專(zhuān)利名稱(chēng)：：P-鈣黏著蛋白抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及結(jié)合P-鈣黏著蛋白的抗體及其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明還涉及編碼這類(lèi)抗體和抗原結(jié)合部分的核酸分子、制造P-鈣黏著蛋白抗體和抗原結(jié)合部分的方法、包含這些抗體和抗原結(jié)合部分的組合物以及使用這些抗體、抗原結(jié)合部分和組合物的方法。
背景技術(shù)：
：鈣黏著蛋白是在發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞黏附的跨膜糖蛋白超家族(Gumbiner乂0〃.所o/"148:399-404(2000);Yagi,etal.，Ge"^Dev,，14:1169-1180(2000))。鈣黏著蛋白的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)(如鏈蛋白和pl20)相互作用，這形成了鈣黏著蛋白附著在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架上的基礎(chǔ)。鈣黏著蛋白具有五個(gè)細(xì)胞外C^+結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)在經(jīng)典鈣黏著蛋白中高度保守的小細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。經(jīng)典的鈣黏著蛋白家族成員包括P-鈣黏著蛋白、E-鈣黏著蛋白和N-鈣黏著蛋白。細(xì)胞黏附分子(如鈣黏著蛋白)被認(rèn)為在癌細(xì)胞和轉(zhuǎn)移細(xì)胞的細(xì)胞聯(lián)絡(luò)中起重要作用(Furukawa,etal.，Af/mMco"i仏rec/mi，e38(4):343-352(1997))。正常成人組織中P-鈣黏著蛋白低表達(dá)，并基本上限于肌上皮細(xì)胞和復(fù)層上皮的基底層(Shimoyama,etal.C匿erL49:2128-33(1989))。在炎性腸疾病如Crohn's疾病和結(jié)腸炎中P-鈣黏著蛋白被上調(diào)(Hardy,etal.,50:513-519(2002))。目前大量證據(jù)表明異常的P-鈣黏著蛋白表達(dá)與細(xì)胞增殖和結(jié)腸、胸、肺、甲狀腺和子宮頸腫瘤相關(guān)(Gamallo,A/o^r"尸W/w/ogy,14:650-654,(2001);和Stefansson,etal.,C//".Owco/.22(7):1242-1252(2004))。人P-鈣黏著蛋白被報(bào)導(dǎo)為是能被NCC-CAD-299單克隆抗體識(shí)別的抗原，所述抗體是針對(duì)外陰表皮樣癌產(chǎn)生的(Shimoyama,etal.，C""cerie乂，49:2128-2133(1989))。對(duì)P-鈣黏著蛋白介導(dǎo)的粘附和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)預(yù)期能導(dǎo)致體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活降低。因此，考慮到P-鈣黏著蛋白看起來(lái)具有控制細(xì)胞增殖和實(shí)體瘤發(fā)展的關(guān)鍵作用，產(chǎn)生針對(duì)P-鈣黏著蛋白的、能夠給多種癌癥患者提供治療益處的抗體是人們需要的。
發(fā)明內(nèi)容在一個(gè)方面，本發(fā)明是P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分，其中抗體或其抗原結(jié)合部分具有下文A)到K)中所述的若干功能特征的至少一種。A)例如在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體或其抗原結(jié)合部分具有與E-鈣黏著蛋白(Kd(E))相比対P-鈣黏著蛋白(kd(P))更大的結(jié)合親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分具有大于或等于1.5的KD(E)/KD(P)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分具有大于或等于2、大于或等于3、大于或等于5、大于或等于10、大于或等于20、大于或等于50、大于或等于100、大于或等于200、大于或等于500或大于或等于1000的KD(E)/KD(P)。典型地，Kd(E)/Kd(P)値不存在上限，因?yàn)镵"E)值可以非常小，例如是0。然而對(duì)于實(shí)踐目的而言，Kd(E)/Kd(P)的上限可以是1x106。對(duì)P-鈣黏著蛋白和E-鈣黏著蛋白而言，這類(lèi)Ko值可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)測(cè)量，例如通過(guò)ELISA、RIA、流式細(xì)胞儀或表面等離振子共振，例如BIACORETm。B)在另一實(shí)施方案中，通過(guò)表面等離振子共振測(cè)量，抗體或其部分以1000nM或更小的Kd與P-鈣黏著蛋白結(jié)合。在另一實(shí)施方案中，通過(guò)表面等離振子共振測(cè)量，抗體或其部分以小于500nM、小于100nM、小于50nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM、小于500pM或小于100pM的Kd與P-鈣黏著蛋白結(jié)合。典型地，不存在Ko值的下限。然而對(duì)于實(shí)踐目的而言，下限可假定為約1pM。C)在另一實(shí)施方案中，如通過(guò)表面等離振子共振所測(cè)量的，抗體或其部分對(duì)P-鈣黏著蛋白具有小于或等于0.01S—4勺清除率(k。ff)。例如，在某些實(shí)施方案中抗體或其部分對(duì)P-鈣黏著蛋白具有小于0.005s—\小于0.004s—1、小于0.003s—1、小于0.002"或小于0.001"的k。ff。典型地，不存在k。ff值的下限。然而對(duì)于實(shí)踐的目的而言，下限可假定為約1x10—7s—]。D)在另一實(shí)施方案中，如通過(guò)P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性細(xì)胞粘附測(cè)定法所測(cè)量的，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分具有100nM或更小的IC,在另一實(shí)施方案中，如通過(guò)P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性細(xì)胞粘附測(cè)定法所測(cè)定的，所述ICso小于50nM、小于40nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM、小于500pM、小于200pM、小于100pM或小于10pM。典型地，如通過(guò)P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性細(xì)胞粘附測(cè)定法所測(cè)定的，不存在ICm)値的下限。然而對(duì)于實(shí)踐的目的而言，下限可假定為約1pM。E)在另一實(shí)施方案中，如通過(guò)P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性細(xì)胞聚集測(cè)定法所測(cè)量的，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分具有100nM或更小的ICso。在另一實(shí)施方案中，如通過(guò)P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性細(xì)胞聚集測(cè)定法所測(cè)定的，所述ICso小于50nM、小于40nM、小于20nM、小于10nM、小于1nM、小于500pM、小于200pM、小于100pM或小于1pM。典型地，如通過(guò)P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性細(xì)胞聚集測(cè)定法所測(cè)定的，不存在IQo值的下限。然而對(duì)于實(shí)踐的目的而言，下限可假定為約1pM。F)在另一實(shí)施方案中，在P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性球狀體破壞測(cè)定法中，與不存在IgG的對(duì)照樣品相比，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分以至少2的因數(shù)提高球狀體破壞。在另一實(shí)施方案中，在P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性球狀體破壞測(cè)定法中，與不存在IgG的對(duì)照樣品相比，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分以至少3、至少4、至少6、至少10或至少15的因數(shù)提高球狀體破壞。G)在另一實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分與選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-eOl;196-dl0;196-g03;196層e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196-h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;和g-129-lc4的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P4丐黏著蛋白。H)在另一實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分與選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196陽(yáng)h02;194-eOl;196-dl0;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196-h02;g-194-e01;g-194-e06129-lc4;和g-129-lc4的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P-鈣黏著蛋白。I)在另一實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分與選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-eOl;196-dl0;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-1%-h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;和g-129-lc4的抗體結(jié)合P-鈣黏著蛋白的相同表位。J)在另一實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分與選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-eOl;196-dlO;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196陽(yáng)h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;和g-129-lc4的抗體以基本上相同的KD結(jié)合P-鈣黏著蛋白。K)在另一實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其部分與選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196陽(yáng)h02;194-eOl;196-dlO;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196-h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;andg-129-lc4的抗體以基本上相同的k。ff結(jié)合P-鈣黏著蛋白。本發(fā)明的另一方面是至少具有先前在A)到K)中描述的功能特征之一的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含氨基酸序列與SEQIDNOs:1到13和320到325之任一至少90%同一的VH結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與SEQIDNOs:1到12和320到325之任一至少91%、至少93%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一。在另一實(shí)施方案中，抗體或其部分至少具有先前在A)到K)中描述的功能特征之一，其包含一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域，所述VH結(jié)構(gòu)域是SEQIDNOs:1到13和320到325之任一，或因具有至少一個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:1至U13和320到325之任一不同。例如，VH結(jié)構(gòu)域因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:1到13和320到325之任一不同。在另一實(shí)施方案中，任何這些保守的氨基酸取代可發(fā)生在CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)。本發(fā)明的另一方面是至少具有先前在A)到K)中描述的功能特征之一的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含一個(gè)氨基酸序列與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一至少90%同一的V^結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述V^結(jié)構(gòu)域氨基酸序列與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一至少91%、至少93%、至少95%、至少97%、至少99%或100%同一。在另一實(shí)施方案中，抗體或其部分至少具有先前A)到K)中所述的功能特征之一，并包含一個(gè)VL結(jié)構(gòu)域，所述V^結(jié)構(gòu)域是SEQIDNOs:14到23和326到331之任一，或因具有至少一個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一不同。例如Vj吉構(gòu)域因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDN0s:14到23和326到331之任一不同。在另一實(shí)施方案中，任何這些保守的氨基酸取代可發(fā)生在CDR1、CDR2禾口/或CDR3區(qū)。本發(fā)明的另一方面是至少具有先前A)到K)中所述功能特征之一的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中Vl和VH結(jié)構(gòu)域分別與下述抗體的Vl和Vh結(jié)構(gòu)域氨基酸序列至少90%同一，所述抗體選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-eOl;196-dl0;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194陽(yáng)b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196-h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;和g-129-lc4任一。例如，Vl和VH結(jié)構(gòu)域分別與下述抗體的Vl和VH結(jié)構(gòu)域氨基酸序列至少91%、93%、95%、97%、99%或100%同一，所述抗體選自194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-eOl;196-dl0;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g陽(yáng)196-g03;g-196-h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;和g-129-lc4任一。本發(fā)明的另一方面是選自以下的抗體或其抗原結(jié)合部分a)包含如SEQIDNO:1所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:14所公開(kāi)的VL結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；b)包含如SEQIDNO:2所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:14所公開(kāi)的VL^結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；c)包含如SEQIDNO:2所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:15所公開(kāi)的Vt結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；d)包含如SEQIDNO:3所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:16所公開(kāi)的V^結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；e)包含如SEQIDNO:4所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:17所公開(kāi)的VL結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；f)包含如SEQIDNO:4所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:23所公開(kāi)的V卜結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；g)包含如SEQIDNO:5所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:18所公開(kāi)的VL結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；h)包含如SEQIDNO:6所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:23所公開(kāi)的VL結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；i)包含如SEQIDNO:7所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:23所公開(kāi)的Vl結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；j)包含如SEQIDNO:8所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:23所公開(kāi)的VL結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；k)包含如SEQIDNO:9所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:23所公開(kāi)的Vj吉構(gòu)域的抗體或其部分；1)包含如SEQIDNO:10所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:19所公開(kāi)的VL結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；m)包含如SEQIDNO:11所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:20所公開(kāi)的Vj吉構(gòu)域的抗體或其部分；n)包含如SEQIDNO:12所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:21所公開(kāi)的Vl結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；o)包含如SEQIDNO:13所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:22所公開(kāi)的VL結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；p)包含如SEQIDNO:320所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:326所公開(kāi)的V^結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；q)包含如SEQIDNO:321所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:327所公開(kāi)的Vt結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；r)包含如SEQIDNO:322所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:328所公開(kāi)的結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；s)包含如SEQIDNO:323所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:329所公開(kāi)的VL結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；t)包含如SEQIDNO:324所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:330所公開(kāi)的VL結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分；和u)包含如SEQIDNO:325所公開(kāi)的VH結(jié)構(gòu)域和如SEQIDNO:331所公開(kāi)的VL結(jié)構(gòu)域的抗體或其部分。在另一實(shí)施方案中，對(duì)如上文在組a)到u)中所述的任何抗體或其部分而言，Vh和/或Vt結(jié)構(gòu)域可與本文所述的特定SEQIDNOs因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同。例如Vh和/或V^結(jié)構(gòu)域可與所述的SEQIDNO因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)保守的氨基酸取代而不同。在另一實(shí)施方案中，這些保守的氨基酸取代中任一可發(fā)生在CDR1、CDR2和/或CDR3區(qū)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有至少一種先前在A)到K)中所述功能特征的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含一個(gè)VH結(jié)構(gòu)域和一個(gè)VL結(jié)構(gòu)域，所述VH結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地選自SEQIDNOs:1到13和320到325之任一，或是與SEQIDNOs:1到13和320到325之任一因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列；所述V^結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地選自SEQIDNOs:14到23和326到331之任一，或是與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列。例如，Vh和VL結(jié)構(gòu)域可各自獨(dú)立地與SEQIDNOs:1到13、320到325、14到23和326到331之任一因l、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)保守的氨基酸取代而不同。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有至少一種先前在A)到K)中所述功能特征的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或部分包含選自SEQIDNOs:26到37禾q91到256之任一的VHCDR3，或與SEQIDNOs:26到37和91到256之任一因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列。例如，VHCDR3可與SEQIDNOs:26到37和91到256之任一因1、2、3或4個(gè)保守的氨基酸取代而不同。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有至少一種先前在A)到K)中所述功能特征的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或部分包含選自SEQIDNOs:40到47和257至U319之任一的VLCDR3，或與SEQIDNOs:40到47和257到319之任一因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列。例如，VLCDR3可與SEQIDNOs:40到47和257至U319之任-一因1、2、3或4個(gè)保守的氨基酸取代而不同。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分包含如SEQIDNO:24中公幵的VhCDR1，或與SEQIDNO:24因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列；如SEQIDNO:25中所公開(kāi)的VHCDR2，或與SEQIDNO:25因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列；和獨(dú)立地選自SEQIDNOs:26到37和91到256之任一的VHCDR3，或與SEQIDNOs:26到37禾卩91到256之任一因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列。例如上文提到的每個(gè)VHCDR1、CDR2和CDR3序列可獨(dú)立地與各自所述的SEQIDNOs因1、2、3、4或5個(gè)保守的氨基酸取代而不同。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分包含如SEQIDN0:38中公開(kāi)的V^CDR1，或與SEQIDNO:38因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列；如SEQIDNO:39中所公開(kāi)的VlCDR2，或與SEQIDNO:39因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列；和獨(dú)立地選自SEQIDNOs:40到47和257到319之任一的VLCDR3，或與SEQIDNOs:40到47和257到319之任一因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列。例如上文提到的每個(gè)VLCDR1、CDR2和CDR3序列可獨(dú)立地與各自所述的SEQIDNOs因1、2、3、4或5個(gè)保守的氨基酸取代而不同。本發(fā)明還提供了抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分包含如SEQIDNO:24中公開(kāi)的VHCDRl;如SEQIDNO:25中所公開(kāi)的VHCDR2;選自SEQIDNOs:26到37和91至U256之任一的VHCDR3;如SEQIDNO:38中公開(kāi)的VLCDRl;如SEQIDNO:39中公開(kāi)的VLCDR2;和選自SEQIDNOs:40到47禾q257到319之任一的VLCDR3。在另一實(shí)施方案中，所述每個(gè)Vh和VLCDR1、CDR2禾卩CDR3序列也可獨(dú)立地與上文所述特定的SEQIDNOs因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同。例如每個(gè)CDR1、CDR2禾卩CDR3序列可獨(dú)立地與上文所述的特定SEQIDNOs因1、2、3、4或5個(gè)保守的氨基酸取代而不同。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分包含如存在于l94-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-e01;196-dlO;196-g03;196-e06;195-a09;198陽(yáng)a09;200畫(huà)h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196隱h02;g隱194-e01;g-194-e06;129-lc4;禾卩gl29畫(huà)lc4的任何抗體中的VH和VLCDRl、VH和VLCDR2和VH和VLCDR3。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含選自SEQIDNOs:1到3和20到325之任一或與SEQIDNOs:1到3和20到325之任一因1到10個(gè)保守的氨基酸取代而不同的VH結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含選自SEQIDNOs:14到23和326到331之任一或與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一因1到IO個(gè)保守的氨基酸取代而不同的Vl枸域。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含一個(gè)vh結(jié)構(gòu)域和一個(gè)Vj吉構(gòu)域，所述vh結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地選自SEQIDNOs:1到13和320到325之任一，或是與SEQIDNOs:1到13和320到325之任一因1到10個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列；所述V^結(jié)構(gòu)域獨(dú)立地選自SEQIDNOs:14到23和326到331之任一，或是與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一因至1到IO個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分包含如SEQIDNO:24中公幵的VhCDR1，或與SEQIDNO:24因1到4個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列；如SEQIDNO:25中所公開(kāi)的VHCDR2，或與SEQIDNO:25因1到4個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列；和選自SEQIDNOs:26到37和91到256之任一的VHCDR3，或與SEQIDNOs:26到37和91到256之任一因1到4個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列。本發(fā)明還提供抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分包含如SEQIDNO:38中公開(kāi)的VLCDR1，或與SEQIDNO:38因1到4個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列；如SEQIDNO:39中所公開(kāi)的VLCDR2，或與SEQIDNO:39因1到4個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列；和選自SEQIDNOs:40到47和257到319之任一的VLCDR3，或與SEQIDNOs:40到47和257到319之任一因1到4個(gè)保守的氨基酸取代而不同的序列。本發(fā)明還提供至少具有先前在A)到K)中描述的功能特征之一的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分包含如SEQIDNO:48中公開(kāi)的VHFR1;如SEQIDNO:49中公開(kāi)的VHFR2;選自SEQIDNOs:50到55之任一的VHFR3;選自SEQIDNOs:56和57之任一的VHFR4;選自SEQIDNOs:58和59之任一的VlFR1;選自SEQIDNOs:60到62之任一的VLFR2;選自SEQIDNOs:63到66之任一的VlFR3;和如SEQIDNO:67中公開(kāi)的FR4。在另一實(shí)施方案中，每個(gè)所述Vh和VLFR1、FR2、FR3和FR4序列也可獨(dú)立地與上述特定的SEQIDNOs因至少一個(gè)保守的氨基酸取代而不同。例如，每個(gè)所述FRKFR2、FR3和FR4序列可獨(dú)立地與上述各自特定的SEQIDNOs因1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)保守的氨基酸取代而不同。還在另一實(shí)施方案中，每個(gè)FR1、FR2、FR3禾卩FR4序列之任一可獨(dú)立地被突變以匹配各自的種系框架序歹ll(germlineframeworksequence)。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是本文所述的任何抗體，其中所述抗體為IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子，或來(lái)自其中。例如，抗體可以是IgGi或lgG2。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，IgG是IgGp其中重鏈恒定區(qū)包含SEQIDNO:344，其中輕鏈恒定區(qū)包含SEQIDNO:345，并且SEQIDNO:344的C-端任選地被切割。另一實(shí)施方案提供上述任何抗體或抗原結(jié)合部分，其為Fab片段、F(ab，)2片段、Fv片段、單鏈Fv片段、單鏈VH片段、單鏈Vl片段、人源化抗體、嵌合抗體或雙特異性抗體。另一實(shí)施方案是衍生的抗體或抗原結(jié)合部分，其包含本文所述任何抗體或其部分和至少一個(gè)額外的分子實(shí)體。例如，所述至少一個(gè)額外的分子實(shí)體可以是另一抗體(例如雙特異性抗體或雙抗體)、檢測(cè)劑、標(biāo)簽、細(xì)胞毒素劑、藥劑和/或能夠介導(dǎo)抗體或抗體部分與另一分子(例如鏈霉親和素核心區(qū)或多組氨酸標(biāo)簽)聯(lián)合的蛋白質(zhì)或肽。例如，有用的檢測(cè)劑(使用它可衍生本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分)包括熒光化合物，包括螢光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、5-二甲胺-l-萘磺酸、藻紅蛋白、鑭系磷光體等?？贵w還可以用適用于檢測(cè)的酶標(biāo)記，所述酶例如辣根過(guò)氧化物酶、/3-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、葡糖氧化酶等。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體或其部分也可用生物素標(biāo)記，或用被次級(jí)報(bào)告子識(shí)別的預(yù)先確定的多態(tài)表位(例如亮氨酸拉鏈對(duì)序列、次級(jí)抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)來(lái)標(biāo)記。還在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，任何抗體或其部分也可用化學(xué)基團(tuán)來(lái)衍生，所述基團(tuán)例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基，或碳水化合物基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，本文公開(kāi)的P-鈣黏著蛋白抗體或抗原結(jié)合部分附著在固體載體上。在一些實(shí)施方案中，任何本發(fā)明P-鈣黏著蛋白抗體的重鏈C-端賴(lài)氨酸被切割。在本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體的重鏈和輕鏈可任選地包括N-端信號(hào)序列。例如重鏈信號(hào)序列可以是SEQIDNO:346，輕鏈信號(hào)序列可以是SEQIDNO:347。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本文所述任何抗體或其抗原結(jié)合部分，其中抗體或其抗原結(jié)合部分是人來(lái)源的。本發(fā)明還提供藥物組合物，其包含上述任何抗體或其抗原結(jié)合部分和藥物可接受載體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的核酸分子，其包含編碼本文所述任何抗體或其抗原結(jié)合部分的核苷酸序列。一個(gè)具體的實(shí)施方案是分離的核酸分子，其包含如SEQIDNOs:68到90和332到343之任一所公開(kāi)的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及包含本文所述的任何核酸分子的載體，其中所述載體任選地包含與所述核酸分子可操作連接的表達(dá)調(diào)控序列。另一實(shí)施方案提供宿主細(xì)胞，其包含本文所述任一載體，或包含本文所述任一核酸分子。本發(fā)明還提供分離的細(xì)胞系，其生產(chǎn)本文所述的任何抗體或抗原結(jié)合部分，或生產(chǎn)任何所述抗體或所述抗原結(jié)合部分的重鏈或輕鏈。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，所述方法包含在合適條件下培養(yǎng)本文所述的任何宿主細(xì)胞或細(xì)胞系，并回收所述抗體或抗原結(jié)合部分。本發(fā)明還涉及包含本文所述任何核酸的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物，其中所述非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)所述核酸。本發(fā)明還提供用于分離結(jié)合P-鈣黏著蛋白的抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，所述方法包含從本文所述的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或轉(zhuǎn)基因植物中分離所述抗體的步驟。本發(fā)明還提供用于在有需要的哺乳動(dòng)物中治療異常細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包含向所述哺乳動(dòng)物施用本文所述的任何抗體或其抗原結(jié)合部分，或任何藥物組合物的步驟。本發(fā)明還提供使用結(jié)合P-鈣黏著蛋白的抗體或其抗原結(jié)合部分用于在有需要的哺乳動(dòng)物中治療異常細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，所述方法包含在合適的條件下向所述哺乳動(dòng)物施用有效數(shù)量的本文所述任何核酸分子的步驟，所述合適的條件允許所述核酸分子表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，治療異常細(xì)胞生長(zhǎng)的方法還包含施用一定用量的一種或多種選自抗腫瘤劑、抗血管生成劑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑和抗增殖劑中的物質(zhì)，所述用量一起能有效地治療所述異常細(xì)胞生長(zhǎng)。在具體的實(shí)施方案中，所述異常細(xì)胞生長(zhǎng)是癌性的。本發(fā)明還提供用于降低P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性細(xì)胞聚集的方法，所述方法包含將細(xì)胞與本文所述任何抗體或其抗原結(jié)合部分或本文所述任何藥物組合物接觸。本發(fā)明的另一方面是抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含利用人VH-3家族基因的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，人VH-3家族基因是Vh-3-23。本發(fā)明的另一方面提供本文所述的任何抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分為人抗體。在另一方面，所述抗體或抗原結(jié)合部分是人重組抗體。本發(fā)明還提供用于生產(chǎn)p-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分的方法，所述方法包含步驟在噬菌體上合成人抗體文庫(kù)、用P-鈣黏著蛋白或其抗原部分篩選所述文庫(kù)、分離與p-鈣黏著蛋白結(jié)合的噬菌體和從噬菌體獲得所述抗體。定義和一般技術(shù)除非本文另有定義，涉及本發(fā)明使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)具有本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員所普遍理解的含義。另外，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)包括單數(shù)。一般地，涉及本文所述的細(xì)胞和組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)和蛋白質(zhì)與核酸化學(xué)和雜交而使用的術(shù)語(yǔ)或其技術(shù)是本領(lǐng)域所公知和普遍使用的。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明的方法和技術(shù)一般根據(jù)本領(lǐng)域公知的傳統(tǒng)方法進(jìn)行，和如貫穿本說(shuō)明書(shū)所列和所述的多種一般的和更特定的參考文獻(xiàn)所述來(lái)進(jìn)行。參閱例如Sambrook,etal.MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded"ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(2000);Ausubel，etal"ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,Wiley,John&Sons,Inc.(2002);HarlowandLaneUsingAntibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.(1998);禾口Coligan,etal.,ShortProtocolsinProteinScience,Wiley,John&Sons,Inc.(2003),其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。如本領(lǐng)域所所普遍完成的或如本文所述，酶反應(yīng)和純化技術(shù)根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。涉及本文所述分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)和醫(yī)學(xué)及制藥化學(xué)所使用的術(shù)語(yǔ)，或其實(shí)驗(yàn)歩驟和技術(shù)是本領(lǐng)域所公知并普遍使用的。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被用于化學(xué)合成，化學(xué)分析，藥物制備、配制、遞送和治療患者。已知基本的抗體結(jié)構(gòu)單元包含四聚物。每個(gè)四聚物由兩個(gè)同樣的多態(tài)鏈對(duì)組成，每對(duì)具有一個(gè)"輕"鏈(約25kDa)和一個(gè)"重"鏈(約SOTOkDa)。每個(gè)鏈的氨基端部分包括約100到120或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，其主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。每個(gè)鏈的羧基端定義恒定區(qū)，所述恒定區(qū)主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子作用。人輕鏈被分類(lèi)為K和入輕鏈。重鏈被分類(lèi)為m、5、7、a或。并將抗體同種型分別定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈中，可變區(qū)和恒定區(qū)通過(guò)約12或更多個(gè)氨基酸的"J"區(qū)而結(jié)合，重鏈還包括約3個(gè)或更多個(gè)氨基酸的"D"區(qū)。一般地參閱FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.，ed"2nded.RavenPress,N.Y.(1989))(就所有目的而言，以其整體通過(guò)引用并入本文)。每個(gè)重鏈/輕鏈對(duì)(Vh和Vl)形成抗體結(jié)合位點(diǎn)。因此，例如完整的IgG抗體具有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。除在雙功能或雙特異性抗體中之外，兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)是相同的。重鏈和輕鏈的可變區(qū)顯示相同的一般結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)為通過(guò)三個(gè)高度可變區(qū)結(jié)合的相對(duì)保守的框架區(qū)(FR)，也稱(chēng)為互補(bǔ)性決定區(qū)或CDR。術(shù)語(yǔ)"可變的"是指下述情況抗體之中可變區(qū)的某些部分在序列上大為不同，并被用于每個(gè)具體的抗體與其具體的抗原的結(jié)合和特異性。然而，所述可變性并非均等地分布于抗體的整個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，而是集中在CDR中，所述CDR被更高度保守的FR隔開(kāi)。來(lái)自每對(duì)兩條鏈的CDR通過(guò)FR排列，使得能夠與特定表位結(jié)合。從N-端到C-端，輕鏈和重鏈均包含F(xiàn)R1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3禾nFR4結(jié)構(gòu)域。每個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸分酉己是根據(jù)KabatSequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987and1991))或Chothia&Lesk乂，Afo/.說(shuō)o/"196:901-917(1987);Chothia,etal.,342:878-883(1989)的定義，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。除非另有說(shuō)明，以下的術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)理解為具有以下的含義除非另有特別說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)"P-鈣黏著蛋白"是指人P-鈣黏著蛋白，其是一種膜內(nèi)在蛋白和調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞粘附的跨膜糖蛋白的經(jīng)典鈣黏著蛋白家族成員。人P-鈣黏著蛋白的克隆和序列已被報(bào)導(dǎo)，例如Shimoyama,etal.，J.Ce〃說(shuō)o/.109(4Pt1),1787-1794(1989)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。術(shù)語(yǔ)P-鈣黏著蛋白旨在包括重組的人P-鈣黏著蛋白和P-鈣黏著蛋白的重組嵌合體形式，其可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組表達(dá)方法制備或商業(yè)購(gòu)得(R&DSystems861-PC-100)。除非另有特別說(shuō)明，本文使用術(shù)語(yǔ)"E-鈣黏著蛋白"是指人E-鈣黏著蛋白，其是一種膜內(nèi)在蛋白和調(diào)節(jié)細(xì)胞-細(xì)胞粘附的跨膜糖蛋白的經(jīng)典鈣黏著蛋白家族成員。E-鈣黏著蛋白描述于例如Takeichi，5We"ce，251:1451-1455(1991)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。術(shù)語(yǔ)E-鈣黏著蛋白旨在包括重組的人E-鈣黏著蛋白和E-鈣黏著蛋白的重組嵌合體形式，其可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的重組表達(dá)方法制備或商業(yè)購(gòu)得(R&DSystems861-EC-100)。術(shù)語(yǔ)"多肽"包括天然或人造的蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段和蛋白質(zhì)序列的多肽類(lèi)似物。多肽可以是單體的或多聚體的。術(shù)語(yǔ)"經(jīng)分離的蛋白質(zhì)"、"經(jīng)分離的多肽"或"經(jīng)分離的抗體"是下述蛋白質(zhì)、多肽或抗體，所述蛋白質(zhì)、多肽或抗體由于其起源或衍生來(lái)源而(1)不帶有在其天然狀態(tài)下與之相隨的天然結(jié)合的成分，(2)不含有來(lái)自相同種類(lèi)的其他蛋白質(zhì)，(3)由來(lái)自不同種類(lèi)的細(xì)胞表達(dá)，或(4)天然不存在。因此，經(jīng)化學(xué)合成的或在與下述多肽天然來(lái)源的細(xì)胞不同的細(xì)胞體系中合成的多肽應(yīng)是從其天然結(jié)合的成分中"經(jīng)分離的"。也可以使用本領(lǐng)域公知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)通過(guò)分離使得蛋白質(zhì)基本上不含天然結(jié)合的成分。經(jīng)分離的抗體實(shí)例包括已經(jīng)使用P-鈣黏著蛋白親和純化的P-鈣黏著蛋白抗體，和通過(guò)細(xì)胞系體外合成的P-鈣黏著蛋白抗體。當(dāng)樣品的至少約60%到75%顯示為單一種類(lèi)的多肽時(shí)，蛋白質(zhì)或多肽是"基本上純凈的"、"基本上均相的"或"基本上經(jīng)純化的"。多肽或蛋白質(zhì)可以是單體的或多聚體的?；旧霞儍舻亩嚯幕虻鞍踪|(zhì)可典型地包含約50%、60%、70%、80%或90%w/w的蛋白質(zhì)樣品，更經(jīng)常為約95%，優(yōu)選地可以大于99%的純凈。蛋白質(zhì)純凈度可以通過(guò)大量本領(lǐng)域公知手段表明，如蛋白質(zhì)樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳之后用本領(lǐng)域公知的染料將凝膠染色來(lái)顯影單一的多肽條帶。就某些目的而言，可通過(guò)使用HPLC或純化領(lǐng)域公知的其他手段提供更高的分辨率。術(shù)語(yǔ)本文使用術(shù)語(yǔ)"多肽片段"是指具有氨基端和/或羧基端刪除、但是剩余的氨基酸序列與天然存在序列中相應(yīng)的位置相同的多肽。在一些實(shí)施方案中，片段為至少5、6、8或10個(gè)氨基酸長(zhǎng)。在其他實(shí)施方案中，所述片段為至少14個(gè)、至少20個(gè)、至少50個(gè)或至少70、80、90、100、150或200個(gè)氨基酸長(zhǎng)。本文使用術(shù)語(yǔ)"類(lèi)似物"或"多肽類(lèi)似物"是指包含下述片段的多肽，所述片段與一些參考氨基酸序列具有基本的同一性，并與參考氨基酸序列具有基本上相同的功能或活性。典型地，多肽類(lèi)似物相對(duì)于參考序列包含保守的氨基酸取代(或插入或缺失)。類(lèi)似物可以是至少20或25個(gè)氨基酸長(zhǎng)，或可以是至少50、60、70、80、90、100、150或200個(gè)氨基酸長(zhǎng)或更長(zhǎng)，或經(jīng)?？梢耘c全長(zhǎng)多肽一樣長(zhǎng)。本發(fā)明的一些實(shí)施方案包括與種系氨基酸序列相比帶有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17個(gè)取代的多肽片段或多肽類(lèi)似物抗體。抗體的片段或類(lèi)似物或免疫球蛋白分子可以由本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員依照本說(shuō)明書(shū)的教導(dǎo)容易地制備。在某些實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分的氨基酸取代為(1)降低對(duì)蛋白酶解的敏感性，(2)降低對(duì)氧化的敏感性，(3)改變形成蛋白質(zhì)絡(luò)合物的親合力，和(4)賦予或修飾這類(lèi)類(lèi)似物的其他物理化學(xué)特征或功能特征，但仍保留對(duì)P-鈣黏著蛋白的特異結(jié)合。類(lèi)似物可包括對(duì)天然存在的肽序列的多種取代。例如，可以在天然存在的序列中(例如在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域之外的多肽部分中)制造單個(gè)或多個(gè)氨基酸取代(優(yōu)選地保守氨基酸取代)。氨基酸取代還可以在形成分子間接觸的結(jié)構(gòu)域中制造，所述分子間接觸可以促進(jìn)多肽活性。保守的氨基酸取代不應(yīng)當(dāng)顯著改變母體序列的結(jié)構(gòu)性質(zhì)；例如替換氨基酸不應(yīng)改變母體序列中存在的組成免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的反向平行的P-折疊，或破壞表征母體序列的其他類(lèi)型二級(jí)結(jié)構(gòu)。通常，甘氨酸或脯氨酸不應(yīng)用于反向平行的P-折疊。本領(lǐng)域識(shí)別的多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)和三極結(jié)構(gòu)的實(shí)例描述于Proteins,StructuresandMolecularPrinciples(Creighton,Ed"W.H.FreemanandCompany,NewYork(1984));IntroductiontoProteinStructure(C,BrandenandJ.Tooze,eds.，GarlandPublishing,NewYork,N.Y.(1991));和Thornton,etal.,A^wre,354:105(1991)，其通過(guò)引用并入本文。本文使用術(shù)語(yǔ)"抗體"與免疫球蛋白同義，應(yīng)如本領(lǐng)域普遍已知地理解。具體地，術(shù)語(yǔ)抗體不受生產(chǎn)抗體的任何具體方法限制。例如術(shù)語(yǔ)抗體包括但不限于重組抗體、單克隆抗體和多克隆抗體。本文使用術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"(或簡(jiǎn)單地"抗體部分")是指具有與抗原(例如P-鈣黏著蛋白)特異結(jié)合能力的一個(gè)或多個(gè)抗體片段。已顯示抗體的抗原結(jié)合功能可以由全長(zhǎng)抗體的片段完成。包括在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"中的結(jié)合片段的實(shí)例包括(i)Fab片段，由VL、VH、Cl和Ch1結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；(ii)F(ab')2片段，包含兩個(gè)Fab片段的二價(jià)片段，所述Fab片段在鉸鏈區(qū)通過(guò)二硫鍵連接；(iii)由Vh和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；(iv)由單臂抗體的VLandVH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，(v)dAb片段(Ward,etal.,A^we,(1989)341:544-546)，其由VH結(jié)構(gòu)域組成；和(vi)經(jīng)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。另外，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域V^和VH由獨(dú)立的基因編碼，但是它們可以使用重組方法通過(guò)合成的接頭連接，所述接頭允許它們作為單個(gè)蛋白質(zhì)鏈產(chǎn)生，所述單鏈中V^和Vh區(qū)対形成単價(jià)分子(已知為單鏈Fv(scFv));參閱例如Birdetal.，Sc/ewce(1988)242:423-426禾口Huston,etal.,Prac.Wa〃.Jcad.Sc/.85:5879-5883(1988))。這類(lèi)單鏈抗體也旨在被包括在術(shù)語(yǔ)抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)。其他形式的單鏈抗體如雙抗體也包括在內(nèi)。雙抗體是二價(jià)的、雙特異性的抗體，其中Vh和VL結(jié)構(gòu)域在單個(gè)多肽鏈上表達(dá)，但是使用太短而不允許相同鏈上兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間配對(duì)的接頭，從而強(qiáng)迫所述結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參閱例如Holliger,etal"尸rac.vVa,/.t/&4，90:6444-6448(1993);Poljak，etal.5Vrw",'2:1121-1123(1994))。另外，抗體或其抗原結(jié)合部分可以是更大的免疫粘附分子的部分，其通過(guò)抗體或抗體部分與一個(gè)或多個(gè)其他蛋白質(zhì)或肽的共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合而形成。這類(lèi)免疫粘附分子包括鏈霉親和素核心區(qū)制造四聚體scFv分子的用途(Kipriyanov,etal.,Jwft7oc^ej"awt/場(chǎng)&n'c/omo，6:93-101(1995))和半胱氨酸殘基、標(biāo)記物肽和C-端多組氨酸標(biāo)簽制造二價(jià)的和生物素化的scFv分子的用途(Kipriyanov,etal.,Mo/,/附"w"o/"31:1047-1058(1994))。其他實(shí)例包括來(lái)自抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR被共價(jià)地或非共價(jià)地整合進(jìn)分子中使其成為特異性結(jié)合目的抗原(如P-鈣黏著蛋白)的免疫粘合素。在這類(lèi)實(shí)施方案中，CDR可以作為更大的多肽鏈的一部分被整合，可以與另一多肽鏈共價(jià)連接或可以非共價(jià)地整合?？贵w部分如Fab和F(ab')2片段可以使用傳統(tǒng)技術(shù)(分別為例如整個(gè)抗體的木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化)從整個(gè)抗體中制備。另外，抗體、抗體部分和免疫粘附分子可使用如本文所述的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)獲得。當(dāng)關(guān)于本發(fā)明涉及"抗體"時(shí)，應(yīng)當(dāng)理解也可使用其抗原結(jié)合部分?？乖Y(jié)合部分與完整抗體競(jìng)爭(zhēng)特異結(jié)合。一般地參閱FimdamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,2nded.RavenPress,N.Y.(1989))(以其整體通過(guò)引用并入，用于所有目的)?？乖Y(jié)合部分可通過(guò)重組DNA技術(shù)或通過(guò)完整抗體的酶切割或化學(xué)切割產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合部分包括Fab、Fab'、F(ab，)2,Fd、Fv、dAb和互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、雙抗體和含有至少一個(gè)抗體部分的多肽，所述至少一個(gè)抗體部分足夠賦予所述多肽特異的抗原結(jié)合。在具有一個(gè)或多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的實(shí)施方案中，結(jié)合位點(diǎn)可以彼此相同或不同。本文使用術(shù)語(yǔ)"人抗體"是指其中可變結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域的序列是人序列的任何抗體。該術(shù)語(yǔ)包括下述抗體，所述抗體帶有來(lái)自人基因的序列，但是已被改變以降低可能的免疫原性、提高親合力、消除可能引起不期望的折疊的半胱氨酸等。該術(shù)語(yǔ)還包括在非人細(xì)胞中重組產(chǎn)生的這類(lèi)抗體，其可能賦予對(duì)人細(xì)胞非典型的糖基化。這些抗體可以以多種方式制備，如下所述。本文使用術(shù)語(yǔ)"嵌合抗體"是指下述抗體，所述抗體包含來(lái)自?xún)煞N或更多不同抗體(包括來(lái)自不同物種的抗體)的區(qū)域。例如，嵌合抗體的一個(gè)或多個(gè)CDR可以來(lái)自人P-鈣黏著蛋白抗體。在一個(gè)實(shí)例中，來(lái)自人抗體的CDR可以與來(lái)自非人抗體(如小鼠或大鼠)的CDR結(jié)合。在另一實(shí)例中，所有的CDR可來(lái)自人P-鈣黏著蛋白抗體。在另一實(shí)例中，來(lái)自多于一個(gè)人P-鈣黏著蛋白抗體的CDR可以組合在一個(gè)嵌合抗體中。例如，嵌合抗體可包含來(lái)自第一個(gè)人P-鈣黏著蛋白抗體輕鏈的CDR1、來(lái)自第二個(gè)人P-l丐黏著蛋白抗體輕鏈的CDR2和來(lái)自第三個(gè)人P-鈣黏著蛋白抗體輕鏈的CDR3，且重鏈的CDR可以來(lái)自一個(gè)或多個(gè)其他P-鈣黏著蛋白抗體。另外，框架區(qū)可來(lái)自一個(gè)P-鈣黏著蛋白抗體(一個(gè)或多個(gè)CDR來(lái)自其中)或來(lái)自一個(gè)或多個(gè)不同的人抗體。另外，術(shù)語(yǔ)"嵌合抗體"旨在包括任何上述組合，其中所述組合涉及人和非人抗體。本文使用術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"是指非人來(lái)源的抗體，其中屬于非人物種抗體序列特征性的氨基酸殘基被替換為存在于人抗體相應(yīng)位置的殘基。該"人源化"過(guò)程被認(rèn)為降低所產(chǎn)生抗體在人中的免疫原性。應(yīng)當(dāng)知道非人來(lái)源的抗體可以使用本領(lǐng)域公知的技術(shù)被人源化。參閱例如Winter,etal.，/wmw"o/.7b&乂14:43-46(1993)。目的抗體可以通過(guò)重組DNA技術(shù)被加工為用相應(yīng)的人序列取代CH1、CH2、CH3、鉸鏈結(jié)構(gòu)域和/或框架結(jié)構(gòu)域。參閱例如WO92/02190和U.S.專(zhuān)利Nos.5,530,101、5,585,089、5,693,761、5,693,792、5,714,350禾口5,777,085。本文使用術(shù)語(yǔ)"人源化抗體"在其含義中包括嵌合的人抗體和CDR-嫁接的抗體。本發(fā)明的嵌合人抗體包括非人物種抗體的Vh和V^以及人抗體的Ch和CJ吉構(gòu)域。本發(fā)明的CDR移植的抗體通過(guò)將人抗體Vh和Vl的CDR分別用非人動(dòng)物抗體的Vh和Vd戈替而得到。本文使用術(shù)語(yǔ)"ELISA"是指酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。該測(cè)定法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。該測(cè)定法的實(shí)例可見(jiàn)于Vaughan,T丄，etal.，Wa,.^'ofcc/l,14:309-314(1996)以及本申請(qǐng)的實(shí)施例7。本文使用的術(shù)語(yǔ)"表面等離振子共振"是指例如使用BIACORE體系(PharmaciaBiosensorAB,Uppsala,SwedenandPiscataway,N丄)，通過(guò)檢測(cè)生物傳感器基質(zhì)中蛋白質(zhì)濃度改變?cè)试S分析實(shí)時(shí)生物特異性相互作用的光學(xué)現(xiàn)象。進(jìn)一歩的描述參閱Jonssonetal.,J朋.5/o/.C//".,51:19-26(1993);Jonsson,etal"所ofec/m—es，11:620-627(1991);Jonsson，etal.,M/.TecogwY"8:125-131(1995);和Johnsson,etal"Jwa/.Sz'ocAem.,198:268-277(1991)。術(shù)語(yǔ)"KD"是指具體的抗體-抗原相互作用的親合力平衡常數(shù)。當(dāng)KDSImM，優(yōu)選地S100nM和最優(yōu)選地^10nM時(shí)稱(chēng)抗體與抗原特異結(jié)合。KD親合力常數(shù)可通過(guò)表面等離振子共振測(cè)量，例如使用實(shí)施例6中所述的BIACORE體系。術(shù)語(yǔ)"k。ff"是指具體的抗體-抗原相互作用的解離速率常數(shù)。k。ff解離速率常數(shù)可通過(guò)表面等離離子共振測(cè)量，例如使用實(shí)施例6中所述的BIACORE體系。本文使用術(shù)語(yǔ)"P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性細(xì)胞粘附測(cè)定法"是指下述測(cè)定法，其用于測(cè)量P-鈣黏著蛋白抗體阻斷細(xì)胞與己固定在固體載體上的受體P-鈣黏著蛋白粘附的能力。該類(lèi)型的測(cè)定法可通過(guò)例如將P-鈣黏著蛋白固定在固體載體(例如塑料)上來(lái)進(jìn)行。然后允許過(guò)表達(dá)P-鈣黏著蛋白的細(xì)胞通過(guò)P-鈣黏著蛋白-P-鈣黏著蛋白相互作用粘附在固體載體上?？墒褂没虿皇褂肞-鈣黏著蛋白抗體來(lái)定量粘附水平。作為抗體濃度函數(shù)的粘附可隨后被用于測(cè)定ICso值。實(shí)施例3提供了用于測(cè)量P-鈣黏著蛋白抗體ICsJ直的P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性的細(xì)胞粘附測(cè)定法的其他細(xì)節(jié)。本文使用術(shù)語(yǔ)"P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性細(xì)胞聚集測(cè)定法"是指下述測(cè)定法，其用于測(cè)量P-鈣黏著蛋白抗體阻斷其表面上表達(dá)P4丐黏著蛋白的細(xì)胞聚集的能力。例如，這種類(lèi)型的測(cè)定法可使用過(guò)表達(dá)P-鈣黏著蛋白的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞被置于懸浮液中，并允許其形成P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性的聚集體。然后使用聚集測(cè)定法，通過(guò)測(cè)量使用和不使用抗體得到的細(xì)胞聚集體的尺寸來(lái)定量P-鈣黏著蛋白抗體阻止該聚集的能力。作為P-鈣黏著蛋白抗體濃度函數(shù)的細(xì)胞聚集體的尺寸可隨后被用于測(cè)定ICs。值。實(shí)施例4提供了用于測(cè)量若干P-鈣黏著蛋白抗體ICs。值的P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性聚集測(cè)定法的其他細(xì)節(jié)。本文使用術(shù)語(yǔ)"p-鈣黏著蛋白依賴(lài)性球狀體破壞測(cè)定法"是指下述測(cè)定法，其用于測(cè)量p-鈣黏著蛋白抗體破壞預(yù)先形成的p-鈣黏著蛋白依賴(lài)性的細(xì)胞聚集體的能力。通過(guò)測(cè)量作為抗體濃度函數(shù)的聚集體尺寸減小，可測(cè)定ICs。值。實(shí)施例5提供了用于測(cè)量P-鈣黏著蛋白抗體IQ。值的P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性球狀體破壞測(cè)定法的其他細(xì)節(jié)。本文使用術(shù)語(yǔ)"分子選擇性"是指抗體對(duì)特定抗原的親合力大于對(duì)相關(guān)抗原的親合力。例如，相對(duì)于E-鈣黏著蛋白，本發(fā)明的抗體是選擇P-鈣黏著蛋白的，即所述抗體對(duì)P-鈣黏著蛋白的親合力比對(duì)E-鈣黏著蛋白的親合力至少大2倍，例如4倍、或10倍、或50倍、或100倍或更多。這類(lèi)親合力可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來(lái)測(cè)量。術(shù)語(yǔ)"表位"包括能夠特異結(jié)合免疫球蛋白或T-細(xì)胞受體或以其他方式與分子相互作用的任何蛋白質(zhì)決定簇。表位決定簇通常由分子的化學(xué)活性表面簇(例如氨基酸或碳水化合物或糖側(cè)鏈)組成，并通常具有特異的三維結(jié)構(gòu)特性以及特異的電荷特性。表位可以是"線(xiàn)性的"或"構(gòu)象的"。在線(xiàn)性表位中，蛋白質(zhì)和相互作用的分子(例如抗體)之間所有的相互作用點(diǎn)沿著蛋白質(zhì)的一級(jí)氨基酸序列線(xiàn)性地存在。在構(gòu)象型表位中，相互作用點(diǎn)橫穿蛋白質(zhì)上彼此分離的氨基酸殘基而存在。一旦抗原上的目的表位被確定，可能使用例如本發(fā)明所述的技術(shù)產(chǎn)生針對(duì)該表位的抗體?；蛘?，在發(fā)現(xiàn)過(guò)程中，抗體的產(chǎn)生和表征可闡述關(guān)于目的表位的信息。根據(jù)該信息可能隨后競(jìng)爭(zhēng)性地篩選抗體對(duì)相同表位的結(jié)合。達(dá)到該目的的一個(gè)途徑是構(gòu)建交叉競(jìng)爭(zhēng)研究以找出彼此競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合的抗體，即所述抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗原。以其交叉競(jìng)爭(zhēng)為基礎(chǔ)的用于"binning"抗體的高通量方法描述于國(guó)際專(zhuān)利公開(kāi)No.WO03/48731。本文關(guān)于抗體使用術(shù)語(yǔ)"競(jìng)爭(zhēng)"是指第一種抗體或其抗原結(jié)合部分與第二種抗體或其抗原結(jié)合部分競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，其中與不存在第二種抗體時(shí)第一種抗體的結(jié)合相比，當(dāng)存在第二種抗體時(shí)第一種抗體與其相關(guān)表位的結(jié)合可檢測(cè)地降低?；蛘?，情況可以是(但不必須是)第二種抗體與其表位的結(jié)合在存在第一種抗體時(shí)也可檢測(cè)地降低。即，第一種抗體能夠抑制第二種抗體與其表位的結(jié)合，而第二種抗體不能抑制第一種抗體與其各自表位的結(jié)合。然而，當(dāng)每個(gè)抗體可檢測(cè)地抑制另一抗體與其表位或配體的結(jié)合時(shí)，無(wú)論程度相同、更大或更小，稱(chēng)為抗體彼此"交叉競(jìng)爭(zhēng)"地結(jié)合它們各自的表位。競(jìng)爭(zhēng)和交叉競(jìng)爭(zhēng)抗體均包括在本發(fā)明中。不考慮這類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)或交叉競(jìng)爭(zhēng)發(fā)生的機(jī)制(例如位阻、構(gòu)象變化或與共同表位或其部分結(jié)合等)，熟練的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，根據(jù)本文提供的教導(dǎo)，這類(lèi)競(jìng)爭(zhēng)和/或交叉競(jìng)爭(zhēng)抗體包括在并適用于本文公開(kāi)的方法中。本文關(guān)于具體的基因使用術(shù)語(yǔ)"利用"是指抗體中具體區(qū)域的氨基酸序列在B-細(xì)胞成熟時(shí)根本地來(lái)源于該基因。例如，短語(yǔ)"利用人VH-3家族基因的重鏈可變區(qū)氨基酸序列"是指下述取代B-細(xì)胞成熟時(shí)抗體的Vh區(qū)域來(lái)自VH-3家族的基因片段。在人B細(xì)胞中存在多于30種不同的功能性重鏈可變基因，這些基因被用于產(chǎn)生抗體。因此，就結(jié)合抗原和功能活性的組合特征而言，具體的重鏈可變基因的使用指示優(yōu)選的抗體-抗原相互作用的結(jié)合基序。應(yīng)當(dāng)知道，基因利用分析僅提供了有限的抗體結(jié)構(gòu)概況。因?yàn)槿薆-細(xì)胞隨機(jī)地產(chǎn)生V-D-J重鏈或V-jk輕鏈轉(zhuǎn)錄物，所以存在大量次級(jí)過(guò)程，所述次級(jí)過(guò)程包括但不限于體細(xì)胞高度突變、n-添加和CDR3擴(kuò)展。參閱例如Mendezetal.A^weGewe"cs15:146-156(1997)。本文依照常規(guī)用法使用二十個(gè)常規(guī)氨基酸及其縮寫(xiě)。參閱Immunology-ASynthesis(2ndEdition,E.S.GolubandD.R.Gren,Eds"SinauerAssociates,Sunderland,Mass.(1991))，其通過(guò)引用并入本文。本文所涉及的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"是指至少10個(gè)堿基長(zhǎng)度的多聚體形式核苷酸，其為核糖核苷酸或脫氧核苷酸或兩種類(lèi)型核苷酸的經(jīng)修飾的形式。該術(shù)語(yǔ)包括單鏈和雙鏈形式。本文使用術(shù)語(yǔ)"經(jīng)分離的多核苷酸"是指基因組、cDNA或合成來(lái)源的多核苷酸或其一些組合，因?yàn)樗?經(jīng)分離的多核苷酸"的來(lái)源，其(1)不伴隨有所述"經(jīng)分離的多核苷酸"天然被發(fā)現(xiàn)時(shí)的所有或部分多核苷酸，(2)與多核苷酸可操作地連接，所述多核苷酸天然不與其連接，或(3)天然不作為更大序列的部分而存在。本文使用的術(shù)語(yǔ)"天然存在的核苷酸"包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文使用的術(shù)語(yǔ)"經(jīng)修飾的核苷酸"包括帶有經(jīng)修飾的或經(jīng)取代的糖基等的核苷酸。本文涉及的術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸連接"包括例如硫代磷酸、二硫代磷酸、硒代磷酸、二硒代磷酸、苯胺硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯月安石粦酸酉旨(phoshoraniladate)、石粦酉先j]安酸(phosphoroamidate)等的寡核苷酸鍵。參閱例如LaPlanche,etal.，M/c/.y4c/&Tes.，14:9081(1986);Stec，etal.,爿m.Oem.&c.，106:6077(1984);Stein,etal.，M/c/.Jc油ias"16:3209(1988);Zon,etal"^""-GawcerZ>wgZ)as7'gw,6:539(1991);Zon,etal.,OligonucleotidesandAnalogues:APracticalApproach,pp.87-108(F.Eckstein,Ed.,OxfordUniversityPress,OxfordEngland(1991));U.S.專(zhuān)禾UNo.5,151,510;UhlmannandPeyman,C/em/ca/T^v纟em，90:543(1990)，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。需要時(shí)寡核苷酸可包括用于檢測(cè)的標(biāo)簽。"可操作地連接的"序列包括與目的基因相鄰的表達(dá)調(diào)控序列和反向作用或在遠(yuǎn)處作用以調(diào)控目的基因的表達(dá)調(diào)控序列。本文使用術(shù)語(yǔ)"表達(dá)調(diào)控序列"是指影響它們所連接的編碼序列表達(dá)和加工所必須的多核苷酸序列。表達(dá)調(diào)控序列包括適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄起始、終止、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列；有效的RNA加工信號(hào)，例如剪接和多腺苷酸化信號(hào)；穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)mRNA的序列；增強(qiáng)翻譯效率的序列(例如Kozak共有序列)；增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；和需要時(shí)增強(qiáng)蛋白質(zhì)分泌的序列。這類(lèi)調(diào)控序列的本質(zhì)取決于宿主生物而不同；在原核生物中，這類(lèi)調(diào)控序列通常包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列；在真核生物中這類(lèi)調(diào)控序列通常包括啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語(yǔ)"調(diào)控序列"旨在至少包括其存在對(duì)于表達(dá)和加工是必需的的所有成分，并也可包括其存在是有利的的額外成分，例如前導(dǎo)序列和融合配偶體序列。本文使用術(shù)語(yǔ)"載體"是指能夠?qū)⑥D(zhuǎn)移其所連接的另一核酸的核酸分子。在一些實(shí)施方案中，載體是質(zhì)粒，即額外的DNA片段可連接在其中的環(huán)狀雙鏈DNA部分。在一些實(shí)施方案中，載體是病毒載體，其中額外的DNA片段可被連接進(jìn)病毒基因組中。在一些實(shí)施方案中，載體能夠在其被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加體哺乳動(dòng)物載體)。在其他實(shí)施方案中，載體(例如非附加體哺乳動(dòng)物載體)可以通過(guò)引入宿主細(xì)胞被整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，從而與宿主基因組一起被復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)與它們可操作地連接的基因的表達(dá)。這類(lèi)載體在本文中稱(chēng)為"重組表達(dá)載體"(或簡(jiǎn)單地"表達(dá)載體")。本文使用的術(shù)語(yǔ)"重組宿主細(xì)胞"(或簡(jiǎn)單地"宿主細(xì)胞")是指重組表達(dá)載體已被引入其中的細(xì)胞。應(yīng)當(dāng)理解"重組宿主細(xì)胞"和"宿主細(xì)胞"不但指具體的受試者細(xì)胞(subjectcell)，也指該細(xì)胞的后代。因?yàn)槟承┬揎椏捎捎谕蛔兓颦h(huán)境影響而在后繼的世代中發(fā)生，因此這類(lèi)后代事實(shí)上可與母細(xì)胞不相同，但是其仍然包括在本文所使用的術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"的范圍內(nèi)。本文使用術(shù)語(yǔ)"種系"是指抗體基因和基因片段的核苷酸序列，因?yàn)樗鼈兺ㄟ^(guò)生殖細(xì)胞從親代傳遞給后代。該種系序列與編碼成熟B細(xì)胞中抗體的核苷酸不同，所述抗體在B細(xì)胞成熟的過(guò)程中己被重組和高突變事件改變。在核酸序列語(yǔ)境中的術(shù)語(yǔ)"序列同一性百分比"是指針對(duì)最大對(duì)應(yīng)進(jìn)行比對(duì)時(shí)，兩個(gè)序列中相同的殘基。序列同一性比較的長(zhǎng)度可以在至少約九個(gè)核苷酸，通常至少約18個(gè)核苷酸，更通常至少約24個(gè)核苷酸，典型地至少約28個(gè)核苷酸，更典型地至少約32個(gè)核苷酸和優(yōu)選地至少約36、48或更多核苷酸的一段上。本領(lǐng)域存在可用于測(cè)量核苷酸序列同一性的大量不同的算法。例如，可使用FASTA、G叩或Bestfit(其為WisconsinPackageVersion10.0，GeneticsComputerGroup(GCG)，Madison,Wisconsin中的程序)比較多核苷酸序列。包括例如程序FASTA2禾PFASTA3的FASTA提供查詢(xún)序列和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對(duì)和序列同一性百*、比(Pearson,7k^AoA五"z;;mo/.，183:63-98(1990);Pearson,^feAo^Afo/.脂.'132:185-219(2000);Pearson,她/力油266:227-258(1996);Pearson,J.M/.276:71-84(1998);通過(guò)引用并入本文)。除非另有說(shuō)明，使用針對(duì)具體程序或算法的默認(rèn)參數(shù)。例如，核酸序列間的序列同一性百分比可使用FASTA用其默認(rèn)參數(shù)(字碼尺寸為6，NOPAM因子用于積分矩陣)測(cè)定，或使用Gap用GCGVersion6.1中提供的默認(rèn)參數(shù)測(cè)定，通過(guò)引用并入本文。除非另有說(shuō)明，提到核苷酸序列時(shí)包括其補(bǔ)體。因此，具有具體序列的核酸的含義應(yīng)當(dāng)被理解為包括其互補(bǔ)鏈及其互補(bǔ)序列。當(dāng)涉及核酸或其片段時(shí)，術(shù)語(yǔ)"顯著相似性"或"顯著序列相似性"是指與另一核酸(或其互補(bǔ)鏈)就適當(dāng)?shù)暮塑账岵迦牖騽h除進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí)，通過(guò)任何公知的序列同一性算法(例如如上所述的FASTA、BLAST或Gap)測(cè)量得到至少約85%，優(yōu)選地至少約90%，和更優(yōu)選地至少約95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸堿基中存在核苷酸序列同一性。在氨基酸語(yǔ)境中的術(shù)語(yǔ)"序列同一性百分比"是指針對(duì)最大對(duì)應(yīng)進(jìn)行比對(duì)時(shí)，兩個(gè)序列中相同的殘基。序列同一性比較的長(zhǎng)度可以在至少約五個(gè)氨基酸，通常至少約20個(gè)氨基酸，更通常至少約30個(gè)氨基酸，典型地至少約50個(gè)氮基酸，更典型地至少約100個(gè)氨基酸和進(jìn)一步更典型地約150、200或更多個(gè)氨基酸的一段上。存在大量不同的可用于測(cè)量氨基酸序列同一性的本領(lǐng)域已知算法。例如，可使用FASTA、Gap或Bestfit(其為WisconsinPackageVersion10.0,GeneticsComputerGroup(GCG),Madison,Wisconsin中的程序)比較氨基酸序列。應(yīng)用于多肽時(shí)，術(shù)語(yǔ)"顯著同一性"或"顯著相似性"是指例如通過(guò)程序GAP或BESTFIT使用程序提供的默認(rèn)缺口權(quán)重進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí)，兩個(gè)氨基酸序列共享至少70%、75%或80%的序列同一性，優(yōu)選地至少90%或95%的序列同一性，更優(yōu)選地至少97%、98%或99%的序列同一性。在某些實(shí)施方案中，不同的殘基位置區(qū)別在于保守的氨基酸取代。本文使用"保守的氨基酸取代"是指下述氨基酸取代其中一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)氨基酸殘基所取代，所述另一個(gè)氨基酸殘基帶有有相似化學(xué)特征(例如電荷或疏水性)的側(cè)鏈R基團(tuán)的。一般地，保守的氨基酸殘基不會(huì)顯著改變蛋白質(zhì)的功能特征。當(dāng)兩個(gè)或更多的氨基酸序列彼此因保守取代而不同時(shí)，可上調(diào)序列同一性百分比以糾正取代的的保守本質(zhì)。進(jìn)行該調(diào)節(jié)的手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。參閱例如Pearson，Me^oAMo/.所o/.,243:307-31(1994)。具有有相似化學(xué)特征側(cè)鏈的氨基酸基團(tuán)的實(shí)例包括1)脂肪族側(cè)鏈甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂肪族-羥基側(cè)鏈絲氨酸和蘇氨酸；3)含酰胺的側(cè)鏈天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族側(cè)鏈；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側(cè)鏈賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸；6)酸性側(cè)鏈天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫的側(cè)鏈半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，保守的氨基酸取代基團(tuán)可以是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴(lài)氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺?；蛘?，保守的替換是在Gonnetetal，，5We"ce256:1443-45(1992)(通過(guò)引用并入本文)中公開(kāi)的PAM250log-相似性矩陣中具有正值的任何改變。"適度保守的"替換是在PAM250log-相似性矩陣中具有非負(fù)值的任何改變。多肽的序列同一性典型地使用序列分析軟件來(lái)測(cè)量。蛋白質(zhì)分析軟件使用對(duì)多種取代、缺失和其他修飾(包括保守的氨基酸取代)賦值的相似性手段來(lái)匹配序列。例如，GCG含有例如"Gap"和"Bestfit"的軟件，其可使用程序指明的默認(rèn)參數(shù)來(lái)測(cè)定密切相關(guān)的多肽(例如來(lái)自不同種類(lèi)生物的同源多肽)之間或野生型蛋白質(zhì)和其類(lèi)似物之間的序列同源性或序列同一性。參閱例如GCGVersion6.1(UniversityofWisconsin,WI)。多肽序列還可使用FASTA用默認(rèn)的或推薦的參數(shù)進(jìn)行比較，參閱GCGVersion6丄FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供查詢(xún)和搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的比對(duì)和序列同一性百分比(Pearson,M&Ao心五"矽mo/.，183:63-98(1990);Pearson,MelodyMo/.肌o/"132:185-219(2000))。將本發(fā)明的序列與包含來(lái)自不同生物的大量序列的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較時(shí)，另一優(yōu)選地算法是計(jì)算機(jī)程序BLAST,特別是blastp或tblastn，使用隨程序提供的默認(rèn)參數(shù)。參閱例如Altschul，etal.，編.5/。/"215:403-410(1990);Altschul,etal"M/c/e/cA;/^i^&，25:3389-402(1997)。一般地，進(jìn)行同源性比較的多肽序列的長(zhǎng)度應(yīng)為至少約16個(gè)氨基酸殘基，通常至少約20個(gè)殘基，更通常至少約24個(gè)殘基，典型地至少約28個(gè)殘基和優(yōu)選地多于約35個(gè)殘基。當(dāng)在包含來(lái)自不同生物的大量序列的數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索時(shí)，優(yōu)選比較氨基酸序列。本文使用術(shù)語(yǔ)"標(biāo)簽"或"經(jīng)標(biāo)記的"是指抗體中整合了另一分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)簽是可檢測(cè)的標(biāo)記，例如整合經(jīng)放射性標(biāo)記的氨基酸，或生物素基部分附著在多肽上，所述生物素基部分可由經(jīng)標(biāo)記的抗生物素蛋白(例如含有熒光標(biāo)記物的鏈霉親和素，或可通過(guò)光學(xué)或比色法檢測(cè)的酶活性)檢測(cè)。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)簽或標(biāo)記物可以是治療性的，例如藥物綴合物或毒素。標(biāo)記多肽和糖蛋白的多種方法是本領(lǐng)域己知的并可被使用。用于多肽的標(biāo)簽包括但不限于以下的放射性同位素或放射性核素(例如3H、14C、15N、35S、90Y、"Tc、mIn、125I、131I)、熒光標(biāo)簽(例如FITC、羅丹明、鑭系磷光體)、酶標(biāo)簽(例如辣根過(guò)氧化物酶、/3-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物、生物素基、被次級(jí)報(bào)告子識(shí)別的、預(yù)先確定的多肽表位(例如亮氨酸拉鏈對(duì)序列、次級(jí)抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)、磁性劑如軋螯合物、毒素如百日咳毒素、紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、依米丁(emetine)、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷(etoposide)、鬼臼噻吩武(tenoposide)、長(zhǎng)春新堿(vincristine)、長(zhǎng)春堿、秋水仙素、阿霉素、柔紅霉素、二羥炭疽菌素二酮(dihydroxyanthracindione)、鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone)、光輝霉素、放線(xiàn)菌素D、1-去氫睪甾酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及其類(lèi)似物或同系物。在一些實(shí)施方案中，標(biāo)簽通過(guò)多種長(zhǎng)度的間隔臂連接以降低可能的位阻。"治療有效量"是指所施用的治療劑的用量會(huì)在一定程度上減輕被治療的疾病的一種或多種癥狀。就癌癥治療而言，治療有效量是指具有至少一種以下效果的量減小腫瘤的尺寸；抑制(即在一定程度上減緩，優(yōu)選地停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；在一定程度上抑制(即在一定程度上減緩，優(yōu)選地停止)腫瘤生長(zhǎng)和在一定程度上減輕(或優(yōu)選地消除)癌癥相關(guān)的--種或多禾中;/S4犬。"治療"是指減輕或消除生物學(xué)疾病和/或附帶的癥狀。就癌癥而言，這些術(shù)語(yǔ)簡(jiǎn)單地表示受癌癥影響的個(gè)體的預(yù)期壽命會(huì)被延長(zhǎng)，或疾病的一種或多種癥狀會(huì)被減輕。"接觸"是指以抗體能夠影響p-鈣黏著蛋白生物活性的方式，將本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合部分和靶p-鈣黏著蛋白或其表位集合在一起。這類(lèi)"接觸"可"體外"完成，即在試管、培養(yǎng)皿等中完成。在試管中，接觸可僅涉及抗體或其抗原結(jié)合部分和p-鈣黏著蛋白或其表位，或其可涉及整個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞可維持或培養(yǎng)在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并在該環(huán)境中與抗體或其抗原結(jié)合部分接觸。在該語(yǔ)境中，可在用更復(fù)雜的活體體內(nèi)嘗試抗體的用途之前測(cè)定具體抗體或其抗原結(jié)合部分影響p-鈣黏著蛋白相關(guān)疾病的能力(即抗體的IC50)。對(duì)生物外的細(xì)胞而言，將p-鈣黏著蛋白與抗體或其抗原結(jié)合部分接觸的多種方法存在并是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。除非另有說(shuō)明，本文使用"異常細(xì)胞生長(zhǎng)"是指不依賴(lài)于正常調(diào)節(jié)機(jī)制的細(xì)胞生長(zhǎng)(例如缺失接觸抑制)，包括正常細(xì)胞的異常生長(zhǎng)和異常細(xì)胞的生長(zhǎng)。這包括但不限于以下的異常生長(zhǎng)通過(guò)表達(dá)經(jīng)突變的酪氨酸激酶或過(guò)表達(dá)受體酪氨酸激酶而增殖的腫瘤細(xì)胞(腫瘤)；其他增殖性疾病的良性或惡性細(xì)胞，其中發(fā)生異常的酪氨酸激酶激活；通過(guò)受體酪氨酸激酶增殖的任何腫瘤；通過(guò)異常的絲氨酸/蘇氨酸激酶激活而增殖的任何腫瘤；其他增殖性疾病的良性和惡性細(xì)胞，其中發(fā)生異常的絲氨酸/蘇氨酸激酶激活；表達(dá)經(jīng)激活的Ras癌基因的良性和惡性腫瘤；良性或惡性的腫瘤細(xì)胞，其中Ras蛋白質(zhì)作為另一基因中致癌突變的結(jié)果而被激活；其他增殖性疾病的良性或惡性細(xì)胞，其中發(fā)生異常的Ras激活。這類(lèi)良性增殖疾病的實(shí)例是銀屑病、良性前列腺肥大、人乳頭狀瘤病毒(HPV)和restinosis。"異常細(xì)胞生長(zhǎng)"還涉及并包括由法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶的酶活性導(dǎo)致的良性和惡性細(xì)胞的異常生長(zhǎng)。術(shù)語(yǔ)"異常細(xì)胞生長(zhǎng)"和"高增殖性疾病"在本申請(qǐng)中可交換使用。"體外"是指在人造環(huán)境中(例如但不限于試管或培養(yǎng)基中)進(jìn)行的步驟。"體內(nèi)"是指在活體中(例如但不限于小鼠、大鼠或兔)中進(jìn)行的歩驟。附圖概述圖1顯示SEQIDNOs:1-347的氨基酸和核酸序列。發(fā)明詳述人P-鈣黏著蛋白抗體本發(fā)明涉及與人P-鈣黏著蛋白結(jié)合的、經(jīng)分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分。優(yōu)選地，人抗體是重組的人P-鈣黏著蛋白抗體，其對(duì)P-鈣黏著蛋白具有比對(duì)E-鈣黏著蛋白更大的親和力。本發(fā)明的多個(gè)方面涉及這類(lèi)抗體和抗原結(jié)合部分及其藥物組合物，以及用于制造這類(lèi)抗體和抗原結(jié)合部分的核酸、重組表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。使用本發(fā)明抗體和抗原結(jié)合部分以體內(nèi)或體外地檢測(cè)人P-鈣黏著蛋白或抑制人P-鈣黏著蛋白活性的方法也包括在本發(fā)明中。已知來(lái)自若干物種(包括人)的P-鈣黏著蛋白氨基酸和核苷酸序列(參閱例如登錄號(hào)No.NM—001793.3)。人P-鈣黏著蛋白或其抗原部分可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來(lái)制備，或可從商業(yè)賣(mài)主處購(gòu)得(例如R&DSystems861-PC-100)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是如194-e06;194-a02;194-b09;195畫(huà)ell;194陽(yáng)g09;196-h02;194-eOl;196-dlO;196-g03;196陽(yáng)e06;195-a09;198-a09;200-h06;g-194-b09;g-194-g09;g-196-g03;g-196-h02;g-194-e01;g-194-e06;129-lc4;和g-129-lc4所指的.IgG。如實(shí)施例1中更詳細(xì)討論的，使用scFv噬菌體展示文庫(kù)的高通量f審選來(lái)鑒定129-lc4scFv，其隨后被轉(zhuǎn)化為IgG。129-lc4代表了初期噬菌體展示篩選中鑒定的前導(dǎo)抗體，并且是一個(gè)譜系的親本抗體，從其中派生出本發(fā)明的若干個(gè)其他抗體。若干個(gè)這類(lèi)經(jīng)派生的抗體被指定為194-e06;194-a02;194-b09;195-ell;194-g09;196-h02;194-eOl;196-dlO;196-g03;196-e06;195-a09;198-a09;和200-h06，并代表了129-lc4親本譜系中經(jīng)最優(yōu)化的抗體。所述g-129-lc4抗體是129-lc4親本抗體的種系版，其中Vh和V^結(jié)構(gòu)域的骨架區(qū)中某些氨基酸被突變以匹配種系骨架區(qū)中的氨基酸。上述任何抗體也可被種系化，使得骨架區(qū)序列與g-129-lc4中的種系骨架序列相同。例如在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，抗體g-194-b09、g-194-g09、g-196-g03、g-196-h02、g-194-e01、g-195-ell、g-200-h06和g-194-e06分別是194-b09、194-g09、196-g03、196-h02、194-e01、195-ell、200-h06和194-e06經(jīng)種系化的版本。被突變以達(dá)到經(jīng)種系化版本的特定氨基酸對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，可通過(guò)將經(jīng)種系化的抗體與未種系化的抗體比較得到。如下所討論的，本發(fā)明抗體的特定氨基酸序列描述于表1-3和圖1中。強(qiáng)烈傾向于利用重鏈可變區(qū)的VH3基因家族生產(chǎn)本發(fā)明的抗體。具體地，129-lc4親本抗體衍生自Vh3-23可変基因片段。在人B細(xì)胞中，存在多于30種不同的功能性重鏈可變基因，其被用于生產(chǎn)抗體。然而就結(jié)合抗原和功能活性的組合特征而言，傾向預(yù)示著抗體-抗原相互作用的優(yōu)選的結(jié)合基序。應(yīng)當(dāng)知道，基因利用分析僅提供有限的抗體結(jié)構(gòu)概況。因?yàn)槿薆-細(xì)胞隨機(jī)地產(chǎn)生V-D-J重鏈或V-jk輕鏈轉(zhuǎn)錄物，所以存在大量次級(jí)過(guò)程，所述次級(jí)過(guò)程包括但不限于體細(xì)胞高度突變、n-添加和CDR3擴(kuò)展。參閱例如Mendezetal.7Va似"15:146-156(1997)和在2002年二月19日提交的U.S.公開(kāi)專(zhuān)利申請(qǐng)2003-0070185。因此，為了進(jìn)一步檢查本發(fā)明的抗體結(jié)構(gòu)，從得自克隆的cDNA產(chǎn)生預(yù)知氨基酸序列的抗體。另外，N-端氨基酸序列通過(guò)蛋白質(zhì)測(cè)序獲得。圖1提供若干個(gè)本發(fā)明抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)的核苷酸和氨基酸序列。如表1和2中所示，上述每個(gè)特定的抗體可通過(guò)它們重鏈(Vh)和輕鏈(Vl)的可變結(jié)構(gòu)域序列來(lái)描述。這些SEQIDNOs.所涉及的特定序列顯示在圖1中。如表1和表2所示，上述抗體相應(yīng)的Vh和VJ勺氨基酸和DNA序列由SEQIDNOs:1-23、68-90和320-343描述。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>本發(fā)明的額外抗體和抗原結(jié)合部分也可被描述為包含CDR和FR序列，所述CDR禾QFR序列構(gòu)成表1和2中所示抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)。因此，對(duì)應(yīng)于本發(fā)明抗體多種CDR禾卩FR序列的SEQIDNOs在表3中顯示。另外，也在129-lc4親本抗體的重鏈和輕鏈CDR3區(qū)中進(jìn)行了大量隨機(jī)的突變，其產(chǎn)生經(jīng)改進(jìn)的P-鈣黏著蛋白親和力，所述親和力通過(guò)表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法測(cè)量改進(jìn)10-到417-倍范圍內(nèi)(見(jiàn)實(shí)施例8)。這些經(jīng)突變的VH和CDR3序列的SEQIDNOs.(SEQIDNOs:91-256和257-319)也包括在以下表3中。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>生產(chǎn)抗體的方法噬菌體展示文庫(kù)本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分可根據(jù)本領(lǐng)域已知的若干方法來(lái)制備。例如，可使用噬菌體展示技術(shù)提供含有一系列抗體的文庫(kù)，所述抗體具有不同的對(duì)p-鈣黏著蛋白的親和力。然后可篩選這些文庫(kù)以鑒定并分離對(duì)p-鈣黏著蛋白具有所需親和力的分離抗體。例如，本發(fā)明的重組人p-鈣黏著蛋白抗體可通過(guò)篩選重組的組合抗體文庫(kù)來(lái)分離。優(yōu)選地，所述文庫(kù)為使用人VL和VHcDNA生產(chǎn)的scFv噬菌體展示文庫(kù)，所述cDNA從分離自人B細(xì)胞的mRNA制備。用于制備和篩選這類(lèi)文庫(kù)的方法為本領(lǐng)域已知。用于生產(chǎn)噬菌體真實(shí)文庫(kù)的試劑盒可商業(yè)購(gòu)得(例如PharmaciaRecombinantPhageAntibodySystem,產(chǎn)品目錄號(hào)no.27-9400-01;和theStratageneSurfZAP噬菌體展示試劑盒，產(chǎn)品目錄號(hào)no.240612)。還存在其他方法和試劑可用于產(chǎn)生和篩選抗體展示文庫(kù)(參閱例如U.S.專(zhuān)禾UNo.5,223,409;PCT公開(kāi)Nos.WO92/18619、WO91/17271、WO92/20791、WO92/15679、WO93/01288、WO92/01047和WO92/09690;Fuchsetal.，說(shuō)o/Tec/mo/ogy9:1370-1372(1991);Hay，etal.,ii/w/w.y4w幼o(hù)d場(chǎng)^廠(chǎng)油mo51,3:81-85(1992);Huse,etal"5Wewce,246:1275-1281(1989);McCaffertyetal.，A^w",348:552-554(1990);Griffiths:etal.,EMSO人12:725-734(1993);Hawkins,etal.，Mo/.AW"226:889-896(1992);Clackson,etal.,淑騰352:624-628(1991);Gram,etal.,尸rac.腐.Jcac/.5W.t/&4，89:3576-3580(1992);Garrad,etal.,5w/rec/mo/ogy，9:1373-1377(1991);Hoogenboom，etal.,Wwc.y4c^ie&,19:4133-4137(1991);Barbas,etal.,尸rac.TVa".Jcadi7&4，88:7978-7982(1991);和Griffiths,etal.，^MSO/.,13:3245-3260(1994);其均通過(guò)引用并入本文)。用于制備用于噬菌體展示技術(shù)的抗體文庫(kù)的另一方法包含步驟用P-鈣黏著蛋白或其抗原部分免疫包含人免疫球蛋白基因座的非人動(dòng)物，以產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從被免疫的動(dòng)物中抽提產(chǎn)生抗體的細(xì)胞；從經(jīng)抽提的細(xì)胞中分離編碼本發(fā)明抗體重鏈和輕鏈的RNA;反轉(zhuǎn)錄該RNA產(chǎn)生cDNA，使用引物擴(kuò)增該cDNA并將該cDNA插入噬菌體展示載體中，使得抗體在噬菌體上被表達(dá)。為了生產(chǎn)這類(lèi)系列，不必須將來(lái)自被免疫動(dòng)物的B細(xì)胞無(wú)限增殖化。另外，原始B細(xì)胞可直接用作DNA的來(lái)源。得自B細(xì)胞(例如來(lái)自脾)的cDNA混合物被用于制備表達(dá)文庫(kù)，例如轉(zhuǎn)染進(jìn)五."http://的噬菌體展示文庫(kù)。根本地，鑒定對(duì)抗原產(chǎn)生所需強(qiáng)度親和力的來(lái)自文庫(kù)的克隆，并將編碼負(fù)責(zé)這類(lèi)結(jié)合的產(chǎn)物的DNA回收并處理用于標(biāo)準(zhǔn)重組表達(dá)。噬菌體展示文庫(kù)還可使用先前經(jīng)處理的核苷酸序列構(gòu)建并以相似方式篩選。一般地，編碼重鏈和輕鏈的cDNA被獨(dú)立地提供或被連接以形成Fv類(lèi)似物，用于在噬菌體文庫(kù)中生產(chǎn)。然后從噬菌體文庫(kù)中篩選對(duì)P-鈣黏著蛋白具有最高親和力的抗體，并從適當(dāng)?shù)目寺≈谢厥者z傳材料。更多輪的篩選可提高所分離的原始抗體的親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，為了分離和生產(chǎn)具有所需特性的人P-鈣黏著蛋白抗體，本文所述的人P-鈣黏著蛋白抗體首先被用于使用PCT公開(kāi)No.WO93/06213中所述的表位印記方法選擇對(duì)P-鈣黏著蛋白具有相似結(jié)合活性的人重鏈和輕鏈序列，所述資料通過(guò)引用并入本文。優(yōu)選地，該方法中使用的抗體文庫(kù)是如PCT公開(kāi)No.WO92/01047，McCafferty，etal.,7Va^"，348:552-554(1990);和Griffiths,etal.，fMSO12:725-734(1993),所述制備并篩選的scFv文庫(kù)，所述資料均通過(guò)引用并入本文。所述scFv抗體文庫(kù)可使用人P-鈣黏著蛋白作為抗原來(lái)篩選。從噬菌體文庫(kù)中篩選對(duì)P-鈣黏著蛋白具有最高親和力的抗體，并從適當(dāng)?shù)目寺≈谢厥者z傳材料。更多輪的篩選可提高所分離的原始抗體的親和力。一旦選擇了初始的人Vl和VH結(jié)構(gòu)域，可然后進(jìn)行"混合并匹配"實(shí)驗(yàn)，其中篩選初始選擇的不同對(duì)V^和VH片段對(duì)P-鈣黏著蛋白的結(jié)合，以選擇優(yōu)選的Vl/Vh対組合。這些混合并匹配實(shí)驗(yàn)也可在隨機(jī)突變V^和VH片段后進(jìn)行，用于下文所述的最佳化結(jié)合。另外，為了進(jìn)一步提高抗體品質(zhì)，優(yōu)選的Vl/Vh対的Vl和Vh片段可以在下述方法中被隨機(jī)突変(優(yōu)選地在Vh和/或Vl的CDR3區(qū)中)，所述方法與天然免疫應(yīng)答中負(fù)責(zé)抗體親和力成熟的體內(nèi)體細(xì)胞突變方法類(lèi)似。該體外親和力成熟可以例如通過(guò)使用分別與VHCDR3或VlCDR3互補(bǔ)的PCR引物擴(kuò)增Vh或Vl結(jié)枸域而完成，所述引物已用四種核苷酸堿基的隨機(jī)混合物在某些位置上被"穿刺(spiked)"，使得產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物編碼下述Vh和Vl片段，所述Vh和VL片段中隨機(jī)突變被引入Vh和/或CDR3區(qū)中?？稍谶@些隨機(jī)突變的Vh和Vl片段中再蹄逸対P-鈣黏著蛋白的結(jié)合，對(duì)P-鈣黏著蛋白顯示高親和力和低解離率(offrate)的序列可被選擇。如先前所述，SEQIDNOs:91-256和257-319指出被隨機(jī)突變并顯示經(jīng)改進(jìn)的親和力的、本發(fā)明的若干Vh禾卩VlCDR3序歹j。從重組的免疫球蛋白展示文庫(kù)中篩選并分離本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體之后，可從展示包(例如從噬菌體基因組中)中回收編碼所選擇抗體的核酸，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)亞克隆進(jìn)其他表達(dá)載體中。需要時(shí)，核酸可被進(jìn)一步加工以產(chǎn)生本發(fā)明的其他抗體形式，如下文所述。為了表達(dá)通過(guò)篩選組合文庫(kù)而分離的重組人抗體，將編碼所述抗體的DNA克隆進(jìn)重組表達(dá)載體中并引入宿主細(xì)胞中，如下文所述。免疫在另一實(shí)施方案中，人P-鈣黏著蛋白抗體可以通過(guò)免疫非人的、轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物來(lái)產(chǎn)生，所述動(dòng)物的基因組中包含帶有P-鈣黏著蛋白抗原的一些或所有的人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座。例如，非人動(dòng)物可以是XENOMOUSETM動(dòng)物。(Abgenix，Inc.,Fremont,CA)。XENOMOUSETM小鼠被操作為包含大片段人免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因座的、小鼠抗體生產(chǎn)不足的小鼠株系。參閱例如Green,etal.,Ato,e7:13-21(1994)和U.S.專(zhuān)利Nos.5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963禾卩6,150,584。還參閱WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735、WO98/16654、WO98/24893、WO98/50433、WO99/45031、WO99/53049、WO00/09560和WO00/037504。這些文件中公開(kāi)的方法可如U.S.專(zhuān)利No.5,994,619中所述被修飾，其通過(guò)引用并入本文。U.S.專(zhuān)利No.5,994,619描述用于制造新培養(yǎng)的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(CICM)細(xì)胞和細(xì)胞系(來(lái)自豬和牛)，以及其中被插入異源DNA的轉(zhuǎn)基因CICM細(xì)胞。CICM轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以用于制造克隆的轉(zhuǎn)基因胚、胎和后代。所述'619專(zhuān)利還描述了制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法，所述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物能夠?qū)愒碊NA傳遞給其后代?？捎糜谶@些方法的非人動(dòng)物實(shí)例包括大鼠、綿羊、豬、山羊、牛、雞和馬。XENOMOUSETM小鼠生產(chǎn)成人樣人系列的全人抗體并產(chǎn)生抗原特異性的人抗體。在一些實(shí)施方案中，XENOMOUSETM小鼠通過(guò)引入經(jīng)測(cè)量的巨堿基(megabasesized)、人重鏈基因座的種系構(gòu)型片段和酵母人工染色體(YAC)中k輕鏈基因座而含有約80%的人抗體V基因系列。在另一實(shí)施方案中，XENOMOUSETM小鼠還含有約所有人入輕鏈基因座。參閱Mendez,etal.,AtoweGewe/to'15:146-156(1997),GreenandJakobovits,五平她d，188:483-495(1998)和WO98/24893，其公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，包含人免疫球蛋白基因的非人動(dòng)物是具有人免疫球蛋白"小基因座(minilocus)"的動(dòng)物。在小基因座途徑中，外源Ig基因座通過(guò)包括來(lái)自Ig基因座的個(gè)體基因而被模擬。因此，一個(gè)或多個(gè)VH基因、一個(gè)或多個(gè)Dh基因、一個(gè)或多個(gè)Jh基因、U恒定結(jié)構(gòu)域和另一恒定結(jié)構(gòu)域(優(yōu)選地，Y恒定結(jié)構(gòu)域)形成一個(gè)構(gòu)建體用于插入動(dòng)物中。該途徑描述于U.S.專(zhuān)禾UNos.5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5，770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215和5,643,763中，通過(guò)引用并入本文。上述非人動(dòng)物可隨后用如下所述的P-鈣黏著蛋白抗原在允許抗體產(chǎn)生的條件下被免疫。從動(dòng)物中分離產(chǎn)生抗體的細(xì)胞，從經(jīng)分離的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞中或從這類(lèi)細(xì)胞所產(chǎn)生的無(wú)限增殖細(xì)胞系中分離編碼目的P-鈣黏著蛋白抗體的重鏈和輕鏈的核酸。這些核酸隨后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和如下文進(jìn)一步描述的技術(shù)被加工，以降低非人序列的量，即人源化所述抗體以降低在人中的免疫應(yīng)答。在一些實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗原可被分離和/或是經(jīng)純化的P-鈣黏著蛋白。在一些實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白是人P-鈣黏著蛋白。在其他實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗原可以是表達(dá)或過(guò)表達(dá)P-鈣黏著蛋白的細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗原是由酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、細(xì)菌如Eco//或其他來(lái)源通過(guò)重組技術(shù)所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)。動(dòng)物免疫可以通過(guò)本領(lǐng)i或己知的任何方法進(jìn)行。參閱例如HarlowandLane,Antibodies:ALaboratoryManual,NewYork:ColdSpringHarborPress(1990)。用于免疫非人動(dòng)物如小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛和馬的方法為本領(lǐng)域公知。參閱例如HarlowandLane,上文，和U.S.專(zhuān)利No.5,994,619。例如，P-鈣黏著蛋白抗原可以與佐劑一起被施用以刺激免疫應(yīng)答。示范性的佐劑包括完全或不完全Freund，s佐劑、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激復(fù)合物)。這類(lèi)佐劑可通過(guò)將多肽隔離在局部沉積物中而保護(hù)其免于快速分散，或它們可包含刺激宿主分泌下述因子的物質(zhì)，所述因子對(duì)巨噬細(xì)胞和免疫系統(tǒng)中的其他成分是趨化性的(chemotactic)。優(yōu)選地，如果多肽被施用，則免疫程序表會(huì)涉及多肽的兩次或更多施用(遍布若干周中)。例如，如上所述用P-鈣黏著蛋白免疫轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后，可從經(jīng)免疫的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中分離原始細(xì)胞(例如脾或外周血B細(xì)胞)，并可鑒定產(chǎn)生下述抗體的個(gè)體細(xì)胞，所述抗體對(duì)目的抗原特異。然后分離來(lái)自每個(gè)個(gè)體細(xì)胞的經(jīng)多腺苷酸化的mRNA，使用與可變區(qū)序列退火的有義引物(例如識(shí)別大部分或所有人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因FR1區(qū)的簡(jiǎn)并引物，和與恒定區(qū)或連接區(qū)序列退火的反義引物)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)。然后克隆重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA并在任何合適的宿主細(xì)胞(例如骨髓瘤細(xì)胞)中表達(dá)為嵌合抗體，所述嵌合抗體帶有各自的免疫球蛋白恒定區(qū)，例如重鏈和/c或入恒定結(jié)構(gòu)域。參閱Babcook，etal.,iVoc.2V^/.JcW.93:7843-48，(1996)，通過(guò)引用并入本文。然后可如本文所述鑒定并分離P-鈣黏著蛋白。生產(chǎn)抗體的重組方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的抗體或抗體部分可以通過(guò)免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因在宿主細(xì)胞中的重組表達(dá)來(lái)制備。例如，為了重組地表達(dá)抗體，用帶有編碼抗體免疫球蛋白輕鏈和重鏈的DNA片段的一個(gè)或多個(gè)重組表達(dá)載體來(lái)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，使得所述輕鏈和重鏈在宿主細(xì)胞中被表達(dá)，優(yōu)選地被分泌進(jìn)入培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中，從該培養(yǎng)基中可回收抗體。使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法獲得抗體重鏈和輕鏈基因，將這些基因整合進(jìn)重組表達(dá)載體并將所述載體引入宿主細(xì)胞，所述方法例如Sambrook,FritschandManiatis(eds):MolecularCloning;ALaboratoryManual,SecondEdition,ColdSpringHarbor,N.Y.,(1989),Ausubel,F.M.，etal.(eds.)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates,(1989)和U.S.專(zhuān)利No.4,816,397中所述的方法，這些資料的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。突變和修飾為了表達(dá)本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體，可使用如上所述的任何方法首先獲得編碼Vh和Vl區(qū)的DNA片段。也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)方法向DNA序列中引入多種突變、缺失和/或添加。例如，可使用標(biāo)準(zhǔn)方法(例如PCR-介導(dǎo)的誘變)進(jìn)行誘變，其中經(jīng)突變的核苷酸被整合進(jìn)PCR引物中，使得PCR產(chǎn)物含有所需的突變或定點(diǎn)誘變。例如，可以制造的一種類(lèi)型的取代是改變抗體中一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸，所述半胱氨酸對(duì)另一殘基(例如但不限于丙氨酸或絲氨酸)可以是化學(xué)反應(yīng)性的。例如，可以存在不規(guī)范半胱氨酸的取代。該取代可以在抗體的CDR中或可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)中或恒定結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生。在一些實(shí)施方案中，半胱氨酸是規(guī)范的。抗體也可以在重鏈和/或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中發(fā)生突變，例如以改變抗體的結(jié)合特征。例如，突變可以在一個(gè)或多個(gè)CDR區(qū)中發(fā)生以提高或降低抗體對(duì)P-鈣黏著蛋白的KD、提高或降低k。ff或改變抗體的結(jié)合特異性。定點(diǎn)誘變技術(shù)為本領(lǐng)域公知。參閱例如Sambrook，etal.andAusubel,etal.，上文，其通過(guò)引用并入本文。例如，如在實(shí)施例8中更詳細(xì)描述的，根據(jù)上文所述步驟制造129-lc4親本的大量可變的Vh和CDR3序列，并在圖1中被顯示為SEQIDNOs:91到256(VHCDR3變體)和SEQIDNOs:257至U319(VlCDR3變體)。也可在框架區(qū)或恒定結(jié)構(gòu)域中制造突變以提高P-鈣黏著蛋白抗體的半衰期。參閱例如PCT公開(kāi)No.WO00/09560，通過(guò)引用并入本文?？蚣軈^(qū)或恒定結(jié)構(gòu)域中的突變也可被制造以改變抗體的免疫原性、提供與另一分子共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合的位點(diǎn)或改變?nèi)缪a(bǔ)體結(jié)合、FcR結(jié)合和抗體依賴(lài)性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性之類(lèi)的特征。根據(jù)本發(fā)明，單個(gè)抗休可在任何一個(gè)或多個(gè)CDR或可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)或恒定區(qū)中具有突變。在稱(chēng)作"種系化"的方法中，Vh和V^序列中某些氨基酸可以被突變以匹配在種系Vh和Vl序列中天然存在的氣基酸。具體地，Vh和Vl序列中框架區(qū)的氨基酸序列可以被突變來(lái)匹配種系序列，以降低抗體被施用時(shí)的免疫原性風(fēng)險(xiǎn)。人Vh和V^基因的種系DNA序列為本領(lǐng)域己知(參閱例如the"Vbase"humangermlinesequencedatabase;還參閱Kabat，E.A.,etal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242;Tomlinson,etal.(1992),Mo/,說(shuō)o/.227:776-798;和Cox,etal.五跌J./mmw"o/,24:827-836(1994);每個(gè)資料的內(nèi)容通過(guò)引用明確并入本文)。可以制造的另一類(lèi)型的氨基酸取代是去除抗體中可能的蛋白水解位點(diǎn)。這類(lèi)位點(diǎn)可存在于CDR中或可變結(jié)構(gòu)域的框架區(qū)中或抗體的恒定結(jié)構(gòu)域中。半胱氨酸殘基的取代和蛋白水解位點(diǎn)的去除可降低抗體產(chǎn)物中的異質(zhì)性風(fēng)險(xiǎn)從而提高其同質(zhì)性。另一類(lèi)型的氨基酸取代是通過(guò)改變天冬酰胺-甘氨酸對(duì)的一個(gè)或兩個(gè)殘基將其消除，所述天冬酰胺-甘氨酸對(duì)形成可能的脫酰胺位點(diǎn)。在另一實(shí)例中，本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體重鏈的C-端賴(lài)氨酸可以被切割。在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體的重鏈和輕鏈可任選地包括N-端信號(hào)序列，如SEQIDNOs:346和347所指的序列。一旦獲得編碼本發(fā)明Vh和V^片段的DNA片段，這些DNA片段可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)被進(jìn)一步地處理，以例如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)抗體鏈基因、轉(zhuǎn)化為Fab片段基因或轉(zhuǎn)化為scFv基因。在這些處理中，Vl-或V『編碼DNA片段被可操作地與編碼另一蛋白質(zhì)的另一DNA片段連接，所述另一蛋白質(zhì)為例如抗體恒定區(qū)或柔性接頭(flexiblelinker)。該語(yǔ)境中使用術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"旨在表示兩個(gè)DNA片段被連接，使得由兩個(gè)DNA片段編碼的氨基酸序列保持在讀碼框內(nèi)(in-frame)。經(jīng)分離的編碼Vh區(qū)的DNA可通過(guò)將V『編碼DNA與編碼重鏈恒定區(qū)(CH1、CH2和CH3)的另一DNA分子可操作地連接而被轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)重鏈基因。人重鏈恒定區(qū)基因的序列為本領(lǐng)域已知(參閱例如Kabat，E.A.，etal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEd"U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，包含這些區(qū)的DNA片段可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定區(qū)，但是最優(yōu)選地是IgGl或IgG2恒定區(qū)。IgGl恒定區(qū)序列可以是任何已知在不同個(gè)體間存在的等位基因或同種異型，例如Gm(l)、Gm(2)、Gm(3)和Gm(17)。這些同種異型代表了IgGl恒定區(qū)中天然存在的氨基酸取代。例如，重鏈IgGl恒定區(qū)可以是SEQIDNO:344。就Fab片段重鏈基因而言，V『編碼DNA可以與僅編碼重鏈CHI恒定區(qū)的另一DNA分子可操作地連接。CHI重鏈恒定區(qū)可以來(lái)自任何重鏈基因。經(jīng)分離的編碼Vl區(qū)的DNA可以通過(guò)將VL-編碼DNA與編碼輕鏈恒定區(qū)CL的另一DNA分子可操作地連接而被轉(zhuǎn)化為全長(zhǎng)輕鏈基因(例如Fab輕鏈基因)。人輕鏈恒定區(qū)基因的序列為本領(lǐng)域已知(參閱例如Kabat,E.A.，etal.(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEd"U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,NIHPublicationNo.91-3242)，包含這些區(qū)的DNA片段可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是k或A恒定區(qū)。k恒定區(qū)可以是任何已知發(fā)生在不同個(gè)體間的多種等位基因，例如Inv(l)、Inv(2)和Inv(3)。入恒定區(qū)可以來(lái)自三個(gè)人基因之任一。例如，輕鏈IgGl恒定區(qū)可以是SEQIDNO:347。為了產(chǎn)生scFv基因，將Vh-和Vl-編礙DNA片段與編碼柔性接頭(例如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一片段可操作地連接，使得Vh和VL序列可以被表達(dá)為緊鄰的單鏈蛋白質(zhì)，其中Vh和VL區(qū)通過(guò)柔性接頭相連(參閱例如Birdetal.5We"ce242:423-426(1988);Hustonetal.尸rac.A^/.爿cad.園85:5879-5883(1988);McCafferty,etal"淑mm，348:552-554(1990))。單鏈抗體可以是單價(jià)的(如果僅使用單個(gè)Vh和Vl)、雙價(jià)的(如果使用兩個(gè)Vh和Vl)或多價(jià)的(如果使用多于兩個(gè)Vh和Vl)。可產(chǎn)生與P-鈣黏著蛋白和另一分子特異結(jié)合的雙特異性抗體或多價(jià)抗休。在另一實(shí)施方案中，可以制造融合抗體或免疫粘附素，其包含與另一多肽連接的本發(fā)明P-鈣黏著蛋白抗體的全部或部分。在另一實(shí)施方案中，僅P-鈣黏著蛋白抗體的可變區(qū)與多肽連接。在另一實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體的VH結(jié)構(gòu)域與第一個(gè)多肽連接，而P-鈣黏著蛋白抗體的VL結(jié)構(gòu)域與第二個(gè)多肽連接，所述第二個(gè)多肽以下述方式與第一個(gè)多肽相連VH和V^結(jié)構(gòu)域能夠彼此相互作用，形成抗原結(jié)合位點(diǎn)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，Vh結(jié)枸域與VL結(jié)構(gòu)域通過(guò)接頭分離，使得Vh和VJ吉構(gòu)域可以彼此相互作用。然后將VH-接頭-V^抗體與目的多肽連接。另外可產(chǎn)生融合蛋白質(zhì)，其中兩個(gè)(或更多)單鏈抗體被彼此連接。這適用于想要在單一多肽鏈上產(chǎn)生二價(jià)或多價(jià)抗體，或想要產(chǎn)生雙特異性抗體時(shí)。在其他實(shí)施方案中，可使用編碼P-鈣黏著蛋白抗體的核酸分子制備其他的經(jīng)修飾的抗體。例如可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)依照本說(shuō)明書(shū)的教導(dǎo)制各"k抗體(Kappabodies)"(111,etal"尸驗(yàn)/"10:949-57(1997)),"小抗體(Minibodies)"(Martin,etal"五細(xì)O13:5303-9(1994))，"雙抗體，，(Holliger,etal"尸rac.淑/.Jed>SW.園'90:6444-6448(1993))或"Janusins，，(Traunecker,etal.，EMSO,,10:3655-3659(1991)禾卩Tra薦cker,etal"乂(Suppl.)7:51-52(1992))。可通過(guò)大量方法(包括融合雜交瘤或連接Fab'片段)生產(chǎn)雙特異性抗體或抗原結(jié)合片段。參閱例如Songsivilai&Lachmann，五xp./m肌廳o/.，79:315-321(1990),Kostelny,etal.,/mm歸/"148:1547-1553(1992)。另外，雙特異性抗體可以形成為"雙抗體"或"Janusins"。在一些實(shí)施方案中，雙特異性抗體與P-鈣黏著蛋白兩個(gè)不同的表位結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，使用來(lái)自本文提供的人P-鈣黏著蛋白抗體的一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域或CDR區(qū)制備如上所述的經(jīng)修飾的抗體。載體和宿主細(xì)胞為了表達(dá)本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合部分，將如上所述獲得的、編碼部分或全長(zhǎng)的輕鏈和重鏈的DNA插入表達(dá)載體中，使得基因與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列可操作地連接。在該語(yǔ)境中，術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"旨在表示抗體基因被連接進(jìn)載體，使得載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列提供它們預(yù)期的調(diào)節(jié)抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。選擇與所使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容的表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序列。表達(dá)載體包括質(zhì)粒，反轉(zhuǎn)錄病毒，腺病毒，腺伴隨病毒(AAV)，植物病毒如花椰菜花葉病毒、煙草花葉病毒，粘粒，YAC，EBV衍生的附加體等?？贵w基因被連接進(jìn)載體，使得載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控序列提供它們預(yù)期的調(diào)節(jié)抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。選擇與所使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容的表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序列。抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可以被插入分離的載體中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，兩個(gè)基因被插入同一表達(dá)載體中?？贵w基因通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(例如連接抗體基因片段和載體上互補(bǔ)的限制性位點(diǎn)，或不存在限制性位點(diǎn)時(shí)連接平末端)被插入表達(dá)載體中。便利的載體是下述載體，其編碼功能完整的人Ch或Cl免疫球蛋白序列，帶有被設(shè)計(jì)的適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c(diǎn)，使得任何Vh或Vl序列可以被容易地插入和表達(dá)，如上所述。在這類(lèi)載體中，剪接通常發(fā)生在被插入的J區(qū)中剪接供體位點(diǎn)和人C結(jié)構(gòu)域之前的剪接受體位點(diǎn)之間，還發(fā)生在存在于人CH外顯子中的剪接區(qū)中。多腺苷酸化和轉(zhuǎn)錄終止存在于編碼區(qū)下游的天然染色體位點(diǎn)中。重組表達(dá)載體還可編碼信號(hào)肽，所述信號(hào)肽有助于抗體鏈從宿主細(xì)胞中分泌。抗體鏈基因可以被克隆進(jìn)載體中，使得信號(hào)肽與免疫球蛋白鏈氨基端按照讀碼框連接。信號(hào)肽可以是免疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(即來(lái)自非免疫球蛋白蛋白質(zhì)的信號(hào)肽)。除抗體鏈基因外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體帶有調(diào)控抗體鏈基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)節(jié)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道表達(dá)載體的設(shè)計(jì)，包括調(diào)節(jié)序列的選擇可取決于下述因子用于被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)表達(dá)水平等等。用于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)的優(yōu)選的調(diào)節(jié)序列包括指導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)高水平表達(dá)的病毒元件，例如來(lái)自逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子、來(lái)自巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子(例如CMV啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、來(lái)自猿猴病毒40(SV40)的啟動(dòng)子禾口/或增強(qiáng)子(例如SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子)、來(lái)自腺病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子(例如腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP))、多瘤啟動(dòng)子和強(qiáng)哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子如天然免疫球蛋白啟動(dòng)子和肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。病毒調(diào)節(jié)元件的進(jìn)一步描述及其序列參閱例如U.S,專(zhuān)利No.5，168，062、U.S.專(zhuān)利No.4,510,245和U.S.專(zhuān)利No.4,968,615。用于在植物中表達(dá)抗體的方法(包括啟動(dòng)子和載體的描述)以及植物轉(zhuǎn)化的方法為本領(lǐng)域已知。參閱例如U.S.專(zhuān)利No.6,517,529，通過(guò)引用并入本文。在細(xì)菌細(xì)胞或真菌細(xì)胞(例如酵母細(xì)胞)中表達(dá)多肽的方法也是本領(lǐng)域公知的。除抗體鏈基因和調(diào)節(jié)序列外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可帶有額外的序列，例如調(diào)節(jié)載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(如復(fù)制起點(diǎn))和可選擇的標(biāo)記基因?？蛇x擇的標(biāo)記基因有助于選擇其中已被引入載體的宿主細(xì)胞(參閱例如U.S.專(zhuān)利Nos.4，399，216、4,634,665和5,179,017，通過(guò)引用并入本文)。例如典型地，可選擇的標(biāo)記基因給其中己被引入載體的宿主細(xì)胞賦予了對(duì)藥物(如G418、潮霉素或甲氨喋呤)的抗性。優(yōu)選的可選擇的標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于用甲氨喋呤選擇/擴(kuò)增的dhfr-宿主細(xì)胞)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(用于G418選擇)和谷氨酸合成酶基因。編碼P-鈣黏著蛋白抗體的核酸分子和包含這些核酸分子的載體可以用于轉(zhuǎn)染合適的哺乳動(dòng)物、植物、細(xì)菌或酵母宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化可以通過(guò)用于將多核苷酸引入宿主細(xì)胞的任何己知方法進(jìn)行。用于將異源多核苷酸引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域公知，其包括葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、磷酸f丐沉淀、polybrene(1,5-二甲基-l,5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、電穿孔、脂質(zhì)體包裹多核苷酸和將DNA直接顯微注射進(jìn)細(xì)胞核中。另外，可通過(guò)病毒載體將核酸分子引入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域公知。參閱例如U.S.專(zhuān)利Nos.4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455，通過(guò)引用并入本文。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法為本領(lǐng)域公知，包括例如土壤桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、生物射彈轉(zhuǎn)化(biolistictransformation)、直接注射、電穿孔和病毒轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化細(xì)菌和酵母細(xì)胞的方法也是本領(lǐng)域公知的?？色@得的作為宿主用于表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是本領(lǐng)域公知的，其包括可得自AmericanTypeCultureCollection(ATCC).的許多無(wú)限增殖細(xì)胞系。這些包括例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、NSO細(xì)胞、SP2細(xì)胞、HEK-293T細(xì)胞、NIH-3T3細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、幼倉(cāng)鼠腎(BHK)細(xì)胞、非洲綠猴腎細(xì)胞(COS)、人肝細(xì)胞癌細(xì)胞(例如H印G2)、A549細(xì)胞和大量其他細(xì)胞系。具體優(yōu)選的細(xì)胞系通過(guò)確定具有高表達(dá)水平的細(xì)胞系來(lái)選擇。可使用的其他細(xì)胞系是昆蟲(chóng)細(xì)胞系，如Sf9或Sf21細(xì)胞。當(dāng)編碼抗體基因的重組表達(dá)載體被引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中時(shí)，通過(guò)將宿主細(xì)胞培養(yǎng)下述時(shí)間段來(lái)生產(chǎn)抗體，所述時(shí)間段足夠允許抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)，或更優(yōu)選地，允許抗體被分泌進(jìn)培養(yǎng)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化方法從培養(yǎng)基中回收抗體。植物宿主細(xì)胞包括例如煙草、擬南芥、浮萍、玉米、小麥、馬鈴薯等等。細(xì)菌宿主細(xì)胞包括五.o//和&Mptom;;c"禾中。酵母宿主細(xì)胞包括5"c/n'zosacc/mra附j(luò)^cespo附6e、Sacc/zaram少ces1cerev^/ae禾口朽c/n.a戸加"^。另外，生產(chǎn)細(xì)胞系對(duì)本發(fā)明抗體的表達(dá)可使用大量已知技術(shù)來(lái)增強(qiáng)。例如，谷氨酰胺合成酶(GS體系)和DHFR基因表達(dá)體系是用于在某些條件下增強(qiáng)表達(dá)的普遍途徑。高表達(dá)細(xì)胞克隆可以使用常規(guī)技術(shù)(例如有限稀釋克隆法和微滴技術(shù))來(lái)鑒定。GS體系描述于歐洲專(zhuān)利Nos.0216846、0256055、0323997和0338841。很可能由不同細(xì)胞系或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)的抗體會(huì)具有彼此不同的糖基化作用。然而，由本文提供的核酸分子編碼的所有抗體，或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗體都屬于本發(fā)明，無(wú)論抗體是否糖基化。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體也可通過(guò)產(chǎn)生下述哺乳動(dòng)物或植物而轉(zhuǎn)基因地生產(chǎn)，所述哺乳動(dòng)物或植物被轉(zhuǎn)入目的免疫球蛋白重鏈和輕鏈序列的基因并生產(chǎn)可回收形式的抗體。就哺乳動(dòng)物中的轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)而言，P-鈣黏著蛋白抗體可以在山羊、?；蚱渌溉閯?dòng)物的乳中產(chǎn)生，并從其中回收。參閱例如U.S.專(zhuān)利Nos.5,827，6卯、5，756，687、5,750,172禾n5,741,957，通過(guò)引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，包含人免疫球蛋白基因座的非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物使用P-鈣黏著蛋白或其免疫原性部分被免疫，如上所述。用于在植物中制造抗體的方法描述于例如U.S.專(zhuān)利6,046,037和5,959,177中，通過(guò)引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物通過(guò)將一個(gè)或多個(gè)本發(fā)明的核酸分子(其編碼P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入動(dòng)物或植物中來(lái)生產(chǎn)。參閱Hogan和UnitedStates專(zhuān)利6,417,429，如上文。用于制造轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞或體細(xì)胞或受精卵。轉(zhuǎn)基因非人生物可以是嵌合體的、非嵌合體的雜合子禾口非嵌合體的纟屯合子。參閱例如Hoganetal.,ManimilatingtheMouseEmbryo:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborPress(1999);Jackson,etal"MouseGeneticsandTransgenics:APracticalApproach,OxfordUniversityPress(2000);禾口Pinkert,TransgenicAnimalTechnology:ALaboratoryHandbook,AcademicPress(1999)，其均通過(guò)引用并入本文。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因非人動(dòng)物具有靶向構(gòu)建體的定向破壞和替換，所述靶向構(gòu)建體編碼目的重鏈和/或輕鏈。P-鈣黏著蛋白可在任何轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，非人動(dòng)物是小鼠、大鼠、綿羊、豬、山羊、?；蝰R。非人轉(zhuǎn)基因動(dòng)物在血、乳、尿、唾液、淚水、粘液和其他體液中表達(dá)所述被編碼的多肽。種類(lèi)轉(zhuǎn)換P-鈣黏著蛋白的種類(lèi)(例如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)和亞類(lèi)(IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法確定。一般地，抗體的種類(lèi)和亞類(lèi)可以使用對(duì)具體的抗體種類(lèi)和亞類(lèi)特異的抗體來(lái)確定。這類(lèi)抗體是可商業(yè)購(gòu)得的?？赏ㄟ^(guò)ELISA或Western印跡以及其他技術(shù)確定種類(lèi)和亞類(lèi)。或者，可如下確定種類(lèi)和亞類(lèi)通過(guò)測(cè)序抗體重鏈和/或輕鏈的全部或部分恒定區(qū)，將它們的氨基酸序列與多種免疫球蛋白種類(lèi)和亞類(lèi)的己知氨基酸序列比較，并確定抗體的種類(lèi)和亞類(lèi)。本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。例如，P-鈣黏著蛋白抗體可以是IgG，所述IgG是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4亞類(lèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體可具有SEQIDNO:344所示的重鏈恒定區(qū)和SEQIDNO:345所示的輕鏈恒定區(qū)。本發(fā)明的一方面提供用于將P-鈣黏著蛋白抗體的種類(lèi)或亞類(lèi)轉(zhuǎn)化為另--種類(lèi)或亞類(lèi)的方法。在一些實(shí)施方案中，使用本領(lǐng)域公知的方法分離編碼vl或vh的核酸分子，其不包括編碼C^或Ch的序列。然后將所述核酸分子與來(lái)自目的免疫球蛋白種類(lèi)或亞類(lèi)的、編碼Cl或Ch的核酸序列可操作地連接。這可使用載體或包含0_或CH鏈的核酸分子完成，如上所述。例如，最初是IgM的P-鈣黏著蛋白抗體可以被種類(lèi)轉(zhuǎn)換為IgG。另外，可使用種類(lèi)轉(zhuǎn)換將一個(gè)IgG亞類(lèi)轉(zhuǎn)換為另一個(gè)，例如從IgGl轉(zhuǎn)換為IgG2。生產(chǎn)包含目的同種型的本發(fā)明抗體的另一種方法包括以下步驟分離編碼P-鈣黏著蛋白抗體重鏈的核酸和編碼P-鈣黏著蛋白抗體輕鏈的核酸，分離編碼Vh區(qū)的序列，將VH序列與編碼目的同種型重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的序列連接，在細(xì)胞中表達(dá)輕鏈基因和重鏈構(gòu)建體，和收集帶有目的同種型的P-鈣黏著蛋白抗體。脫免疫化的抗體在本發(fā)明的另一方面，可使用例如PCT公開(kāi)Nos.W098/52976和WOOO/34317(通過(guò)引用并入本文)中描述的技術(shù)脫免疫化抗體或其抗原結(jié)合部分以降低其免疫原性。經(jīng)衍生的和經(jīng)標(biāo)記的抗體本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白或其抗原結(jié)合部分可以被衍生或連接至另一分子(例如另一肽或蛋白質(zhì))。一般地，抗體或其部分被衍生使得P-f丐黏著蛋白結(jié)合不受衍生或標(biāo)記的不利影響。因此，本發(fā)明的抗體和抗體部分旨在包括本文所述的完整的和經(jīng)修飾形式的人P-鈣黏著蛋白。例如，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以被功能性地連接(通過(guò)化學(xué)偶聯(lián)、遺傳融合、非共價(jià)結(jié)合或以其他方式)至一個(gè)或多個(gè)其他分子部分，例如另一抗體(例如雙特異性抗體或雙抗體)、檢測(cè)劑、標(biāo)簽、細(xì)胞毒素劑、藥劑和/或蛋白質(zhì)或肽，所述一個(gè)或多個(gè)其他分子部分能夠介導(dǎo)抗體或抗體部分與另一分子(例如鏈霉親和素核區(qū)或多組氨酸標(biāo)簽)的結(jié)合。一種類(lèi)型的衍生抗體是通過(guò)將兩個(gè)或更多個(gè)抗體(相同或不同類(lèi)型的，例如產(chǎn)生雙特異性抗體)交聯(lián)而生產(chǎn)的。合適的交聯(lián)劑包括異雙功能劑(例如m-maleimidobenzoyl-N-羥基琥珀酰亞胺酯)或同雙功能劑(例如disuccinimidylsuberate)，所述異雙功能劑具有被適當(dāng)隔離區(qū)分隔開(kāi)的兩個(gè)不同的反應(yīng)基團(tuán)。這類(lèi)接頭可得自PierceChemicalCompany,Rockford，IL。另一種類(lèi)型的衍生抗體是經(jīng)標(biāo)記的抗體。可以用來(lái)衍生本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合部分的檢測(cè)劑包括熒光化合物(包括熒光黃、異硫氰酸熒光素、羅丹明、5-二甲胺-l-萘磺酰氯、藻紅蛋白、鑭系磷光體等)。抗體還可用適用于檢測(cè)的酶標(biāo)記，例如辣根過(guò)氧化物酶、P-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。抗體使用可檢測(cè)的酶標(biāo)記時(shí)，其可通過(guò)添加額外的試劑檢測(cè)，酶使用所述額外的試劑產(chǎn)生可以辨別的反應(yīng)產(chǎn)物。例如黨存在辣根過(guò)氧化物酶時(shí)，添加過(guò)氧化氫酶和二氨基聯(lián)苯導(dǎo)致有色的反應(yīng)產(chǎn)物，其是可檢測(cè)的?？贵w還可用生物素標(biāo)記，并通過(guò)間接測(cè)量抗生物素蛋白或鏈霉親和素結(jié)合來(lái)檢測(cè)?？贵w還可用預(yù)先確定的、被二級(jí)報(bào)告基因(例如亮氨酸拉鏈對(duì)序列、用于二級(jí)抗體的結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽)識(shí)別的多肽表位來(lái)標(biāo)記。在一些實(shí)施方案種，標(biāo)簽通過(guò)多種長(zhǎng)度的間隔臂結(jié)合以降低可能的位阻。P-鈣黏著蛋白還可以用化學(xué)基團(tuán)衍生，所述化學(xué)基團(tuán)例如聚乙二醇(PEG)、甲基或乙基或碳水化合物基團(tuán)。這些基團(tuán)適用于促進(jìn)抗體的生物學(xué)特性，例如提高血清的半衰期。P-鈣黏著蛋白抗體對(duì)P-鈣黏著蛋白的親合力P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分對(duì)P-鈣黏著蛋白的親合力(KD)和離解速率(k。ff)可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法測(cè)量。可通過(guò)ELISA、RIA、流式細(xì)胞儀或表面等離振子共振，例如BIACORETM來(lái)測(cè)量親合力。離解速率可以通過(guò)表面等離振子共振來(lái)測(cè)量。優(yōu)選地，通過(guò)表面等離振子共振測(cè)量親合力和離解速率。更優(yōu)選地，使用BIACORETM測(cè)量親合力和離解速率?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知方法測(cè)定抗體是否與P-鈣黏著蛋白抗體具有基本相同的KD。這類(lèi)測(cè)定KD和k。ff的方法可用于初始的篩選階段，以及隨后的優(yōu)化階段。鑒定被P-鈣黏著蛋白識(shí)別的P-鈣黏著蛋白表位本發(fā)明提供下述人P-鈣黏著蛋白抗體，所述人P-鈣黏著蛋白抗休與P-鈣黏著蛋白結(jié)合，并與表1或2中所述的任何抗體競(jìng)爭(zhēng)或交叉競(jìng)爭(zhēng)和/或結(jié)合相同表位?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知方法測(cè)定抗體是否與本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體結(jié)合相同的表位，或針對(duì)結(jié)合而交叉競(jìng)爭(zhēng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，允許本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體在飽和條件下與P-鈣黏著蛋白結(jié)合，然后測(cè)量測(cè)試抗體與P-鈣黏著蛋白結(jié)合的能力。如果測(cè)試抗體能夠和P-鈣黏著蛋白抗體同時(shí)與P-鈣黏著蛋白結(jié)合，則測(cè)試抗體和P-鈣黏著蛋白抗體結(jié)合不同的表位。然而，如果測(cè)試抗體不能同時(shí)結(jié)合P-鈣黏著蛋白，則測(cè)試抗體結(jié)合相同的表位或重疊表位，或與人P-鈣黏著蛋白抗體所結(jié)合的表位密切近似的表位結(jié)合。該實(shí)驗(yàn)可使用ELISA、RIA、BIACORETM或流式細(xì)胞儀進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，實(shí)驗(yàn)使用ELISA進(jìn)行。通過(guò)P-鈣黏著蛋白抗體抑制P-鈣黏著蛋白活性可使用大量測(cè)定法鑒定抑制P-鈣黏著蛋白活性的P-鈣黏著蛋白抗體。例如，細(xì)胞聚集測(cè)定法提供了測(cè)量P-鈣黏著蛋白-依賴(lài)性的細(xì)胞聚集的方法。該類(lèi)型的測(cè)定法使用過(guò)表達(dá)P-鈣黏著蛋白的細(xì)胞系，其中細(xì)胞被置于懸浮液中并被允許形成P-鈣黏著蛋白-依賴(lài)性聚集體。然后使用聚集測(cè)試，通過(guò)測(cè)量使用和不使用抗體導(dǎo)致的細(xì)胞聚集體的尺寸來(lái)定量P-鈣黏著蛋白抗體阻止該聚集的能力。作為P-鈣黏著蛋白抗體濃度的函數(shù)，細(xì)胞聚集體的尺寸可隨后被用于測(cè)定ICs。值。實(shí)施例3提供了用于測(cè)量若干P-鈣黏著蛋白抗體ICso值的P-鈣黏著蛋白-依賴(lài)性聚集體測(cè)定法的其他細(xì)節(jié)。細(xì)胞粘附測(cè)定法還可用于測(cè)量P-鈣黏著蛋白阻斷細(xì)胞與受體P-鈣黏著蛋白粘附的能力，所述受體P-鈣黏著蛋白已被固定在固體載體上。該類(lèi)型的測(cè)定法可通過(guò)例如將P-鈣黏著蛋白固定在固體載體如塑料上來(lái)進(jìn)行。然后允許過(guò)表達(dá)P-鈣黏著蛋白的細(xì)胞通過(guò)P-鈣黏著蛋白-P-鈣黏著蛋白相互作用附著在固體載體上。然后可以使用或不使用P-鈣黏著蛋白抗體定量附著的水平。作為抗體濃度的函數(shù)，附著可隨后用于測(cè)定IC5。值。實(shí)施例3提供用于測(cè)量P-鈣黏著蛋白抗體ICso值的P-鈣黏著蛋白-依賴(lài)性細(xì)胞附著測(cè)定法的其他細(xì)節(jié)。p-鈣黏著蛋白活性的抑制也可使用p-鈣黏著蛋白依賴(lài)性球狀體破壞測(cè)定法來(lái)測(cè)量。該類(lèi)型的測(cè)定法測(cè)量p-鈣黏著蛋白抗體破壞預(yù)先形成的p-鈣黏著蛋白-依賴(lài)性細(xì)胞聚集的能力。通過(guò)測(cè)量聚集體的尺寸減小(作為抗體濃度的函數(shù))，可測(cè)定ICso值。實(shí)施例5提供用于測(cè)量P-鈣黏著蛋白抗體ICso值的P-鈣黏著蛋白-依賴(lài)性球狀體破壞測(cè)定法的其他細(xì)節(jié)。上述通過(guò)多種抗體或其抗原結(jié)合部分用于測(cè)定p-鈣黏著蛋白活性抑制的方法和測(cè)定法，可在初始的篩選階段以及隨后的優(yōu)化階段使用。分子選擇性本發(fā)明P-鈣黏著蛋白抗體對(duì)其他鈣黏著蛋白(例如E-鈣黏著蛋白)的選擇性可使用本領(lǐng)域公知方法測(cè)定。例如，可使用Western印跡、流式細(xì)胞儀、ELISA、免疫沉淀或RIA測(cè)定選擇性。實(shí)施例7提供ELISA測(cè)定法的其他細(xì)節(jié)，所述ELISA測(cè)定法用于測(cè)量特定抗體對(duì)P-鈣黏著蛋白超出E-鈣黏著蛋白的選擇性。上述用于測(cè)定多種抗體或其抗原結(jié)合部分對(duì)P-鈣黏著蛋白選擇性的方法和測(cè)定法，可在初始的篩選階段以及隨后的優(yōu)化階段使用。藥物組合物和施用本發(fā)明還涉及用于在哺乳動(dòng)物(包括人)中治療異常細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物組合物，所述藥物組合物包含一定量的本文所述P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分以及藥物可接受載體，所述量有效治療異常細(xì)胞生長(zhǎng)。本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合部分可被整合進(jìn)適用于施用給受試者的藥物組合物中。典型地，藥物組合物包含本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合部分和藥物可接受載體。本文使用"藥物可接受載體"是指生理學(xué)適用的任何和所有的溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。藥物可接受載體的一些實(shí)例是水、鹽水、磷酸鹽緩沖的鹽水、葡萄糖、tt油、乙醇等及其組合。在許多情況下，組合物屮優(yōu)選包括等滲劑例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。藥物可接受物質(zhì)的其他實(shí)例是濕潤(rùn)劑或少量輔助物質(zhì)，例如濕潤(rùn)劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液，其延長(zhǎng)抗體的儲(chǔ)藏壽命或提高其效力。本發(fā)明的組合物可以是多種形式，例如液體、半固體和固體劑型，例如液體溶液(例如可注射的和可輸注的溶液)、分散液或懸浮液、藥片、丸劑、粉末、脂質(zhì)體和栓劑。優(yōu)選的形式取決于將采用的施用和治療應(yīng)用模式。典型的優(yōu)選的組合物是可注射或可輸注的溶液，例如與用于被動(dòng)免疫人的組合物類(lèi)似的組合物。優(yōu)選的施用模式是腸胃外的(例如靜脈、皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi))。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)靜脈輸注或注射施用抗體。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)肌內(nèi)或皮下注射施用抗體。用于注射的配方可以以單位劑型存在于例如安瓿或多劑容器中，添加或不添加防腐劑。組合物可在油性或水性運(yùn)載體中帶有如懸浮液、溶液或乳劑之類(lèi)的形式，并可含有配制劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以是用于在使用前與合適運(yùn)載體(例如滅菌的無(wú)熱原水)組合的粉末形式。典型地，治療組合物在制造和儲(chǔ)存的條件下必須是無(wú)菌和穩(wěn)定的。組合物可被配制為溶液、微乳劑、分散劑、脂質(zhì)體或適用于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^(guò)將所需用量的P-鈣黏著蛋白抗體整合進(jìn)帶有所需的上文所列成分之一或其組合的適當(dāng)溶劑中，然后過(guò)濾滅菌來(lái)制備無(wú)菌的可注射溶液。一般地，通過(guò)將活性化合物整合進(jìn)無(wú)菌運(yùn)載體中制備分散劑，所述無(wú)菌運(yùn)載體含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)和來(lái)自上文所列的需要的其他成分。在用于配制無(wú)菌注射溶液的無(wú)菌粉末的情況下，優(yōu)選的配制方法是真空干燥和冷凍干燥，其從先前經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾的溶液中得到活性成分加上任何額外所需成分的粉末?？衫缤ㄟ^(guò)使用涂層如卵磷脂，通過(guò)維持所需的顆粒尺寸(在分散劑的情況下)和通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持溶液的適當(dāng)流動(dòng)性?？勺⑸浣M合物的延長(zhǎng)吸收可通過(guò)在組合物中包括延遲吸收的劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的抗體或抗體部分可通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法施用，盡管對(duì)于許多治療應(yīng)用而言，優(yōu)選的施用途徑/方式是皮下、肌內(nèi)或靜脈輸注。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，施用途徑和/或方式會(huì)取決于所需結(jié)果而變化。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體組合物可以用下述載體制備，所述載體會(huì)保護(hù)抗體免于快速釋放，例如受控釋放成分，包括埋植劑、透皮貼劑和微囊包埋遞送體系?？墒褂蒙锟山到獾?、生物相容的多聚體，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚正酯和聚乳酸。用于制備這類(lèi)配方的許多方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員普遍已知的。參閱例如SustainedandControlledReleaseDrugDeliverySystems,J,R.Robinson,ed.,MarcelDekker,Inc.，NewYork,1978，其通過(guò)引用并入本文。額外的活性化合物也可被整合進(jìn)組合物中。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的異質(zhì)性P-鈣黏著蛋白抗體與一種或多種額外的治療劑共同配制和/或共同施用。這些劑包括但不限于結(jié)合其他靶標(biāo)的抗體、抗腫瘤劑、抗血管生成劑、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑、抗增殖劑、化學(xué)治療劑或抑制P-鈣黏著蛋白的肽類(lèi)似物。這類(lèi)組合治療可需要低劑量的抑制性P-鈣黏著蛋白以及共同施用的劑，從而避免伴隨著多種單一治療的可能的毒性或并發(fā)癥。本發(fā)明的組合物可包括"治療上有效量"或"預(yù)防上有效量"的本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合部分。"治療上有效量"是指按劑量或?qū)Ρ匦璧臅r(shí)間段而言，有效達(dá)到所需治療結(jié)果的量?？贵w或抗原結(jié)合部分的治療上有效量可根據(jù)例如疾病階段、年齡、性別和個(gè)體體重的因子以及抗體或抗體部分在個(gè)體中因其所需應(yīng)答的能力而變化。治療上有效量也是下述量，其中治療上有益的效應(yīng)勝過(guò)抗體或抗原結(jié)合部分的任何有毒效應(yīng)或有害效應(yīng)。"預(yù)防上有效量"是指按劑量或?qū)Ρ匦璧臅r(shí)間段而言，有效達(dá)到所需預(yù)防結(jié)果的量。典型地，因?yàn)轭A(yù)防劑量被用于患疾病之前的或處于疾病早期階段的受試者中，所以預(yù)防上有效量可少于治療上有效量?？烧{(diào)節(jié)給藥方案以提供最佳的期望應(yīng)答(例如治療的或預(yù)防的應(yīng)答)。例如，可以施用單次大丸劑(bolus)，可以隨時(shí)間進(jìn)展施用若干被分開(kāi)的劑量或所述劑量可根據(jù)治療情況所要求的按比例降低或提高。特別有利的是以單位劑型配制腸胃外組合物，以簡(jiǎn)化施用和劑量均一性。本文使用單位劑型是指物理上分離的單位，其適合作為單一劑量用于被治療的哺乳動(dòng)物受試者；每個(gè)單位含有與所需藥物載體結(jié)合的、經(jīng)計(jì)算以產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定數(shù)量的活性成分。本發(fā)明單位劑型的規(guī)格由以下規(guī)定并直接取決于(a)P-鈣黏著蛋白抗體或其部分的獨(dú)特特性和所要達(dá)到的具體治療或預(yù)防效應(yīng)；和(b)調(diào)劑領(lǐng)域中這類(lèi)抗體用于治療個(gè)體中敏感性的固有限制。本發(fā)明抗體或抗體部分的治療上或預(yù)防上有效量的示范性的、非限制的范圍是0.025到50mg/kg，更優(yōu)選地0.1到50mg/kg，更優(yōu)選地0.1-25、0.1到10或0.1到3mg/kg。在一些實(shí)施方案中，配方在20mM檸檬酸鈉(pH5.5)、140mMNaCl和0.2mg/mL聚山梨酯80的緩沖液中含有5mg/mL的抗體。應(yīng)當(dāng)注意劑量值可隨著待減輕的病癥類(lèi)型和嚴(yán)重性而變化。還應(yīng)當(dāng)理解對(duì)任何具體的受試者，應(yīng)當(dāng)根據(jù)個(gè)體需要和施用組合物或管理組合物施用的人的專(zhuān)業(yè)判斷，隨著時(shí)間調(diào)整特定的給藥方案，本文公開(kāi)的劑量范圍僅是示范性的，并不旨在限制所要求的組合物的范圍或?qū)嵺`。本發(fā)明的另一方面提供包含本發(fā)明P-鈣黏著蛋白抗體或抗原結(jié)合部分的試劑盒，或包含這類(lèi)抗體或部分的組合物。除抗體或組合物外，試劑盒可包括診斷劑或治療劑。試劑盒可包括針對(duì)診斷方法或治療方法使用的說(shuō)明書(shū)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包括抗體或包含抗體的組合物，以及可用于下述方法中的診斷劑。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒包括抗體或包含抗體的組合物，以及可用于下述方法中的一種或多種治療劑。使用的診斷方法P-鈣黏著蛋白或其抗體結(jié)合部分可用于診斷方法以檢測(cè)體外或體內(nèi)生物樣品中的P-鈣黏著蛋白。例如，P-鈣黏著蛋白可用于常規(guī)免疫測(cè)定法，包括但不限于ELISA、RIA、流式細(xì)胞儀、組織免疫組織化學(xué)、Western印跡或免疫沉淀。本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白可用于檢測(cè)來(lái)自人的P-鈣黏著蛋白。P-鈣黏著蛋白也可用于檢測(cè)來(lái)自小鼠、大鼠和短尾猴的P-鈣黏著蛋白。本發(fā)明提供用于檢測(cè)生物樣品中P-鈣黏著蛋白的方法，包含將生物樣品與本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白接觸并檢測(cè)結(jié)合的抗休。在一個(gè)實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體用可檢測(cè)的標(biāo)簽直接標(biāo)記。在另一實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體(第一抗體)未被標(biāo)記，能夠結(jié)合P-鈣黏著蛋白抗體的第二抗體或其他分子被標(biāo)記。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的，選擇能夠與具體種類(lèi)和類(lèi)別的第一抗體特異結(jié)合的第二抗體。例如，如果P-鈣黏著蛋白抗體是人IgG，則第二抗體可以是抗-人-IgG。能夠結(jié)合抗體的其他分子包括但不限于A蛋白和G蛋白，其均可從例如PierceChemicalCo.商業(yè)獲得。用于抗體或二級(jí)抗體的合適標(biāo)簽先前已討論，其包括多種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料和放射性材料。合適的酶的實(shí)例包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、3-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基絡(luò)合物實(shí)例包括鏈霉親和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合適的熒光材料實(shí)例包括傘形酮、熒光黃、異硫氰酸熒光素、羅丹明、dichlorotriazinylamine熒光黃、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實(shí)例包括魯米諾；合適的放射性材料的實(shí)例包括1251、1311、35S或3h。在其他實(shí)施方案中，可使用經(jīng)可檢測(cè)物質(zhì)標(biāo)記的P-鈣黏著蛋白標(biāo)準(zhǔn)和未標(biāo)記的P-鈣黏著蛋白抗體，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)免疫測(cè)定法在生物樣品中測(cè)定P-鈣黏著蛋白。在該測(cè)定法中，將生物樣品、經(jīng)標(biāo)記的P-鈣黏著蛋白標(biāo)準(zhǔn)和P-鈣黏著蛋白抗體組合，并測(cè)定與未標(biāo)記抗體結(jié)合的經(jīng)標(biāo)記的P-鈣黏著蛋白標(biāo)準(zhǔn)的量。生物樣品中P-鈣黏著蛋白的量和結(jié)合了P-鈣黏著蛋白抗體的經(jīng)標(biāo)記的P-鈣黏著蛋白標(biāo)準(zhǔn)的量成反比。上述免疫測(cè)定法可被用于大量目的。例如，P-鈣黏著蛋白抗體可被用于在經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞中檢測(cè)P-鈣黏著蛋白。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，P-l丐黏著蛋白抗體被用于檢測(cè)細(xì)胞產(chǎn)生的P-鈣黏著蛋白的量，所述細(xì)胞已用多種化合物處理。該方法可用于鑒定調(diào)節(jié)P-鈣黏著蛋白水平的化合物。根據(jù)該方法，用一種測(cè)試化合物處理一種細(xì)胞一段時(shí)間，同時(shí)另一樣品不被處理。如果要測(cè)量總P-鈣黏著蛋白水平，則將細(xì)胞裂解并使用上述免疫測(cè)定法之一測(cè)量總P-鈣黏著蛋白水平。比較處理細(xì)胞與未處理細(xì)胞相對(duì)的總P-鈣黏著蛋白水平以測(cè)定測(cè)試化合物的效應(yīng)。用于測(cè)量總P-鈣黏著蛋白水平的優(yōu)選免疫測(cè)定法是流式細(xì)胞儀或免疫組織化學(xué)。例如ELISA、RIA、流式細(xì)胞儀、Western印跡、免疫組織化學(xué)、細(xì)胞表面標(biāo)記膜內(nèi)在蛋白質(zhì)和免疫沉淀為本領(lǐng)域公知。參閱例如HarlowandLane，上文。另外，免疫測(cè)定法可以提高為高通量篩選，從而檢測(cè)大量化合物的活性或?qū)-鈣黏著蛋白的抑制。本發(fā)明的P-鈣黏著蛋白抗體也可用于檢測(cè)組織中或來(lái)自該組織的細(xì)胞中P-鈣黏著蛋白水平。在一些實(shí)施方案中，該組織是患病組織。在該方法的一些實(shí)施方案中，組織或其組織活檢從患者切離。然后將組織或組織活檢用于免疫測(cè)定法，以通過(guò)上文所述方法測(cè)定例如總P-鈣黏著蛋白水平或定位P-鈣黏著蛋白。本發(fā)明的抗體還可體內(nèi)用于鑒定表達(dá)P-鈣黏著蛋白的組織和器官。使用本發(fā)明的人P-鈣黏著蛋白抗體的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于與非人來(lái)源的抗體或人源化抗體或嵌合抗體不同，它們可被安全地體內(nèi)使用而不因?yàn)槭┯靡饘?duì)抗體的顯著免疫應(yīng)答。該方法包含步驟向需要這類(lèi)診斷測(cè)試的患者施用經(jīng)可檢測(cè)地標(biāo)記的P-鈣黏著蛋白抗體或包含它們的組合物，對(duì)患者進(jìn)行圖像分析以確定表達(dá)P-鈣黏著蛋白的組織定位。圖像分析為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所公知，包括但不限于X射線(xiàn)分析、磁共振成像(MRI)或計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(CT)。抗體可用適用于體內(nèi)成像的任何劑標(biāo)記，例如造影劑如鋇(其可被用于X射線(xiàn)分析)，或磁造影劑如釓螯合物(其可用于MRI或CT)。其他標(biāo)記劑包括但不限于放射性同位素，例如"Tc。在另一實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體可以是未標(biāo)記的，并可通過(guò)施用可檢測(cè)并能結(jié)合P-鈣黏著蛋白抗體的第二抗體或其它分子而被成像。在一個(gè)實(shí)施方案中，從患者獲得組織活檢以確定目的組織是否表達(dá)P-鈣黏著蛋白。使用的治療方法在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)向需要的患者施用P-鈣黏著蛋白抗體而用于抑制P-鈣黏著蛋白活性的方法。本文所述任何抗體或其抗原結(jié)合部分可治療性地使用。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體是人抗體、嵌合抗體或人源化的抗體。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白是人的，患者是人患者。或者，患者可以是表達(dá)與所述P-鈣黏著蛋白抗體交叉反應(yīng)的P-鈣黏著蛋白的哺乳動(dòng)物?？梢韵虮磉_(dá)(與所述抗體交叉反應(yīng)的)P-鈣黏著蛋白的非人哺乳動(dòng)物(例如大鼠、小鼠或短尾猴)施用抗體，用于獸醫(yī)的目的或用作人疾病的動(dòng)物模型。這類(lèi)動(dòng)物模型可適用于評(píng)價(jià)本發(fā)明抗體的治療效力。在另一實(shí)施方案中，P-鈣黏著蛋白抗體或其抗體部分可被施用給表達(dá)異常高水平P-鈣黏著蛋白的患者。該抗體可被施用一次，但更優(yōu)選被施用多次。抗體可被施用為一天三次到每六個(gè)月或更久一次。施用可以按照如下的日程表一天三次、一天兩次、一天一次、兩天一次、三天一次、一周一次、兩周一次、一個(gè)月一次、兩個(gè)月一次、三個(gè)月一次和六個(gè)月一次。抗體還可通過(guò)微泵被連續(xù)地施用?？贵w可以通過(guò)粘膜、頰、鼻內(nèi)、吸入、靜脈、皮下、肌內(nèi)、腸胃外或瘤內(nèi)途徑被施用?？贵w可被施用一次、至少兩次或至少施用一段之間直到病癥被治療、減輕或治愈。一般地，只要病癥存在，抗體就被施用。一般地，抗體會(huì)作為上文所述藥物組合物的一部分被施用。一般地，抗體劑量會(huì)在0.1到100mg/kg，更優(yōu)選地0.5到50mg/kg，更優(yōu)選地1到20mg/kg和進(jìn)一步更優(yōu)選地1到10mg/kg的范圍內(nèi)。血清抗體濃度可通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法測(cè)量。本發(fā)明還涉及用于治療哺乳動(dòng)物(包括人)中異常細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，包含向所述哺乳動(dòng)物施用治療上有效量的P-鈣黏著蛋白或其抗原結(jié)合部分，如上所述，其有效治療異常細(xì)胞生長(zhǎng)。在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，異常細(xì)胞生長(zhǎng)是癌癥，包括但不限于間皮瘤、肝膽管(肝和膽管)的癌癥、原發(fā)性或繼發(fā)性的CNS腫瘤、原發(fā)性或繼發(fā)性的腦腫瘤、肺癌(NSCLC和SCLC)、骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭與頸癌、表皮或眼內(nèi)黑色素瘤、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、腸胃(胃的、結(jié)腸直腸的和十二指腸的)的癌癥、乳腺癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、陰道癌、陰門(mén)癌、Hodgkin's疾病、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、前列腺癌、睪丸癌、慢性或急性白血病、慢性髓細(xì)胞樣白血病、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)新生物、原發(fā)性CNS淋巴瘤、非hodgkins，s淋巴瘤、脊髓性樞椎腫瘤(spinalaxistumors)、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、單囊癌、多發(fā)性骨髓瘤、膽管癌、纖維肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，或一種或多種上述癌癥的組合。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥選自肺癌(NSCLC禾BSCLC)、頭與頸癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛區(qū)癌、胃癌、乳腺癌、腎或輸尿管癌、腎細(xì)胞癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)新生物、原發(fā)性CNS淋巴瘤、非hodgkins，s淋巴瘤、脊髓樞椎腫瘤或一種或多種上述癌癥的組合。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，癌癥選自肺癌(NSCLC和SCLC)、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛區(qū)癌或一種或多種上述癌癥的組合。在所述方法的另一實(shí)施方案中，所述異常細(xì)胞生長(zhǎng)是良性的增生疾病，包括但不限于銀屑病、良性前列腺肥大或組織增生(restinosis)。本發(fā)明還涉及用于治療哺乳動(dòng)物中異常細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包含向所述哺乳動(dòng)物施用一定量的P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分(如本文所述，所述量有效治療異常細(xì)胞生長(zhǎng))以及選自以下的抗腫瘤劑核分裂抑制劑、烷化劑、抗代謝物、嵌入抗生素、生長(zhǎng)因子抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑、酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、生物應(yīng)答修飾劑、抗體、細(xì)胞毒素、抗激素和抗雄激素。本發(fā)明還涉及用于治療哺乳動(dòng)物(包括人)中異常細(xì)胞生長(zhǎng)的藥物組合物，其包含一定量(如本文所述，所述量有效治療異常細(xì)胞生長(zhǎng))的P-鈣黏著蛋白或其抗原結(jié)合部分與藥物可接受載體和選自以下的抗腫瘤劑核分裂抑制劑、烷化劑、抗代謝物、嵌入抗生素、生長(zhǎng)因子抑制劑、細(xì)胞周期抑制劑、酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、生物應(yīng)答修飾劑、抗激素和抗雄激素。本發(fā)明還涉及用于治療哺乳動(dòng)物中高增生性疾病的方法，其包含向所述哺乳動(dòng)物施用治療上有效量的P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分(如本文所述)以及選自以下的抗腫瘤劑抗增殖劑、激酶抑制劑、血管生成抑制劑、生長(zhǎng)因子抑制劑、COX-I抑制劑、COX-II抑制劑、核分裂抑制劑、垸化劑、抗代謝物、嵌入抗生素、生長(zhǎng)因子抑制劑、輻射、細(xì)胞周期抑制劑、酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑、生物應(yīng)答修飾劑、抗體、細(xì)胞毒素、抗激素、statins和抗雄激素。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，與本文所述P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分和藥物組合物組合使用的抗腫瘤劑是抗血管生成劑、激酶抑制劑、pan激酶抑制劑或生長(zhǎng)因子抑制劑。優(yōu)選的pan激酶抑制劑包括U.S.專(zhuān)利No.6,573,293(Pfizer，Inc，NY,USA)中描述的SU-11248。抗血管生成劑，包括但不限于以下劑，例如EGF抑制劑、EGFR抑制劑、VEGF抑制劑、VEGFR抑制劑、TIE2抑制劑、IGFIR抑制劑、COX-II(環(huán)氧合酶II)抑制劑、MMP-2(基質(zhì)-金屬蛋白酶2)抑制劑和MMP-9(基質(zhì)-金屬蛋白酶9)抑制劑。優(yōu)選的VEGF抑制劑包括例如Avastin(貝4戈單抗bevacizumab)禾卩Genentech,Inc.ofSouthSanFrancisco,California的抗VEGF單克隆抗體。其它的VEGF抑制劑包括CP-547,632(PfizerInc.,NY,USA)、AG13736(PfizerInc.)、ZD-6474(AstraZeneca)、AEE788(Novartis)、AZD-2171)、VEGFTrap(Regeneron，/Aventis)、Vatalanib(也稱(chēng)為PTK-787、ZK隱222584:Novartis&ScheringAG)、Macugen(pegaptaniboctasodium,NX-1838,EYE-001,PfizerInc./Gilead/Eyetech)、IM862(CytranInc.ofKirkland，Washington,USA);禾口angiozyme~—來(lái)自Ribozyme(Boulder,Colorado)和Chiron(Emeryville,Califomia)的合成性合酶，及其組合。在本發(fā)明實(shí)踐中有用的VEGF抑制劑公開(kāi)于US專(zhuān)利No.6,534,524禾n6，235，764中，所述資料的整體內(nèi)容均并入本文用于所有目的。具體優(yōu)選的VEGF抑制劑包括CP-547,632、AG13736、Vatalanib、Macugen及其組合。其它的VEGF抑制劑描述于例如WO99/24440(1999年五月20日公開(kāi))、PCT國(guó)際申請(qǐng)PCT/IB99/00797(1999年五月3日提交)、WO95/21613(1995年八月17日公開(kāi))、WO99/61422(1999年十二月2日公開(kāi))、美國(guó)專(zhuān)利6,534,524(公開(kāi)AG13736)、美國(guó)專(zhuān)利5,834,504(1998年H^—月10日出版)、WO98/50356(1998年i-一月12日公開(kāi))、美國(guó)專(zhuān)利5,883,113(1999年三月16日出版)、美國(guó)專(zhuān)利5,886,020(1999年三月23日出版)、美國(guó)專(zhuān)利5,792,783(1998年八月11日出版)、U.S.專(zhuān)利No.US6,653,308(2003年H^—月25日出版)、WO99/10349(1999年三月4日公開(kāi))、WO97/32856(1997年十二月12日公開(kāi))、WO97/22596(1997年六月26日公開(kāi))、WO98/54093(1998年十二月3日公開(kāi))、WO98/02438(1998年一月22日公開(kāi))、WO99/16755(1999年四月8日公開(kāi))和WO98/02437(1998年一月22日公開(kāi))，其整體內(nèi)容均通過(guò)引用并入本文?？梢耘c本發(fā)明抗體或其抗原結(jié)合部分使用的其它抗增殖劑包括法呢基蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移酶的酶抑制劑和受體酪氨酸激酶PDGFr的抑制劑，包括以下美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)中所公開(kāi)并要求的化合物09/221946(1998年十二月28日提交)；09/454058(1999年十二月2日提交)；09/501163(2000年二月9日提交)；09/539930(2000年三月31日提交)；09/202796(1997年五月22日提交);09/384339(1999年八月26日提交)和09/383755(1999年八月26日提交)；和以下的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)中公開(kāi)并要求的化合物60/168207(1999年^^一月30日提交);60/170119(1999年十二月10日提交)；60/177718(2000年一月21日提交)；60/168217(1999年H"^—月30日提交)和60/200834(2000年五月1日提交)。每個(gè)上述專(zhuān)利申請(qǐng)和臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)的整體內(nèi)容被引入本文。PDGRr抑制劑包括但不限于公開(kāi)于以下的那些2001年七月7日公開(kāi)的WO01/40217和2004年三月11日公開(kāi)的WO2004/020431，就一切目的而言其內(nèi)容整體并入本文。優(yōu)選的PDGFr抑制劑包括Pfizer'sCP-673，451和CP-868,596及其可藥用鹽。優(yōu)選的GARF抑制劑包括Pfizer'sAG-2037(pelitrexol及其可藥用鹽)。適用于本發(fā)明實(shí)踐的GARF抑制劑公開(kāi)于U.S.專(zhuān)利No.5,608,082，就一切目的而言其被整體引入。可與本文所述P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分和本文所述藥物組合物組合使用的、有用的COX-II抑制劑的實(shí)例包括CELEBREX(塞來(lái)考昔)、帕瑞考昔、地拉考昔、ABT-963、MK-663(艾托考昔)、COX-189(L畫(huà)iracoxib)、BMS347070、RS57067、NS陽(yáng)398、Bextra(伐地考昔)、paracoxib、Vioxx(羅非考昔)、SD-8381、4-甲基-2-(3，4-二甲基苯基)-1-(4-氨磺?；?苯基)-1H-口比咯、2-(4-乙氧苯基)-4-甲基-1-(4-氨磺?；交?-lH-吡咯、T-614、JTE-522、S-2474、SVT-2016、CT-3、SC-58125和Arcoxia(艾托考昔)。另夕卜，COX-II抑制劑公開(kāi)于U.S.專(zhuān)利申請(qǐng)Nos.10/801,446和10/801,429，就一切目的而言其內(nèi)容被整體并入。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是如U.S.專(zhuān)利No.5,466,823中公開(kāi)的塞來(lái)考昔，就一切目的而言其內(nèi)容通過(guò)引用被整體并入。塞來(lái)考昔的結(jié)構(gòu)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage63</formula>在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是如U.S.專(zhuān)利No.5,633,272中所公開(kāi)的法利考昔(valecoxib)，就一切目的而言其內(nèi)容通過(guò)引用被整體并入。法利考昔的結(jié)構(gòu)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是如U.S.專(zhuān)利No.5，932,598中,公開(kāi)的帕瑞考昔，就一切目的而言其內(nèi)容通過(guò)引用被整體并入。帕瑞考二的結(jié)構(gòu)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>parecoxibCASNo.198470-84-5,932,598C-2931在-'昔-個(gè)實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是如U.S.專(zhuān)利No.5,521,207所述的地拉:一切目的而言其內(nèi)容通過(guò)引用被整體并入。地拉考昔的結(jié)構(gòu)如下所:CHF.deracoxibCASNo.169590-5,521,207C-2779在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是如U.S.專(zhuān)利No.6,034,256中公開(kāi)的SD-8381,就一切目的而言其內(nèi)容通過(guò)引用被整體并入。SD-8381的結(jié)構(gòu)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage64</formula>在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO2002/24719中公開(kāi)的ABT-963，就一切目的而言其內(nèi)容通過(guò)引用被整體并入。ABT-963的結(jié)構(gòu)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>在優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是如下所示的羅非考昔:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO1998/03484中所公開(kāi)的MK-663(艾托考昔)，就一切目的而言其內(nèi)容通過(guò)引用被整體并入。艾托考昔的結(jié)構(gòu)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是如國(guó)際公開(kāi)號(hào)WO1999/11605中所述的COX-189(Lumiracoxib)，就一切目的而言其內(nèi)容通過(guò)引用被整體并入。Lumiracoxib的結(jié)構(gòu)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage65</formula>在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是如美國(guó)專(zhuān)利No.6,180,651中所公開(kāi)的BMS-347070，就一切目的而言其內(nèi)容通過(guò)引用被整體并入。BMS-347070的結(jié)構(gòu)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是NS-398(CAS123653-11-2)。NS-398(CAS123653-1l-2)的結(jié)構(gòu)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是RS57067(CAS17932-91-3)。RS57067(CAS17932-91-3)的結(jié)構(gòu)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是4-甲基-2-(3,4-二甲基苯基)-1-(4-氨磺?；?苯基)-lH-吡咯。4-甲基-2-(3,4-二甲基苯基)-l-(4-氨磺?；?苯基)-lH-吡咯的結(jié)構(gòu)如下所示<formula>formulaseeoriginaldocumentpage66</formula>在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是2-(4-乙氧苯基)-4-甲基-l-(4-氨磺?；交?-lH-吡咯。2-(4-乙氧苯基)-4-甲基-l-(4-氨磺?；交?-lH-吡咯的結(jié)構(gòu)如下所示在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，抗腫瘤劑是美洛昔康(mdoxicam)。美洛昔康的結(jié)構(gòu)如下所示與本發(fā)明抗體和本文所述的藥物組合物一起用作抗腫瘤劑的其它有用抑制劑包括阿司匹林和非載體抗炎藥(NSAID)，它們抑制制造前列腺素的酶(環(huán)氧合酶I和II)，導(dǎo)致更低的前列腺素水平，其包括但不限于以下的雙水楊酸酯(Salsalate)(Amigesic)、氟苯水楊酸(Diflunisal)(Dolobid)、布洛芬(Ibuprofen)(Motrin)、酮洛芬(Ket叩rofen)(Orudis)、萘丁美酮(Nabumetone)(Relafen)、皮洛西康(Piroxicam)(Feldene)、萘普生(Naproxen)(Aleve，Naprosyn)、雙氯芬酸(Diclofenac)(Voltaren)、卩引口朵美辛(Indomethacin)(Indocin)、舒林酸(Sulindac)(Clinoril)、痛滅定(Tolmetin)(Tolectin)、依托度酸(Etodolac)(Lodine)、酮咯酸(Ketorolac)(Tomdol)、惡丙嗪(Oxaprozin)(Daypro)及其組合。優(yōu)選的COX-I抑制劑包括布洛芬(Motrin)、磺胺二甲噁唑、萘普生(Aleve)、吲哚美辛(Indocin)、萘丁美酮(Relafen)及其組合。與本文所述P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分以及本文所述藥物組合物組合使用的定向劑包括EGFr抑制劑，例如易瑞沙(Iressa)(吉非替尼(gefitinib)、阿斯利康(AstraZeneca))、得舒緩(Tarceva)(埃羅替尼(erlotinib)或OSI-774,OSIPharmaceuticalsInc.)、而必得舒(Erbitux)(西妥昔單抗，ImclonePharmaceuticals,Inc.)、EMD-7200(MerckAG)、ABX隱EGF(AmgenInc.禾口AbgenixInc.)、HR3(CubanGovernment)、IgA抗體(UniversityofErlangen-Nuremberg)、TP-38(IVAX)、EGFR融合蛋白、EGF-疫苗、抗-EGFr免疫脂質(zhì)體(HermesBiosciencesInc.)及其組合。優(yōu)選的EGFr抑制劑包括易瑞沙、而必得舒、得舒緩及其組合。本發(fā)明還涉及選自panerb受體抑制劑或ErbB2受體抑制劑的抗腫瘤劑，例如CP-724,714(Pfizer,Inc.)、CI-1033(坎呢替尼(canertinib),Pfizer,Inc.)、賀癌平(Herceptin)(曲妥單抗，GenentechInc.)、奧米他(Omitarg)(2C4，派特資哌(pertuzumab),GenentechInc.)、TAK-165(Takeda)、GW-572016(龍呢法尼(lonafarnib),GlaxoSmkhKline)、GW-282974(GlaxoSmithKline)、EKB-569(Wyeth)、PKI-166(Novartis)、dHER2(HER2Vaccine,CorixaandGlaxoSmithKline)、APC8024(HER2Vaccine,Dendreon)、抗HER2/神經(jīng)鞘雙特異性抗體(DecofCancerCenter)、B7.her2.IgG3(Agensys)、ASHER2(ResearchInstituteforRadBiology&Medicine)、三功能雙特異性抗體(UniversityofMunich)禾BmABAR-209(AronexPharmaceuticalsInc)和mAB2B-1(Chiron)及其組合。優(yōu)選的erb選擇性抗腫瘤劑包括Herceptin、TAK-165、CP-724,714、ABX-EGF、HER3及其組合。優(yōu)選的panerbb受體抑制劑包括GW572016、CI-1033、EKB-569和奧米他及其組合。其它的erbB2抑制劑包括描述于以下的那些WO98/02434(1998年一月22日公開(kāi))、WO99/35146(1999年七月15日公開(kāi))、WO99/35132(1999年七月15日公開(kāi))、WO98/02437(1998年一月22日公開(kāi))、WO97/13760(1997年四月17日公開(kāi))、WO95/19970(1995年七月27日公開(kāi))、美國(guó)專(zhuān)利5,587,458(1996年十二月24日出版)和美國(guó)專(zhuān)利5，877,305(1999年三月2日出版)，每個(gè)資料通過(guò)引用被整體并入本文。適用于本發(fā)明的ErbB2受體抑制劑也描述于美國(guó)專(zhuān)利Nos.6,465,449和6,284,764和國(guó)際申請(qǐng)No.WO2001/98277中，每個(gè)資料通過(guò)引用被整體并入本文。另外，其它的抗腫瘤劑可選自以下劑BAY-43-9006(OnyxPharmaceuticalsInc.)、根纟內(nèi)三思(Genasense)(奧格莫森(augmerosen),Genta)、盤(pán)尼圖姆(Panitumumab)(Abgenix/Amgen)、澤娃靈(Zevalin)(Schering)、托西莫(Bexxar)(Corixa/GlaxoSmithKline)、阿巴瑞克(Abarelix)、力比泰(Alimta)、EPO906(Novartis)、迪斯德莫來(lái)(discodermolide)(XAA-296)、ABT-510(Abbott)、癌立消(Neovastat)(Aetema)、恩澤特林(enzastaurin)(EliLilly)、風(fēng)車(chē)子阻生素(Combrestatin)A4P(Oxigene)、ZD-6126(AstraZeneca)、氟拉皮雷多(flavopiridol)(Aventis)、CYC-202(Cyclacel)、AVE-8062(Aventis)、DMXAA(Roche/Antisoma)、諾拉曲特(Thymitaq)(Eximias)、石肖卡芥(Temodar)(替莫唑胺，ScheringPlough)和雷維里德(Revilimd)(Celegene)及其組合。其它抗腫瘤劑可選自以下劑西皮特(CyPat)(醋酸環(huán)丙孕酮)、組胺瑞林(Histerelin，醋酸組氨瑞林)、皮雷恩思(Plenaixis)(abarelixdepot)、阿曲生坦(Atrasentan)(ABT-627)、薩特鉑(Satraplatin)(JM-216)、沙利度胺(thalomid)、塞拉特(Theratope)、替米利芬(Temilifene)(DPPE)、ABI-007(紫杉醇)、易維特(Evista)(雷洛昔芬)、阿他美坦(Atamestane)(Biomed-777)、聚殼氨酸紫杉醇(Xyotax，polyglutamatepaclitaxel)、他格停(Targetin)(bexarotine)及其組合。另外，其它抗腫瘤劑可選自以下劑特塞酮(Trizaone)(替拉扎明)、依昔舒林(Aposyn，exisulind)、萘瓦特(Nevastat)(AE-941)、色譜林(Ceplene)(二鹽酸組胺)、盧比替康(Orathecin，rubitecan)、維如利金(Virulizin)、胰腺癌疫苗(Gastrimmune)(G17DT)、DX-8951f(依喜替康甲磺酸鹽(exatecanmesylate))、Onconase(豹蛙酶)、BEC2(米妥莫單抗)、莫特沙芬軋(Xcytrin，motexafmgadolinium)及其組合。其它的抗腫瘤劑可選自以下劑昔瓦(CeaVac)(CEA)、新特瑞辛(NeuTrexin)(三切葡糖醛酸酯(trimetresateglucuronate))及其組合。額外的抗腫瘤劑可選自以下劑奧雷瑞(OvaRex)(oregovomab)、奧昔地(Osidem)(IDM-1)及其組合。額外的抗腫瘤劑可選自以下劑阿德維辛(Advexin)(ING201)、替拉茲明(Tirazone)(tirapazamine)及其組合。額外的抗腫瘤劑可以選自以下劑RSR13(乙丙昔羅(efaproxiral))、克他拉(Cotara)(1311chTNTl/b)、NBI-3001(IL-4)及其組合。額外的抗腫瘤劑可選自以下劑Canvaxin、GMK疫苗、PEGInteronA、泰克派新(Taxoprexin)(DHA/派昔泰克(paciltaxel))及其組合。其它優(yōu)選的抗腫瘤劑包括Pfizer的MEK1/2抑制劑PD325901、ArrayBiopharm的MEK抑制劑ARRY-142886、BristolMyers的CDK2抑制劑BMS-387,032、Pfizer的CDK抑制劑PD0332991和AstraZeneca的AXD-5438及其組合。額外地，mTOR抑制劑也可利用，例如CCI-779(Wyeth)和雷怕霉素衍生物RAD001(Novartis)和AP-23573(Ariad)、HDAC抑制齊USAHA(MerckInc./AtonPharmaceuticals)及其組合。額外的抗腫瘤劑包括aurora2抑制劑VX-680(Vertex)、Chkl/2抑制劑XL844(Exilixis)。以下的細(xì)胞毒素劑，例如選自表柔比星(Ellence)、多西紫杉醇(Taxotere)、紫杉醇、右雷佐生(Zinecard，dexrazoxane)、美羅華(Rituxan)、甲磺酸伊馬替尼(imatinibmesylate)(Gleevec)的-一種或多種及其組合可與本文所述的P-鈣黏著蛋白抗體或其抗原結(jié)合部分和本文所述的藥物組合物組合使用。本發(fā)明還關(guān)注本發(fā)明抗體及其抗原結(jié)合部分與激素療法一起的用途，所述激素療法包括但不限于依西美坦(Aromasin,PfizerInc.)、亮丙瑞林(Lupron或Leuplin，TAP/Abbott/Takeda)、阿那曲唑(Arimidex,Astrazeneca)、gosrelin(Zoladex,AstraZeneca)、度骨化醇、法倔唑、福美坦、檸檬酸他莫昔芬(他莫昔芬，Nolvadex,AstraZeneca)、康士得(Casodex)(AstraZeneca)、阿巴瑞克(Abarelix)(Praecis)、普托雷林(Trelstar)及其組合。本發(fā)明還涉及激素治療劑例如抗抗雌激素，包括但不限于氟維司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、拉索昔芬、來(lái)曲唑(Femara,Novartis);抗雄激素，例如比卡魯胺、氟他胺、米非司酮、尼魯米特、Casodex(4'-氰基-3-(4-氟苯基磺酰)-2-羥基-2-甲基-3'-(三氟甲基)丙酰苯胺，比卡魯胺)及其組合。另外，本發(fā)明提供單獨(dú)的或與一種或多種支持性醫(yī)護(hù)產(chǎn)品組合的本發(fā)明的抗體，所述支持性醫(yī)護(hù)產(chǎn)品例如選自沙格莫丁(Filgrastim)(Neupogen)、昂丹司瓊(Zofran)、法瑪西亞(Fragmin)、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素(Procrit)、阿樂(lè)喜(Aloxi)、止敏吐(Emend)的產(chǎn)品或其組合。具體地優(yōu)選的細(xì)胞毒素劑包括伊立替康(Camptosar)、而必得舒、易瑞沙、格列衛(wèi)(Gleevec)、泰素帝(Taxotere)及其組合。以下的拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑可以作為抗腫瘤劑使用喜樹(shù)堿、鹽酸伊立替康(irinotecanHC1，伊立替康(Camptosar))、艾替卡辛(edotecarin)、盧比替康(orathecin)(Supergen)、依沙替康(exatecan，Daiichi)、BN-80915(Roche)及其組合。具體地優(yōu)選的拓?fù)洚悩?gòu)酶II包括表柔比星(Ellence)。本發(fā)明的抗體可以與抗腫瘤劑、烷化劑、抗代謝物、抗生素、來(lái)自植物的抗腫瘤劑、喜樹(shù)堿衍生物、酪氨酸激酶抑制劑、其它抗體、干擾素和/或生物應(yīng)答修飾劑一起使用。烷化劑包括但不限于氮芥N-氧化物、環(huán)磷酰胺、異磷酰胺、美法侖、白消安、二溴甘露醇、卡波醌、塞替派、雷莫司汀、尼莫司汀、替莫唑胺、AMD-473、六甲蜜胺、AP-5280、阿帕茲酮(apaziquone)、布羅他辛(brostallicin)、苯達(dá)莫司汀、卡莫司汀、雌莫司汀、福莫司汀、葡磷酰胺、異磷酰胺、KW-2170、馬磷酰胺和二溴衛(wèi)矛醇；鉑配合的垸化化合物包括但不限于順鉑、必治妥(Paraplatin)(卡鉑)、依它鉑、洛鉑、奈達(dá)鉑、奧沙利鉑(Eloxatin，oxaliplatin，Sanofi)或塞特鉑(satrplatin)及其組合。具體地優(yōu)選的垸化劑包括奧沙利鉑(Eloxatin)?？勾x物包括但不限于甲氨喋呤、6-巰嘌呤苷、巰嘌呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)單獨(dú)或與亞葉酸(leucovorin)、替加氟、UFT、去氧氟尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷(cytarabine)、阿糖胞苷(cytarabineocfosfate)、依諾他濱、S-l，力比泰(Alimta，premetrexed二鈉，LY231514,MTA)、健澤(Gemzar)(吉西他濱，EliLilly)、氟達(dá)拉濱、5-阿扎胞苷、卡培他濱、克拉屈濱、氯法拉濱(clofarabine)、地西他濱、依氟鳥(niǎo)氨酸、乙炔基胞核(ethynylcytidine)、阿糖胞苷(cytosinearabinoside)、羥基脲、TS-1、美法侖、奈拉濱、諾拉曲塞、奧佛思特(ocfosfate)、力比泰(disodiumpremetrexed)、噴司他丁、派利特克(pelitrexol)、雷替曲塞、特阿平(triapine)、曲美沙特、阿糖腺苷、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春瑞濱組合；或例如優(yōu)選的抗代謝物之一公開(kāi)于歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)No.239362，例如N-(5-[N-(3，4-二氫-2-甲基-4-氧喹唑啉-6-基甲基)-N-甲氨基]-2-噻吩甲酰)-L-谷氨酸及其組合。抗生素包括嵌入抗生素但不限于阿柔比星(aclarubidn)、放線(xiàn)菌素D(actinomycinD)、安柔比星(amrubicin)、月旨質(zhì)體蒽環(huán)霉素(amiamycin)、阿霉素(adriamycin)、博來(lái)霉素(bleomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、依沙盧星(elsamitrucin)、表柔比星(epirubicin)、力口柔比星(galarubicin)、伊達(dá)比星(idarubicin)、絲裂霉素C、奈莫柔比星(nemorubicin)、新制癌菌素(neocarzinostatin)、培》各毒素(peplomycin)、卩比柔比星(pirarubicin)、蝴蝶霉素(rebeccamycin)、司丁拉米(stimalamer)、鏈佐星.(streptozocin)、〖戈柔比星(valrubicin)、7爭(zhēng)司亍也丁(zinostatin)及來(lái)自植物的抗腫瘤物質(zhì)包括例如選自核分裂抑制劑的物質(zhì)，例如長(zhǎng)春堿(vinblastine)、多西紫杉醇(Taxotere)、紫杉醇(paclitaxel)及其組合。細(xì)胞毒拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑包括一種或多種選自以下的劑阿拉柔比星(aclarubicn)、氨萘非特(amonafide)、白龍?zhí)婵?belotecan)、喜樹(shù)石咸(camptothecin)、10-竽圣基喜豐對(duì)石咸(10-hydroxycamptothecin)、9-氨基喜樹(shù)堿(9-aminocamptothecin)、達(dá)佛莫替康(diflomotecan)、鹽酸伊立替康(Camptosar)、edotecarin、表柔比星(Ellence)、表鬼臼毒吡喃葡糖苷(etoposide)、依沙替康(exatecan)、基哌替康(gimatecan)、勒托替康(lurtotecan)、米托蒽酉昆(mitoxantrone)、卩比柔比星(pirarubicin)、皮可特酮(pixantrone)、盧比替康(rubitecan)、索布佐生其組合。(sobuzoxane)、SN-38、泰魯潑昔(tafluposide)、托泊替康(topotecan)及其組合。優(yōu)選的細(xì)胞毒拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑包括選自以下的一種或多種劑喜樹(shù)堿、10-羥基喜樹(shù)堿、9-氨基喜樹(shù)堿、鹽酸伊立替康(Camptosar)、艾替卡辛(edotecarin)、表柔比星(Ellence)、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、SN-38、托泊替康及其組合。免疫劑包括干擾素和大量其它免疫增強(qiáng)劑。干擾素包括干擾素a、干擾素a-2a、干擾素a-2b、干擾素P、干擾素Y-la、干擾素y-lb(Actimmime)或干擾素Y-nl及其組合。其它劑包括非格司亭(filgrastim)、香范多糖(lentinan)、裂裥多糖(sizofilan)、TheraCys、烏苯美司(ubenimex)、WF-IO、阿地白介素(aldesleukin)、阿侖單抗(alemtuzumab)、BAM-002、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、達(dá)珠單抗(daclizumab)、地尼白介素(denileukin)、吉姆單抗(gemtuz腿ab)奧佐米星(ozogamicin)、伊莫單抗(ibritumomab)、咪喹莫特(imiquimod)、來(lái)格司亭(lenograstim)、香燕多糖(lentinan)、黑瘤疫苗(melanomavaccine)(Corixa)、莫拉司亭(molgramostim)、OncoVAX-CL、沙格司亭(sargramostim)、他索納明(tasonermin)、泰克白介素(tecleukin)、司卩屑拉辛(thymalasin)、托西莫單f亢(tositumomab)、維如利金(Virulizin)、Z-IOO、依帕珠單抗(epratuzumab)、米妥莫單抗(mi.tumomab)、奧雷瑞(oregovomab)、派圖莫(pemtumomab)(Y-muHMFGl)、普拉維格(Provenge)(Dendreon)及其組合。生物應(yīng)答修飾劑是修飾活體防御機(jī)制或生物應(yīng)答(例如存活、生長(zhǎng)或組織細(xì)胞分化)使得它們具有抗腫瘤活性的劑。這類(lèi)劑包括云芝多糖(krestin)、香燕多糖(lentinan)、西佐喃(sizofiran)、溶鏈菌(picibanil)、烏苯美司(ubenimex)及其組合。其它抗癌劑包括阿利維A酸(alitretinoin)、聚肌胞(ampligen)、阿曲生坦(atrasentan)貝沙羅汀(bexarotene)、硼替佐米(bortezomib)、伯森坦(Bosentan)、骨化三醇(calcitriol)、依昔舒林(exisulind)、非那雄胺(finasteride)、福莫司汀(fot飄stine)、伊班膦酸(ibandronicacid)、米替福新(miltefosine)、米托蒽醌(mitoxantrone)、1-門(mén)冬酰胺酶、丙卡巴阱(procarbazine)、達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)、羥基脲(hydroxycarbamide)、培門(mén)冬酉每(pegaspargase)、噴司他丁(pentostatin)、泰紫羅尼(tazarotne)、泰司特(Telcyta)(TLK-286,TelikInc.)、萬(wàn)5可(Velcade)(bortemazib，Millenium)、纟隹甲酸(tretinoin)及其組合。其它抗血管生成化合物包括阿西曲丁(acitretin)、芬維A胺(fenretinide)、沙禾ll度胺(thalidomide)、唑來(lái)月粦酸(zoledronicacid)、制管張素(angiostatin)、脫氫膜海鞘素B(aplidine)、昔冷特(cilengtide)、考布他汀A-4(combretastatinA-4)、內(nèi)皮抑制素(endostatin)、齒夫酉同(halofoginone)、雷必瑪特(rebimastat)、雷莫氟(removab)、來(lái)那度胺(Revlimid)、角鯊胺(squalamine)、烏克蘭(ukrain)、單抗LM609(Vitaxin)及其組合。與鉬配合的化合物包括但不限于順鉑、卡鉑、奈達(dá)鉑、奧沙利鉑及其組合。喜樹(shù)堿衍生物包括但不限于喜樹(shù)堿、10-羥基喜樹(shù)堿、9-氨基喜樹(shù)堿、伊立替康、SN-38、艾替卡辛(edotecarin)、托泊替康及其組合。其它抗腫瘤劑包括米托蒽醌、1-門(mén)冬酰胺酶、丙卡巴阱、達(dá)卡巴嗪、羥基脲、噴司他丁、維甲酸及其組合。能夠增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答的抗腫瘤劑如CTLA4(細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞抗原4)和能夠阻斷CTLA4的其它劑也可被利用，例如MDX-010(Medarex)和美國(guó)專(zhuān)利No.6,682,736中公幵的CTLA4化合物；和抗增殖劑如其它法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑，例如法呢基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑。另外，可用于本發(fā)明的特定CTLA4抗體包括描述于美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/113，647(1998年十二月23日提交)、美國(guó)專(zhuān)利No.6,682，736中的那些，所述兩個(gè)資料均通過(guò)引用整體并入本文。可用于本發(fā)明的特定IGF1R抗體包括描述于國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.WO2002/053596中的那些，其通過(guò)引用整體并入本文?？捎糜诒景l(fā)明的特定CD40抗體包括描述于國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)No.WO2003/040170中的那些，其通過(guò)引用整體并入本文?；蛑委焺┮部捎米骺鼓[瘤劑，例如TNFerade(GeneVec)，其響應(yīng)放射性治療而表達(dá)TNFa。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，他汀類(lèi)(statins)可與本文所述的P-鈣黏著蛋白抗體或其抗體結(jié)合部分及其藥物組合物組合使用。他汀類(lèi)(HMG-CoA還原酶抑制劑)可以選自阿托伐他汀(Atorvastatin，Lipitor,PfizerInc.)、普》去4也？丁(Pravastatin,Pravachol,Bristol-MyersSquibb)、？各"f戈f也丁(Lovastatin，Mevacor，MerckInc.)、辛j戈"f也丁(Simvastatin,Zocor，MerckInc.)、氟伐他汀(Fluvastatin，Lescol,Novartis)、薛利伐史達(dá)汀(Cerivastatin，Baycol,Bayer)、瑞舎予伐他汀(Rosuvastatin，Crestor,AstraZeneca)、洛伐他汀(Lovostatin)禾卩煙堿酸(Niacin,Advicor,KosPharmaceuticals)其衍生物或其組合。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，他汀類(lèi)選自阿托伐他汀和洛伐他汀、其衍生物或其組合。適用于抗腫瘤劑的其它劑包括苯磺酸氨氯地平/阿伐他汀鈣(Caduet)。就治療本文所述的高增生性疾病或異常細(xì)胞生長(zhǎng)的任何方法而言(所述方法使用P-鈣黏著蛋白抗體或抗原結(jié)合部分與至少-一種額外的治療劑的組合)，P-鈣黏著蛋白抗體可以與額外的治療劑綴合，或衍生化。所述至少一種額外的治療劑也可以單獨(dú)地施用，或以非衍生化的或非綴合的方式施用。當(dāng)所述至少一種額外的治療劑不是經(jīng)衍生化的或與抗體綴合，其可以在與抗體相同的藥物配方中施用，或其可以在單獨(dú)的配方中施用?；虔煼ň幋a本發(fā)明抗體和抗體部分的核酸分子可以通過(guò)基因療法施用給需要的患者。該療法可以是體內(nèi)的或離體的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼重鏈和輕鏈二者的核酸分子被施用給患者。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，核酸分子被施用，使得它們被穩(wěn)定的整合進(jìn)B細(xì)胞的染色體中，因?yàn)檫@些細(xì)胞是專(zhuān)門(mén)用于生產(chǎn)抗體的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染或離體感染前體B細(xì)胞，并再移植進(jìn)需要的患者中。在另一實(shí)施方案中，使用已知感染目的細(xì)胞類(lèi)型的病毒體內(nèi)感染前體B細(xì)胞或其它細(xì)胞。用于基因療法的典型載體包括脂質(zhì)體、質(zhì)粒和病毒載體。示范性的病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒。體內(nèi)或離體感染后，通過(guò)從被治療的患者中采樣并使用本領(lǐng)域已知的或本文所述的任何免疫測(cè)定法監(jiān)控抗體表達(dá)水平。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因治療方法包含步驟施用編碼P-鈣黏著蛋白抗體重鏈或其抗原結(jié)合部分的、經(jīng)分離的核酸分子，和表達(dá)所述核酸分子。在另一實(shí)施方案中，基因治療方法包含步驟施用編碼P-鈣黏著蛋白抗體輕鏈或其抗原結(jié)合部分的、經(jīng)分離的核酸分子，和表達(dá)所述核酸分子。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因治療方法包含步驟施用編碼P-鈣黏著蛋白抗體重鏈或其抗原結(jié)合部分的、經(jīng)分離的核酸分子和編碼P-鈣黏著蛋白抗體輕鏈或其抗原結(jié)合部分的、經(jīng)分離的核酸分子，和表達(dá)所述核酸分子?；蛑委煼椒ㄟ€可包含施用另一治療劑(例如先前所述的與組合療法相關(guān)的任何劑)的步驟。為了使本發(fā)明更好地被理解，公開(kāi)以下實(shí)施例。這些實(shí)施例僅用于闡述的目的而不應(yīng)理解為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例在以下的實(shí)施例和制劑中，"BSA"是指牛血清白蛋白；"EDTA"是指乙二胺四乙酸；"DMSO"是指二甲基亞砜；"MOPS"是指3-(N-嗎琳代)丙磺酸；"MES"是指2-(N-嗎啉代)甲磺酸；"PBS"是指磷酸鹽緩沖的鹽水；"dPBS"是指Dulbecco，s磷酸鹽緩沖的鹽水；"HEMA"是指2-羥基-乙基異丁烯酸；"DMEM"是指Dulbecco's改良的小鷹培養(yǎng)基(eagle'smedium);"FBS"是指胎牛血清；"NEAA"是指非必需的氨基酸；"HEPES"是指N-2-羥乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸；"DMF"是指二甲基甲酰胺。實(shí)施例1:篩選scFv噬菌體展示文庫(kù)重組的人P-鈣黏著蛋白(R&DSystems861-PC-100)被用作抗原以篩選scFv噬菌體展示文庫(kù)?？寺∵M(jìn)噬菌粒載體中的大scFv人抗體文庫(kù)被用于選擇(Vaughan，T丄etal.,Nat.Biotech.14:309-314(1996))。識(shí)別P4丐黏著蛋白的scFv在對(duì)重組人P-鈣黏著蛋白和表達(dá)P-鈣黏著蛋白的HCT116細(xì)胞融合單細(xì)胞層所采取的一系列重復(fù)選擇循環(huán)中從噬菌體展示文庫(kù)中被分離。簡(jiǎn)言之，與文庫(kù)孵育之后，從P-鈣黏著蛋白回收結(jié)合的噬菌體，未結(jié)合的噬菌體被洗掉。然后如Vaughan,T丄etal.,Nat.Biotech.14:309-314(1996)中所述復(fù)蘇結(jié)合的噬菌體，并重復(fù)選擇過(guò)程。來(lái)自選擇周期輸出的代表性比例的克隆進(jìn)行噬菌體酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)以檢測(cè)對(duì)P-鈣黏著蛋白的結(jié)合，基本上如Vaughan,T丄etal.，Nat.Biotech.14:309-314(1996)中所述。ELISA中使用兩個(gè)不同的抗原重組的人P-鈣黏著蛋白(R&DSystems)和表達(dá)P-鈣黏著蛋白的A431細(xì)胞的融合單細(xì)胞層。對(duì)ELISA-陽(yáng)性克隆進(jìn)行如Vaughan,TJ.etal.，Nat.Biotech.14:309-314(1996)和Osboum，J.K.etal.,Immunotechnology3:293-302(1998)中所述的DNA測(cè)序。獨(dú)特的ELISA-陽(yáng)性克隆被轉(zhuǎn)化為完整IgG分子并檢測(cè)它們?cè)趯?shí)施例4中描述的P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性粘附測(cè)定法中中和P-鈣黏著蛋白的能力。根據(jù)該篩選的結(jié)果，抗體129-lc4(在A431粘附測(cè)定法中IC50為1-3pM)被選擇為先導(dǎo)親本譜系用于進(jìn)一歩的優(yōu)化。實(shí)施例2:先導(dǎo)物優(yōu)化通過(guò)寡核苷酸指導(dǎo)誘變抗體可變重鏈(VH)和可變輕鏈(VJCD3區(qū)構(gòu)建來(lái)自129-lc4的噬菌體展示文庫(kù)。使用如ClacksonandLowman,PhageDisplay-APracticalApproach(OxfordUniversityPress2004)中所述的標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建該文庫(kù)。由此進(jìn)行基于親和力的選擇；與文庫(kù)孵育后，重組人P-鈣黏著蛋白(R&DSystems)被G蛋白包被的順磁珠(Dynal100.03)捕獲，結(jié)合的噬菌體通過(guò)磁分離被回收，同時(shí)未結(jié)合的復(fù)合物被洗掉。重復(fù)選擇過(guò)程，選擇時(shí)存在的重組人P-鈣黏著蛋白濃度遞減(4輪中25nM到10pM)。另外，來(lái)自VHCDR3和VLCDR3文庫(kù)的選擇輸出被重組進(jìn)另一噬菌體展示文庫(kù)，并在另外兩輪基于親和力的選擇中被選擇。來(lái)自選擇周期輸出的代表性比例的克隆進(jìn)行篩選，如實(shí)施例8中所述129-lc4表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中的scFv。實(shí)施例3:P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性的粘附測(cè)定法使用以下的方案在P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性的粘附測(cè)定法中使用若干個(gè)經(jīng)最佳化的scFv測(cè)定ICs。值，所述經(jīng)最佳化的scFv在如實(shí)施例2中上述的抗體回收最佳化階段中被轉(zhuǎn)化為IgG。這些抗體的平均測(cè)量ICs。值顯示在下表4中。使用前24小時(shí)時(shí)，用2mMCaCl2的MilliQ水溶液將重組人P-鈣黏著蛋白Fc(R&DCat.861-PC)重建為1mg/mL的濃度并儲(chǔ)存于4°C。如下培養(yǎng)并制備A431細(xì)胞。常規(guī)地，將A431細(xì)胞(ECACCNo.85090402)在最小必需培養(yǎng)基(MEM)(InvitrogenCat31095)中培養(yǎng)于Nunc三元燒瓶(3x175cm2面積)中，所述最小必需培養(yǎng)基含有10X胎牛血清(InvitrogenCat.10100-147)和lX的非必需氨基酸(InvitrogenCat.11140-035)。在收集用于測(cè)定時(shí)，經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞約80%融合。為了防止可能的傳代相關(guān)小鷹，常規(guī)地使用第4代和第8代之間、在培養(yǎng)48或72小時(shí)后收集的細(xì)胞。用0.25%胰蛋白酶/1mMEDTA(GibcoCat25200-056)經(jīng)恰好足夠細(xì)胞分離的時(shí)間(7-10分鐘)收集A431細(xì)胞，然后立刻在組織培養(yǎng)培養(yǎng)基中稀釋為約2x1(f細(xì)胞/mL的密度。然后將A431細(xì)胞離心(1200rpm)、重懸進(jìn)測(cè)定緩沖液中(Hanks平衡鹽溶液(不含Mg"禾卩Ca2+，不含酚磺酞)(InvitrogenCat.14175-053)，補(bǔ)充為1mM的終CaCl2終濃度)、再離心并再次以2x1(^細(xì)胞/mL的終濃度再重懸進(jìn)測(cè)定緩沖液中。如下進(jìn)行IgG系列稀釋液的制備和與A431細(xì)胞的預(yù)孵育。180/xL的每種檢測(cè)IgG或其部分被補(bǔ)充以20/iL含10%BSA(SigmaCat.A-9576)的測(cè)定緩沖液，將BSA濃度標(biāo)準(zhǔn)化為1。％。最初將抗鼠/人P-鈣黏著蛋白參考多克隆抗體(R&DCat.AF-761)重懸進(jìn)MilliQ水中得到1mg/mL的儲(chǔ)液。然后將40AtL該儲(chǔ)存液進(jìn)一步稀釋進(jìn)140^L測(cè)定緩沖液中。然后加入20/xL含10%BSA的測(cè)定緩沖液，得到200溶液(0.2mg/mL抗體和0.1%BSA)。通過(guò)首先向Greiner96孔聚丙烯稀釋板(GrdnerCat.780271)的第一列添加2x90/xL的AF-761多克隆抗體或檢測(cè)IgG來(lái)制備雙份系列稀釋。然后向第2-ll列加入60/xL測(cè)定緩沖液。然后在平板上從左到右從第1-11列制備30mL到60AtL(l:3)的稀釋。然后向孔12A-d中單獨(dú)加入60/iL測(cè)定緩沖液以定義最大粘附。通過(guò)向孔12E-H中添加60pL的25mMEDTA(測(cè)定緩沖液中)來(lái)定義最小粘附。然后向所有孔中加入60的A431細(xì)胞懸浮液(測(cè)定緩沖液中2x1(^細(xì)胞/mL——如上文下劃線(xiàn)的制備)，攪動(dòng)后將平板在37"C預(yù)孵育1小時(shí)。制備測(cè)試IgG系列稀釋和與A431細(xì)胞預(yù)孵育的同時(shí)，如下制備P-鈣黏著蛋白包被的測(cè)定平板。將重組人P-鈣黏著蛋白Fc在包被緩沖液(不含Mg"和Ca"的PBS-InvitrogenCat.14190-094)中稀釋至10/xg/mL的濃度并分散在Fluoronunc96(NuncCat.437958)孔測(cè)定平板(100//L/孔)上。然后將平板在室溫下孵育1到30分鐘。然后使用Tecan96平板洗滌器用PBS洗漆平板3次。然后加入200/xL/孔的測(cè)定緩沖液用于封閉，并將平板在室溫下孵育額外的1小時(shí)。然后如前所述將平板用PBS洗滌3次。然后將100^L/孔經(jīng)預(yù)孵育的IgG/A431材料從Greiner96孔稀釋平板轉(zhuǎn)移至P-鈣黏著蛋白包被的測(cè)定平板中。轉(zhuǎn)移時(shí)通過(guò)吸打混合IgG/A431材料，以保證細(xì)胞是均相的。然后通過(guò)將測(cè)定板在37。C孵育30-45分鐘允許粘附過(guò)程發(fā)生。孵育結(jié)束時(shí)，通過(guò)將培養(yǎng)基從平板中輕柔抽吸去除未粘附的細(xì)胞，并用細(xì)胞洗滌緩沖液(補(bǔ)充至1mMCaCl2終濃度的Hanks平衡鹽溶液(不含Mg"+和Ca"并且不含酚磺酞-InvitrogenCat.14175-053)再充填孔。然后將平板倒置于細(xì)胞洗滌緩沖液浴中15分鐘以去除殘留的未粘附細(xì)胞。該孵育結(jié)束時(shí)，輕柔抽吸孔的內(nèi)含物。如下進(jìn)行粘附細(xì)胞的定量。通過(guò)添加100ml/孔的組合溶解/堿性磷酸酶檢測(cè)試劑(用水1:5稀釋的二乙醇胺底物緩沖液5X濃縮物(PierceCat.34064)，之后每25mL的1X溶液中溶解一個(gè)15mg的PNPP藥片(SigmaCat.N-2640))然后再37。C孵育30-60分鐘來(lái)檢測(cè)粘附細(xì)胞。然后通過(guò)添加1MNaOH(50/xL/孔)終止反應(yīng)，以得到不存在抑制時(shí)約0.8的最大OD值。然后使用標(biāo)準(zhǔn)平板讀數(shù)器測(cè)量405nm處的吸光度。然后如下分析結(jié)果。第12列、孔A-D作為100%粘附，第12列、孔E-H作為0%粘附，如下將原始數(shù)據(jù)首先轉(zhuǎn)化為％粘附值%粘附={(粘附值一最小粘附值)/(最大粘附_最小粘附)}*100然后使用Prism軟件計(jì)算。X粘附比IgG抑制劑濃度，測(cè)定ICs。值。當(dāng)觀(guān)察到部分抑制時(shí)，IC5。引用為與曲線(xiàn)中點(diǎn)相比產(chǎn)生真實(shí)的50%抑制的IgG濃度。ICM)值報(bào)告于表4中。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的A431粘附測(cè)定，與其未種系化的等價(jià)物相比，研究若干個(gè)來(lái)自129-lc4譜系的經(jīng)種系化、最優(yōu)化的IgG。就這些實(shí)驗(yàn)而言，必須改變?yōu)橐慌碌腜-鈣黏著蛋白(CFR-134041)，其顯示和比其它數(shù)據(jù)輕微提高的ICso值相關(guān)。來(lái)自這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)的針對(duì)若干個(gè)經(jīng)種系化的IgG的平均數(shù)據(jù)顯示于表5中。如前所述，g-194-b09是指194-b09的經(jīng)種系化版本，等等。<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table>實(shí)施例4:P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性的細(xì)胞聚集測(cè)定法使用以下方案用于在P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性的聚集測(cè)定法中測(cè)定ic50值，所述方法使用若干在如上文實(shí)施例2所述的抗體回收最佳化階段中被轉(zhuǎn)化為IgG的經(jīng)最佳化的scFv。因?yàn)橹糜趹乙荷L(zhǎng)中時(shí)，過(guò)表達(dá)P-鈣黏著蛋白的細(xì)胞系形成緊密的多細(xì)胞聚集體，因此細(xì)胞聚集可以在影響細(xì)胞聚集的P-鈣黏著蛋白抗體存在時(shí)被測(cè)量。若干抗體的平均測(cè)量IC50顯示于下表6中。如下制備平板。每個(gè)96孔測(cè)定板用50uL多聚HEMA(12mg/mL溶于90%乙醇、10%甲醇中)包被，然后蒸發(fā)6小時(shí)過(guò)夜，之后在使用前用3x100uL無(wú)菌H20洗滌。然后如下培養(yǎng)細(xì)胞。來(lái)自人細(xì)胞系SW480(穩(wěn)定表達(dá)P-鈣黏著蛋白G418D的細(xì)胞在完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基(qsDMEM(inVitrogen11995-065)、10%FBS(OmegaScientificFB-02)、1:100NEAA(InVitrogen11140-050)、1:100丙酮酸鈉(InVitrogen11360-070)、1:100谷氨酰胺(InVitrogen25030-051)、1:100青霉素/鏈球菌溶血素(InVitrogen15070-063)、1:100、遺傳霉素50mg/mL(Invitrogen10131-035))+G418(500ug/mL)中傳代，然后1:3-4每周分傳兩次。然后將培養(yǎng)物冷凍于生長(zhǎng)培養(yǎng)基+10%DMSO中。第1天以5x106細(xì)胞/100mm平皿、不大于1:3的稀釋度接種SW480:pCAD細(xì)胞和對(duì)照SW480:pCLNX(穩(wěn)定的對(duì)照載體)。細(xì)胞然后在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48小時(shí)。每個(gè)100mm平皿提供約10x106的或足夠2x96孔板的細(xì)胞。第3天，去除培養(yǎng)基后用dPBS(Dulbecco，sPBS(InVitrogen14040-133))洗漆，之后在3mL/100mm平皿中使細(xì)胞受胰蛋白酶作用。用兩體積(6mL)完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基釋放后進(jìn)行中和。然后使用10mL的吸量管將平板洗滌三次以破壞聚簇。然后計(jì)數(shù)細(xì)胞并使用Beckman離心機(jī)在1000rpm5分鐘獲得沉淀。吸去培養(yǎng)基，通過(guò)手指渦旋隨后p1000吸量管吸打?qū)⒊恋硎紫戎貞矣?lt;1mL的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，然后將細(xì)胞濃度標(biāo)準(zhǔn)化至1.3M/mL。通過(guò)顯微鏡確保單個(gè)細(xì)胞分散。然后通過(guò)用dPBS和5%PBS封閉96孔板30分鐘來(lái)制備試劑平板。然后用1x100PLdPBS洗滌平板，隨后抽吸并輕彈至干燥。使用4x[IgG]濃度，用dPBS制備測(cè)試IgG的稀釋系列，其足夠96孔中一個(gè)孔中處理板的3個(gè)孔。30^L/孔中的40000個(gè)細(xì)胞被等分至96孔的、經(jīng)洗滌的、多聚HEMA包被的Costar3590非組織培養(yǎng)平板(Coming3590)中。然后向96孔板的每個(gè)孔轉(zhuǎn)移10iiL試劑。使用8通道吸量管進(jìn)行每處理三份樣品。然后在250rpm搖動(dòng)下在潮濕的37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜(16-18小時(shí))。第4天，將40UL經(jīng)搖動(dòng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至聚賴(lài)氨酸包被的96孔板(BioCoat聚賴(lài)氨酸包被的96孔板BD356516)。然后用60uL完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基沖洗孔，通過(guò)敲打搖動(dòng)平板，并轉(zhuǎn)移至涂布有聚賴(lài)氨酸的平板。需要時(shí)進(jìn)行額外的50wL洗滌。隨后在潮濕的37°C,5%C02培養(yǎng)箱中孵育60分鐘。在該步驟小心地在數(shù)量上轉(zhuǎn)移所有的細(xì)胞，盡可能輕柔，不要過(guò)度吸打。然后通過(guò)在通風(fēng)櫥中添加100yL固定液(7.4%甲醛(37%wt/vol,SigmaF15587))，之后在室溫下孵育>30分鐘來(lái)固定細(xì)胞。為了洗滌細(xì)胞，隨后將液體傾析進(jìn)收集杯中或碟中并輕彈以去除殘余液體，輕柔地倒在紙巾上。然后添加100uL每孔的dPBS以洗滌，隨后孵育15分鐘。然后通過(guò)如上傾析并使用100^LHoescht(dPBS中1g/mLHoescht-Hoescht10mg/mLMolecularProbes33342)，隨后孵育30分鐘將細(xì)胞染色。然后洗滌細(xì)胞兩次，孔中剩余100uLdPBS用于顯微鏡檢査。然后測(cè)量每孔中聚集的物體數(shù)量(Cellomics)，將平均物體計(jì)數(shù)(測(cè)試IgG)與IgG(例如Gt-抗-P-鈣黏著蛋白R(shí)&DSystemsAF761)的或只有培養(yǎng)基的對(duì)照相比。然后計(jì)算物體計(jì)數(shù)比IgG抑制劑的濃度，并測(cè)定IC5()值。本發(fā)明若干抗體的ICs。值報(bào)告于表6中。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage83</column></row><table>實(shí)施例5:P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性的球形體破壞測(cè)定法以下的球形體破壞測(cè)定法是聚集測(cè)定法(描述于實(shí)施例4)的變體，其中在添加P-鈣黏著蛋白和對(duì)照抗體之前過(guò)夜形成細(xì)胞聚集體。然后在分析前額外的24小時(shí)加入測(cè)試試劑。如下制備平板。每個(gè)96孔測(cè)定板用50uL多聚HEMA(90%乙醇、10%甲醇中12mg/mL)包被，然后蒸發(fā)6小時(shí)過(guò)夜，之后在使用前用3x100uL無(wú)菌H20洗滌。然后如下培養(yǎng)細(xì)胞。來(lái)自人細(xì)胞系SW480(穩(wěn)定表達(dá)P-鈣黏著蛋白G4iy)的細(xì)胞在完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基(qSDMEM(inVitrogen11995-065)、10%FBS(OmegaScientificFB-02)、1:100NEAA(InVitrogen11140-050)、1:100丙酮酸鈉(InVitrogen11360-070)、1:100谷氨酰胺(InVitrogen25030-051)、1:100青霉素/鏈球菌溶血素(InVitrogen15070-063)、1:100、遺傳霉素50mg/mL(Invitrogen10131-035))+G418(500ug/mL)中傳代，然后1:3-4每周分傳兩次。然后將培養(yǎng)物冷凍于生長(zhǎng)培養(yǎng)基+10%DMSO中。第1天以5x106細(xì)胞/100mm平皿、不大于1:3的稀釋度接種SW480:pCAD細(xì)胞和對(duì)照SW480:pCLNX(穩(wěn)定的對(duì)照載體)。細(xì)胞然后在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)48小時(shí)。每個(gè)100mm平皿提供約10x106的或足夠2x96孔板的細(xì)胞。第3天，去除培養(yǎng)基后用dPBS(Dulbecco，sPBS(InVitrogen14040-133))洗滌，之后在3mL/100mm平皿中使細(xì)胞受胰蛋白酶作用。用兩體積(6mL)完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基釋放后進(jìn)行中和。然后使用10mL的吸量管將平板洗滌三次以破壞聚簇。然后計(jì)數(shù)細(xì)胞并使用Beckman離心機(jī)在1000rpm5分鐘獲得沉淀。吸去培養(yǎng)基，通過(guò)手指渦旋隨后p1000吸量管吸打?qū)⒊恋硎紫戎貞矣?lt;1mL的完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，然后將細(xì)胞濃度標(biāo)準(zhǔn)化至1.0xl06/mL。通過(guò)顯微鏡確保單個(gè)細(xì)胞分散。40uL/孔中的40000個(gè)細(xì)胞被等分至96孔的、經(jīng)洗滌的、多聚HEMA包被的Costar3590非組織培養(yǎng)平板(Corning3590)中。然后在250rpm搖動(dòng)下在潮濕的37°C、5%002培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜(16-18小時(shí))。第4天，通過(guò)用dPBS和5%PBS封閉96孔板30分鐘來(lái)制備試劑平板。然后用1x100uLdPBS洗滌平板，隨后抽吸并輕彈至干燥。使用5x[IgG]濃度，用dPBS制備測(cè)試IgG的稀釋系列，其足夠96孔中一個(gè)孔中處理板的3個(gè)孔。使用8通道吸量管進(jìn)行每處理三份樣品。然后在250rpm搖動(dòng)下在潮濕的37°C、5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(20-24小時(shí))。第5天，將50tlL經(jīng)搖動(dòng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至聚賴(lài)氨酸包被的96孔板(BioCoat聚賴(lài)氨酸包被的96孔板BD356516)。然后用50yL完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基沖洗孔，通過(guò)敲打搖動(dòng)平板，并轉(zhuǎn)移至涂布有聚賴(lài)氨酸的平板。需要時(shí)進(jìn)行額外的50UL洗滌。隨后在潮濕的37。C,5%C02培養(yǎng)箱中孵育60分鐘。在該步驟小心地在數(shù)量上轉(zhuǎn)移所有的細(xì)胞，盡可能輕柔，不要過(guò)度吸打。然后通過(guò)在通風(fēng)櫥中添加100tiL固定液(7.4%甲醛(37%wt/vol,SigmaF15587))，之后在室溫下孵育〉30分鐘來(lái)固定細(xì)胞。為了洗滌細(xì)胞，隨后將液體傾析進(jìn)收集杯中或碟中并輕彈以去除殘余液體，輕柔地倒在紙巾上。然后添加100uL每孔的dPBS以洗滌，隨后孵育15分鐘。然后通過(guò)如上傾析并使用100txLHoescht(dPBS中1g/mLHoescht—Hoescht10mg/mLMolecularProbes33342)，隨后孵育30分鐘將細(xì)胞染色。然后洗滌細(xì)胞兩次，孔中剩余100wLdPBS用于顯微鏡檢查。然后測(cè)量每孔中聚集的物體數(shù)量(Cellomics)，將平均物體計(jì)數(shù)(測(cè)試IgG)與IgG(例如Gt-抗-P-鈣黏著蛋白R(shí)&DSystemsAF761)的或只有培養(yǎng)基的對(duì)照相比。然后計(jì)算物體計(jì)數(shù)比IgG抑制劑的濃度以測(cè)定ICso值。或者，物體計(jì)數(shù)被表達(dá)為在表7所示的一個(gè)確定的濃度下與對(duì)照相比的破壞倍數(shù)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>實(shí)施例6:測(cè)量P-鈣黏著蛋白抗體的K^和如下使用制造商的方案，使用BIACORE3000設(shè)備通過(guò)表面等離振子共振進(jìn)行P-鈣黏著蛋白scFv單鏈抗體的親和力測(cè)量(Ko和k。ff)。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析，使用常規(guī)的胺偶合將重組的人P-鈣黏著蛋白/Fc融合蛋白(hCad/Fc)和小鼠P-鈣黏著蛋白/Fc融合蛋白(mCad/Fc)固定在CM5BIACORE傳感器芯片的分離流動(dòng)單元上。使用含有2.0mMCaCl2的10mM乙酸鹽緩沖液pH4.5作為固定緩沖液制備表面，并達(dá)到hCad/FC和mCad/Fc融合蛋白分別為5800和1600RU的蛋白質(zhì)密度。使用1M鹽酸乙醇胺，pH8.5進(jìn)行未反應(yīng)N-羥基琥珀酰亞胺酯的失活。使用激活的/滅活的空白表面作為對(duì)照表面。在電泳緩沖液中制備濃度從200nM到0.78nM(包括作為零參考的、只包含電泳緩沖液的OnM溶液)的scFv抗體樣品。將樣品隨機(jī)化，并使用HBS-P(10mMHEPESpH7.4，150mMNaCl,0.005%SurfactantP20)—式三份穿過(guò)流動(dòng)單元注射1分鐘，使用2.0mMCaCl2作為電泳緩沖液。使用25uL/分鐘的流速測(cè)定親和常數(shù)。抗體離解被檢測(cè)5分鐘，表面通過(guò)12秒注射10mM甘氨酸-HClpH1.5(25wL/min)來(lái)再生。原始數(shù)據(jù)使用Scrubber(BioLogicSoftware)軟件包加工，使用CLAMP(BioLogicSoftware)軟件包分析。數(shù)據(jù)整體上符合1:1的Langmuir結(jié)合模型。表8列出本發(fā)明單鏈抗P-鈣黏著蛋白抗體的親和常數(shù)表8<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>實(shí)施例7:測(cè)定P-鈣黏著蛋白抗體的選擇性使用以下方案測(cè)定多種抗體對(duì)P-鈣黏著蛋白超出E-鈣黏著蛋白的選擇性。將重組人P-鈣黏著蛋白(R&DSystems861-PC-100)和重組人E-鈣黏著蛋白(R&DSystems648-EC-100)以1pg/mL在PBS+0.5mMCaCl2中涂布于Exiqon蛋白質(zhì)固定平板(VWRInternational)的孔上。在從50nM(7.5昭/mL)滴定至0.64nM(0.096)ig/mL)前將樣品IgG在3%Marvel/PBS+0.5mMCaCl2中封閉1小時(shí)，雙份加入用兩種不同抗原包被的孔中。在4。C過(guò)夜平衡后，將平板用lxPBS/0.1%Tween+0.5mMCaCl2洗滌三次，隨后用1xPBS+0.5mMCaCl2洗滌三次。然后向每個(gè)孔中加入501:5000稀釋于3%Marvel/PBS+0.5mMCaCl2中的抗人Fab過(guò)氧化物酶綴合物，使其在室溫下平衡1小時(shí)。將平板用1xPBS/0.1%Tween+0.5mMCaCl2洗滌三次，用1xPBS+0.5mMCaCl2洗滌三次。向每個(gè)孔中加入50pl3，3，，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB;Sigma)，允許反應(yīng)進(jìn)行20分鐘，之后通過(guò)加入25fiL/well0.5M112804終止反應(yīng)。在450nm處讀吸光度數(shù)值后，使用GraphpadPrism軟件分析數(shù)據(jù)以計(jì)算每個(gè)抗體結(jié)合P-鈣黏著蛋白和E-鈣黏著蛋白的相對(duì)Kd但。得到的數(shù)據(jù)概括在表9中。表9<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>實(shí)施例8:表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法使用以下的方案在表位競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定法中測(cè)量IC5Q值以測(cè)量親本譜系中變體scFv用親本IgG代替A431細(xì)胞表面上天然P-鈣黏著蛋白的能力。用銪鏈霉親和素(europiumstreptavidin)禾nDELFIA定量來(lái)檢測(cè)存在抑制性scFv時(shí)結(jié)合的、經(jīng)生物素化的親本IgG的數(shù)量。若干scFv的經(jīng)測(cè)量的IC50值顯示在表IO中。使用前一天，將根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)的、隨后在約80%融合時(shí)收集的A431細(xì)胞(ECACCNo.85090402)以2.5乂104細(xì)胞每孔接種在96孔BecktonDickenson(BDCat.6407)膠原包被的平板上。然后通過(guò)浸入PBS緩沖液(GibcoCat.14190-094，不含f丐、鎂和碳酸氫鈉)容器中，之后添加200uL每孔的封閉緩沖液(PBSGibcoCat.14190-094，加3%Marvel(PremierInternationalFoodsLtd.))并在室溫下孵育2小時(shí)。然后將平板用如上的PBS洗滌3次。對(duì)高通量篩選和ICso繪圖而言，首先在Greiner稀釋平板(Greiner96孔聚丙烯平板(GreinerCat.780271))中60yL總體積的測(cè)定緩沖液中制備scFv/IgG材料。然后將50uL從被控的Greiner平板直接轉(zhuǎn)移至測(cè)定平板，允許結(jié)合反應(yīng)在室溫下進(jìn)行2小時(shí)30分鐘。結(jié)合反應(yīng)結(jié)束時(shí)，將平板在PBS中洗滌三次，之后添加銪標(biāo)記的鏈霉親和素(PerkinElmerCat.1244-360，1:1000稀釋于DELFIA測(cè)定緩沖液(PerkinElmerCat.4002-0010)中)，在室溫下再孵育l小時(shí)。然后通過(guò)重復(fù)地將平板浸入緩沖液容器中，用DELFIA洗滌緩沖液(PerkinElmerCat.4010-0010)洗滌平板7次。最后，添加DELFIA增強(qiáng)因子(PerkinElmerCat.4001-0010—100uL/孑L)后，使用標(biāo)準(zhǔn)DELFIA方案在適合的讀數(shù)器(例如Wallac或Envision)上讀數(shù)平板。Greiner稀釋平板裝配-HTS高通量篩選(HTS)條件根據(jù)最佳化的階段而不同地設(shè)置。對(duì)來(lái)自個(gè)體Vh和VL鏈最佳化的輸出HTS而言，最終[peri-prep]被設(shè)定為12.5%,使得親本scFv給出部分抑制。對(duì)來(lái)自VH:V^重組文庫(kù)輸出的后期HTS而言，最終peri-prep濃度降至1.7%，在這些條件下經(jīng)Vh恍化的基準(zhǔn)scFv(TOP-108-C01)給出部分抑制。最優(yōu)化peri-prep濃度使得相關(guān)的基準(zhǔn)scFv產(chǎn)生部分抑制，這建立了一個(gè)鑒定經(jīng)改良克隆的窗口。為了達(dá)到這些最終scFvperi-prep濃度，采取以下步驟i)使用Cybiwell設(shè)備，將所需體積(見(jiàn)下文)的peri-prep樣品材料從深孔樣品平板中轉(zhuǎn)移至Greiner稀釋平板的第1-11列。轉(zhuǎn)移體積[12.5%]=7.5uL=lO.OuL(的1:10稀釋的peri-prep)(通過(guò)將10yL純peri-prep從樣品平板轉(zhuǎn)移進(jìn)含90^L測(cè)定緩沖液的Greiner稀釋平板(使用Cybiwell)來(lái)制備1:10預(yù)稀釋的peri-prep)ii)然后通過(guò)添加合適體積的測(cè)定緩沖液將第1-11列的體積補(bǔ)足30UE。iii)然后向第12列(A-D)(完全結(jié)合孔)中添加30測(cè)定緩沖液。iv)向第12歹ij(E-H)添加30pL測(cè)定緩沖液中過(guò)量的未標(biāo)記的親本IgG(129-lc4)以定義非特異性的結(jié)合。以1000nM的濃度添加以得到500nM的終濃度。v)使用水溶性試劑EZ-link-NHS-LC-Biotin(Perbio/Pierceproductno.21336)生物素化129-lc4IgG。通過(guò)添加1/10體積的1MNaHC。3和1/10體積的二甲基酰胺補(bǔ)充IgG溶液。將EZ-link-NHS-LC-Biotin試劑溶解在DMF中，然后以超出IgG五倍的摩爾數(shù)添加，允許反應(yīng)在室溫下進(jìn)行20分鐘。然后通過(guò)添加BSA(0.1%)來(lái)穩(wěn)定經(jīng)生物素化的IgG。然后向所有孔中添加30/xL的、測(cè)定緩沖液中的、經(jīng)生物素化的親本129-lc4IgG，得到最終60AtL體積中1.5nM的終濃度(即以2x終濃度添加銪標(biāo)記的IgG)。vi)通過(guò)攪動(dòng)混合Greiner平板內(nèi)含物后，將50^L直接轉(zhuǎn)移至測(cè)定平板，允許結(jié)合反應(yīng)在室溫下進(jìn)行2小時(shí)30分鐘(如前文所述)。Greiner稀釋平板裝配一ICso繪圖i)將30iwL/孔測(cè)定緩沖液添加至標(biāo)準(zhǔn)Greiner稀釋平板的第2-11列和孔12A到12D。ii)將30ML的、測(cè)定緩沖液中的、過(guò)量的未標(biāo)記的129-lc4親本IgG添加至第12列(E-H)中以定義非特異性結(jié)合。這應(yīng)當(dāng)以1000nM濃度添加以得到500nM的終濃度。iii)向第1列中加入2x45^L每種未稀釋的scFvHis-prep，使得每個(gè)96孔測(cè)定平板能夠進(jìn)行4個(gè)雙份11點(diǎn)IQo滴定。然后通過(guò)從第1列取出15/xL與第2列混合、之后從第2列取出15ML混合進(jìn)第3列等等，進(jìn)行1:3的雙份系列稀釋?；旌线M(jìn)第11列后，去除15/xL(即剩余30//L的終體積)。iv)然后向所有孔中加入30/IL的、測(cè)定緩沖液中的、經(jīng)生物素化的129-lc4親本IgG，得到最終60體積中1.5nM的終濃度(即以2x終濃度添加銪標(biāo)記的IgG)。v)通過(guò)攪動(dòng)混合Greiner平板內(nèi)含物后，將50直接轉(zhuǎn)移至測(cè)定平板，如前文所述允許結(jié)合反應(yīng)在室溫下進(jìn)行2小時(shí)30分鐘。對(duì)HTS而言，scFv在96孔板中被表達(dá)為來(lái)自含MOPS/EDTA/SorbitolpH7.4(MESpH7.4)的基礎(chǔ)緩沖液中的細(xì)菌周質(zhì)膜(scFvperi-prep)的粗提物。就IC50繪圖而言，使用基礎(chǔ)緩沖液中用于親和純化的scFvffis-tag(scFvHis-prep)PBS將scFv表達(dá)較低通量的經(jīng)純化的形式。對(duì)HTS和IC5。分析二者而言，原始數(shù)據(jù)首先根據(jù)以下等式轉(zhuǎn)化為％結(jié)合數(shù)據(jù)%結(jié)合={(結(jié)合值一非特異結(jié)合)/(總結(jié)合一非特異結(jié)合)}*100然后使用標(biāo)準(zhǔn)Excel模板進(jìn)一步分析HTS數(shù)據(jù)，以鑒定與相關(guān)基準(zhǔn)scFv相比給出更大抑制(更低％結(jié)合)的提示。對(duì)ICso分析而言，使用Prism4.0版曲線(xiàn)擬合軟件分析％結(jié)合數(shù)據(jù)。ScFv是129-lc4親本IgG的變體，其中Vh和VLCDR3區(qū)被隨機(jī)突變，如實(shí)施例2中所述。VhCDR3変體序列在圖1中顯示為SEQIDNOs:91到256。VLCDR3變體序列在圖1中顯示為SEQIDNOs:257到319。顯示超出親本129-lc4IgG的經(jīng)改進(jìn)的結(jié)合的若干scFv的IQo值顯示在表10中。129-lc4親本的每種scFv變體通過(guò)兩個(gè)序列SEQIDNOs:VHCDR3和VLCDR3鑒定。作為參考，親本129-lc4IgG的ICso是108.3nM。表IO<table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>本說(shuō)明書(shū)所列的所有出版物、專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文，好像每個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)被明確地、單獨(dú)地指出是通過(guò)引用并入本文一樣。盡管己經(jīng)就明確理解的目的通過(guò)闡述和舉例比較詳細(xì)地描述了前述發(fā)明，但是根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)容易地明白可以對(duì)其進(jìn)行某些改變和變更，而不偏離所附帶的權(quán)利要求書(shū)的思想或范圍。權(quán)利要求1.具有至少一個(gè)選自以下組的特征的抗體或其抗原結(jié)合部分，所述組由a)具有大于或等于1.5的KD(E)/KD(P)；b)通過(guò)表面等離振子共振測(cè)量以50nM或更小的KD與P-鈣黏著蛋白結(jié)合；c)對(duì)P-鈣黏著蛋白而言，通過(guò)表面等離振子共振測(cè)量的koff小于或等于0.01s-1；d)通過(guò)P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性細(xì)胞黏著測(cè)定法測(cè)量的IC50為50nM或更??；e)通過(guò)P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性細(xì)胞聚集測(cè)定法測(cè)量的IC50為50nM或更??；f)在P-鈣黏著蛋白依賴(lài)性球狀體破壞測(cè)定法中，與無(wú)IgG的對(duì)照樣品相比球狀體破壞增加因數(shù)為2或更多；g)與選自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P-鈣黏著蛋白；h)與選自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06129-1c4；和g-129-1c4的抗體交叉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合P-鈣黏著蛋白；i)與選自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗體結(jié)合在P-鈣黏著蛋白上相同的表位；j)與選自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗體以基本上相同的KD結(jié)合P-鈣黏著蛋白；和k)與選自194-e06；194-a02；194-b09；195-e11；194-g09；196-h02；194-e01；196-d10；196-g03；196-e06；195-a09；198-a09；200-h06；g-194-b09；g-194-g09；g-196-g03；g-196-h02；g-194-e01；g-194-e06；129-1c4；和g-129-1c4的抗體以基本上相同的koff結(jié)合P-鈣黏著蛋白構(gòu)成。2.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含氨基酸序列與SEQIDNOs:13、320、321和322中任一至少90%同一的vh結(jié)構(gòu)域。3.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含氨基酸序列與SEQIDNOs:22、326、327和328中任一至少90%同一的V^結(jié)構(gòu)域。4.選自以下組的如權(quán)利要求1所述的抗體或抗原結(jié)合部分，所述組由a)抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含如SEQIDNO:13中公開(kāi)的Vh結(jié)構(gòu)域或因1到10個(gè)保守氨基酸取代而與SEQIDNO:13不同的Vh結(jié)枸域，和如SEQIDNO:22中公開(kāi)的Vj吉構(gòu)域或因1到IO個(gè)保守氨基酸取代而與SEQIDNO:22不同的Vi結(jié)構(gòu)域；b)抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含如SEQIDNO:320中公開(kāi)的Vh結(jié)構(gòu)域或因1到10個(gè)保守氨基酸取代而與SEQIDNO:320不同的Vh結(jié)枸域，和如SEQIDNO:326中公開(kāi)的V^結(jié)構(gòu)域或因1到10個(gè)保守氨基酸取代而與SEQIDNO:326不同的V^結(jié)構(gòu)域；c)抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含如SEQIDNO:321中公開(kāi)的Vh結(jié)構(gòu)域或因1到10個(gè)保守氨基酸取代而與SEQIDNO:321不同的Vh結(jié)枸域，和如SEQIDNO:327中公開(kāi)的vl結(jié)構(gòu)域或因1到IO個(gè)保守氨基酸取代而與SEQIDNO:327不同的vl結(jié)構(gòu)域；禾口d)抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含如SEQIDNO:322中公開(kāi)的Vh結(jié)構(gòu)域或因1到10個(gè)保守氨基酸取代而與SEQIDNO:322不同的Vh結(jié)枸域，和如SEQIDNO:328中公開(kāi)的Vj吉構(gòu)域或因1到10個(gè)保守氨基酸取代而與SEQIDNO:328不同的V^結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。5.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含獨(dú)立地選自SEQIDNOs:1到13和320到325之任一的VH結(jié)構(gòu)域或因1到10個(gè)保守氨基酸取代而與SEQIDNOs:1到13和320到325之任一不同的序列；并還包含獨(dú)立地選自SEQIDNOs:14到23和326到331之任一的VL結(jié)構(gòu)域或因1到10個(gè)保守氨基酸取代而與SEQIDNOs:14到23和326到331之任一不同的序列。6.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分包含選自SEQIDNOs:26到37禾D91到256之任一的VHCDR3，或因1個(gè)或2個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:26到37和91到256之任一不同的序列。7.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分包含選自SEQIDNOs:40到47和257至(J319之任一的VLCDR3，或因1個(gè)或2個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:40到47和257到319之任一不同的序列。8.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分包含a)如SEQIDNO:24所公開(kāi)的VHCDR1，或因1個(gè)或2個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNO:24不同的序列；b)如SEQIDNO:25所公開(kāi)的VHCDR2，或因1個(gè)或2個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNO:25不同的序列；禾口c)選自SEQIDNOs:26到37和91到256之任一的VHCDR3，或因1個(gè)或2個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:26到37和91到256之任一不同的序列。9.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述抗體或抗原結(jié)合部分包含a)如SEQIDNO:38所公開(kāi)的VLCDR1，或因l個(gè)或2個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNO:38不同的序列；b)如SEQIDNO:39所公開(kāi)的VLCDR2，或因1個(gè)或2個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNO:39不同的序列；和c)選自SEQIDNOs:40到47和257至(J319之任一的VLCDR3，或因1個(gè)或2個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:40到47和257到319之任一不同的序列。10.抗體或其抗原結(jié)合部分，其中VH結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNOs:13、320、321禾n322之任一，或因1至(J10個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:13、320、321和322之任一不同的序列；禾卩VL結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNOs:22、326、327和328之任一，或因l到10個(gè)保守的氨基酸取代而與SEQIDNOs:22、326、327和328之任一不同的序列。11.如權(quán)利要求1妾U10任一項(xiàng)所述的抗體，其為IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子，或由這些獲得。12.如權(quán)利要求ll所述的抗體，其中IgG為IgG,，其中重鏈恒定區(qū)包含SEQIDNO:344，其中輕鏈恒定區(qū)包含SEQIDNO:345，并且SEQIDNO:344的C-端賴(lài)氨酸殘基任選地被切割。13.藥物組合物，其包含如權(quán)利要求1到12任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合部分和藥物可接受載體。14.經(jīng)分離的核酸分子，其包含如SEQIDNOs:80、89、332、333、334、338、339和340中任一所公開(kāi)的核苷酸序列。15.如權(quán)利要求1所述的抗體或其抗原結(jié)合部分，其包含利用人VH-3家族基因的重鏈可變區(qū)氨基酸序列。全文摘要本發(fā)明涉及抗體，其包括人抗體及其抗原結(jié)合部分，其結(jié)合P-鈣黏著蛋白，并且發(fā)揮抑制P-鈣黏著蛋白的作用。本發(fā)明還涉及來(lái)自人P-鈣黏著蛋白抗體的重鏈和輕鏈免疫球蛋白，以及編碼這類(lèi)免疫球蛋白的核酸分子。本發(fā)明還涉及制造人P-鈣黏著蛋白抗體的方法、包含這些抗體的組合物和使用所述抗體和組合物的方法。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明核酸分子的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或植物。文檔編號(hào)C07K16/28GK101184778SQ200680014282公開(kāi)日2008年5月21日申請(qǐng)日期2006年4月13日優(yōu)先權(quán)日2005年4月26日發(fā)明者克里斯托弗·托德·保爾,大衛(wèi)·威廉·格里格斯,威廉·迪恩·卓恩,孟拉尼·波耶勒,巴雷特·理查德·思伊拉,托德·李·瓦納斯達(dá)勒,拉爾夫·雷蒙德·米特爾,杰拉爾德·菲爾斯·加斯波森,理查德·大衛(wèi)·漢德,理查德·艾倫·瑪扎艾勒,莫琳·杰瑞·鮑內(nèi),馬克·艾倫·莫法特申請(qǐng)人:輝瑞有限公司