專利名稱：：利用hcic和離子交換層析的蛋白質(zhì)純化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般地涉及利用兩步非親和層析方法并且不使用過程中(in-process)切向流過濾步驟的蛋白質(zhì)純化。特別地，本發(fā)明涉及一種從包含多肽和一種或多種污染物的組合物中純化多肽(例如重組蛋白、抗體、抗體片段、Fab和Fv相關(guān)產(chǎn)物、單鏈抗體、雙抗體、線性抗體、雙特異性抗體、包括來自抗體片段的多特異性抗體、與Fc樣區(qū)的融合蛋白、抗體樣分子，如免疫粘附素)的方法。
背景技術(shù)：
：大規(guī)模、經(jīng)濟(jì)的蛋白質(zhì)純化是生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)上日益重要的問題。治療性蛋白質(zhì)典型地利用原核或真核細(xì)胞系產(chǎn)生，該細(xì)胞系:故工程化為由含編碼該蛋白質(zhì)的基因的重組質(zhì)粒表達(dá)目的蛋白質(zhì)。由于幾個原因，從提供給細(xì)胞的成分和細(xì)胞副產(chǎn)品的混合物中分離出所需蛋白質(zhì)以達(dá)到足夠的純度，如足以用作人類治療劑的純度，對于生物制品的制造者來說是一個巨大的挑戰(zhàn)?；诘鞍踪|(zhì)的藥物產(chǎn)品的生產(chǎn)者必需遵守嚴(yán)格的規(guī)章標(biāo)準(zhǔn)，包括極其嚴(yán)格的純度要求。為確保安全性，管理機(jī)構(gòu)，例如食品和藥品管理局(FDA),要求基于蛋白質(zhì)的藥物產(chǎn)品基本上不含雜質(zhì)，包括與產(chǎn)品有關(guān)的污染物如重組蛋白的聚集體、片段和變體，以及與操作相關(guān)的污染物如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、培養(yǎng)基成分、病毒、DNA和內(nèi)毒素。盡管有多種蛋白質(zhì)純化方案可以應(yīng)用并被廣泛用于生物制藥產(chǎn)業(yè)，但是這些方案通常包括親和純化步驟，例如在抗體的例子中的蛋白A純化，以達(dá)到藥學(xué)上可接受的純度。盡管有先進(jìn)的層析和過濾方法的出現(xiàn)，為獲得治療級別的純度，親和層析仍然經(jīng)常用作捕獲步驟來滿足生物醫(yī)藥抗體純化在純度、產(chǎn)率、生產(chǎn)能力方面的要求。盡管蛋白A層析對于抗體具有高結(jié)合親和性(對于人IgG來說，大約為1(T8M),以及具有除去多達(dá)99.5%的雜質(zhì)的能力，但是對于在商業(yè)規(guī)模上應(yīng)用于純化治療性蛋白質(zhì)而言，親和層析是一種昂貴的純化步驟。不僅蛋白A比非親和介質(zhì)顯著更貴，還存在其他問題，例如樹脂的不穩(wěn)定性、清洗的困難、配體的滲漏、污染純化產(chǎn)品的蛋白A或蛋白A相關(guān)化合物的潛在免疫原性。然而，親和介質(zhì)的高成本和不穩(wěn)定性提高了基于蛋白質(zhì)的治療劑的最終成本，特別是那些需要高劑量和/或長期施用的治療劑。僅層析就可占下游加工成本的三分之二，對于單克隆抗體來說，親和捕獲柱的樹脂的成本可超過原材料的成本(見Rathore等人，CostingIssuesintheProductionofBiopharmaceuticals,BioPharmInternational,Feb1,2004)。即使使用蛋白A親和層析，也經(jīng)常不能獲得足夠的純度，除非結(jié)合幾種純化步驟，由此進(jìn)一步增加了成本并降低了產(chǎn)品的產(chǎn)率。由于抗體占市場上和發(fā)展中的治療癌癥、自身免疫病、感染性疾病、心血管疾病和移植排斥的治療性生物制劑的比例日益增大，需要一種可以利用較少的步驟來純化蛋白質(zhì)的方法，由此實(shí)現(xiàn)較低的成本。美國專利公開No.2003/0229212(其全文在此引入作為參考)描述了一種利用非親和層析純化步驟緊接著利用高效切向流過濾(HPTFF)步驟從包含宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的混合物中純化抗體的方法。通過CHOPs(中國倉鼠卵巢細(xì)胞蛋白)的減少來確定，該純化方法導(dǎo)致污染物水平在陽離子交換純化之后為大約144,780ppmCHOPs,在陰離子交換純化之后為大約410ppmCHOPs,在HPTFF純化(最后的步驟)之后大約為17-21ppmCHOPs,因而提供了一種三步非親和方法。HPTFF的純化步驟對于獲得最終純度是關(guān)鍵的，其使用帶電膜來分離雜質(zhì)(相對大小不限)，例如蛋白質(zhì)、DNA和內(nèi)毒素，并從包含抗體的混合物中清除蛋白質(zhì)寡聚體和降解產(chǎn)物。而且，HPTFF存在缺點(diǎn)，即(1)它是蛋白質(zhì)治療劑的發(fā)展、優(yōu)化和放大中的一個額外步驟，需要膜清洗、確認(rèn)、商業(yè)上可以獲得的大規(guī)模GMP套件(其對于HPTFF仍然是無法獲得的)、以及另外的緩沖液、裝置和更多的處理時(shí)間，和(2)它增加了成本，同時(shí)通過損害抗體完整性(通過降解或聚集或其他影響分子活性的分子變化)具有潛在產(chǎn)物損失的危險(xiǎn)。因此，希望可通過一種兩步非親和方法獲得高純度的蛋白質(zhì)治療劑，該方法不基于HPTFF,與基于親和力的純化方法和其他多步驟純化方法相比降低成本。如果該非親和純化方法可以去除宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、核酸、內(nèi)毒素、與產(chǎn)品相關(guān)的污染物如蛋白質(zhì)的聚集、氧化、脫酰胺化或降解形式、和培養(yǎng)基添加劑如脂質(zhì)、維生素、胰島素、氨曱喋呤、氨基酸、碳源例如葡萄糖等，它將是有益的。開發(fā)可應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)的、可規(guī)模化、可控制、利用更便宜、可重復(fù)使用的樹脂的純化方案將允許其整合進(jìn)整個藥物發(fā)展中非常早期的產(chǎn)品發(fā)展中。這種純化方案的設(shè)計(jì)方法可使生產(chǎn)方法的改變在成本上減為最小，該生產(chǎn)方法的改變在藥物開發(fā)的后期是必需的，或更糟糕的是，在批準(zhǔn)之后是必需的。當(dāng)該方法放大并接近GMP生產(chǎn)條件時(shí)，會出現(xiàn)另外的內(nèi)在復(fù)雜性，包括與樹脂包裝和緩沖液制備相關(guān)的問題。該生產(chǎn)方法和其能力可通過筒化純化方案來改善，這種簡化是通過取消處理步驟并使生產(chǎn)量和生產(chǎn)率最大化，同時(shí)保持被純化分子的完整性和純度。因此，開發(fā)一種可生產(chǎn)高質(zhì)量、高安全性的藥物物質(zhì)的簡單且有效的方法是所期望的并且是有益的。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于以下的意外發(fā)現(xiàn)多肽和蛋白質(zhì)，特別是重組蛋白例如單克隆抗體，可通過利用不包括親和層析步驟或過程中緩沖液交換步驟(如TFF或HPTFF)的兩步純化法，從包含目的分子和至少一種污染物例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和其他物質(zhì)如培養(yǎng)基成分的被污染混合物中純化。而且，從第一步驟到第二步驟僅僅需要調(diào)節(jié)pH。因而，本發(fā)明的兩步法大大降低了通常依賴親和層析或多步方法來獲得類似高水平蛋白質(zhì)純度的純化蛋白質(zhì)的成本。在本發(fā)明中，利用陽離子交換層析和疏水電荷誘導(dǎo)層析(hydrophobicchargeinductionchromatography)的步驟爿奪蛋白質(zhì)高度純化至治療等級，不用考慮它們的順序，并且不使用親和層析，以產(chǎn)生高純度的、雜質(zhì)(例如，宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，如含量低于每百萬^分100份(ppm)的CHOPs)含量可忽略的蛋白質(zhì)。在下文實(shí)施例描述的發(fā)明的具體實(shí)施方式中，HCPCHOP的水平降低到低于20ppm。本發(fā)明的方法的一個優(yōu)點(diǎn)是層析步驟可互換，因此允許實(shí)施者根據(jù)需要修改方法。而且，本發(fā)明的純化方法不僅可除去目的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，而且可除去核酸、內(nèi)毒素、與產(chǎn)品相關(guān)的污染物例如蛋白質(zhì)的聚集、氧化、脫酰胺化或降解形式，以及培養(yǎng)基添加物例如脂質(zhì)、維生素、胰島素、氨甲喋呤、氨基酸、碳源如葡萄糖，等等。本發(fā)明提供了純化重組蛋白的方法，所述重組蛋白包括但不限于抗體、具有Fc樣區(qū)的融合蛋白、抗體樣分子，如免疫粘附素，用以獲得適于應(yīng)用于制備治療等級組合物的高純度蛋白質(zhì)。因此，所述高純度蛋白質(zhì)適于應(yīng)用于制備治療等級的物質(zhì)并可直接用于人類治療是本發(fā)明的方法的一個優(yōu)點(diǎn)。因此，在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明的一種方法用于純化含有目標(biāo)蛋白質(zhì)和一種或多種污染物的混合物，包括(a)將該混合物進(jìn)行離子交換純化步驟和疏水電荷誘導(dǎo)純化步驟，其中沒有過程中切向流過濾步驟，和(b)分離目標(biāo)蛋白質(zhì)。在一個特定實(shí)施方式中，該方法用于純化含有目標(biāo)蛋白質(zhì)和一種或多種污染物例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(如CHOPs)和核酸的混合物，包括將該混合物進(jìn)行陽離子交換層析和疏水電荷誘導(dǎo)層析，并分離目標(biāo)蛋白質(zhì)至純度為100ppm(百萬分之一)或更低的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和10pg/mg或更少的核酸。圖1顯示了本發(fā)明的兩步純化方法的流程圖，其中A組和B組指以不同順序使用的同樣的樹脂。A組代表本發(fā)明的純化方法的第一實(shí)施方式，其中陽離子交換層析(CEXC)是捕獲層析步驟，接下來是疏水電荷誘導(dǎo)層析(HCIC),在兩個層析步驟之間只需進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。B組代表第二實(shí)施方式，其中HCIC是捕獲層析步驟，接下來是CEXC,在兩個層析步驟之間只需進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。捕獲過程中的大致結(jié)合pH是，A組為6.2,B組為7.0。具體實(shí)施方式定義如此處所用，"蛋白質(zhì)"通常指典型地具有至少5個或更多個通過肽鍵彼此連接的氨基酸的肽和蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可以是抗體、受體、配體融合蛋白(包括兩個或多個在其自然狀態(tài)下不融合的多肽的至少一部分),等等，如，見US2003022921和US20030166869，它們?nèi)吭诖艘胱鳛閰⒖?，其中列出了多種可用本發(fā)明的方法進(jìn)行純化的蛋白質(zhì)。多肽可以來自任何生物(原核的或真核的)，特別是哺乳動物。另外，根據(jù)本發(fā)明的一種方法純化的蛋白質(zhì)或多肽可以是抗體、其片段或變體。"抗體，，在最廣意義上使用，覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(如雙特異性抗體)、免疫粘附素域?？贵w可針對目的"抗原，，，如多肽，該多肽可以是生物學(xué)相關(guān)治療靶標(biāo)，或非多肽抗原((如，腫瘤相關(guān)糖脂抗原，見美國專利No.5,091,178)。優(yōu)選地，抗原是生物學(xué)重要的多肽，將該抗體施用于遭受疾病或失調(diào)的哺乳動物可以導(dǎo)致對該哺乳動物的治療益處。多肽抗原包括跨膜分子(如受體)和配體如生長因子。示例性的抗原包括上是公知的。任選地與其他分子偶聯(lián)的可溶性抗原或其片段可被用作產(chǎn)生抗體的免疫原。對于跨膜分子，例如受體，其片段(如受體的胞外結(jié)構(gòu)域)可用作免疫原?？蛇x擇地，表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞可用作免疫原。這樣的細(xì)胞可獲自天然來源(如癌細(xì)胞系)或可以是通過重組技術(shù)轉(zhuǎn)化而表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞。"抗體片段"包括全長抗體的至少一部分，典型地為其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；單鏈抗體分子；雙抗體；線性抗體；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。"單克隆抗體"在通常意義上使用，是指從一群基本同源的抗體獲得的抗體，以致包括該抗體群的各個抗體除了可能以很小的數(shù)量出現(xiàn)的天然突變以外均相同。單克隆抗體是高度特異性的，針對一個抗原位點(diǎn)。與通常包括抗不同抗原決定簇(表位)的各種抗體的多克隆抗體制劑相比，單克隆抗體針對該抗原上的一個決定簇。在描述抗體時(shí)術(shù)語"單克隆，，指抗體獲自基本同源的一群抗體的特性，并且不應(yīng)理解為需要通過任何特定方法來產(chǎn)生該抗體。例如，本發(fā)明中使用的單克隆抗體可使用Kohler等人，Nature256:495(1975)首先描述的常規(guī)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)，或者可使用重組DNA方法生產(chǎn)(見，如美國專利No.4,816,567)。單克隆抗體也可從噬菌體抗體文庫中分離，如使用Clackson等人，Nature352:624-628(1991);Marks等人，J.Mol.Biol.222:581-597(1991);和美國專利Nos.5,223,409;5,403,484;5,571,698;5,427,908;5,580,717;5,969,108;6,172,197;5，885，793;6,521,404;6,544,731;6，555，313;6，582，915;和6,593,081)描述的才支術(shù)。此處描述的單克隆抗體包括"嵌合"和"人源化"抗體，其中重鏈和或輕鏈的一部分與來自特定種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，同時(shí)鏈的其余部分與來自其他種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及所述抗體的片段，只要它們顯示所需的生物學(xué)活性(美國專利No.4,816,567;和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。非人(例如鼠)抗體的"人源化，，形式是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗體。人源化抗體的大部分是人免疫球蛋白(接受抗體)，其中接受抗體的超變區(qū)殘基被具有所需特異性、親和性和能力的來自非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長動物的超變區(qū)殘基取代。在一些例子中，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被相應(yīng)的非人殘基取代。而且，人源化抗體可以包括在接受抗體或供體抗體中未發(fā)現(xiàn)的殘基。這些修飾可進(jìn)一步提升抗體的性能。通常，人源化抗體包括基本上全部的至少一個、一般兩個可變域，其中全部或基本上全部的超變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的超變環(huán)，全部或基本上全部的FR區(qū)是人免疫球蛋白序列的FR區(qū)。人源化抗體任選地還包括免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，典型地包括人免疫球蛋白的該部分。更多的細(xì)節(jié)可見Jones等人，Nature321:522-525(1986);Riechmann等人，Nature332:323-329(1988);和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。嵌合或人源化抗體可基于如上所述制備的鼠單克隆抗體的序列而制備。編碼重鏈和輕鏈免疫球蛋白的DNA可獲自目的鼠雜交瘤，并利用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建為含有非鼠(如，人)免疫球蛋白序列。例如，為了產(chǎn)生嵌合抗體，可利用本領(lǐng)域/^知的方法(見例如，Cabilly等人的美國專利No.4,816,567)將鼠可變區(qū)與人恒定區(qū)連接。為了產(chǎn)生人源化抗體，可利用本領(lǐng)域公知的方法(見例如，Winter的美國專利No.5，225，539以及Queen等人的美國專利Nos.5,530,101;5,585,089;5,693,762和6,180,370)將鼠CDR區(qū)插入人框架中。此處描述的單克隆抗體還可包括"人，，抗體，其可從多種來源分離獲得，包括，例如，從病人的血液中分離或利用轉(zhuǎn)基因動物重組制備。所迷轉(zhuǎn)基因動物的例子包括KM-Mouse(Medarex，Inc.,Princeton:NJ),其具有人重鏈轉(zhuǎn)基因和人輕鏈轉(zhuǎn)染色體(見WO02/43478),Xenomouse(Abgenix,Inc.,FremontCA;描述于，例如，Kucheriapati等人的美國專利Nos.5,939,598;6,075,181;6,114,598;6,150，584和6,162,963),和HuMAb-Mouse(Medarex，Inc.;描述于，例如，Taylor，L.等人(1992)iVwc/e/c血油to麼c/z20:6287-6295;Chen，J.等人(1993)/"化n7油'o腦//m聽朋/ogy5:647-656;Tuaillon等人(1993)尸rac.A^/.爿cadSd.90:3720-3724;Choi等人(1993)A^"reGe""z'w4:117-123;Chen，J.等人(1993)嵐5<912:821-830;Tuaillon等人(1994)/麵畫/.152:2912-2920;Taylor，L.等人(1994)/"^謹(jǐn)"',//wra"o/o^y6:579-591;和Fishwild,D.等人(1996)Atowre5z'o&c/wo/ogy14:845-851，Korman等人的美國專利Nos.5，545，806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5，789，650;5,877,397;5，661，016;5,814,318;5,874,299;和5,770,429;5,545,807;和PCT公開Nos.WO92/03918,WO93/12227,WO94/25585,WO97/13852，WO98/24884和WO99/45962,WO01/14424)。本發(fā)明的人單克隆抗體還可以利用SCID小鼠制備，該SCID小鼠中已經(jīng)重構(gòu)了人免疫細(xì)胞，以致在免疫后可產(chǎn)生人抗體反應(yīng)。所述小鼠描述于，例如，Wilson等人的美國專利Nos.5,476,996和5,698,767。術(shù)語"超變區(qū)"用于描述負(fù)責(zé)與抗原結(jié)合的抗體的氨基酸殘基。超變區(qū)包括來自"互補(bǔ)決定區(qū)"或"CDR"的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)中的殘基24-34(Ll)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區(qū)中的殘基31-35(Hl)、50-65(H2)和95-102(H3)，見Kabat等人，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))和/或來自"超變環(huán)"的殘基(即，輕鏈可變區(qū)中的殘基26-32(Ll)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)中的殘基26-32(Hl)、53-55(H2)和96-101(H3)，Chothia和LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。"框架"或"FR"殘基是超變區(qū)殘基之外的可變區(qū)殘基。在此處應(yīng)用的術(shù)語"免疫粘附素"指抗體樣分子，其將異源"粘附"蛋白(例如，受體、配體或酶)的"結(jié)合域"與免疫球蛋白恒定區(qū)的效應(yīng)器功能組合。在結(jié)構(gòu)上，免疫粘附素包括粘附素氨基酸序列與免疫球蛋白恒定區(qū)序列的融合體，該粘附素氨基酸序列具有與抗體的抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)(抗原結(jié)合位點(diǎn))不同的預(yù)期結(jié)合特異性(也就是為"異源，，的)。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定區(qū)序列優(yōu)選地來源于Yl、丫2或y4重鏈，因?yàn)榘@些區(qū)的免疫粘附素可通過蛋白A層析(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))而純化?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法純化免疫粘附素。術(shù)語"配體結(jié)合域"指任何天然細(xì)胞表面受體或其任何至少保持相應(yīng)天然受體與配體結(jié)合的性質(zhì)的區(qū)域或其衍生物。在一個特定實(shí)施方式中，受體來自具有與免疫球蛋白超基因家族中的成員同源的胞外結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞表面多肽。不屬于免疫球蛋白超基因家族的成員、但被該定義所覆蓋的其他受體包括細(xì)胞因子受體，特別是具有酪氨酸激酶活性的受體(酪氨酸激酶受體)，促紅細(xì)胞生成素和神經(jīng)生長因子受體超家族的成員，和細(xì)胞粘附分子，如(E-、L-和P-)選擇素。術(shù)語"受體結(jié)合區(qū)"用于指一種受體的任何天然配體(包括細(xì)胞粘附分子)或至少保持相應(yīng)天然配體的受體結(jié)合能力的這些天然配體的任何區(qū)域或衍生物。該定義尤其特別包括來自上述受體的配體的結(jié)合序列。"抗體-免疫粘附素嵌合體"包括將一種抗體(如此處所定義的)的至少一個結(jié)合域與至少一種免疫粘附素(如本申請所定義的)組合的分子。示例性的抗體-免疫粘附素嵌合體是Berg等人，PNAS(USA)88:4723-4727(1991)和Chamow等人，J.Immunol.153:4268(1994)描述的雙特異性CD4-IgG嵌合體。此處所用的"混合物，，包括目的多肽(期望對其進(jìn)行純化)和一種或多種污染物，也就是雜質(zhì)?；旌衔锟芍苯荧@自宿主細(xì)胞或產(chǎn)生該多肽的生物體。作為非限定性的例子，可根據(jù)本發(fā)明的方法純化的混合物包括收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和條件細(xì)胞培養(yǎng)上清液。已經(jīng)"部分純化，，的混合物已經(jīng)進(jìn)行了層析步驟，例如，非親和層析、親和層析等等。"條件混合物，，是為本發(fā)明方法中的層析步驟而制備的混合物，例如細(xì)胞培養(yǎng)上清液，所述制備包括將混合物進(jìn)行一個或多個緩沖液交換、稀釋、加鹽、pH滴定或過濾，以設(shè)定pH和/或電導(dǎo)率范圍和/或緩沖液基質(zhì)，從而獲得所需的層析性能。"條件混合物"可用于將第一層析柱上的加樣條件標(biāo)準(zhǔn)化。通常，混合物可通過多種本領(lǐng)域公知的各種分離方法獲得，例如，通過利用過濾或離心將生物反應(yīng)器反應(yīng)結(jié)束后的肉湯中的死細(xì)胞和活細(xì)胞與其他成分物理分離，或通過將細(xì)胞培養(yǎng)上清液濃縮和/或滲濾為特定的pH范圍、電導(dǎo)率和緩沖液種類濃度。術(shù)語"雜質(zhì)"和"污染物"以及其語法上的變體可互換地用于表示除了期望從含有目的蛋白質(zhì)的組合物中移出的該目的蛋白質(zhì)之外的任何物質(zhì)。污染物包括但不限于任何生物大分子例如宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(如，CHOPs)、目的蛋白質(zhì)之外的蛋白質(zhì)、核酸(如，DNA和RNA)、脂質(zhì)、糖類、內(nèi)毒素、細(xì)菌或其他微生物例如酵母、培養(yǎng)基成分，和作為在層析中使用的吸附劑的部分并可能在層析過程中進(jìn)入樣品中的任何分子，等等。術(shù)語"目的蛋白質(zhì)"和"目標(biāo)蛋白質(zhì)"可互換地用于指上述蛋白質(zhì)，例如，期望根據(jù)本發(fā)明的方法從混合物中純化的抗體。術(shù)語"宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)，，或"HCP"指表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞的代謝(細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外)產(chǎn)生的任何蛋白質(zhì)，包括任何從宿主細(xì)胞的基因組中表達(dá)的蛋白質(zhì)或重組表達(dá)的蛋白質(zhì)，不考慮目標(biāo)蛋白質(zhì)。宿主細(xì)胞可以是任何能夠表達(dá)目標(biāo)蛋白質(zhì)的細(xì)胞，特別是哺乳動物(如，CHO和鼠骨髓瘤細(xì)月包系例如NSO)、昆蟲、細(xì)菌、植物和酵母細(xì)胞系。在本發(fā)明的一個特定實(shí)施方式中，HCP是"中國倉鼠卵巢細(xì)胞蛋白質(zhì)"，或"CHOP，,，其指任何來源于中國倉鼠卵巢("CHO")細(xì)胞培養(yǎng)物的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)("HCP")。HCP通常作為包含目的蛋白質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基或裂解液[例如，收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液("HCCF，)]中的雜質(zhì)存在。包含目的蛋白質(zhì)的混合物中存在的HCP的量提供了一種對目的蛋白質(zhì)純度的度量。通常，蛋白質(zhì)混合物中HCP的量以相對于該混合物中目的蛋白質(zhì)含量的百萬分比來表示。術(shù)語"百萬分比，，或"ppm"在此可互換地用于指通過本發(fā)明的方法純化的目的蛋白質(zhì)的純度的度量。單位ppm,對于溶液中的蛋白質(zhì)，指相對于以毫克/毫升表示的目的蛋白質(zhì)，以納克/毫升表示的HCP的量(也就是，如下文實(shí)施例所述，HCPppm=(CHOPng/ml)/(目的蛋白質(zhì)mg/ml))。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被干燥，例如凍干時(shí)，ppm指(HCPng)/(目的蛋白質(zhì)mg)。肽和一種或多種雜質(zhì)的混合物中的至少一種雜質(zhì)，因而提高了該組合物中多肽的純度水平(也就是，降低了該組合物中雜質(zhì)的含量(ppm))。根據(jù)本發(fā)明，純化用兩個非親和層析步驟和非過程中TFF步驟進(jìn)行。本發(fā)明的一種方法可純化目的蛋白質(zhì)，以獲得含有少于100ppm的HCP、優(yōu)選少于90ppm、少于80ppm、少于70ppm、少于60ppm、少于50ppm、少于40ppm、少于30ppm、少于20ppm、少于10ppm、或少于5ppm的HCP的產(chǎn)品，其通過ELISA測定。如此處所用的術(shù)語"分離"及其語法上的變體是指從其他物質(zhì)中分離純化的目的蛋白質(zhì)，例如，從用于純化目的蛋白質(zhì)的柱或樹脂中分離，以獲得均質(zhì)的組成，其包含基本沒有污染物、雜質(zhì)和其他物質(zhì)的目的蛋白質(zhì)。術(shù)語"層析，，是指通過在該方法的特定緩沖條件下使混合物流經(jīng)吸附劑而將混合物中的目的溶質(zhì)如目的蛋白質(zhì)從混合物中的其他溶質(zhì)中分離的方法，由于溶質(zhì)的性質(zhì)例如pl、疏水性、大小和結(jié)構(gòu)，該吸附劑或多或少地有效吸附或保留該溶質(zhì)。"吸附劑"是任何能夠通過與目的分子直接相互作用或與附著到吸附劑上的化合物相互作用而將另一種物質(zhì)吸附到其表面上的固態(tài)并固定的物質(zhì)。在各種類型的層析中有用的吸附劑在本領(lǐng)域是公知的并且通過商業(yè)途徑可以容易地獲得。術(shù)語"親和層析"和"蛋白質(zhì)親和層析"可互換地用來指一種蛋白質(zhì)分離技術(shù)，其中目的蛋白質(zhì)可逆并特異性地與生物特異性配體結(jié)合，通常作為空間互補(bǔ)性和一種或多種化學(xué)相互作用的組合，如結(jié)合位點(diǎn)處的靜電力、氫鍵、疏水力和/或范德華力。這些相互作用不是歸因于分子的通常性質(zhì)例如等電點(diǎn)、疏水性或大小，而是目的分子與配體的特異性相互作用的結(jié)果，所述配體例如是適于蛋白A和抗體相互作用的精確的疏水性蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域。蛋白A是吸附劑的一個例子，其可被固定到固體支持物上，如用于結(jié)合含F(xiàn)c區(qū)的分子的瓊脂糖。見Ostrove(1990),GuidetoProteinPurification,MethodsofEnzymology182:357-379，其全文在此引入作為參考。可使用任何配體純化其相應(yīng)的特異性結(jié)合蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，生物特異性配體與層析固相物質(zhì)共價(jià)結(jié)合，并且當(dāng)溶液接觸該層析固相物質(zhì)時(shí)可與溶液中目的蛋白質(zhì)(如，抗體、酶或受體蛋白質(zhì))接觸。目的蛋白質(zhì)在層析過程中保持與生物特異性配體(例如，抗原、底物、輔因子或激素)的特異性結(jié)合親和性，同時(shí)混合物中的其他溶質(zhì)和/或蛋白質(zhì)不與配體可檢測地或特異性地結(jié)合。目的蛋白質(zhì)與固定配體的結(jié)合允許污染蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)雜質(zhì)通過層析介質(zhì)，同時(shí)目的蛋白質(zhì)保持與固相物質(zhì)上的固定配體特異性結(jié)合。然后利用低pH、高pH、低鹽、高鹽、竟?fàn)幮耘潴w等從固定配體上去除特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，并與洗脫緩沖液一起通過層析柱。也可能存在相對于目的蛋白質(zhì)具有較低相對濃度的污染蛋白質(zhì)和其他類型的污染物例如核酸和內(nèi)毒素，其4交早地通過柱子。術(shù)語"特異性結(jié)合，，和"結(jié)合特異性，，及其語法上的變體描述目的蛋白質(zhì)與配體之間的通常特異性且可逆的相互作用，其需要蛋白質(zhì)和配體結(jié)構(gòu)在結(jié)合位點(diǎn)處的空間互補(bǔ)性與結(jié)合位點(diǎn)處的一種或多種靜電力、氫鍵、疏水力和/或范德華力的組合作用。配體應(yīng)該具有允許其與基質(zhì)附著而不破壞其結(jié)合活性的化學(xué)可修飾基團(tuán)。配體與結(jié)合物質(zhì)的理想的親和力為在自由溶液中10-4到1(T8M。空間互補(bǔ)性越大以及在結(jié)合位點(diǎn)處的其他力越強(qiáng)，蛋白質(zhì)與其相應(yīng)配體的結(jié)合特異性也越大。特異性結(jié)合的非限制性實(shí)例包括抗體-抗原結(jié)合、酶-底物結(jié)合、酶-輔因子結(jié)合、金屬離子螯合、DNA結(jié)合蛋白-DNA結(jié)合、調(diào)節(jié)蛋白-蛋白質(zhì)相互作用等。術(shù)語"非親和層析"和"非親和純化"指不使用親和層析但需要溶質(zhì)(如目的蛋白質(zhì))與吸附劑基質(zhì)之間的非特異性結(jié)合相互作用的純化步驟。此處使用的術(shù)語"非特異性結(jié)合"指目的蛋白質(zhì)與配體或其他化合物之間的相互作用，所述配體或其他化合物通過在相互作用位點(diǎn)處的非特異性相互作用，例如通過靜電力、氫鍵、疏水力和/或范德華力，與固相基質(zhì)結(jié)合，但是缺乏增強(qiáng)非結(jié)構(gòu)力例如親和(特異性)結(jié)合的效果的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性。依賴于非特異性結(jié)合而不是親和性的層析方法的例子包括離子交換層析(例如，陰離子和陽離子交換)和疏水電荷誘導(dǎo)層析。術(shù)語"疏水電荷誘導(dǎo)層析"(或"HCIC")是一種混合模式的層析方法，其中混合物中的目的蛋白質(zhì)在沒有添加鹽(例如，易溶鹽)的情況下通過溫和的疏水相互作用與雙模式(即，具有一種結(jié)合模式和另一種洗脫模式)可離子化配體結(jié)合[見Boschetti等人，2000,GeneticEngineeringNews20(13)]。"疏水電荷誘導(dǎo)層析樹脂"是包含配體的固相，所述配體具有親^L效應(yīng)(即，利用親碌u層析的性質(zhì))、疏水性以及用于其分離能力的可離子化基團(tuán)的組合性質(zhì)。因此，一種在本發(fā)明的方法中使用的HCIC樹脂包含在中性(生理學(xué)上的)或微酸性pH,例如大約pH5到10,優(yōu)選大約pH6到9.5時(shí)可離子化并且適度疏水性的配體。在此pH范圍里，配體大部分不帶電荷，通過溫和的非特異性疏水相互作用與目的蛋白質(zhì)結(jié)合。當(dāng)pH降低時(shí)，配體獲得電荷，由pH轉(zhuǎn)移引起的對溶質(zhì)的靜電荷排斥使疏水結(jié)合破壞。適用于HCIC的配體的例子包括任何可離子化的芳香族或雜環(huán)結(jié)構(gòu)(例如，具有吡啶結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，如2-氨甲基吡啶、3-氨甲基他啶、4-氨曱基吡啶、2-巰基吡啶、4-巰基吡啶、或4-巰基乙基嘧啶、巰基酸、巰基醇、基于咪唑基的、巰基曱基咪唑、2-巰基苯并咪唑、氨甲基苯并咪唑、組胺、巰基苯并咪唑、二乙氨基丙胺、氨丙基嗎啉、氨丙基咪唑、氨基己酸、硝基羥基苯曱酸、硝基酪氨酸/乙醇胺、二氯水楊酸、二溴酪胺、氯代羥基苯基乙酸、羥苯基乙酸、酪胺、苯硫酚、谷胱甘肽、硫酸氬鹽、染料，包括其衍生物，見Burton和Harding,JournalofChromatographyA814:81-81(1998)和Boschetti,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods49:361-389(2001)，其全文在此引入作為參考)，這些物質(zhì)在連接臂和/或配體結(jié)構(gòu)上具有脂肪族鏈和至少一個硫原子。HCIC樹脂的例子包括MEPHYPERCEL(PallCorporation;EastHills，NY).。術(shù)語"離子交換，，和"離子交換層析"指一種層析方法，其中目的可離子化溶質(zhì)(例如，混合物中的目的蛋白質(zhì))在適當(dāng)?shù)膒H和電導(dǎo)率的條件下與連接(例如通過共價(jià)連接)于固相離子交換物質(zhì)上的帶有相反電荷的配體相互作用，以致目的溶質(zhì)以強(qiáng)于或弱于混合物中雜質(zhì)或污染物的作用力與該帶電荷化合物發(fā)生非特異性相互作用。混合物中的污染溶質(zhì)可比目的溶質(zhì)更快或更慢地從離子交換材料柱上洗去或者與樹脂結(jié)合或從樹脂上除去。"離子交換層析"特別包括陽離子交換、陰離子交換以及混合模式層析。短語"離子交換物質(zhì)"指帶負(fù)電荷的固相(即陽離子交換樹脂)或帶正電荷的固相(即陰離子交換樹脂)。在一個實(shí)施方式中，可通過將一種或多種帶電配體(或吸附劑)附著到固相上(例如通過共價(jià)連接)而提供電荷。可替代地，或者除此之外，電荷可以是固相固有的性質(zhì)(例如，如在硅石的例子中，其總體上帶負(fù)電荷)。"陽離子交換樹脂，，指具有負(fù)電荷的固相，并且其具有可與通過或穿過該固相的水溶液中的陽離子交換的自由陽離子。可以使用任何附著于適于形成陽離子交換樹脂的固相上的帶負(fù)電配體，例如，羧酸鹽、磺酸鹽以及下述的其他物質(zhì)。商業(yè)上可以獲得的陽離子交換樹脂包括，但不限于，例如，具有以下基團(tuán)的物質(zhì)磺酸基基團(tuán)(如，MonoS、MiniS、Source15S和30S、SPSepharoseFastFlow,來自GEHealthcare的SPSepharoseHighPerformance,來自Tosoh的ToyopearlSP-650S和SP-650M，來自BioRad的Macro-PrepHighS，來自PallTechnologies的CeramicHyperDS、TrisacrylM和LSSP和SpherodexLSSP));基于磺乙基(sulfoethyl)的基團(tuán)(如，來自EMD的FractogelSE,來自AppliedBiosystems的PorosS-10和S畫20);基于磺丙基的基團(tuán)(如，來自Tosoh的TSKGelSP5PW和SP-5PW-HR,來自AppliedBiosystems的PorosHS-20和HS50))));基于石黃異丁基的基團(tuán)(如，來自EMD的FractogelEMDS03);基于次硫酸乙基(sulfoxyethyl)的基團(tuán)(如，來自Whatman的SE52、SE53和Express-IonS);基于羧甲基的基團(tuán)(如，來自GEHealthcare的CMSepharoseFastFlow,來自BiochromLabsInc.的HydrocellCM,來自BioRad的Macro-PrepCM，來自PallTechnologies的CeramicHyperDCM、TrisacrylMCM、TrisacrylLSCM,來自Milipore的MatrxCellufmeC500和C200，來自Whatman的CM52、CM32、CM23和Express—IonC，來自Tosoh的ToyopearlCM畫650S、CM-650M和CM-650C);基于^黃酸基和羧酸的基團(tuán)(如，來自丄T.Baker的BAKERBONDCarboxy-Sulfon);基于羧酸的基團(tuán)(如，來自J.TBaker的WPCBX,來自DowLiquidSeparations的DOWEXMAC-3，來自Sigma-Aldrich的Amberlite弱陽離子交換劑、DOWEX弱陽離子交換劑和Diaion弱陽離子交換劑，以及來自EMD的FractogelEMDCOO-);基于磺酸的基團(tuán)(如，來自BiochromLabsInc的HydrocellSP，來自DowLiquidSeparations的DOWEX細(xì)篩強(qiáng)酸陽離子樹脂,來自J.T,Baker的UNOsphereS，WPSulfonic,來自Sartorius的SartobindS膜，來自Sigma-Aldrich的Amberlite強(qiáng)陽離子交換劑、DOWEX強(qiáng)陽離子和Diaion強(qiáng)陽離子交換劑);和基于正磷酸的基團(tuán)(^口，來自Whatman的Pll)。"陰離子交換樹脂，，指帶有正電荷因而其上附著有一種或多種正電荷配體的固相。任何附著于適于形成陰離子交換樹脂的固相上的正電荷配體都可使用，例如季氨基。商業(yè)上可以獲得的陰離子交換樹脂包括來自AppliedBiosystems的DEAE纖維素、PorosPI20、PI50、HQ10、HQ20、HQ50、D50,來自Sartorius的SartobindQ,MonoQ、MiniQ、Source15Q和30Q、Q、DEAE和ANXSepharoseFastFlow、QS印harosehighPerformance,QAESEPHADEX和FASTQSEPHAROSETM(GEHealthcare),來自J.T.Baker的WPPEI、WPDEAM、WPQUAT,來自BiochromLabInc的HydrocellDEAE和HydrocellQA.,來自Biorad的UNOsphereQ、Macro-PrepDEAE和Macro-PrepHighQ,來自PallTechnologies的CeramicHyperDQ、ceramicHyperDDEAE、TrisacrylM和LSDEAE、SpherodexLSDEAE、QMASpherosilLS、QMASpherosilM和MustangQ,來自DowLiquidSeparations的DOWEX細(xì)篩強(qiáng)堿I型和II型陰離子樹脂和DOWEXMONOSPHERE77、弱;威陰離子，來自Millipore的Interc印tQ膜、MatrexCdlufineA200、A500、Q500和Q800，來自EMD的FractogelEMDTMAE、FractogelEMDDEAE和FmctogelEMDDMAE,來自Sigma-Aldrich的AmberliteI型和II型弱強(qiáng)陰離子交換劑、DOWEXI型和II型弱強(qiáng)陰離子交換劑、DiaionI型和II型弱強(qiáng)陰離子交換劑、Duolite，來自Tosoh的TSKgelQ和DEAE5PW和5PW-HR、Toy叩earlSuperQ-650S、650M和650C、QAE畫550C和650S、DEAE-650M和650C,來自Whatman的QA52、DE23、DE32、DE51、DE52、DE53、Express-IonD和Express-IonQ。"混合模式離子交換樹脂"指利用陽離子、陰離子和/或疏水部分共價(jià)修飾的固相。混合模式離子交換樹脂的例子包括BAKERBONDABXTM(J.T.Baker;Phillipsburg，NJ)、陶瓷羥磷灰石I型和II型和氟化羥磷灰石(BioRad;Hercules,CA)和MEP和MBIHyperCel(PallCorporation;EastHills,NY)。術(shù)語"親硫的，，指蛋白質(zhì)具有的對緊密靠近硫醚基團(tuán)的砜基的選擇性(Porath等人，1985)。"親疏層析，，也被稱為"親硫吸附層析"，是一類非親和層析，其中含有親硫區(qū)域和芳香族氨基殘基的目的蛋白質(zhì)與用于分離該蛋白質(zhì)的含硫配體結(jié)合。親硫凝膠可通過用(3-巰基乙醇還原二乙烯砜(與Sepharose4B偶聯(lián))而制備。親硫吸附層析基于電子供體-受體性質(zhì)并與基于疏水性的層析明顯不同。不與親硫吸附劑發(fā)生疏水性結(jié)合和離子相互作用，因?yàn)榱?乙基砜結(jié)構(gòu)沒有顯著的疏水性或離子電荷。商業(yè)上可以獲得的親硫?qū)游鰳渲‵ractogelEMDTA(Merck;Rahway,NJ)、Uniflow和Superflow樹脂(Clontech)和T-Gel(Pierce)。術(shù)語"固相"用于表示任何非水基質(zhì)，一種或多種配體可附著于其上，或者，在大小排斥層析中，其可指樹脂的凝膠結(jié)構(gòu)。固相可以是任何能夠以這樣方式附著配體的基質(zhì)，例如，純化柱、離散粒子的不連續(xù)相、膜、濾器、凝膠，等等。可用于形成固相的物質(zhì)的例子包括多糖(例如瓊脂糖和纖維素)和其他機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)例如硅石(如可控孔玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯酰胺、陶瓷粒子及其普通技術(shù)人源可以選擇適當(dāng)?shù)墓滔辔镔|(zhì)用于本發(fā)明。術(shù)語"去污劑"指離子、兩性離子和非離子表面活性劑，其對于防止蛋白質(zhì)的聚集以及防止污染物與目的蛋白質(zhì)的非特異性相互作用或結(jié)合是有用的，可以在用于本發(fā)明的多種緩沖液中存在，所述緩沖液包括凈化、平衡、上樣、上樣后清洗、洗脫或清除緩沖液。在特別的實(shí)施方式中，可將去污劑加到清洗緩沖液中?？捎糜诒景l(fā)明的去污劑的例子包括但不限于聚山梨醇酯(如，聚山梨醇酯20或80);泊洛沙姆(poloxamers)(泊洛沙姆188);Triton;十二烷基硫酸鈉(SDS);月桂基硫酸鈉；辛基糖苷鈉；月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-、或硬脂酰-硫代甜菜堿；月桂基-、肉豆蔻基-、亞油基-、或硬脂酰-肌氨酸；亞油基-、肉豆蔻基-、或鯨蠟基-甜菜堿；月桂酰胺丙基-、椰油酰胺丙基-、亞油酰胺丙基-、肉豆蔻酰胺丙基-、棕櫚酰胺丙基-、或異硬脂酰胺丙基-甜菜堿(例如月桂酰胺丙基)；肉豆蔻酰胺丙基-、棕櫚酰胺丙基-、或異硬脂酰胺丙基-二曱胺；甲基椰油基牛磺酸鈉或曱基油基?；撬岫c；M0NAQUAT系列(MonaIndustries,Inc.,Paterson,N丄)；IgepalCA-630、Plu腦ic、Triton、BRIJ、AtlasG2127、Genapol、HECAMEG、LUBROLPX、MEGA、NP、THESIT、TOPPS、CHAPS、CHAPS0、D畫AU、EMPIGENBB、AWITTERGENT和C12E8。去污劑可添加到任何有用的緩沖液中，還可包含在含有目的分子的料液中。去污劑可以任何適于蛋白質(zhì)純化方法的量存在，例如，從大約0.001%到大約20%，典型地從大約0.01%到大約1%。在一個特別的實(shí)施方式中，在用于CEXC的清洗緩沖液中使用聚山梨醇酯80。本發(fā)明中使用的"緩沖液"是通過其酸-堿偶合成分阻止添加酸或堿引起的pH變化的溶液。多種緩沖液可用于本發(fā)明的方法中，取決于緩沖液的所需pH和純化方法的具體步驟[見Buffers.AGuideforthePreparationandUseofBuffersinBiologicalSystems,Gueffroy,D.，ed.CalbiochemCorporation(1975)]?？捎糜诳刂票景l(fā)明方法所需pH范圍的緩沖液成分的非限制性實(shí)例包括醋酸鹽、檸檬酸鹽、組氨酸、磷酸鹽、銨緩沖液例如醋酸銨、琥珀酸鹽、MES、CHAPS、MOPS、MOPSO、HEPES、Tris等，以及下列物質(zhì)的組合TRIS-蘋果酸-NaOH、馬來酸鹽、氯代醋酸鹽、曱酸鹽、苯甲酸鹽、丙酸鹽、吡口定、哌。秦、ADA、PIPES、ACES、BES、TES、tricine、N-二(羥乙基)甘氨酸、TAPS、乙醇胺、CHES、CAPS、甲胺、哌啶、O-硼酸、碳酸、乳酸、丁二酸、二乙基丙二酸、雙甘氨肽、HEPPS、HEPPSO、咪唑、苯酚、POPSO、琥珀酸鹽、TAPS、基于胺的、芐胺、三曱基或二曱基或乙基或苯基胺、乙二胺、或嗎啉。需要時(shí)緩沖液中也可含有其他成分(添加劑)，例如，可用鹽調(diào)節(jié)緩沖液的離子強(qiáng)度，例如，氯化鈉、」琉酸鈉和氯化鉀；以及其他添加劑，例如氨基酸(如甘氨酸和組氨酸)、離液劑(如尿素)、醇(如乙醇、甘露醇、甘油、千醇)、去污劑(見上文)、以及糖(例如蔗糖、甘露醇、麥芽糖、海藻糖、葡萄糖和果糖)。緩沖液成分和添加劑以及使用濃度可根據(jù)本發(fā)明使用的層析類型而改變。緩沖液的pH和電導(dǎo)率可根據(jù)純化方法中使用緩沖液的步驟而改變。在CEXC中，根據(jù)純化步驟和使用的緩沖液，緩沖液的pH可在3至U10之間，更優(yōu)選從大約pH4.0到8.0，電導(dǎo)率可從大約0.1到40mS/cm,更優(yōu)選從大約0.5到15mS/cm。在HCIC中，根據(jù)純化步驟和使用的緩沖液，緩沖液的pH可從大約3到10,更優(yōu)選從大約pH4.0到9.0，電導(dǎo)率可從大約0.0(WFI,注射用水)到90.0mS/cm,更優(yōu)選從大約0.1到9.0mS/cm。在整個純化方法中使用的緩沖液將在下文對每個層析步驟更詳細(xì)地描述。"凈化"溶液一般用于在純化步驟之前通過除去任何結(jié)合的污染物例如生物來源的污染物而清潔樹脂。只要與根據(jù)本發(fā)明的方法選擇的特定柱和樹脂兼容，任何期望的緩沖液都可用于此目的。優(yōu)選地，凈化溶液的pH較高，例如，pH10或更高，更優(yōu)選pHll或更高，更優(yōu)選pH12或更高；可替代地，凈化溶液的pH可以較低，例如pH4或更低，更優(yōu)選pH3或更低。在一個特定實(shí)施方式中，HCIC和CEXC柱用包含1NNaOH，pH212的凈化溶液來清洗。"平衡緩沖液"用于在用含有待純化的目的蛋白質(zhì)的混合物裝柱之前調(diào)節(jié)層析柱的pH和電導(dǎo)率?？捎糜诖四康牡倪m合的緩沖液在本領(lǐng)域是熟知的，例如，上述緩沖液，并包括其pH值與用于純化目的蛋白質(zhì)的層析步驟中選擇使用的樹脂相容的任何緩沖液。這種緩沖液用于裝載包括目的多肽的混合物。平衡緩沖液的電導(dǎo)率和/或pH為使得目的多肽與樹脂結(jié)合或目的蛋白質(zhì)流經(jīng)柱子而一種或多種雜質(zhì)與柱子結(jié)合。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，層析柱的平tf在平tf緩沖液的pH和電導(dǎo)率分別在土0.2和±0.4mS/cm以內(nèi)時(shí)完成，更優(yōu)選分別在土O.l和±0.2mS/cm以內(nèi)時(shí)完成。在優(yōu)選實(shí)施方式中，用于CEXC和HCIC的平衡緩沖液的種類是基于磷酸鈉的。在CEXC中，平衡緩沖液的pH為大約3到大約9，更優(yōu)選為大約4.0到8.0，電導(dǎo)率為大約0.1到大約40mS/cm，更優(yōu)選為大約0.5到10.0mS/cm。在HCIC中，平衡緩沖液的pH為大約5到大約10，更優(yōu)選pH為大約6到9，電導(dǎo)率為大約0.0(WFI)到大約90mS/cm，更優(yōu)選電導(dǎo)率為大約2.0到9mS/cm。"上樣緩沖液，，用于將含目的蛋白質(zhì)的混合物上樣到柱子上。任何適當(dāng)?shù)娜芤憾伎捎米魃蠘泳彌_液。本方法的上樣緩沖液的電導(dǎo)率和pH選擇為使得目的蛋白質(zhì)與樹脂結(jié)合而污染物可以流過柱子。優(yōu)選地，上樣緩沖液可以是交換的緩沖液。上樣緩沖液也可以由前一純化步驟獲得的緩沖液混合物例如洗脫緩沖液來制備。適合作為上樣緩沖液用于選擇的樹脂的緩沖液在本領(lǐng)域是公知的，例如，上述的那些緩沖液。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)該認(rèn)識到，用于CEXC和HCIC的上樣緩沖液可以與上述用于CEXC和HCIC的平衡緩沖液相當(dāng)(如果不相同的話)的pH和電導(dǎo)率使用。在此使用的術(shù)語"清洗緩沖液，，或"上樣后清洗液，，指用于在洗脫目的蛋白質(zhì)前從離子交換樹脂中洗脫一種或多種雜質(zhì)的緩沖液。術(shù)語"清洗"及其語法上的變體用于描述適當(dāng)?shù)那逑淳彌_液通過或穿過層析樹脂。有利地，清洗、平衡和上樣緩沖液可以是相同的，但這不是必需的。緩沖液的pH和電導(dǎo)率被設(shè)置成一種或多種雜質(zhì)從樹脂上洗脫下來而樹脂保留目的多肽。需要時(shí)，清洗緩沖液可以含有如上所述的去污劑，例如聚山梨醇酯。其pH適于選擇的樹脂的任何合適的緩沖液可以用于純化目的蛋白質(zhì)，例如上述的緩沖液。清洗緩沖液的pH和電導(dǎo)率的選擇對于在不顯著洗脫目的蛋白質(zhì)的情況下除去HCPs和其他污染物是重要的。為了在洗脫步驟之前除去比目的蛋白質(zhì)更親水性和更酸性或堿性的污染物并降低系統(tǒng)的電導(dǎo)率，在混合物上樣后，在用于HCIC和CEXC層析的后續(xù)清洗步驟中使用的清洗緩沖液的電導(dǎo)率和pH可以降低或保持或升高。在一個特別的實(shí)施方式中，HCIC層析中僅僅電導(dǎo)率降低，CEXC的上樣后清洗不包括任何用于平衡、上樣和上樣后清洗的緩沖液的pH或電導(dǎo)率的改變。在一個特定實(shí)施方式中，用于CEXC的清洗緩沖液是磷酸鈉。用于CEXC的清洗緩沖液的pH可以是從大約3到大約9,更優(yōu)選的pH是從約4.0到約8.0,電導(dǎo)率為大約0.1到大約40mS/cm,更優(yōu)選的電導(dǎo)率是從大約0.5到大約10mS/cm。用于HCIC的清洗緩沖液可以是用于獲得期望的pH和電導(dǎo)率的任何適當(dāng)?shù)木彌_液，可選自上述的緩沖液。在一個特定實(shí)施方式中，用于HCIC的清洗緩沖液是磷酸鈉。用于HCIC的清洗緩沖液的pH可為大約5到大約10,更優(yōu)選的pH是從大約6到大約9，電導(dǎo)率為大約0.0(WFI)到大約90mS/cm,更優(yōu)選的電導(dǎo)率為大約0.1到大約9mS/cm。如此處所用的術(shù)語"洗脫緩沖液，，指用于從固相(即，層析樹脂)中洗脫目的蛋白質(zhì)的緩沖液。術(shù)語"洗脫"及其語法上的變體指通過利用適當(dāng)?shù)臈l件從層析物質(zhì)中去除一種分子，例如目的蛋白質(zhì)，所述條件例如是，通過改變圍繞層析物質(zhì)的緩沖液的離子強(qiáng)度或pH,通過添加配體的竟?fàn)幮苑肿?，通過改變分子的疏水性，或通過改變配體的化學(xué)性質(zhì)(如，電荷)，以致目的蛋白質(zhì)不能與樹脂結(jié)合因而從層析柱上洗脫下來。術(shù)語"洗出液"指當(dāng)對柱子進(jìn)行洗脫時(shí)從柱子上洗下的含有目的多肽的流出液。在目的多肽洗脫后，柱子可根據(jù)需要進(jìn)行再生、凈化和儲存。選擇洗脫緩沖液的pH和電導(dǎo)率，以使目的蛋白從本方法使用的特定CEXC或HCIC樹脂上洗脫下來。適于用作洗脫緩沖液的緩沖液如上所述。在一個特定實(shí)施方式中，用于CEXC和HCIC層析的洗脫緩沖液分別是磷酸鈉和乙酸鈉。用于CEXC的洗脫緩沖液的pH可為大約3.0到大約10，更優(yōu)選的pH為大約4到8，電導(dǎo)率為大約0.1到大約40mS/cm，更優(yōu)選的電導(dǎo)率為大約5到大約15mS/cm。用于HCIC的洗脫緩沖液的pH可為大約3.0到大約7.0,更優(yōu)選的pH為大約4.0到大約6.0,電導(dǎo)率為大約0.0(WFI)到大約20mS/cm,更優(yōu)選的電導(dǎo)率為大約0.1到大約2mS/cm。如果期望，可以使用另外的溶液處理柱子以重新使用。例如，可以使用"再生溶液，，從純化方法使用的柱子上"清除"或除去緊密結(jié)合的污染物。典型地，再生溶液具有足以從樹脂上基本去除任何殘存雜質(zhì)和目的蛋白質(zhì)的電導(dǎo)率和pH。此處使用的術(shù)語"電導(dǎo)率，，指水溶液在特定溫度下在兩個電極之間傳導(dǎo)電流的能力。電流通過離子轉(zhuǎn)運(yùn)在溶液中流動。因此，隨著水溶液中存在的離子量的增加，溶液將具有更高的電導(dǎo)率。在本發(fā)明的一種方法中，在特定pH范圍內(nèi)，一般進(jìn)行純化的溫度是從大約4到大約37°C,更優(yōu)選大約15到大約25°C。電導(dǎo)率的測量單位是毫西門子每厘米(mS/cm),可利用標(biāo)準(zhǔn)電導(dǎo)儀進(jìn)行測量。溶液的電導(dǎo)率可通過改變其中離子的濃度而改變。例如，可改變?nèi)芤褐械木彌_液試劑的濃度和/或鹽(例如，NaCl或KC1)的濃度，以獲得期望的電導(dǎo)率。優(yōu)選地，如下面實(shí)施例所述改變鹽濃度以獲得期望的電導(dǎo)率。多肽的"pl"或"等電點(diǎn)"指多肽的正電荷與負(fù)電荷平衡時(shí)的pH?？筛鶕?jù)多種常規(guī)方法計(jì)算pl,例如，根據(jù)多肽上氨基酸和/或唾液酸殘基的凈電荷或通過等電位聚焦來計(jì)算。如此處所用的"低pH保持"(lowpHhold)是指含目的蛋白質(zhì)的洗出液的pH的降低，其中pH降低至低于大約pH5.0,優(yōu)選低于大約pH4.0,更優(yōu)選低于大約pH3.7，最優(yōu)選大約pH3.4到大約3.6,以達(dá)到病毒滅活(即，病毒滴度至少降低2log，更優(yōu)選至少降低31og)，隨后升高pH,以制備用于第二層析步驟的洗出液或?qū)a(chǎn)物帶至為目的產(chǎn)品的分子完整性提供穩(wěn)定性的基質(zhì)中。任何適當(dāng)?shù)乃峥蓱?yīng)用于含目的蛋白質(zhì)的洗出液中以降低pH進(jìn)行低pH保持，例如，INHCI或冰醋酸。任何適當(dāng)?shù)膲A可應(yīng)用于洗出液以將其pH還原至更中性的范圍，如，INNaOH或INTris。低pH保持一l殳導(dǎo)致電導(dǎo)率上升至少0.5mS/cm。如果低pH保持在第一層析步驟后發(fā)生并且第二層析步驟是陽離子交換層析，則很可能pH的升高在適當(dāng)?shù)膒H范圍內(nèi)，大約3.0到9.0,優(yōu)選大約4.0-8.0。如果低pH保持發(fā)生在第一層析步驟之后并且第二層析步驟是HCIC，則pH的升高可能在適于HCIC的pH范圍之內(nèi)，大約pH5到大約pHlO.O，優(yōu)選大約pH6.0到大約9.0。低pH保持也可發(fā)生在第二層析步驟之后，但在本發(fā)明的方法中出于實(shí)驗(yàn)便利的考慮選擇發(fā)生在層析步驟之間。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，低pH保持步驟不是獲得本發(fā)明的方法可達(dá)到的純度水平的關(guān)鍵。"切向流過濾，，或"TFF"或"橫向流過濾"是指一種過濾方法，其中樣品混合物在膜的頂部循環(huán)，同時(shí)施加的壓力使某些溶質(zhì)和小分子穿過該膜。在TFF中，溶液一般與濾膜平行地流動。膜兩邊的壓力差導(dǎo)致液體和可濾過溶質(zhì)(其分子量小于膜或有類似的性質(zhì)，如球蛋白)穿過濾器。這可作為連續(xù)流方法進(jìn)行，因?yàn)槿芤悍磸?fù)地在膜上流過，而穿過濾器的液體^皮連續(xù)地抽入獨(dú)立的循環(huán)中。在HPTFF(高效切向流過濾)中，膜帶有電荷，因此利用分子的大小和電荷來分離污染物(見美國專利公開No.2003/0229212)。如果需要，TFF可用于交換緩沖液，其中目的蛋白質(zhì)在本發(fā)明方法開始之前溶于另一種更適于結(jié)合到層析樹脂上的緩沖液中。換句話說，TFF可在第一層析步驟之前使用，然而，過程中TFF步驟(即，TFF發(fā)生在兩個層析步驟之間)不是必需的，因?yàn)楸痉椒ㄊ褂玫木彌_液和樹脂允許直接從一個樹脂運(yùn)動到另一個樹脂。如此處所用的"過程中"是指在本發(fā)明的方法中，在開始第一層析柱的上樣步驟之后，但在收集第二層析柱的洗脫峰之前進(jìn)行的任何方法、步驟、操作等等。過程中方法可直接導(dǎo)致純度的變化(如過程中TFF)或不直接導(dǎo)致純度的變化(例如pH和/或電導(dǎo)率的調(diào)整，調(diào)整的結(jié)果并不直接導(dǎo)致任何純度的改變)?？善谕帽景l(fā)明的方法獲得治療級的蛋白質(zhì)純度，其中任選地可以使用本領(lǐng)域/>知的附加步驟來獲得對于外來和內(nèi)源病毒的病毒清除能力，如，低pH滅活和病毒過濾方法(包括特定的用于諸如VRCUNO(CUNO)或DV20等病毒的帶電膜濾過(PallTechnologies)),這將在下文中進(jìn)一步描述。如此處所用的"深度過濾"是一種使用深度濾器的過濾方法，其典型的特征是其設(shè)計(jì)為在過濾基質(zhì)中保留顆粒。深度濾器的能力一般用深度(如，IO"或20"的基質(zhì))、因而用保持固體的能力來定義。在本發(fā)明的一種方法中，深度濾器可用于提高純化方案的病毒清除能力，然而這是任選的步驟，對于獲得本發(fā)明方法的純度水平并不是必需的。用于去除病毒的深度濾器可在純化方案中的任何時(shí)間點(diǎn)上使用，但出于濾器成本的考慮優(yōu)選地在第一層析步驟之后使用，此時(shí)處理體積較低。方法的描述在本發(fā)明的方法中，CEXC和HCIC可以按任何順序^f吏用，以將目的蛋白質(zhì)純化為少至大約100ppm或更少的HCP,以及高達(dá)99%或更高的單體純度。不需要另外的層析步驟即可獲得這樣高水平的純度。目的蛋白質(zhì)可由被基因工程化為產(chǎn)生該蛋白質(zhì)的活宿主細(xì)胞產(chǎn)生。將細(xì)胞基因工程化以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法在本領(lǐng)域是公知的。見例^口,Ausabel等人，eds.(1990)，CurrentProtocolsinMolecularBiology(Wiley，NewYork)和美國專利Nos.5,534,615和4,816,567，每篇都特別在此引入作為參考。所述的方法包括將編碼蛋白質(zhì)并允許其表達(dá)的核酸導(dǎo)入到活的宿主細(xì)胞中。這些宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、或優(yōu)選培養(yǎng)生長的動物細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞包括但不限于大腸桿菌細(xì)胞。合適的大腸桿菌菌一朱的例子包括HB101、DH5a、GM2929、JM109、KW251、NM53S、NM539，以及任何不能切割外源DNA的大腸桿菌菌抹?？衫玫恼婢拗骷?xì)胞包括但不限于釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母和曲霉細(xì)胞?？衫玫膭游锛?xì)胞系的例子是CHO、VERO、DXBll、BHK、HeLa、Cos、MDCK、293、3T3、NSO和WI138。新的動物細(xì)胞系可利用本領(lǐng)域4支術(shù)人員熟知的方法建立(如，通過轉(zhuǎn)化、病毒感染和/或篩選)。在特定實(shí)施方式中，目的蛋白質(zhì)在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生(見，例如WO94/11026)。CHO細(xì)胞的各種類型在本領(lǐng)域是已知的，例如，CHO-Kl、CHO-DG44、CHO-DXB11、CHO/dhfr和CHO畫S。從細(xì)胞碎片制備用于純化蛋白質(zhì)的混合物首先依賴于蛋白質(zhì)的表達(dá)方法。一些蛋白質(zhì)直接從細(xì)胞分泌到周圍的生長培養(yǎng)基中，而其他蛋白質(zhì)保留在細(xì)胞內(nèi)。對于細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，可利用任何裂解方法，例如機(jī)械剪切、滲透休克以及酶處理法使細(xì)胞裂解。裂解使全部細(xì)胞內(nèi)容物釋放到勻漿中，另外產(chǎn)生可通過離心或過濾除去的亞細(xì)胞片段。在蛋白質(zhì)生產(chǎn)過程中，由于細(xì)胞的自然死亡和宿主細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的釋放，直接分泌的蛋白質(zhì)會產(chǎn)生類似的問題，盡管程度較小。當(dāng)使用重組技術(shù)時(shí)，目的蛋白質(zhì)可在細(xì)胞內(nèi)、在周質(zhì)間隙中產(chǎn)生，或直接分泌到培養(yǎng)基中。本發(fā)明的方法不依賴于任何特定的清除細(xì)胞碎片的方法。熟練技術(shù)人員可利用任何方法實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。如果蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生，作為第一步驟，可(例如)通過離心或過濾步驟除去微粒碎片、宿主細(xì)胞或裂解片段，以制備用于純化的混合物。如果蛋白質(zhì)分泌到培養(yǎng)基中，則可通過(例如)切向流過濾(TFF)或深度過濾從細(xì)胞培養(yǎng)基中分離重組宿主細(xì)胞，以制備用于純化的混合物。根據(jù)本發(fā)明，一旦獲得了含有目的蛋白質(zhì)的混合物，即可如上文所述，在適當(dāng)條件下以任何期望的順序利用HCIC和CEXC層析的組合(見圖1)進(jìn)行目的蛋白質(zhì)與混合物中污染物的分離。獲得本發(fā)明方法可得到的純度水平不需要其他過程中純化步驟，如TFF或HPTFF。僅僅根據(jù)需要在兩個層析步驟之間進(jìn)行pH的處理以制備用于在第二層析步驟中純化的混合物。在一個特定實(shí)施方式中，利用的HCIC樹脂是MEPHyperCel(PallCorp.),CEXC樹脂是Poros50HS(AppliedBiosystems)。這些層析技術(shù)基于包括電荷和疏水性在內(nèi)的多種性質(zhì)分離蛋白質(zhì)混合物?；旧希@些分離方法導(dǎo)致蛋白質(zhì)和其他分子以不同速率沿著長柱向下移動，以在物質(zhì)進(jìn)一步沿著柱子向下流動時(shí)獲得物理上的分離。在上述適當(dāng)條件下，層析步驟使目的蛋白質(zhì)附著于柱子上，而使其他物質(zhì)通過柱子。目的蛋白質(zhì)然后用適當(dāng)?shù)木彌_液差別洗脫?？蛇x地，在適當(dāng)條件下，可通過將雜質(zhì)附著到柱子上而使目的蛋白質(zhì)穿過柱子，也就是說，目的蛋白質(zhì)存在于"流過液，，中，從而將所需的蛋白質(zhì)與雜質(zhì)分離。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，需要時(shí)可以將低pH保持引入本方法中。由于管理機(jī)構(gòu)對治療性蛋白質(zhì)生產(chǎn)中病毒清除的要求，必須至少有兩個病毒滅活和清除的單獨(dú)步驟，基于不同的化學(xué)作用模式，其典型地是低pH保持和病毒過濾步驟。低pH保持一般利用純化的樣品的pH改變(見，如下文的實(shí)施例)，并可被引入到準(zhǔn)備第二層析步驟必需的pH處理中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，在兩個層析步驟之間的pH保持可利用任何本領(lǐng)域公知的方法實(shí)現(xiàn)，以達(dá)到一般通過低pH保持獲得的病毒清除，只要包含目的蛋白質(zhì)的混合物在應(yīng)用于第二柱子之前被適當(dāng)?shù)鼐彌_。例如，并非意在限制，HCIC之后的低pH保持可通過如下方式荻得，利用INHC1或冰醋酸降低HCIC洗出液的pH到大約3.4到3.6,然后用2MTrispH9.0提高洗出液的pH到大約6.2;或者，在CEXC之后，可以用INHC1或冰醋酸降低CEXC洗出液的pH到pH范圍大約3.4到3.6,并且用2MTrispH9.0提高洗出液的pH到大約7.0。pH保持一般將導(dǎo)致電導(dǎo)率升高至少0.5mS/cm。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識到在本發(fā)明方法中使用的低pH保持步驟的時(shí)間條件。典型地，低pH保持進(jìn)行至少大約30分鐘，優(yōu)選大約45分鐘，更優(yōu)選長達(dá)大約60分鐘，最優(yōu)選長達(dá)大約90分鐘。在特定純化方案中，根據(jù)被純化的蛋白質(zhì)，可期望進(jìn)行低pH保持長達(dá)5小時(shí)。如果希望獲得治療級蛋白質(zhì)制劑，可采用第二病毒清除步驟，例如病毒過濾步驟，然而，達(dá)到本發(fā)明方法可獲得的純度水平不需要該步驟。可在本發(fā)明方法中利用的過濾裝置是本領(lǐng)域公知的(如，UltiporVFGradeDV20或DV50和FiltronTFF(PallCorporation,EastHills，NY);Viresolve(Millipore,Billerica，MA);VRCUNO(CUNO;Meriden，CT);和Planova(AsahiKaseiPharma,PlanovaDivision,BuffaloGrove，IL),用于除去病毒和其他生物物質(zhì)，優(yōu)選其孔徑小于20nm，這樣可除去脊髓灰質(zhì)炎病毒。本發(fā)明的層析步驟可通過任何機(jī)械方法進(jìn)行。層析可在一個柱上進(jìn)行。柱子可使用或不用壓力并從頂部到底部或從底部到頂部運(yùn)行。柱子中的液體流的方向在層析過程中可轉(zhuǎn)換。層析也可利用批處理進(jìn)行，其中通過任何適當(dāng)?shù)姆椒?，包括重力、離心或過濾，將固體支持物與用來上樣、清洗和洗脫樣品的液體分離。層析還可以如下進(jìn)行利用與對于層析樹脂所描述的同樣的化學(xué)原理，使樣品接觸比其他濾器更強(qiáng)地吸附或保留樣品中的一些分子的帶電荷濾器。盡管用于本發(fā)明的柱子的準(zhǔn)備步驟可被修改以適應(yīng)操作者的個人需求，但是提供下述描述作為指導(dǎo)，而且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會理解在不偏離本發(fā)明精神的前提下可以進(jìn)行改變。柱子按照制造商的說明進(jìn)行準(zhǔn)備。在純化之前，柱子一般利用凈化溶液進(jìn)行凈化，然后利用易溶鹽例如1MNaCl使其帶電荷，并利用平衡緩沖液進(jìn)行平衡。在凈化步驟中，一般在凈化溶液加到柱子上后停留例如大約30分鐘，優(yōu)選大約1小時(shí)，以清洗具有任何結(jié)合污染物(包括生物來源的污染物)的樹脂。電荷化(charge)步驟通過置換凈化溶液而中和樹脂，如，在CEXC中，可利用NaCl從柱子中除去NaOH并保持樹脂配體接觸正電離子。在柱子電荷化后，用平衡緩沖液平衡柱子，以準(zhǔn)備樹脂結(jié)合目的蛋白質(zhì)的pH和電導(dǎo)率。例如，當(dāng)其平衡緩沖液的pH和電導(dǎo)率分別在±0.1和士0.2mS/cm以內(nèi)時(shí)，^主子可以i^為是平tf的。制備上樣混合物，其典型地是在適當(dāng)緩沖鹽(即上樣緩沖液)中濃縮和緩沖液交換的細(xì)胞培養(yǎng)上清液。利用任選地與平衡緩沖液相同的上樣緩沖液，將獲自重組宿主細(xì)胞的上樣混合物(即，含有預(yù)期進(jìn)行純化的目的蛋白質(zhì))上樣到平衡柱(CEXC或HCIC)上。當(dāng)混合物流過柱子的固相時(shí)，目的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)(例如，如果蛋白質(zhì)在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生，則為HCPs)差異性地與固相結(jié)合，由此在蛋白質(zhì)和污染物穿過層析柱時(shí)允許分離。一旦混合物被上樣到柱子上并與樹脂結(jié)合，就利用所述的清洗緩沖液進(jìn)行清洗步驟以從柱子中清除污染物。任選地，可以利用比其他清洗和洗脫步驟更慢的流速，例如，利用對應(yīng)于幾分鐘(例如，5-10分鐘)停留時(shí)間的流速，進(jìn)行第一清洗步驟(但不是必需的)。流速將在下文更詳細(xì)地討論。清洗緩沖液的pH和電導(dǎo)率在第一次清洗中是重要的，特別是對于HCIC層析而言，以最大化地清除HCPs。在本方法中，CEXC層析中的清洗步驟清除了核酸并保留了HCPs同時(shí)保留了目的蛋白質(zhì)。在HCIC中的第一清洗步驟除去HCPs,而第二清洗除去更親水的污染物，例如，HCPs。HCIC對于核酸的去除是非常有效的，因?yàn)槠渲饕谖唇Y(jié)合級分中流動。如果HCIC用作第一柱子，可使用第三清洗步驟進(jìn)一步降低任何親水污染物的水平。為從柱子上洗脫目的蛋白質(zhì)，如上所述利用了適當(dāng)?shù)南疵摼彌_液，以使目的蛋白質(zhì)與柱子脫離結(jié)合。緩沖液組合物中的緩沖液、鹽和/或其他化合物的類型和濃度為致使緩沖液與目的蛋白質(zhì)有差別地洗脫雜質(zhì)，而目的蛋白質(zhì)相對于雜質(zhì)被保留。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員利用此處提供的實(shí)施例作為指導(dǎo)，可容易地確定用于上樣、清洗和洗脫緩沖液的適當(dāng)?shù)膒H和電導(dǎo)率范圍，從而在洗脫過程中回收目的蛋白質(zhì)。為了使含目的蛋白質(zhì)的洗出液中的HCPs減至最少，可利用下文描述的降低的流速，例如，不大于相應(yīng)的2分鐘停留時(shí)間，更優(yōu)選不大于3分鐘停留時(shí)間，更優(yōu)選不大于IO分鐘停留時(shí)間。當(dāng)從柱子上洗脫目的蛋白質(zhì)時(shí)，根據(jù)通過吸光度測量的在高于基線5%到25%之間從上升A28o到下降A(chǔ)280的峰的形成收集目的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可在緩沖液通過柱子時(shí)通過測量平衡緩沖液在250-280nm處的吸光度而容易地確定基線。為了減少HCPs的收集以制備含目的蛋白質(zhì)的純化組合物，優(yōu)選在最高峰高度的25%之前收集含目的蛋白質(zhì)的洗出液，因?yàn)閷τ贖CIC樹脂來說，HCPs將在較晚時(shí)間或較低pH下洗脫下來?；旧希景l(fā)明采用的分離方法導(dǎo)致污染物以不同速率沿著長柱子向下移動，獲得隨著它們進(jìn)一步沿柱子向下流動而增強(qiáng)的物理分離，同時(shí)目的蛋白質(zhì)附著于層析介質(zhì)上，然后根據(jù)緩沖液進(jìn)行差別洗脫。在本純化方法中，混合物沿柱子(HCIC或CEXC)向下移動的最大速率不大于30分鐘停留時(shí)間，優(yōu)選不大于IO分鐘，更優(yōu)選不大于6分鐘，更優(yōu)選不大于3分鐘，最優(yōu)選不大于2分鐘。在一個本發(fā)明的特定實(shí)施方式中，在CEXC步驟中的流速對應(yīng)于不大于大約2分鐘的停留時(shí)間；在HCIC步驟中不大于3分鐘。盡管流速對于獲得本發(fā)明方法可獲得的純度水平不是關(guān)鍵因素，仍然提供了流速作為指導(dǎo)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可根據(jù)需要改變流速。通過本發(fā)明方法的蛋白質(zhì)純化的優(yōu)選測量方法是測量宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)的去除。純化的蛋白質(zhì)優(yōu)選是如上文定義的均質(zhì)組分。樣品在任何純化階段的蛋白質(zhì)濃度可通過任何適當(dāng)?shù)姆椒y定。所述方法在本領(lǐng)域是公知的，包括1)比色法，例如Lowry測定、Bradford測定、Smith測定、月交體金測定；2)利用蛋白質(zhì)的UV吸收性質(zhì)的方法；和3)基于凝膠上染色蛋白條帶與相同凝膠上已知量的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)作比4交而進(jìn)行的—見覺估測。見例如，Stoschek(1990),QuantitationofProtein,inGuidetoProteinPurification,MethodsinEnzymol.182:50-68。含目的蛋白質(zhì)的均質(zhì)組合物的蛋白質(zhì)污染物可通過本領(lǐng)域已知的多種方法測定，例如，通過酶聯(lián)免疫測定(ELISA;見例如，Reen(1994),Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay(ELISA),inBasicProteinandPeptideProtocols,MethodsMol.Biol.32:461-466,其全文在ot匕引入作為參考)。含目的蛋白質(zhì)的均質(zhì)組合物中可能存在的DNA的含量可通過任何適當(dāng)方法確定。例如，可使用一種利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測。DNA可降至低于10pg/mg的水平。如此回收的蛋白質(zhì)可以配制在生物醫(yī)藥可接受的組合物中，用于多種診斷、治療或該分子的其他已知用途。在收集含目的蛋白質(zhì)的洗出液之后，可通過利用含有用于層析的緩沖液或鹽、但其摩爾濃度更高或pH改變的溶液清除層析介質(zhì)，釋放任何可能保持與柱子結(jié)合的蛋白質(zhì)。然后可以用一種溶液(例如，再生溶液)使柱子再生，該溶液具有從層析介質(zhì)中釋放大多數(shù)或全部蛋白質(zhì)并減少或消除任何可能存在于層析介質(zhì)中的微生物污染物的效果。隨后，柱子可被清洗并保存在防止微生物生長的溶液中。所述溶液可包含氫氧化鈉，但也可使用其他試劑，例如乙醇、疊氮鈉、苯曱醇或高濃度的易溶鹽。下述實(shí)施例用于說明本發(fā)明，而非意在限制。實(shí)施例本實(shí)施例描述了利用本發(fā)明的純化方法進(jìn)行抗體純化。利用Medarex的HuMAbMouse⑧制備了抗活化T細(xì)胞相關(guān)抗原(CTLA-4)和腫瘤相關(guān)抗原(CD30)的全人抗體。利用CHODG44細(xì)胞制備了轉(zhuǎn)染瘤。利用中性pH(7到8)和電導(dǎo)率為10到16mS/cm的合成的無血清限定培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。DG44CHO細(xì)胞生長到密度大約為3到10xl()6細(xì)月包/ml。通過利用60MO2CUNO濾器(Meriden，CT)過濾以澄清細(xì)胞培養(yǎng)物。將得到的細(xì)胞培養(yǎng)上清液濃縮并在pH6.2的35或70mM磷酸鈉中滲濾。對于使用MEPhypercel作為捕獲樹脂的實(shí)驗(yàn)，通過用1MNaOH滴定濃縮和滲濾的細(xì)胞培養(yǎng)上清液以將上樣樣品調(diào)節(jié)到pH7。包含兩種抗體之一的混合物的純化按照下述任一說明進(jìn)行。表1和2顯示了用于生產(chǎn)治療級蛋白質(zhì)物質(zhì)的本發(fā)明純化方法的兩個步驟的例子。在方法(A)中，第一非親和CEXC層析步驟是利用Poros50HS樹脂進(jìn)行捕獲的陽離子交換層析(表l),緊接著利用1NHC1或冰醋酸保持低pH，以將洗出液的pH降低到3.4到3.6，使用2MTrispH9.0將級分的pH提高到7.0。第二非親和步驟是利用MEPHyperCel進(jìn)行捕獲的HCIC(表2)。低pH保持一般導(dǎo)致電導(dǎo)率升高大約2mS/cm。本方法利用如表1和表2中顯示的用于各自樹脂的平衡、上樣、清洗和洗脫緩沖液而進(jìn)行。每個純化步驟都沒有使用過程中緩沖液交換步驟，也就是說，樣品從一個層析步驟到下一個步驟僅僅進(jìn)行pH調(diào)節(jié)作為低pH保持的一部分。進(jìn)行了一種用于生產(chǎn)治療級蛋白質(zhì)物質(zhì)的替代方法(B),其中CEXC和HCIC層析步驟被顛倒，也就是說，表2中的步驟先進(jìn)行，然后進(jìn)行表1中的步驟。第一非親和層析步驟是表2所述的利用MEPHyperCel樹脂進(jìn)行捕獲的HCIC。利用INHC1或冰醋酸進(jìn)行低pH保持，以將MEP洗出液的pH降低到3.4到3.6,緊跟著用2MTris,pH9.0將級分的pH提高至6.2。低pH保持一般導(dǎo)致電導(dǎo)率升高大約2mS/cm。第二層析步驟(CEXC)是如表1所述的利用Poros50HS樹脂進(jìn)行精制的CEXC。本方法利用如表中所示的用于各自樹脂的平衡、上樣、清洗和洗脫緩沖液進(jìn)行。該替代方法中的純化步驟均不包括過程中緩沖液交換步驟，也就是說，樣品從一個層析步驟到下一個步驟僅僅只進(jìn)行pH調(diào)節(jié)作為低pH保持的一部分。表l.用于抗體捕荻或精制的陽離子交換層析主要操作細(xì)節(jié)的概要。結(jié)合能力恒定在15mg/ml樹脂。流速相應(yīng)停留時(shí)間來表示，以提供較寬實(shí)驗(yàn)靈活性。工作溫度在15-25。C之間變化。NaPJ粦酸鈉。<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表2.用于抗體捕獲或精制的MEPHyperCel層析主要細(xì)節(jié)的概述。結(jié)合能力恒定在15mg/ml樹脂。流速以相應(yīng)停留時(shí)間來表示，以提供較寬實(shí)驗(yàn)靈活性。工作溫度在15-25°C之間變化。NaP=磷酸鈉。<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>利用標(biāo)準(zhǔn)ELISA^r測確定CHOP水平，利用PCR確定DNA水平，并且利用HPLC-SEC確定抗體單體的純度，這兩種純化方法A和B的每一種均獲得均質(zhì)的組成，含有少于100ppm的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)(見下面表3)、少于lOpgDNA/mg的抗體以及大于99%的單體，其允許將純化的物質(zhì)進(jìn)一步操作和配制為治療級產(chǎn)品。對于CHOPs，第一步驟后的污染物濃度在200到1500ng/mg之間變化，對于單體為95%到100%。利用兩種不同全人單克隆抗體的方法A和B的結(jié)果顯示在表3中。表3.利用建議的純化方案去除污染物的總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>權(quán)利要求1.一種純化包含目標(biāo)蛋白質(zhì)和一種或多種污染物的混合物的方法，包括(a)將該混合物進(jìn)行離子交換層析步驟和疏水電荷誘導(dǎo)層析步驟，其中沒有過程中切向流過濾步驟，和(b)分離目標(biāo)蛋白質(zhì)。2.—種純化包含目標(biāo)蛋白質(zhì)和一種或多種污染物的混合物的方法，所述混合物已經(jīng)進(jìn)行了疏水電荷誘導(dǎo)層析，該方法包括(a)將該混合物進(jìn)行陽離子交換層析步驟，其中沒有過程中切向流過濾步驟，和(b)分離目標(biāo)蛋白質(zhì)。3.—種純化包含目標(biāo)蛋白質(zhì)和一種或多種污染物的混合物的方法，所述混合物已經(jīng)進(jìn)行了離子交換層析，該方法包括(a)將該混合物進(jìn)行疏水電荷誘導(dǎo)層析步驟，其中沒有過程中切向流過濾步驟，和(b)分離目標(biāo)蛋白質(zhì)。4.一種純化混合物的方法，所述混合物包含目標(biāo)蛋白質(zhì)和選自宿主細(xì)月包蛋白質(zhì)和核酸的污染物，該方法包4舌將該混合物進(jìn)行陽離子交換層析和疏水電荷誘導(dǎo)層析，并分離目標(biāo)蛋白質(zhì)至純度為大約每百萬份100份(ppm)或更少的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和大約10pg/mg或更少的核酸。5.權(quán)利要求l-4的方法，進(jìn)一步包括病毒滅活步驟。6.權(quán)利要求5的方法，其中所述病毒滅活步驟是過程中步驟。7.權(quán)利要求1-4的方法，其中所述混合物由細(xì)胞培養(yǎng)上清液制備。8.權(quán)利要求1、2或4的方法，其中所述陽離子交換層析在pH3到IO的范圍內(nèi)進(jìn)行。9.權(quán)利要求1、2或4的方法，其中所述陽離子交換層析在pH4.0到8.0的范圍內(nèi)進(jìn)行。10.權(quán)利要求1、3或4的方法，其中所述疏水電荷誘導(dǎo)層析在pH3到IO的范圍內(nèi)進(jìn)行。11.權(quán)利要求1、3或4的方法，其中所述疏水電荷誘導(dǎo)層析利用pH4.0到9.0的范圍進(jìn)行。12.權(quán)利要求1、2或4的方法，其中在pH3到9并且電導(dǎo)率為0.1到40mS/cm的條件下，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)與陽離子交換層析柱結(jié)合。13.片又利要求1、2或4的方法，其中在pH4.0到8.0并且電導(dǎo)率為0.5到10mS/cm的條件下，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)與陽離子交換層析柱結(jié)合。14.權(quán)利要求1、3或4的方法，其中在pH5到IO并且電導(dǎo)率為0到90mS/cm的條件下，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)與疏水電荷誘導(dǎo)層析柱結(jié)合。15.權(quán)利要求1、3或4的方法，其中在pH6到9并且電導(dǎo)率為2到9mS/cm的條件下，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)與疏水電荷誘導(dǎo)層析柱結(jié)合。16.權(quán)利要求1、2或4的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)與陽離子交換層析柱結(jié)合，并且利用pH為3到9且電導(dǎo)率為0.1到40mS/cm的清洗緩沖液清洗層析柱。17.權(quán)利要求1、2或4的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)與陽離子交換層析柱結(jié)合，并且利用pH為4.0到8.0且電導(dǎo)率為0.5到10mS/cm的清洗緩沖液清洗層析柱。18.權(quán)利要求1、3或4的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)與疏水電荷誘導(dǎo)層析柱結(jié)合，并且利用pH為5到IO且電導(dǎo)率為0到90mS/cm的清洗緩沖液清洗層析柱。19.權(quán)利要求1、3或4的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)與疏水電荷誘導(dǎo)層析柱結(jié)合，并且利用pH為6到9且電導(dǎo)率為0.1到9mS/cm的清洗緩沖液清洗層析柱。20.權(quán)利要求1，2或4的方法，其中在pH3到IO和電導(dǎo)率為0.1到40mS/cm的條件下，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)從陽離子交換層析柱上洗脫下來。21.權(quán)利要求1、2或4的方法，其中在pH4.0到8.0和電導(dǎo)率為5到15mS/cm的條件下，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)從陽離子交換層析柱上洗脫下來。22.權(quán)利要求1、3或4的方法，其中在pH3.0到7.0和電導(dǎo)率為0到20mS/cm的條件下，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)從疏水電荷誘導(dǎo)交換層析柱上洗脫下來。23.權(quán)利要求1、3或4的方法，其中在pH4.0到6.0和電導(dǎo)率為0.1到2.0mS/cm的條件下，所述目標(biāo)蛋白質(zhì)從疏水電荷誘導(dǎo)交換層析柱上洗脫下來。24.權(quán)利要求1、2或4的方法，其中所述陽離子交換層析步驟使用選自以下的陽離子交換配體磺酸鹽、羧酸、羧甲基磺酸、磺基異丁基、磺基乙基、羧基、磺丙基、磺酰基、次硫酸乙基和正磷酸鹽。25.權(quán)利要求1、2或4的方法，其中所述陽離子交換層析步驟在選自下列的陽離子交換樹脂上進(jìn)行PorosHS、PorosS、羧甲基纖維素、BAKERBONDABXTM、固定于瓊脂糖上的磺丙基和固定于瓊脂糖上的磺?；琈onoS、MiniS、Source15S、30S、SPsepharose、CMSepharose、BAKERBONDCarboxy-S函n、WPCBX、WPSulfonic,HydrocellCM、HydrocdSP、UNOsphereS、Macro-PrepHighS、Macro-PrepCM、CeramicHyperDS、CeramicHyperDCM、Ce讓icHyperDZ、TrisacrylMCM、TrisacrylLSCM、TrisacrylMSP、TrisacrylLSSP、SpherodexLSSP、DOWEX細(xì)篩強(qiáng)酸陽離子樹脂、DOWEXMAC-3、MatrexCellufineC500、MatrexCellufineC200、FractogelEMDS03-、FractogelEMDSE、FractogelEMDCOO-、Amberlite弱及強(qiáng)陽離子交換劑、Diaion弱及強(qiáng)陽離子交換劑、TSKGelSP-5PW-HR、TSKGelSP-5PW、ToyopeadCM(650S、650M、650C)、ToyopearlSP(650S、650M、650C)、CM(23、32、52)、SE(52，53)、Pll、Express-IonC和Express-IonS。26.權(quán)利要求1、3或4的方法，其中所述疏水電荷誘導(dǎo)層析步驟使用疏水電荷誘導(dǎo)層析配體，所述配體包括可離子化芳香族或雜環(huán)結(jié)構(gòu)，其在連接臂和/或配體結(jié)構(gòu)上具有脂肪族鏈和至少一個硫原子。27.權(quán)利要求26的方法，其中所述疏水電荷誘導(dǎo)層析配體包含選自下列的基團(tuán)2-氨甲基吡啶、3-氨甲基吡啶和4-氨曱基吡啶、2-巰基吡啶、4-巰基吡啶或4-巰基乙基吡啶、巰基酸、巰基醇、基于咪唑基的、巰基甲基咪唑、2-巰基苯并咪唑、氨甲基苯并咪唑、組胺、巰基苯并咪唑、二乙氨基丙胺、氨丙基嗎啉、氨丙基咪唑、氨基己酸、硝基羥基苯甲酸、硝基酪氨酸/乙醇胺、二氯水楊酸、二溴酪胺、氯羥基苯基乙酸、羥苯基乙酸、酪胺、苯橫"酚、谷胱甘肽、硫酸氬鹽和染料或其衍生物。28.權(quán)利要求1、3或4的方法，其中利用選自MEPHyperCel的疏水電荷誘導(dǎo)樹脂進(jìn)行疏水電荷誘導(dǎo)層析步驟。29.權(quán)利要求l-4的方法，其中所述污染物選自宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、宿主細(xì)胞代謝物、宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)、核酸、內(nèi)毒素、與產(chǎn)物有關(guān)的污染物、脂質(zhì)、和培養(yǎng)基添加劑、或培養(yǎng)基衍生物。30.權(quán)利要求1-4的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)是一種抗體或抗體片段。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述抗體是一種單克隆抗體。32.權(quán)利要求30的方法，其中所述抗體是一種全人抗體。33.權(quán)利要求30的方法，其中所述抗體選自抗-CTLA4抗體和抗-CD30抗體。34.權(quán)利要求30的方法，其中所述抗體選自單鏈抗體分子、雙抗體、線性抗體、雙特異性抗體和多特異性抗體。35.權(quán)利要求30的方法，其中所述抗體片段選自Fab、Fab'、F(ab')2和Fv。36.權(quán)利要求1-4的方法，其中所述目標(biāo)蛋白質(zhì)是一種免疫粘附素。37.權(quán)利要求l-4的方法，進(jìn)一步包括將分離的蛋白質(zhì)配制成藥物組合物的步驟。全文摘要本發(fā)明提供純化蛋白質(zhì)的方法。具體地，本方法利用一種兩步非親和層析方法，該方法不使用過程中切向流過濾步驟。文檔編號C07K1/18GK101218247SQ200680016610公開日2008年7月9日申請日期2006年3月21日優(yōu)先權(quán)日2005年4月11日發(fā)明者A·阿魯納庫馬里,G·M·M·費(fèi)賴?yán)暾埲?米德列斯公司