專利名稱：具有氨基酸殘基或肽殘基的化合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有氨基酸殘基或肽殘基并能夠有效表現(xiàn)該殘基的功能性的化合物。本發(fā)明還涉及上述化合物的制備方法。

背景技術(shù)：
已知氨基酸或寡肽根據(jù)其種類具有各種有用的作用。例如，已知精氨酸及其寡肽具有透過(guò)細(xì)胞膜的作用，已知其作為用于將目標(biāo)物導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的試劑是有用的。此外，還已知與單獨(dú)使用氨基酸或寡肽相比，使用將它們多個(gè)結(jié)合的化合物會(huì)在所期望作用的增強(qiáng)、安全性的提高等方面有利。
但是，對(duì)于含有氨基酸或寡肽的化合物，迄今為止并未提及具有氨基酸或寡肽的側(cè)鏈結(jié)合于主鏈的結(jié)構(gòu)的化合物。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供具有氨基酸或寡肽的側(cè)鏈結(jié)合于主鏈的結(jié)構(gòu)的化合物、用保護(hù)基保護(hù)的上述化合物以及這些化合物的制備方法。
本發(fā)明提供以下通式(1)和(1a)所示的化合物以及這些化合物的制備方法。
第1項(xiàng).下述通式(1)所示的化合物
[式(1)中，n1表示0～10的整數(shù)，n2表示1～50的整數(shù)，n3表示1～10的整數(shù)；m1表示0～100的整數(shù)，m2表示0～100的整數(shù)，m3表示0～100的整數(shù)，m4表示0或1的整數(shù)，m5表示0～100的整數(shù)，m6表示0～100的整數(shù)； Y表示羥基或氨基； E表示N或CH； R表示氨基酸殘基或由2～100個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽殘基； L表示氫原子、具有脂質(zhì)基的基團(tuán)、具有脂肪酸殘基的基團(tuán)或具有熒光性基團(tuán)的基團(tuán)； n1為2以上時(shí)，重復(fù)單元A中的m1，在各個(gè)重復(fù)單元A之間可以相同也可以不同； n2為2以上時(shí)，重復(fù)單元B中的m2～m5及R，在各個(gè)重復(fù)單元B之間可以相同也可以不同； n3為2以上時(shí)，重復(fù)單元C中的m6，在各個(gè)重復(fù)單元C之間可以相同也可以不同。] 第2項(xiàng).第1項(xiàng)所述的化合物，式(1)中，L為具有磷脂基的基團(tuán)。
第3項(xiàng).第1項(xiàng)所述的化合物，式(1)中，R為選自精氨酸殘基、賴氨酸殘基和絲氨酸殘基中的氨基酸殘基，或含有這些氨基酸殘基中的至少1種的肽殘基。
第4項(xiàng).第1項(xiàng)所述的化合物，式(1)中，R為肽殘基，該肽殘基由選自精氨酸殘基、賴氨酸殘基和絲氨酸殘基中的1種或2種以上的氨基酸殘基構(gòu)成且氨基酸殘基的總數(shù)為2～20個(gè)。
第5項(xiàng).第1項(xiàng)所述的化合物，式(1)中，R為由2～5個(gè)精氨酸殘基構(gòu)成的肽殘基。
第6項(xiàng).第1項(xiàng)所述的化合物，式(1)中，n1為0～2的整數(shù)，n2為1～10的整數(shù)，n3為0～2的整數(shù)。
第7項(xiàng).第1項(xiàng)所述的化合物，式(1)中，E為N，m2為2，m3和m4為1，m5為5。
第8項(xiàng).第1項(xiàng)所述的化合物，式(1)中，E為CH，m2、m3和m4為0，m5為4。
第9項(xiàng).下述通式(1a)所示的化合物
[n1～n3、m1～m6、E和R與上述相同， Y表示羥基； X表示保護(hù)基； Z表示與保護(hù)基X不同的保護(hù)基Za或者與保護(hù)基X相同的保護(hù)基Zb； RZ表示上述R的氨基酸殘基或肽殘基的官能團(tuán)上結(jié)合有保護(hù)基Z； n1為2以上時(shí)，重復(fù)單元A中的m1，在各個(gè)重復(fù)單元A之間可以相同也可以不同； n2為2以上時(shí)，重復(fù)單元B中的m2～m5及RZ，在各個(gè)重復(fù)單元B之間可以相同也可以不同； n3為2以上時(shí)，重復(fù)單元C中的m6，在各個(gè)重復(fù)單元C之間可以相同也可以不同。] 第10項(xiàng).第9項(xiàng)所述的化合物，式(1a)中，X為叔丁氧羰基或9-芴甲氧羰基。
第11項(xiàng).第9項(xiàng)所述的化合物，式(1a)中，R為選自精氨酸殘基、賴氨酸殘基和絲氨酸殘基中的氨基酸殘基，或?yàn)楹羞@些氨基酸殘基中的至少1種且氨基酸殘基的總數(shù)為2～20個(gè)的肽殘基。
第12項(xiàng).第9項(xiàng)所述的化合物，式(1a)中，R為肽殘基，該肽殘基由選自精氨酸殘基、賴氨酸殘基和絲氨酸殘基中的1種或2種以上的氨基酸殘基構(gòu)成且氨基酸殘基的總數(shù)為2～20個(gè)。
第13項(xiàng).第9項(xiàng)所述的化合物，式(1a)中，R為由2～5個(gè)精氨酸殘基構(gòu)成的肽殘基。
第14項(xiàng).第9項(xiàng)所述的化合物，式(1a)中，n1為0～2的整數(shù)，n2為1～10的整數(shù)，n3為0～2的整數(shù)。
第15項(xiàng).第9項(xiàng)所述的化合物，式(1a)中，E為N，m2為2，m3和m4為1，m5為5。
第16項(xiàng).第9項(xiàng)所述的化合物，式(1a)中，E為CH，m2、m3和m4為0，m5為4。
第17項(xiàng).復(fù)合化合物，通過(guò)上述第9項(xiàng)所述的化合物與具有氨基或羥基的化合物的縮合反應(yīng)而合成。
第18項(xiàng).第17項(xiàng)所述的復(fù)合化合物，其中，具有氨基的化合物為PNA單體或PNA寡聚物。
第19項(xiàng).下述通式(1)所示的化合物的制備方法，其包含以下第1-1工序～第1～5工序
[式(1)中，n1表示0～10的整數(shù)，n2表示1～50的整數(shù)，n3表示1～10的整數(shù)；m1表示0～100的整數(shù)，m2表示0～100的整數(shù)，m3表示0～100的整數(shù)，m4表示0或1的整數(shù)，m5表示0～100的整數(shù)，m6表示0～100的整數(shù)；Y表示羥基或氨基；E表示N或CH；R表示氨基酸殘基或由2～100個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽殘基；L表示氫原子、具有脂質(zhì)的基團(tuán)、具有脂肪酸殘基的基團(tuán)或具有熒光性基團(tuán)的基團(tuán)；n1為2以上時(shí)，重復(fù)單元A中的m1，在各個(gè)重復(fù)單元A之間可以相同也可以不同；n2為2以上時(shí)，重復(fù)單元B中的m2～m5及R，在各個(gè)重復(fù)單元B之間可以相同也可以不同；n3為2以上時(shí)，重復(fù)單元C中的m6，在各個(gè)重復(fù)單元C之間可以相同也可以不同。] 第1-1工序使下述通式(I)所示的化合物
[式(I)中，m6與上述相同] 縮合于固相樹(shù)脂或固相化合物后，通過(guò)進(jìn)行n3-1次縮合于固相樹(shù)脂或固相化合物的化合物的保護(hù)基X的脫除以及通式(I)所示的化合物的縮聚，得到下述通式(i)所示的化合物的工序；
[式(i)中，n3、m6和X與上述相同?！肮滔唷北硎竟滔鄻?shù)脂或固相化合物] 第1-2工序通過(guò)對(duì)通式(i)所示的化合物進(jìn)行n2次下述通式(II)所示的化合物
[式(II)中，m2～m5和X與上述相同。Za表示與X不同的保護(hù)基。] 的縮合反應(yīng)，得到下述通式(ii)所示的化合物的工序
[式(ii)中，n2、n3、m2～m6、X、Za和“固相”與上述相同]； 第1-3工序通過(guò)對(duì)通式(ii)所示的化合物進(jìn)行n1次下述通式(III)所示的化合物
[式(III)中，m1和X與上述相同] 的縮合反應(yīng)，得到下述通式(iii)所示的化合物的工序
[式(iii)中，n1～n3、m1～m6、X、Za和“固相”與上述相同]； 第1-4工序通過(guò)對(duì)通式(iii)所示的化合物進(jìn)行1～100次在結(jié)合于α位碳原子的羧基以外的官能團(tuán)上結(jié)合有保護(hù)基Za的氨基酸的縮合反應(yīng)，得到下述通式(iv)所示的化合物的工序
[式(iv)中，n1～n3、m1～m6、X、RZa和“固相”與上述相同]； 第1-5工序從通式(iv)所示的化合物切除固相樹(shù)脂或固相化合物而在末端形成-COOH或-CONH2，并且脫除保護(hù)基X和Za，從而得到通式(1)所示的化合物的工序。
第20項(xiàng).下述通式(1a)所示的化合物的制備方法，其包含以下第3-1工序～第3-5工序
[n1～n3、m1～m6、E、X和RZ與上述相同；Y為羥基；n1為2以上時(shí)，重復(fù)單元A中的m1，在各個(gè)重復(fù)單元A之間可以相同也可以不同；n2為2以上時(shí)，重復(fù)單元B中的m2～m5及RZ，在各個(gè)重復(fù)單元B之間可以相同也可以不同；n3為2以上時(shí)，重復(fù)單元C中的m6，在各個(gè)重復(fù)單元C之間可以相同也可以不同]； 第3-1工序使下述通式(I)所示的化合物
[式(I)中，m6與上述相同] 縮聚于具有氨基的固相樹(shù)脂或固相化合物后，通過(guò)進(jìn)行n3-1次縮聚于固相樹(shù)脂或固相化合物的化合物的保護(hù)基X的脫除以及將通式(I)所示的化合物的縮聚，得到下述通式(i)所示的化合物的工序
[式(i)中，n3、m6和X與上述相同?！肮滔唷北硎竟滔鄻?shù)脂或固相化合物]； 第3-2工序通過(guò)對(duì)通式(i)所示的化合物進(jìn)行n2次下述通式(II)所示的化合物
[式(II)中，m2～m5、X和Za與上述相同] 的縮合反應(yīng)，得到下述通式(ii)所示的化合物的工序
[式(ii)中，n2、n3、m2～m6、X、Za和“固相”與上述相同]； 第3-3工序通過(guò)對(duì)通式(ii)所示的化合物進(jìn)行n1次下述通式(III)所示的化合物
[式(III)中，m1和X與上述相同] 的縮合反應(yīng)，得到下述通式(iii)所示的化合物的工序
[式(iii)中，n1～n3、m1～m6、X、Za和“固相”與上述相同]； 第3-4工序通過(guò)對(duì)通式(iii)所示的化合物進(jìn)行1～100次在氨基上結(jié)合有保護(hù)基Z的氨基酸的縮合反應(yīng)，得到下述通式(iv)所示的化合物的工序
[式(iv)中，n1～n3、m1～m6、X、RZa和“固相”與上述相同]； 第3-5工序根據(jù)需要將通式(iv)所示化合物的保護(hù)基Za置換為保護(hù)基Zb，在保留保護(hù)基X和Z的狀態(tài)下，切除固相樹(shù)脂或固相化合物，在末端形成-COOH，由此得到通式(1a)所示的化合物的工序。
以下，在本說(shuō)明書中，所謂“膜透過(guò)性”是指透過(guò)細(xì)胞膜的特性。



[圖1]圖1是表示參考實(shí)驗(yàn)例4中實(shí)驗(yàn)結(jié)果(通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)的結(jié)果)的圖。圖中，各泳道對(duì)應(yīng)以下內(nèi)容 泳道1陰性對(duì)照泳道； 泳道2bcl-2對(duì)應(yīng)siRNA(添加量45pmpl/well)的導(dǎo)入XtremeGene； 泳道3bcl-2對(duì)應(yīng)siRNA(添加量90pmpl/well)的導(dǎo)入XtremeGene； 泳道4GFP對(duì)應(yīng)siRNA(添加量42.5pmpl/well)的導(dǎo)入?yún)⒖祭?的核酸導(dǎo)入用載體； 泳道5bcl-2對(duì)應(yīng)siRNA(添加量13.5pmpl/well)的導(dǎo)入?yún)⒖祭?的核酸導(dǎo)入用載體； 泳道6bcl-2對(duì)應(yīng)siRNA(添加量45pmpl/well)的導(dǎo)入?yún)⒖祭?的核酸導(dǎo)入用載體； 泳道7bcl-2對(duì)應(yīng)siRNA(添加量135pmpl/well)的導(dǎo)入?yún)⒖祭?的核酸導(dǎo)入用載體； 泳道8bcl-2對(duì)應(yīng)siRNA(添加量225pmpl/well)的導(dǎo)入?yún)⒖祭?的核酸導(dǎo)入用載體； 泳道9bcl-2對(duì)應(yīng)siRNA(添加量450pmpl/well)的導(dǎo)入?yún)⒖祭?的核酸導(dǎo)入用載體。

具體實(shí)施例方式 1.通式(1)所示的化合物 作為具有氨基酸或寡肽的側(cè)鏈結(jié)合于主鏈的構(gòu)造的化合物，提供以下通式(1)所示的化合物。

式(1)中，n1表示重復(fù)單元A的個(gè)數(shù)，表示0～10的整數(shù)，優(yōu)選0～5的整數(shù)，更優(yōu)選0～2的整數(shù)。
重復(fù)單元A中，m1表示0～100的整數(shù)，優(yōu)選0～30的整數(shù)，更優(yōu)選0～11的整數(shù)。n1為2以上的整數(shù)、即重復(fù)單元A為2個(gè)以上時(shí)，在各個(gè)重復(fù)單元A之間，m1可以相同也可以不同。
此外，式(1)中，n2表示重復(fù)單元B的個(gè)數(shù)，表示1～50的整數(shù)，優(yōu)選1～20的整數(shù)，更優(yōu)選1～10的整數(shù)。
重復(fù)單元B中，m2表示0～100的整數(shù)，優(yōu)選0～20的整數(shù)，更優(yōu)選0～2的整數(shù)。m3表示0～100的整數(shù)，優(yōu)選0～20的整數(shù)，更優(yōu)選0～2的整數(shù)。m4表示0或1的整數(shù)。m5表示0～100的整數(shù)，優(yōu)選0～30的整數(shù)，更優(yōu)選0～11的整數(shù)。
此外，重復(fù)單元B中，E表示N或CH。在重復(fù)單元B中，E為N時(shí)，優(yōu)選列舉m2為0～2，優(yōu)選為2；m3為0～1，優(yōu)選為1；m4為1；m5為0～11，優(yōu)選為5的化合物。此外，在重復(fù)單元B中，E為CH時(shí)，優(yōu)選列舉m2為0～2，優(yōu)選為0；m3為0～1，優(yōu)選為0；m4為0；m5為0～11，優(yōu)選為5的化合物。
重復(fù)單元B中，R表示氨基酸殘基或由2～100個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽殘基。R中，作為氨基酸殘基，可以是任意的天然氨基酸殘基或非天然氨基酸殘基，并無(wú)特別限制。從使通式(1)所示的化合物具備膜透過(guò)性的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為精氨酸殘基、賴氨酸殘基和絲氨酸殘基，更優(yōu)選為精氨酸殘基。
此外，R中，對(duì)于肽殘基，只要是由2～100個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的即可，對(duì)該構(gòu)成氨基酸殘基的種類并無(wú)特別限制。作為該肽殘基的一個(gè)例子，從使通式(1)所示的化合物具備膜透過(guò)性的觀點(diǎn)出發(fā)，可以列舉具有選自精氨酸殘基、賴氨酸殘基和絲氨酸殘基中的至少1種的氨基酸殘基的肽殘基；優(yōu)選只以精氨酸殘基、賴氨酸殘基和絲氨酸殘基作為構(gòu)成氨基酸殘基的肽殘基；特別優(yōu)選只以精氨酸殘基和/或賴氨酸殘基作為構(gòu)成氨基酸殘基的肽殘基。
此外，在該肽殘基中，含有賴氨酸殘基作為構(gòu)成氨基酸殘基時(shí)，賴氨酸的α位或ε位的氨基中的任何一種、或該兩種氨基能夠與鄰接氨基酸的羧基構(gòu)成肽鍵。
作為構(gòu)成肽殘基的氨基酸殘基的個(gè)數(shù)，可以列舉優(yōu)選2～50，更優(yōu)選2～20，進(jìn)一步優(yōu)選2～5，特別優(yōu)選2～3。
作為R的優(yōu)選形式的一個(gè)例子，可以列舉由2～5個(gè)精氨酸殘基構(gòu)成的肽殘基，作為特別優(yōu)選的例子，可以列舉由3個(gè)精氨酸殘基構(gòu)成的三精氨酸殘基。通過(guò)具有這種肽殘基，通式(1)所示的化合物可以具備更優(yōu)異的膜透過(guò)性。
在重復(fù)單元B中，氨基酸殘基或肽殘基是，C末端側(cè)的構(gòu)成氨基酸的羧基與重復(fù)單元的側(cè)鏈的氨基以脫水縮合的方式結(jié)合。即，R的氨基酸殘基或肽殘基相當(dāng)于氨基酸或肽的C末端側(cè)的構(gòu)成氨基酸的羧基的OH被除去的基團(tuán)。
重復(fù)單元B中，m2為2以上的整數(shù)、即重復(fù)單元B為2個(gè)以上時(shí)，在各個(gè)重復(fù)單元B之間，m2～m5及R可以相同也可以不同。
式(1)中，n3表示重復(fù)單元C的個(gè)數(shù)，表示0～10的整數(shù)，優(yōu)選0～5的整數(shù)，更優(yōu)選0～2的整數(shù)。
重復(fù)單元C中，m6表示0～100的整數(shù)，優(yōu)選0～30的整數(shù)，更優(yōu)選0～11的整數(shù)。n3為2以上的整數(shù)、即重復(fù)單元C為2個(gè)以上時(shí)，在各個(gè)重復(fù)單元C之間，m6可以相同也可以不同。
作為式(1)中n1～n3的具體例子，可以列舉n1為0～2的整數(shù)、n2為1～10的整數(shù)且n3為0～2的整數(shù)，特別優(yōu)選n1為1或2的整數(shù)、n2為4～6的整數(shù)且n3為1或2的整數(shù)。
在式(1)中，Y表示羥基或氨基。
在式(1)中，L表示氫原子、具有脂質(zhì)的基團(tuán)、具有脂肪酸殘基的基團(tuán)或具有熒光性基團(tuán)的基團(tuán)。
作為具有脂質(zhì)基的基團(tuán)的構(gòu)成脂質(zhì)并無(wú)特別限制，可以列舉磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、鞘氨醇、神經(jīng)酰胺、縮醛磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酸等磷脂；半乳糖甘油二酯、6-硫代異鼠李糖甘油二酯等甘油糖脂；半乳糖腦苷脂等鞘糖脂；類固醇；前列腺素等。這些中，優(yōu)選磷脂，更優(yōu)選的可以列舉磷脂酰乙醇胺，作為構(gòu)成這些脂質(zhì)基的脂肪酸殘基并無(wú)特別限制，可以列舉碳原子數(shù)4～30(優(yōu)選12～20)的飽和或不飽和脂肪酸殘基。作為這種脂肪酸殘基，具體可以列舉十二烷酰基、十四烷?；?、十六烷酰基、十八烷酰基、油?；?、亞油酰基等。該脂肪酸殘基中，作為優(yōu)選的可以列舉十六烷?；陀王；?。
具有脂質(zhì)基的基團(tuán)可以是脂質(zhì)基本身，也可以是在脂質(zhì)基上結(jié)合有連接基的基團(tuán)。作為連接基，使用例如以下的(a)和(b)所示結(jié)構(gòu)的基團(tuán)。
-CO-(CH2)i-CO- (a) -O(CH2CH2O)j- (b) i表示1～20，優(yōu)選1～8的整數(shù)；j表示1～1000，優(yōu)選1～21的整數(shù)。
具體來(lái)說(shuō)，作為脂質(zhì)基上結(jié)合有連接基的基團(tuán)，在構(gòu)成脂質(zhì)具有氨基時(shí)，可以列舉以下述式(L1)所示的基團(tuán)；在構(gòu)成脂質(zhì)具有羧基時(shí)，可以列舉以下述式(L2)所示的基團(tuán)。


-CO-(CH2)i-CO-(L1)

-O(CH2CH2O)j- (L2) 式(L1)和(L2)中，i和j與上述相同。
此外，具有脂質(zhì)基的基團(tuán)可以是結(jié)合有以上的脂質(zhì)基的基團(tuán)。
此外，L中，作為具有脂肪酸殘基的基團(tuán)，可以是脂肪酸殘基本身，也可以是脂肪酸殘基上結(jié)合有連接基的基團(tuán)。在此，所謂脂肪酸殘基，是指脂肪酸的羧基的OH被去除的基團(tuán)。作為脂肪酸殘基，具體可以列舉碳原子數(shù)4～30(優(yōu)選12～20)的飽和或不飽和脂肪酸殘基。作為這種脂肪酸殘基，具體可以列舉十二烷?；?、十四烷?；⑹轷；?、十八烷?；?、油?；営王；取Ｔ撝舅釟埢?，作為優(yōu)選的可以列舉十六烷酰基和油?；?。
此外，脂肪酸殘基上結(jié)合有連接基的基團(tuán)，作為該連接基，使用上述(a)和(b)所示結(jié)構(gòu)的基團(tuán)。具體來(lái)說(shuō)，作為脂肪酸殘基上結(jié)合有連接基的基團(tuán)，可以列舉下述式(L3)所示的基團(tuán)。


-O(CH2CH2O)j-(L3) 式(L3)中，j與上述相同。
此外，具有脂肪酸殘基的基團(tuán)，可以是結(jié)合有2個(gè)以上(例如2～8個(gè)，優(yōu)選2～4個(gè))脂肪酸殘基的基團(tuán)。作為結(jié)合有2個(gè)以上脂肪酸殘基的基團(tuán)，具體可以列舉以下所示的基團(tuán)。

此外，L中，作為具有熒光性基團(tuán)的基團(tuán)，可以是熒光性基團(tuán)本身，也可以是脂質(zhì)基上結(jié)合有連接基的基團(tuán)。所謂熒光性基團(tuán)，是指具有發(fā)出熒光的性質(zhì)的基團(tuán)。作為熒光性基團(tuán)可以使用公知的熒光化合物。作為熒光性基團(tuán)的一個(gè)例子，可以列舉以下結(jié)構(gòu)的基團(tuán)。

此外，脂肪酸殘基上結(jié)合有連接基的基團(tuán)，作為該連接基，使用上述(a)和(b)所示結(jié)構(gòu)的基團(tuán)。
在式(1)中，L是具有脂質(zhì)基的基團(tuán)或具有脂肪酸殘基的基團(tuán)時(shí)，可以提高通式(1)所示的化合物的膜透過(guò)性、與油性成分的混溶性。
此外，在式(1)中，L是具有熒光性基團(tuán)的基團(tuán)時(shí)，能夠熒光標(biāo)記通式(1)所示的化合物，因而可以通過(guò)熒光的有無(wú)檢測(cè)出該化合物。
2.通式(1a)所示的化合物 作為具有氨基酸或寡肽的側(cè)鏈結(jié)合于主鏈的構(gòu)造的化合物，還提供以下通式(1a)所示的化合物。

式(1a)中，n1～n3、m1～m6、E和R與上述相同。
式(1a)中，Y表示羥基。
式(1a)中，X表示保護(hù)基。此外，式(1a)中，Z表示與保護(hù)基X不同的保護(hù)基(記為保護(hù)基Za)或者與保護(hù)基X相同的保護(hù)基(記為保護(hù)基Zb)。在此，所謂保護(hù)基，是指保護(hù)構(gòu)成通式(1a)所示的化合物的特定區(qū)域中的結(jié)合基，以使其不會(huì)受到由該化合物其它的構(gòu)成區(qū)域中的氧化、還原、水解、縮合等反應(yīng)所引起的影響的基團(tuán)，并且該基團(tuán)在規(guī)定的條件下可以脫除而置換為氫原子、羥基。作為保護(hù)基，具體來(lái)說(shuō)，有代表性的是叔丁氧羰基(Boc基)或9-芴甲氧羰基(Fmoc基)，除此之外還可列舉以下所示的保護(hù)基。作為保護(hù)基X，優(yōu)選為Boc基或Fmoc基。作為保護(hù)基R，優(yōu)選為與保護(hù)基X不同的保護(hù)基(保護(hù)基Za)。

特別是當(dāng)保護(hù)基X為Boc基或Fmoc基時(shí)，優(yōu)選保護(hù)基R是如下所示的Aloc基。

式(1a)中，所謂RZ，表示上述R的氨基酸殘基或肽殘基的官能團(tuán)上結(jié)合有保護(hù)基Z。此外，在上述R的氨基酸殘基或肽殘基中，存在2個(gè)以上官能團(tuán)時(shí)，結(jié)合于各個(gè)官能團(tuán)的保護(hù)基Z，可以是同種保護(hù)基，也可以是不同種類的保護(hù)基。作為氨基酸殘基或肽殘基的官能團(tuán)，可以列舉氨基、羧基、胍基、咪唑基、硫醇基等。
此外，n2為2以上的整數(shù)、即重復(fù)單元B為2個(gè)以上時(shí)，在各個(gè)重復(fù)單元B之間，RZ可以相同，也可以不同。
在通式(1a)所示的化合物中，所有官能團(tuán)用保護(hù)基X和Z保護(hù)，并且在重復(fù)單元C的末端存在游離羧基。因此，通式(1a)所示的化合物可以容易地與具有氨基或羥基的靶化合物進(jìn)行縮合反應(yīng)，從而成為通式(1a)所示的化合物與靶化合物相結(jié)合的復(fù)合化合物。因此，通過(guò)使用通式(1a)所示的化合物作為原料，可以使重復(fù)單元A、B和C容易地結(jié)合于靶化合物。此外，通過(guò)將通式(1a)所示的化合物的保護(hù)基置換為氫原子，可以制造上述通式(1)所示的化合物。
作為成為通式(1a)所示的化合物的結(jié)合對(duì)象的靶化合物，只要具有氨基或羥基就沒(méi)有特別限制，作為具體例子，可以列舉PNA(肽核酸)寡聚物、PNA單體、肽、脂質(zhì)、脂肪酸等。
例如，如下述反應(yīng)式(15)直至(17)，或反應(yīng)式(18)直至(19)所示，通式(1a)所示的化合物通過(guò)經(jīng)由與PNA單體或PNA寡聚物之間的縮合反應(yīng)，可以高效地制備帶有重復(fù)單元A、B和C的PNA單體或PNA寡聚物。

[Fmoc-[......]-OH表示通式(1a)中的保護(hù)基X是Fmoc的化合物，B表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶等核酸堿基，Bhoc表示Fmoc以外的保護(hù)基。q為1以上，優(yōu)選1～50的整數(shù)。]
[Boc-[......]-OH表示通式(1a)中的保護(hù)基X是Boc的化合物，B表示腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶等核酸堿基，Cbz表示Boc以外的保護(hù)基。q為1以上，優(yōu)選1～50的整數(shù)。] 3.通式(1)所示的化合物的制備方法 作為通式(1)所示的化合物第1制備方法，可以列舉依次進(jìn)行以下所示的第1-1工序～第1-5工序的方法。對(duì)于第1-1工序～第1-5工序，詳細(xì)敘述每個(gè)工序。
第1-1工序 在第1-1工序中，使用下述通式(I)所示的化合物及固相樹(shù)脂或固相化合物，合成通式(i)所示的化合物。
[化30]
[式(I)中，m6與上述相同]
[式(i)中，n3、m6和X與上述相同?！肮滔唷北硎竟滔鄻?shù)脂或固相化合物] 通式(I)所示的化合物是公知化合物或按照公知的制備方法所制備的化合物。
作為在該工序中使用的固相樹(shù)脂或固相化合物并無(wú)特別限制，可以列舉例如MBHA(甲基二苯甲胺樹(shù)脂)、PAL(肽酰胺連接物)、Oxime(對(duì)硝基二苯甲酮肟)、PAM(4-羥甲基苯基乙酰胺甲基樹(shù)脂)、Merrifield樹(shù)脂等。
首先，使上述通式(I)所示的化合物與固相樹(shù)脂或固相化合物進(jìn)行縮合反應(yīng)。
通式(I)所示的化合物與固相樹(shù)脂或固相化合物的縮合反應(yīng)，相對(duì)于通式(I)所示的化合物1摩爾，通常是將固相樹(shù)脂或固相化合物0.01～100摩爾、優(yōu)選0.1～10摩爾混合而進(jìn)行的。
通式(I)所示的化合物與固相樹(shù)脂或固相化合物的縮合反應(yīng)，通常在適當(dāng)?shù)娜軇┲羞M(jìn)行。作為溶劑，只要是不阻礙反應(yīng)的溶劑就可以廣泛使用公知的溶劑。作為這樣的溶劑，可以列舉例如二甲基甲酰胺(DMF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)等。
通式(I)所示的化合物與固相樹(shù)脂或固相化合物的縮合反應(yīng)，優(yōu)選使用縮合劑和反應(yīng)促進(jìn)劑來(lái)進(jìn)行。作為縮合劑，可以列舉例如O-(偶氮苯并三氮唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)、O-(苯并三氮唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、鹽酸1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDCI)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)等。作為縮合劑，優(yōu)選使用HATU。此外，作為反應(yīng)促進(jìn)劑，可以列舉例如N，N-二異丙基乙基胺(DIEA)、三乙胺(TEA)等。作為反應(yīng)促進(jìn)劑，優(yōu)選DIEA。
縮合劑的使用量，相對(duì)于1摩爾固相樹(shù)脂或固相化合物，縮合劑以總量計(jì)通常為0.01～100摩爾，優(yōu)選為0.1～10摩爾。
此外，上述反應(yīng)促進(jìn)劑的使用量，相對(duì)于1摩爾固相樹(shù)脂或固相化合物，縮合劑以總量計(jì)通常為0.01～100摩爾，優(yōu)選為0.1～10摩爾。
通式(I)所示的化合物與固相樹(shù)脂或固相化合物的縮合反應(yīng)通常在5～80℃、優(yōu)選10～30℃，根據(jù)需要通過(guò)攪拌進(jìn)行0.1～48小時(shí)，優(yōu)選0.1～1小時(shí)。
這樣，可以得到使1個(gè)通式(I)所示的化合物縮合于固相樹(shù)脂或固相化合物的下述結(jié)構(gòu)的化合物。以下，將結(jié)合于固相樹(shù)脂或固相化合物的狀態(tài)的化合物記做固相結(jié)合化合物。

進(jìn)行如此所得的固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除。固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除適當(dāng)采用與保護(hù)基X的種類相應(yīng)的方法來(lái)進(jìn)行。例如，保護(hù)基X是Boc基時(shí)，可以列舉在TFA(三氟醋酸)溶液(95容積％TFA/5容積％間甲苯酚)中、在10～30℃下處理0.1～1小時(shí)的方法。此外，保護(hù)基X是Fmoc基時(shí)，可以列舉在哌啶溶液(20容積％哌啶/80容積％DMF)中、在10～30℃下處理0.01～0.5小時(shí)的方法。進(jìn)而，保護(hù)基X是Alloc時(shí)，可以列舉在Pd(PPh3)4[四(三苯基膦)合鈀，312mg]溶液(55容積％氯仿/30容積％醋酸/15容積％N-甲基嗎啉)中、在10～30℃下處理0.1～1小時(shí)的方法。
接著，進(jìn)行已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(I)所示的化合物的縮合反應(yīng)。該縮合反應(yīng)的條件等，除了將固相樹(shù)脂或固相化合物與固相結(jié)合化合物替換以外，與上述的縮合反應(yīng)相同。
通過(guò)將上述固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)、以及已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(I)所示的化合物的縮合反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行n3-1次，可以得到通式(i)所示的化合物。
第1-2工序 在第1-2工序中，使用由第1-1工序得到的通式(i)所示的化合物和下述通式(II)所示的化合物，合成下述通式(ii)所示的化合物。

式(II)中，m2～m5、X和Za與上述相同。此外，通式(II)所示的化合物是公知化合物或按照公知的制備方法所制備的化合物。

式(ii)中，n2、n3、m2～m6、X、Za和“固相”與上述相同。
在第2工序中，首先進(jìn)行固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)。進(jìn)行保護(hù)基X的脫除的方法可以采用與上述第1-1工序時(shí)相同的條件。
接著，進(jìn)行已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(II)所示的化合物的縮合反應(yīng)。
已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與下述通式(II)所示的化合物的縮合反應(yīng)，可以采用與上述第1-1工序的縮合反應(yīng)相同的條件。具體來(lái)說(shuō)，在上述第1-1工序的縮合反應(yīng)條件下，通過(guò)將固相樹(shù)脂或固相化合物與固相結(jié)合化合物替換，進(jìn)而將通式(I)所示的化合物替換為通式(II)所示的化合物，進(jìn)行第1-2工序的縮合反應(yīng)。
通過(guò)將上述固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)、以及已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(II)所示的化合物的縮合反應(yīng)合計(jì)進(jìn)行n2次，可以得到通式(ii)所示的化合物。
第1-3工序 在第1-3工序中，使用由第1-2工序得到的通式(ii)所示的化合物和下述通式(III)所示的化合物，合成下述通式(iii)所示的化合物。

式(III)中，m1和X與上述相同。通式(III)所示的化合物是公知化合物或按照公知制備方法所制備的化合物。

式(iii)中，n1～n3、m1～m6、X、Za和“固相”與上述相同。
在第1-3工序中，首先進(jìn)行固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)。進(jìn)行保護(hù)基X的脫除的方法可以采用與上述第1工序時(shí)相同的條件。
接著，進(jìn)行已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與下述通式(III)所示的化合物的縮合反應(yīng)。
已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與下述通式(III)所示的化合物的縮合反應(yīng)，可以采用與上述第1-1工序的縮合反應(yīng)相同的條件。具體來(lái)說(shuō)，在上述第1-1工序的縮合反應(yīng)條件下，通過(guò)將固相樹(shù)脂或固相化合物與固相結(jié)合化合物替換，進(jìn)而將通式(I)所示的化合物替換為通式(III)所示的化合物，進(jìn)行第1-3工序的縮合反應(yīng)。
通過(guò)將上述固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)、以及已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(III)所示的化合物的縮合反應(yīng)合計(jì)進(jìn)行n3次，可以得到通式(iii)所示的化合物。
第1-4工序 在第1-4工序中，使用由第1-3工序得到的通式(iii)所示的化合物以及在結(jié)合于α位碳原子的羧基以外的官能團(tuán)上結(jié)合有保護(hù)基Za的氨基酸，合成下述通式(iv)所示的化合物。

式(iv)中，n1～n3、m1～m6、X、RZa和“固相”與上述相同。
此外，在本工序中使用的上述氨基酸，可以在結(jié)合于α位碳原子的羧基以外的官能團(tuán)上結(jié)合有保護(hù)基Za。
例如，除了結(jié)合于α位碳原子的羧基和氨基以外無(wú)官能團(tuán)的氨基酸時(shí)，可以在結(jié)合于α位碳原子的氨基上結(jié)合有保護(hù)基Za。
此外，例如像賴氨酸、精氨酸、絲氨酸等在α位碳原子以外結(jié)合有官能團(tuán)的氨基酸，可以在結(jié)合于α位碳原子的羧基以外的所有官能團(tuán)上結(jié)合有保護(hù)基Za。這時(shí)，優(yōu)選結(jié)合于α位碳原子的氨基的保護(hù)基Za，與結(jié)合于α位碳原子以外的部位的官能團(tuán)的保護(hù)基Za，分別為不同種類的保護(hù)基。像這樣，當(dāng)上述氨基酸上存在2個(gè)以上的保護(hù)基Zb時(shí)，通過(guò)分別采用不同種類的保護(hù)基，可以選擇性地只使結(jié)合于縮合反應(yīng)中使用的氨基的保護(hù)基Za脫除，而使結(jié)合于其他官能團(tuán)的保護(hù)基Za處于保留的狀態(tài)。
在第1-4工序中，首先進(jìn)行固相結(jié)合化合物中結(jié)合于縮合反應(yīng)中使用的氨基的保護(hù)基Za的脫除反應(yīng)。進(jìn)行保護(hù)基Za的脫除的方法可以采用與上述第1-1工序時(shí)相同的條件。
接著，如上所述地進(jìn)行已脫除保護(hù)基Za的固相結(jié)合化合物與上述氨基酸的縮合反應(yīng)。
已脫除保護(hù)基Za的固相結(jié)合化合物與上述氨基酸的縮合反應(yīng)，可以采用與上述第1-1工序的縮合反應(yīng)相同的條件。具體來(lái)說(shuō)，在上述第1-1工序的縮合反應(yīng)條件下，通過(guò)將固相樹(shù)脂或固相化合物與固相結(jié)合化合物替換，進(jìn)而將通式(I)所示的化合物替換為上述氨基酸，來(lái)進(jìn)行第1-4工序的縮合反應(yīng)。
通過(guò)將上述固相結(jié)合化合物的保護(hù)基Za的脫除反應(yīng)、以及已脫除保護(hù)基Za的固相結(jié)合化合物與上述氨基酸的縮合反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行1～100次，可以得到通式(iv)所示的化合物。例如，將上述保護(hù)基Za的脫除以及縮合反應(yīng)進(jìn)行1次，可以合成R是氨基酸殘基的化合物，此外，例如，將上述保護(hù)基Za的脫除以及縮合反應(yīng)進(jìn)行3次，可以合成R是由3個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽殘基的化合物。
第1-5工序 接著，從第1-4工序得到的通式(iv)所示的化合物切除固相樹(shù)脂或固相化合物而在末端形成-COOH或-CONH2，并且使保護(hù)基X和Z脫除并置換為氫原子。此外，根據(jù)需要，使具有脂質(zhì)基的基團(tuán)、具有脂肪酸殘基的基團(tuán)或具有熒光性基團(tuán)的基團(tuán)結(jié)合于通式(1)所示化合物的重復(fù)單元A的末端氨基。這樣，可以合成通式(1)所示的化合物。
例如，作為固相樹(shù)脂或固相化合物，使用Merrifield樹(shù)脂時(shí)，通過(guò)置于超強(qiáng)酸性條件下，能夠得到Y(jié)是羧基的通式(1)所示的化合物。此外，例如，作為固相樹(shù)脂或固相化合物，使用MBHA樹(shù)脂時(shí)，通過(guò)置于超強(qiáng)酸性條件下，能夠得到Y(jié)是氨基的通式(1)所示的化合物。
進(jìn)一步，作為通式(1)所示的化合物的第2制備方法，可以列舉依次進(jìn)行以下所示的第2-1工序～第2-5工序的方法。對(duì)于第2-1工序～第2-5工序，詳細(xì)敘述每個(gè)工序。
第2-1工序 在第2-1工序中，使用上述通式(I)所示的化合物固相樹(shù)脂或固相化合物，合成通式(i)所示的化合物。
首先，使上述通式(I)所示的化合物縮合于固相樹(shù)脂或固相化合物而得到固相結(jié)合化合物后，進(jìn)行該固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)。保護(hù)基X的脫除以與上述第1-1工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
接著，將已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(I)所示的化合物的縮合反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行n3-1次。該縮合反應(yīng)以與上述第1-1工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。這樣，能夠得到通式(i)所示的化合物。
第2-2工序 在第2-2工序中，使用上述通式(II)所示的化合物、以及結(jié)合于α位碳原子的羧基以外的官能團(tuán)上結(jié)合有保護(hù)基Za的氨基酸，合成下述通式(II’)所示的化合物。

式(II’)中，m2～m5、X和RZa與上述相同。
在本第2-2工序中，優(yōu)選通式(II)所示的化合物的羧基用與X和Zb不同的保護(hù)基來(lái)保護(hù)。
首先，進(jìn)行通式(II)所示的化合物的保護(hù)基Za的脫除。保護(hù)基Za的脫除以與上述第1-4工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
接著進(jìn)行已脫除保護(hù)基Za的通式(II)所示的化合物與上述氨基酸的縮合反應(yīng)。該縮合反應(yīng)以與上述第1-4工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
如上所述，通過(guò)將結(jié)合于縮合反應(yīng)中使用的氨基的保護(hù)基Za的脫除反應(yīng)、以及已脫除結(jié)合于縮合反應(yīng)中使用的氨基的保護(hù)基Za的化合物與上述氨基酸的縮合反應(yīng)，合計(jì)進(jìn)行1～100次，可以得到通式(II’)所示的化合物。
第2-3工序 在第2-3工序中，使用由第2-1工序得到的通式(i)所示的化合物以及由第2-2工序得到的通式(II’)所示的化合物，合成下述通式(ii’)所示的化合物。

式(ii’)中，n2、n3、m2～m6、RZa和“固相”與上述相同。
首先，進(jìn)行固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除。進(jìn)行保護(hù)基X的脫除的方法可以采用與上述第1-2工序時(shí)相同的條件。
接著進(jìn)行已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(III)所示的化合物的縮合反應(yīng)。該縮合反應(yīng)以與上述第1-2工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
通過(guò)將上述固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)、以及已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(II’)所示的化合物的縮合反應(yīng)，合計(jì)進(jìn)行n2次，可以得到以下通式(ii’)所示的化合物。
第2-4工序 在第2-4工序中，使用由第2-3工序得到的通式(ii’)所示的化合物以及通式(III)所示的化合物，合成通式(iv)所示的化合物。
首先，進(jìn)行固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)。進(jìn)行保護(hù)基X的脫除的方法可以采用與上述第1-3工序時(shí)相同的條件。
接著進(jìn)行已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(III)所示的化合物的縮合反應(yīng)。該縮合反應(yīng)以與上述第1-3工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
通過(guò)將上述固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)、以及已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(III)所示的化合物的縮合反應(yīng)，合計(jì)進(jìn)行n1次，得到通式(iv)所示的化合物。
第2-5工序 接著，從第2-4工序所得的通式(iv)所示的化合物切除固相樹(shù)脂或固相化合物而在末端形成-COOH或-CONH2，并且使保護(hù)基X和Za脫除。此外，根據(jù)需要，使具有脂質(zhì)基的基團(tuán)、具有脂肪酸殘基的基團(tuán)、具有熒光性基團(tuán)的基團(tuán)結(jié)合于通式(1)所示化合物的重復(fù)單元A的末端氨基。這樣，可以合成通式(1)所示的化合物。應(yīng)予說(shuō)明，本第2-5工序按與上述第1-5工序相同的方法進(jìn)行。
此外，作為通式(1)所示的化合物的第3制備方法，可以列舉使通式(1a)所示的化合物中的保護(hù)基X和Z脫除的方法。保護(hù)基X和Z的脫除反應(yīng)，可以通過(guò)適當(dāng)設(shè)定與保護(hù)基的種類相應(yīng)的條件來(lái)進(jìn)行。
4.通式(1a)所示的化合物的制備方法 作為通式(1a)所示的化合物的第1制備方法，可以列舉依次進(jìn)行以下所示的第3-1工序～第3-5工序的方法。以下，對(duì)于第3-1工序～第3-5工序，詳細(xì)敘述每個(gè)工序。
第3-1工序 在第3-1工序中，使用上述通式(I)所示的化合物及固相樹(shù)脂或固相化合物，合成通式(i)所示的化合物。
對(duì)于用于通式(1a)所示的化合物的合成的固相樹(shù)脂或固相化合物，可以根據(jù)通式(1a)所示的化合物所含有的保護(hù)基X和Z的種類適當(dāng)進(jìn)行選擇。例如，當(dāng)通式(1a)所示的化合物所含有的保護(hù)基X和Z的一方或雙方為Boc基時(shí)，優(yōu)選采用Oxime樹(shù)脂作為固相樹(shù)脂，或氧芐基化合物(オキシルベンジル)作為固相化合物。此外，當(dāng)通式(1a)所示的化合物所含有的保護(hù)基X和Z的一方或雙方為Fmoc基時(shí)，優(yōu)選采用PAM樹(shù)脂作為固相樹(shù)脂。
首先，使通式(I)所示的化合物縮合于固相樹(shù)脂或固相化合物而得到固相結(jié)合化合物后，進(jìn)行該固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)。保護(hù)基X的脫除以與上述第1-1工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
接著，將已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(I)所示的化合物的縮合反應(yīng)反復(fù)進(jìn)行n3-1次。該縮合反應(yīng)以與上述第1-1工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。這樣，能夠得到通式(i)所示的化合物。
第3-2工序 在第3-2工序中，使用由第3-1工序得到的通式(i)所示的化合物以及通式(II)所示的化合物，合成通式(ii)所示的化合物。
首先，進(jìn)行固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)。進(jìn)行保護(hù)基X的脫除的方法可以采用與上述第1-2工序時(shí)相同的條件。
接著，進(jìn)行已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(II)所示的化合物的縮合反應(yīng)。該縮合反應(yīng)以與上述第1-2工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
通過(guò)將上述固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除、以及已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(II)所示的化合物的縮合反應(yīng)，合計(jì)進(jìn)行n2次，可以得到通式(ii)所示的化合物。
第3-3工序 在第3-3工序中，使用由第3-2工序得到的通式(ii)所示的化合物以及通式(III)所示的化合物，合成通式(iii)所示的化合物。
首先，進(jìn)行固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)。進(jìn)行保護(hù)基X的脫除的方法可以采用與上述第1-3工序時(shí)相同的條件。
接著，進(jìn)行已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(III)所示的化合物的縮合反應(yīng)。該縮合反應(yīng)以與上述第1-3工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
通過(guò)將上述固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除、以及已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(III)所示的化合物的縮合反應(yīng)，合計(jì)進(jìn)行n1次，可以得到通式(iii)所示的化合物。
第3-4工序 在第3-4工序中，使用由第3-3工序得到的通式(iii)所示的化合物以及在結(jié)合于α位碳原子的羧基以外的官能團(tuán)上結(jié)合有保護(hù)基Za的氨基酸，合成通式(iv)所示的化合物。
在第3-4工序中使用的氨基酸與上述第1-4工序中使用的氨基酸相同。
首先，進(jìn)行通式(iii)所示的化合物的保護(hù)基Za的脫除。保護(hù)基Za的脫除以與上述第1-4工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
接著進(jìn)行已脫除保護(hù)基Za的通式(iii)所示的化合物與上述氨基酸的縮合反應(yīng)。該縮合反應(yīng)以與上述第4工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
如上所述，通過(guò)將結(jié)合于縮合反應(yīng)中使用的氨基的保護(hù)基Za的脫除反應(yīng)、以及已脫除結(jié)合于縮合反應(yīng)中使用的氨基的保護(hù)基Za的化合物與上述氨基酸的縮合反應(yīng)，合計(jì)進(jìn)行1～100次，可以得到通式(iv)所示的化合物。
第3-5工序 由上述第3-4工序得到的通式(iv)所示的化合物上，結(jié)合有Za作為保護(hù)基。因此，根據(jù)需要，按照公知的方法，將保護(hù)基Za替換為與保護(hù)基X相同的保護(hù)基(保護(hù)基Zb)。
接著，在保護(hù)基X和Z保留的狀態(tài)下，從第3-4工序得到的通式(iv)所示的化合物切除固相樹(shù)脂或固相化合物而在末端形成-COOH。
例如，使用Oxime樹(shù)脂作為固相樹(shù)脂或固相化合物時(shí)，通過(guò)置于堿性條件下，可以得到通式(1-a)所示的化合物。
進(jìn)一步，作為通式(1a)所示的化合物的第2制備方法，可以列舉進(jìn)行以下所示的第4-1工序～第4-5工序的方法。以下，對(duì)于第4-1工序～第4-5工序，詳細(xì)敘述每個(gè)工序。
第4-1工序 在第4-1工序中，使用上述通式(I)所示的化合物及固相樹(shù)脂或固相化合物，合成通式(i)所示的化合物。本第4-1工序以與上述第3-1工序相同的條件進(jìn)行。
第4-2工序 在第4-2工序中，使用上述通式(II)所示的化合物、以及在結(jié)合于α位碳原子的羧基以外的官能團(tuán)上結(jié)合有保護(hù)基Za的氨基酸，合成通式(II’)所示的化合物。
本第1-2工序中使用的氨基酸，與上述第3-4工序中使用的氨基酸相同。
首先，進(jìn)行通式(II)所示的化合物的保護(hù)基Za的脫除。保護(hù)基Za的脫除以與上述第3-4工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
接著進(jìn)行已脫除保護(hù)基Za的通式(II)所示的化合物與上述氨基酸的縮合反應(yīng)。該縮合反應(yīng)以與上述第3-4工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
如上所述，通過(guò)將結(jié)合于縮合反應(yīng)中使用的氨基的保護(hù)基Za的脫除反應(yīng)、以及已脫除結(jié)合于縮合反應(yīng)中使用的氨基的保護(hù)基Za的化合物與上述氨基酸的縮合反應(yīng)，合計(jì)進(jìn)行1～100次，可以得到通式(II’)所示的化合物。
第4-3工序 在第4-3工序中，使用由第4-1工序得到的通式(i)所示的化合物以及由第4-2工序得到的通式(II’)所示的化合物，合成通式(ii’)所示的化合物。
首先，進(jìn)行固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除。進(jìn)行保護(hù)基X的脫除的方法可以采用與上述第3-2工序時(shí)相同的條件。
接著進(jìn)行已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(III)所示的化合物的縮合反應(yīng)。該縮合反應(yīng)以與上述第3-2工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
通過(guò)將上述固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除、以及已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(II’)所示的化合物的縮合反應(yīng)，合計(jì)進(jìn)行n2次，可以得到以下通式(ii’)所示的化合物。
第4-4工序 在第4-4工序中，使用由第4-3工序得到的通式(ii’)所示的化合物以及通式(III)所示的化合物，合成通式(iv)所示的化合物。
首先，進(jìn)行固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除反應(yīng)。進(jìn)行保護(hù)基X的脫除的方法可以采用與上述第3-3工序時(shí)相同的條件。
接著進(jìn)行已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(III)所示的化合物的縮合反應(yīng)。該縮合反應(yīng)以與上述第3-3工序時(shí)相同的條件進(jìn)行。
通過(guò)將上述固相結(jié)合化合物的保護(hù)基X的脫除、以及已脫除保護(hù)基X的固相結(jié)合化合物與通式(III)所示的化合物的縮合反應(yīng)，合計(jì)進(jìn)行n1次，可以得到以下通式(iv)所示的化合物。
第4-5工序 在由上述第4-4工序中得到的通式(iv)所示的化合物中，結(jié)合有Za作為保護(hù)基。因此，根據(jù)需要，按照公知的方法，將保護(hù)基Za替換為與保護(hù)基X相同的保護(hù)基(保護(hù)基Zb)。
接著，在保護(hù)基X和Zb保留的狀態(tài)下，從第4-4工序得到的通式(iv)所示的化合物切除固相樹(shù)脂或固相化合物而在末端形成-COOH。本第4-5工序以與上述第3-5工序相同的方法進(jìn)行。
實(shí)施例 以下，列舉實(shí)施例和試驗(yàn)例更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明。但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例和試驗(yàn)例。
參考合成例1通式(11)所示化合物的合成 合成以下通式(11)所示的化合物(以下，記為化合物(11))
具體來(lái)說(shuō)，在水浴冷卻下向Alloc(烯丙氧羰基)-HN-C5H10-COOH(891mg，3.0mmol)和Pfp-OH(五氟苯酚)(754mg，4.5mmol)的二氯甲烷溶液(12ml)中加入DCC(1，3-二環(huán)己基碳二亞胺)(845mg，4.5mmol)，將該反應(yīng)液在0℃攪拌30分鐘、接著在室溫?cái)嚢?5小時(shí)。過(guò)濾反應(yīng)液并將濾液減壓濃縮，將殘?jiān)怨枘z柱層析法(CH2Cl2)純化后，用己烷重結(jié)晶得到白色粉末Alloc-HN-C5H10-COO-Pfp(537.5mg，98％)。1H-NMR(CDCl3)δ5.92(m，1H)，5.26(m，2H)，4.96(brt，1H)，4.57(brd，2H)，3.22(q，J＝6.2Hz，2H)，2.69(t，J＝7.2Hz，2H)，2.0-1.8(m，2H)，1.75-1.1(m，8H)；LRMS(FAB+)calcd forC16H17F5NO4[(M+H)+]382.3 observed 382。
接著，向丙酮(6.0mL)和水(1.0mL)的混合溶液中加入NaHCO3(67.2mg，0.8mmol)，將Alloc-HN-C5H10-O-Pfp(763mg，2.0mmol)與下式(12)所示的化合物(681mg，2.0mmol)溶解，在室溫?cái)嚢?小時(shí)。

用水浴冷卻的1N鹽酸將冷卻的反應(yīng)溶液調(diào)至pH3.0，進(jìn)而加入1％的枸櫞酸水溶液后，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)層以飽和食鹽水洗凈。以無(wú)水硫酸鎂使有機(jī)層干燥后濃縮，以硅膠柱層析法(1-5％MeOH/CH2Cl2)純化。其后，溶于二氯甲烷，減壓濃縮得到作為無(wú)定形粉末的化合物(11)(157.3mg，80％)。1H-NMR(CDCl3)δ7.75(d，J＝6.8Hz，2H)，7.59(d，J＝7.6Hz，2H)，7.35(m，4H)，5.8(m，1H)，5.8(ma)and 5.6(mi)(m，1H)，5.2(m，2H)，4.6(mi)and 4.53(ma)(brd，2H)，4.37(brd，2H)，4.22(mi)and 4.04(ma)(brd，2H)，3.50(m，2H)，3.33(m，2H)，3.16(m，2H)，2.37(ma)and 2.2(mi)(brt，2H)，1.8-1.2(m，6H)；LRMS(FAB+)calcd for C29H36N3O7[(M+H)+]538.6 observed 538。
實(shí)施例1通式所示的化合物(1-A)的合成 合成以下通式所示的化合物(1-A)(以下，記為化合物(1-A))。

按照標(biāo)準(zhǔn)tBoc法(cf.Koch，T.；Hansen，H.F.；Andersen，P.；Larsen，T.；Batz，H.G；Otteson，K.；Orum，H.J.Peptide Res.1997，49，80-88.)，首先，對(duì)固相載體MBHA(4-甲基-二苯甲胺)樹(shù)脂(120mg，73.2μmol)使用Boc-HN-C5H10-COOH(叔丁氧羰基-6-氨基己酸；34.3mg，109.8μmol)、縮合劑HATU[2-(1H-9-偶氮苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3四甲基脲六氟磷酸鹽](41.7mg，109.8μmol)和DIEA(二異丙基乙基胺)(50μL)進(jìn)行縮合反應(yīng)(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r1-1)。通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后，使用Boc-HN-C5H10-COOH(34.3mg，109.8μmol)、縮合劑HATU(41.7mg，109.8μmol)和DIEA(50μL)進(jìn)行逐次增長(zhǎng)反應(yīng)(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r1-2和r1-3)。
接著，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后(反應(yīng)工序r1-4)，使用縮合劑HATU(41.7mg，109.8μmol)和DIEA(50μL)，使下式(13)所示的化合物(58.6mg，109.8μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)5次(反應(yīng)工序r1-5和2-6)。

其后，進(jìn)行哌啶處理(20％哌啶的DMF溶液，室溫5分鐘)將Fmoc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r1-7)。然后，使用縮合劑HATU(417mg，1098μmol)和DIEA(192μL)，使Fmoc-Arg(MtsN-均三甲苯-2-磺?；?-OH·IPE(異丙基乙基胺)(747mg，1098μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)3次(反應(yīng)工序r1-8～r1-10)。
最后，通過(guò)哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，以常法(TFA/TFMSA/對(duì)甲苯酚/苯硫基甲烷＝60/25/10/10)進(jìn)行從固相載體MBHA的切除以及Arg的保護(hù)基Mts基的脫保護(hù)，得到目標(biāo)物(化合物(1-A))(反應(yīng)工序r1-11)。MALDI-TOF MScalcd.3653.53(M+H+)，found 3654.57。

實(shí)施例2通式所示的化合物(1-B)的合成 合成以下的通式所示的化合物(1-B)(以下，記為化合物(1-B))。

具體來(lái)說(shuō)，按照標(biāo)準(zhǔn)tBoc法(cf.Koch，T.；Hansen，H.F.Andersen，P.；Larsen，T.；Batz，H.G；Otteson，K.；Orum，H.J.Peptide Res.1997，49，80-88.)，首先，對(duì)固相載體MBHA(120mg，73.2μmol)使用作為連接基用ω-氨基酸的Boc-HN-C5H10-COOH(34.3mg，109.8μmol)、縮合劑HATU(41.7mg，109.8μmol)和DIEA(50μL)進(jìn)行縮合反應(yīng)(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r2-1)。通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后，使用Boc-HN-C5H10-COOH(34.3mg，109.8μmol)、縮合劑HATU(41.7mg，109.8μmol)和DIEA(50μL)進(jìn)行逐次增長(zhǎng)反應(yīng)(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r2-2和r2-3)。
接著，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后(反應(yīng)工序r2-4)，使用縮合劑HATU(41.7mg，109.8μmol)和DIEA(50μL)使Boc-Lys(Fmoc)-OH(53.4mg，109.8μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)5次(反應(yīng)工序r2-5和r2-6)。
其后，進(jìn)行哌啶處理(20％哌啶的DMF溶液，室溫5分鐘)將Fmoc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r2-7)。然后，使用縮合劑HATU(417mg，1098μmol)和DIEA(192μL)使Fmoc-Arg(Mts)-OH·IPE(747mg，1098μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)3次(反應(yīng)工序r2-8～r2-10)。
最后，通過(guò)哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，以常法(TFA/TFMSA/對(duì)甲苯酚/苯硫基甲烷＝ 60/25/10/10)進(jìn)行從固相載體MBHA的切除以及Arg的保護(hù)基Mts基的脫保護(hù)，得到目標(biāo)物(化合物(1-B))(反應(yīng)工序r2-11)。MALDI-TOF MScalcd.3228.00(M+H+)，found 3227.91。

實(shí)施例3通式所示的化合物(1-C)的合成 合成以下的通式所示的化合物(1-C)(以下，記為化合物(1-C))。

具體來(lái)說(shuō)，按照標(biāo)準(zhǔn)tBoc法(cf.Koch，T.；Hansen，H.F.；Andersen，P.；Larsen，T.；Batz，H.G；Otteson，K.；Orum，H.J.Peptide Res.1997，49，80-88.)，首先，對(duì)固相載體MBHA(120mg，73.2μmol)使用作為連接基用ω-氨基酸的Boc-HN-C5H10-COOH(34.3mg，109.8μmol)、縮合劑HATU(41.7mg，109.8μmol)和DIEA(50μL)進(jìn)行縮合反應(yīng)(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r3-1)。通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后，使用Boc-HN-C5H10-COOH(34.3mg，109.8μmol)、縮合劑HATU(41.7mg，109.8μmol)和DIEA(50μL)進(jìn)行逐次增長(zhǎng)反應(yīng)(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r3-2和r3-3)。
接著，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后(反應(yīng)工序r3-4)，使用縮合劑HATU(41.7mg，109.8μmol)和DIEA(50μL)使上述式(13)所示的化合物(58.6mg，109.8μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)5次(反應(yīng)工序r3-5和r3-6)。
其后，進(jìn)行哌啶處理(20％哌啶的DMF溶液，室溫5分鐘)將Fmoc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r3-7)。然后，使用縮合劑HATU(417mg，1098μmol)和DIEA(192μL)使Fmoc-Lys(Boc)-OH(534mg，1098μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)3次(反應(yīng)工序r3-8～r3-10)。
最后，通過(guò)哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，以常法(TFA/TFMSA/對(duì)甲苯酚/苯硫基甲烷＝60/25/10/10)進(jìn)行從固相載體MBHA的切除以及Lys的保護(hù)基Boc基的脫保護(hù)，得到目標(biāo)物(化合物(1-C))(反應(yīng)工序r3-11)。MALDI-TOF MScalcd.3233.32(M+H+)，found 3233.60。

實(shí)施例4通式(1-D)所示的化合物的合成 合成以下的通式(1-D)所示的化合物(1-D)(以下，記為化合物(1-D))。

具體來(lái)說(shuō)，按照標(biāo)準(zhǔn)tBoc法(cf.Koch，T.；Hansen，H.F.；Andersen，P.；Larsen，T.；Batz，H.G.；Otteson，K.；Orum，H.J.Peptide Res.1997，49，80-88.)，首先，對(duì)固相載體MBHA(120mg，73.2μmol)使用作為連接基用ω-氨基酸的Boc-HN-C5H10-COOH(34.3mg，109.8μmol)、縮合劑HATU(41.7mg，109.8μmol)和DIEA(50μL)進(jìn)行縮合反應(yīng)(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r4-1)。通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后，使用Boc-HN-C5H10-COOH(34.3mg，109.8μmol)、縮合劑HATU(41.7mg，109.8μmol)和DIEA(50μL)進(jìn)行逐次增長(zhǎng)反應(yīng)(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r4-2和r4-3)。
接著，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后(反應(yīng)工序r4-4)，使用縮合劑HATU(41.7mg，109.8μmol)和DIEA(50μL)使上述式(13)所示的化合物(58.6mg，109.8μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)5次(反應(yīng)工序r4-5和r4-6)。
其后，進(jìn)行哌啶處理(20％哌啶的DMF溶液，室溫5分鐘)將Fmoc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r4-7)。然后，使用縮合劑HATU(417mg，1098μmol)和DIEA(192μL)使Fmoc-Lys(Boc)-OH(534mg，1098μmol)縮合(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r4-8)。接著，通過(guò)哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)，使用縮合劑HATU(417mg，1098μmol)和DIEA(192μL)使Fmoc-Arg(Mts)-OH·IPE(747mg，1098μmol)縮合(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r4-9)。進(jìn)而，通過(guò)哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)，使用縮合劑HATU(417mg，1098μmol)和DIEA(192μL)使Fmoc-Ser(Trt)-OH(415mg，1098μmol)縮合(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r4-10)。
最后，通過(guò)哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，以常法(TFA/TFMSA/對(duì)甲苯酚/苯硫基甲烷＝60/25/10/10)進(jìn)行從固相載體MBHA的切除以及Lys的保護(hù)基Boc基、Arg的保護(hù)基Mts基、Ser的保護(hù)基Trt基的脫保護(hù)，得到目標(biāo)物(化合物(1-D))(反應(yīng)工序r4-11)。MALDI-TOF MScalcd.3167.92(M+H+)，found 3166.89。

實(shí)施例5化合物(1L-A)的合成 合成以下的通式所示的化合物(1L-A)。

具體來(lái)說(shuō)，按照標(biāo)準(zhǔn)Fmoc法(cf.Carpino，L.A.；Han，G.Y.J.Org.Chem.1972，37，3404-9.)，首先，將固相載體PAL(5-(4’-氨甲基-3’，5’-二甲氧基苯氧基)-戊酸)(180mg，72μmol)進(jìn)行哌啶處理(20％哌啶的DMF溶液，室溫5分鐘)而將Fmoc基脫保護(hù)。對(duì)此載體使用縮合劑HATU(274mg，720μmol)和DIEA(126μL)，使作為連接基用ω-氨基酸的Fmoc-HN-C10H20-COOH(305mg，720μmol)縮合(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r5-1)。
接著，進(jìn)行哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，使用縮合劑HATU(137mg，360μmol)和DIEA(63μL)使化合物(11)(193mg，360μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)5次(反應(yīng)工序r5-2～r5-4)。
然后，進(jìn)行哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，使用Fmoc-HN-C10H20-COOH(305mg，720μmol)、縮合劑HATU(274mg，720μmol)和DIEA(126μL)縮合(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r5-5)。
接著，進(jìn)行哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r5-6)。其后，使用DMF/DIEA(1mL/50μL)溶液，使磷脂活性酯體DOPE-NHS(二油酰磷脂酰乙醇胺-N-羥基琥珀酰亞胺)(90.5mg，92.3μmol)縮合(反應(yīng)工序r5-7)。
接著，用Pd(PPh3)4[四(三苯基膦)合鈀(0)]的CHCl3/AcOH/N-甲基嗎啉溶液(312mg，2.8mL，1.5mL，0.75mL，室溫30分鐘)進(jìn)行二次處理，將Alloc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r5-8)。接著，使用縮合劑HATU(410mg，1080μmol)和DIEA(188μL)使Fmoc-Arg(Pbf)-OH·0.3IPE(733mg，1080μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)3次(反應(yīng)工序r5-9～r5-11)。
最后，通過(guò)哌啶處理后將Fmoc基脫保護(hù)，然后通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)，進(jìn)行從固相載體PAL的切除以及Arg的保護(hù)基Pbf基的脫保護(hù)，得到目標(biāo)物(化合物(1L-A))(反應(yīng)工序r5-12)。MALDI-TOF MScalcd.4632.90(M+H+)，found 4632.63。


具體來(lái)說(shuō)，按照標(biāo)準(zhǔn)Fmoc法(cf.Carpino，L.A.；Han，G.Y.J.Org.Chem.1972，37，3404-9.)，首先，將固相載體PAL(180mg，72μmol)進(jìn)行哌啶處理(20％哌啶的DMF溶液，室溫5分鐘)而將Fmoc基脫保護(hù)。對(duì)該載體使用作為連接基用ω-氨基酸的Fmoc-HN-C10H20-COOH(305mg，720μmol)、縮合劑HATU(274mg，720μmol)和DIEA(126μL)進(jìn)行縮合(室溫，30分鐘)。(反應(yīng)工序r6-1) 接著，進(jìn)行哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，使用縮合劑HATU(137mg，360μmol)和DIEA(63μL)使化合物(11)(193mg，360μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)4次(反應(yīng)工序r6-2～r6-4)。
然后，進(jìn)行哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，使用Fmoc-HN-C10H20-COOH(305mg，720μmol)、縮合劑HATU(274mg，720μmol)和DIEA(126μL)進(jìn)行縮合(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r6-5)。
接著，進(jìn)行哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r6-6)。其后，使用DMF/DIEA(1mL/50μL)溶液，使磷脂活性酯體DOPE-NHS(二油酰磷脂酰乙醇胺-N-羥基琥珀酰亞胺)(90.5mg，92.3μmol)縮合(反應(yīng)工序r6-7)。
進(jìn)而，用Pd(PPh3)4的CHCl3/AcOH/N-甲基嗎啉溶液(312mg，2.8mL，1.5mL，0.75mL，室溫30分鐘)進(jìn)行二次處理，將Alloc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r6-8)。接著，使用縮合劑HATU(410mg，1080μmol)和DIEA(188μL)使Fmoc-Lys(Boc)-OH(525mg，1080μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)3次(反應(yīng)工序r6-9～r6-11)。
最后，通過(guò)哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)，進(jìn)行從固相載體PAL的切除以及Lys的保護(hù)基Boc基的脫保護(hù)，得到目標(biāo)物(化合物(1L-B))(反應(yīng)工序r6-12)。MALDI-TOFMScalcd.3614.91(M+H+)，found 3611.60。


實(shí)施例7通式所示的化合物(1L-C)的合成 合成以下的通式所示的化合物(1L-C)(以下，記為化合物(1L-C))。

具體來(lái)說(shuō)，按照標(biāo)準(zhǔn)Fmoc法(cf.Carpino，L.A.；Han，G.Y.J.Org.Chem.1972，37，3404-9.)，首先，將固相載體PAL(180mg，72μmol)進(jìn)行哌啶處理(20％哌啶的DMF溶液，室溫5分鐘)而將Fmoc基脫保護(hù)后。對(duì)該載體使用作為連接基用ω-氨基酸的Fmoc-HN-C10H20-COOH(305mg，720μmol)、縮合劑HATU(274mg，720μmol)和DIEA(126μL)進(jìn)行縮合(室溫，30分鐘)。(反應(yīng)工序r7-1) 接著，進(jìn)行哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，使用縮合劑HATU(137mg，360μmol)和DIEA(63μL)使化合物(11)(193mg，360μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)5次(反應(yīng)工序r7-2～r7-4)。
然后，進(jìn)行哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，使用Fmoc-HN-C10H20-COOH(305mg，720μmol)、縮合劑HATU(274mg，720μmol)和DIEA(126μL)進(jìn)行縮合(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r7-5)。
接著，進(jìn)行哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r7-6)。其后，使用縮合劑HATU(54.6mg，144μmol)和DIEA(25μL)，使油酸(40mg，144μmol)縮合(反應(yīng)工序r7-7)。
進(jìn)而，用Pd(PPh3)4的CHCl3/AcOH/N-甲基嗎啉溶液(312mg，2.8mL，1.5mL，0.75mL，室溫30分鐘)進(jìn)行二次處理，將Alloc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r7-8)。接著，使用縮合劑HATU(410mg，1080μmol)和DIEA(188μL)使Fmoc-Arg(Pbf)-OH·0.3IPE(733mg，1080μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)3次(反應(yīng)工序r7-9～r7-11)。
最后，通過(guò)哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)，進(jìn)行從固相載體PAL的切除以及Arg的保護(hù)基Pbf基的脫保護(hù)，得到目標(biāo)物(化合物(1L-C))(反應(yīng)工序r7-12)。


實(shí)施例8通式(1L-D)所示的化合物的合成 合成以下的通式(1L-D)所示的化合物(以下，記為化合物(1L-D))。

具體來(lái)說(shuō)，按照標(biāo)準(zhǔn)Fmoc法(cf.Carpino，L.A.；Han，G.Y.J.Org.Chem.1972，37，3404-9.)，首先，將固相載體PAL(180mg，72μmol)進(jìn)行哌啶處理(20％哌啶的DMF溶液，室溫5分鐘)而將Fmoc基脫保護(hù)。對(duì)該載體使用作為連接基用ω-氨基酸的Fmoc-HN-C10H20-COOH(305mg，720μmol)、縮合劑HATU(274mg，720μmol)和DIEA(126μL)進(jìn)行縮合(室溫，30分鐘)。(反應(yīng)工序r8-1) 接著，進(jìn)行哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，使用縮合劑HATU(137mg，360μmol)和DIEA(63μL)使化合物(11)(193mg，360μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)5次(反應(yīng)工序r8-2～r8-4)。
然后，進(jìn)行哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，使用Fmoc-HN-C10H20-COOH(305mg，720μmol)、縮合劑HATU(274mg，720μmol)和DIEA(126μL)進(jìn)行縮合(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r8-5)。
接著，進(jìn)行哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r8-6)。其后，使用DMF/DIEA(1mL/50μL)溶液，使磷脂活性酯體Ole-PEG-NHS(油酸-聚乙二醇-N-羥基琥珀酰亞胺)(306mg，144μmol)縮合(反應(yīng)工序r8-7)。
進(jìn)而，用Pd(PPh3)4的CHCl3/AcOH/N-甲基嗎啉溶液(312mg，2.8mL，1.5mL，0.75mL，室溫30分鐘)進(jìn)行二次處理，將Alloc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r8-8)。接著，使用縮合劑HATU(410mg，1080μmol)和DIEA(188μL)使Fmoc-Arg(Pbf)-OH·0.3IPE(733mg，1080μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)3次(反應(yīng)工序r8-9～r8-11)。
最后，通過(guò)哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)，進(jìn)行從固相載體PAL的切除以及Arg的保護(hù)基Pbf基的脫保護(hù)，得到目標(biāo)物(化合物(1L-D))(反應(yīng)工序r8-12)。


實(shí)施例9化合物(1-E)的合成 合成以下的通式所示的化合物(1-E)。

具體來(lái)說(shuō)，按照標(biāo)準(zhǔn)tBoc法(cf.Koch，T.；Hansen，H.F.；Andersen，P.；Larsen，T.；Batz，H.G.；Otteson，K.；Orum，H.J.Peptide Res.1997，49，80-88.)，首先，對(duì)固相載體MBHA(100mg，61μmol)使用作為連接基用ω-氨基酸的Boc-HN-C5H10-COOH(6.93mg，30μmol)、縮合劑HATU(11.4mg，30μmol)和DIEA(10μL)進(jìn)行縮合反應(yīng)(室溫，120分鐘)(反應(yīng)工序r9-1)。
接著，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r6-6)。其后，使用縮合劑HATU(13.7mg，60μmol)和DIEA(12.5μL)，使下述通式(91)所示的化合物(19.9mg，60μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)5次(反應(yīng)工序r9-7和r9-8)。

接著，進(jìn)行哌啶處理(20％哌啶的DMF溶液，室溫5分鐘)將Fmoc基脫保護(hù)(反應(yīng)工序r9-9)。然后，使用縮合劑HATU(85mg，225μmol)和DIEA(39μL)使Fmoc-Arg(Mts)-OH·IPE(153mg，225μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)3次(反應(yīng)工序r9-10～r9-12)。
接著，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后，使用Boc-HN-C5H10-COOH(13.9mg，60μmol)、縮合劑HATU(22.8mg，60μmol)和DIEA(20μL)進(jìn)行縮合反應(yīng)(室溫，30分鐘)(反應(yīng)工序r9-2和r9-3)。
進(jìn)而，通過(guò)TFA處理將Boc基脫保護(hù)后，將FITC(29.2mg，75μmol)的DIEA/DMF(26.7mL/1.5mL)溶液在室溫下攪拌14小時(shí)而熒光標(biāo)記化(反應(yīng)工序r9-13)。
最后，通過(guò)哌啶處理將Fmoc基脫保護(hù)后，以常法(TFA/TFMSA/對(duì)甲苯酚/苯硫基甲烷＝60/25/10/10)進(jìn)行從固相載體MBHA的切除以及Arg的保護(hù)基Mts基的脫保護(hù)，得到目標(biāo)物(化合物(1-E))(反應(yīng)工序r9-14)。MALDI-TOF MScalcd.4041.40(M+H+)，found 4042.91。
實(shí)施例10通式(1a-1)所示化合物的合成 按照下述所示的反應(yīng)工序，合成以下的通式所示的化合物(1a-1)。

具體來(lái)說(shuō)，按照標(biāo)準(zhǔn)tBoc法(cf.Koch，T.；Hansen，H.F.；Andersen，P.；Larsen，T.；Batz，H.G.；Otteson，K.；Orum，H.J.Peptide Res.1997，49，80-88.)，首先，對(duì)固相載體Oxime(100mg，120μmol)使用作為連接基用ω-氨基酸的Boc-HN-C5H10-COOH(181mg，480μmol)、縮合劑DCC(124mg，480μmol)進(jìn)行縮合反應(yīng)(室溫，15小時(shí))。通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后，使用Boc-HN-C5H10-COOH(68mg，180μmol)、縮合劑HATU(68mg，180μmol)和DIEA(83μL)進(jìn)行逐次增長(zhǎng)反應(yīng)(室溫，30分鐘)。
接著，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)。其后，使用縮合劑HATU(41mg，180μmol)和DIEA(37.5μL)，使下述通式(101)所示的化合物(19.9mg，180μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)5次。

接著，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后，使用Boc-HN-C5H10-COOH(68mg，180μmol)、縮合劑HATU(68mg，180μmol)和DIEA(83μL)進(jìn)行逐次增長(zhǎng)反應(yīng)(室溫，30分鐘)。
接著，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后，使用Boc-HN-C5H10-COOH(68mg，180μmol)、縮合劑HATU(68mg，180μmol)和DIEA(83μL)進(jìn)行逐次增長(zhǎng)反應(yīng)(室溫，30分鐘)。
進(jìn)而，用Pd(PPh3)4的CHCl3/AcOH/N-甲基嗎啉溶液(312mg，2.8mL，1.5mL，0.75mL，室溫30分鐘)進(jìn)行二次處理，將Alloc基脫保護(hù)。接著，使用縮合劑HATU(340mg，900μmol)和DIEA(157μL)使Alloc-Arg(Pbf)-OH(459mg，900μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)2次。
進(jìn)而，用Pd(PPh3)4的CHCl3/AcOH/N-甲基嗎啉溶液(312mg，2.8mL，1.5mL，0.75mL，室溫30分鐘)進(jìn)行二次處理，將Alloc基脫保護(hù)。接著，使用縮合劑HATU(340mg，900μmol)和DIEA(157μL)使Boc-Arg(Pbf)-OH·IPE(474mg，900μmol)縮合(室溫，30分鐘)。
最后，用1N NaOH的二烷水溶液(70％二烷/30％水)進(jìn)行從固相載體Oxime的切除(室溫，5分鐘)，中和后，得到目標(biāo)物(通式(1a-1)所示的化合物)。


實(shí)施例11通式(1a-2)所示的化合物的合成 按照下述所示的反應(yīng)工序，合成以下的通式所示的化合物(1a-2)。

具體來(lái)說(shuō)，按照標(biāo)準(zhǔn)tBoc法(cf.Koch，T.；Hansen，H.F.；Andersen，P.；Larsen，T.；Batz，H.G.；Otteson，K.；Orum，H.J.Peptide Res.1997，49，80-88.)，首先，對(duì)固相載體Oxime(100mg，120μmol)使用作為連接基用ω-氨基酸的Boc-HN-C5H10-COOH(181mg，480μmol)、縮合劑DCC(124mg，480μmol)進(jìn)行縮合反應(yīng)(室溫，15小時(shí))。通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后，使用Boc-HN-C5H10-COOH(68mg，180μmol)、縮合劑HATU(68mg，180μmol)和DIEA(83μL)進(jìn)行逐次增長(zhǎng)反應(yīng)(室溫，30分鐘)。
接著，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)。其后，使用縮合劑HATU(41mg，180μmol)和DIEA(37.5μL)，使下述通式(111)所示的化合物(19.9mg，180μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)5次。

接著，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后，使用Boc-HN-C5H10-COOH(68mg，180μmol)、縮合劑HATU(68mg，180μmol)和DIEA(83μL)進(jìn)行逐次增長(zhǎng)反應(yīng)(室溫，30分鐘)。
接著，通過(guò)TFA處理(95％TFA/5％間甲苯酚)將Boc基脫保護(hù)后，使用Fmoc-HN-C5H10-COOH(64mg，180μmol)、縮合劑HATU(68mg，180μmol)和DIEA(83μL)進(jìn)行逐次增長(zhǎng)反應(yīng)(室溫，30分鐘)。
進(jìn)而，用Pd(PPh3)4的CHCl3/AcOH/N-甲基嗎啉溶液(312mg，2.8mL，1.5mL，0.75mL，室溫30分鐘)進(jìn)行二次處理，將Alloc基脫保護(hù)。接著，使用縮合劑HATU(340mg，900μmol)和DIEA(157μL)使Alloc-Arg(Pbf)-OH(459mg，900μmol)縮合(室溫，30分鐘)。將該操作重復(fù)2次。
進(jìn)而，用Pd(PPh3)4的CHCl3/AcOH/N-甲基嗎啉溶液(312mg，2.8mL，1.5mL，0.75mL，室溫30分鐘)進(jìn)行二次處理，將Alloc基脫保護(hù)。接著，使用縮合劑HATU(340mg，900μmol)和DIEA(157μL)使Boc-Arg(Pbf)-OH·IPE(474mg，900μmol)縮合(室溫，30分鐘)。
最后，用1N NaOH的二烷水溶液(70％二烷/30％水)進(jìn)行從固相載體Oxime的切除(室溫，5分鐘)，中和后，得到目標(biāo)物(通式(1a-2)所示的化合物)。


實(shí)施例12通式(1a-3)所示的化合物的合成 按照下述所示的反應(yīng)工序，合成以下的通式所示的化合物(1a-3)。

參考試驗(yàn)例1核酸導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)(寡鏈DNA水平) 用含10％FBS的RPMI培養(yǎng)基(PC3細(xì)胞、NIH-3T3細(xì)胞、T24細(xì)胞)或含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基(UMUC細(xì)胞)，在12孔板中預(yù)培養(yǎng)PC3(人肺腺癌)細(xì)胞、UMUC3(人膀胱癌)細(xì)胞、T24(人泌尿膀胱癌)細(xì)胞或NIH-3T3(小鼠胚胎成纖維)細(xì)胞，使之成為60-70％連生的狀態(tài)。
將表1所示的化合物[化合物(1-A)或(1-B)分別配制成0.37、0.13、0.04mM的溶液]1μL加入至無(wú)血清培養(yǎng)基50μL中，以輕叩法混合，室溫培養(yǎng)5分鐘。接著，向上述調(diào)制的含核酸導(dǎo)入用載體的培養(yǎng)基中，加入FITC標(biāo)記單鏈DNA(20mer)(FITC-TAATACGACTCACTATAGGGProligo社制)0.3μg，以輕叩法混合，在37℃培養(yǎng)30分鐘(每10分鐘輕叩混合)。將所得混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)后的上述孔中，輕搖勻后在37℃培養(yǎng)4小時(shí)。回收細(xì)胞，通過(guò)以FACS測(cè)定FITC陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算DNA向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入效率(％)。此外，為了進(jìn)行與以往的核酸導(dǎo)入用載體(Lipofectamine 2000，TransIt-TKO，F(xiàn)ugene 6)的比較，使用各公司對(duì)導(dǎo)入核酸量0.3μg的推薦方案，與上述相同求出siRNA向PC3細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入效率(％)。
所得結(jié)果示于表1。由該結(jié)果可以確認(rèn)，化合物(1-A)或(1-B)使核酸向細(xì)胞內(nèi)透過(guò)的作用優(yōu)異，作為核酸導(dǎo)入用載體是有用的。
[表1] DNA向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入效率(％) Lipofectamine 2000Invitrogen公司制 TransIT-TKOMirus公司制 FuGene 6Roche公司制 參考例1-17核酸導(dǎo)入用載體的制備 將溶于有機(jī)溶劑的脂質(zhì)及上述的陽(yáng)離子脂質(zhì)體構(gòu)成單元(構(gòu)成示于表2)加入適當(dāng)大小的玻璃容器(梨形燒瓶或試管等)中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸除溶劑(膜的制備)。在真空條件下(6小時(shí)以上)完全除去溶劑后，用磷酸緩沖液(PBS緩沖液，pH7.4)水合使最終濃度為2.0mM，將形成的膜完全剝離，制備脂質(zhì)懸浮液。將該懸浮液交替浸入干冰浴和溫水，反復(fù)進(jìn)行所謂的“凍融”操作10次，制備多層脂質(zhì)體(MLVmultilamellar vesicle)。
接著，MLV調(diào)整為粒徑200～100nm左右的LUV(large unilamellarvesicle)或粒徑20nm左右的SUV(small unilamellar vesicle)。LUV通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)制備裝置(Avanti公司制Mini-Extruder)制備。此外，SUV通過(guò)探針型超聲波儀(TOMY公司制UD-220)制備。
[表2] DOPE1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺 POPC1-十六烷酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷脂酰膽堿 參考試驗(yàn)例2核酸導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)(siRNA水平) 在導(dǎo)入前一天將PC3(人肺腺癌)細(xì)胞、UMUC3(人膀胱癌)細(xì)胞或T24(人泌尿膀胱癌)細(xì)胞接種于6孔板并在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以使其在siRNA導(dǎo)入時(shí)成為50-60％連生狀態(tài)。
在1.5ml的試管中加入100μL的Opti-MEM，向其中加入含有參考例3或8的核酸導(dǎo)入用載體的PBS溶液(各核酸導(dǎo)入用載體的具有量調(diào)整至使化合物(1L-A)為0.067mM)1、3或10μL，在室溫靜置約10分鐘后，進(jìn)一步添加FITC標(biāo)記siRNA[熒光標(biāo)記siRNA((有義)Fluo-GACCCGCGCCGAGGUGAAGUU/(反義)CUUCACCUCGGCGCGGGUCUUProligo公司制)]0.5μg，靜置15分鐘，形成siRNA與基因?qū)胗幂d體的復(fù)合體。
此外，另外在1.5ml的試管中加入50μL的Opti-MEM，向其中加入0.6mM的含有化合物(1-A)或(1-B)的PBS溶液1、3、10μL，輕叩混合，在室溫下靜置5分鐘后，進(jìn)一步添加FITC標(biāo)記siRNA(與上述相同)0.5μg，靜置30分鐘，形成siRNA與基因?qū)胗幂d體的復(fù)合體。
將這樣調(diào)制的siRNA和基因?qū)胗幂d體的含有液加入至細(xì)胞以50-60％連生狀態(tài)存在的各孔中，將板前后左右輕搖后在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2小時(shí)。培養(yǎng)后，通過(guò)以流式細(xì)胞儀測(cè)定FITC陽(yáng)性細(xì)胞，算出siRNA向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入效率(％)。此外，為了進(jìn)行與以往的核酸導(dǎo)入用載體(Lipofectamine 2000，TransIt-TKO，Metafectene，oligofectamline)的比較，使用各公司對(duì)導(dǎo)入核酸量0.5μg的推薦方案，與上述相同求出siRNA向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入效率(％)。
所得結(jié)果示于表3。由該結(jié)果可知，通過(guò)使用化合物(1L-A)，與以往公知的核酸導(dǎo)入用載體相比，能夠高效地向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入siRNA。
[表3] siRNA向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入效率(％) Lipofectamine 2000invitrogen公司制 TransIt-TKOMirus公司制 MetafecteneBiontex公司制 OligofectamineInvitrogen公司制 試驗(yàn)例3核酸導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)(質(zhì)粒DNA水平) 在導(dǎo)入前一天將PC3(人肺腺癌)細(xì)胞接種于6孔板并在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)，以使其在質(zhì)粒DNA導(dǎo)入時(shí)成為60-70％連生狀態(tài)。將各孔中的培養(yǎng)液在導(dǎo)入2小時(shí)前置換為無(wú)血清培養(yǎng)基(RPMI培養(yǎng)基)。
在1.5ml的試管中加入250μL的Opti-MEM，向其中加入含有參考例3的核酸導(dǎo)入用載體的PBS溶液(各核酸導(dǎo)入用載體的含量調(diào)整至使化合物(1L-A)為0.133mM)5μL，在室溫下靜置約10分鐘后，進(jìn)一步向其中添加含有EGFP重組質(zhì)粒DNA(pEGFP-N3)的Opti-MEM(pEGFP-N3的濃度5.0μg/250ml)250μl，輕叩后靜置15分鐘，形成質(zhì)粒DNA與核酸導(dǎo)入用載體的復(fù)合體。
將這樣調(diào)制的siRNA和基因?qū)胗幂d體的含有液加入至細(xì)胞以60-70％連生狀態(tài)存在的各孔中，將板前后左右輕搖后在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)2小時(shí)后，完全置換為培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2條件下進(jìn)一步培養(yǎng)45小時(shí)(合計(jì)47小時(shí))。培養(yǎng)后，通過(guò)以流式細(xì)胞儀測(cè)定GFP(綠色熒光蛋白質(zhì))的陽(yáng)性細(xì)胞，算出質(zhì)粒DNA向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入效率(％)。
此外，為了進(jìn)行與以往的核酸導(dǎo)入用載體(FuGene 6，Lipofectamine2000，Metafectene)的比較，按照各公司推薦的方案，向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入質(zhì)粒DNA，與上述相同求出導(dǎo)入效率(％)。
所得結(jié)果示于表4。由該結(jié)果可知，通過(guò)使用化合物(1L-A)，能夠向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入質(zhì)粒DNA。
[表4] 質(zhì)粒DNA向細(xì)胞內(nèi)的導(dǎo)入效率(％) 參考試驗(yàn)例4核酸導(dǎo)入實(shí)驗(yàn)(siRNA水平) 在導(dǎo)入前一天將PC3(人肺腺癌)/Bcl-2細(xì)胞(向PC3導(dǎo)入了插入有Bcl-2的質(zhì)粒的細(xì)胞)接種于6孔板并在37℃、5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以使其在siRNA導(dǎo)入時(shí)成為50-60％連生狀態(tài)。
在1.5ml的試管中加入100μL的Opti-MEM，向其中加入含有參考例3的核酸導(dǎo)入用載體的PBS溶液(各核酸導(dǎo)入用載體的含有量調(diào)整至使化合物(1L-A)為0.067mM)6μL，在室溫下進(jìn)行10分鐘預(yù)培養(yǎng)。向其中添加13.5-450pmol的與bcl-2對(duì)應(yīng)的siRNA[siRNA((有義)GACCCGCGCCGAGGUGAAGUU/(反義)CUUCACCUCGGCGCGGGUCUUProligo社制)]，靜置15分鐘，形成siRNA與基因?qū)胗幂d體的復(fù)合體。將該復(fù)合體滴入細(xì)胞以50-60％連生狀態(tài)存在的各孔中，在37℃培養(yǎng)約48小時(shí)。培養(yǎng)后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)bcl-2蛋白質(zhì)的表達(dá)。
此外，為了與以往的核酸導(dǎo)入用載體(Roche公司制XtremeGene)進(jìn)行比較，使用各公司對(duì)導(dǎo)入核酸量0.5μg的推薦方案，與上述相同測(cè)出向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入與bcl-2對(duì)應(yīng)的siRNA的效率(泳道2，3)。此外，還證明了即使用復(fù)合體將不含靶序列的與GFP對(duì)應(yīng)的siRNA導(dǎo)入，也不會(huì)引起bcl-2蛋白質(zhì)表達(dá)的抑制效果(泳道4)。各泳道的詳細(xì)導(dǎo)入條件如下表所示。
所得結(jié)果示于圖1。由該結(jié)果可知，通過(guò)使用化合物(1L-A)，與以往公知的核酸導(dǎo)入用載體相比，被導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)的siRNA顯示了高效的蛋白質(zhì)表達(dá)抑制效果。
產(chǎn)業(yè)上的可應(yīng)用性 本發(fā)明通式(1)所示的化合物在側(cè)鏈上具有氨基酸或寡肽，能夠更有效發(fā)揮基于這些氨基酸或寡肽的有用活性。特別是在通式(1)所示的化合物中，通過(guò)具備選自精氨酸、賴氨酸和絲氨酸中的氨基酸或含有這些氨基酸的寡肽，能夠有效發(fā)揮膜透過(guò)功能。
此外，本發(fā)明通式(1a)所示的化合物，游離氨基被保護(hù)基保護(hù)，并且重復(fù)單元C的末端上存在游離羧基。因此，通式(1a)所示的化合物能夠容易地與具有氨基或羥基的靶化合物進(jìn)行縮合反應(yīng)，能夠?qū)υ摪谢衔镔x予基于氨基酸或寡肽的有用活性。
權(quán)利要求
1.下述通式(1)所示的化合物
式(1)中，n1表示0～10的整數(shù)，n2表示1～50的整數(shù)，n3表示1～10的整數(shù)；
m1表示0～100的整數(shù)，m2表示0～100的整數(shù)，m3表示0～100的整數(shù)，m4表示0或1的整數(shù)，m5表示0～100的整數(shù)，m6表示0～100的整數(shù)；
Y表示羥基或氨基；
E表示N或CH；
R表示氨基酸殘基或由2～100個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽殘基；
L表示氫原子、具有脂質(zhì)基的基團(tuán)、具有脂肪酸殘基的基團(tuán)或具有熒光性基團(tuán)的基團(tuán)；
n1為2以上時(shí)，重復(fù)單元A中的m1，在各個(gè)重復(fù)單元A之間可以相同也可以不同；
n2為2以上時(shí)，重復(fù)單元B中的m2～m5及R，在各個(gè)重復(fù)單元B之間可以相同也可以不同；
n3為2以上時(shí)，重復(fù)單元C中的m6，在各個(gè)重復(fù)單元C之間可以相同也可以不同。
2.權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，式(1)中，L為具有磷脂基的基團(tuán)。
3.權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，式(1)中，R為選自精氨酸殘基、賴氨酸殘基和絲氨酸殘基中的氨基酸殘基，或具有這些氨基酸殘基中的至少1種的肽殘基。
4.權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，式(1)中，R為肽殘基，所述肽殘基由選自精氨酸殘基、賴氨酸殘基和絲氨酸殘基中的1種或2種以上的氨基酸殘基構(gòu)成且氨基酸殘基的總數(shù)為2～20個(gè)。
5.權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，式(1)中，R為由2～5個(gè)精氨酸殘基構(gòu)成的肽殘基。
6.權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，式(1)中，n1為0～2的整數(shù)，n2為1～10的整數(shù)，n3為0～2的整數(shù)。
7.權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，式(1)中，E為N，m2為2，m3和m4為1，m5為5。
8.權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，式(1)中，E為CH，m2、m3和m4為0，m5為4。
9.下述通式(1a)所示的化合物
n1～n3、m1～m6、E和R與上述相同，
Y表示羥基；
X表示保護(hù)基；
Z表示與保護(hù)基X不同的保護(hù)基Za或者與保護(hù)基X相同的保護(hù)基Zb；
RZ表示上述R的氨基酸殘基或肽殘基的官能團(tuán)上結(jié)合有保護(hù)基Z；
n1為2以上時(shí)，重復(fù)單元A中的m1，在各個(gè)重復(fù)單元A之間可以相同也可以不同；
n2為2以上時(shí)，重復(fù)單元B中的m2～m5及RZ，在各個(gè)重復(fù)單元B之間可以相同也可以不同；
n3為2以上時(shí)，重復(fù)單元C中的m6，在各個(gè)重復(fù)單元C之間可以相同也可以不同。
10.權(quán)利要求9所述的化合物，其特征在于，式(1a)中，X為叔丁氧羰基或9-芴甲氧羰基。
11.權(quán)利要求9所述的化合物，其特征在于，式(1a)中，R為選自精氨酸殘基、賴氨酸殘基和絲氨酸殘基中的氨基酸殘基，或?yàn)楹羞@些氨基酸殘基中的至少1種且氨基酸殘基的總數(shù)為2～20個(gè)的肽殘基。
12.權(quán)利要求9所述的化合物，其特征在于，式(1a)中，R為肽殘基，所述肽殘基由選自精氨酸殘基、賴氨酸殘基和絲氨酸殘基中的1種或2種以上的氨基酸殘基構(gòu)成且氨基酸殘基的總數(shù)為2～20個(gè)。
13.權(quán)利要求9所述的化合物，其特征在于，式(1a)中，R為由2～5個(gè)精氨酸殘基構(gòu)成的肽殘基。
14.權(quán)利要求9所述的化合物，其特征在于，式(1a)中，n1為0～2的整數(shù)，n2為1～10的整數(shù)，n3為0～2的整數(shù)。
15.權(quán)利要求9所述的化合物，其特征在于，式(1a)中，E為N，m2為2，m3和m4為1，m5為5。
16.權(quán)利要求9所述的化合物，其特征在于，式(1a)中，E為CH，m2、m3和m4為0，m5為4。
17.復(fù)合化合物，其特征在于，通過(guò)權(quán)利要求9所述的化合物與具有氨基或羥基的化合物的縮合反應(yīng)而合成。
18.權(quán)利要求17所述的復(fù)合化合物，其特征在于，所述具有氨基或羥基的化合物為PNA單體或PNA寡聚物。
19.下述通式(1)所示的化合物的制備方法，其包含以下第1-1工序～第1～5工序
式(1)中，n1表示0～10的整數(shù)，n2表示1～50的整數(shù)，n3表示1～10的整數(shù)；m1表示0～100的整數(shù)，m2表示0～100的整數(shù)，m3表示0～100的整數(shù)，m4表示0或1的整數(shù)，m5表示0～100的整數(shù)，m6表示0～100的整數(shù)；Y表示羥基或氨基；E表示N或CH；R表示氨基酸殘基或由2～100個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽殘基；L表示氫原子、具有脂質(zhì)的基團(tuán)、具有脂肪酸殘基的基團(tuán)或具有熒光性基團(tuán)的基團(tuán)；n1為2以上時(shí)，重復(fù)單元A中的m1，在各個(gè)重復(fù)單元A之間可以相同也可以不同；n2為2以上時(shí)，重復(fù)單元B中的m2～m5及R，在各個(gè)重復(fù)單元B之間可以相同也可以不同；n3為2以上時(shí)，重復(fù)單元C中的m6，在各個(gè)重復(fù)單元C之間可以相同也可以不同；
第1-1工序使下述通式(I)所示的化合物
縮合于固相樹(shù)脂或固相化合物后，通過(guò)進(jìn)行n3-1次縮合于固相樹(shù)脂或固相化合物的化合物的保護(hù)基X的脫除以及通式(I)所示的化合物的縮聚，得到下述通式(i)所示的化合物的工序，
式(I)中，m6與上述相同，
式(i)中，n3、m6和X與上述相同；“固相”表示固相樹(shù)脂或固相化合物；
第1-2工序通過(guò)對(duì)通式(i)所示的化合物進(jìn)行n2次下述通式(II)所示的化合物
的縮合反應(yīng)，得到下述通式(ii)所示的化合物的工序，
式(II)中，m2～m5和X與上述相同，Za表示與X不同的保護(hù)基，式(ii)中，n2、n3、m2～m6、X、Za和“固相”與上述相同；
第1-3工序通過(guò)對(duì)通式(ii)所示的化合物進(jìn)行n1次下述通式(III)所示的化合物
的縮合反應(yīng)，得到下述通式(iii)所示的化合物的工序，
式(III)中，m1和X與上述相同，
式(iii)中，n1～n3、m1～m6、X、Za和“固相”與上述相同；
第1-4工序通過(guò)對(duì)通式(iii)所示的化合物進(jìn)行1～100次在結(jié)合于α位碳原子的羧基以外的官能團(tuán)上結(jié)合有保護(hù)基Za的氨基酸的縮合反應(yīng)，得到下述通式(iv)所示的化合物的工序，
式(iv)中，n1～n3、m1～m6、X、RZa和“固相”與上述相同；
第1-5工序從通式(iv)所示的化合物切除固相樹(shù)脂或固相化合物而在末端形成-COOH或-CONH2，并且脫除保護(hù)基X和Za，從而得到通式(1)所示的化合物的工序。
20.下述通式(1a)所示的化合物的制備方法，其包含以下第3-1工序～第3～5工序
n1～n3、m1～m6、E、X和RZ與上述相同；Y為羥基；n1為2以上時(shí)，重復(fù)單元A中的m1，在各個(gè)重復(fù)單元A之間可以相同也可以不同；n2為2以上時(shí)，重復(fù)單元B中的m2～m5及RZ，在各個(gè)重復(fù)單元B之間可以相同也可以不同；n3為2以上時(shí)，重復(fù)單元C中的m6，在各個(gè)重復(fù)單元C之間可以相同也可以不同；
第3-1工序使下述通式(I)所示的化合物
縮聚于具有氨基的固相樹(shù)脂或固相化合物后，通過(guò)進(jìn)行n3-1次縮聚于固相樹(shù)脂或固相化合物的化合物的保護(hù)基X的脫除以及將通式(I)所示的化合物的縮聚，得到下述通式(i)所示的化合物的工序；
式(I)中，m6與上述相同，
式(i)中，n3、m6和X與上述相同，“固相”表示固相樹(shù)脂或固相化合物；
第3-2工序通過(guò)對(duì)通式(i)所示的化合物進(jìn)行n2次下述通式(II)所示的化合物
的縮合反應(yīng)，得到下述通式(ii)所示的化合物的工序；
式(II)中，m2～m5、X和Za與上述相同，
式(ii)中，n2、n3、m2～m6、X、Za和“固相”與上述相同；
第3-3工序通過(guò)對(duì)通式(ii)所示的化合物進(jìn)行n1次下述通式(III)所示的化合物
的縮合反應(yīng)，得到下述通式(iii)所示的化合物的工序；
式(III)中，m1和X與上述相同，
式(iii)中，n1～n3、m1～m6、X、Za和“固相”與上述相同；
第3-4工序通過(guò)對(duì)通式(iii)所示的化合物進(jìn)行1～100次在氨基上結(jié)合有保護(hù)基Z的氨基酸的縮合反應(yīng)，得到下述通式(iv)所示的化合物的工序；
式(iv)中，n1～n3、m1～m6、X、RZa和“固相”與上述相同，
第3-5工序根據(jù)需要將通式(iv)所示化合物的保護(hù)基Za置換為保護(hù)基Zb，在保留保護(hù)基X和Z的狀態(tài)下，切除固相樹(shù)脂或固相化合物，在末端形成-COOH，由此得到通式(1a)所示的化合物的工序。
全文摘要
本發(fā)明的主要目的在于提供這樣結(jié)構(gòu)的化合物具有氨基酸或寡肽的側(cè)鏈結(jié)合于主鏈，其是以下的通式(1)所示的化合物式(1)中，n1～n3、及m1～m6表示規(guī)定的整數(shù)；Y表示羥基或氨基；E表示N或CH；R表示氨基酸殘基或由2～100個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的肽殘基；L表示氫原子、具有脂質(zhì)基的基團(tuán)、具有脂肪酸殘基的基團(tuán)或具有熒光性基團(tuán)的基團(tuán)。
文檔編號(hào)C07K7/00GK101163713SQ20068001301
公開(kāi)日2008年4月16日 申請(qǐng)日期2006年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月22日
發(fā)明者池田壽文, 外崎圓 申請(qǐng)人:創(chuàng)新生命化學(xué)日本株式會(huì)社