專利名稱：：非蛋白水解起源的新型可溶性epcr蛋白質(zhì)及其用途的制作方法非蛋白水解起源的新型可溶性EPCR蛋白質(zhì)及其用途
背景技術(shù)：
：所述C蛋白系統(tǒng)(PC)的最后蛋白是內(nèi)皮C蛋白/激活C蛋白受體(EPCR)(1,2)。EPCR表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞膜上并以高親和力(Kd~30nM)結(jié)合PC和激活C蛋白(APC)。它的生理學(xué)使命是使PC集中在內(nèi)皮表面上并將其呈遞給凝血酶-血栓調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物，從而促進(jìn)PC的有效激活(3)。在對非人靈長類進(jìn)行的研究中，已證實用單克隆抗體阻斷EPCR使APC的生理學(xué)生產(chǎn)減少90%，并且近期研究提出EPCR的遺傳缺陷可能易于罹患靜脈和動脈血栓形成(4-7)。這些事實證實EPCR可能在凝固調(diào)節(jié)和血栓形成中起重要作用。此外，EPCR似乎是負(fù)責(zé)PC的有效抗炎作用的分子之一。PC/APC與EPCR的相互作用可能在由革蘭氏陰性菌感染的過程中發(fā)展的凝血病和炎癥應(yīng)答調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用(8)。近來，已證實APC對內(nèi)皮細(xì)胞具有抗炎和抗細(xì)胞凋亡作用，并且EPCR的存在是這種作用變得明顯所必需的(9，10)。EPCR是大約46kDa的糖蛋白。成熟蛋白在除去信號肽后包括221個氨基酸，所述信號肽由17個殘基組成(11)。它由位于染色體20的長臂(20qll.2)中的基因編碼，由3個內(nèi)含子打斷的4個外顯子形成(12)。外顯子I編碼5'非翻譯區(qū)和信號肽，外顯子IV編碼跨膜結(jié)構(gòu)域、3個殘基的胞質(zhì)內(nèi)尾以及3'非翻譯區(qū)。外顯子ii和m編碼EPCR的大部分胞外區(qū)，其與屬于I類主要組織相容性復(fù)合物的CD1超家族的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域ocl和a2具有同源性。近來，顯示EPCR如何具有由折疊的P折疊形成的平臺的三維結(jié)構(gòu)已設(shè)法被結(jié)晶和分析，在所述平臺上2個具有a螺旋構(gòu)象，其形成穩(wěn)定分子的其中容納磷脂的口袋U3)。同樣地，通過丙氨酸掃描，涉及與PC/APC結(jié)合的主要?dú)埢驯昏b別，在鈣和鎂離子的存在下它經(jīng)由它的GLA結(jié)構(gòu)域與所述主要?dú)埢Y(jié)合(14)。但是，除了內(nèi)皮細(xì)胞膜上錨定的EPCR之外，還存在血漿可溶形式(sEPCR)，其至少部分地來自EPCR通過經(jīng)由刺激物例如;疑血酶誘導(dǎo)的金屬蛋白酶的消化U5，16)。文章(15)J.Clin.Invest.第100巻,no.2July1997,411-418,涉及在血漿中發(fā)現(xiàn)的可溶形式的EPCR。它說明血漿中的EPCR似乎是獨(dú)特的種類，并且純化蛋白質(zhì)的氨基末端片段測序給出血漿EPCR的獨(dú)特序列，其與重組sEPCR的氨基末端序列一致。它說明在其他受體的情況下，所述可溶性EPCR的起源可能是蛋白水解破裂，或可變切割-剪接機(jī)制，并且具體地牛EPCR的基因組結(jié)構(gòu)包含可變切割位點(diǎn)，其編碼其中跨膜結(jié)構(gòu)域由內(nèi)含子編碼的序列代替的蛋白質(zhì)，所述內(nèi)含子位于外顯子III后(17)。這個文件指出將需要更多的研究以證明來源于可變切割的EPCR形式的可能性。此外，申請WO-9900673涉及人血漿中的sEPCR的分離和表征，并且它說明sEPCR可能來自蛋白水解，其中EPCR的胞外結(jié)構(gòu)域被釋放并且使蛋白其余部分結(jié)合膜，或來自mRNA的可變切割-剪接機(jī)制，這產(chǎn)生altsEPCR的序列。本申請的圖l顯示圖解，其中觀察到蛋白水解起源的可溶性EPCR(psEPCR)、通過可變切割-剪接獲得的申請WO-9900673中公開的EPCR(altsEPCR)、以及本發(fā)明的新EPCR對象(sEPCRvar)之間的差異。本申請因此指出至少人EPCR可以經(jīng)歷可變切割-剪接過程，從而產(chǎn)生可溶性截短的EPCR，其包括只在來源于所述可變切割-剪接機(jī)制的可溶性EPCR(sEPCRvar)中存在的獨(dú)特插入片段。所述sEPCRvar可以充當(dāng)大血管和癌癥中的疾病過程標(biāo)記。當(dāng)APC結(jié)合sEPCR時，它失去它的抗凝血性但維持它的酶促能力，由于這個原因認(rèn)為sEPCR改變APC特異性，可能將其導(dǎo)向目前未知的底物，其可以連接至歸因于APC的抗炎性質(zhì)(18)。sEPCR與膜上存在的EPCR竟?fàn)嶤蛋白并以這種方式抑制APC產(chǎn)生。還已描述sEPCR通過蛋白酶-3(PR3)(19)和Mac-1(CDllb/CD18)能夠與活化的嗜中性粒細(xì)胞相互作用，所述蛋白酶-3是存在于嗜中性粒細(xì)胞顆粒中的蛋白酶，且Mac-1是存在于嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞表面上的誘導(dǎo)型表達(dá)的整聯(lián)蛋白。PR3可能涉及作用于膜結(jié)合的TNF-a和IL-l卩前體的組織破壞機(jī)制。Mac-l干涉細(xì)胞信號傳導(dǎo)和胞間粘附現(xiàn)象，與粘附分子例如內(nèi)皮ICAM-1相互作用，由于這個原因它在炎癥過程的嗜中性粒細(xì)胞募集中起作用。推測起來，sEPCR與PR3和Mac-1的結(jié)合將減少它們的活性。由人基因組DNA(cDNA)開始，本發(fā)明人已能夠克隆并表達(dá)新蛋白質(zhì)。它的序列與其他已知序列的分析和比較，以及其功能表征已證實所述蛋白質(zhì)是通過可變剪接過程產(chǎn)生的未知形式的可溶性EPCR蛋白質(zhì)。另一方面，所述蛋白質(zhì)具有作為鑒別特征的由最初視為EPCR基因3'非翻譯區(qū)的區(qū)域編碼的多肽區(qū)，其在目前已知的EPCR形式中不存在。發(fā)明描述本發(fā)明首先涉及新型可溶形式的EPCR，我們稱其為可溶性EPCR變體(sEPCRvar)，更具體而言涉及來源于內(nèi)皮C蛋白受體的多肽，其包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256，或所述殘基序列的片段。在具體實施方案中，所述片段具有至少9個氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的具體實施方案，所述片段選自包括SEQIDNO:l的殘基213-227、229-242、212-226、227-241、242-256的片^殳。特異性抗體^操作中是特別有用的。U;、、"'本發(fā)明進(jìn)一步涉及分離或重組蛋白質(zhì)，其包括由序列SEQIDNO:l的殘基201-256形成的多肽，所述蛋白質(zhì)是EPCR蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，所述分離或重組EPCR蛋白質(zhì)包括序列SEQIDNO:1。本發(fā)明的另外目的是包括由序列SEQIDNO:l的殘基201-256、或所述殘基序列的片段形成的多肽的重組蛋白質(zhì)。本發(fā)明的另外目的是包括編碼由序列SEQIDNO:l的殘基201-256或所述殘基序列的片段形成的多肽的序列的多核苷酸。在具體實施方案中，所述多核苷酸來自對應(yīng)于SEQIDNO:2的cDNA序列。這種cDNA涉及由mRNA逆轉(zhuǎn)錄的DNA。在具體實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸可以包含在DNA構(gòu)建體中。因此，本發(fā)明的另外目的是編碼包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,或所述殘基序列的片段的蛋白質(zhì)或多肽的DNA構(gòu)建體。優(yōu)選地，所述片段具有至少9個氨基酸。在所述構(gòu)建體的具體實施方案中，它包括來自對應(yīng)于SEQIDNO:2的cDNA序列的多核苷酸。所述DNA構(gòu)建體可以整合可操作地結(jié)合所述蛋白質(zhì)或多肽的控制序列。關(guān)于核酸或多核苷酸，"可操作地結(jié)合"意指一個核苷酸區(qū)域置于與另一個核苷酸序列的功能關(guān)系中。"控制序列"是由某一宿主細(xì)胞特異識別的表達(dá)信號，其調(diào)節(jié)功能，例如某一編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯。啟動子、表達(dá)增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)等是控制序列。剪接所需序列以形成DNA構(gòu)建體可以通過在合適的限制位點(diǎn)切割和剪接來進(jìn)行。如果這些結(jié)合位點(diǎn)不存在，那么可能通過常規(guī)基因工程方法使用合成寡核苷酸作為銜接頭或間隔區(qū)來產(chǎn)生它們。本發(fā)明的多核苷酸或DNA構(gòu)建體可以通過通常在實驗室手冊中記錄的常規(guī)基因工程方法來獲得。本發(fā)明的多核苷酸或構(gòu)建體可以被插入合適的表達(dá)載體中。因此，本發(fā)明的另外目的是包括所述多核苷酸或DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體。在本發(fā)明不同實施方案中表達(dá)載體的選擇將取決于所述表達(dá)載體準(zhǔn)備插入其中的宿主細(xì)胞。例如，本發(fā)明的多核苷酸或DNA構(gòu)建體插入其中的載體可以是質(zhì)?；虿《?，其一旦引入宿主細(xì)胞中，就可以整合或不整合到細(xì)胞基因組中。這種表達(dá)載體還可以通過常規(guī)方法獲付。本發(fā)明的另外目的是轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，其包括編碼多肽的多核苷酸或DNA構(gòu)建體，所述多肽包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256，或所述殘基序列具有至少9個氨基酸的片段。根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如大腸桿菌(五"/7en'c/n'aco//)，或真核細(xì)胞，例如酵母(尤其是巴斯德畢赤氏酵母(尸/c/zz'a尸o^on^)和啤酒斗唐酵母(5Vcc/zanm_ycescerevz.s/ae)),昆蟲纟田月包或p甫l'L動4勿纟田月包系、。在本發(fā)明的具體實施方案中，具有SEQIDNO:2的本發(fā)明的多核苷酸被引入巴斯德畢赤氏酵母中以產(chǎn)生SEQIDNO:l的重組sEPCR蛋白質(zhì)，對應(yīng)于本發(fā)明中公開的通過可變切割和剪接產(chǎn)生的新型sEPCR形式(sEPCRvar)。用于產(chǎn)生DNA構(gòu)建體、表達(dá)載體以及生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)所需的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的方法稍后詳細(xì)描述，包括關(guān)于其純化的方法。在本發(fā)明的具體實施方案中，包括本發(fā)明的多核苷酸或DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體被設(shè)計用于其在體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移或治療的組合物和方法中使用。在更具體的實施方案中，這種表達(dá)載體是病毒載體。用于這個目的的合適病毒載體包括腺病毒、腺伴隨、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、曱病毒、皰滲病毒、冠狀病毒衍生的載體等。本發(fā)明的另外目的是包括包含多核苷酸的表達(dá)載體的表達(dá)系統(tǒng)，所述多核苷酸編碼包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,或所述殘基序列的片段的多肽，以及用所述多核苷酸或所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，所述片段包括至少9個氨基酸。本發(fā)明的另外目的是生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽的方法，所述蛋白質(zhì)或多肽包括SEQIDNO:l的殘基201-256，或所述殘基序列的片段，優(yōu)選具有至少9個氨基酸，所述方法的特征在于它包括在允許所述蛋白質(zhì)、多肽或片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)包括本發(fā)明的多核普酸或DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。最優(yōu)化培養(yǎng)的條件將取決于使用的宿主細(xì)胞。需要時，這種方法還可包括分離和純化表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽的某些步驟?？商娲兀景l(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽可以通過其他常規(guī)方法獲得，例如通過使用固相技術(shù)的化學(xué)合成；通過高效液相層析(HPLC)純化；以及需要時它們還可通過常規(guī)，技術(shù)進(jìn)行分析，例如通過測序和質(zhì)譜法、氨基酸分析、核磁共振等。本發(fā)明的另外目的是編碼蛋白質(zhì)的mRNA，所述蛋白質(zhì)包括序列SEQIDNO:l，或所述殘基序列的片段。本發(fā)明的另外目的是對于包括SEQIDNO:l的殘基201-256,或所述殘基序列具有免疫原性質(zhì)的片段的多肽的特異分離的抗體。在具體實施方案中，所述片段具有至少9個氨基酸。在具體實施方案中，所述抗體對于多肽或片段是特異的，所述多肽或片段的序列選自殘基201-256、213-227、229-242、212-226、227-241和242-256,所述殘基都參照SEQIDNO:l。在另一具體實施方案中，所述抗體對于SEQIDNO:l是特異的，并且當(dāng)它不結(jié)合區(qū)域201-256時不識別區(qū)域1-200。根據(jù)優(yōu)選實施方案，所述抗體是單克隆抗體。本發(fā)明的另外目的是用于體外選擇性檢測生物學(xué)樣品中的EPCR蛋白質(zhì)的方法，所述EPCR蛋白質(zhì)包括序列SEQIDNO:l的殘基20]-256,例如SEQIDNO:l的新EPCR蛋白質(zhì)，或所述殘基序列的片段，所述方法包括-獲得生物學(xué)樣品，-分析EPCR蛋白質(zhì)的量，所述EPCR蛋白質(zhì)包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256，或所述殘基序列的片段。所述生物學(xué)樣品可以是包括生物學(xué)材料的任何樣品。在優(yōu)選實施方案中，所述生物學(xué)樣品是尿、血漿、血清、組織或組織液樣品。所述方法可以是4壬<可已知方法，包4舌例如質(zhì):^普法、免疫測定、化學(xué)測定、液相層析和不同的間接和直接光度法。例如，某些分析型方法可以應(yīng)用于使用質(zhì)語法定量標(biāo)記。一般來說，標(biāo)記可以從生物學(xué)樣品中分離，例如通過液相層析或二維凝月交電泳。標(biāo)記通過質(zhì)i普法定量，例如與液相層析關(guān)聯(lián)的串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)、MALDI-TOF-MS("基質(zhì)輔助激光解吸/電離質(zhì)譜法飛行時間MS")等。靶標(biāo)記可以通過與已知量的純化標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)比較，或通過與從健康對照獲得的相同類型生物學(xué)樣品中存在的所述標(biāo)記的量比較進(jìn)行定量。在本發(fā)明的另一實施方案中，方法可以是免疫測定。一般地說，在免疫測定中使用一種或多種標(biāo)記配體。如本發(fā)明中使用的，"配體"是能夠特異性結(jié)合靶標(biāo)記的任何化合物或分子。這些配體可以分開或組合使用(例如，抗體可以與適體組合使用)。在本發(fā)明的實施方案中，免疫測定可以是均相測定、非均相測定、酶免疫測定(EIA、ELISA)、竟?fàn)帨y定、免疫測定(夾層)、濁度測定、比濁測定或其他類似測定。同樣地，免疫測定可以手動或用自動分析儀進(jìn)行。在本發(fā)明的方法中，所述蛋白質(zhì)的量與疾病相關(guān)，所述疾病選自與血管損傷相關(guān)的炎性疾病、炎癥、與異常凝固相關(guān)的疾病和癌癥。所述疾病還可以是自身免疫性疾病，例如狼瘡、膿毒癥、休克、先兆子癇、糖尿病、不穩(wěn)定心絞痛、移植物的監(jiān)控、再狹窄、血管成形術(shù)和肝或腎疾病。根據(jù)本發(fā)明的方法，檢測的EPCR蛋白質(zhì)的量還可以與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。本發(fā)明的另外目的是用于檢測和定量EPCR蛋白質(zhì)的試劑盒，所述EPCR蛋白質(zhì)包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,例如SEQIDNO:l的新EPCR蛋白質(zhì)，或所述殘基序列的片段，優(yōu)選具有至少9個氨基酸，所述試劑盒包括a)對于包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,或所述殘基序列的片段的多肽特異的抗體，或?qū)τ赟EQIDNO:l蛋白質(zhì)特異的抗體，當(dāng)所述抗體不結(jié)合區(qū)域201-256時不識別區(qū)域1-200。b)檢測抗體a)和生物學(xué)樣品中存在的EPCR蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)的試劑，所述EPCR蛋白質(zhì)包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256，或所述殘基序列的片段。優(yōu)選地，試劑盒還包括使產(chǎn)生的反應(yīng)的量與EPCR蛋白質(zhì)的正常和異常水平關(guān)聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)，所述EPCR蛋白質(zhì)包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256。本發(fā)明的另外目的是編碼包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,或所述殘基序列的片段的的多肽的多核苷酸用于檢測和定量對應(yīng)于EPCR蛋白質(zhì)的mRNA的用途，所述EPCR蛋白質(zhì)包括序列SEQIDNO:l的殘基201-256,例如SEQIDNO:1的新EPCR蛋白質(zhì)，或所述殘基序列的片段，優(yōu)選地所述片段具有至少9個氨基酸。所述EPCR蛋白質(zhì)以與疾病相關(guān)的量存在，所述疾病選自與血管損傷相關(guān)的炎性疾病、炎癥、癌癥和與異常^^固相關(guān)的疾病。此外，非蛋白水解起源的新可溶形式的EPCR可以用于開發(fā)選擇性單獨(dú)且專有地;險測這種形式的可溶性EPCR(sEPCRvar)的存在的分析方法，優(yōu)點(diǎn)是它可以引入特定疾病的檢測，所述方法與其中檢測其他形式的可溶性EPCR或膜EPCR的那些不重疊。附圖簡述圖1:它顯示不同類型的EPCR,取決于其中RNA被加工以產(chǎn)生成熟的信使RNA(mRNA)的方式，可以產(chǎn)生3種可變形式的mRNA,其依次將產(chǎn)生3種不同形式的蛋白質(zhì)1:與將翻譯為膜EPCR(mEPCR)的蛋白質(zhì)有4個外顯子不同的mRNA。2.只包括外顯子ExI、ExII和ExIII隨后為內(nèi)含子3以及這個內(nèi)含子后的全部序列，并且將翻譯為由Esmon在WO-9900673中公開的可溶形式的EPCR(altsEPCRs)的mRNA。3.通過本發(fā)明中公開的新形式的可變切割和剪接將產(chǎn)生包括外顯子Exl、ExII和ExIII的mRNA，但在加工中，外顯子ExIV丟失，由于這個原因，跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾都不轉(zhuǎn)錄，并且在其位置中，在外顯子III后，位于3'非翻譯區(qū)中的隱蔽外顯子的序列出現(xiàn)，在這種情況下mRNA將翻"i斧為本發(fā)明的新可溶性EPCR形式(sEPCRvar)?？扇苄訣PCR還可以通過可能來自金屬蛋白酶(仍未表征)的蛋白水解活性產(chǎn)生，所述金屬蛋白酶在膜高度切割EPCR，從而使得它產(chǎn)生新可溶形式的EPCR(sEPCR),其由細(xì)胞外受體級分組成并缺乏跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)內(nèi)尾。圖2:用特異性EPCR基因引物擴(kuò)增HUVECcDNA后獲得的帶型除了對應(yīng)于野生型EPCRcDNA的條帶(1221bp,箭標(biāo)1)夕卜，還觀察到新的擴(kuò)增片段，對應(yīng)于通過可變切割-剪接產(chǎn)生的新變體同種型的cDNA(箭標(biāo)2)。圖3.用野生型EPCR(圖A)或用同種型(圖B)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞，兩種EPCR都與綠色熒光蛋白融合。圖A顯示野生型蛋白質(zhì)趨向在細(xì)胞膜上積聚(箭標(biāo))，同時對于同種型3，沒有觀察到這種定位模式(圖B)。圖4.舉例說明了在巴斯德畢赤氏酵母中的sEPCRvar表達(dá)。如說明書中指出的，sEPCRvar從穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的巴斯德畢赤氏酵母細(xì)胞的上清液中純化。圖A:顯示通過SDS-PAGE分離并使用GELCODEBlue染料檢測的不同蛋白質(zhì)；道St:分子量標(biāo)記，指出以kDa表示的每個條帶的分子量；道l:重組sEPCR。觀察到大約42kDa的擴(kuò)散帶(由于強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)糖基化(glycosilation));道2:sEPCRvar。觀察到47kDa的擴(kuò)散帶(由于強(qiáng)烈的蛋白質(zhì)糖基化)。圖B:蛋白質(zhì)通過蛋白質(zhì)印跡使用單克隆抗-EPCR抗體進(jìn)行檢測；道St:分子量標(biāo)記，指出以kDa表示的每個條帶的分子量；道l:空白；道2:sEPCRvar。觀察到大約47kDa的擴(kuò)散帶(由于可變的蛋白質(zhì)糖基化其在35-60kDa之間)。圖5.由來自不同組織和腫瘤的cDNA擴(kuò)增EPCR基因。圖A)1:分子量標(biāo)記，2:心臟，3:肝，4:腎，5:胰，6:肺，7:胎盤。圖B)1:分子量標(biāo)記，2:骨骼肌，3:腦，4:胸腺，5:小腸，6:脾。圖C)1:標(biāo)記，2:前列腺；3:睪丸，4:卵巢，5:結(jié)腸。圖D)是來自肺腫瘤的腫瘤系的樣品2:H446,3:H510,4:H1264,5:H549,6:H4化7:HTB51，8:H676，9:H727,10:H720,11:H385,12:H1299。包含分子量標(biāo)記的道在圖中用縮寫St(來自標(biāo)準(zhǔn))指出。標(biāo)記下方的條帶對應(yīng)于100bp的大?。幻總€新條帶表示相對于先前條帶的100bp增量(100bp，200bp，300bp……)。本發(fā)明的實施方案由內(nèi)皮細(xì)胞cDNA擴(kuò)增EPCRcDNAHUVEC細(xì)胞從人臍帶靜脈中獲得，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序(JaffeEA，NachmanRL,BeckerCG，MinickCR.Cultureofhumanendothelial!cellsderivedfromumbilicalveins.Identificationbymorphologicandimmunologiccriteria.JClinInves.1973Nov;52(11):2745-56)進(jìn)行i咅養(yǎng)，并才艮才居如(Perez-RuizA，MontesR,VelascoF,Lopez-PedreraC,AntonioParamoJ，OrbeJ,HermidaJ,RochaE.Regulationbynitricoxideofendotoxin-inducedtissuefactorandplasminogenactivatorinhibitor-1inendothelialcells.ThrombHaemost.2002Dec;88(6):1060-5)中描述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)提取總RNA。將所得到的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將其與轉(zhuǎn)錄酶于37。C溫育60分鐘，隨后于65°C5分鐘用于滅活酶。為了^:到這點(diǎn)，向最終體積為10|liL的1)iigRNA中加入120單位(U)M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(GibcoBRL)，其包含4逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、2mmol/L脫氧核普酸(dNTPs,Invitrogen)、0.3昭/mL隨才幾六聚體(GibcoBRL)、0.5mmol/L二石克蘇凈唐醇(diothiotreitol)和35URNA酶抑制劑(48,000U/mL來自人胎盤的RNAsin,RNAguard,GEHealthcareBio-Science)。EPCR基因的表達(dá)通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行分析。使用的引物(Genset,法國)是對應(yīng)于序列SEQIDNO:3的5'引物和對應(yīng)于序列SEQIDNO:4的3'引物。PCR以25pL的體積進(jìn)行。使用先前通過逆轉(zhuǎn)錄1pgRNA獲得的cDNA等分試樣，向其中加入1UtaqDNA聚合酶(Roche)、2.5反應(yīng)緩沖液(Roche)、0.5laL每種引物(來自10pmol/L溶液)、0.25At氧才亥苷酸(dNTPs,GEHealthcareBio-Science)和0.25|al1mg/mLBSA。反應(yīng)混合物用水調(diào)整至25pL。擴(kuò)增循環(huán)由94°C30秒的變性階段、以及72。C3.5分鐘的另一個退火和延伸階段組成。該循環(huán)重復(fù)5次，這之后進(jìn)行32個循環(huán)，使用相同的變性階段以及68°C3分鐘的另一個退火和延伸階段。終止擴(kuò)增，使混合物于68。C維持5分鐘作為最終延伸階段。PCR擴(kuò)增的區(qū)段具有1221堿基對(bp)的長度。當(dāng)EPCR基因在這些條件下擴(kuò)增時，另外的條帶出現(xiàn)在大約850bp的高度處(圖2)。擴(kuò)增的EPCR的另外條帶的測序?qū)l帶2使用相同擴(kuò)增條件再擴(kuò)增，但從圖2的850bp條帶作為模板開始。在瓊脂糖凝膠電泳后使用商業(yè)試劑盒-QIAquickGelExtractionKit根據(jù)制造商的說明書純化擴(kuò)增產(chǎn)物。如此純化的產(chǎn)物用作才莫斗反用于序列反應(yīng)(ABIPrismBigDyeTMTerminatorCycleSequencingReadyReactionKit)。使用對應(yīng)于序列SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的引物進(jìn)行2次序列反應(yīng)，一次在5，-3，方向并且另一次在相反方向。反應(yīng)的結(jié)果在ABIPrism377DNAS叫uencers自動測序4義中分析。結(jié)論是新條帶對應(yīng)于由序列SEQIDNO:7限定的片段。這個片段的中央部分以及SEQIDN0:2的序列對應(yīng)于缺乏外顯子4和部分3'非翻譯區(qū)的新EPCR的cDNA。這種cDNA的起源可能是EPCRRNA的可變切割-剪接現(xiàn)象。這種新cDNA種類編碼氨基酸序列是SEQIDNO:l的多肽。所述序列的殘基1-17對應(yīng)于信號肽；殘基18-200對應(yīng)于EPCR的共有胞外結(jié)構(gòu)域；殘基201-256對應(yīng)于這種新形式的EPCR的新差別結(jié)構(gòu)域并代替EPCR的跨膜結(jié)構(gòu)域。這種新結(jié)構(gòu)域不符合成為跨膜結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)。與綠色熒光蛋白融合的EPCR和sEPCRvar在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)為了研究EPCR同種型的亞細(xì)胞定位，將它的cDNA在pcDNA3.1/CT-GFP-TOPO載體中克隆以將其表達(dá)為與綠色焚光蛋白的融合蛋白。^口it匕制備的載體^f吏用Lipofectamine2000(Invitrogen)用于瞬時轉(zhuǎn)化培養(yǎng)中的哺乳動物COS-7細(xì)胞；使用其中野生型EPCR的cDNA已克隆、與綠色熒光蛋白融合的相同載體作為對照。野生型EPCR和同種型的亞細(xì)胞定位通過焚光顯微鏡術(shù)檢測。如圖3中所示，野生型EPCR主要定位于細(xì)胞膜上，在其中觀察到綠色熒光；然而，依照本發(fā)明人的々支設(shè)sEPCRvar同種型不定位于細(xì)胞膜上。EPCR同種型的克隆、表達(dá)、純化和表征。克隆和表達(dá)為了表達(dá)鑒別的EPCR變體(EPCRvar),已通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)使用下列起始物擴(kuò)增不含其信號肽的sEPCRvar序列(殘基17-256):5'-agcttggcatatcgattagccaagacgcctcagatg-3'和5'-agctatcgtagcggccgcctaccctattatatcagc-3'使用內(nèi)皮細(xì)胞作為cDNA模板，其在5，和3'末端分別加入Clal和另一個Notl限制位點(diǎn)。這些修飾允許EPCR變體序列結(jié)合啤酒糖酵母的因子cc分泌信號后的pPICZocC(Invitrogen)質(zhì)粒的Clal和Notl位點(diǎn)，這允許許多蛋白質(zhì)從酵母中有效分泌至細(xì)胞外培養(yǎng)基。由于克隆過程，在sEPCRvar的氨基末端添加絲氨酸殘基和另一個異亮氨酸(isoleukin)殘基。使用直接測序檢查插入序列和載體是正確的。使用先前制備的表達(dá)載體并用Pmel限制性內(nèi)切酶使其線性化后，將巴斯德畢赤氏酵母細(xì)胞^吏用化學(xué)法(EasyComp,Invitrogen)轉(zhuǎn)化，結(jié)果產(chǎn)生在曱醇應(yīng)答內(nèi)源啟動子中通過同源重組的sEPCRvar編碼序列化的巴斯德畢赤氏酵母菌落，所述載體包;:EPCRvar編碼序列，所述sEPCRvar編碼序列依次包含zeocin抗性基因。簡言之，將轉(zhuǎn)化的酵母在4ml補(bǔ)加了1%(v/v)甘油的BMY培養(yǎng)基[1%(w/v)酵母提取物、2%(w/v)蛋白胨、100mM磷酸鉀(pH6.0)、1.34%(w/v)含石危酸銨的酵母氮源、4x10-5%(w/v)生物素](BMGY)中培養(yǎng)并在28-30。C下伴隨攪拌溫育大約18小時。通過在2,000g在室溫下離心5分鐘收集細(xì)胞。棄去上清液并由1%甲醇誘導(dǎo)sEPCRvar表達(dá)18小時。為了做到這點(diǎn)，將細(xì)胞重懸浮于3ml補(bǔ)加了0.5%(w/v)甲醇的BMY中并在大約28-30。C下伴隨劇烈攪拌溫育18小時。溫育后，將來自條件培養(yǎng)基的樣品裝載到12%NuPAGEBis-Tris凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)上并通過蛋白質(zhì)印跡使用RCR-2單克隆抗體(由Dr.KenjiFukodome友情贈予，SagaUniversity,日本)檢測sEPCRvar(圖4)。對于大規(guī)模生產(chǎn)，選擇分泌最高濃度的sEPCRvar的菌落。在由于其高sEPCRvar生產(chǎn)能力選擇的菌落中，研究其曱醇代謝(快或慢代謝者(metaboliser)),這允許確立對于大多數(shù)合適菌落的最佳表達(dá)條件。一旦培養(yǎng)條件和曱醇誘導(dǎo)被最優(yōu)化，就增加規(guī)模以生產(chǎn)大量的sEPCRvar。純化巴斯德畢赤氏酵母培養(yǎng)上清液濃縮并針對不含NaCl的20mMTris-HC1(pH7.6)透析后，執(zhí)行2個連續(xù)的純化步驟離子交換層析和凝膠過濾。在離子交換純化中，使用ResourceQ柱(GEHealthcareBio-Science)并使用等于20柱體積的0.0-300mM梯度的NaCl進(jìn)行洗脫。包含sEPCRvar的洗脫級分被合并且通過離心超濾濃縮，并且P逭后施力口到Superdex75-HR10/30牙主(GEHealthcareBio-Science)以執(zhí)行凝膠過濾。純化蛋白質(zhì)的濃度使用BCA總蛋白測定(Pierre,Rockford，IL)和BSA標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測定。為了檢測純化的sEPCRvar,將樣品裝載到12%NuPAGEBis-Tris凝膠(Invitrogen,Carlsbad,CA)上，并在還原條件下進(jìn)行電泳，隨后用考馬斯藍(lán)染色。對電泳凝膠實施電印跡并使用RCR-2單克隆抗體檢測sEPCRvar。為了估計sEPCRvar的分子量，在每次凝膠電泳中都包括分子量標(biāo)準(zhǔn)。表征新型可溶性EPCR變體的活性的生物化學(xué)分析sEPCRvar對PC的親和力APC在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中的產(chǎn)生。使用的細(xì)胞系是EA.hy926-轉(zhuǎn)化的人內(nèi)皮細(xì)胞系，其已保留表達(dá)血栓調(diào)節(jié)蛋白和EPCR的能力(Steams-KurosawaDJ,KurosawaS，MollicaJS,FerrellGL，EsmonCT.TheendothelialcellproteinCreceptoraugmentsproteinCactivationbythethrombin-thrombomodulincomplex.ProcNatlAcadSciUSA.1996;93:10212-6)。將96孔板上每孔5xl04細(xì)胞與0.02U/ml凝血酶(0.17nM)(ERL，Swansea,英國)以及溶于20mMTris緩沖液，pH7.4的50-1,000nM濃度漸增的PC(Baxter,Deerfield,IL.美國)溫育，所述Tris緩沖液補(bǔ)加了150mMNaCl，5mMCaCl2,0.6mMMgCl2,1%BSA,0.001%Tween-20和0.02%NaN3。在室溫下45分鐘后，加入最終濃度為0.2ial的來匹盧定(ScheringAG,Berlin,德國)以抑制凝血酶，并在3-4分鐘后加入最終濃度為0.4mM的顯色底物S-2366(Chromogenix，Milan,意大利)以監(jiān)控其經(jīng)由APC的蛋白水解。在孩i量培養(yǎng)板閱讀器(正MSReader,Labsystems,芬蘭)中動態(tài)記錄405nm處吸光度的增加。使用計算在這些條件下的PC激活Km值的Enzfitter程序(Biosoft,Cambridge,英國)進(jìn)行針對米畫曼方程的曲線數(shù)據(jù)調(diào)整。為了研究sEPCRvar的抑制作用，與凝血酶和PC同時加入2|imol/L。因此，可以分析sEPCRvar對PC激活的作用并與sEPCR對激活的作用進(jìn)行比較，這反映其對PC的親和力。表1顯示在sEPCR和sEPCRvar的存在或不存在下在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞表面上經(jīng)由凝血酶的C蛋白激活的生物化學(xué)表征。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>sEPCR和sEPCRvar對PC的親和力活化部分凝血激酶時間的測定。活化部分凝血激酶時間(APTT)使用DiagnosticaStagoBoehringerMannheimSTACompact設(shè)備(Roche)和Pathromtin試齊'j(DadeBehring，美國)使用來自健康受試者的5份血漿混合物進(jìn)行測定。如眾所周知的，正常血漿混合物中APC的存在導(dǎo)致APTT延長。在使用的實驗條件下，在APC不存在下的APTT是33.1士0.4秒(平均值士SD),同時當(dāng)APC以1nmol/L的最終濃度加入時，APTT延長至43.9±0.4秒。當(dāng)加入sEPCR時，APC的作用被減少，從而卩吏得在1mmol/LsEPCR的存在下APTT為37.2±0.2秒。sEPCR對APC抗凝作用的這種抑制作用是劑量依賴性的。加入正常血漿混合物中的sEPCR對APTT沒有直4^作用(不存在下的33.1士0.4秒與sEPCR存在下的33.9土0.4秒比較)。所有實一瞼重復(fù)4次。當(dāng)代替sEPCR加入相同濃度的sEPCRvar時，結(jié)果與使用sEPCR觀察到的那種結(jié)果可重疊，這證實sEPCRvar如sEPCR—樣結(jié)合APC。表2顯示sEPCR和sEPCRvar對APC抗凝功能的作用。向其中加入1nmol/LAPC和不同濃度sEPCR的正常血漿混合物的凝血時間(APTT)。表示了4次實驗的平均值士SD。在APC不存在下的APTT是33.1±0.4秒。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>在不同組織和腫瘤系中的sEPCRvar表達(dá)分析為了鑒別其中表達(dá)sEPCRvar的組織，通過PCR使用允許同時擴(kuò)增對應(yīng)于EPCR和sEPCRvar的cDNA的引物研究不同人組織的cDNA文庫(多組織cDNA(MTC)組I和II，Bioscience,美國)。使用的引物(Genset,法國)是引物5，5，-GCAGTATGTGCAGAAACATATTTCCGC畫3,和引物3，:5'-CATCCCAAGTCTGACACACCTGGAAGT-3，PCR以25)iL的體積進(jìn)行。使用cDNA等分試樣，向其中加入1UtaqDNA聚合酶(Roche)、2.5iuL反應(yīng)緩沖液(Roche)、0.5|aL每種引物(來自10pmol/L溶液)、0.25脫氧核苷酸(dNTPs，GEHealthcareBio-Science)和0.25|dl1mg/mLBSA。反應(yīng)混合物用水調(diào)整至25pL。擴(kuò)增循環(huán)由94。C30秒的變性階段、以及56°C1分鐘的另一個退火階段和72。C1.5分鐘的延伸組成。該循環(huán)重復(fù)35次。終止擴(kuò)增，使混合物于72。C維持5分鐘作為最終延伸階段。擴(kuò)增的EPCR的cDNA區(qū)段具有578bp的長度，同時sEPCRvar的那種是189bp(圖5)。sEPCRvar形式在胰、心臟、肝、腎、肺、胎盤、胸腺、小腸、脾和結(jié)腸中豐富表達(dá)。sEPCRvar形式在某些腫瘤系特別是H549、H441和H720中豐富表達(dá)。某些肺瘤系特別是H446和H676進(jìn)一步表達(dá)另一種仍未鑒別的形式，其依照其電泳遷移率具有1000bp?？贵w產(chǎn)生免疫接種至少1個月大的BALB/C雄性依照下列模式使用sEPCRvar進(jìn)行免疫3次皮下、皮內(nèi)或腹膜內(nèi)免疫接種或其組合，免疫原的量為在弗氏佐劑或另一種佐劑中的10-200昭，隔開至少2周；第三次免疫接種后2周，施用2次新的加強(qiáng)劑量，隔開2天并使用相同量的免疫原但這次溶于鹽水血清中。其他動物同樣用SEQIDNO:l的肽213-227、229-242、212-226、227-241和242-256的混合物進(jìn)行免疫接種。選擇這些肽是因為根據(jù)KyteJ.,DoolittleR.F.(J.Mol.Biol.,1982;157:105-132)的算法依照Protscale程序它們是高度親水的。融合。最后一次加強(qiáng)劑量后2天,生產(chǎn)雜交瘤；這是在聚乙二醇1500或4000的存在下由動物脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0-Agl4;P3X63-Ag8.6.5.3;P3-NS-l-Ag4-l;等)融合組成的技術(shù)。這種試劑使得膜融合，從而使得雜交體將在各種細(xì)胞類型之間產(chǎn)生動物B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞之間的雜交體將形成新細(xì)胞類型-雜交瘤，它將產(chǎn)生抗體并且在培養(yǎng)中還將是無限增殖的。向細(xì)胞培養(yǎng)物中加入HAT培養(yǎng)基以選擇這些雜交瘤并除去其余雜交體HAT包含氨基蝶呤-鳥苦從頭合成途徑(從頭途徑)的抑制劑。因為骨髓瘤細(xì)胞缺乏核酸合成補(bǔ)救途徑所需的功能性HPRT酶，所以當(dāng)唯一可用的途徑從頭途徑被氨基蝶呤阻斷時，它們不能合成核酸；因此，培養(yǎng)2周后，培養(yǎng)物中存活的唯一細(xì)胞將是脾細(xì)胞-骨髓瘤雜交體脾細(xì)胞將給予雜交體通過可替代途徑合成鳥苷的能力，并且骨髓瘤細(xì)胞給予在體外培養(yǎng)中無限培養(yǎng)的能力。產(chǎn)生抗-sEPCRvar和抗-sEPCR抗體的雜交瘤的檢測。HAT培養(yǎng)基中的細(xì)胞將分布在至少10個96孔微量培養(yǎng)板中。融合后9-14天，集落的大小將足以分析上清液中抗體的存在。為了選擇分泌目的抗體，即針對sEPCRvar的抗體的雜交瘤，上清液樣品將取自包含克隆的5個微量培養(yǎng)板的所有孔，以對其實施免疫測定執(zhí)行ELISA和蛋白質(zhì)印跡測定。對于ELISA，板用sEPCRvar包被，0.3嗎/孔；在4。C下溫育15小時并用合適蛋白質(zhì)相應(yīng)封閉后，將加入培養(yǎng)上清液，進(jìn)行相應(yīng)洗滌并隨后加入第二小鼠抗免疫球蛋白抗體。以這種方式，洗滌并用過氧化物酶和鄰苯二胺(o-phenylendiamine)使孔顯色后，其中檢測到顏色或吸光度(492nm)增加的那些孔可能包含分泌sEPCRvar抗體的雜交瘤克隆。對于蛋白質(zhì)印跡，使用重組蛋白質(zhì)和/或表達(dá)sEPCRvar蛋白質(zhì)的組織或細(xì)胞提取物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將它轉(zhuǎn)移至經(jīng)由格子類型裝置分為獨(dú)立區(qū)帶的硝酸纖維素或PVDF膜以證實上清液中特異性抗體的存在。封閉并與特異性抗體溫育后，將它洗滌3次并與綴合至過氧化物酶的第二抗體溫育。使用通過酶轉(zhuǎn)化后在它已結(jié)合特異性抗體的位置中產(chǎn)生光的底物進(jìn)行顯色。如果發(fā)光帶對應(yīng)于具有預(yù)期分子量的蛋白質(zhì)，那么上清液來自于其的孔的抗體生產(chǎn)性細(xì)月包將生長并冷凍于液氮中。因為sEPCRvar包含完整的sEPCR部分，所以將分析sEPCRvar陽性雜交瘤的重組EPCR的胞外區(qū)的反應(yīng)性。以這種方式可以選擇產(chǎn)生針對sEPCRvar特定區(qū)域的抗體的那些雜交瘤。雜交瘤的單克隆性(monoclonality)。為了確保分泌抗-sEPCRvar抗體的每種細(xì)胞培養(yǎng)物都是單克隆的，應(yīng)用克隆或限度稀釋技術(shù)來自原始培養(yǎng)或來自在第一次蛋白質(zhì)印跡或ELISA測試中陽性的干細(xì)胞的分離細(xì)胞將在新微量培養(yǎng)板上生長。一旦由一種或多種細(xì)胞產(chǎn)生的新集落獲得足夠大小，那么將再次從這些中獲取上清液以對其實施新ELISA或蛋白質(zhì)印跡。對再次陽性的集落實施限度稀釋并重復(fù)該過程直至第3次限度稀釋后分析的上清液的100%包含針對sEPCRvar的抗體?？贵w純化。在特定條件下培養(yǎng)雜交瘤以獲得更大的抗體濃度得率后(培養(yǎng)并瓦^f吏用來自IntegraBiosciences的CELline系統(tǒng)或來自BectonDickinson的CELline系統(tǒng))，將通過液相層析4吏用一種或幾種下列方法對包含IgGs的上清液實施純化免疫親和層析、親和層析(在A蛋白/G蛋白/L蛋白中，固定的金屬，生物親和性)、陽離子交換、羥磷灰石、疏水相互作用、凝膠過濾等，其中使用AKTAFPLC設(shè)備，GEHealthcareBio-Science)。參考文獻(xiàn)1.BangaloreIT,Drohan麗,Orthner.CL.'HighaffinitybindingsitesforactivatedproteinCandproteinConculturedhumanumbilicalveinendothelialcells.IndependentofproteinSanddistinctfromknownligands,ThrombHaemost199472:465-74.2.FukudomeK,EsmonCT.Identification,cloning,andregulationofanovelendothelialcellproteinC/activatedproteinCreceptor.JBiolChem1994;269:26486-91.3.Stearns-KufosawaDJ,KurosawaS,MollicaJS,FerrellGIj,EsmonCT.TheendothelialcellproteinCxeceptoraugmentsproteinCactivationbythetkrombin-thrombomodulincomplex.ProcKTatlAcadSciUSA1996;93rl0212-6,4.TaylorFBJr,PeerGT,Loc:khartMS,FerrellG,EsmonCT.EndothelialcellproteinCreceptorplaysanimportantrolein■proteinCactivationinvivo.Blood2001,.97:1685-8,5.Bigu:zziE,MeratiG,Liaw.PC,BucciarelliP,OganesyanQuD,GuJM,FetiveauR,EsmonCT,MannucciPM,FaioniEM.A23bpinsertionintheendothelialproteinCreceptor'(EPCR)geneimpairsEPCRfunction.ThrombHaetnost2001,.86:945-8.6.SaposnikB,RenyJL,GaussemP,EmmerichJ,AlachM,GandrilleS.AhaplotypeoftheEPCRgeneisassociatedwithincreasedplasmalevelsofsEPCRandisacandidateriskfactorforthrombosis,B:Lood2004,.103:1311-1318.7.UittedeWilligeS,VanMarionV,RosendaalFR,VosHL,deVisserMC,Bert.inaRM,HaplotypesoftheEPCRgene,plasmasEPCRlevelsandtheriskofdeepvenousthrombosis.JThrombHaemost.2004,'2:1305-10.8.TaylorFB<Jr,Stearns-KurossawaDO",KurosawaS,FerrellG,ChangAC,LaszikZ,KosankeS,PeerG,EsmonCT.TheendothelialcellproteinCreceptoraidsinhostdefenseagainstEscherichia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256，或所述殘基序列的片段。33.根據(jù)權(quán)利要求32的多核苷酸的用途，其特征在于所述EPCR蛋白質(zhì)以與疾病相關(guān)的量存在，所述疾病選自與血管損傷相關(guān)的炎性疾病、炎癥、癌癥以及與異常卩疑固相關(guān)的疾病。全文摘要本發(fā)明涉及起源于可變剪接機(jī)制的新型可溶形式的EPCR，并且更具體而言，涉及包括序列SEQIDNO1的殘基201-256或所述序列的片段的多肽。本發(fā)明還涉及包括所述多肽的重組或分離的EPCR蛋白質(zhì)，編碼所述多肽的分離的多核苷酸，編碼包括所述多肽的蛋白質(zhì)的mRNA，及其在疾病檢測中的用途。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括所述多核苷酸的表達(dá)載體或宿主細(xì)胞，包括表達(dá)載體和所述細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)，對于所述多肽特異的分離抗體，以及用于體外選擇性檢測生物學(xué)樣品中包括序列SEQIDNO1的EPCR蛋白質(zhì)的方法和試劑盒。文檔編號C07K14/705GK101189260SQ200680016945公開日2008年5月28日申請日期2006年3月17日優(yōu)先權(quán)日2005年3月17日發(fā)明者E·莫利納布伊,E·馬蒂納茨安索,J·赫米達(dá)桑托斯,R·蒙特斯迪阿茨申請人:西馬生物醫(yī)學(xué)計劃公司