/或分散試劑。用于腸胃外施用的藥物組合物包括水可溶形式的活性制品的水溶液。另外，活性成分的懸浮液可以制備為適合的油性或基于水的注射懸浮液。適合的親油性溶劑或賦形劑包括脂肪油，例如芝麻油，或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可以含有提高懸浮液的粘度的物質(zhì)，例如羧甲基纖維素鈉鹽、山梨醇或葡聚糖。任選地，懸浮液也可以含有適合的穩(wěn)定劑或提高活性成分的溶解性以允許制備高濃度溶液的試劑。做為選擇，活性成分可以是粉未形式，用于在使用前與適合的賦形劑，例如，無菌的無熱原的基于水的溶液來構(gòu)建。通過使用諸如可可脂或其他甘油酯的常規(guī)栓劑基劑，本發(fā)明的藥物組合物也可以一皮配制為直腸的組合物，例如一全劑或滯留灌腸劑，。適合于在本發(fā)明的上下文中使用的藥物組合物包括一些組合物，其中以有效量包含活性成分來實現(xiàn)預(yù)期的目的。更具體地，"治療有效量，，是指有效防止、減輕或改善失調(diào)(例如，缺血)的癥狀或延長接受治療的受試者的存活的活性成分(例如，核酸或構(gòu)建體)的量。治療有效量的確定處于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)，特別是考慮在此提供的詳細(xì)公開的情況下。對于用于本發(fā)明的方法任何制品，可以最初從體外和細(xì)胞培養(yǎng)分析來估計劑量或治療有效量。例如，可以在動物模型中配制劑量來實現(xiàn)期望的濃度或滴度。這種信息可用于更精確地測定人類中有用的劑曰里。在此描述的活性成分的毒性和療效可以通過標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)步驟在體外、在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)?瞼動物中確定。從這些體外和細(xì)胞培養(yǎng)分析獲得的數(shù)據(jù)可被用于配制用于人類的劑量范圍。取決于采用的劑型和使用的給藥途徑，劑量可以變動?？梢杂瑟毩⒌尼t(yī)師#4居患者的狀況選擇確切的制劑、給藥途徑和劑量。(參見，例如Fmgl,E.(1975),"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics,"Ch.1,p.l.)可以分別地調(diào)節(jié)給藥數(shù)量和施用間隔來提供足夠的活性成分血漿或腦水平來誘導(dǎo)或抑制生物效應(yīng)(即，最低有效濃度，MEC)。MEC將隨每種制品變化，但可以從體外數(shù)據(jù)來估計。實現(xiàn)MEC所必需的劑量將取決于個體特征和給藥途徑。可以使用檢測分析來確定血漿濃度。取決于要治療的狀況的嚴(yán)重度和反應(yīng)性，給藥可以是單次或多次施用，療程持續(xù)從幾天到幾個星期，或直到實現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的減弱。毫無疑問，要施用的組合物的量將取決于待治療的受試者、痛苦的嚴(yán)重度、施用的方式和處方醫(yī)師的判斷，等等。如果希望，本發(fā)明的組合物可以存在于包裝或分配器設(shè)備中，例如PDA批準(zhǔn)的試劑盒，其可以含有一種或多種含有所述活性成分的單位劑型。例如，所述包裝可以包括金屬或塑料薄膜，例如泡罩包裝。所述包裝或分配器設(shè)備可以伴有施用的說明。所述包裝或分配器設(shè)備也可以伴隨有由管理藥物的制造備、使用或銷售的政府部分4幾構(gòu)開具規(guī)定形式的注意事項公告，所述公告反映機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)了組合物的形式用于人類或獸醫(yī)學(xué)施用。例如，這種注意事項公告可以包括由美國食品和藥品管理局對于處方藥物的和批準(zhǔn)和經(jīng)批準(zhǔn)的的產(chǎn)品插入物批準(zhǔn)插頁的標(biāo)簽。配制在藥學(xué)上可接受的載體中包含本發(fā)明的制品、配制在藥學(xué)上可接受的載體中的組合物也可以被制備、置于合適的容器中，并被標(biāo)記上對以上進(jìn)一步詳述的適應(yīng)癥的治療。要理解的是，本發(fā)明的這個方面的分子(例如，嵌合的蛋白)可以通過基因治療的方式向受試者提供。因此，以上描述的哺乳動物表達(dá)構(gòu)建體可以采用上文描述的任何適合的施用方式(即，體內(nèi)基因治療)來向受試者施用。做為選擇，經(jīng)由合適的基因遞送工具/方法(轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、同源重組，等等)和所需的表達(dá)系統(tǒng)將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入適合的細(xì)胞，然后在培養(yǎng)中擴(kuò)展修飾的細(xì)胞并返回到受試者中(即，離體基因治療)。當(dāng)前優(yōu)選的體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移技術(shù)包括使用病毒或非病毒構(gòu)建體如腺病毒、慢病毒、單純性皰疹I(lǐng)病毒或腺病毒相關(guān)病毒(AAV)和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染。用于基因的脂質(zhì)介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的有用的脂質(zhì)是，例如，DOTMA、DOPE和DC-Chol[Tonkmson"a/"CancerInvestigation,14(1):54-65(1996)]。用于基因治療的最優(yōu)選的構(gòu)建體是病毒，最優(yōu)選的是腺病毒、AAV、慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒。病毒構(gòu)建體例如逆病毒構(gòu)建體包括至少一個轉(zhuǎn)錄啟動子/增強(qiáng)子或基因座界定元件，或通過其他的方式如可變剪接、核RNA輸出或信使的翻譯后修飾來控制基因表達(dá)的其他元件。這種載體構(gòu)建體還包括包裝信號、長末端重復(fù)(LTR)或其部分，以及適合于病毒使用的正鏈和負(fù)鏈引物結(jié)合位點，除非它已經(jīng)存在于病毒構(gòu)建體中。此外，這種構(gòu)建體一般包括信號序列，用于肽從其置身其中的宿主細(xì)胞分泌。優(yōu)選地，用于這個目的的信號序列是哺乳動物信號序列，例如lgK前導(dǎo)序列(例如，SEQIDNO:7和8)。任選地，構(gòu)建體還可以包括指導(dǎo)多聚腺苦酸化的信號，以及一個或多個限制性位點和翻i奪終止序列。舉例來說，這種構(gòu)建體一般將包括5'LTR、tRNA結(jié)合位點、包裝信號、第二《連DNA合成起點和3'LTR或其部分?？梢允褂梅遣《镜钠渌d體，例如陽離子脂質(zhì)、聚賴氨酸和樹枝狀聚合物(dendrimers)。本發(fā)明的CCR2肽對MCP-1的親和性使得其能用在MCP-1的純化和;險測中。因而，根據(jù)本發(fā)明的又另一個方面，提供了包含標(biāo)簽和本發(fā)明的CCR2肽的分子。在此使用時，術(shù)語"標(biāo)簽"是指由結(jié)合配偶體例如抗體、螯合劑或抗生物素蛋白(生物素)分子特異性識別的部分。所述標(biāo)簽可以置于CCR2肽的C-末端或N-末端，只要它不影響其生物學(xué)活性(例如，MCP-1結(jié)合)。例如，標(biāo)簽多肽具有足夠的殘基以提供表位(即，表位標(biāo)簽)，針對該表位可以產(chǎn)生抗體，而又足夠短從而不千擾CCR2肽的生物學(xué)活性。所述表位標(biāo)簽優(yōu)選還是十分獨特的，以致針對它的抗體基本上不與其他表位交叉反應(yīng)。適合的標(biāo)簽多肽一般地具有至少六個氨基酸殘基，通常在約8-50個氨基酸殘基之間(優(yōu)選的，在約9-30個氨基酸殘基之間)。優(yōu)選的是聚組氨酸序列，其結(jié)合鎳，容許通過例如所描述的Ni-NTA層析來分離標(biāo)簽的蛋白質(zhì)(Lmdsaywa/.Neuron17:571-574(1996)]。這種CCR2的表位標(biāo)簽的形式是期望的，因為它的存在可以使用針對所述標(biāo)簽多肽的標(biāo)記的抗體來檢測。而且，提供表位標(biāo)簽允許本發(fā)明的CCR2肽容易地通過使用抗標(biāo)簽抗體的親和純化來純化。涉及抗體的親和純化纟支術(shù)和^^斷分析在此稍后il明。標(biāo)簽多肽和它們相應(yīng)的抗體是本領(lǐng)域/〉知的。實例包括流感HA標(biāo)簽多肽和它的抗體12CA5(FieldMol.Cell.Biol.,8:2159-2165(1988));c-myc標(biāo)簽和它的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體(Evan""/.，MolecularandCellularBiology,5:3610-3616(1985));和單純性皰滲病毒糖蛋白D(gD)標(biāo)簽和它的抗體(PaborskyW"/.，ProteinEngineering,3(6):547-553(1990))。已經(jīng)/>開了其他標(biāo)簽多月太。實如j包4舌Flag月太[Hopp"a/.,BioTechnology,6:1204-1210(1988)];KT3表位肽[Martinet/.，Science,255:192-194(1992)];a-微管蛋白表位肽[Skmner"J.Biol.Chem.，266:15163-15166(1991)];和T7基因10蛋白狀標(biāo)簽[Lutz陽Freyermuthe/1"/，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990)]。一旦選4奪了標(biāo)簽多肽，可以使用本領(lǐng)域公知的方法來產(chǎn)生它的抗體。這些抗體是商業(yè)上可獲得的，例3口來自Sigma,St.Louis.USA。本發(fā)明的這個方面的分子可以用于從生物樣品分離MCP-1或檢測其中MCP-1的存在。如在此使用的，用語"生物樣品"是指生物流體，例如其中存在MCP-1的血液、血清、血漿、淋巴、膽汁、尿、唾液、痰、滑液、精液、淚、腦脊液、支氣管肺泡灌洗液、腹腔積液、膿、條件培養(yǎng)基等等。根據(jù)本發(fā)明的這個方面，MCP-1的分離通過以下方式來實現(xiàn)使生物樣品與本發(fā)明的這個方面的分子接觸，從而MCP-1和所述分子形成復(fù)合物(使用容許分子與MCP-1結(jié)合的緩沖液、溫度條件，實例參見datta-MannanandStone2004,上文)；并分離所述復(fù)合物從而從所述生物樣品分離MCP-1。為了分離所述復(fù)合物，分子優(yōu)選的固定在固相支持物上。如在此使用的，用語"固相支持物"是指目的試劑(例如，本發(fā)明的這個方面的分子)可以粘附的非水基質(zhì)。固相支持物的實例包括但不限于，部分或全部地由玻璃(例如，受控的孔隙玻璃)、多糖(例如，瓊脂糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和硅樹脂形成的固相支持物。在某些實施方式中，取決于實際情況，固相支持物可以包括測定^^的孔；在其它實施方式中，其是純化柱(例如，親和層析柱)。這個術(shù)語還包括離散微粒的不連續(xù)固相，例如那些在美國專利No.4,275,149中描述的。做為選擇，這樣的分子可以用于檢測生物樣品中MCP-1的水平。對于診斷應(yīng)用，分子一^:地將用可檢測的部分標(biāo)記?？蓹z測部分可以是能夠直接或間接地產(chǎn)生可檢測信號的任何一種。例如，所述可檢測部分可以是放射性同位素、熒光或化學(xué)發(fā)光化合物，或標(biāo)簽(例如上文描述的，標(biāo)記的抗體可以與之結(jié)合)。本發(fā)明的分子可以應(yīng)用于任何已知的測定方法，例如竟?fàn)幮越Y(jié)合測定、直接和間接夾心測定和免疫^CJ定測定。Zola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,pp.147-158(CRCPress,Inc.,1987)。分子和任選的固相支持物和成像試劑(例如，抗;、生色底;勿等等^可以被包裝在具有適合的緩沖液和防腐劑的適合的容器中，用于診斷。在參閱無意用來限制的以下實施例時，本發(fā)明的其他目的、益處和新的特征對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將變得明顯。另外，上文中描述的各種實施方式和方面以及在以下的權(quán)利要求部分中要求權(quán)利的每一種都可以在以下實施例中找到實驗支持。實施例現(xiàn)在參考以下實施例，其與以上的描述一同以非限制性的方式說明了本發(fā)明。一般地，在此使用的術(shù)語和本發(fā)明中使用的實驗方法包括分子的、生物化學(xué)的、微生物學(xué)的和重組DNA的技術(shù)。這些技術(shù)已經(jīng)在文獻(xiàn)中充分i兌明了。參見，例如，MolecularCloning:AlaboratoryManual"Sambrook"<a/.，(1989);"CurrentProtocolsinMolecularBiology"VolumesI-IIIAusubel,R.M.,ed.(1994);Ausubel"a/.，"CurrentProtocolsinMolecularBiology",JohnWileyandSons,Baltimore,Maryland(1989);Perbal,"APracticalGuidetoMolecularClonmg",JohnWiley&Sons,NewYork(1988);Watson""/,,"RecombinantDNA",ScientificAmericanBooks,NewYork;Birrena/.(eds)"GenomeAnalysis:ALaboratoryManualSeries",Vols.1-4,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1998);在美國專利Nos.4,666,828;4,683,202;4,801,531;5,192,659和5,272,057中闡述的方法；"CellBiology:ALaboratoryHandbook",VolumesI-IIICellis，J.E.,ed.(1994);"CurrentProtocolsinImmunology"VolumesI-IIIColiganJ.E.,ed.(1994);Stitese/1a/,(eds),"BasicandClmicalImmunology"(8thEdition),Appleton&Lange,Norwalk,CT(1994);MishellandShiigi(eds),"SelectedMethodsinCellularImmunology",W.H.FreemanandCo.,NewYork(1980);在專利和科學(xué)文獻(xiàn)中廣泛地描迷了可用的免疫測定，參見，例如，美國專利Nos.3,791,932;3,839,153;3,850,752;3,850,578;3,853,987;3,867,517;3,879,262;3,901,654;3,935,074;3,984,533;3,996，345;4,034,074;4,098,876;4,879,219;5,011，771和5,281,521;"OligonucleotideSynthesis"Gait，M.J.,ed.(1984);"NucleicAcidHybridization"Hames,B.D.，andHigginsS.J.,eds.(1985);"TranscriptionandTranslation"Hames,B.D.，andHigginsS.J.，Eds.(1984);"AmmalCellCulture"Freshney,R.I.,ed.(1986);"ImmobilizedCellsandEnzymes"IRLPress,(1986);"APracticalGuidetoMolecularCloning"Perbal,B.,(1984)和"MethodsmEnzymology"Vol.1-317，AcademicPress;"PCRProtocols:AGuideToMethodsAndApplications",AcademicPress,SanDiego,CA(1990);Marshak""StrategiesforProteinPurificationandCharacterization-ALaboratoryCourseManual"CSHLPress(1996);通過引用將所有這些合并在此，如同在此完全地闡述了一樣。在這個文件的通篇提供了其他一般的參考文件。其中的步驟被認(rèn)為是本領(lǐng)域公知的，為了讀者的方便而提供。通過引用將其中含有的所有信息合并在此。,/i/靡婆癥,慈l^示7乂,MC尸-/使用關(guān)于針對包括MCP-1(CCL2)在內(nèi)各種趨化因子的抗體在前列腺癌癥患者中存在性的ELISA測試，確定了CCL2與前列腺癌癥之間的if關(guān)系。,悉4^f本-與以色列Haifa的CARMEL和RAMBAM醫(yī)療中心的泌尿科學(xué)部合作進(jìn)行了人類實驗工作。所有的血清和組織樣品在日期為2003年11月11日的Helsinki委員會批準(zhǔn)No.1822之下從RAMBAM醫(yī)院的患者獲得。由來自CARMEL醫(yī)療中心泌尿科學(xué)部的AviStem教授進(jìn)行病理分析?；颊叩呐R床數(shù)據(jù)在以下的表1中概述。在#646,漆產(chǎn)的4;t-使用之前詳細(xì)描述的ELISA測試來才全測針對每種測試的趨化因子的Ab滴度(Wildbaum,G.,M.Nahir,andN.Karin.2003.Beneficialautoimmunitytoproinflammatorymediatorsrestrainstheconsequencesofself-destructiveimmunity.Immunity19:679)。重組人類趨化因子SDF-1(CXCL12)、MlP隱la(CCL3)、MIP-l卩(CCL4)、IL-8(CXCL8)、IP-10(CXCL10)、MIP-3a(CCL20)、MIP-3(3(CCL-19)、Lymphotactm(XCLl)、MIG(CXCL9)、RANTES(CCL5)、MCP-3(CCL7)和MCP-l(CCL2)全部購自PeproTech,RockyHill,NJ。人類MIF購自R&DSystems(Minneapolis,NM)。錄果#/#^#癥,悉;#^云7#對^(:尸-/的^著的《,戎庫諒i來自23位前列腺癌癥患者，21位具有良性前列腺肥大(BPH)的個體、11位對照受試者的血清(以下的表3)測試了針對各種趨化因子的自身抗體的存在，特別是參與癌癥的那些，包括SDF-1(CXCL12)、MIF、M1P-1cx(CCL3)、MIP-1P(CCL4)、IL-8(CXCL8)、IP隱IO(CXCL10),、MIP-3oc(MCP-10)、MIP-3(3(CCL-19)、淋巴細(xì)胞趨化因子(XCL1)、MIG(CXCL9)、RANTES(CCL5)、MCP-3(CCL7)和MCP-1(MCP-1)。,3-,悉者凝#炎'《;^#一在征集的前列腺癌癥患者的數(shù)目23年齡，年[中值(范圍)]74(64-81)<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>征集的良性前列腺肥大患者的數(shù)目21<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>所有測試的趨化因子中，前列腺癌癥患者具有專門針對MCP-1的高顯著度的抗體滴度(圖la，log2Ab滴度11.85±0.8)。在健康個體和BPH患者中抗MCP-1抗體的基線滴度(log2)是5-6，與根據(jù)任何其他的趨化因子觀察到的沒有不同。因而，前列腺癌癥患者顯示了針對MCP-1的高度特異性的和選擇性的抗體反應(yīng)(圖la,p<0.01)。統(tǒng)計分析揭示了，約82%的前列腺癌癥患者(19/30),和患有非惡性的BPH的僅4.7%(1/21)的患者顯示了針對MCP-1的顯著反應(yīng)(log2Ab滴度>10,p<0.01)(圖lb)。這些結(jié)果表明，MCP-1CCR2相互作用的抑制作用可以用來抑制由MCP-1/CCR2調(diào)節(jié)的癌癥和其他疾病。ccw嵌合戚的Z^^j勿^屑辦f和,驗,潔CCW2f五3,-/gG淘建#^Z^:圖2顯示了CCR2(E3)-IgG嵌合體表達(dá)構(gòu)建體的示例。根據(jù)之前用來產(chǎn)生CTLA4-Ig的基礎(chǔ)方案(VanOosterhout,A.J.，C.L.Hofstra，R.Shields,B.Chan,I.VanArk,P.M.Jardieu,andF.P.Nijkamp.1997MurineCTLA4-IgGtreatmentinhibitsairwayeosmophiliaandhyperresponsivenessandattenuatesIgEupregulationmamurinemodelofallergicasthma.AmJRespirCellMolBiol17:386)來產(chǎn)生IgGl構(gòu)建體，修改是編碼人類IgGl重鏈的恒定區(qū)(鉸鏈-CH2-CH3)的cDNA從LPS和IL-4活化的外周血單核細(xì)胞(PBMC)克隆到pSecTag2/HygroB(Invitrogen,SanDiego,CA)上。人類CCR2-E3從LPS活化的人類PBMC中使用如下編碼部分CCR2的6結(jié)構(gòu)域(E3，分別為SEQIDNO:1禾口2)的引物來亞克隆正義cccaagcttggcctgagtaactgtgaaag(SEQIDNO:12)，反義ccgctcgagagtctctgtcacctgcgtgg(SEQIDNO:13)。在證實序列之后，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆到pSec-Tag2載體(Invitrogen,SanDiego,CA)中。將人類IgGFey的鉸鏈-CH2-CH3連接到質(zhì)粒(pSec-CCR2)的CCR2(E3)下游來產(chǎn)生融合蛋白CCR2-IgG。潛定的/&c-CCW2f丑3，-/gG^這勿應(yīng),秀將pSec-CCR2(E3)-IgG質(zhì)粒與CHODHFR迷你基因載體根據(jù)廠家的方案使用jetPEI(多相轉(zhuǎn)染-IllkirchCedex,France)共轉(zhuǎn)染入DG44CHO細(xì)胞(DHFR—'-)(由USA哥倫比亞大學(xué)的Dr.LawrenceChasm提供)。在含有潮霉素(hygromycme)(200)ig/ml)的培養(yǎng)基中篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的纟田胞。通過從AmershamBiosciences(Uppsia,Sweden)獲得的蛋白G-Sepharose柱從上清液純化CCR2(E3)-IgG融合蛋白，使用山羊抗人IgG-HRP(Sigma,St.Louis,MO)通過Western印跡分析來驗證。CC72f五3,-/gG^一^^/,合MC尸-/通過ELISA測定確定了CCR2的E3結(jié)構(gòu)域結(jié)合MCP-1的能力。五ZJ&4-通過如下的直接ELISA測定了CCR2(E3)-IgG對各種商業(yè)上可獲得的人類趨化因子(PeproTech,RockyHill,NJ)的結(jié)合特異性96孑LELISA平板(Nunc,roskilde,Denemark)用100ng/mL每種趨化因子包被，用1%BSA/PBS洗滌和封閉。然后添加濃度5jig/ml的CCR2(E3)-IgG。添加HRP標(biāo)記的小鼠抗人Ig(Jackson,Pennsylvama)作為第二抗體。結(jié)果顯示為4S0nm處的O.D.讀數(shù)。CCL2單克隆抗體(MAB679;R&DSystems,Mmne叩olis,NM)用作陽性對照(1(ig/ml)。茲l通過ELISA測定CCR2(E3)-IgG與各種細(xì)胞因子的結(jié)合。如圖3所示，CCR2的E3結(jié)構(gòu)域足以結(jié)合MCP-1,與測試的其他因子相比，展現(xiàn)了與這種趨化因子的高四倍的結(jié)合。CO2廣￡3J-/gG,浙M^P-7滲^的勿/《if移勿l賓THP-1細(xì)胞從美國典型培養(yǎng)物保藏所獲得(ATCC，Rockville,MD,ATCCAccessionNo.TIB-202),根據(jù)廠家的方案培養(yǎng)。勿應(yīng)if移都;t-測試了CCR2(E3)-IgG抑制MCP-1誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞遷移的能力。4吏用轉(zhuǎn)移孔室(CorningCostar,Cambridge,MA)進(jìn)行了化學(xué)趨向性測定。將THP-1細(xì)胞與培養(yǎng)基(1x106細(xì)胞/孔)添加到轉(zhuǎn)移孔的上室，在用培養(yǎng)基平衡下室之后，添加補(bǔ)充有或不補(bǔ)充可溶CCR2(E3)-IgG的重組人類MCP-l(R&DSystems,Minneapolis,NM)。然后在含有7.5%(302的濕潤空氣中在37。C孵育轉(zhuǎn)移孔3小時。從下室收集遷移的單核細(xì)胞并計數(shù)。潛^圖4顯示了可溶的CCR2(E3)-IgG以劑量依賴性的方式顯著地并斷然地(90%)阻斷MCP-1誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞遷移。用CCR2(E3)-IgG治療小鼠-六只SCID/Bg小鼠的三個組皮下施用5x106個PC陽3Luc細(xì)月包/小鼠(ElHilali""/,ClmCancerRes.2005Febl;ll(3):1253-8.).第一組經(jīng)歷CCR2(E3)-IgG的重復(fù)施用(200昭/小鼠，i.v.,四天的間隔)。第二組施用匹配量的PBS,第三組施用同種型匹配的對照IgG。對于晚期治療(即，建立的肺瘤的治療)，在施用PC-3細(xì)胞18天后開始施用。J^GF的^^^-參見deWet,J.R.,K.V.Wood,M.DeLuca,D.R.Helmski，andS.Subramam.1987.Fireflyluciferasegene:structureandexpressionmmammaliancells.MolCellBiol7:725;Rubio,N.,M.M.Villacampa,andJ.Blanco.1998.TraffictolymphnodesofPC-3prostatetumorcellsmnudemicevisualizedusmgtheluciferasegeneasatumorcellmarker.LabInvest78:1315;Rubio,N.,M..LorgansmeasuredusmgprostatetumorPC-3cellsexpressingtheluciferasegeneasaquantifiabletumorcellmarker.Prostate44:133;Harlow,E.,andD.Lane.1988.Antibodies,alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratory,NewYork。在第30天處死動物，獲取腫瘤并切片。使用來自SantaCruz.的兔抗VEGF(如果你需要，我可以明天給你提供cat編號)檢測VEGF。炎>￡#遊澤#-如先前描述的，參見ElHilaliClmCancerRes.2005Febl;ll(3):1253-8。簡言之，使用C〇2在第30天處死動物。獲取肺和骨并在液氮中冷凍。然后將冷凍的組織研磨成粉未，添加裂解緩沖液(Promega)。樣品渦旋數(shù)秒，混合物離心20分鐘(13000rpm)。然后添加熒光素酶底物。潛^使用CCR2(E3)-Ig的治療完全地降低了PC-3腫瘤生長-如圖5a所示，與施用PBS或?qū)φ誌gG的小鼠中發(fā)展的腫瘤相比，重復(fù)施用CCR2(E3)-IgG完全地抑制了PC-3腫瘤生長。使用CCR2-Ig的晚期治療(第15天)阻斷了預(yù)先建立的原發(fā)腫瘤的發(fā)展和它形成轉(zhuǎn)移的能力。圖5b清楚地顯示了，即使當(dāng)CCR2(E3)-IgG在腫瘤發(fā)展之后(細(xì)胞注射的第18天)施用，CCL2的阻斷顯著地降低了原發(fā)肺瘤的發(fā)展和它形成轉(zhuǎn)移的能力。即使在腫瘤細(xì)胞施用的中間時間(8天)之后，CCR2(E3)-IgG仍能夠抑制腫瘤發(fā)展。用CCR2(E3)-Ig治療降低了肺瘤轉(zhuǎn)移-如圖5c所示，如由熒光素酶活性的降低所指明的，用CCR2(E3)-IgG治療小鼠顯著地抑制了向肺部和骨組織的紳瘤轉(zhuǎn)移。與未治療的動物相比，在兩種組織中的熒光素酶活性被降低了4-10倍，并且總體達(dá)到了相同的最小水平(即，約0.5)。用CCR2(E3)-IgG治療完全地降低VEGF表達(dá)-如圖6a-f所示，與同種型匹配的對照IgG(附圖6b、e)和PBS(圖6d、f)相比，使用CCR2(E3)-IgG(圖6a、d)顯著地降低了VEGF在腫瘤位點的表達(dá)。這表明，CCR2途徑的阻斷抑制了VEGF的腫瘤誘導(dǎo)的活性。CCX2滲^#PC-3勿應(yīng)遷移被CCW2J-/gG細(xì)胞遷移測定-使用CellBiolabs，SanDiego,CA的CytoSelect試劑盒測定細(xì)胞遷移?？笴CL2是從Dr.Martinez和Dr.Melado，免疫學(xué)和月中瘤學(xué)部，CentroNationaldeBiotecnologia，UAMCampusdeCantoblanco,Madrid,Spam獲得的。簡言之，如圖7所示，PC-3細(xì)胞(106/孔)添加到轉(zhuǎn)移孔平板的上室，CCL2(重組人類MCP-l、RHMCP-1;20ng/ml)添加到下孔，下孔也補(bǔ)充有抗CCL2(50yg)和/或CCR2(E3)-IgG(200)ig)。在37°C孵育2小時之后，通過FACS計數(shù)遷移的PC-3細(xì)胞。結(jié)果顯示為三個副本的平均數(shù)土SE。結(jié)果在CCL2對前列腺癌細(xì)胞的可能的作用機(jī)制之中的是它吸引腫瘤細(xì)胞。這可以在圖7中看出，CCL2與CCR2-Ig比抗CCL2mAb更好地抑制PC3細(xì)胞的遷移。CCW2尸EG必為了穩(wěn)定本發(fā)明的CCR2氨基酸序列以及為了使它適合于口服和/或胃腸外施用，肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法(例如，Croyle,M.A.，Wa/.,2000,Hum.GeneTher.11:1721-1730;Croyle,M.A.,"a/,,2004,J.Virol.78:912-921)PEG化，所述肽具有以下的序列LysGlyLeuSerAsnCysGluSerThrSerGinLeuAspGinAlaThrGinValThrGluThr(SEQIDNO:11),除了在它的N-末端添加了賴氨酸殘基之外其與SEQIDNO:1相同。例如，單甲氧基聚(乙烯)乙二醇可以通過琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(其可以從SigmaChemicals,St.Louis,Mo.獲得)活化。一旦被活化，聚合物可以以約10:1(聚合物肽)的肺瘤比添加至CCR2肽，在25。C輕柔攪拌下來進(jìn)一步進(jìn)行PEG化反應(yīng)。通過添加相對于添加的PEG數(shù)量過量(例如，10倍)的賴氨酸(SigmaChemicals)，可以停止反應(yīng)。未反應(yīng)的PEG、過量的賴氨酸和反應(yīng)副產(chǎn)物通過在用100mM磷酸鉀緩沖的鹽水(pH7.4)平衡的Micro-BioSpmP-30層析柱(Bio-Rad)上進(jìn)行緩沖液交換來消除。要理解的是，為了清楚而在獨立的實施方式的上下文中描述的本發(fā)明的某些特征，也可以組合于單個實施方式中提供。反之，為了簡便起見在單個實施方式的上下文中描述的本發(fā)明的各種特征，也可以單獨地或以任何適合的子組合來才是供。盡管已經(jīng)結(jié)合其具體實施方式描述了本發(fā)明，很明顯的是，多種替換、修改和變體對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。因此，旨在包括所有落在所附的權(quán)利要求的精神和廣義范圍內(nèi)的這種替換、修改和變體。在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請和GenBankAccession號碼通過引用將它們完全地合并到本說明書中，達(dá)到如同每個單獨的出jf反物、專利或?qū)＠阨青或GenBankAccession號碼一皮具體和分別地指明通過引用合并在此的相同程度。此外，在本申請中所有參考文獻(xiàn)的引用或列明不應(yīng)被看作是承認(rèn)這些參考文獻(xiàn)是本發(fā)明可獲得的現(xiàn)有技術(shù)。權(quán)利要求1.一種包含異源氨基酸序列的分子，所述異源氨基酸序列結(jié)合到缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域的CCR2氨基酸序列，所述CCR2氨基酸序列能夠結(jié)合MCP-1，并且其中所述分子是無免疫原性的。2.—種分子，其包含附著于非蛋白質(zhì)部分的CCR2氨基酸序列，其中所述CCR2氨基酸序列能夠結(jié)合MCP-1，而且所述分子在受試者中是無免疫原性的。3.—種分子，包含至少兩個各自能夠結(jié)合MCP-1的CCR2氨基酸序列。4.一種包含標(biāo)簽的分子，所述標(biāo)簽附著于缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域的CCR2氨基酸序列，所述CCR2氨基酸序列能夠結(jié)合MCP-1。5.如SEQIDNO:14或15所示的分子。6.包含權(quán)利要求1、2或3的分子以及藥學(xué)上可接受的載體的藥物纟且合物。7.包含一種分子和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，所述分子包含缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域并能夠結(jié)合MCP-1的CCR2氨基酸序列，所述藥物組合物是無免疫原性的。8.—種在有需要的受試者中治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病的方法，包括向所述受試者施用治療有效量的權(quán)利要求1、2、3和/或5和Z或7的分子，從而在所述受試者中治療MCP1/CCR2相關(guān)疾病。9.權(quán)利要求1、2、3、5或7的分子的用途，用于制備被鑒定用于治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病的藥物。10.—種從生物樣品中分離MCP-1的方法，所述方法包括(a)使所述生物樣品與權(quán)利要求4的分子接觸，以使得MCP-1和權(quán)利要求4的分子形成復(fù)合物；以及(b)從所述生物樣品分離所述復(fù)合物從而分離MCP-1。11.權(quán)利要求1、6、8或9的任一項的分子、藥物組合物、方法和用途，其中所述異源氨基酸序列包含免疫球蛋白氨基酸序列。12.^又利要求1、4、6、8、9或10的任一項的分子、藥物組合物、方法和用途，其中所述缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域的CCR2氨基酸序列在SEQIDNO:2中示出。13.權(quán)利要求8或9的任一項的方法或用途，其中所述MCP-1/CCR2相關(guān)疾病選自由炎癥性疾病、壞死、動脈粥樣石更4匕、癌癥、多發(fā)性石更化、粉瘤、單核細(xì)胞性白血病、腎臟疾病(例如，血管球性腎炎)、hamman-rich綜合癥、子宮內(nèi)膜異位、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、細(xì)支氣管炎、哞喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病(例如，結(jié)腸炎)、牙槽炎、再狹窄、腦外傷、銀屑病、特發(fā)性肺纖維化和移植動脈硬化構(gòu)成的組。14.權(quán)利要求4或10的任一項的分子或方法，其中所述標(biāo)簽是表位標(biāo)簽。15.權(quán)利要求4或10的任一項的分子或方法，其中權(quán)利要求4的分子附著于固相支持物上。16.權(quán)利要求1、2、3、5或7的任一項的分子，附著于非蛋白質(zhì)部分。17.^又利要求2、6、8、9的任一項的分子、藥物組合物、方法或用途，其中所述非蛋白質(zhì)部分選自由聚乙二醇(PEG)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、苯乙烯馬來酐共聚物(SMA)和二乙烯醚與順丁烯二酸酐的共聚物(DIVEMA)構(gòu)成的組。18.^又利要求6或7的^壬一項的藥物組合物，其中所述接受的載體被配制為用于腸胃外施用。19.^又利要求6或7的^f壬一項的藥物組合物，其中所述接受的載體基本上是無免疫原性的。20.^又利要求6或7的任一項的藥物組合物，其中所述藥學(xué)接受的載體包括脂氨基酸。21.壽又利要求6或7的任一項的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括碳水化物。22.^又利要求6或7的^壬一項的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括微球體。23.權(quán)利要求6或7的任一項的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括脂質(zhì)體。24.^又利要求6或7的任一項的藥物組合物，其中所述藥學(xué)上可接受的載體包括聚合物微球體。25.—種在有需要的受試者中治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病的方法，包括向所述受試者施用治療有效量的分子，所述分子包含缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域并能夠結(jié)合MCP-1的CCR2氨基酸序列，從而在所述受試者中治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病。26.—種分子用于制備藥物的用途，所述分子包含缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域并能夠結(jié)合MCP-1的CCR2氨基酸序列，所述藥物被鑒定為用于治療MCP-1/CCR2相關(guān)疾病。27.權(quán)利要求25或26的任一項的方法或用途，其中所述缺少CCR2N-末端結(jié)構(gòu)域的CCR2氨基酸序列如SEQIDNO:2中所示。28.^又利要求25或26的任一項的方法或用途，其中所述MCP-1/CCR2相關(guān)疾病選自由炎癥性疾病、壞死、動力永粥樣石更化、癌癥、、多發(fā)性硬化、粉瘤、單核細(xì)胞性白血病、腎臟疾病(例如，血管球性腎炎)、hamman-rich綜合癥、子宮內(nèi)膜異位、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、細(xì)支氣管炎、哮喘、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、炎癥性腸病(例如，結(jié)腸炎)、牙槽炎、再狹窄、腦外傷、銀屑病、特發(fā)性肺纖維化和移植動脈硬化構(gòu)成的組。29.權(quán)利要求25或26的任一項的方法或用途，其中所述分子在SEQIDNO:14或15中示出。全文摘要分子和包含該分子的組合物用于分離MCP-1和治療CCR2/MCP-1相關(guān)疾病。文檔編號C07K14/715GK101160323SQ200680012540公開日2008年4月9日申請日期2006年4月10日優(yōu)先權(quán)日2005年4月15日發(fā)明者G·威爾德鮑姆,L·伊扎克,N·卡林,U·韋因伯格,Y·佐哈申請人:拉帕波特家族醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所