專利名稱：福爾馬林固定組織的蛋白質(zhì)抽提的制作方法
福爾馬林固定組織的蛋白質(zhì)抽提
本發(fā)明涉及溶解，隨后定量測定蛋白質(zhì)，特別是來自福爾馬林固定的生物學(xué) 樣品中的完整全長蛋白質(zhì)的方法。
在許多國家，用福爾馬林固定組織然后進(jìn)行組織病理學(xué)檢測是一種標(biāo)準(zhǔn)方法， 其目的是為了，例如區(qū)分健康組織和患病組織。幾十年來， 一直收集福爾馬林固定
和石蠟包埋(FFPE)的組織，其是許多診斷研究的來源。可使用來自大多數(shù)器官、不 同患病階段、治療前/期間/后的組織。FFPE組織的優(yōu)點(diǎn)在于可以高度保留形態(tài)。 然而由于發(fā)生交聯(lián)，不能準(zhǔn)確的研究大分子(DNA、 RNA、蛋白質(zhì))。根據(jù)目前的觀 點(diǎn)，福爾馬林固定的組織不適用于常規(guī)且可靠地分離足量的蛋白質(zhì)，以用于隨后定 量(例如，Espina等，2003)。因此，人們正尋求替代福爾馬林固定組織隨后定量 測定大分子的方法。其中，這里述及的是冷凍組織(低溫切片)和目前討論的實(shí)驗(yàn)性 方法，例如70%乙醇(如Ahram等，2003)。冷凍物質(zhì)是優(yōu)良的大分子來源，但該 組織的收集、加工和儲(chǔ)存是昂貴的。這些實(shí)驗(yàn)性固定方法是維持大分子的形態(tài)和完 整性的良好折衷方法；然而，它們在回顧性硏究中沒什么大作用。
在大型回顧性和前瞻性研究中，必須在蛋白質(zhì)水平檢驗(yàn)人基因組項(xiàng)目所鑒定 的候選分子的臨床適用性。以前認(rèn)為不可能用福爾馬林固定的物質(zhì)進(jìn)行DNA和 RNA分析。如今，這種分析是慣常的，甚至在激光支持組織顯微切片后也可行。 同樣的物質(zhì)也適用于蛋白質(zhì)分析。分離核酸的方法與分離蛋白質(zhì)的方法極為不同。 例如，蛋白質(zhì)分離中不用蛋白酶，因?yàn)檫@樣蛋白質(zhì)會(huì)被消化，從而不再完整。對于 這點(diǎn)，可認(rèn)為表達(dá)病理學(xué)方法(WO 2004/080579 A2)是精確的，其聯(lián)用蛋白酶和 熱效應(yīng)來分離蛋白水解片段-即，肽。然后通過質(zhì)譜法分析這些片段。因此，表 達(dá)病理學(xué)方法與本文所述方法不同。充分的熱處理可破壞蛋白質(zhì)交聯(lián)鍵(福爾馬 林所造成的)。
以下是該方面的已知例子。
(1)染色質(zhì)免疫沉淀(ChiP). ChiP是能檢測靶蛋白在體內(nèi)是否與某些DNA序 列結(jié)合的方法。用福爾馬林固定完整的細(xì)胞從而導(dǎo)致DNA-蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)以及蛋
白質(zhì)-蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)。然后裂解細(xì)胞，切割DNA將其分裂成較小的片段。然后用 該靶蛋白的抗體免疫沉淀DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后加熱使DNA-蛋白質(zhì)連接鍵斷 裂，用蛋白酶破壞蛋白質(zhì)。最后，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)確認(rèn)用特定的抗體是否 共同免疫沉淀了某DNA序列。在這里，熱作用是使福爾馬林導(dǎo)致的交聯(lián)斷裂的原 理。
(2)抗原回收.抗原經(jīng)過福爾馬林固定后常喪失其免疫反應(yīng)性。因此，使用許 多抗體的免疫組織學(xué)研究只在一定范圍內(nèi)可能。目前可行的方法能恢復(fù)大多數(shù)抗原 的免疫反應(yīng)性(抗體回收)。其中的原理是在組織切片脫石蠟和再水化后，加熱水溶 液中的組織。然而，定量測定免疫組織化學(xué)反應(yīng)只在一定范圍內(nèi)可能。
制備生物分子裂解液的方法見WO 2004/080579 A2，該方法在緩沖液系統(tǒng)中 再次加熱福爾馬林固定的組織樣品，然后用蛋白水解酶處理以降解該組織。
然而，目前沒有方法能用現(xiàn)代方法定量且靈敏地可靠研究福爾馬林固定組織 中的完整蛋白質(zhì)。免疫組織化學(xué)(IHC)(測定組織切片中各細(xì)胞的免疫反應(yīng)性和分配) 是目前研究福爾馬林固定組織中蛋白質(zhì)的唯一方法。然而，IHC只能在一定范圍內(nèi) 定量。福爾馬林固定確實(shí)良好地維持了組織的形態(tài)，但導(dǎo)致蛋白質(zhì)彼此和與其它大 分子，例如DNA嚴(yán)重交聯(lián)。以前從福爾馬林固定的組織分離蛋白質(zhì)的努力(例如 Ahram等，2003)不成功，因?yàn)檫@些方法得到的蛋白質(zhì)產(chǎn)率一般很差，不可靠，只 限于蛋白質(zhì)印跡研究(例如，Ikeda等，1998)并且經(jīng)常不能檢測或定量測定完整的 蛋白質(zhì)。Ikeda等描述了實(shí)際上適用于分離FFPE組織的蛋白質(zhì)的方法，但該方 法不能定量分離。其原因是6(TC的溫育步驟明顯不足以定量分離蛋白質(zhì)。必須 能定量測定最小的固定組織樣品，例如生物活檢樣品中的蛋白質(zhì)。采用目前的 方法不能從這種樣品中分離足夠量的蛋白質(zhì)，例如用于蛋白質(zhì)陣列測定。因此， 這些方法不適用于日常常規(guī)臨床方法來測定疾病標(biāo)記。不只是蛋白質(zhì)印跡對于 從福爾馬林固定的組織定量測定蛋白質(zhì)的要求增加，臨床或研究也是。目前開 發(fā)的高通量方法，例如蛋白質(zhì)陣列正變得極其重要。目前認(rèn)為用蛋白質(zhì)陣列不 能檢測福爾馬林固定組織中的完整蛋白質(zhì)(Espina等，2003)。
因此，本發(fā)明(要解決)的問題是提供一種改進(jìn)的方法從福爾馬林固定的生物學(xué) 樣品中提取蛋白質(zhì)。
通過以下方法從福爾馬林固定的生物學(xué)樣品定量提取蛋白質(zhì)解決了該問題，
該方法是在足以釋放蛋白質(zhì)的溫度下在緩沖液中溫育生物學(xué)樣品，其中所述緩沖液 含有去污劑和無蛋白水解活性的化合物，先加熱緩沖液中的生物學(xué)樣品，然后在高
于6(TC的溫度下再次溫育。本發(fā)明的其它改進(jìn)之處見各從屬權(quán)利要求。
本文描述的發(fā)明涉及從固定的生物學(xué)樣品，例如組織樣品中提取蛋白質(zhì)用于 隨后的分析，特別是定量測定蛋白質(zhì)的明顯優(yōu)化方法，該方法與目前臨床和實(shí)驗(yàn)性 研究的高通量方法，例如蛋白質(zhì)陣列相容。這樣則易于通過抗體檢測分析和定量測 定不同疾病狀態(tài)或過程的樣品。
出乎意料的是，本發(fā)明從福爾馬林固定組織提取蛋白質(zhì)的方法能提供優(yōu)良的
結(jié)果并避免了現(xiàn)有技術(shù)水平的缺點(diǎn)。以前使用的技術(shù)明顯無法成功，因?yàn)?a)樣品 的加熱太簡單(例如，只在10(TC加熱.50秒)；或(b)使用蛋白酶(不能分離完整的蛋 白質(zhì))；或(c)實(shí)際上使用了去污劑，但隨后未充分加熱樣品(例如，不超過60'C， 嬰兒蛋白質(zhì)產(chǎn)率過低)。只有采用本文所述的方法，即例如(a)使用不含蛋白酶的緩 沖液，(b)使用去污劑和(c)較高的加熱溫度(高于6(TC，長于50秒)才能以出乎意 料的方式獲得足夠量的完整蛋白質(zhì)而用于隨后的精確定量測定。
檢測分離的完整蛋白質(zhì)的其它方法可以是，例如蛋白質(zhì)印跡、蛋白質(zhì)陣列、 免疫沉淀、SELDI-TOF質(zhì)譜法、ELISA和2-D凝膠電泳。
下文根據(jù)聚體的實(shí)施例進(jìn)一步說明了本發(fā)明。


圖1顯示了本發(fā)明方法臨床應(yīng)用的一個(gè)例子。
圖2舉例顯示在高于6CTC的溫度下溫育組織樣品提高了蛋白質(zhì)產(chǎn)率。通過 蛋白質(zhì)印跡顯示與本發(fā)明方法O60。C，例如80。C，右圖)相比，60。C(左圖)培育 樣品后a-微管蛋白的產(chǎn)率(完整蛋白，50kDa)。
圖3顯示了從福爾馬林固定的組織提取后兩種蛋白質(zhì)(E-鈣粘蛋白，a-微管 蛋白)的相關(guān)性。
圖4顯示了蛋白質(zhì)印跡(檢測蛋白質(zhì)的完整性，證明抗體特異性)和形式最 簡單的反相蛋白質(zhì)陣列(斑點(diǎn)印跡)之間的相關(guān)性。
圖5顯示了用含有不同還原劑的緩沖液提取FFPE切片后p-肌動(dòng)蛋白的相 關(guān)性。
采用本發(fā)明方法可檢測和定量測定一種完整的蛋白質(zhì)或幾種完整的蛋白 質(zhì)。能可靠地分離和定量測定來自完全不同的細(xì)胞區(qū)室(compartment),例如細(xì)
胞核、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜的蛋白質(zhì)?？梢韵♂尫蛛x的完整蛋白質(zhì)，即獲得系列稀 釋液，從而能建立內(nèi)標(biāo)曲線。這樣能確保蛋白質(zhì)的檢測和定量測定發(fā)生在線性 區(qū)域中。如果需要，可以預(yù)先采用蛋白質(zhì)印跡檢測蛋白質(zhì)以確保所用的檢測試 劑，例如抗體之間不發(fā)生交叉反應(yīng)(蛋白質(zhì)印跡中只有大小正確的一條特異性 條帶)。通過本文所述方法分離可定量的完整蛋白質(zhì)以最佳方式補(bǔ)充了日常常規(guī) 臨床方法中早已實(shí)施的免疫組織化學(xué)分析的結(jié)果。因此，首次能在固定的組織 中精確且靈敏地定量測定完整的蛋白質(zhì)(本發(fā)明要解決的問題)和蛋白質(zhì)的細(xì)胞 分配(免疫組織化學(xué))?，F(xiàn)在可以以前未有報(bào)道的精確性臨床測定已知的疾病標(biāo)
記，例如乳腺癌患者的Her2/neu。此外，可用常規(guī)蛋白質(zhì)方法，例如質(zhì)譜法分 析分離的完整蛋白質(zhì)從而能在健康和患病組織之間比較性地鑒定新的疾病標(biāo) 記。也可采用本發(fā)明方法檢測動(dòng)物組織。動(dòng)物模型已可用于許多人類疾病，例 如腫瘤疾病。通常用福爾馬林固定動(dòng)物組織，石蠟包埋，然后進(jìn)行組織病理學(xué) 檢測?？捎帽景l(fā)明分離蛋白質(zhì)的方法精確、靈敏并有效地定量測定該模型中已 知和新的疾病標(biāo)記，例如通過蛋白質(zhì)陣列。本發(fā)明(要解決)的另一問題是提供 一種應(yīng)用包(一種"試劑盒")，使用這種應(yīng)用包能可靠且高產(chǎn)率地分離福爾馬 林固定的人或動(dòng)物生物學(xué)樣品，例如組織中的完整蛋白質(zhì)。該應(yīng)用包的組分至 少有，例如(a)不含蛋白酶的緩沖液系統(tǒng)和(b)去污劑。隨該應(yīng)用包附有從福爾 馬林固定組織分離蛋白質(zhì)的詳細(xì)方案(說明書)。
本發(fā)明可用于臨床研究和基礎(chǔ)定向研究。更重要的是，本文所述的從福爾馬 林固定組織分離蛋白質(zhì)的方法可優(yōu)選整合入日常常規(guī)臨床方法。這樣，可采用顯著 更精確的診斷和治療方法。
圖l顯示了常規(guī)福爾馬林固定組織中完整蛋白質(zhì)的臨床應(yīng)用的一個(gè)例子。這 樣，可以檢測即使是經(jīng)化學(xué)修飾的蛋白質(zhì)，例如磷酸化或糖基化的蛋白質(zhì)。迄 今為止，僅在臨床上用過免疫組織化學(xué)臨床以檢測福爾馬林固定物質(zhì)中的蛋白 質(zhì)。定量測定蛋白質(zhì)的本發(fā)明方法能提供已知和新疾病標(biāo)記表達(dá)的補(bǔ)充信息， 其精確性是常規(guī)臨床方法尚未知曉的。
通過構(gòu)建蛋白質(zhì)陣列，定量蛋白質(zhì)組研究正變成常規(guī)臨床方法的一部分。然 而，由于蛋白質(zhì)產(chǎn)率不佳，目前不能用這些高通量方法檢測福爾馬林固定的組織樣 品。本發(fā)明方法解決了該缺陷。本文描述了可整合入本發(fā)明方法的用于檢測蛋白質(zhì)
的微陣列的三種示范性方案。1.所謂的夾心免疫陣列(抗體陣列I).在這種形式的 陣列中，將蛋白質(zhì)結(jié)合分子，例如抗體與固體表面偶聯(lián)。抗體特異性地結(jié)合按照所 述方法分離的蛋白質(zhì)(抗原)，然后可用為檢測而作了標(biāo)記的第二種特異性的抗原結(jié) 合抗體來檢測。2.抗原捕捉陣列(抗體陣列II).該方案也將蛋白質(zhì)結(jié)合分子，例如 抗體與固體表面偶聯(lián)。將按照本發(fā)明方法分離的蛋白質(zhì)與檢測試劑，例如熒光染料 偶聯(lián)，然后先用抗體進(jìn)行特異性結(jié)合。這樣可直接檢測所結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過比較 不同組織，例如腫瘤組織和正常組織的分離蛋白質(zhì)，可利用不同熒光染料(例如，
Cy3和Cy5)比較性地顯示感興趣蛋白質(zhì)的相對量。3.直接蛋白質(zhì)陣列(directprotein array,反相蛋白質(zhì)陣列).在此方法中，將按照所述方法分離的蛋白質(zhì)直接滴加到 合適的表面，例如硝化纖維素或PVDF上，用特異性抗體(用第二檢測抗體)直接或 間接檢測結(jié)合的蛋白質(zhì)。信號擴(kuò)增方法(例如，DAKO的CSA)能非常靈敏且特異性 地檢測溶液中的蛋白質(zhì)。此方法與已知的斑點(diǎn)印跡非常類似。
本發(fā)明提供定量測定福爾馬林固定的組織樣品中蛋白質(zhì)的方法。該項(xiàng)技術(shù)首 次在接近臨床條件下精確地測定了組織樣品中的疾病標(biāo)記。出乎意料地發(fā)現(xiàn)，對于 小組織樣品(例如，生物活檢)研究中所需的固定組織中完整蛋白質(zhì)的高產(chǎn)率而言， 聯(lián)用以前未獲成功的技術(shù)至關(guān)重要。例如，以前的方法先將組織樣品加熱至IO(TC， 然后在6(TC長時(shí)間加熱。發(fā)現(xiàn)延長樣品在6(TC的加熱時(shí)間不足以獲得高產(chǎn)率的蛋 白質(zhì)。將樣品加熱至高于6(TC，例如8tTC，得到的溶解蛋白質(zhì)含量明顯較高(圖 2)。相應(yīng)地，本發(fā)明方法可由以下步驟構(gòu)成
(a) 切割福爾馬林固定的和石蠟包埋的組織樣品塊；
(b) 除去各切片的石蠟；
(c) 通過手工或激光顯微切片將要研究的組織區(qū)域從組織切片上切下(任選可 研究整個(gè)組織)；
(d) 將切下的組織片轉(zhuǎn)移至含有去污劑但不含蛋白水解活性化合物的緩沖液 中。不使用蛋白酶，例如胰蛋白酶或蛋白激酶K以確保蛋白質(zhì)的完整性；
(e) 首先加熱緩沖液中的樣品(加熱至95'C-10(TC)。培育時(shí)間可以不同，例如 5分鐘-40分鐘。加熱時(shí)間可取決于例如樣品的大??；
(f) 然后在高于60'C的溫度(例如，8(TC)溫育樣品。高于6(TC的溫育時(shí)間可以 不同，例如l小時(shí)-6小時(shí)。然而，高于60'C的最長溫育時(shí)間應(yīng)不超過16小時(shí)；
(g)現(xiàn)在溶液中完整蛋白質(zhì)的含量足夠可以進(jìn)行，例如定量測定。
本發(fā)明方法的另一優(yōu)選實(shí)施方式使用含有DTT的提取緩沖液。使用DTT作 為還原劑公認(rèn)對于分離的完整蛋白質(zhì)的產(chǎn)率特別有益。該實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)尤其在于 獲得的裂解液可以直接定量測定，特別適用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的市售可得的蛋 白質(zhì)定量測定試驗(yàn)，例如Pierce的BioRad DC⑧或BCA試驗(yàn)⑧并可用于進(jìn)一步 分析?？梢圆幌♂寴悠?，從而避免檢測的不精確并確保在隨后的分析(例如，蛋 白質(zhì)印跡)中使用相同量的蛋白質(zhì)。
圖1顯示了本發(fā)明方法臨床應(yīng)用的一個(gè)例子。福爾馬林固定的組織中完整蛋 白質(zhì)的高產(chǎn)率使得可首次整合常規(guī)獲得的生物活檢或解剖物質(zhì)的組織學(xué)、免疫組織 學(xué)和定量蛋白質(zhì)表達(dá)。例如，該方法能在不同疾病階段(惡化前、侵襲性)或治療前 后通過蛋白質(zhì)陣列精確檢測疾病標(biāo)記。
圖2顯示了通過在高于60。C的溫度溫育組織樣品提高蛋白質(zhì)產(chǎn)率的例子。比 較了在60。C (左圖)與用本發(fā)明方法&6(TC，例如，80°C，右圖)溫育樣品后通過蛋 白質(zhì)印跡檢測的a-微管蛋白(完整的蛋白質(zhì)，50kDa)產(chǎn)率。
圖3顯示了從福爾馬林固定的組織提取后兩種蛋白質(zhì)(E-鈣粘蛋白、a-微管蛋 白)的相關(guān)性。兩種蛋白質(zhì)的信號強(qiáng)度彼此良好相關(guān)，即從福爾馬林固定的組織分 離后完整的蛋白質(zhì)彼此相關(guān)(定量的)。采用蛋白質(zhì)印跡分析正常結(jié)腸組織的蛋白質(zhì) 裂解液的不同稀釋液(1:2-1: 16)。為了說明，顯示了從載玻片上刮下前后的組織(箭 頭)。Unverd.=未稀釋的樣品。
圖4顯示了蛋白質(zhì)印跡(檢測蛋白質(zhì)的完整性，證明抗體特異性)和形式最 簡單的反相蛋白質(zhì)陣列(斑點(diǎn)印跡)之間的相關(guān)性。采用蛋白質(zhì)印跡和斑點(diǎn)印跡檢
測正常結(jié)腸組織的蛋白質(zhì)裂解液的不同稀釋液(1:2-1:64)。對于光密度評估，在各
情況下，百分比值相對于未稀釋的樣品作圖(下圖X未稀釋的樣品=ioo%)。 Negative,陰性對照(提取緩沖液)；Positive,陽性對照(深凍結(jié)腸組織的蛋白質(zhì)裂解 液)。
圖5顯示了用含有不同還原劑的緩沖液提取FFPE切片后P-肌動(dòng)蛋白的相 關(guān)性。(A)用兩種提取緩沖液EB(含有p-巰基乙醇)和EB2(含DTT)分離正常腦 組織的完整蛋白質(zhì)。采用斑點(diǎn)印跡通過(3-肌動(dòng)蛋白免疫染色(immunocolouration) 分析蛋白質(zhì)裂解液的稀釋液。信號強(qiáng)度良好相關(guān)。(B)用市售可得的蛋白質(zhì)定
量試劑盒測定用提取緩沖液EB2制備的蛋白質(zhì)裂解液的蛋白質(zhì)濃度。(C)根據(jù) 用蛋白質(zhì)定量試劑盒定量的蛋白質(zhì)和斑點(diǎn)圖中的相關(guān)性，采用SDS-PAGE分離 各20嗎的兩種蛋白質(zhì)裂解液，采用蛋白質(zhì)印跡測定P-肌動(dòng)蛋白的含量。兩份 樣品的信號強(qiáng)度良好相關(guān)并能定量。
本發(fā)明所稱的緩沖液或緩沖液系統(tǒng)涉及具有1.0-9.0范圍內(nèi)特定pH值的緩沖液。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知且適用于細(xì)胞裂解的所有去污劑可用作本發(fā)明方法的去 污劑。特別是SDS、脫氧膽酸鈉、CHAPS、 Triton XIOO、 Nonidet P40或吐溫20
可用作去污劑。
去污劑的濃度可以是，例如0.1-10%。特別優(yōu)選的濃度范圍在約1-5%之間。 此夕卜，緩沖液可含有額外的還原劑，例如1,4-二硫-DL-蘇糖醇、DTE、 TCEP 或MEA。
本發(fā)明所稱的蛋白質(zhì)水解活性化合物應(yīng)理解為包括所有蛋白質(zhì)切割化合 物，例如蛋白質(zhì)水解酶，如蛋白酶，特別是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋 白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶和內(nèi)切蛋白酶Lys-C。此外，本發(fā)明所稱的蛋白 質(zhì)水解活性化合物也包括適合于切割蛋白質(zhì)的非酶促物質(zhì)，例如溴化氰 (bromocyan)。
本發(fā)明所稱的生物學(xué)樣品可以是完整的生物體、組織切片、組織樣品、體液、 細(xì)胞或病毒物質(zhì)。本發(fā)明方法優(yōu)選使用組織樣品和/或細(xì)胞培養(yǎng)物。這些樣品可以 是人或動(dòng)物的生物學(xué)樣品，但也可以是細(xì)菌、病毒或單細(xì)胞生物的樣品。 優(yōu)選用福爾馬林固定生物學(xué)樣品和/或用福爾馬林固定并用石蠟包埋。 因此，本發(fā)明描述了從福爾馬林固定的生物學(xué)樣品提取蛋白質(zhì)的方法，該方 法在足以釋放蛋白質(zhì)的溫度下用緩沖液溫育生物學(xué)樣品，所述緩沖液含有去污劑和 無蛋白水解活性的化合物，首先加熱緩沖液中的生物學(xué)樣品，然后在高于6(TC的 溫度再次溫育。
生物學(xué)樣品優(yōu)選在緩沖液中加熱5-40分鐘。特別優(yōu)選加熱生物學(xué)樣品20分鐘 -16小時(shí)。
本發(fā)明的特別優(yōu)點(diǎn)是所釋放的蛋白質(zhì)基本上完整。
20。
緩沖液優(yōu)選含有額外的還原劑，例如1，4-二硫-DL-蘇糖醇、DTE、 TCEP或 MEA。
當(dāng)生物學(xué)樣品是用福爾馬林固定和石蠟包埋的樣品時(shí)，在提取蛋白質(zhì)之前要 脫石蠟。
本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)是可以進(jìn)一步級分提取的蛋白質(zhì)。 具體地說，可用一個(gè)或多個(gè)步驟級分提取的蛋白質(zhì)。 另一優(yōu)點(diǎn)是隨后可以定量測定蛋白質(zhì)。
優(yōu)選通過Lowry或BCA方法定量測定蛋白質(zhì)，也可采用其它定量測定方法， 特別是蛋白質(zhì)陣列。
然后可用多蛋白水解酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白激酶K、木瓜 蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋白酶、內(nèi)切蛋白酶Lys-C、內(nèi)切蛋白酶Glu-C-或糖 苷酶(如內(nèi)切糖苷酶H、 N-糖苷酶F、神經(jīng)氨酸酶(neuroaminidase))或磷酸酶進(jìn)一 步處理提取的蛋白質(zhì)。
這些蛋白質(zhì)優(yōu)選可用于至少一種生物化學(xué)試驗(yàn)。
例如，優(yōu)選的生物化學(xué)試驗(yàn)是蛋白質(zhì)陣列，例如微陣列，特別是夾心免疫陣
列、抗原捕捉陣列或直接蛋白質(zhì)陣列。
生物化學(xué)試驗(yàn)優(yōu)選用于測定一種或幾種診斷或臨床相關(guān)的標(biāo)記蛋白質(zhì)。 因此能相互比較至少兩種生物學(xué)樣品的標(biāo)記蛋白質(zhì)。例如，因而能區(qū)分患病
和健康(對象)。此外，也可在較高的多重水平(multiplexlevel)進(jìn)行該試驗(yàn)以分析一
種或多種相關(guān)標(biāo)記。
特別優(yōu)選的生物學(xué)樣品是組織樣品，例如用石蠟包埋的福爾馬林固定樣品。
特別優(yōu)選的緩沖液不含有蛋白酶，如蛋白水解活性化合物。
此外，本發(fā)明提供從福爾馬林固定的樣品中定量提取完整蛋白質(zhì)的試劑盒，
其裝有
(a) 不含蛋白水解活性化合物的緩沖液系統(tǒng)，和
(b) 去污劑。
試劑盒優(yōu)選裝有SDS、脫氧膽酸鈉、CHAPS、 Triton X100、 Nonidet P40或
吐溫20作為去污劑。
特別優(yōu)選的緩沖液不含有蛋白酶，如蛋白水解活性化合物。 具體實(shí)施例
實(shí)施例l:從福爾馬林固定的組織提取蛋白質(zhì)
下文詳細(xì)描述了本發(fā)明的典型蛋白質(zhì)提取方法。圖2顯示了本發(fā)明方法相對 于標(biāo)準(zhǔn)方法的明顯改進(jìn)之處(蛋白質(zhì)產(chǎn)率高)。有經(jīng)驗(yàn)的操作者在一定程度上可以改 變該方案的一個(gè)或其它步驟。可以使用在一定程度上組成和pH不同的緩沖液。然 而，使用去污劑，例如SDS，在95'C-10(TC加熱樣品和隨后在高于6(TC的溫度(例 如，8(TC)溫育是至關(guān)重要的；此外不可使用蛋白酶。各熱處理的時(shí)間和緩沖液的 體積可以不同。組織的手工切碎也可以不同。例如，可采用機(jī)械方法(例如，使用 研棒)或超聲進(jìn)行。本文列出了典型的時(shí)間和體積。圖3顯示了福爾馬林固定組織 的兩種蛋白質(zhì)的相關(guān)性結(jié)果。圖4顯示了含有福爾馬林固定組織的完整蛋白質(zhì) 的第一種蛋白質(zhì)陣列(反相蛋白質(zhì)陣列，斑點(diǎn)印跡)。
典型過程
1. 用同樣的石蠟塊制備2X10pm切片
2. 使切片脫石蠟
2.1. IO分鐘二甲苯，重復(fù)2X
2.2. 10分鐘100%乙醇
2.3. 10分鐘96%乙醇
2.4. 10分鐘70%乙醇
2.5. 將切片轉(zhuǎn)移至蒸餾水中
3. 從蒸餾水中取出切片，簡單干燥(但不應(yīng)干透)
4. 用套管刮下組織區(qū)域
5. 將套管上的組織轉(zhuǎn)移入100 提取緩沖液(EB)* (每1.5 ml反應(yīng)容器2 個(gè)切片的組織)
6. 用特氟隆研棒在提取緩沖液中充分研磨，置于冰上
7. 旋振，置于冰上
8. 重復(fù)步驟6-7—次
9. 利用注射器小心抽吸溶液數(shù)次10. 旋振，置于冰上
11. 旋振，置于冰上(如果泡沫很多，短時(shí)離心)
12. 20分鐘，100。C (水浴) 13.2小時(shí)，80°C (搖床，750 rpm)
14. 離心15分鐘，4°C， 12500 rpm
15. 將上清液轉(zhuǎn)移入新鮮的1.5ml反應(yīng)容器-〉準(zhǔn)備蛋白質(zhì)裂解
*制備提取緩沖液(EB): T-PER (Pierce)/Lammlil:2
a. 5X Lammli緩沖液母液(不含溴苯酚藍(lán))10 ml每批 2.5 ml 1.25 M Tris/HCl (pH 6.8)
4.5 ml甘油
2.8 ml P-巰基乙醇
1 g SDS
用蒸餾水加至10 ml
b. 2XLammli緩沖液1000 pi 5 XLammli緩沖液+ 1500 pi蒸餾水
c. 對于5ml提取緩沖液 2.5 ml T-PER (Pierce)
+ 2.5 ml 2XLSmmli緩沖液
+ '/2完全Mini蛋白酶抑制劑藥片(Bayer)
-201:冷凍等份試樣
實(shí)施例2:用另一種提取緩沖液EB2從FFPE組織提取蛋白質(zhì)
本發(fā)明方法的另一實(shí)施方式使用DTT(l，4-二硫-DL-蘇糖醇)。例如，在用 BioRad公司的DC蛋白質(zhì)測定試劑盒⑧或Pierce的Micro BCA測定試劑盒⑧定
量測定分離的蛋白質(zhì)中優(yōu)選使用DTT(圖5)。
SDS濃度和在IO(TC和8(TC的相應(yīng)溫育時(shí)間不變。該實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)是能用 不含會(huì)干擾測定的組分(在這里是還原劑)的市售蛋白質(zhì)定量試劑盒直接測定待用 蛋白質(zhì)裂解液的濃度。線性區(qū)域內(nèi)能更好的檢測蛋白質(zhì)濃度，如果合適的話，隨后 必須稀釋樣品，只是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)含量高。這樣可以獲得更精確的檢測結(jié)果，從而可 將各含量的蛋白質(zhì)用于下游應(yīng)用。
1. 從同樣的石蠟塊上切下2X10^im的切片，轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器中
2. 使切片脫石蠟
2.1. 10分鐘二甲苯，重復(fù)2X
2.2. 10分鐘100%乙醇
2.3. 10分鐘96%乙醇
2.4. 10分鐘70%乙醇
3. 加入100^提取緩沖液(EB2)*
4. 旋振，置于冰上
5. 小心地將溶液抽入移液管數(shù)次
6. 旋振，置于冰上(如果泡沫很多，短時(shí)離心)
7. 20分鐘，IO(TC (水浴)
8. 2小時(shí)，80。C (搖床，750 rpm)
9. 離心15分鐘，4°C， 12500 rpm
10. 將上清液轉(zhuǎn)移入新鮮的1.5ml反應(yīng)容器+準(zhǔn)備蛋白質(zhì)裂解
11. 用市售蛋白質(zhì)定量試劑盒定量測定
另一種提取緩沖液2(EB2) 90 mM Tris/HCl (pH 6.8) 20%甘油 2 % SDS
1 mM DTT (1,4-二硫-DL-蘇糖醇) -20^冷凍等份試樣
權(quán)利要求
1.從福爾馬林固定的生物學(xué)樣品提取蛋白質(zhì)的方法，該方法是在足以釋放所述蛋白質(zhì)的溫度下，在緩沖液中溫育所述生物學(xué)樣品，其特征在于，所述緩沖液含有去污劑，不含蛋白水解活性化合物，首先加熱所述緩沖液中的所述生物學(xué)樣品，然后在高于60℃的溫度再次溫育。
2. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，將所述生物學(xué)樣品在所述緩沖 液中加熱5-40分鐘。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，將所述生物學(xué)樣品溫育 20分鐘到16小時(shí)。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所釋放的蛋白質(zhì)是 完整的。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述去污劑是SDS、 脫氧膽酸鈉、CHAPS、 TritonX100、 Nonidet P40或吐溫20。
6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述緩沖液還含有 還原劑，例如1,4-二硫-DL-蘇糖醇、DTE、 TCEP或MEA。
7. 如權(quán)利要求l-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述樣品是用石 蠟包埋的福爾馬林固定樣品時(shí)，先使該生物學(xué)樣品脫蠟再提取蛋白質(zhì)。
8. 如權(quán)利要求l-7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，提取后進(jìn)一步級分 所述蛋白質(zhì)。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，用一個(gè)或多個(gè)方法步驟級分提 取的蛋白質(zhì)。
10. 如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，隨后定量測定提 取的蛋白質(zhì)。
11. 如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，采用Lowry或BCA方法定量測定蛋白質(zhì)。
12. 如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，用蛋白水解酶， 例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、蛋白激酶K、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、鏈霉蛋 白酶、內(nèi)切蛋白酶Lys-C、內(nèi)切蛋白酶Glu-C-或糖苷酶-如內(nèi)切糖苷酶H、 N- 糖苷酶F、神經(jīng)氨酸酶)或磷酸酶處理提取的蛋白質(zhì)。
13. 如權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)用于 至少一種生物化學(xué)試驗(yàn)。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述生物化學(xué)試驗(yàn)是蛋白質(zhì) 陣列，例如微陣列，特別是夾心免疫陣列、抗原捕捉陣列或直接蛋白質(zhì)陣列。
15. 如權(quán)利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述生物化學(xué)試驗(yàn)用 于測定一種或幾種診斷或臨床相關(guān)的標(biāo)記蛋白質(zhì)。
16. 如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，相互比較至少兩個(gè)生物學(xué)樣 品的標(biāo)記蛋白質(zhì)。
17. 如權(quán)利要求l-16中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述生物學(xué)樣品 是組織樣品。
18. 如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述蛋白水解活 性化合物是蛋白酶。
19. 從福爾馬林固定的樣品中定量提取完整蛋白質(zhì)的試劑盒，其裝有(a) 不含蛋白水解活性化合物的緩沖液系統(tǒng)，和(b) 去污劑。
20. 如權(quán)利要求19所述的試劑盒，其中去污劑是SDS、脫氧膽酸鈉、CHAPS、 Triton XI00、 Nonidet P40或吐溫20。
21. 如權(quán)利要求20所述的試劑盒，其特征在于，所述蛋白水解活性化合物是 蛋白酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及能溶解，隨后定量測定福爾馬林固定生物學(xué)樣品中的完整蛋白質(zhì)的方法。該方法能提取這些樣品的全長蛋白質(zhì)，隨后對其進(jìn)行分析。
文檔編號C07K1/36GK101180310SQ200680017361
公開日2008年5月14日 申請日期2006年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月19日
發(fā)明者K·-F·貝克, P·普羅斯維斯基 申請人:恰根有限公司