專利名稱：人類原癌基因及其編碼的蛋白質(zhì)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種表現(xiàn)出誘導癌發(fā)生和癌轉(zhuǎn)移能力的新的原癌基因及其編碼的蛋白質(zhì)。

背景技術：
通常，已知高等動物，包括人，具有大約30,000個基因，但每個個體中只能表達大約15％的基因。因此，發(fā)現(xiàn)根據(jù)被選擇和表達的基因決定所有生命現(xiàn)象，即發(fā)育、分化、穩(wěn)態(tài)、對刺激的反應、細胞周期控制、老化和細胞凋亡(程序性細胞死亡)等(Liang，P.和A.B.Pardee，Science 257967-971，1992)。
病理現(xiàn)象如腫瘤發(fā)生由遺傳變異引起，其導致基因表達的改變。因此，不同細胞間基因表達的比較被認為是理解多種生物學機制的基礎和根本方法。
例如，由Liang和Pardee提出的mRNA差異顯示方法(Liang，P和A.B.Pardee，參見上述參考文獻)已經(jīng)有效用于尋找腫瘤抑制基因、與細胞周期調(diào)控有關的基因和與細胞凋亡有關的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因等，并還廣泛用于確定在單個細胞出現(xiàn)的多種基因之間的關系。
將腫瘤發(fā)生的多種起因綜合起來，有報道稱例如特定染色體雜合性的丟失、原癌基因的激活和包括p53基因的其它腫瘤抑制基因的失活的多種遺傳改變在腫瘤組織內(nèi)積累，導致人類腫瘤的形成(Bishop，J.M.，Cell 64235-248，1991；Hunter，T.，Cell 64249-270，1991)。同樣，有報道稱10～30％的癌癥是由原癌基因通過原癌基因的擴增而激活從而誘導的。
原癌基因的激活在多種癌癥的病因?qū)W研究中起著重要的作用，因此，人們已經(jīng)進行了嘗試以確定該作用。
因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在原癌基因水平研究產(chǎn)生乳腺癌的機制，因此稱為人類增殖誘導基因(PIG)(proliferation inducing gene)的原癌基因，只在癌細胞中表現(xiàn)出特定升高的表達水平。該原癌基因可以有效地用于診斷、預防和治療如乳腺癌、白血病、子宮癌、惡性淋巴瘤等的多種癌癥。


發(fā)明內(nèi)容
因此，設計本發(fā)明以解決現(xiàn)有技術的問題，因此本發(fā)明的目的是提供一種原癌基因或其片段。
本發(fā)明的另一目的是提供一種包含上述原癌基因或其片段的重組載體；和用該重組載體轉(zhuǎn)化的微生物。
本發(fā)明的又一目的是提供由上述原癌基因編碼的蛋白質(zhì)；或其片段。
本發(fā)明的又一目的是提供一種用于診斷癌癥，包括所述原癌基因或其片段的試劑盒。
本發(fā)明的再一目的是提供一種用于診斷癌癥，包括所述蛋白質(zhì)或其片段的試劑盒。
為了完成上述目的之一，本發(fā)明提供了具有DNA序列的原癌基因及其片段，該DNA序列選自由SEQ ID NO1；SEQ ID NO5；SEQ ID NO9；SEQID NO13；SEQ ID NO17；SEQ ID NO21；SEQ ID NO25；SEQ ID NO29；SEQ ID NO33；SEQ ID NO37；SEQ ID NO41；SEQ ID NO45；SEQ ID NO49；SEQ ID NO53；SEQ ID NO57；SEQ ID NO61；SEQ ID NO65；SEQID NO69；SEQ ID NO73；SEQ ID NO77和SEQ ID NO81組成的組。
根據(jù)上述另一目的，本發(fā)明提供一種包含上述原癌基因或其片段的重組載體；和用該重組載體轉(zhuǎn)化的微生物。
根據(jù)上述又一目的，本發(fā)明提供含有氨基酸序列的蛋白質(zhì)及其片段，該氨基酸序列選自由SEQ ID NO2；SEQ ID NO6；SEQ ID NO10；SEQ ID NO14；SEQ ID NO18；SEQ ID NO22；SEQ ID NO26；SEQ ID NO30；SEQID NO34；SEQ ID NO38；SEQ ID NO42；SEQ ID NO46；SEQ ID NO50；SEQ ID NO54；SEQ ID NO58；SEQ ID NO62；SEQ ID NO66；SEQ ID NO70；SEQ ID NO74；SEQ ID NO78和SEQ ID NO82組成的組，該蛋白質(zhì)及其片段分別由上述原癌基因編碼。
根據(jù)上述又一目的，本發(fā)明提供一種包括上述原癌基因或其片段的用于診斷癌癥的試劑盒。
根據(jù)上述再一目的，本發(fā)明提供一種包括上述原癌蛋白或其片段的用于診斷癌癥的試劑盒。
下文，參照附圖將詳細描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。
1.PIG12 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因12(PIG 12)(下文，稱為PIG 12原癌基因)具有SEQ ID NO1示出的1,258-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO1的DNA序列中，對應于68-1,252核苷酸序列位置的可讀框(1,250-1,252終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO2且包含394個氨基酸(“PIG12蛋白質(zhì)”)。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有394個氨基酸，且具有示于SEQID NO2的氨基酸序列，且分子量大約為46KDa。
2.PIG18 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因18(PIG 18)(下文，稱為PIG 18原癌基因)具有SEQ ID NO5示出的1,024-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO5的DNA序列中，對應于875-1,063核苷酸序列位置的可讀框(1,061-1,063終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO6且包含62個氨基酸(下文稱為“PIG18A蛋白質(zhì)”)。
SEQ ID NO5的DNA序列已經(jīng)由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY771596(預定發(fā)布日期2005年12月31日)，且該DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內(nèi)的收錄號為NM_001992的人類凝血因子II(凝血酶)受體(F2R)基因的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)PIG18原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，而在多種正常組織中其表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有62個氨基酸，且具有示于SEQ IDNO6的氨基酸序列，且分子量大約為7KDa。
3.PIG23 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因23(PIG23)(下文，稱為PIG 23原癌基因)具有SEQ ID NO9示出的2,150-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO9的DNA序列中，對應于25-1,953核苷酸序列位置的可讀框(1,951-1,953終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO10且包含642個氨基酸(下文稱為“PIG23蛋白質(zhì)”)。
SEQ ID NO9的DNA序列已經(jīng)由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY826819(預定發(fā)布日期2005年12月31日)，且該DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內(nèi)的收錄號為NM_016166的人類活化的STAT的抑制蛋白(PIAS1)基因的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)PIG23原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，而在多種正常組織中其表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有642個氨基酸，且具有示于SEQID NO10的氨基酸序列，且分子量大約為70KDa。
4.PIG27 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因27(PIG27)(下文，稱為PIG 27原癌基因)具有SEQ ID NO13示出的446-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO13的DNA序列中，對應于20-337核苷酸序列位置的可讀框(335-337終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO14且包含105個氨基酸(下文稱為“PIG27蛋白質(zhì)”)。
SEQ ID NO13的DNA序列已經(jīng)由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY453399(預定發(fā)布日期2005年12月31日)，且該DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內(nèi)的收錄號為CR456487的人類DNAL4全長可讀框(ORF)cDNA克隆基因等的相似。這些基因的功能還是未知的。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)PIG27原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，而在多種正常組織中其表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有105個氨基酸，且具有示于SEQID NO14的氨基酸序列，且分子量大約為12KDa。
5.PIG28 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因28(PIG28)(下文，稱為PIG 28原癌基因)具有SEQ ID NO17示出的1,024-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO17的DNA序列中，對應于33-998核苷酸序列位置的可讀框(996-998終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO18且包含321個氨基酸(下文稱為“PIG28蛋白質(zhì)”)。
SEQ ID NO17的DNA序列已經(jīng)由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY453398(預定發(fā)布日期2005年3月31日)，且該DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內(nèi)的收錄號分別為NM_001153和BC000182的人類膜聯(lián)蛋白A4(ANXA4)基因和人類膜聯(lián)蛋白A4基因的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)PIG28原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，而在多種正常組織中其表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有321個氨基酸，且具有示于SEQID NO18的氨基酸序列，且分子量大約為36KDa。
6.PIG30 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因30(PIG30)(下文，稱為PIG 30原癌基因)具有SEQ ID NO21示出的2,152-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO21的DNA序列中，對應于6-2,150核苷酸序列位置的可讀框(2,148-2,150終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO22且包含714個氨基酸(PIG30蛋白質(zhì))。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有714個氨基酸，且具有示于SEQID NO22的氨基酸序列，且分子量大約為82KDa。
7.PIG31 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因31(PIG31)(下文，稱為PIG 31原癌基因)具有SEQ ID NO25示出的2,246-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO25的DNA序列中，對應于37-2,232核苷酸序列位置的可讀框(2,230-2,232終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO26且包含731個氨基酸(PIG31蛋白質(zhì))。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有731個氨基酸，且具有示于SEQID NO26的氨基酸序列，且分子量大約為83KDa。
8.PIG38 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因38(PIG38)(下文，稱為PIG 38原癌基因)具有SEQ ID NO29示出的1,973-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO29的DNA序列中，對應于25-1,956核苷酸序列位置的可讀框(1,954-1,956終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO30且包含643個氨基酸(PIG38蛋白質(zhì))。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有643個氨基酸，且具有示于SEQID NO30的氨基酸序列，且分子量大約為73KDa。
9.PIG40 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因40(PIG40)(下文，稱為PIG 40原癌基因)具有SEQ ID NO33示出的1,586-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO33的DNA序列中，對應于36-1,541核苷酸序列位置的可讀框(1,539-1,541終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO34且包含501個氨基酸(下文稱為“PIG40蛋白質(zhì)”)。
SEQ ID NO33的DNA序列已經(jīng)由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY762100(預定發(fā)布日期2005年12月31日)，且該DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內(nèi)的收錄號為NM_001349的天冬氨酰-tRNA合成酶(DARS)基因等的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)PIG40原癌基因在包括白血病的多種人類腫瘤中高表達，而在多種正常組織中其表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有501個氨基酸，且具有示于SEQID NO34的氨基酸序列，且分子量大約為57KDa。
10.PIG43 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因43(PIG43)(下文，稱為PIG 43原癌基因)具有SEQ ID NO37示出的1,245-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO37的DNA序列中，對應于57-758核苷酸序列位置的可讀框(756-758終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO38且包含233個氨基酸(下文稱為“PIG43蛋白質(zhì)”)。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有233個氨基酸，且具有示于SEQID NO38的氨基酸序列，且分子量大約為26KDa。但是，在不影響蛋白質(zhì)功能的范圍內(nèi)，可以取代、添加或去除所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的一個或多個氨基酸，并且根據(jù)其用途可以只使用一些蛋白質(zhì)。這樣修飾的氨基酸序列同樣包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明也包括具有與致癌蛋白基本相同的氨基酸序列的多肽；及其片段。術語“基本相同的多肽”是指具有至少80％，優(yōu)選至少90％，且最優(yōu)選至少95％的序列同源性的多肽。
11.PIG44 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因44(PIG44)(下文，稱為PIG 44原癌基因)具有SEQ ID NO41示出的1,721-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO41的DNA序列中，對應于55-1,512核苷酸序列位置的可讀框(1,510-1,512終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO42且包含485個氨基酸(PIG44蛋白質(zhì))。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有485個氨基酸，且具有示于SEQID NO42的氨基酸序列，且分子量大約為55KDa。
12.PIG46 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因46(PIG46)(下文，稱為PIG 46原癌基因)具有SEQ ID NO45示出的1,312-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO45的DNA序列中，對應于5-1,297核苷酸序列位置的可讀框(1,295-1,297終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO46且包含430個氨基酸(PIG46蛋白質(zhì))。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有430個氨基酸，且具有示于SEQID NO46的氨基酸序列，且分子量大約為48KDa。
13.PIG47 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因47(PIG47)(下文，稱為PIG 47原癌基因)具有SEQ ID NO49示出的827-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO49的DNA序列中，對應于56-826核苷酸序列位置的可讀框(824-826終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO50且包含256個氨基酸(PIG47蛋白質(zhì))。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有256個氨基酸，且具有示于SEQID NO50的氨基酸序列，且分子量大約為29KDa。
14.PIG48 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因48(PIG48)(下文，稱為PIG 48原癌基因)具有SEQ ID NO53示出的1,707-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO53的DNA序列中，對應于57-1,694核苷酸序列位置的可讀框(1,692-1,694終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO54且包含545個氨基酸(PIG48蛋白質(zhì))。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有545個氨基酸，且具有示于SEQID NO54的氨基酸序列，且分子量大約為60KDa。
15.PIG50 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因50(PIG50)(下文，稱為PIG 50原癌基因)具有SEQ ID NO57示出的643-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO57的DNA序列中，對應于2-595核苷酸序列位置的可讀框(593-595終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO58且包含197個氨基酸(PIG50蛋白質(zhì))。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有197個氨基酸，且具有示于SEQID NO58的氨基酸序列，且分子量大約為22KDa。
16.PIG54 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因54(PIG54)(下文，稱為PIG 54原癌基因)具有SEQ ID NO61示出的1,936-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO61的DNA序列中，對應于38-1,840核苷酸序列位置的可讀框(1,838-1,840終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO62且包含600個氨基酸(PIG54蛋白質(zhì))。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有600個氨基酸，且具有示于SEQID NO62的氨基酸序列，且分子量大約為69KDa。
17.PIG55 本發(fā)明的原癌基因，人類增殖誘導基因55(PIG55)(下文，稱為PIG 55原癌基因)具有SEQ ID NO65示出的526-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO65的DNA序列中，對應于15-485核苷酸序列位置的可讀框(483-485終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO66且包含156個氨基酸(PIG55蛋白質(zhì))。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有156個氨基酸，且具有示于SEQID NO66的氨基酸序列，且分子量大約為18KDa。
18.GIG9 本發(fā)明的原癌基因，人類原癌基因GIG9具有SEQ ID NO69示出的1,008-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO69的DNA序列中，對應于1-1,008核苷酸序列位置的可讀框(1006-1008終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO70且包含335個氨基酸(下文稱為“GIG9蛋白質(zhì)”)。
SEQ ID NO69的DNA序列已經(jīng)由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY453396(預定發(fā)布日期2005年3月31日)，且該DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內(nèi)的收錄號為NM_016930的人類突觸融合蛋白(STX18)基因的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)GIG9原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，而在多種正常組織中其表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有335個氨基酸，且具有示于SEQID NO70的氨基酸序列，且分子量大約為38KDa。
19.HLC-9 本發(fā)明的原癌基因，人肺癌相關基因9(下文，稱為HLC9原癌基因)具有SEQ ID NO73示出的1,382-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO73的DNA序列中，對應于27-1,370核苷酸序列位置的可讀框(1,368-1,370終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO74且包含447個氨基酸(下文稱為“HLC9蛋白質(zhì)”)。
SEQ ID NO73的DNA序列已經(jīng)由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY189686(預定發(fā)布日期2004年5月1日)，且該DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內(nèi)的收錄號為NM_002717的人類蛋白質(zhì)磷酸酶2(以前為2A)調(diào)節(jié)亞基B(PR 52)α亞型(PPP2R2A)(proteinphosphotase 2(formerly 2A)，regulatory subunit B(PR52)，α-isoform(PPP2R2A))基因的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)HLC9原癌基因在包括肺癌的多種人類腫瘤中高表達，而在多種正常組織中其表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因HLC9表達的蛋白質(zhì)含有447個氨基酸，且具有示于SEQ ID NO74的氨基酸序列，且分子量大約為51KDa。
20.GIG18 本發(fā)明的原癌基因，GIG18基因(下文，稱為GIG18原癌基因)具有SEQ IDNO77示出的1,301-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO77的DNA序列中，對應于3-1,244核苷酸序列位置的可讀框(1,242-1,244終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO78且包含413個氨基酸(GIG18蛋白質(zhì))。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有413個氨基酸，且具有示于SEQID NO78的氨基酸序列，且分子量大約為46KDa。
21.MIG22 本發(fā)明的原癌基因，人類轉(zhuǎn)移誘導基因(migration-inducinggene)14(MIG22)(下文，稱為MIG22原癌基因)具有SEQ ID NO81示出的749-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO81的DNA序列中，對應于15-734核苷酸序列位置的可讀框(732-734終止密碼子)是全長蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且來自該蛋白質(zhì)編碼區(qū)的氨基酸序列示于SEQ ID NO82且包含239個氨基酸(下文稱為“MIG22蛋白質(zhì)”)。
SEQ ID NO81的DNA序列已經(jīng)由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY771595(預定發(fā)布日期2005年12月31日)，且該DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內(nèi)的收錄號分別為D45248和BC072025的基因的相似。與以前報道的RAE1基因的功能相反，但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)MIG22原癌基因在包括肺癌的多種人類腫瘤中高表達，而在多種正常組織中其表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)含有239個氨基酸，且具有示于SEQID NO82的氨基酸序列，且分子量大約為27KDa。
同時，由于密碼子的簡并性，或考慮到生物表達原癌基因的密碼子偏愛性，可以對本發(fā)明的原癌基因在編碼區(qū)進行多種修飾而不改變由該編碼區(qū)表達的致癌蛋白的氨基酸序列，也可以對除編碼區(qū)外的區(qū)域在不影響基因表達的范圍內(nèi)進行多種修飾或變化。這樣修飾的基因同樣包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明也包括具有與上述原癌基因基本相同的DNA序列的多核苷酸；及其片段。術語“基本相同的多核苷酸”是指具有至少80％、優(yōu)選至少90％且最優(yōu)選至少95％的序列同源性的DNA序列。
同樣，在不影響蛋白質(zhì)功能的范圍內(nèi)，甚至可以在本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列內(nèi)取代、添加或缺失一個或多個氨基酸，并且根據(jù)其用途可以只使用一些蛋白質(zhì)。這樣修飾的氨基酸序列同樣包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明也包括具有與致癌蛋白基本相同的氨基酸序列的多肽；及其片段。術語“基本相同的多肽”是指具有至少80％、優(yōu)選至少90％且最優(yōu)選至少95％的序列同源性的多肽。
本發(fā)明的原癌基因和蛋白質(zhì)可以從人類癌癥組織中分離，或者通過已知的合成DNA或肽的方法合成。同樣，可以將如此制備的基因插入到本領域中已知的用于在微生物內(nèi)表達的載體中，以獲得表達載體，接著將表達載體導入合適的宿主細胞，例如大腸桿菌(Escherichia coli)、酵母細胞等。本發(fā)明基因的DNA可以大量復制或者其蛋白可以在這樣的轉(zhuǎn)化宿主內(nèi)以商品化數(shù)量產(chǎn)生。例如，通過將PIG全長cDNA插入到表達載體pBAD/Thio-Topo(Invitrogen，美國)，接著用得到的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α而在本發(fā)明中可以得到轉(zhuǎn)化體。
在構建表達載體時，根據(jù)產(chǎn)生原癌基因或蛋白質(zhì)的宿主細胞的種類可以適當選擇和組合表達調(diào)控序列，如啟動子和終止子、自主復制序列、分泌信號等。
由于在如RNA印跡法等的分析方法中顯示本發(fā)明的基因在正常乳腺組織中幾乎不表達，但其在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系中過表達，因此本發(fā)明的基因被證明是能誘發(fā)乳腺癌的強癌基因。除了如乳腺癌的上皮組織，本發(fā)明的原癌基因在其他癌性腫瘤如乳腺癌、白血病、子宮癌、惡性淋巴瘤等中高表達。因此，本發(fā)明的原癌基因被認為是在多種腫瘤發(fā)生中的共同的癌基因，其可以有效地用于多種癌癥的診斷，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化動物及用于反義基因治療等。
例如，使用原癌基因診斷癌癥的方法包括步驟在使用全部或部分原癌基因作為探針與由個體體液中提取的核酸雜交后，通過使用多種本領域已知的方法檢測原癌基因，以此來檢測個體中是否具有本發(fā)明的原癌基因。使用放射性同位素、酶等標記的探針可以容易地確定組織樣本中所述基因的存在。因此，本發(fā)明提供包括全部或一些所述原癌基因的用于診斷癌癥的試劑盒。
可以通過將本發(fā)明的原癌基因?qū)肜缛缡蟮膰X類動物的哺乳動物來獲得轉(zhuǎn)化的動物，優(yōu)選在至少8-細胞階段之前的受精卵階段導入該原癌基因。這樣培育的轉(zhuǎn)化動物可以有效地用于尋找致癌物質(zhì)或如抗氧化劑的抗癌物質(zhì)。
來自本發(fā)明的原癌基因的蛋白質(zhì)可以有效地作為診斷工具以產(chǎn)生抗體。使用本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質(zhì)或其片段，根據(jù)本領域已知的常規(guī)方法可以制備為單克隆或多克隆抗體的本發(fā)明的抗體，其中所述的蛋白質(zhì)具有選自由SEQ ID NO2；SEQ ID NO6；SEQ ID NO10；SEQ ID NO14；SEQ IDNO18；SEQ ID NO22；SEQ ID NO26；SEQ ID NO30；SEQ ID NO34；SEQID NO38；SEQ ID NO42；SEQ ID NO46；SEQ ID NO50；SEQ ID NO54；SEQ ID NO58；SEQ ID NO62；SEQ ID NO66；SEQ ID NO70；SEQ ID NO74；SEQ ID NO78和SEQ ID NO82組成的組的氨基酸序列。因此，通過使用本領域中已知的方法，例如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)、夾心法測定、聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)印跡法或免疫印跡法等，來確定受試者體液樣品中是否表達該蛋白質(zhì)，由此那些抗體可以用于診斷癌癥。
同樣，本發(fā)明的原癌基因可以用于建立不受控制生長的癌細胞系，例如該細胞系可以使用用原癌基因轉(zhuǎn)染的成纖維細胞而由在裸鼠背上生長產(chǎn)生的腫瘤組織來產(chǎn)生。該癌細胞系可以有效用于尋找抗癌劑等。
以下，將參考優(yōu)選實施例對本發(fā)明進行詳細描述，但這里提出的描述僅是為了對優(yōu)選實施例進行舉例說明，無意對發(fā)明的范圍進行限制。



參照附圖，在下面的詳細描述中，將更全面地描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的這些和其它特征、技術方案和優(yōu)點。在圖中 圖1～21為示出差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)結果的圖，用以確定FC21(圖1)、FC23(圖6)、FC34(圖7)、FC24(圖12)、FC54(圖13)、FC71(圖14)、BBCC5-5(圖15)和FC4(圖17)是否分別在正常乳腺組織、乳腺癌瘤組織和MCF-7癌細胞中表達；MC113DNA片段(圖2)、CA338d DNA片段(圖3)、H124DNA片段(圖4)、H122DNA片段(圖5)和H148DNA片段(圖18)是否分別在正常外宮頸(exocervical)組織、子宮頸癌組織、淋巴結轉(zhuǎn)移性癌組織(metastatic lymph node tumor tissue)和CUMC-6癌細胞中表達；HP103(圖8)、HP11(圖10)、HP23(圖11)、HP15(圖16)和HP47(圖20)是否分別在正常肝組織、肝癌組織和HepG2肝癌細胞中表達；GV11DNA片段(圖9)是否在正常外周血白細胞組織、白血病組織和K562白血病細胞系中表達；以及L738(圖19)和L690(圖21)是否分別在正常肺組織、左肺癌組織、從左肺轉(zhuǎn)移到右肺的轉(zhuǎn)移性肺癌組織和A549肺癌細胞中表達。
圖22～42為示出用以確定PIG12(圖22)、PIG30(圖27)、PIG31(圖28)、PIG46(圖33)、PIG47(圖34)、PIG48(圖35)、PIG50(圖36)和PIG55(圖38)原癌基因是否分別在乳腺癌組織表達；PIG18(圖23)、PIG23(圖24)、PIG27(圖25)、PIG28(圖26)和GIG9(圖39)原癌基因是否分別在正常外宮頸組織、子宮癌組織、宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性癌組織(metastatic cervical lymph nodetumor tissue)和子宮頸癌細胞系表達；PIG38(圖29)、PIG43(圖31)、PIG44(圖32)、PIG54(圖37)、GIG18(圖41)原癌基因是否在正常人肝、肝癌和肝癌細胞系表達；PIG40(圖30)原癌基因是否在正常外周血白細胞組織、白血病組織和K562白血病細胞系表達；以及HLC9(圖40)和MIG22(圖42)原癌基因是否分別在正常肺組織、左肺癌組織、從左肺轉(zhuǎn)移到右肺的轉(zhuǎn)移性肺癌組織和A549、NCI-H2009和NCI-H441肺癌細胞系表達的RNA印跡結果的圖；并且圖22～42下部為分別示出使與圖22～42上部相同的樣品和β-肌動蛋白探針雜交得到的RNA印跡結果的圖。
圖43～63為示出用以確定PIG12(圖43)、PIG18(圖44)、PIG23(圖45)、PIG27(圖46)、PIG28(圖47)、PIG30(圖48)、PIG31(圖49)、PIG38(圖50)、PIG40(圖51)、PIG43(圖52)、PIG44(圖53)、PIG46(圖54)、PIG47(圖55)、PIG48(圖56)、PIG50(圖57)、PIG54(圖58)、PIG55(圖59)、GIG9(圖60)、HLC-9(圖61)、GIG18(圖62)和MIG22(圖63)原癌基因是否分別在12泳道的正常人多種組織中表達的RNA印跡結果的圖；并且圖43～63的下部為分別示出使與圖43～63上部相同的樣品和β-肌動蛋白探針雜交得到的RNA印跡結果的圖。
圖64～84為示出用以確定PIG12(圖64)、PIG18(圖65)、PIG23(圖66)、PIG27(圖67)、PIG28(圖68)、PIG30(圖69)、PIG31(圖70)、PIG38(圖71)、PIG40(圖72)、PIG43(圖73)、PIG44(圖74)、PIG46(圖75)、PIG47(圖76)、PIG48(圖77)、PIG50(圖78)、PIG54(圖79)、PIG55(圖80)、GIG9(圖81)、HLC-9(圖82)、GIG18(圖83)和MIG22(圖84)原癌基因是否分別在人癌細胞系表達的RNA印跡結果的圖；并且圖64～84的下部為分別示出使與圖64～84上部相同的樣品和β-肌動蛋白探針雜交得到的RNA印跡結果的圖。
圖85～105為示出用以確定在本發(fā)明的原癌基因PIG12(圖85)、PIG18(圖86)、PIG23(圖87)、PIG27(圖88)、PIG28(圖89)、PIG30(圖90)、PIG31(圖91)、PIG38(圖92)、PIG40(圖93)、PIG43(圖94)、PIG44(圖95)、PIG46(圖96)、PIG47(圖97)、PIG48(圖98)、PIG50(圖99)、PIG54(圖100)、PIG55(圖101)、GIG9(圖102)、HLC-9(圖103)、GIG18(圖104)和MIG22(圖105)分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌后L-阿拉伯糖誘導前和誘導后表達的蛋白質(zhì)大小的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)結果的圖。

具體實施例方式 下文，參照附圖將詳細地描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。
實施例1腫瘤細胞的培養(yǎng)和總RNA的分離 1-1.PIG12、PIG30、PIG31、PIG46、PIG47、PIG48、PIG50和PIG55 (步驟1)腫瘤細胞的培養(yǎng) 為了進行mRNA差異顯示方法，從已經(jīng)進行乳房切除術的乳腺癌患者得到正常乳腺組織樣品，并且從外科手術時沒有進行抗癌化學治療和/或放射治療的乳腺癌患者在乳房切除術期間得到原發(fā)性乳腺癌組織。MCF-7(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)；ATCC號HTB-22)用作差異顯示方法中的人乳腺癌細胞系。在這個實驗中使用的培養(yǎng)細胞處于指數(shù)生長期，且在此使用當臺盼藍染料染色(參見Freshney，″Culture of Animal CellsAManual of Basic Technique″第2版，A.R.Liss，紐約，(1987))時顯示至少95％存活率的細胞。
(步驟2)RNA的分離和mRNA差異顯示法 使用可商購的系統(tǒng)RNeasy總RNA試劑盒(Qiagen公司，德國)，從步驟1得到的各正常乳腺組織、原發(fā)性乳腺癌組織和MCF-7細胞分離總RNA樣品。使用message clean試劑盒(GenHunter公司，Brookline，MA，美國)從RNA樣品中除去DNA污染物。
1-2.PIG18、PIG23、PIG27、PIG28和GIG9 (步驟1)腫瘤細胞的培養(yǎng) 為了進行mRNA差異顯示法，從已經(jīng)進行子宮切除術的子宮肌瘤患者得到正常外宮頸組織，并且從外科手術以前未進行抗癌化學治療和/或放射治療的子宮癌患者得到原發(fā)性子宮頸癌組織和淋巴結轉(zhuǎn)移性癌組織。CUMC-6(Kim，J.W.等人，Gynecol.Oncol.62230-240，1996)用作差異顯示法中的人子宮頸癌細胞系。
將從得到的組織中獲得的細胞和CUMC-6細胞系在含有2mM谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10％胎牛血清(Gibco，美國)的Waymouth′s MB 752/1培養(yǎng)基(Gibco)中生長。在這個實驗中使用的培養(yǎng)細胞處于指數(shù)生長期，并且在此使用臺盼藍染色中顯示至少95％存活率的細胞(Freshney，″Culture of Animal CellsA Manual of Basic Technique″第2版，A.R.Liss，紐約，1987)。
(步驟2)RNA的分離和mRNA差異顯示法 使用可商購的系統(tǒng)RNeasy總RNA試劑盒(Qiagen公司，德國)，從步驟1得到的各正常外宮頸組織、原發(fā)性子宮頸癌組織、淋巴結轉(zhuǎn)移性癌組織和CUMC-6細胞分離總RNA樣品。使用message clean試劑盒(GenHunter公司，Brookline，MA，美國)從RNA樣品中除去DNA污染物。
1-3.PIG38、PIG43、PIG44、PIG54和GIG18 (步驟1)腫瘤細胞的培養(yǎng) 為了進行mRNA差異顯示法，從已經(jīng)進行肝組織活檢的患者得到正常肝組織，并且在肝組織活檢期間從以前沒有進行抗癌化學治療和/或放射治療的肝癌患者得到原發(fā)性肝癌組織。HepG2(美國典型培養(yǎng)物保藏中心)用作差異顯示法中的人肝癌細胞系。在這個實驗中使用的培養(yǎng)細胞處于指數(shù)生長期，且在此使用當臺盼藍染料染色時顯示至少95％存活率的細胞(參見Freshney，″Culture of Animal CellsA Manual of Basic Technique″第2版，A.R.Liss，紐約，(1987))。
(步驟2)RNA的分離和mRNA差異顯示法 使用可商購的系統(tǒng)RNeasy總RNA試劑盒(Qiagen公司，德國)，從步驟1得到的各正常肝組織、原發(fā)性肝癌組織和HepG2細胞分離總RNA樣品。使用message clean試劑盒(GenHunter公司，Brookline，MA，美國)從RNA樣品中除去DNA污染物。
1-4.PIG40 (步驟1)腫瘤細胞的培養(yǎng) 為了進行mRNA差異顯示法，從正常人得到外周血白細胞組織，并且在骨髓組織活檢期間從以前沒有進行抗癌化學治療和/或放射治療的白血病患者得到原發(fā)性白血病骨髓組織(primary leukemic bone marrow tissue)。K-562(美國典型培養(yǎng)物保藏中心；ATCC號CCL-243)用作差異顯示法中的人慢性髓性白血病細胞系。
將從得到的組織中獲得的細胞和K-562細胞系在含有2mM谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10％胎牛血清(Gibco，美國)的Waymouth′s MB 752/1培養(yǎng)基(Gibco)中生長。在這個實驗中使用的培養(yǎng)細胞處于指數(shù)生長期，并且在此使用臺盼藍染色中顯示至少95％存活率的細胞(Freshney，″Culture of Animal CellsA Manual of Basic Technique″第2版，A.R.Liss，紐約，1987)。
(步驟2)RNA的分離和mRNA差異顯示法 使用可商購的系統(tǒng)RNeasy總RNA試劑盒(Qiagen公司，德國)，從步驟1得到的各正常人的外周血白細胞組織、原發(fā)性白血病骨髓組織和人慢性髓性白血病細胞系分離總RNA樣品。使用message clean試劑盒(GenHunter公司，Brookline，MA，美國)從RNA樣品中除去DNA污染物。
1-5.HLC-9和MIG22 (步驟1)腫瘤細胞的培養(yǎng) 為了進行mRNA差異顯示法，從正常人得到正常肺組織，并且在外科手術期間從以前沒有進行抗癌化學治療和/或放射治療的肺癌患者得到原發(fā)性白血病肺癌組織和轉(zhuǎn)移到右肺的癌組織。A549(美國典型培養(yǎng)物保藏中心；ATCC號CCL-185)用作差異顯示法中的人肺癌細胞系。
將從得到的組織中獲得的細胞和A549肺癌細胞系在含有2mM谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和10％胎牛血清(Gibco，美國)的Waymouth′s MB 752/1培養(yǎng)基(Gibco)中生長。在這個實驗中使用的培養(yǎng)細胞處于指數(shù)生長期，并且在此使用臺盼藍染料染色時顯示至少95％存活率的細胞(參見Freshney，″Culture of Animal CellsA Manual of Basic Technique″第2版，A.R.Liss，紐約，1987)。
(步驟2)RNA的分離和mRNA差異顯示法 使用可商購的系統(tǒng)RNeasy總RNA試劑盒(Qiagen公司，德國)，從步驟1得到的各正常肺組織、原發(fā)性肺癌組織、轉(zhuǎn)移性肺癌組織和A549細胞分離總RNA樣品。使用message clean試劑盒(GenHunter公司，Brookline，MA，美國)從RNA樣品中除去DNA污染物。
實施例2差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR) 使用由Liang，P.和A.B.Pardee提出的稍微修改的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄。
2-1.PIG12 首先，使用SEQ ID NO3的錨定引物H-T11A(5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′，RNAimage試劑盒，Genhunter，Cor.，MA，美國)作為oligo-dT錨定引物將0.2μg實施例1的步驟1獲得的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。
然后，使用相同的錨定引物和5′-13-mer隨機引物(RNAimage引物1-5)H-AP 1～40中的引物H-AP21(SEQ ID NO4)(5′-AAGCTTTCTCTGG-3′)，在0.5mM[α-35S]dATP(1200Ci/mmole)存在下進行PCR反應。PCR反應在下述條件下進行總40個擴增循環(huán)，每個循環(huán)由95℃下40秒的變性步驟、40℃下2分鐘的退火步驟和72℃下40秒的延伸步驟組成，以及接著為72℃下5分鐘的最后延伸步驟。
將PCR-擴增片段在6％聚丙烯酰胺測序凝膠中分離，且然后使用放射自顯影法確定差異表達條帶的位置。
從干凝膠中切下FC21 cDNA的262-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO1的913～1,174堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫FC21 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增FC21 cDNA。
2-2.PIG18 除了在此使用具有SEQ ID NO7示出的DNA序列的錨定引物H-T11C(5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′，RNAimage試劑盒，Genhunter，Cor.，MA，美國)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ ID NO8示出的DNA序列的引物H-AP11(5′-AAGCTTCGGGTAA-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下MC113 cDNA的277-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO5的2,023～2,299堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫MC113 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增MC113cDNA。
2-3.PIG23 除了在此使用具有SEQ ID NO11示出的DNA序列的錨定引物H-T11C(5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′，RNAimage試劑盒，Genhunter，Cor.，MA，美國)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ ID NO12示出的DNA序列的引物H-AP33(5′-AAGCTTGCTGCTC-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下CA338d cDNA的278-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO9的1,822～2,099堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫CA338d cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增CA338dcDNA。
2-4.PIG27 除了在此使用具有SEQ ID NO15示出的DNA序列的錨定引物H-T11A(5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′，RNAimage試劑盒，Genhunter，Cor.，MA，美國)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ ID NO16示出的DNA序列的引物H-AP12(5′-AAGCTTGAGTGCT-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下H124 cDNA的177-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO13的243～419堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫H124 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增H124 cDNA。
2-5.PIG28 除了在此使用具有SEQ ID NO19示出的DNA序列的錨定引物H-T11C(5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′，RNAimage試劑盒，Genhunter，Cor.，MA，美國)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ ID NO20示出的DNA序列的引物H-AP12(5′-AAGCTTGAGTGCT-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下H122 cDNA的232-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO17的748～979堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫H122 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增H122 cDNA。
2-6.PIG30 除了在此使用具有SEQ ID NO23示出的DNA序列的錨定引物H-T11C(5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′，RNAimage試劑盒，Genhunter，Cor.，MA，美國)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ ID NO24示出的DNA序列的引物H-AP33(5′-AAGCTTGCTGCTC-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下FC23 cDNA的271-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO21的1,823～2,093堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫FC23 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增FC23 cDNA。
2-7.PIG31 除了在此使用具有SEQ ID NO27示出的DNA序列的錨定引物H-T11G(5′-AAGCTTTTTTTTTTTG-3′)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ IDNO28示出的DNA序列的引物H-AP34(5′-AAGCTTCAGCAGC-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下FC34 cDNA的312-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO25的1,884～2,195堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫FC34 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增FC34 cDNA。
2-8.PIG38 除了在此使用具有SEQ ID NO31示出的DNA序列的錨定引物H-T11C(5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ IDNO32示出的DNA序列的引物H-AP10(5′-AAGCTTCCACGTA-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下HP103 cDNA的267-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO29的1,633～1,899堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫HP103 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增HP103 cDNA。
2-9.PIG40 除了在此使用具有SEQ ID NO35示出的DNA序列的錨定引物H-T11C(5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′，RNAimage試劑盒，Genhunter，Cor.，MA，美國)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ ID NO36示出的DNA序列的引物H-AP11(5′-AAGCTTCGGGTAA-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下GV11 cDNA的215-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO33的1,313～1,527堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫GV11 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增GV11 cDNA。
2-10.PIG43 除了在此使用具有SEQ ID NO39示出的DNA序列的錨定引物H-T11G(5′-AAGCTTTTTTTTTTTG-3′)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ IDNO40示出的DNA序列的引物H-AP11(5′-AAGCTTCGGGTAA-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下HP11 cDNA的321-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO37的879～1,199堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫HP11 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增HP11 cDNA。
2-11.PIG44 除了在此使用具有SEQ ID NO43示出的DNA序列的錨定引物H-T11C(5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ IDNO44示出的DNA序列的引物H-AP23(5′-AAGCTTGGCTATG-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下HP23 cDNA的311-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO41的1,633～1,899堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫HP23 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增HP23 cDNA。
2-12.PIG46 除了在此使用具有SEQ ID NO47示出的DNA序列的錨定引物H-T11A(5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ IDNO48示出的DNA序列的引物H-AP24(5′-AAGCTTCACTAGC-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下FC24 cDNA的256-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO45的992～1,247堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫FC24 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增FC24 cDNA。
2-13.PIG47 除了在此使用具有SEQ ID NO51示出的DNA序列的錨定引物H-T11C(5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ IDNO52示出的DNA序列的引物H-AP5(5′-AAGCTTAGTAGGC-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下FC54 cDNA的192-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO49的587～778堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫FC54 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增FC54 cDNA。
2-14.PIG48 除了在此使用具有SEQ ID NO55示出的DNA序列的錨定引物H-T11A(5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ IDNO56示出的DNA序列的引物H-AP7(5′-AAGCTTAACGAGG-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下FC71 cDNA的272-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO53的1,348～1,619堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫FC71 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增FC71 cDNA。
2-15.PIG50 除了在此使用具有SEQ ID NO59示出的DNA序列的錨定引物H-T11C(5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ IDNO60示出的DNA序列的引物H-AP5(5′-AAGCTTAGTAGGC-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下BBCC5-5 cDNA的182-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO57的418～599堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫BBCC5-5 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增BBCC5-5cDNA。
2-16.PIG54 除了在此使用具有SEQ ID NO63示出的DNA序列的錨定引物H-T11A(5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ IDNO64示出的DNA序列的引物H-AP15(5′-AAGCTTACGCAAC-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下HP15 cDNA的345-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO61的1,533～1,877堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫HP15 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增HP15 cDNA。
2-17.PIG55 除了在此使用具有SEQ ID NO67示出的DNA序列的錨定引物H-T11G(5′-AAGCTTTTTTTTTTTG-3′)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ IDNO68示出的DNA序列的引物H-AP4(5′-AAGCTTCTCAACG-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下FC4 cDNA的186-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO65的292～477堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫FC4cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增FC4 cDNA。
2-18.GIG9 除了在此使用具有SEQ ID NO71示出的DNA序列的錨定引物H-T11A(5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′，RNAimage試劑盒，Genhunter，Cor.，MA，美國)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ ID NO72示出的DNA序列的引物H-AP14(5′-AAGCTTGGAGCTT-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下H148 cDNA的221-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO69的769～989堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫H148 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增H148 cDNA。
2-19.HLC-9 除了在此使用具有SEQ ID NO75示出的DNA序列的錨定引物H-T11G(5′-AAGCTTTTTTTTTTTG-3′)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ IDNO76示出的DNA序列的引物H-AP7(5′-AAGCTTAACGAGG-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下L738 cDNA的322-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO73的1,007～1,328堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫L738 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增L738 cDNA。
2-20.GIG18 除了在此使用具有SEQ ID NO79示出的DNA序列的錨定引物H-T11C(5′-AAGCTTTTTTTTTTTC-3′)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ IDNO80示出的DNA序列的引物H-AP4(5′-AAGCTTCTCAACG-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下HP47 cDNA的321-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO77的879～1,199堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫HP47 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增HP47 cDNA。
2-21.MIG22 除了在此使用具有SEQ ID NO83示出的DNA序列的錨定引物H-T11A(5′-AAGCTTTTTTTTTTTA-3′，RNAimage試劑盒，Genhunter，Cor.，MA，美國)作為oligo-dT錨定引物，以及使用具有SEQ ID NO84示出的DNA序列的引物H-AP6(5′-AAGCTTGCACCAT-3′)外，以與實施例2-1相同的方式重復PCR反應。
從干凝膠中切下L690 cDNA的327-堿基對(bp)條帶(SEQ ID NO81的273～599堿基位置)。將提取的凝膠加熱15分鐘以洗脫L690 cDNA，然后除了在此不使用[α-35S]-標記的dATP(1200Ci/mmole)和20μM dNTP外，用如上所述相同的引物在相同的條件下重復PCR反應以重新擴增L690 cDNA。
實施例3克隆 使用TA克隆系統(tǒng)(Promega，美國)，根據(jù)制造商手冊，將如上所述所有重新擴增的FC21產(chǎn)物；MC113產(chǎn)物；CA338d產(chǎn)物；H124產(chǎn)物；H122產(chǎn)物；FC23產(chǎn)物；FC34產(chǎn)物；HP103產(chǎn)物；GV11產(chǎn)物；HP11產(chǎn)物；HP23產(chǎn)物；FC24產(chǎn)物；FC54產(chǎn)物；FC71產(chǎn)物；BBCC5-5產(chǎn)物；HP15產(chǎn)物；FC4產(chǎn)物；H148產(chǎn)物；L738產(chǎn)物；HP47產(chǎn)物以及L690 PCR產(chǎn)物分別插入到pGEM-TEASY載體中。
(步驟1)連接反應 將實施例2中所有重新擴增的FC21產(chǎn)物、MC113產(chǎn)物、CA338d產(chǎn)物、H124產(chǎn)物、H122產(chǎn)物、FC23產(chǎn)物、FC34產(chǎn)物、HP103產(chǎn)物、GV11產(chǎn)物、HP11產(chǎn)物、HP23產(chǎn)物、FC24產(chǎn)物、FC54產(chǎn)物、FC71產(chǎn)物、BBCC5-5產(chǎn)物、HP15產(chǎn)物、FC4產(chǎn)物、H148產(chǎn)物、L738產(chǎn)物、HP47產(chǎn)物以及L690 PCR產(chǎn)物各2μl；1μl pGEM-T EASY載體(50ng)；1μl T4 DNA連接酶緩沖液(10X)和1μl T4 DNA連接酶(3weiss單位/μl；Promega)置于0.5ml試管中，并向其中加入蒸餾水至終體積10μl。將該連接反應混合物在14℃下孵育過夜。
(步驟2)TA克隆的轉(zhuǎn)化 將大腸桿菌JM109(Promega，WI，美國)在10ml LB培養(yǎng)基(10g細菌用胰蛋白胨、5g細菌用酵母抽提物、5g NaCl)中培養(yǎng)直到在600nm的光密度達到大約0.3～0.6。將培養(yǎng)的混合物在冰中保持約10分鐘并于4℃下4,000rpm離心10分鐘，然后棄去上清液并收集細胞。將收集的細胞沉淀物暴露于10ml 0.1M冰冷卻的CaCl2中大約30分鐘至1小時以制備感受態(tài)細胞。將該產(chǎn)物再于4℃下4,000rpm離心10分鐘，然后棄去上清液并收集細胞并將細胞在2ml 0.1M冰冷卻的的CaCl2中懸浮。
將200μl感受態(tài)細胞懸液轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中，并向其中加入2μl步驟1中制備的各連接反應產(chǎn)物。將得到的混合物于42℃水浴中孵育90秒，然后0℃驟凍。向其中加入800μl SOC培養(yǎng)基(2.0g細菌用胰蛋白胨、0.5g細菌用酵母抽提物、1ml 1M NaCl、0.25ml 1M KCl、97ml TDW、1ml 2MMg2+、1ml 2M葡萄糖)并將得到的混合物在220rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)箱中于37℃下孵育45分鐘。
用玻璃棒將25μl X-gal(二甲基甲酰胺中40mg/ml儲存)涂布到添加氨芐青霉素并預先在37℃的培養(yǎng)箱中保持的LB平板上，然后向其中加入25μl各轉(zhuǎn)化的細胞并用玻璃板再涂布，然后于37℃下孵育過夜。孵育后，選擇3～4個形成的白色菌落，然后將各選擇的細胞接種在添加氨芐青霉素的LB平板上。為了構建質(zhì)粒，選擇在上述菌落中分別被證明為導入連接反應產(chǎn)物的菌落的菌株，即轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株JM109/FC21；JM109/MC113；JM109/CA338d；JM109/H124；JM109/H122；JM109/FC23；JM109/FC34；JM109/HP103；JM109/GV11；JM109/HP11；JM109/HP23；JM109/FC24；JM109/FC54；JM109/FC71；JM109/BBCC5-5；JM109/HP15；JM109/FC4；JM109/H148；JM109/L738；JM109/HP47以及JM109/L690，并在10ml TB培養(yǎng)基(terrific broth)(900ml TDW、12g細菌用胰蛋白胨、24g細菌用酵母抽提物、4ml甘油、0.17M KH2PO4、100ml 0.72N K2HPO4)中培養(yǎng)。
實施例4重組質(zhì)粒DNA的分離 使用WizardTMPlus小量制備DNA純化試劑盒(Promega，美國)，根據(jù)制造商手冊，從轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株中分離FC21質(zhì)粒DNA。
證實少量的各分離的質(zhì)粒DNA用限制性內(nèi)切酶ECoRI處理，然后在2％的凝膠中電泳以證實FC21；MC113；CA338d；H124；H122；FC23；FC34；HP103；GV11；HP11；HP23；FC24；FC54；FC71；BBCC5-5；HP15；FC4；H148；L738；HP47以及L690的部分序列分別插入到質(zhì)粒中。
實施例5DNA堿基序列分析 根據(jù)常規(guī)方法，將所有在實施例2中獲得的FC21產(chǎn)物；MC113產(chǎn)物；CA338d產(chǎn)物；H124產(chǎn)物；H122產(chǎn)物；FC23產(chǎn)物；FC34產(chǎn)物；HP103產(chǎn)物；GV11產(chǎn)物；HP11產(chǎn)物；HP23產(chǎn)物；FC24產(chǎn)物；FC54產(chǎn)物；FC71產(chǎn)物；BBCC5-5產(chǎn)物；HP15產(chǎn)物；FC4產(chǎn)物；H148產(chǎn)物；L738產(chǎn)物；HP47產(chǎn)物以及L690 PCR產(chǎn)物擴增、克隆并然后重新擴增。使用Sequenase version2.0DNA測序試劑盒(United States Biochemical，Cleveland，OH，美國)根據(jù)雙脫氧鏈終止法對得到的FC21；MC113；CA338d；H124；H122；FC23；FC34；HP103；GV11；HP11；HP23；FC24；FC54；FC71；BBCC5-5；HP15；FC4；H148；L738；HP47以及L690片段進行測序。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO1的913～1,174核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“FC21”。
使用5′-隨機引物H-AP21和3′-錨定引物H-T11A，將上述得到的262-bpcDNA片段，即FC21進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖1所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和MCF-7細胞中差異表達。在圖1中可見，262-bp cDNA片段FC21在乳腺癌和MCF-7癌細胞中高表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO5的2,023～2,299核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“MC113”。
使用5′-隨機引物H-AP11和3′-錨定引物H-T11C，將上述得到的277-bpcDNA片段，即MC113進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。
如圖2所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常外宮頸組織、轉(zhuǎn)移淋巴結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖2中可見，277-bp cDNA片段MC113在子宮頸癌、轉(zhuǎn)移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO9的1,822～2,099核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“CA338d”。
使用5′-隨機引物H-AP33和3′-錨定引物H-T11C，將上述得到的278-bpcDNA片段，即CA338d進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。
如圖3所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常外宮頸組織、轉(zhuǎn)移淋巴結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖3中可見，278-bp cDNA片段CA338d在子宮頸癌、轉(zhuǎn)移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO13的243～419核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“H124”。
使用5′-隨機引物H-AP12和3′-錨定引物H-T11A，將上述得到的177-bpcDNA片段，即H124進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。
如圖4所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常外宮頸組織、轉(zhuǎn)移淋巴結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖4中可見，177-bp cDNA片段H124在子宮頸癌、轉(zhuǎn)移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO17的748～979核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“H122”。
使用5′-隨機引物H-AP12和3′-錨定引物H-T11C，將上述得到的232-bpcDNA片段，即H122進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。
如圖5所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常外宮頸組織、轉(zhuǎn)移淋巴結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖5中可見，232-bp cDNA片段H122在子宮頸癌、轉(zhuǎn)移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO21的1,823～2,093核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“FC23”。
使用5′-隨機引物H-AP23和3′-錨定引物H-T11C，將上述得到的271-bpcDNA片段，即FC23進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖6所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和MCF-7細胞中差異表達。在圖6中可見，271-bp cDNA片段FC23在乳腺癌和MCF-7癌細胞中高表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO25的1,884～2,195核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“FC34”。
使用5′-隨機引物H-AP34和3′-錨定引物H-T11G，將上述得到的312-bpcDNA片段，即FC34進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖7所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和MCF-7細胞中差異表達。在圖7中可見，312-bp cDNA片段FC34在乳腺癌和MCF-7癌細胞中高表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO29的1,633～1,899核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“HP103”。
使用5′-隨機引物H-AP10和3′-錨定引物H-T11C，將上述得到的267-bpcDNA片段，即HP103進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖8所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常肝組織、肝癌組織和HepG2細胞中差異表達。在圖8中可見，267-bp cDNA片段HP103在肝癌和HepG2癌細胞中表達，而在正常組織中不表達或檢測不到。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO33的1,313～1,527核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“GV1”。
使用5′-隨機引物H-AP11和3′-錨定引物H-T11C，將上述得到的215-bpcDNA片段，即GV11進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。
如圖9所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常外周血組織、白血病組織和K-562細胞中差異表達。在圖9中可見，215-bp cDNA片段GV11在白血病組織和K-562癌細胞中表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO37的879～1,199核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“HP11”。
使用5′-隨機引物H-AP11和3′-錨定引物H-T11G，將上述得到的321-bpcDNA片段，即HP11進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖10所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常肝組織、肝癌組織和HepG2細胞中差異表達。在圖10中可見，321-bp cDNA片段HP11在肝癌組織和HepG2癌細胞中表達，而在正常組織中不表達或檢測不到。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO41的1,369～1,679核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“HP23”。
使用5′-隨機引物H-AP23和3′-錨定引物H-T11C，將上述得到的311-bpcDNA片段，即HP23進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖11所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常肝組織、肝癌組織和HepG2細胞中差異表達。在圖11中可見，311-bp cDNA片段HP23在肝癌和HepG2癌細胞中表達，而在正常組織中不表達或很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO45的992～1,247核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“FC24”。
使用5′-隨機引物H-AP24和3′-錨定引物H-T11A，將上述得到的256-bpcDNA片段，即FC24進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖12所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和MCF-7細胞中差異表達。在圖12中可見，256-bp cDNA片段FC24在乳腺癌組織和MCF-7癌細胞中高表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO49的587～778核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“FC54”。
使用5′-隨機引物H-AP5和3′-錨定引物H-T11C，將上述得到的192-bpcDNA片段，即FC54進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖13所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和MCF-7細胞中差異表達。在圖13中可見，192-bp cDNA片段FC54在乳腺癌組織和MCF-7癌細胞中高表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO53的1,348～1,619核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“FC71”。
使用5′-隨機引物H-AP7和3′-錨定引物H-T11A，將上述得到的272-bpcDNA片段，即FC71進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖14所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和MCF-7細胞中差異表達。在圖14中可見，272-bp cDNA片段FC71在乳腺癌組織和MCF-7癌細胞中高表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO57的418～599核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“BBCC5-5”。
使用5′-隨機引物H-AP5和3′-錨定引物H-T11C，將上述得到的182-bpcDNA片段，即BBCC5-5進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖15所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和MCF-7細胞中差異表達。在圖15中可見，182-bp cDNA片段BBCC5-5在乳腺癌組織和MCF-7癌細胞中高表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO61的1,533～1,877核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“HP15”。
使用5′-隨機引物H-AP15和3′-錨定引物H-T11A，將上述得到的345-bpcDNA片段，即HP15進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖16所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常肝組織、肝癌組織和HepG2細胞中差異表達。在圖16中可見，345-bp cDNA片段HP15在肝癌組織和HepG2癌細胞中表達，而在正常組織中不表達或很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO65的292～477核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“FC4”。
使用5′-隨機引物H-AP4和3′-錨定引物H-T11G，將上述得到的186-bpcDNA片段，即FC4進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖17所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和MCF-7細胞中差異表達。在圖17中可見，186-bp cDNA片段FC4在乳腺癌組織和MCF-7癌細胞中高表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO69的769～989核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“H148”。
使用5′-隨機引物H-AP14和3′-錨定引物H-T11A，將上述得到的221-bpcDNA片段，即H148進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。
如圖18所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常外宮頸組織、轉(zhuǎn)移淋巴結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖18中可見，221-bp cDNA片段H148在子宮頸癌組織、轉(zhuǎn)移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO73的1,007～1,328核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“L738”。
使用5′-隨機引物H-AP7和3′-錨定引物H-T11G，將上述得到的322-bpcDNA片段，即L738進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖19所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常肺組織、左肺癌組織、從左肺轉(zhuǎn)移到右肺的轉(zhuǎn)移性肺癌組織和A549肺癌細胞中差異表達。在圖19中可見，322-bp cDNA片段L738在肺癌組織、轉(zhuǎn)移性肺癌組織和A549肺癌細胞中表達，而在正常肺組織中不表達或很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO77的879～1,199核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“HP47”。
使用5′-隨機引物H-AP4和3′-錨定引物H-T11C，將上述得到的321-bpcDNA片段，即HP47進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。如圖20所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常肝組織、肝癌組織和HepG2細胞中差異表達。在圖20中可見，321-bp cDNA片段HP47在肝癌組織和HepG2癌細胞中表達，而在正常組織中很少表達。
所述基因的DNA序列對應于SEQ ID NO81的273～599核苷酸序列位置，其在本發(fā)明中稱為“L690”。
使用5′-隨機引物H-AP6和3′-錨定引物H-T11A，將上述得到的327-bpcDNA片段，即L690進行差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(DDRT-PCR)，且然后使用電泳確認。
如圖21所示，從差異顯示(DD)顯示出基因在正常肺組織、左肺癌組織、從左肺轉(zhuǎn)移到右肺的轉(zhuǎn)移性肺癌組織和A549肺癌細胞中差異表達。在圖21中可見，327-bp cDNA片段L690在肺癌組織、轉(zhuǎn)移性肺癌組織和A549肺癌細胞中表達，而在正常肺組織中很少表達或不表達。尤其是，327-bp cDNA片段L690在癌組織，例如轉(zhuǎn)移性癌組織中表達最高。
實施例6全長原癌基因的cDNA序列分析 6-1.PIG12 使用32P-標記的FC21作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA庫(bacteriophageλgt11 human lung embryonic fibroblast cDNAlibrary)(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將1,258-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG12 cDNA克隆，然后于2004年2月16日以收錄號AY550973保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。
AY550973基因的DNA序列與以收錄號NM_006299保存在數(shù)據(jù)庫中的人類基因鋅指蛋白193(ZNF193)基因的相似。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY550973基因與尤其包括乳腺癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)PIG12原癌基因在包括乳腺組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括乳腺癌的多種癌組織中其表達明顯升高。
由1,258bp組成的PIG12的全長DNA序列在SEQ ID NO1中示出。
在SEQ ID NO1的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?8～1,252的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO2的由394個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-2.PIG18 使用32P-標記的MC113作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將2,403-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG18 cDNA克隆，然后于2004年10月5日以收錄號AY771596保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。
將插入到λpCEV載體的PIG18克隆用限制性內(nèi)切酶NotI酶切并以氨芐青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體的形式從噬菌體分離(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。
通過T4 DNA連接酶連接含有PIG18基因的pCEV-LAC載體以制備PIG18質(zhì)粒DNA，且然后用連接的克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
由2,403bp組成的PIG18的全長DNA序列在SEQ ID NO5中示出。
在SEQ ID NO5的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?75～1,063的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO6的由62個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-3.PIG23 使用32P-標記的CA338d作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA庫獲得其中將2,150-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG23 cDNA克隆，然后于2004年10月23日以收錄號AY826819保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。
將插入到λpCEV載體的PIG23克隆用限制性內(nèi)切酶NotI酶切并以氨芐青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體的形式從噬菌體分離(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。
通過T4DNA連接酶連接含有PIG23基因的pCEV-LAC載體以制備PIG23質(zhì)粒DNA，且然后用連接的克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
由2,150bp組成的PIG23的全長DNA序列在SEQ ID NO9中示出。
在SEQ ID NO9的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?5～1,953的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO10的由642個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-4.PIG27 使用32P-標記的H124作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將446-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG27 cDNA克隆，然后于2003年10月30日以收錄號AY453399保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年3月31日)。
將插入到λpCEV載體的PIG27克隆用限制性內(nèi)切酶NotI酶切并以氨芐青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體的形式從噬菌體分離(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。
通過T4 DNA連接酶連接含有PIG27基因的pCEV-LAC載體以制備PIG27質(zhì)粒DNA，且然后用連接的克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
由446bp組成的PIG27的全長DNA序列在SEQ ID NO13中示出。
在SEQ ID NO13的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?0～337的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO14的由105個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-5.PIG28 使用32P-標記的H122作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將1,024-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG28 cDNA克隆，然后于2003年10月30日以收錄號AY453398保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年3月31日)。
將插入到λpCEV載體的PIG28克隆用限制性內(nèi)切酶NotI酶切并以氨芐青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體的形式從噬菌體分離(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。
通過T4 DNA連接酶連接含有PIG28基因的pCEV-LAC載體以制備PIG28質(zhì)粒DNA，且然后用連接的克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
由1,024bp組成的PIG28的全長DNA序列在SEQ ID NO17中示出。
在SEQ ID NO17的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?3～998的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO18的由321個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-6.PIG30 使用32P-標記的FC23作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將2,152-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG30 cDNA克隆，然后于2004年2月16日以收錄號AY550975保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。
AY550975基因的DNA序列與以收錄號NM_005186保存在數(shù)據(jù)庫中的人類鈣蛋白酶1，(mu/I)大亞基(CAPN1)基因的相似。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY550975基因與尤其包括乳腺癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)PIG30原癌基因在包括乳腺組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括乳腺癌的多種癌組織中其表達明顯升高。
由2,152bp組成的PIG30的全長DNA序列在SEQ ID NO21中示出。
在SEQ ID NO21的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?～2,150的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO22的由714個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-7.PIG31 使用32P-標記的FC34作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將2,246-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG31 cDNA克隆，然后于2004年6月3日以收錄號AY644768保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。AY644768基因的DNA序列與以收錄號AF085199保存在數(shù)據(jù)庫中的人類golgin-84mRNA基因的相似。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY644768基因與尤其包括乳腺癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)PIG31原癌基因在包括乳腺組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括乳腺癌的多種癌組織中其表達明顯升高。
由2,246bp組成的PIG31的全長DNA序列在SEQ ID NO25中示出。
在SEQ ID NO25的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?7～2,232的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO26的由731個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-8.PIG38 使用32P-標記的HP103作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA庫獲得其中將1,973-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG38 cDNA克隆，然后于2003年12月24日以收錄號AY513282保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。AY513282基因的DNA序列與以收錄號BC024178保存在數(shù)據(jù)庫中的人類假定蛋白FLJ10094基因的相似。然而，該基因的功能是未知的。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY513282基因與尤其包括肝癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)PIG38原癌基因在包括肝組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括肝癌的多種癌組織中其表達明顯升高。
由1,973bp組成的PIG38的全長DNA序列在SEQ ID NO29中示出。
在SEQ ID NO29的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?5～1,956的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO30的由643個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-9.PIG40 使用32P-標記的GV11作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將1,586-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG40 cDNA克隆，然后于2004年9月23日以收錄號AY762100保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年3月31日)。
將插入到λpCEV載體的PIG40克隆用限制性內(nèi)切酶NotI酶切并以氨芐青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體的形式從噬菌體分離(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。
通過T4 DNA連接酶連接含有PIG40基因的pCEV-LAC載體以制備PIG40質(zhì)粒DNA，且然后用連接的克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
由1,586bp組成的PIG40的全長DNA序列在SEQ ID NO33中示出。
在SEQ ID NO33的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?6～1,541的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO34的由501個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-10.PIG43 使用32P-標記的HP11作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將1,245-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG43 cDNA克隆，然后于2003年12月25日以收錄號AY513283保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。AY513283基因的DNA序列與以收錄號NM_002065保存在數(shù)據(jù)庫中的人類谷氨酸-氨連接酶(谷氨酰胺合成酶)(GLUL)基因的相似，但它們表達的蛋白質(zhì)彼此不同。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY513283基因與尤其包括肝癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)PIG43原癌基因在包括肝組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括肝癌的多種癌組織中其表達明顯升高。
由1,245bp組成的PIG43的全長DNA序列在SEQ ID NO37中示出。
在SEQ ID NO37的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?7～758的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO38的由233個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-11.PIG44 使用32P-標記的HP23作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將1,721-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG44 cDNA克隆，然后于2003年12月25日以收錄號AY513284保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。AY513282基因的DNA序列與以收錄號AB037773保存在數(shù)據(jù)庫中的人類假定蛋白FLJ10094基因的相似，但它們表達的蛋白質(zhì)彼此不同。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY513284基因與尤其包括肝癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)PIG44原癌基因在包括肝組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括肝癌的多種癌組織中其表達明顯升高。
由1,721bp組成的PIG44的全長DNA序列在SEQ ID NO41中示出。
在SEQ ID NO41的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?5～1,512的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO42的由485個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-12.PIG46 使用32P-標記的FC24作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將1,312-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG46 cDNA克隆，然后于2004年9月23日以收錄號AY762101保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。AY762101基因的DNA序列與以收錄號NM_000224保存在數(shù)據(jù)庫中的人類角蛋白18(KRT18)，轉(zhuǎn)錄變體1(keratin 18(KRT18)，transcriptional variant 1)基因的相似。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY762101基因與尤其包括乳腺癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)PIG46原癌基因在包括乳腺組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括乳腺癌的多種癌組織中其表達明顯升高。
由1,312bp組成的PIG46的全長DNA序列在SEQ ID NO45中示出。
在SEQ ID NO45的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?～1,297的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO46的由430個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-13.PIG47 使用32P-標記的FC54作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將827-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG47 cDNA克隆，然后于2005年1月1日以收錄號AY871272保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2006年10月1日)。AY871272基因的DNA序列與以收錄號NM_001688保存在數(shù)據(jù)庫中的ATP合酶，H+轉(zhuǎn)運，線粒體F0復合物，亞基b，亞型1(ATP5F1)(ATP sythetase，H+transporting，mitochondria F0 complex，subunit b，isoform 1(ATP5F1))基因的相似。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY871272基因與尤其包括乳腺癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)PIG47原癌基因在包括乳腺組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括乳腺癌的多種癌組織中其表達明顯升高。由827bp組成的PIG47的全長DNA序列在SEQ ID NO49中示出。
在SEQ ID NO49的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?6～826的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO50的由256個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-14.PIG48 使用32P-標記的FC71作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將1,707-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG48 cDNA克隆，然后于2004年1月12日以收錄號AY524046保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。AY524046基因的DNA序列與以收錄號NM_005998保存在數(shù)據(jù)庫中的人類包含TCP1的陪伴蛋白，亞基3(γ)(CCT3)基因的相似。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY524046基因與尤其包括乳腺癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)PIG48原癌基因在包括乳腺組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括乳腺癌的多種癌組織中其表達明顯升高。
由1,707bp組成的PIG48的全長DNA序列在SEQ ID NO53中示出。
在SEQ ID NO53的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?7～1,694的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO54的由545個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-15.PIG50 使用32P-標記的BBCC5-5作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將643-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG50cDNA克隆，然后于2004年2月5日以收錄號AY542309保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。AY542309基因的DNA序列與以收錄號AK000504保存在數(shù)據(jù)庫中的人類cDNA FLJ20497 fis基因的相似。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY542309基因與尤其包括乳腺癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)PIG50原癌基因在包括乳腺組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括乳腺癌的多種癌組織中其表達明顯升高。
由643bp組成的PIG50的全長DNA序列在SEQ ID NO57中示出。
在SEQ ID NO57的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?～595的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO58的由197個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-16.PIG54 使用32P-標記的HP15作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將1,936-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG44 cDNA克隆，然后于2004年2月16日以收錄號AY550968保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。AY550968基因的DNA序列與以收錄號BC041361保存在數(shù)據(jù)庫中的人類SCC-112蛋白質(zhì)基因的相似。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY550968基因與尤其包括肝癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)PIG54原癌基因在包括肝組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括肝癌的多種癌組織中其表達明顯升高。
由1,936bp組成的PIG54的全長DNA序列在SEQ ID NO61中示出。
在SEQ ID NO61的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?8～1,840的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO62的由600個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-17.PIG55 使用32P-標記的FC4作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將526-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長PIG55 cDNA克隆，然后于2004年6月2日以收錄號AY644767保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。AY644767基因的DNA序列與以收錄號NM_007362保存在數(shù)據(jù)庫中的20kDa人類核帽結合蛋白亞基2(NCBP2)基因的相似。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY644767基因與尤其包括乳腺癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)PIG55原癌基因在包括乳腺組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括乳腺癌的多種癌組織中其表達明顯升高。
由526bp組成的PIG55的全長DNA序列在SEQ ID NO65中示出。
在SEQ ID NO65的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?5～485的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO66的由156個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-18.GIG9 使用32P-標記的H148作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA庫獲得其中將1,008-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長GIG9 cDNA克隆，然后于2003年10月29日以收錄號AY453396保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。
將插入到λpCEV載體的GIG9克隆用限制性內(nèi)切酶NotI酶切并以氨芐青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體的形式從噬菌體分離(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。
通過T4 DNA連接酶連接含有GIG9基因的pCEV-LAC載體以制備GIG9質(zhì)粒DNA，且然后用連接的克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
由1,008bp組成的GIG9的全長DNA序列在SEQ ID NO69中示出。
在SEQ ID NO69的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?～1,008的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO70的由335個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-19.HLC-9 使用32P-標記的L738作為探針篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)，從而得到含有L738 cDNA序列的全長基因。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得兩個全長基因；一個得到的基因為其中將1,382-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長HLC9 cDNA克隆，然后于2002年11月30日以收錄號AY189686保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2004年5月1日)。
將插入到λpCEV載體的HLC9克隆用限制性內(nèi)切酶NotI酶切并以氨芐青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體的形式從噬菌體分離(參加上述參考文獻)。
通過T4 DNA連接酶連接含有HLC9基因的pCEV-LAC載體以制備HLC9質(zhì)粒DNA，且然后用連接的克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
由1,382bp組成的HLC9的全長DNA序列在SEQ ID NO73中示出。
在SEQ ID NO73的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?7～1,370的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO74的由447個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-20.GIG18 使用32P-標記的HP47作為探針篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA文庫獲得其中將1,301-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長GIG18 cDNA克隆，然后于2003年12月24日以收錄號AY513279保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。證實AY513279基因的DNA序列與以收錄號NM_002079保存在數(shù)據(jù)庫中的人類谷草轉(zhuǎn)氨酶1，可溶(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶1)(GOT1)mRNA基因的相似。與以前報道的其功能相反，然而從本研究結果發(fā)現(xiàn)AY513279基因與尤其包括肝癌的多種腫瘤發(fā)生密切相關。作為研究結果，發(fā)現(xiàn)GIG18原癌基因在包括肝組織的多種正常人組織中很少表達，而在包括肝癌的多種癌組織中其表達明顯升高。由1,301bp組成的GIG18的全長DNA序列在SEQ ID NO77中示出。
在SEQ ID NO77的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?～1,244的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO78的由413個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
6-21.MIG22 使用32P-標記的L690作為探針以篩選噬菌體λgt11人胚肺成纖維細胞cDNA文庫(Miki，T.等人，Gene 83137-146，1989)。從人胚肺成纖維細胞cDNA庫獲得其中將749-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長MIG22 cDNA克隆，然后于2004年10月5日以收錄號AY771595保存在美國GenBank數(shù)據(jù)庫(預定發(fā)布日期2005年12月31日)。
將插入到λpCEV載體的MIG22克隆用限制性內(nèi)切酶NotI酶切并以氨芐青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體的形式從噬菌體分離(Miki，T.等人，Gene83137-146，1989)。
通過T4 DNA連接酶連接含有MIG22基因的pCEV-LAC載體以制備MIG22質(zhì)粒DNA，且然后用連接的克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。
在SEQ ID NO81的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長可讀框?qū)?5～734的核苷酸序列位置，并且編碼SEQ ID NO82的由239個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。
實施例7多種細胞中原癌基因的RNA印跡分析 7-1.PIG12、PIG30、PIG31、PIG46、PIG47、PIG48、PIG50和PIG55 以與實施例1-1相同的方式從正常乳腺組織、乳腺癌組織和乳腺細胞系MCF-7中提取總RNA樣品。
為了確定各PIG基因的表達水平，將20μg從各組織和細胞系中提取的變性的各總RNA樣品在1％甲醛瓊脂糖凝膠中電泳，且然后將得到的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Boehringer-Mannheim，德國)上。然后將印跡與使用Rediprime II隨機引物標記系統(tǒng)(Amersham，英國)制備的32P-標記的隨機引物FC21 cDNA探針雜交。將RNA印跡分析重復兩次，并因此將得到的印跡用光密度計定量并用β-肌動蛋白標準化。
圖22顯示確定PIG12原癌基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和乳腺癌細胞系(MCF-7)是否表達的RNA印跡結果。如圖22所示，顯示出在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系MCF-7中MIG3原癌基因的表達水平明顯升高，而在正常組織中表達水平非常低或檢測不到。在圖22中，“正?！庇镜辣硎菊Ｈ橄俳M織，“癌”泳道表示乳腺癌組織，以及“MCF-7”泳道表示乳腺癌細胞系。圖22的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖43示出確定PIG12原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖43的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖43所示，顯示PIG12 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約2.0kb)在多種正常組織中不表達。
圖64示出確定PIG12原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖64的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖64所示，顯示PIG12 mRNA轉(zhuǎn)錄物在HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4和伯基特淋巴瘤細胞系Raji中有非常高的表達，而在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、結腸癌細胞系SW480、皮膚癌細胞系G361和肺癌細胞系A549中不表達。
圖27示出確定PIG30原癌基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和乳腺癌細胞系(MCF-7)中是否表達的RNA印跡結果。如圖27所示，顯示PIG30原癌基因在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系MCF-7中的表達水平明顯升高，而在正常組織中表達水平非常低或未檢測到。在圖27中，“正?！庇镜辣硎菊Ｈ橄俳M織，“癌”泳道表示乳腺癌組織，以及“MCF-7”泳道表示乳腺癌細胞系。圖27的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖48示出確定PIG30原癌基因在12泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖48的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖48所示，顯示PIG30 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約3.5kb)在多種正常組織中很少表達。
圖69示出確定PIG30原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖69的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖69所示，顯示PIG30 mRNA轉(zhuǎn)錄物在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中高表達。
圖28示出確定PIG31原癌基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和乳腺癌細胞系(MCF-7)中是否表達的RNA印跡結果。如圖28所示，顯示PIG31原癌基因在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系MCF-7中的表達水平明顯升高，而在正常組織中表達水平非常低或未檢測到。在圖28中，“正?！庇镜辣硎菊Ｈ橄俳M織，“癌”泳道表示乳腺癌組織，以及“MCF-7”泳道表示乳腺癌細胞系。圖28的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖49示出確定PIG31原癌基因在12泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖49的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖49所示，顯示PIG31 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約2.5kb)在多種正常組織中很少表達。
圖70示出確定PIG31原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖70的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖70所示，顯示PIG31mRNA轉(zhuǎn)錄物在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中高表達。
圖33示出確定PIG46原癌基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和乳腺癌細胞系(MCF-7)中是否表達的RNA印跡結果。如圖33所示，顯示PIG46原癌基因在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系MCF-7中的表達水平明顯升高，而在正常組織中表達水平非常低或未檢測到。在圖33中，“正?！庇镜辣硎菊Ｈ橄俳M織，“癌”泳道表示乳腺癌組織，以及“MCF-7”泳道表示乳腺癌細胞系。圖33的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖54示出確定PIG46原癌基因在12泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖54的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖54所示，顯示PIG46 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約1.4kb)在多種正常組織中很少表達或不表達。
圖75示出確定PIG46原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖75的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖75所示，顯示PIG46 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約1.4kb)在HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、結腸癌細胞系SW480和肺癌細胞系A549高表達，而在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji和皮膚癌細胞系G361中不表達。
圖34示出確定PIG47原癌基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和乳腺癌細胞系(MCF-7)中是否表達的RNA印跡結果。如圖34所示，顯示PIG47原癌基因在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系MCF-7中的表達水平明顯升高，而在正常組織中表達水平非常低或未檢測到。在圖34中，“正?！庇镜辣硎菊Ｈ橄俳M織，“癌”泳道表示乳腺癌組織，以及“MCF-7”泳道表示乳腺癌細胞系。圖34的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖55示出確定PIG47原癌基因在12泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖55的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖55所示，顯示PIG47 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約1.3kb)在正常心臟和肌肉組織中表達，而在多種正常組織中很少表達。
圖76示出確定PIG47原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖76的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖76所示，顯示PIG47 mRNA轉(zhuǎn)錄物在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4和伯基特淋巴瘤細胞系Raji高表達，而在結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中不表達。
圖35示出確定PIG48原癌基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和乳腺癌細胞系(MCF-7)中是否表達的RNA印跡結果。如圖35所示，顯示PIG48原癌基因在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系MCF-7中的表達水平明顯升高，而在正常組織中表達水平非常低或未檢測到。在圖35中，“正常”泳道表示正常乳腺組織，“癌”泳道表示乳腺癌組織，以及“MCF-7”泳道表示乳腺癌細胞系。圖35的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖56示出確定PIG48原癌基因在12泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖56的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖56所示，顯示PIG48 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約2.0kb)在多種正常組織中很少表達或不表達。
圖77示出確定PIG48原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖77的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖77所示，顯示PIG48 mRNA轉(zhuǎn)錄物在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中表達非常高。
圖36示出確定PIG50原癌基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和乳腺癌細胞系(MCF-7)中是否表達的RNA印跡結果。如圖36所示，顯示PIG50原癌基因在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系MCF-7中的表達水平明顯升高，而在正常組織中表達水平未檢測到。在圖36中，“正常”泳道表示正常乳腺組織，“癌”泳道表示乳腺癌組織，以及“MCF-7”泳道表示乳腺癌細胞系。圖36的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖57示出確定PIG50原癌基因在12泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖57的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖57所示，顯示PIG50 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約1.0kb)在多種正常組織中很少表達或不表達。而且，同時也顯示具有大約5.0kb大小的PIG50 mRNA轉(zhuǎn)錄物很少表達。
圖78示出確定PIG50原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖78的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖78所示，顯示PIG50mRNA轉(zhuǎn)錄物在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361高表達。而且，同時也顯示具有大約5.0kb大小的PIG50 mRNA轉(zhuǎn)錄物高表達。
圖38示出確定PIG55原癌基因在正常乳腺組織、乳腺癌組織和乳腺癌細胞系(MCF-7)中是否表達的RNA印跡結果。如圖38所示，顯示PIG55原癌基因在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系MCF-7中的表達水平明顯升高，而在正常組織中表達水平非常低或未檢測到。在圖38中，“正常”泳道表示正常乳腺組織，“癌”泳道表示乳腺癌組織，以及“MCF-7”泳道表示乳腺癌細胞系。圖38的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖59示出確定PIG55原癌基因在12泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖59的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖59所示，顯示PIG55 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約3.0kb)在多種正常組織中很少表達或不表達。
圖80示出確定PIG55原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖80的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖80所示，顯示PIG55mRNA轉(zhuǎn)錄物在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361高表達。
7-2.PIG18、PIG23、PIG27、PIG28和GIG9 以與實施例1-2相同的方式從正常外宮頸組織、子宮頸癌組織、宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性組織和子宮頸癌細胞系CaSki(ATCC CRL 1550)和CUMC-6中提取總RNA樣品。
為了確定各PIG或GIG基因的表達水平，將20μg從組織和細胞系中提取的變性的各總RNA樣品在1％甲醛瓊脂糖凝膠中電泳，且然后將得到的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Boehringer-Mannheim，德國)。然后將印跡與使用Rediprime II隨機引物標記系統(tǒng)(Amersham，英國)制備的32P-標記的隨機引物全長PIG23 cDNA探針雜交。將RNA印跡分析重復兩次，且然后將得到的印跡用光密度計定量并用β-肌動蛋白標準化。
圖23顯示確定PIG18原癌基因在正常外宮頸組織、子宮頸癌組織、宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性組織和子宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6)是否表達的RNA印跡結果。如圖23所示，顯示PIG18原癌基因的表達水平升高，即，具有大約5.0kb大小的優(yōu)勢PIG18 mRNA轉(zhuǎn)錄物在子宮頸癌組織和子宮頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中過表達。在圖23中，“正常”泳道表示正常外宮頸組織，“癌”泳道表示子宮頸癌組織，“轉(zhuǎn)移”泳道表示宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性組織，以及“CaSki”和“CUMC-6”泳道各表示子宮癌細胞系。圖23的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖44示出確定PIG18原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖44的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖44所示，顯示PIG18 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約5.0kb大小的優(yōu)勢PIG18mRNA轉(zhuǎn)錄物)在正常組織，如腦、心臟、肌肉、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞中很少表達或不表達。而且，同時顯示具有大約3.0kb大小的PIG18 mRNA轉(zhuǎn)錄物在正常心臟中很少表達。
圖65示出確定PIG18原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖65的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖65所示，顯示PIG18 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約5.0kb大小的優(yōu)勢PIG18 mRNA轉(zhuǎn)錄物)在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中有非常高的表達。而且，顯示具有3.0kb大小的PIG18 mRNA轉(zhuǎn)錄物同時在HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4中以升高的水平表達。
圖24顯示確定PIG23原癌基因在正常外宮頸組織、子宮頸癌組織、宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性組織和子宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6)是否表達的RNA印跡結果。如圖24所示，顯示PIG23原癌基因的表達水平升高，即，具有大約4.5kb大小的優(yōu)勢PIG23 mRNA轉(zhuǎn)錄物在子宮頸癌組織、宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性組織和子宮頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中過表達。在圖24中，“正?！庇镜辣硎菊Ｍ鈱m頸組織，“癌”泳道表示子宮頸癌組織，“轉(zhuǎn)移”泳道表示宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性組織，以及“CaSki”和“CUMC-6”泳道各表示子宮癌細胞系。圖24的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖45示出確定PIG23原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖45的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖45所示，顯示PIG18 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約4.5kb大小的優(yōu)勢PIG18mRNA轉(zhuǎn)錄物)在正常組織，如腦、心臟、肌肉、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞中很少表達或不表達。
圖66示出確定PIG23原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖66的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖66所示，顯示PIG23mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約4.5kb大小的優(yōu)勢PIG23 mRNA轉(zhuǎn)錄物)在HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中有非常高的表達。而且，顯示具有大約7.0kb和2.0kb大小的PIG23mRNA轉(zhuǎn)錄物同時在HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中以升高的水平表達。
圖25顯示確定PIG27原癌基因在正常外宮頸組織、子宮頸癌組織、宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性組織和子宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6)是否表達的RNA印跡結果。如圖25所示，顯示PIG27原癌基因的表達水平升高，即，具有大約1.5kb大小的優(yōu)勢PIG27 mRNA轉(zhuǎn)錄物在子宮頸癌組織和子宮頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中過表達。在圖25中，“正?！庇镜辣硎菊Ｍ鈱m頸組織，“癌”泳道表示子宮頸癌組織，“轉(zhuǎn)移”泳道表示宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性組織，以及“CaSki”和“CUMC-6”泳道各表示子宮癌細胞系。圖25的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖46示出確定PIG27原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖46的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖46所示，顯示PIG27 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約1.5kb大小的優(yōu)勢PIG27mRNA轉(zhuǎn)錄物)在正常組織，如腦、心臟、肌肉、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞中很少表達。
圖67示出確定PIG27原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖67的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖67所示，顯示PIG27 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約1.5kb大小的優(yōu)勢PIG27 mRNA轉(zhuǎn)錄物)在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中有非常高的表達。
圖26顯示確定PIG28原癌基因在正常外宮頸組織、子宮頸癌組織、宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性組織和子宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6)是否表達的RNA印跡結果。如圖26所示，顯示PIG28原癌基因的表達水平升高，即，具有大約1.5kb大小的優(yōu)勢PIG28 mRNA轉(zhuǎn)錄物在子宮頸癌組織和子宮頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中過表達。在圖26中，“正?！庇镜辣硎菊Ｍ鈱m頸組織，“癌”泳道表示子宮頸癌組織，“轉(zhuǎn)移”泳道表示宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性組織，以及“CaSki”和“CUMC-6”泳道各表示子宮癌細胞系。圖26的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖47示出確定PIG28原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖47的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖47所示，顯示PIG28 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約1.5kb大小的優(yōu)勢PIG28mRNA轉(zhuǎn)錄物)在正常組織，如腦、心臟、肌肉、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞中很少表達或不表達。而且，顯示具有大約2.2kb大小的PIG28 mRNA轉(zhuǎn)錄物同時在正常組織，如腦、心臟、肌肉、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞中很少表達或不表達。
圖68示出確定PIG28原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖68的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖68所示，顯示PIG28 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約1.5kb大小的優(yōu)勢PIG28 mRNA轉(zhuǎn)錄物)在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中有非常高的表達。而且，顯示2.2kb大小的PIG28 mRNA轉(zhuǎn)錄物同時在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中以升高的水平的表達。
圖39顯示確定GIG9原癌基因在正常外宮頸組織、子宮頸癌組織、宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性組織和子宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6)是否表達的RNA印跡結果。如圖39所示，顯示GIG9原癌基因的表達水平升高，即，具有大約1.5kb大小的優(yōu)勢GIG9 mRNA轉(zhuǎn)錄物在子宮頸癌組織和子宮頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中過表達。在圖39中，“正?！庇镜辣硎菊Ｍ鈱m頸組織，“癌”泳道表示子宮頸癌組織，“轉(zhuǎn)移”泳道表示宮頸部淋巴結轉(zhuǎn)移性組織，以及“CaSki”和“CUMC-6”泳道各表示子宮癌細胞系。圖39的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖60示出確定GIG9原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖60的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖60所示，顯示GIG9 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約1.5kb大小的優(yōu)勢GIG9mRNA轉(zhuǎn)錄物)在正常組織，如腦、心臟、肌肉、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞中很少表達。
圖81示出確定GIG9原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖81的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖81所示，顯示GIG9 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約1.5kb大小的優(yōu)勢GIG9 mRNA轉(zhuǎn)錄物)在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中有非常高的表達。
7-3.PIG38、PIG43、PIG44、PIG54和GIG18 以與實施例1-3相同的方式從正常肝組織、肝癌組織和肝癌細胞系HepG2中提取總RNA樣品。
為了確定各PIG基因的表達水平，將20μg從組織和細胞系中提取的變性的各總RNA樣品在1％甲醛瓊脂糖凝膠中電泳，且然后將得到的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Boehringer-Mannheim，德國)。然后將印跡與使用Rediprime II隨機引物標記系統(tǒng)(Amersham，英國)制備的32P-標記的隨機引物HP103 cDNA探針雜交。將RNA印跡分析重復兩次，并然后將得到的印跡用光密度計定量并用β-肌動蛋白標準化。
圖29顯示確定PIG38原癌基因在正常肝組織、肝癌組織和肝癌細胞系(HepG2)是否表達的RNA印跡結果。如圖29所示，顯示出在肝癌組織和肝癌細胞系HepG2中PIG38原癌基因高表達，而在正常組織中不表達或很少表達。圖29的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖50示出確定PIG38原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖50的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖50所示，顯示PIG38 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約1.5kb)在如肝組織的多種正常組織中不表達或很少表達。圖71示出確定PIG38原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖71的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖71所示，顯示PIG38 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約1.5kb)在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中高表達。而且，顯示另外的具有大約2.5kb、3kb和4.5kb大小的PIG38 mRNA轉(zhuǎn)錄物同時在癌細胞系中表達。
圖31顯示確定PIG43原癌基因在正常肝組織、肝癌組織和肝癌細胞系(HepG2)是否表達的RNA印跡結果。如圖31所示，顯示出在肝癌組織和肝癌細胞系HepG2中PIG43原癌基因高表達，而在正常組織中不表達或很少表達。圖31的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖52示出確定PIG43原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖52的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖52所示，顯示PIG43 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約3.0kb)在如肝組織的多種正常組織中不表達或很少表達。圖73示出確定PIG43原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖73的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖73所示，顯示PIG43 mRNA轉(zhuǎn)錄物在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、結腸癌細胞系SW480和皮膚癌細胞系G361中高表達，而在伯基特淋巴瘤細胞系Raji和肺癌細胞系A549中不表達。
圖32顯示確定PIG44原癌基因在正常肝組織、肝癌組織和肝癌細胞系(HepG2)是否表達的RNA印跡結果。如圖32所示，顯示出在肝癌組織和肝癌細胞系HepG2中PIG44原癌基因高表達，而在正常組織中不表達或很少表達。圖32的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖53示出確定PIG44原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖53的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖53所示，顯示PIG44 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約4.5kb)在如肝組織的多種正常組織中不表達或很少表達，但只在正常心臟和肌肉中很少表達。而且，顯示具有大約5.0kb大小的PIG38 mRNA轉(zhuǎn)錄物在正常心臟和肌肉中很少表達。圖74示出確定PIG38原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖74的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖74所示，顯示PIG44 mRNA轉(zhuǎn)錄物在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中高表達。而且，顯示具有大約5.0kb大小的PIG44 mRNA轉(zhuǎn)錄物同時表達。
圖37顯示確定PIG54原癌基因在正常肝組織、肝癌組織和肝癌細胞系(HepG2)是否表達的RNA印跡結果。如圖37所示，顯示出在肝癌組織和肝癌細胞系HepG2中PIG38原癌基因高表達，而在正常組織中不表達或很少表達。圖37的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖58示出確定PIG54原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖58的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖58所示，顯示PIG54 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約7.0kb)在如肝組織的多種正常組織中不表達或很少表達。而且，顯示具有大約9.0kb大小的PIG54 mRNA轉(zhuǎn)錄物同時很少表達。圖79示出確定PIG38原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖79的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖79所示，顯示PIG54 mRNA轉(zhuǎn)錄物在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中高表達。而且，顯示具有大約9.0kb和3.0kb大小的PIG54mRNA轉(zhuǎn)錄物同時表達。
圖41顯示確定GIG18原癌基因在正常肝組織、肝癌組織和肝癌細胞系(HepG2)是否表達的RNA印跡結果。如圖41所示，顯示出在肝癌組織和肝癌細胞系HepG2中GIG18原癌基因高表達，而在正常組織中很少表達。圖41的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖62示出確定GIG18原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖62的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖62所示，顯示GIG18 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約2.2kb)在如肝組織的多種正常組織中不表達或很少表達。而且，顯示具有大約2.0kb大小的GIG18mRNA轉(zhuǎn)錄物同時很少表達。圖83示出確定GIG18原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖83的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖83所示，顯示GIG18 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約2.2kb)在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中高表達。而且，顯示具有大約2.0kb大小的GIG18 mRNA轉(zhuǎn)錄物同時在癌細胞系高表達。
7-4.PIG40 以與實施例1-4相同的方式從正常外周血組織、白血病組織和K-562細胞中提取總RNA樣品。
為了確定PIG40基因的表達水平，將20μg從組織和細胞系中提取的變性的各總RNA樣品在1％甲醛瓊脂糖凝膠中電泳，且然后將得到的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Boehringer-Mannheim，德國)。然后將印跡與使用Rediprime II隨機引物標記系統(tǒng)(Amersham，英國)制備的32P-標記的隨機引物全長PIG40cDNA探針雜交。將RNA印跡分析重復兩次，并然后將得到的印跡用光密度計定量并用β-肌動蛋白標準化。
圖30顯示確定PIG40原癌基因在正常外周血組織、白血病組織和K-562細胞是否表達的RNA印跡結果。如圖30所示，顯示出PIG40原癌基因的表達水平升高，即，具有2.5kb大小的優(yōu)勢PIG40 mRNA轉(zhuǎn)錄物在白血病組織和K-562細胞系中過表達。在圖30中，“正?！庇镜辣硎菊Ｍ庵苎M織，“癌”泳道表示白血病組織，以及“K562”泳道表示白血病細胞系。圖30的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖51示出確定PIG40原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖51的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖51所示，顯示PIG40 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約2.5kb大小的優(yōu)勢PIG40mRNA轉(zhuǎn)錄物)在多種正常組織，如腦、心臟、肌肉、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中很少表達或不表達。
圖72示出確定PIG40原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖72的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖72所示，顯示PIG40 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約2.5kb大小的優(yōu)勢PIG40 mRNA轉(zhuǎn)錄物)在HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中高表達。而且，顯示具有大約2.0kb大小的PIG40 mRNA轉(zhuǎn)錄物同時在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中以升高的水平表達。
7-5.HLC-9和MIG22 以與實施例1相同的方式從正常肺組織、左肺癌組織、從左肺轉(zhuǎn)移道右肺的轉(zhuǎn)移性肺癌組織以及肺癌細胞系A549、NCI-H2009(美國典型培養(yǎng)物保藏中心；ATCC號CRL-5911)和NCI-H441(美國典型培養(yǎng)物保藏中心；ATCC號HTB-174)中提取總RNA樣品。
為了確定各HLC9或MIG22基因的表達水平，將20μg從組織和細胞系中提取的變性的各總RNA樣品在1％甲醛瓊脂糖凝膠中電泳，且然后將得到的瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Boehringer-Mannheim，德國)。然后將印跡與使用Rediprime II隨機引物標記系統(tǒng)(Amersham，英國)制備的32P-標記的隨機引物部分L738或L690 cDNA探針雜交。將RNA印跡分析重復兩次，并然后將得到的印跡用光密度計定量并用β-肌動蛋白標準化。
圖40顯示確定HLC9原癌基因在正常肺組織、肺癌組織、轉(zhuǎn)移性肺癌組織和肺癌細胞系(A549、NCI-H2009和NCI-H441)是否表達的RNA印跡結果。如圖40所示，顯示HLC9原癌基因在肺癌組織、轉(zhuǎn)移性肺癌組織和肺癌細胞系A549、NCI-H2009和NCI-H441中高表達，而在正常肺組織中很少表達或不表達。在圖40中，“正常”泳道表示正常肺組織，“癌”泳道表示肺癌組織，“轉(zhuǎn)移”泳道表示轉(zhuǎn)移性肺癌組織，以及“A549”、“NCI-H2009”和“NCI-H441”泳道表示肺癌細胞系。圖40的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖61示出確定HLC9原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖61的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖61所示，顯示HLC9 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約2.5kb)在如肌肉、心臟和胎盤的正常組織中表達，且在其它正常組織中非常表達或不表達。而且，顯示具有大約4.4kb大小的另一個HLC9 mRNA轉(zhuǎn)錄物同時在正常組織中很少表達或不表達。
圖82示出確定HLC9原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖82的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖82所示，顯示HLC9 mRNA轉(zhuǎn)錄物(大約1.5kb)在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中高表達。而且，顯示另外的具有4.4kb的另一個HLC9 mRNA轉(zhuǎn)錄物同時在癌細胞系中高表達。
圖42顯示確定MIG22原癌基因在正常肺組織、肺癌組織、轉(zhuǎn)移性肺癌組織和肺癌細胞系(A549和NCI-H358)是否表達的RNA印跡結果。如圖42所示，顯示MIG22原癌基因在肺癌組織、轉(zhuǎn)移性肺癌組織和肺癌細胞系A549和NCI-H358中高表達，而在正常肺組織中很少表達或不表達。在圖42中，“正?！庇镜辣硎菊７谓M織，“癌”泳道表示肺癌組織，“轉(zhuǎn)移”泳道表示轉(zhuǎn)移性肺癌組織，以及“A549”和“NCI-H358”泳道表示肺癌細胞系。圖42的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。
圖63示出確定MIG22原癌基因在12-泳道正常人多種組織(Clontech)，例如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾、腎、肝、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖63的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖63所示，顯示MIG22 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約1.0kb大小的轉(zhuǎn)錄物)在正常組織中很少表達或不表達。
圖84示出確定MIG22原癌基因在人癌細胞系，例如HL-60、HeLa、K-562、MOLT-4、Raji、SW480、A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結果。圖84的底部示出通過使相同樣品和β-肌動蛋白探針雜交而表明β-肌動蛋白mRNA是否轉(zhuǎn)錄的RNA印跡結果。如圖84所示，顯示MIG22 mRNA轉(zhuǎn)錄物(具有大約1.0kb大小的優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄物和具有大約5.0kb和8.0kb大小的另外的轉(zhuǎn)錄物)在早幼粒細胞白血病細胞系HL-60、HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞性白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中有非常高的表達。
實施例8用原癌基因轉(zhuǎn)化大腸桿菌后表達的蛋白質(zhì)大小的確定 將各SEQ ID NO1的PIG12原癌基因；SEQ ID NO5的PIG18原癌基因；SEQ ID NO9的PIG23原癌基因；SEQ ID NO13的PIG27原癌基因；SEQ IDNO17的PIG28原癌基因；SEQ ID NO21的PIG30原癌基因；SEQ ID NO25的PIG31原癌基因；SEQ ID NO29的PIG38原癌基因；SEQ ID NO33的PIG40原癌基因；SEQ ID NO37的PIG43原癌基因；SEQ ID NO41的PIG44原癌基因；SEQ ID NO45的PIG46原癌基因；SEQ ID NO49的PIG47原癌基因；SEQ ID NO53的PIG48原癌基因；SEQ ID NO57的PIG50原癌基因；SEQ ID NO61的PIG54原癌基因；SEQ ID NO65的PIG55原癌基因；SEQID NO69的GIG9原癌基因；SEQ ID NO73的HLC-9原癌基因；SEQ ID NO77的GIG18原癌基因以及SEQ ID NO81的MIG22原癌基因插入到pBAD/thio-TOPO載體(Invitrogen)的多克隆位點，且然后用各得到的表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。將各轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株在LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，然后將得到的各培養(yǎng)物以1/100的比率稀釋并再培養(yǎng)3小時。向其中加入1mM異丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，Sigma)以促進其蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。在IPTG誘導前/后將大腸桿菌細胞在培養(yǎng)基中超聲處理，然后將超聲處理的勻漿進行12％十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。根據(jù)引用的參考文獻(Sambrook，J.等人，Molecular CloningA Laboratory manual，紐約冷泉港實驗室(1989))中描述的方法，在從培養(yǎng)基得到蛋白質(zhì)樣品后進行SDS-PAGE。
圖85為示出PIG12蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析結果的圖。在圖85中，泳道1表示IPTG誘導前的蛋白質(zhì)樣品，且泳道2表示由IPTG誘導的PIG12基因表達后的蛋白質(zhì)樣品。如圖85所示，表達的PIG12蛋白質(zhì)具有大約46kDa的分子量，其對應于來自其DNA序列的分子量。
圖86示出確定在用pBAD/thio-Topo/PIG18載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約22kDa分子量的融合蛋白條帶。15-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約7kDa分子量的PIG18蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/PIG18載體中的蛋白質(zhì)。
圖87示出確定在用pBAD/thio-Topo/PIG28載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約85kDa分子量的融合蛋白條帶。85-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約70kDa分子量的PIG23蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/PIG23載體中的蛋白質(zhì)。
圖88示出確定在用pBAD/thio-Topo/PIG27載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約27kDa分子量的融合蛋白條帶。27-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約12kDa分子量的PIG27蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/PIG27載體中的蛋白質(zhì)。
圖89示出確定在用pBAD/thio-Topo/PIG28載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約51kDa分子量的融合蛋白條帶。51-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約36kDa分子量的PIG28蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/PIG28載體中的蛋白質(zhì)。
圖90為示出PIG30蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析結果的圖。在圖90中，泳道1表示IPTG誘導前的蛋白質(zhì)樣品，且泳道2表示由IPTG誘導的PIG30基因表達后的蛋白質(zhì)樣品。如圖90所示，表達的PIG30蛋白質(zhì)具有大約82kDa的分子量，其對應于來自其DNA序列的分子量。
圖91為示出PIG31蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析結果的圖。在圖91中，泳道1表示IPTG誘導前的蛋白質(zhì)樣品，且泳道2表示由IPTG誘導的PIG31基因表達后的蛋白質(zhì)樣品。如圖91所示，表達的PIG31蛋白質(zhì)具有大約83kDa的分子量，其對應于來自其DNA序列的分子量。
圖92示出確定在用pBAD/thio-Topo/PIG38載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約88kDa分子量的融合蛋白條帶。88-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約73kDa分子量的PIG38蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/PIG38載體中的蛋白質(zhì)。
圖93示出確定在用pBAD/thio-Topo/PIG40載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約72kDa分子量的融合蛋白條帶。72-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約57kDa分子量的PIG38蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/PIG40載體中的蛋白質(zhì)。
圖94示出確定在用pBAD/thio-Topo/PIG43載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約41kDa分子量的融合蛋白條帶。41-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約26kDa分子量的PIG43蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/PIG43載體中的蛋白質(zhì)。
圖95示出確定在用pBAD/thio-Topo/PIG44載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約70kDa分子量的融合蛋白條帶。70-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約55kDa分子量的PIG38蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/PIG44載體中的蛋白質(zhì)。
圖96為示出PIG46蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析結果的圖。在圖96中，泳道1表示IPTG誘導前的蛋白質(zhì)樣品，且泳道2表示由IPTG誘導的PIG46基因表達后的蛋白質(zhì)樣品。如圖96所示，表達的PIG46蛋白質(zhì)具有大約48kDa的分子量，其對應于來自其DNA序列的分子量。
圖97為示出PIG47蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析結果的圖。在圖97中，泳道1表示IPTG誘導前的蛋白質(zhì)樣品，且泳道2表示由IPTG誘導的PIG47基因表達后的蛋白質(zhì)樣品。如圖97所示，表達的PIG47蛋白質(zhì)具有大約29kDa的分子量，其對應于來自其DNA序列的分子量。
圖98為示出PIG48蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析結果的圖。在圖98中，泳道1表示IPTG誘導前的蛋白質(zhì)樣品，且泳道2表示由IPTG誘導的PIG48基因表達后的蛋白質(zhì)樣品。如圖98所示，表達的PIG48蛋白質(zhì)具有大約60kDa的分子量，其對應于來自其DNA序列的分子量。
圖99為示出PIG50蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析結果的圖。在圖99中，泳道1表示IPTG誘導前的蛋白質(zhì)樣品，且泳道2表示由IPTG誘導的PIG50基因表達后的蛋白質(zhì)樣品。如圖99所示，表達的PIG50蛋白質(zhì)具有大約22kDa的分子量，其對應于來自其DNA序列的分子量。
圖100示出確定在用pBAD/thio-Topo/PIG54載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約84kDa分子量的融合蛋白條帶。84-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約69kDa分子量的PIG54蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/PIG54載體中的蛋白質(zhì)。
圖101為示出PIG55蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析結果的圖。在圖101中，泳道1表示IPTG誘導前的蛋白質(zhì)樣品，且泳道2表示由IPTG誘導的PIG55基因表達后的蛋白質(zhì)樣品。如圖101所示，表達的PIG55蛋白質(zhì)具有大約18kDa的分子量，其對應于來自其DNA序列的分子量。
圖102示出確定在用pBAD/thio-Topo/GIG9載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約53kDa分子量的融合蛋白條帶。53-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約38kDa分子量的GIG9蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/GIG9載體中的蛋白質(zhì)。
圖103示出確定在用pBAD/thio-Topo/HLC9載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約66kDa分子量的融合蛋白條帶。66-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約51kDa分子量的HLC9蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/HLC9載體中的蛋白質(zhì)。
圖104示出確定在用pBAD/thio-Topo/GIG18載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約61kDa分子量的融合蛋白條帶。61-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約46kDa分子量的GIG18蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/GIG18載體中的蛋白質(zhì)。
圖105示出確定在用pBAD/thio-Topo/MIG22載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌Top10菌株中的蛋白質(zhì)表達模式的SDS-PAGE結果，其中在L-阿拉伯糖誘導后清楚地觀察到具有大約42kDa分子量的融合蛋白條帶。42-kDa融合蛋白包括具有大約15kDa分子量的HT-硫氧還蛋白和具有大約27kDa分子量的MIG22蛋白質(zhì)，各被插入到pBAD/thio-Topo/MIG22載體中的蛋白質(zhì)。
工業(yè)實用性 本發(fā)明的原癌基因可有效地用于診斷包括乳腺癌、白血病、子宮癌、肺癌、惡性淋巴瘤等的多種癌癥。
序列表
<110>金弦起(KIM，HYUN-KEE)
<120>人類原癌基因及其編碼的蛋白質(zhì)
<130>PCT06-023
<150>KR10-2005-0026244
<151>2005-03-30
<160>84
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>1258
<212>DNA
<213>人類
<400>1
gcctccaagg tttgtcttga agcatagctc cagctggagg gtacctttta agctgttcaa60
ggtcaagatg aatacaaact caaaggaggt tttatccctg ggtgttcaag ttcccgaggc120
atgggaagaa cttctgacaa tgaaagtgga agcaaaaagt caccttcaat ggcaggaatc180
cagactgaaa cgcagtaatc cactggcaag ggaaatcttc cgaaggcact ttcgacagct240
gtgctaccaa gagacccctg gaccaaggga ggctcttact cgactccagg aactttgcta300
ccagtggttg aggccacatg tgagcacaaa ggagcagatt ttggatctgc tggtgctgga360
gcagtttcta tccattctgc ccaaggagct ccagggctgg gtgagggaac actgtccaga420
gagtggagaa gaggctgtga ttttgctgga ggatctggag agagagctcg atgaaccaca480
acatgagatg gtggcccaca gacacagaca agaagtcctc tgtaaagaga tggtgcctct540
agcagagcag acaccactga cccttcagtc ccagcctaag gagccacagc tcacatgtga600
ctctgctcag aagtgccatt ctattggaga gacagatgaa gtaaccaaga ctgaggacag660
agagttggtg ctaaggaaag actgtcctaa gatagtggaa ccacatggga aaatgtttaa720
tgagcagacc tgggaggtat cacagcagga tccctcacat ggagaagttg gtgaacataa780
ggataggata gagaggcagt ggggaaacct cttaggagag gggcaacaca aatgtgatga840
atgtgggaag agctttactc agagctcagg tctcattcga catcaaagaa ttcatactgg900
agaaagacct tatgaatgta atgaatgtgg gaaagccttc agtcgaagtt ctggtctttt960
taatcaccga ggaatccaca atatacagaa acggtaccac tgcaaggagt gtgggaaggt1020
cttcagtcag agtgcgggtc ttatccagca tcagagaatc cacaaaggag aaaagccgta1080
tcagtgcagc cagtgcagta agagctacag tcggcgttca tttctcattg aacatcagag1140
aagccacaca ggggagcgac ctcaccagtg cattgaatgt gggaaaagct ttaatcgaca1200
ctgcaacctc attcgccatc agaagatcca cacagtggct gagctggtct agggcttg 1258
<210>2
<211>394
<212>PRT
<213>人類
<400>2
Met Asn Thr Asn Ser Lys Glu Val Leu Ser Leu Gly Val Gln Val Pro
1 5 10 15
Glu Ala Trp Glu Glu Leu Leu Thr Met Lys Val Glu Ala Lys Ser His
20 25 30
Leu Gln Trp Gln Glu Ser Arg Leu Lys Arg Ser Asn Pro Leu Ala Arg
35 40 45
Glu Ile Phe Arg Arg His Phe Arg Gln Leu Cys Tyr Gln Glu Thr Pro
50 55 60
Gly Pro Arg Glu Ala Leu Thr Arg Leu Gln Glu Leu Cys Tyr Gln Trp
65 70 75 80
Leu Arg Pro His Val Ser Thr Lys Glu Gln Ile Leu Asp Leu Leu Val
85 90 95
Leu Glu Gln Phe Leu Ser Ile Leu Pro Lys Glu Leu Gln Gly Trp Val
100 105 110
Arg Glu His Cys Pro Glu Ser Gly Glu Glu Ala Val Ile Leu Leu Glu
115 120 125
Asp Leu Glu Arg Glu Leu Asp Glu Pro Gln His Glu Met Val Ala His
130 135 140
Arg His Arg Gln Glu Val Leu Cys Lys Glu Met Val Pro Leu Ala Glu
145 150 155 160
Gln Thr Pro Leu Thr Leu Gln Ser Gln Pro Lys Glu Pro Gln Leu Thr
165 170 175
Cys Asp Ser Ala Gln Lys Cys His Ser Ile Gly Glu Thr Asp Glu Val
180 185 190
Thr Lys Thr Glu Asp Arg Glu Leu Val Leu Arg Lys Asp Cys Pro Lys
195 200 205
Ile Val Glu Pro His Gly Lys Met Phe Asn Glu Gln Thr Trp Glu Val
210 215 220
Ser Gln Gln Asp Pro Ser His Gly Glu Val Gly Glu His Lys Asp Arg
225 230 235 240
Ile Glu Arg Gln Trp Gly Asn Leu Leu Gly Glu Gly Gln His Lys Cys
245 250 255
Asp Glu Cys Gly Lys Ser Phe Thr Gln Ser Ser Gly Leu Ile Arg His
260 265 270
Gln Arg Ile His Thr Gly Glu Arg Pro Tyr Glu Cys Asn Glu Cys Gly
275 280 285
Lys Ala Phe Ser Arg Ser Ser Gly Leu Phe Asn His Arg Gly Ile His
290 295 300
Asn Ile Gln Lys Arg Tyr His Cys Lys Glu Cys Gly Lys Val Phe Ser
305 310 315 320
Gln Ser Ala Gly Leu Ile Gln His Gln Arg Ile His Lys Gly Glu Lys
325 330 335
Pro Tyr Gln Cys Ser Gln Cys Ser Lys Ser Tyr Ser Arg Arg Ser Phe
340 345 350
Leu Ile Glu His Gln Arg Ser His Thr Gly Glu Arg Pro His Gln Cys
355 360 365
Ile Glu Cys Gly Lys Ser Phe Asn Arg His Cys Asn Leu Ile Arg His
370 375 380
Gln Lys Ile His Thr Val Ala Glu Leu Val
385 390
<210>3
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG12的錨定引物
<400>3
aagctttttt ttttta 16
<210>4
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG12的H-AP21引物
<400>4
aagctttctc tgg 13
<210>5
<211>2403
<212>DNA
<213>人類
<400>5
cccagcagtt ataacagcag tgggcagttg atggcaagta aaatggatac ctgctctagt60
aacctgaata acagcatata caaaaagctg ttaacttagg aaaagggact gctgggaggt120
taaaaagaaa agtttataaa agtgaataac ctgaggattc tattagtccc cacccaaact180
ttattgattc acctcctaaa acaacagatg tacgacttgc atacctgctt tttatgggag240
ctgtcaagca tgtatttttg tcaattacca gaaagataac aggacgagat gacggtgtta300
ttccaaggga atattgccaa tgctacagta ataaatgaat gtcacttctg gatatagcta360
ggtgacatat acatacttac atgtgtgtat atgtagatgt atgcacacac atatattatt420
tgcagtgcag tatagaatag gcactttaaa acactctttc cccgcacccc agcaattatg480
aaaataatct ctgattccct gatttaatat gcaaagtcta ggttggtaga gtttagccct540
gaacatttca tggtgttcat caacagtgag agactccata gtttgggctt gtaccacttt600
tgcaaataag tgtattttga aattgtttga cggcaaggtt taagttatta agaggtaaga660
cttagtacta tctgtgcgta gaagttctag tgttttcaat tttaaacata tccaagtttg720
aattcctaaa attatggaaa cagatgaaaa gcctctgttt tgatatgggt agtatttttt780
acattttaca cactgtacac ataagccaaa actgagcata agtcctctag tgaatgtagg840
ctggctttca gagtaggcta ttcctgagag ctgcatgtgt ccgcccccga tggaggactc900
caggcagcag acacatgcca gggccatgtc agacacagat tggccagaaa ccttcctgct960
gagcctcaca gcagtgagac tggggccact acatttgctc catcctcctg ggattggctg1020
tgaactgatc atgtttatga gaaactggca aagcagaatg tgatatccta ggaggtaatg1080
accatgaaag acttctctac ccatcttaaa aacaacgaaa gaaggcatgg acttctggat1140
gcccatccac tgggtgtaaa cacatctagt agttgttctg aaatgtcagt tctgatatgg1200
aagcacccat tatgcgctgt ggccactcca ataggtgctg agtgtacaga gtggaataag1260
acagagacct gccctcaaga gcaaagtaga tcatgcatag agtgtgatgt atgtgtaata1320
aatatgtttc acacaaacaa ggcctgtcag ctaaagaagt ttgaacattt gggttactat1380
ttcttgtggt tataacttaa tgaaaacaat gcagtacagg acatatattt tttaaaataa1440
gtctgattta attgggcact atttatttac aaatgttttg ctcaatagat tgctcaaatc1500
aggttttctt ttaagaatca atcatgtcag tctgcttaga aataacagaa gaaaatagaa1560
ttgacattga aatctaggaa aattattcta taatttccat ttacttaaga cttaatgaga1620
ctttaaaagc attttttaac ctcctaagta tcaagtatag aaaatcttca tggaattcac1680
aaagtaattt ggaaattagg ttgaaacata tctcttatct tacgaaaaaa tggtagcatt1740
ttaaacaaaa tagaaagttg caaggcaaat gtttatttaa aagagcaggc caggcgcggt1800
ggctcacgcc tgtaatccca gcactttggg aggctgaggc gggtggatca cgaggtcagg1860
agatcgagac catcctggct aacacggtga aacccgtctc tactaaaaat gcaaaaaaaa1920
ttagccgggc gtggtggcag gcacctgtag tcccagctac tcgggaggct gaggcaggag1980
actggcgtga acccaggagg cggaccttgt agtgagccga gatcgcgcca ctgtgctcca2040
gcctgggcaa cagagcaaga ctccatctca aaaaataaaa ataaataaaa aataaaaaaa2100
taaaagagca aactatttcc aaataccata gaataactta cataaaagta atataactgt2160
attgtaagta gaagctagca ctggttttat taatttagtg actattcatt ttatctaaat2220
cagtgaagat ttactgtcat tgtttattag tctgtatata ttaaaatatg atatcattaa2280
tgtacttaca aaatagtatg tcactgtttt tatgttcatt cttaaaaaca taacctgtat2340
taataaatgt gaacatttgc ttggtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa2400
aaa 2403
<210>6
<211>167
<212>PRT
<213>人類
<400>6
Met Cys Pro Pro Pro Met Glu Asp Ser Arg Gln Gln Thr His Ala Arg
1 5 10 15
Ala Met Ser Asp Thr Asp Trp Pro Glu Thr Phe Leu Leu Ser Leu Thr
20 25 30
Ala Val Arg Leu Gly Pro Leu His Leu Leu His Pro Pro Gly Ile Gly
35 40 45
Cys Glu Leu Ile Met Phe Met Arg Asn Trp Gln Ser Arg Met Met Thr
50 55 60
Met Lys Asp Phe Ser Thr His Leu Lys Asn Asn Glu Arg Arg His Gly
65 70 75 80
Leu Leu Asp Ala His Pro Leu Gly Val Asn Thr Ser Ser Ser Cys Ser
85 90 95
Glu Met Ser Val Leu Ile Trp Lys His Pro Leu Cys Ala Val Ala Thr
100 105 110
Pro Ile Gly Ala Glu Cys Thr Glu Trp Asn Lys Thr Glu Thr Cys Pro
115 120 125
Gln Glu Gln Ser Arg Ser Cys Ile Glu Cys Asp Val Cys Val Ile Asn
130 135 140
Met Phe His Thr Asn Lys Ala Cys Gln Leu Lys Lys Phe Glu His Leu
145 150 155 160
Gly Tyr Tyr Phe Leu Trp Leu
165
<210>7
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG18的錨定引物
<400>7
aagctttttt tttttc 16
<210>8
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG18的H-AP11引物
<400>8
aagcttcggg taa13
<210>9
<211>2150
<212>DNA
<213>人類
<400>9
gcggacagtg cggaactaaa gcaaatggtt atgagcctta gagtttctga actccaagta60
ctgttgggct acgccgggag aaacaagcac ggacgcaaac acgaacttct cacaaaagcc120
ctgcatttgc taaaggctgg ctgtagtcct gctgtgcaaa tgaaaattaa ggaactctat180
aggcggcggt tcccacagaa aatcatgacg cctgcagact tgtccatccc caacgtacat240
tcaagtccta tgccagcaac tttgtctcca tctaccattc cacaactcac ttacgatggt300
caccctgcat catcgccatt actccctgtt tctcttctgg gacctaaaca tgaactggaa360
ctcccacatc ttacatcagc tcttcaccca gtccatccgg atataaaact tcaaaaatta420
ccattttatg atttactgga tgaactgata aaacccacca gtctagcatc agacaacagt480
cagcgctttc gagaaacctg ttttgcattt gccttgacac cacaacaagt gcagcaaatc540
agtagttcca tggatatttc tgggaccaaa tgtgacttca cagtacaggt ccagttaagg600
ttttgtttat cagaaaccag ttgtccacaa gaagatcact tcccacccaa tctttgtgtg660
aaagtgaata caaaaccttg cagccttcca ggttaccttc cacctacaaa aaatggcgtg720
gaaccaaagc gacccagccg accaattaat atcacctcac ttgtccgact gtccacaaca780
gtaccaaaca cgattgttgt ttcttggact gcagaaattg gaagaaacta ttccatggca840
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aatgtacaga gaaaaaaata aaaaaaaaat aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa2150
<210>10
<211>642
<212>PRT
<213>人類
<400>10
Met Val Met Ser Leu Arg Val Ser Glu Leu Gln Val Leu Leu Gly Tyr
1 5 10 15
Ala Gly Arg Asn Lys His Gly Arg Lys His Glu Leu Leu Thr Lys Ala
20 25 30
Leu His Leu Leu Lys Ala Gly Cys Ser Pro Ala Val Gln Met Lys Ile
35 40 45
Lys Glu Leu Tyr Arg Arg Arg Phe Pro Gln Lys Ile Met Thr Pro Ala
50 55 60
Asp Leu Ser Ile Pro Asn Val His Ser Ser Pro Met Pro Ala Thr Leu
65 70 75 80
Ser Pro Ser Thr Ile Pro Gln Leu Thr Tyr Asp Gly His Pro Ala Ser
85 90 95
Ser Pro Leu Leu Pro Val Ser Leu Leu Gly Pro Lys His Glu Leu Glu
100 105 110
Leu Pro His Leu Thr Ser Ala Leu His Pro Val His Pro Asp Ile Lys
115 120 125
Leu Gln Lys Leu Pro Phe Tyr Asp Leu Leu Asp Glu Leu Ile Lys Pro
130 135 140
Thr Ser Leu Ala Ser Asp Asn Ser Gln Arg Phe Arg Glu Thr Cys Phe
145 150 155 160
Ala Phe Ala Leu Thr Pro Gln Gln Val Gln Gln Ile Ser Ser Ser Met
165 170 175
Asp Ile Ser Gly Thr Lys Cys Asp Phe Thr Val Gln Val Gln Leu Arg
180 185 190
Phe Cys Leu Ser Glu Thr Ser Cys Pro Gln Glu Asp His Phe Pro Pro
195 200 205
Asn Leu Cys Val Lys Val Asn Thr Lys Pro Cys Ser Leu Pro Gly Tyr
210 215 220
Leu Pro Pro Thr Lys Asn Gly Val Glu Pro Lys Arg Pro Ser Arg Pro
225 230 235 240
Ile Asn Ile Thr Ser Leu Val Arg Leu Ser Thr Thr Val Pro Asn Thr
245 250 255
Ile Val Val Ser Trp Thr Ala Glu Ile Gly Arg Asn Tyr Ser Met Ala
260 265 270
Val Tyr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Thr Val Leu Leu Gln Arg Leu
275 280 285
Arg Ala Lys Gly Ile Arg Asn Pro Asp His Ser Arg Ala Leu Ile Lys
290 295 300
Glu Lys Leu Thr Ala Asp Pro Asp Ser Glu Ile Ala Thr Thr Ser Leu
305 310 315 320
Arg Val Ser Leu Leu Cys Pro Leu Gly Lys Met Arg Leu Thr Ile Pro
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Cys Arg Ala Leu Thr Cys Ser His Leu Gln Cys Phe Asp Ala Thr Leu
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Tyr Ile Gln Met Asn Glu Lys Lys Pro Thr Trp Val Cys Pro Val Cys
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Asp Lys Lys Ala Pro Tyr Glu His Leu Ile Ile Asp Gly Leu Phe Met
370 375 380
Glu Ile Leu Lys Tyr Cys Thr Asp Cys Asp Glu Ile Gln Phe Lys Glu
385 390 395 400
Asp Gly Thr Trp Ala Pro Met Arg Ser Lys Lys Glu Val Gln Glu Val
405 410 415
Ser Ala Ser Tyr Asn Gly Val Asp Gly Cys Leu Ser Ser Thr Leu Glu
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Glu Val Ile Asp Leu Thr Ile Asp Ser Ser Ser Asp Glu Glu Glu Glu
450 455 460
Glu Pro Ser Ala Lys Arg Thr Cys Pro Ser Leu Ser Pro Thr Ser Pro
465 470 475 480
Leu Asn Asn Lys Gly Ile Leu Ser Leu Pro His Gln Ala Ser Pro Val
485 490 495
Ser Arg Thr Pro Ser Leu Pro Ala Val Asp Thr Ser Tyr Ile Asn Thr
500 505 510
Ser Leu Ile Gln Asp Tyr Arg His Pro Phe His Met Thr Pro Met Pro
515 520 525
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530 535 540
Gln His Tyr Asn Thr Ser Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Val Ser
545 550 555 560
Asp Asp Gln Asp Leu Leu His Ser Ser Arg Phe Phe Pro Tyr Thr Ser
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Leu Asp
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<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG23的錨定引物
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<210>12
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG23的H-AP33引物
<400>12
aagcttgctg ctc13
<210>13
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<212>DNA
<213>人類
<400>13
tggtcacagt ggaaggatca tgggagaaac agaagggaag aaagatgagg ctgattataa60
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<212>PRT
<213>人類
<400>14
Met Gly Glu Thr Glu Gly Lys Lys Asp Glu Ala Asp Tyr Lys Arg Leu
1 5 10 15
Gln Thr Phe Pro Leu Val Arg His Ser Asp Met Pro Glu Glu Met Arg
20 25 30
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35 40 45
Asn Asn Glu Ser Ala Ala Lys Met Ile Lys Glu Thr Met Asp Lys Lys
50 55 60
Phe Gly Ser Ser Trp His Val Val Ile Gly Glu Gly Phe Gly Phe Glu
65 70 75 80
Ile Thr His Glu Val Lys Asn Leu Leu Tyr Leu Tyr Phe Gly Gly Thr
85 90 95
Leu Ala Val Cys Val Trp Lys Cys Ser
100 105
<210>15
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG27的錨定引物
<400>15
aagctttttt ttttta 16
<210>16
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG27的H-AP12引物
<400>16
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<212>DNA
<213>人類
<400>17
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tccagcgagt gctggtgtct ctgtcagctg gtgggaggga tgaaggaaat tatctggacg540
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tgtttgatga atacaaaagg atatcacaga aggatattga acagagtatt aaatctgaaa720
catctggtag ctttgaagat gctctgctgg ctatagtaaa gtgcatgagg aacaaatctg780
catattttgc tgaaaagctc tataaatcga tgaagggctt gggcaccgat gataacaccc840
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gagg 1024
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<212>PRT
<213>人類
<400>18
Met Ala Met Ala Thr Lys Gly Gly Thr Val Lys Ala Ala Ser Gly Phe
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Asn Ala Met Glu Asp Ala Gln Thr Leu Arg Lys Ala Met Lys Gly Leu
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Ser Ile Lys Ser Glu Thr Ser Gly Ser Phe Glu Asp Ala Leu Leu Ala
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275 280 285
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Thr Ser Gly Asp Tyr Arg Lys Val Leu Leu Val Leu Cys Gly Gly Asp
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Asp
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<212>DNA
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<223>用于PIG28的錨定引物
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<212>PRT
<213>人類
<400>22
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165 170 175
Phe Val His Ser Ala Glu Gly Asn Glu Phe Trp Ser Ala Leu Leu Glu
180 185 190
Lys Ala Tyr Ala Lys Val Asn Gly Ser Tyr Glu Ala Leu Ser Gly Gly
195 200 205
Ser Thr Ser Glu Gly Phe Glu Asp Phe Thr Gly Gly Val Thr Glu Trp
210 215 220
Tyr Glu Leu Arg Lys Ala Pro Ser Asp Leu Tyr Gln Ile Ile Leu Lys
225 230 235 240
Ala Leu Glu Arg Gly Ser Leu Leu Gly Cys Ser Ile Asp Ile Ser Ser
245 250 255
Val Leu Asp Met Glu Ala Ile Thr Phe Lys Lys Leu Val Lys Gly His
260 265 270
Ala Tyr Ser Val Thr Gly Ala Lys Gln Val Asn Tyr Arg Gly Gln Val
275 280 285
Val Ser Leu Ile Arg Met Arg Asn Pro Trp Gly Glu Val Glu Trp Thr
290 295 300
Gly Ala Trp Ser Asp Ser Ser Ser Glu Trp Asn Asn Val Asp Pro Tyr
305 310 315 320
Glu Arg Asp Gln Leu Arg Val Lys Met Glu Asp Gly Glu Phe Trp Met
325 330 335
Ser Phe Arg Asp Phe Met Arg Glu Phe Thr Arg Leu Glu Ile Cys Asn
340 345 350
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Thr Leu Tyr Glu Gly Thr Trp Arg Arg Gly Ser Thr Ala Gly Gly Cys
370 375 380
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Leu Asp Glu Thr Asp Asp Pro Asp Asp Tyr Gly Asp Arg Glu Ser Gly
405 410 415
Cys Ser Phe Val Leu Ala Leu Met Gln Lys His Arg Arg Arg Glu Arg
420 425 430
Arg Phe Gly Arg Asp Met Glu Thr Ile Gly Phe Ala Val Tyr Glu Val
435 440 445
Pro Pro Glu Leu Val Gly Gln Pro Ala Val His Leu Lys Arg Asp Phe
450 455 460
Phe Leu Ala Asn Ala Ser Arg Ala Arg Ser Glu Gln Phe Ile Asn Leu
465 470 475 480
Arg Glu Val Ser Thr Arg Phe Arg Leu Pro Pro Gly Glu Tyr Val Val
485 490 495
Val Pro Ser Thr Phe Glu Pro Asn Lys Glu Gly Asp Phe Val Leu Arg
500 505 510
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515 520 525
Gln Ala Asn Leu Pro Asp Glu Gln Val Leu Ser Glu Glu Glu Ile Asp
530 535 540
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Phe Arg Gln Leu Ala Gly Glu Asp Met Glu
545 550 555 560
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565 570 575
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580 585 590
Met Val Asn Leu Met Asp Arg Asp Gly Asn Gly Lys Leu Gly Leu Val
595 600 605
Glu Phe Asn Ile Leu Trp Asn Arg Ile Arg Asn Tyr Leu Ser Ile Phe
610 615 620
Arg Lys Phe Asp Leu Asp Lys Ser Gly Ser Met Ser Ala Tyr Glu Met
625 630 635 640
Arg Met Ala Ile Glu Ser Ala Gly Phe Lys Leu Asn Lys Lys Leu Tyr
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Glu Leu Ile Ile Thr Arg Tyr Ser Glu Pro Asp Leu Ala Val Asp Phe
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Asp Asn Phe Val Cys Cys Leu Val Arg Leu Glu Thr Met Phe Arg Phe
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Phe Lys Thr Leu Asp Thr Asp Leu Asp Gly Val Val Thr Phe Asp Leu
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Phe Lys Trp Leu Gln Leu Thr Met Phe Ala
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<210>23
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG30的錨定引物
<400>23
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<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG30的H-AP33引物
<400>24
aagcttgctg ctc13
<210>25
<211>2246
<212>DNA
<213>人類
<400>25
cctcaggttt gccaatagga ttatcctgct gccatcatgt cttggtttgt tgatcttgct60
ggaaaggcag aagatctttt aaaccgagtt gatcaagggg ctgcaacagc tctcagtagg120
aaagacaatg ccagcaacat atatagcaaa aatactgact atactgaact tcaccagcaa180
aatacagatt tgatatatca gactggacct aaatctacgt atatttcatc agcagctgat240
aacattcgaa atcaaaaagc caccatctta gctggcactg caaatgtgaa agtaggatct300
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aaaaccattg aagaaaattc ttttgggagc caaacccacg aagctgccag taactcagat600
tctagccatg aaggtcaaga ggaatcttca aaggaaaatg tgtcatcaaa tgctgcctgc660
cctgaccaca ccccaacacc taatgatgat ggcaaatcac atgaactgtc taaccttcga720
ctggagaatc agctgctgag gaatgaagtt cagtctttaa atcaagaaat ggcctcgtta780
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<211>731
<212>PRT
<213>人類
<400>26
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1 5 10 15
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180 185 190
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Ser Asn Leu Arg Leu Glu Asn Gln Leu Leu Arg Asn Glu Val Gln Ser
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Leu Asn Gln Glu Met Ala Ser Leu Leu Gln Arg Ser Lys Glu Thr Gln
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275 280 285
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675 680 685
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<210>27
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>用于PIG31的錨定引物
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aagctttttt tttttg16
<210>28
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG31的H-AP34引物
<400>28
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<210>29
<211>1973
<212>DNA
<213>人類
<400>29
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atttaccttt ctggttatag gatgcgatta gggtctagca ccgacaaaaa ggattcaggc660
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<212>PRT
<213>人類
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His Arg Arg Lys Leu Glu Glu Asp Arg Leu Arg Pro Pro Ser Pro Pro
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Ala Ile Met His Tyr Ser Glu His Glu Ala Ala Leu Leu Ala Glu Lys
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Leu Lys Asp Asp Ser Lys Ser Ser Glu Ala Ile Thr Val Leu Leu Ser
275 280 285
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Ser Met Val Gln Ser Ala Asn Ser His Val Arg Arg Leu Met Asn Glu
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Lys Ala Thr His Glu Gln Glu Met Glu Glu Ala Lys Glu Asn Phe Lys
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Phe Asn Ala Ser Thr Arg Gln Lys Ala Trp Asp His Phe Ser Lys Ala
355 360 365
Gln Arg Lys Asn Ile Asp Ile Trp Arg Lys His Ser Glu Glu Leu Arg
370 375 380
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<213>人工序列
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<223>用于PIG38的錨定引物
<400>31
aagctttttt tttttc16
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<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG38的H-AP10引物
<400>32
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<212>DNA
<213>人類
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agagtcagga gaagccgcgg gagatcatgg acgcggcgga agattatgct aaagagagat120
atggaatatc ttcaatgata caatcacaag aaaaaccaga tcgagttttg gttcgggtta180
gagacttgac aatacaaaaa gctgatgaag ttgtttgggt acgtgcaaga gttcatacaa240
gcagagctaa agggaaacag tgcttcttag tcctacgtca gcagcagttt aatgtccagg300
ctcttgtggc ggtgggagac catgcaagca agcagatggt taaatttgct gccaacatca360
acaaagagag cattgtggat gtagaaggtg ttgtgagaaa agtgaatcag aaaattggaa420
gctgtacaca gcaagacgtt gagttacatg ttcagaagat ttatgtgatc agtttggctg480
aaccccgtct gcccctgcag ctggatgatg ctgttcggcc tgaggcagaa ggagaagagg540
aaggaagagc tactgttaac caggatacaa gattagacaa cagagtcatt gatcttagga600
catcaactag tcaggcagtc ttccgtctcc agtctggcat ctgccatctc ttccgagaaa660
ctttaattaa caaaggtttt gtggaaatcc aaactcctaa aattatttca gctgccagtg720
aaggaggagc caatgttttt actgtgtcat attttaaaaa taatgcatac ctggctcagt780
ccccacagct atataagcaa atgtgcattt gtgctgattt tgagaaggtt ttctctattg840
gaccagtatt cagagcggaa gactctaata cccatagaca tctaactgag tttgttggtt900
tggacattga aatggctttt aattaccatt accacgaagt tatggaagaa attgctgaca960
ccatggtaca catattcaaa ggacttcaag aaaggtttca gactgaaatt caaacagtga1020
ataaacagtt cccatgtgag ccattcaaat ttttggagcc aactctaaga ctagaatatt1080
gtgaagcatt ggctatgctt agggaagctg gagtcgaaat gggagatgaa gacgatctga1140
gcacaccaaa tgaaaagctg ttgggtcatt tggtaaagga aaagtatgat acagattttt1200
atattcttga taaatatcca ttggctgtaa gacctttcta taccatgcct gacccaagaa1260
atcccaaaca gtccaactct tacgatatgt tcatgagagg agaagaaata ttgtcaggag1320
ctcaaagaat acatgatcct caactgctaa cagagagagc tttacatcat ggaattgatt1380
tggagaaaat taaggcttac attgattcct tccgctttgg agcccctcct catgctggtg1440
gaggcattgg attggaacga gttactatgc tgtttctggg attgcataat gttcgtcaga1500
cctccatgtt ccctcgtgat cccaaacgac tcactcctta aattcacact ttgccactta1560
actccagtgt ggatgacaga gcgaga 1586
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<211>501
<212>PRT
<213>人類
<400>34
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Arg Asp Leu Thr Ile Gln Lys Ala Asp Glu Val Val Trp Val Arg Ala
50 55 60
Arg Val His Thr Ser Arg Ala Lys Gly Lys Gln Cys Phe Leu Val Leu
65 70 75 80
Arg Gln Gln Gln Phe Asn Val Gln Ala Leu Val Ala Val Gly Asp His
85 90 95
Ala Ser Lys Gln Met Val Lys Phe Ala Ala Asn Ile Asn Lys Glu Ser
100 105 110
Ile Val Asp Val Glu Gly Val Val Arg Lys Val Asn Gln Lys Ile Gly
120 120 125
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130 135 140
Ile Ser Leu Ala Glu Pro Arg Leu Pro Leu Gln Leu Asp Asp Ala Val
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Gln Ala Val Phe Arg Leu Gln Ser Gly Ile Cys His Leu Phe Arg Glu
195 200 205
Thr Leu Ile Asn Lys Gly Phe Val Glu Ile Gln Thr Pro Lys Ile Ile
210 215 220
Ser Ala Ala Ser Glu Gly Gly Ala Asn Val Phe Thr Val Ser Tyr Phe
225 230 235 240
Lys Asn Asn Ala Tyr Leu Ala Gln Ser Pro Gln Leu Tyr Lys Gln Met
245 250 255
Cys Ile Cys Ala Asp Phe Glu Lys Val Phe Ser Ile Gly Pro Val Phe
260 265 270
Arg Ala Glu Asp Ser Asn Thr His Arg His Leu Thr Glu Phe Val Gly
275 280 285
Leu Asp Ile Glu Met Ala Phe Asn Tyr His Tyr His Glu Val Met Glu
290 295 300
Glu Ile Ala Asp Thr Met Val His Ile Phe Lys Gly Leu Gln Glu Arg
305 310 315 320
Phe Gln Thr Glu Ile Gln Thr Val Asn Lys Gln Phe Pro Cys Glu Pro
325 330 335
Phe Lys Phe Leu Glu Pro Thr Leu Arg Leu Glu Tyr Cys Glu Ala Leu
340 345 350
Ala Met Leu Arg Glu Ala Gly Val Glu Met Gly Asp Glu Asp Asp Leu
355 360 365
Ser Thr Pro Asn Glu Lys Leu Leu Gly His Leu Val Lys Glu Lys Tyr
370 375 380
Asp Thr Asp Phe Tyr Ile Leu Asp Lys Tyr Pro Leu Ala Val Arg Pro
385 390 395 400
Phe Tyr Thr Met Pro Asp Pro Arg Asn Pro Lys Gln Ser Asn Ser Tyr
405 410 415
Asp Met Phe Met Arg Gly Glu Glu Ile Leu Ser Gly Ala Gln Arg Ile
420 425 430
His Asp Pro Gln Leu Leu Thr Glu Arg Ala Leu His His Gly Ile Asp
435 440 445
Leu Glu Lys Ile Lys Ala Tyr Ile Asp Ser Phe Arg Phe Gly Ala Pro
450 455 460
Pro His Ala Gly Gly Gly Ile Gly Leu Glu Arg Val Thr Met Leu Phe
465 470 475 480
Leu Gly Leu His Asn Val Arg Gln Thr Ser Met Phe Pro Arg Asp Pro
485 490 495
Lys Arg Leu Thr Pro
500
<210>35
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG40的錨定引物
<400>35
aagctttttt tttttc 16
<210>36
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG40的H-AP11引物
<400>36
aagcttcggg taa13
<210>37
<211>1245
<212>DNA
<213>人類
<400>37
aagagggcaa ccctaacgat acgcttgact ttctgtggct gggaacacct tccaccatga60
ccacctcagc aagttcccac ttaaataaag gcatcaagca ggtgtacatg tccctgcctc120
agggtgagaa agtccaggcc atgtatatct ggatcgatgg tactggagaa ggactgcgct180
gcaagacccg gaccctggac agtgagccca agtgtgtgga agagttgcct gagtggaatt240
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ctgccatgtt tcgggacccc ttccgtaagg accctaacaa gctggtgtta tgtgaagttt360
tcaagtacaa tcgaaggcct gcagagacca atttgaggca cacctgtaaa cggataatag420
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cagatgggca cccctttggt tggccttcca acggcttcca gggccccagg gtccatatta540
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ctgcttgtat gctggagtca agattgcggg gactaatgcc gaggtcatgc ctgcccagtg660
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tttcatcttg catcgtgtgt gtgaagactt tggagtgata gcaacctttg atcctaagcc780
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attccatgaa acctccaaca tcaacgactt ttctgctggt gtagccaatc gtagcgccag1020
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agcccctcct agttcttcat cccactccaa ctcttccccc tctca1245
<210>38
<211>233
<212>PRT
<213>人類
<400>38
Met Thr Thr Ser Ala Ser Ser His Leu Asn Lys Gly Ile Lys Gln Val
1 5 10 15
Tyr Met Ser Leu Pro Gln Gly Glu Lys Val Gln Ala Met Tyr Ile Trp
20 25 30
Ile Asp Gly Thr Gly Glu Gly Leu Arg Cys Lys Thr Arg Thr Leu Asp
35 40 45
Ser Glu Pro Lys Cys Val Glu Glu Leu Pro Glu Trp Asn Phe Asp Gly
50 55 60
Ser Ser Thr Leu Gln Ser Glu Gly Ser Asn Ser Asp Met Tyr Leu Val
65 70 75 80
Pro Ala Ala Met Phe Arg Asp Pro Phe Arg Lys Asp Pro Asn Lys Leu
85 90 95
Val Leu Cys Glu Val Phe Lys Tyr Asn Arg Arg Pro Ala Glu Thr Asn
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Leu Arg His Thr Cys Lys Arg Ile Ile Asp Met Val Ser Asn Gln His
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Pro Trp Phe Gly Met Glu Gln Glu Tyr Thr Leu Met Gly Thr Asp Gly
130 135 140
His Pro Phe Gly Trp Pro Ser Asn Gly Phe Gln Gly Pro Arg Val His
145 150 155 160
Ile Thr Val Val Trp Glu Gln Thr Glu Pro Met Ala Gly Thr Ser Trp
165 170 175
Arg Pro Ile Thr Gly Pro Ala Cys Met Leu Glu Ser Arg Leu Arg Gly
180 185 190
Leu Met Pro Arg Ser Cys Leu Pro Ser Gly Asn Phe Arg Leu Asp Leu
195 200 205
Val Lys Glu Ser Ala Trp Glu Ile Ile Ser Gly Trp Pro Val Ser Ser
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Cys Ile Val Cys Val Lys Thr Leu Glu
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>用于PIG43的錨定引物
<400>39
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG43的H-AP11引物
<400>40
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<211>1721
<212>DNA
<213>人類
<400>41
ggcaaggatc ttgttccaaa tcatctttca tattaccttt ataatcatgt ggctatgtgg60
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gttttaatac actcctcaca gtatcttatg gaagtaacac atgaccttag actacgactc720
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<210>42
<211>485
<212>PRT
<213>人類
<400>42
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Val Glu Ala Met Ala Asp Ala Gly Ile Leu Arg Leu Tyr Thr Trp Val
65 70 75 80
Glu Trp Val Lys Glu Met Val Ala Asn Trp Asp Ser Leu Arg Ser Gly
85 90 95
Pro Ala Ser Thr Phe Asn Asp Arg Val Phe Ala Ser Glu Leu Asn Ala
100 105 110
Gly Ile Ile Lys Thr Asp Gln Asn Tyr Glu Lys Met Met Phe Lys Glu
115 120 125
Ala Leu Lys Thr Gly Phe Phe Glu Phe Gln Ala Ala Lys Asp Lys Tyr
130 135 140
Arg Glu Leu Ala Val Glu Gly Met His Arg Glu Leu Val Phe Arg Phe
145 150 155 160
Ile Glu Val Gln Thr Leu Leu Leu Ala Pro Phe Cys Pro His Leu Cys
165 170 175
Glu His Ile Trp Thr Leu Leu Gly Lys Pro Asp Ser Ile Met Asn Ala
180 185 190
Ser Trp Pro Val Ala Gly Pro Val Asn Glu Val Leu Ile His Ser Ser
195 200 205
Gln Tyr Leu Met Glu Val Thr His Asp Leu Arg Leu Arg Leu Lys Asn
210 215 220
Tyr Met Met Pro Ala Lys Gly Lys Lys Thr Asp Lys Gln Pro Leu Gln
225 230 235 240
Lys Pro Ser His Cys Thr Ile Tyr Val Ala Lys Asn Tyr Pro Pro Trp
245 250 255
Gln His Thr Thr Leu Ser Val Leu Arg Lys His Phe Glu Ala Asn Asn
260 265 270
Gly Lys Leu Pro Asp Asn Lys Val Ile Ala Ser Glu Leu Gly Ser Met
275 280 285
Pro Glu Leu Lys Lys Tyr Met Lys Lys Val Met Pro Phe Val Ala Met
290 295 300
Ile Lys Glu Asn Leu Glu Lys Met Gly Pro Arg Ile Leu Asp Leu Gln
305 310 315 320
Leu Glu Phe Asp Glu Lys Ala Val Leu Met Glu Asn Ile Val Tyr Leu
325 330 335
Thr Asn Ser Leu Glu Leu Glu His Ile Glu Val Lys Phe Ala Ser Glu
340 345 350
Ala Glu Asp Lys Ile Arg Glu Asp Cys Cys Pro Gly Lys Pro Leu Asn
355 360 365
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370 375 380
Pro Ser Asn Gly His Phe Ser Thr Lys Ile Glu Ile Arg Gln Gly Asp
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Asn Cys Asp Ser Ile Ile Arg Arg Leu Met Lys Met Asn Arg Gly Ile
405 410 415
Lys Asp Leu Ser Lys Val Lys Leu Met Arg Phe Asp Asp Pro Leu Leu
420 425 430
Gly Pro Arg Arg Val Pro Val Leu Gly Lys Glu Tyr Thr Glu Lys Thr
435 440 445
Pro Ile Ser Glu His Ala Val Phe Asn Val Asp Leu Met Ser Lys Lys
450 455 460
Ile His Leu Thr Glu Asn Gly Ile Arg Val Asp Ile Gly Asp Thr Ile
465 470 475 480
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485
<210>43
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<212>DNA
<213>人工序列
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<223>用于PIG44的錨定引物
<400>43
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<210>44
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG44的H-AP23引物
<400>44
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<210>45
<211>1312
<212>DNA
<213>人類
<400>45
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ccccaaatct caggacctcg ccaagatcat ggcagacatc cgggcccaat atgacgagct780
ggctcggaag aaccgagagg agctagacaa gtactggtct cagcagattg aggagagcac840
cacagtggtc accacacagt ctgctgaggt tggagctgct gagacgacgc tcacagagct900
gagacgtaca gtccagtcct tggagatcga cctggactcc atgagaaatc tgaaggccag960
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<210>46
<211>430
<212>PRT
<213>人類
<400>46
Met Ser Phe Thr Thr Arg Ser Thr Phe Ser Thr Asn Tyr Arg Ser Leu
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Gly Ser Val Gln Ala Pro Ser Tyr Gly Ala Arg Pro Val Ser Ser Ala
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Ala Ser Val Tyr Ala Gly Ala Gly Gly Ser Gly Ser Arg Ile Ser Val
35 40 45
Ser Arg Ser Thr Ser Phe Arg Gly Gly Met Gly Ser Gly Gly Leu Ala
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Arg Glu His Leu Glu Lys Lys Gly Pro Gln Val Arg Asp Trp Ser His
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
Glu Leu Leu Phe Met Lys Lys Asn His Glu Glu Glu Val Lys Gly Leu
210 215 220
Gln Ala Gln Ile Ala Ser Ser Gly Leu Thr Val Glu Val Asp Ala Pro
225 230 235 240
Lys Ser Gln Asp Leu Ala Lys Ile Met Ala Asp Ile Arg Ala Gln Tyr
245 250 255
Asp Glu Leu Ala Arg Lys Asn Arg Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Trp Ser
260 265 270
Gln Gln Ile Glu Glu Ser Thr Thr Val Val Thr Thr Gln Ser Ala Glu
275 280 285
Val Gly Ala Ala Glu Thr Thr Leu Thr Glu Leu Arg Arg Thr Val Gln
290 295 300
Ser Leu Glu Ile Asp Leu Asp Ser Met Arg Asn Leu Lys Ala Ser Leu
305 310 315 320
Glu Asn Ser Leu Arg Glu Val Glu Ala Arg Tyr Ala Leu Gln Met Glu
325 330 335
Gln Leu Asn Gly Ile Leu Leu His Leu Glu Ser Glu Leu Ala Gln Thr
340 345 350
Arg Ala Glu Gly Gln Arg Gln Ala Gln Glu Tyr Glu Ala Leu Leu Asn
355 360 365
Ile Lys Val Lys Leu Glu Ala Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Arg Leu Leu
370 375 380
Glu Asp Gly Glu Asp Phe Asn Leu Gly Asp Ala Leu Asp Ser Ser Asn
385 390 395 400
Ser Met Gln Thr Ile Gln Lys Thr Thr Thr Arg Arg Ile Val Asp Gly
405 410 415
Lys Val Val Ser Glu Thr Asn Asp Thr Lys Val Leu Arg His
420 425 430
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<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG46的錨定引物
<400>47
aagctttttt ttttta 16
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<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG46的H-AP24引物
<400>48
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<212>DNA
<213>人類
<400>49
ttctcctatc ggggtcacag ggacgctaag attgctacct ggactttcgt tgaccatgct60
gtcccgggtg gtactttccg ccgccgccac agcggccccc tctctgaaga atgcagcctt120
cctaggtcca ggggtattgc aggcaacaag gacctttcat acagggcagc cacaccttgt180
ccctgtacca cctcttcctg aatacggagg aaaagttcgt tatggactga tccctgagga240
attcttccag tttctttatc ctaaaactgg tgtaacagga ccctatgtac tcggaactgg300
gcttatcttg tacgctttat ccaaagaaat atatgtgatt agcgcagaga ccttcactgc360
cctatcagta ctaggtgtaa tggtctatgg aattaaaaaa tatggtccct ttgttgcaga420
ctttgctgat aaactcaatg agcaaaaact tgcccaacta gaagaggcga agcaggcttc480
catccaacac atccagaatg caattgatac ggagaagtca caacaggcac tggttcagaa540
gcgccattac ctttttgatg tgcaaaggaa taacattgct atggctttgg aagttactta600
ccgggaacga ctgtatagag tatataagga agtaaagaat cgcctggact atcatatatc660
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cgtggtgcaa agcatctcca cacagcagga aaaggagaca attgccaagt gcattgcgga780
cctaaagctg ctggcaaaga aggctcaagc acagccagtt atgtaaa 827
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<211>256
<212>PRT
<213>人類
<400>50
Met Leu Ser Arg Val Val Leu Ser Ala Ala Ala Thr Ala Ala Pro Ser
1 5 10 15
Leu Lys Asn Ala Ala Phe Leu Gly Pro Gly Val Leu Gln Ala Thr Arg
20 25 30
Thr Phe His Thr Gly Gln Pro His Leu Val Pro Val Pro Pro Leu Pro
35 40 45
Glu Tyr Gly Gly Lys Val Arg Tyr Gly Leu Ile Pro Glu Glu Phe Phe
50 55 60
Gln Phe Leu Tyr Pro Lys Thr Gly Val Thr Gly Pro Tyr Val Leu Gly
65 70 75 80
Thr Gly Leu Ile Leu Tyr Ala Leu Ser Lys Glu Ile Tyr Val Ile Ser
85 90 95
Ala Glu Thr Phe Thr Ala Leu Ser Val Leu Gly Val Met Val Tyr Gly
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
His Ile Gln Asn Ala Ile Asp Thr Glu Lys Ser Gln Gln Ala Leu Val
145 150 155 160
Gln Lys Arg His Tyr Leu Phe Asp Val Gln Arg Asn Asn Ile Ala Met
165 170 175
Ala Leu Glu Val Thr Tyr Arg Glu Arg Leu Tyr Arg Val Tyr Lys Glu
180 185 190
Val Lys Asn Arg Leu Asp Tyr His Ile Ser Val Gln Asn Met Met Arg
195 200 205
Arg Lys Glu Gln Glu His Met Ile Asn Trp Val Glu Lys His Val Val
210 215 220
Gln Ser Ile Ser Thr Gln Gln Glu Lys Glu Thr Ile Ala Lys Cys Ile
225 230 235 240
Ala Asp Leu Lys Leu Leu Ala Lys Lys Ala Gln Ala Gln Pro Val Met
245 250 255
<210>51
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG47的錨定引物
<400>51
aagctttttt tttttc 16
<210>52
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG47的H-AP5引物
<400>52
aagcttagta ggc13
<210>53
<211>1707
<212>DNA
<213>人類
<400>53
cagaaggttc tgccggttcc cccagctctg ggtacccggc tctgcatcgc gtcgccatga60
tgggccatcg tccagtgctc gtgctcagcc agaacacaaa gcgtgaatcc ggaagaaaag120
ttcaatctgg aaacatcaat gctgccaaga ctattgcaga tatcatccga acatgtttgg180
gacccaagtc catgatgaag atgcttttgg acccaatggg aggcaatgtg atgaccaatg240
atggcaatgc cattcttcga gagattcaag tccagcatcc agcggccaag tccatgatcg300
aaattagccg gacccaggat gaagaggttg gagatgggac cacatcagta attattcttg360
caggggaaat gctgtctgta gctgagcact tcctggagca gcagatgcac ccaacagtgg420
tgatcagtgc ttaccgcaag gcattggatg atatgatcag caccctaaag aaaataagta480
tcccagtcga catcagtgac agtgatatga tgctgaacat catcaacagc tctattacta540
ccaaagccat cagtcggtgg tcatctttgg cttgcaacat tgccctggat gctgtcaaga600
tggtacagtt tgaggagaat ggtcggaaag agattgacat aaaaaaatat gcaagagtgg660
aaaagatacc tggaggcatc attgaagact cctgtgtctt gcgtggagtc atgattaaca720
aggacgtgac ccatccacgt atgtggcgct atatcaagaa ccctcgcatt gtgctgctgg780
attcttctct ggagtacaag aaaggagaaa gccagactga cattgagatt acacgagagg840
aggacttcac ccgaattctc cagatggagg aagagtacat ccagcagctc tgtgaggaca900
ttatccaact gaagcccgat gtggtcatca ctgaaaaggg catctcagat ttagctcagc960
actaccttat gcgggccaat atcacagcca tccgcagagt ccggaagaca gacaataatc1020
gcattgctag agcctgtggg gcccggatag tcagccgacc agaggaactg agagaagatg1080
atattggaac aggagcaggc ctgttggaaa tcaagaaaat tggagatgaa tactttactt1140
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tcctggaccc tcagctggtg ccagggggtg gggcctccga gatggctgtg gcccatgcct1320
tgacagaaaa atccaaggcc atgactggtg tggaacaatg gccatacagg gctgttgccc1380
aggccctaga ggtcattcct cgtaccctga tccagaactg tggggccagc accatccgtc1440
tacttacctc ccttcgggcc aagcacaccc aggagaactg tgagacctgg ggtgtaaatg1500
gtgagacggg tactttggtg gacatgaagg aactgggcat atgggagcca ttggctgtga1560
agctgcagac ttataagaca gcagtggaga cggcagttct gctactgcga attgatgaca1620
tcgtttcagg ccacaaaaag aaaggcgatg accagagccg gcaaggcggg gctcctgatg1680
ctggccagga gtgagtgcta ggcaagg1707
<210>54
<211>545
<212>PRT
<213>人類
<400>54
Met Met Gly His Arg Pro Val Leu Val Leu Ser Gln Asn Thr Lys Arg
1 5 10 15
Glu Ser Gly Arg Lys Val Gln Ser Gly Asn Ile Asn Ala Ala Lys Thr
20 25 30
Ile Ala Asp Ile Ile Arg Thr Cys Leu Gly Pro Lys Ser Met Met Lys
35 40 45
Met Leu Leu Asp Pro Met Gly Gly Asn Val Met Thr Asn Asp Gly Asn
50 55 60
Ala Ile Leu Arg Glu Ile Gln Val Gln His Pro Ala Ala Lys Ser Met
65 70 75 80
Ile Glu Ile Ser Arg Thr Gln Asp Glu Glu Val Gly Asp Gly Thr Thr
85 90 95
Ser Val Ile Ile Leu Ala Gly Glu Met Leu Ser Val Ala Glu His Phe
100 105 110
Leu Glu Gln Gln Met His Pro Thr Val Val Ile Ser Ala Tyr Arg Lys
115 120 125
Ala Leu Asp Asp Met Ile Ser Thr Leu Lys Lys Ile Ser Ile Pro Val
130 135 140
Asp Ile Ser Asp Ser Asp Met Met Leu Asn Ile Ile Asn Ser Ser Ile
145 150 155 160
Thr Thr Lys Ala Ile Ser Arg Trp Ser Ser Leu Ala Cys Asn Ile Ala
165 170 175
Leu Asp Ala Val Lys Met Val Gln Phe Glu Glu Asn Gly Arg Lys Glu
180 185 190
Ile Asp Ile Lys Lys Tyr Ala Arg Val Glu Lys Ile Pro Gly Gly Ile
195 200 205
Ile Glu Asp Ser Cys Val Leu Arg Gly Val Met Ile Asn Lys Asp Val
210 215 220
Thr His Pro Arg Met Trp Arg Tyr Ile Lys Asn Pro Arg Ile Val Leu
225 230 235 240
Leu Asp Ser Ser Leu Glu Tyr Lys Lys Gly Glu Ser Gln Thr Asp Ile
245 250 255
Glu Ile Thr Arg Glu Glu Asp Phe Thr Arg Ile Leu Gln Met Glu Glu
260 265 270
Glu Tyr Ile Gln Gln Leu Cys Glu Asp Ile Ile Gln Leu Lys Pro Asp
275 280 285
Val Val Ile Thr Glu Lys Gly Ile Ser Asp Leu Ala Gln His Tyr Leu
290 295 300
Met Arg Ala Asn Ile Thr Ala Ile Arg Arg Val Arg Lys Thr Asp Asn
305 310 315 320
Asn Arg Ile Ala Arg Ala Cys Gly Ala Arg Ile Val Ser Arg Pro Glu
325 330 335
Glu Leu Arg Glu Asp Asp Ile Gly Thr Gly Ala Gly Leu Leu Glu Ile
340 345 350
Lys Lys Ile Gly Asp Glu Tyr Phe Thr Phe Ile Thr Asp Cys Lys Asp
355 360 365
Pro Lys Ala Cys Thr Ile Leu Leu Arg Gly Ala Ser Lys Glu Ile Leu
370 375 380
Ser Glu Val Glu Arg Asn Leu Gln Asp Ala Met Gln Val Cys Arg Asn
385 390 395 400
Val Leu Leu Asp Pro Gln Leu Val Pro Gly Gly Gly Ala Ser Glu Met
405 410 415
Ala Val Ala His Ala Leu Thr Glu Lys Ser Lys Ala Met Thr Gly Val
420 425 430
Glu Gln Trp Pro Tyr Arg Ala Val Ala Gln Ala Leu Glu Val Ile Pro
435 440 445
Arg Thr Leu Ile Gln Asn Cys Gly Ala Ser Thr Ile Arg Leu Leu Thr
450 455 460
Ser Leu Arg Ala Lys His Thr Gln Glu Asn Cys Glu Thr Trp Gly Val
465 470 475 480
Asn Gly Glu Thr Gly Thr Leu Val Asp Met Lys Glu Leu Gly Ile Trp
485 490 495
Glu Pro Leu Ala Val Lys Leu Gln Thr Tyr Lys Thr Ala Val Glu Thr
500 505 510
Ala Val Leu Leu Leu Arg Ile Asp Asp Ile Val Ser Gly His Lys Lys
515 520 525
Lys Gly Asp Asp Gln Ser Arg Gln Gly Gly Ala Pro Asp Ala Gly Gln
530 535 540
Glu
545
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG48的錨定引物
<400>55
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG48的H-AP7引物
<400>56
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<211>643
<212>DNA
<213>人類
<400>57
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<212>PRT
<213>人類
<400>58
Met Gln Arg Ala Ser Arg Leu Lys Arg Glu Leu His Met Leu Ala Thr
1 5 10 15
Glu Pro Pro Pro Gly Ile Thr Cys Trp Gln Asp Lys Asp Gln Met Asp
20 25 30
Asp Leu Arg Ala Gln Ile Leu Gly Gly Ala Asn Thr Pro Tyr Glu Lys
35 40 45
Gly Val Phe Lys Leu Glu Val Ile Ile Pro Glu Arg Tyr Pro Phe Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Ala Gly Arg Ile Cys Leu Asp Val Leu Lys Leu Pro Pro Lys Gly
85 90 95
Ala Trp Arg Pro Ser Leu Asn Ile Ala Thr Val Leu Thr Ser Ile Gln
100 105 110
Leu Leu Met Ser Glu Pro Asn Pro Asp Asp Pro Leu Met Ala Asp Ile
115 120 125
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130 135 140
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Glu Met Leu Asp Asn Leu Pro Glu Ala Gly Asp Ser Arg Val His Asn
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<213>人工序列
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<400>60
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<212>DNA
<213>人類
<400>61
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actagccttg catcttgcat ctgaattctt cctcaggaac cccaataaag atgtgcgtct300
ccttgtagca tgttgtttgg ctgatatctt tcgtatctat gccccagaag ctccatatac360
ttcccatgat aaacttaagg acatattttt gtttattacc agacaattaa aaggtttgga420
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gattcaggaa ctttttgcta tagatcctca tttattatta tccgtcatgc cacagcttga900
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ggataaacgg tggcgagtaa gaaaagaagc tatgatgggt ctggctcagc tttataagaa1320
atactgtctt catggtgaag caggaaagga agctgcagag aaagtcagct ggataaagga1380
caaacttctg catatttatt atcagaacag cattgacgac aaactgttgg tagagaaaat1440
ctttgctcgg tatcttgtcc cccacaacct ggaaacagaa gagagaatga aatgcttata1500
ttacttatat gctagtttgg atccaaatgc tgtaaaagct ctcaacgaaa tgtggaagtg1560
tcagaacatg cttcggagcc atgtacgcga actattggat ttgcacaagc agcctacatc1620
agaggctaac tgttctgcca tgtttggaaa actgatgacc atagcaaaga atttgcctga1680
ccccgggaag gcacaagatt ttgtgaagaa atttaaccag gttctcggcg atgatgagaa1740
acttcggtct cagttggagt tattaattag cccaacctgt tcttgcaaac aagcagatat1800
ttgtgtggtt agtaaatcat acttcacact ttttctctag ctttacttac agaaatatgt1860
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<210>62
<211>600
<212>PRT
<213>人類
<400>62
Met Asp Phe Thr Ala Gln Pro Lys Pro Ala Thr Ala Leu Cys Gly Val
1 5 10 15
Val Ser Ala Asp Gly Lys Ile Ala Tyr Pro Pro Gly Val Lys Glu Ile
20 25 30
Thr Asp Lys Ile Thr Thr Asp Glu Met Ile Lys Arg Leu Lys Met Val
35 40 45
Val Lys Thr Phe Met Asp Met Asp Gln Asp Ser Glu Asp Glu Lys Gln
50 55 60
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65 70 75 80
Asn Pro Asn Lys Asp Val Arg Leu Leu Val Ala Cys Cys Leu Ala Asp
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Ile Phe Arg Ile Tyr Ala Pro Glu Ala Pro Tyr Thr Ser His Asp Lys
100 105 110
Leu Lys Asp Ile Phe Leu Phe Ile Thr Arg Gln Leu Lys Gly Leu Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Ser Pro Gln Phe Asn Arg Tyr Phe Tyr Leu Leu Glu Asn
130 135 140
Leu Ala Trp Val Lys Ser Tyr Asn Ile Cys Phe Glu Leu Glu Asp Cys
145 150 155 160
Asn Glu Ile Phe Ile Gln Leu Phe Arg Thr Leu Phe Ser Val Ile Asn
165 170 175
Asn Ser His Asn Lys Lys Val Gln Met His Met Leu Asp Leu Met Ser
180 185 190
Ser Ile Ile Met Glu Gly Asp Gly Val Thr Gln Glu Leu Leu Asp Ser
195 200 205
Ile Leu Ile Asn Leu Ile Pro Ala His Lys Asn Leu Asn Lys Gln Ser
210 215 220
Phe Asp Leu Ala Lys Val Leu Leu Lys Arg Thr Val Gln Thr Ile Glu
225 230 235 240
Ala Cys Ile Ala Asn Phe Phe Asn Gln Val Leu Val Leu Gly Arg Ser
245 250 255
Ser Val Ser Asp Leu Ser Glu His Val Phe Asp Leu Ile Gln Glu Leu
260 265 270
Phe Ala Ile Asp Pro His Leu Leu Leu Ser Val Met Pro Gln Leu Glu
275 280 285
Phe Lys Leu Lys Ser Asn Asp Gly Glu Glu Arg Leu Ala Val Val Arg
290 295 300
Leu Leu Ala Lys Leu Phe Gly Ser Lys Asp Ser Asp Leu Ala Thr Gln
305 310 315 320
Asn Arg Pro Leu Trp Gln Cys Phe Leu Gly Arg Phe Asn Asp Ile His
325 330 335
Val Pro Val Arg Leu Glu Ser Val Lys Phe Ala Ser His Cys Leu Met
340 345 350
Asn His Pro Asp Leu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Tyr Leu Lys Val Arg
355 360 365
Ser His Asp Pro Glu Glu Ala Ile Arg His Asp Val Ile Val Thr Ile
370 375 380
Ile Thr Ala Ala Lys Arg Asp Leu Ala Leu Val Asn Asp Gln Leu Leu
385 390 395 400
Gly Phe Val Arg Glu Arg Thr Leu Asp Lys Arg Trp Arg Val Arg Lys
405 410 415
Glu Ala Met Met Gly Leu Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Tyr Cys Leu His
420 425 430
Gly Glu Ala Gly Lys Glu Ala Ala Glu Lys Val Ser Trp Ile Lys Asp
435 440 445
Lys Leu Leu His Ile Tyr Tyr Gln Asn Ser Ile Asp Asp Lys Leu Leu
450 455 460
Val Glu Lys Ile Phe Ala Arg Tyr Leu Val Pro His Asn Leu Glu Thr
465 470 475 480
Glu Glu Arg Met Lys Cys Leu Tyr Tyr Leu Tyr Ala Ser Leu Asp Pro
485 490 495
Asn Ala Val Lys Ala Leu Asn Glu Met Trp Lys Cys Gln Asn Met Leu
500 505 510
Arg Ser His Val Arg Glu Leu Leu Asp Leu His Lys Gln Pro Thr Ser
515 520 525
Glu Ala Asn Cys Ser Ala Met Phe Gly Lys Leu Met Thr Ile Ala Lys
530 535 540
Asn Leu Pro Asp Pro Gly Lys Ala Gln Asp Phe Val Lys Lys Phe Asn
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<210>63
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG54的錨定引物
<400>63
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<210>64
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG54的H-AP15引物
<400>64
aagcttacgc aac13
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<212>DNA
<213>人類
<400>65
cgcttctctg cactatgtcg ggtggcctcc tgaaggcgct gcgcagcgac tcctacgtgg60
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<212>PRT
<213>人類
<400>66
Met Ser Gly Gly Leu Leu Lys Ala Leu Arg Ser Asp Ser Tyr Val Glu
1 5 10 15
Leu Ser Gln Tyr Arg Asp Gln His Phe Arg Gly Asp Asn Glu Glu Gln
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Glu Lys Leu Leu Lys Lys Ser Cys Thr Leu Tyr Val Gly Asn Leu Ser
35 40 45
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Asp Ile Lys Lys Ile Ile Met Gly Leu Asp Lys Met Lys Lys Thr Ala
65 70 75 80
Cys Gly Phe Cys Phe Val Glu Tyr Tyr Ser Arg Ala Asp Ala Glu Asn
85 90 95
Ala Met Arg Tyr Ile Asn Gly Thr Arg Leu Asp Asp Arg Ile Ile Arg
100 105 110
Thr Asp Trp Asp Ala Gly Phe Lys Glu Gly Arg Gln Tyr Gly Arg Gly
115 120 125
Arg Ser Gly Gly Gln Val Arg Asp Glu Tyr Arg Gln Asp Tyr Asp Ala
130 135 140
Gly Arg Gly Gly Tyr Gly Lys Leu Ala Gln Asn Gln
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<210>67
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG55的錨定引物
<400>67
aagctttttt tttttg 16
<210>68
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于PIG55的H-AP4引物
<400>68
aagcttctca acg13
<210>69
<211>1008
<212>DNA
<213>人類
<400>69
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tacttgaaaa gagtatgtaa actttactca gaacagagag ccatccgagt taaaagagtg480
gtggataaga aaagattatc taagctggaa ccagaaccaa atacaaagac aagagaatcc540
acatcttctg agaaagtttc acagagtcct tcaaaagact ctgaagaaaa ccctgccact600
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<210>70
<211>335
<212>PRT
<213>人類
<400>70
Met Ala Val Asp Ile Thr Leu Leu Phe Arg Ala Ser Val Lys Thr Val
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20 25 30
Gly Ser Arg Asp Glu Leu Phe Arg Arg Ser Pro Arg Pro Lys Gly Asp
35 40 45
Phe Ser Ser Arg Ala Arg Glu Val Ile Ser His Ile Gly Lys Leu Arg
50 55 60
Asp Phe Leu Leu Glu His Arg Lys Asp Tyr Ile Asn Ala Tyr Ser His
65 70 75 80
Thr Met Ser Glu Tyr Gly Arg Met Thr Asp Thr Glu Arg Asp Gln Ile
85 90 95
Asp Gln Asp Ala Gln Ile Phe Met Arg Thr Cys Ser Glu Ala Ile Gln
100 105 110
Gln Leu Arg Thr Glu Ala His Lys Glu Ile His Ser Gln Gln Val Lys
115 120 125
Glu His Arg Thr Ala Val Leu Asp Phe Ile Glu Asp Tyr Leu Lys Arg
130 135 140
Val Cys Lys Leu Tyr Ser Glu Gln Arg Ala Ile Arg Val Lys Arg Val
145 150 155 160
Val Asp Lys Lys Arg Leu Ser Lys Leu Glu Pro Glu Pro Asn Thr Lys
165 170 175
Thr Arg Glu Ser Thr Ser Ser Glu Lys Val Ser Gln Ser Pro Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Glu Glu Asn Pro Ala Thr Glu Glu Arg Pro Glu Lys Ile Leu
195 200 205
Ala Glu Thr Gln Pro Glu Leu Gly Thr Trp Gly Asp Gly Lys Gly Glu
210 215 220
Asp Glu Leu Ser Pro Glu Glu Ile Gln Met Phe Glu Gln Glu Asn Gln
225 230 235 240
Arg Leu Ile Gly Glu Met Asn Ser Leu Phe Asp Glu Val Arg Gln Ile
245 250 255
Glu Gly Arg Val Val Glu Ile Ser Arg Leu Gln Glu Ile Phe Thr Glu
260 265 270
Lys Val Leu Gln Gln Glu Ala Glu Ile Asp Ser Ile His Gln Leu Val
275 280 285
Val Gly Ala Thr Glu Asn Ile Lys Glu Gly Asn Glu Asp Ile Arg Glu
290 295 300
Ala Ile Lys Asp Asn Ala Gly Phe Arg Val Trp Ile Leu Phe Phe Leu
305 310 315 320
Val Met Cys Ser Phe Ser Leu Leu Phe Leu Asp Trp Tyr Asp Ser
325 330 335
<210>71
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于GIG9的錨定引物
<400>71
aagctttttt ttttta 16
<210>72
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于GIG9的H-AP14引物
<400>72
aagcttggag ctt13
<210>73
<211>1382
<212>DNA
<213>人類
<400>73
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ctacagtaga atttaatcat tctggagaat tactagcaac aggagataaa ggtggtagag180
ttgtcatctt tcaacaggag caggagaaca aaatccagtc tcatagcaga ggagaatata240
atgtttacag caccttccag agccatgaac cagagtttga ctacttgaaa agtttagaaa300
tagaagaaaa gatcaacaaa attaggtggt taccccagaa aaatgctgct cagtttttat360
tgtctaccaa tgataaaaca ataaaattat ggaaaatcag tgaaagggac aaaagaccag420
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cc 1382
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<400>74
Met Ala Gly Ala Gly Gly Gly Asn Asp Ile Gln Trp Cys Phe Ser Gln
1 5 10 15
Val Lys Gly Ala Val Asp Asp Asp Val Ala Glu Ala Asp Ile Ile Ser
20 25 30
Thr Val Glu Phe Asn His Ser Gly Glu Leu Leu Ala Thr Gly Asp Lys
35 40 45
Gly Gly Arg Val Val Ile Phe Gln Gln Glu Gln Glu Asn Lys Ile Gln
50 55 60
Ser His Ser Arg Gly Glu Tyr Asn Val Tyr Ser Thr Phe Gln Ser His
65 70 75 80
Glu Pro Glu Phe Asp Tyr Leu Lys Ser Leu Glu Ile Glu Glu Lys Ile
85 90 95
Asn Lys Ile Arg Trp Leu Pro Gln Lys Asn Ala Ala Gln Phe Leu Leu
100 105 110
Ser Thr Asn Asp Lys Thr Ile Lys Leu Trp Lys Ile Ser Glu Arg Asp
115 120 125
Lys Arg Pro Glu Gly Tyr Asn Leu Lys Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Arg
130 135 140
Asp Pro Thr Thr Val Thr Thr Leu Arg Val Pro Val Cys Arg Pro Met
145 150 155 160
Asp Leu Met Val Glu Ala Ser Pro Arg Arg Ile Phe Ala Asn Ala His
165 170 175
Thr Tyr His Ile Asn Ser Ile Ser Ile Asn Ser Asp Tyr Glu Thr Tyr
180 185 190
Leu Ser Ala Asp Asp Leu Arg Ile Asn Leu Trp His Leu Glu Ile Thr
195 200 205
Asp Arg Ser Phe Asn Ile Val Asp Ile Lys Pro Ala Asn Met Glu Glu
210 215 220
Leu Thr Glu Val Ile Thr Ala Ala Glu Phe His Pro Asn Ser Cys Asn
225 230 235 240
Thr Phe Val Tyr Ser Ser Ser Lys Gly Thr Ile Arg Leu Cys Asp Met
245 250 255
Arg Ala Ser Ala Leu Cys Asp Arg His Ser Lys Leu Phe Glu Glu Pro
260 265 270
Glu Asp Pro Ser Asn Arg Ser Phe Phe Ser Glu Ile Ile Ser Ser Ile
275 280 285
Ser Asp Val Lys Phe Ser His Ser Gly Arg Tyr Met Met Thr Arg Asp
290 295 300
Tyr Leu Ser Val Lys Ile Trp Asp Leu Asn Met Glu Asn Arg Pro Val
305 310 315 320
Glu Thr Tyr Gln Val His Glu Tyr Leu Arg Ser Lys Leu Cys Ser Leu
325 330 335
Tyr Glu Asn Asp Cys Ile Phe Asp Lys Phe Glu Cys Cys Trp Asn Gly
340 345 350
Ser Asp Ser Val Val Met Thr Gly Ser Tyr Asn Asn Phe Phe Arg Met
355 360 365
Phe Asp Arg Asn Thr Lys Arg Asp Ile Thr Leu Glu Ala Ser Arg Glu
370 375 380
Asn Asn Lys Pro Arg Thr Val Leu Lys Pro Arg Lys Val Cys Ala Ser
385 390 395 400
Gly Lys Arg Lys Lys Asp Glu Ile Ser Val Asp Ser Leu Asp Phe Asn
405 410 415
Lys Lys Ile Leu His Thr Ala Trp His Pro Lys Glu Asn Ile Ile Ala
420 425 430
Val Ala Thr Thr Asn Asn Leu Tyr Ile Phe Gln Asp Lys Val Asn
435 440 445
<210>75
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于HLC-9的錨定引物
<400>75
aagctttttt tttttg 16
<210>76
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于HLC-9的H-AP7引物
<400>76
aagcttaacg agg13
<210>77
<211>1301
<212>DNA
<213>人類
<400>77
atatggcacc tccgtcagtc tttgccgagg ttccgcaggc ccagcctgtc ctggtcttca60
agctcactgc cgacttcagg gaggatccgg acccccgcaa ggtcaacctg ggagtgggag120
catatcgcac ggatgactgc catccctggg ttttgccagt agtgaagaaa gtggagcaga180
agattgctaa tgacaatagc ctaaatcacg agtatctgcc aatcctgggc ctggctgagt240
tccggagctg tgcttctcgt cttgcccttg aggatgacag cccagcactc aaggagaagc300
gggtaggagg tgtgcaatct ttggggggaa caggtgcact tcgaattgga gctgatttct360
tagcgcgttg gtacaatgga acaaacaaca agaacacacc tgtctatgtg tcctcaccaa420
cctgggagaa tcacaatgct gtgttttccg ctgctggttt taaagacatt cggtcctatc480
gctactggga tgcagagaag agaggattgg acctccaggg cttcctgaat gatctggaga540
atgctcctga gttctccatt gttgtcctcc acgcctgtgc acacaaccca actgggattg600
acccaactcc ggagcagtgg aagcagattg cttctgtcat gaagcaccgg tttctgttcc660
ccttctttga ctcagcctat cagggcttcg catctggaaa cctggagaga gatgcctggg720
ccattcgcta ttttgtgtct gaaggcttcg agttcttctg tgcccagtcc ttctccaaga780
acttcgggct ctacaatgag agagtcggga atctgactgt ggttggaaaa gaacctgaga840
gcatcctgca agtcctttcc cagatggaga agatcgtgcg gattacttgg tccaatcccc900
ccgcccaggg agcacgaatt gtggccagca ccctctctaa ccctgagctc tttgaggaat960
ggacaggtaa tgtgaagaca atggctgacc ggattctgac catgagatct gaactcaggg1020
cacgactaga agccctcaaa acccctggga cctggaacca catcactgat caaattggca1080
tgttcagctt cactgggttg aaccccaagc aggttgagta tctggtcaat gaaaagcaca1140
tctacctgct gccaagtggt cgaatcaacg tgagtggctt aaccaccaaa aatctagatt1200
acgtggccac ctccatccat gaagcagtca ccaaaatcca gtgaagaaac accacccgtc1260
cagtaccacc aaagtagttc tctgtcatgt gtgttccctg c1301
<210>78
<211>413
<212>PRT
<213>人類
<400>78
Met Ala Pro Pro Ser Val Phe Ala Glu Val Pro Gln Ala Gln Pro Val
1 5 10 15
Leu Val Phe Lys Leu Thr Ala Asp Phe Arg Glu Asp Pro Asp Pro Arg
20 25 30
Lys Val Asn Leu Gly Val Gly Ala Tyr Arg Thr Asp Asp Cys His Pro
35 40 45
Trp Val Leu Pro Val Val Lys Lys Val Glu Gln Lys Ile Ala Asn Asp
50 55 60
Asn Ser Leu Asn His Glu Tyr Leu Pro Ile Leu Gly Leu Ala Glu Phe
65 70 75 80
Arg Ser Cys Ala Ser Arg Leu Ala Leu Glu Asp Asp Ser Pro Ala Leu
85 90 95
Lys Glu Lys Arg Val Gly Gly Val Gln Ser Leu Gly Gly Thr Gly Ala
100 105 110
Leu Arg Ile Gly Ala Asp Phe Leu Ala Arg Trp Tyr Asn Gly Thr Asn
115 120 125
Asn Lys Asn Thr Pro Val Tyr Val Ser Ser Pro Thr Trp Glu Asn His
130 135 140
Asn Ala Val Phe Ser Ala Ala Gly Phe Lys Asp Ile Arg Ser Tyr Arg
145 150 155 160
Tyr Trp Asp Ala Glu Lys Arg Gly Leu Asp Leu Gln Gly Phe Leu Asn
165 170 175
Asp Leu Glu Asn Ala Pro Glu Phe Ser Ile Val Val Leu His Ala Cys
180 185 190
Ala His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Pro Glu Gln Trp Lys Gln
195 200 205
Ile Ala Ser Val Met Lys His Arg Phe Leu Phe Pro Phe Phe Asp Ser
210 215 220
Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Ser Gly Asn Leu Glu Arg Asp Ala Trp Ala
225 230 235 240
Ile Arg Tyr Phe Val Ser Glu Gly Phe Glu Phe Phe Cys Ala Gln Ser
245 250 255
Phe Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly Asn Leu Thr
260 265 270
Val Val Gly Lys Glu Pro Glu Ser Ile Leu Gln Val Leu Ser Gln Met
275 280 285
Glu Lys Ile Val Arg Ile Thr Trp Ser Asn Pro Pro Ala Gln Gly Ala
290 295 300
Arg Ile Val Ala Ser Thr Leu Ser Asn Pro Glu Leu Phe Glu Glu Trp
305 310 315 320
Thr Gly Asn Val Lys Thr Met Ala Asp Arg Ile Leu Thr Met Arg Ser
325 330 335
Glu Leu Arg Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Thr Pro Gly Thr Trp Asn
340 345 350
His Ile Thr Asp Gln Ile Gly Met Phe Ser Phe Thr Gly Leu Asn Pro
355 360 365
Lys Gln Val Glu Tyr Leu Val Asn Glu Lys His Ile Tyr Leu Leu Pro
370 375 380
Ser Gly Arg Ile Asn Val Ser Gly Leu Thr Thr Lys Asn Leu Asp Tyr
385 390 395 400
Val Ala Thr Ser Ile His Glu Ala Val Thr Lys Ile Gln
405 410
<210>79
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于GIG18的錨定引物
<400>79
aagctttttt tttttc 16
<210>80
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于GIG18的H-AP4引物
<400>80
aagcttctca acg13
<210>81
<211>749
<212>DNA
<213>人類
<400>81
gcgactgaag cagcatggcc aagccgtgtg gggtgcgcct gagcggggaa gcccgcaaac60
aggtggaggt cttcaggcag aatcttttcc aggaggctga ggaattcctc tacagattct120
tgccacagaa aatcatatac ctgaatcagc tcttgcaaga ggactccctc aatgtggctg180
acttgacttc cctccgggcc ccactggaca tccccatccc agaccctcca cccaaggatg240
atgagatgga aacagataag caggagaaga aagaagtccc taagtgtgga tttctccctg300
ggaatgagaa agtcctgtcc ctgcttgccc tggttaagcc agaagtctgg actctcaaag360
agaaatgcat tctggtgatt acatggatcc aacacctgat ccccaagatt gaagatggaa420
atgattttgg ggtagcaatc caggagaagg tgctggagag ggtgaatgcc gtcaagacca480
aagtggaagc tttccagaca accatttcca agtacttctc agaacgtggg gatgctgtgg540
ccaaggcctc caaggagacc catgtaatgg attaccgggc cttggtgcat gagcgagatg600
aggcagccta tggggagctc agggccatgg tgctggacct gagggccttc tatgctgagc660
tttatcatat catcagcagc aacctggaga aaattgtcac cccaaagggt gaagaaaagc720
catctatgta ctgaacccgg gactagaag 749
<210>82
<211>239
<212>PRT
<213>人類
<400>82
Met Ala Lys Pro Cys Gly Val Arg Leu Ser Gly Glu Ala Arg Lys Gln
1 5 10 15
Val Glu Val Phe Arg Gln Asn Leu Phe Gln Glu Ala Glu Glu Phe Leu
20 25 30
Tyr Arg Phe Leu Pro Gln Lys Ile Ile Tyr Leu Asn Gln Leu Leu Gln
35 40 45
Glu Asp Ser Leu Asn Val Ala Asp Leu Thr Ser Leu Arg Ala Pro Leu
50 55 60
Asp Ile Pro Ile Pro Asp Pro Pro Pro Lys Asp Asp Glu Met Glu Thr
65 70 75 80
Asp Lys Gln Glu Lys Lys Glu Val Pro Lys Cys Gly Phe Leu Pro Gly
85 90 95
Asn Glu Lys Val Leu Ser Leu Leu Ala Leu Val Lys Pro Glu Val Trp
100 105 110
Thr Leu Lys Glu Lys Cys Ile Leu Val Ile Thr Trp Ile Gln His Leu
115 120 125
Ile Pro Lys Ile Glu Asp Gly Asn Asp Phe Gly Val Ala Ile Gln Glu
130 135 140
Lys Val Leu Glu Arg Val Asn Ala Val Lys Thr Lys Val Glu Ala Phe
145 150 155 160
Gln Thr Thr Ile Ser Lys Tyr Phe Ser Glu Arg Gly Asp Ala Val Ala
165 170 175
Lys Ala Ser Lys Glu Thr His Val Met Asp Tyr Arg Ala Leu Val His
180 185 190
Glu Arg Asp Glu Ala Ala Tyr Gly Glu Leu Arg Ala Met Val Leu Asp
195 200 205
Leu Arg Ala Phe Tyr Ala Glu Leu Tyr His Ile Ile Ser Ser Asn Leu
210 215 220
Glu Lys Ile Val Thr Pro Lys Gly Glu Glu Lys Pro Ser Met Tyr
225 230 235
<210>83
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于MIG22的錨定引物
<400>83
aagctttttt ttttta 16
<210>84
<211>13
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于MIG22的H-AP6引物
<400>84
aagcttgcac cat 1權利要求
1.一種人類原癌蛋白，其具有選自由SEQ ID NO2；SEQ ID NO6；SEQID NO10；SEQ ID NO14；SEQ ID NO18；SEQ ID NO22；SEQ ID NO26；SEQ ID NO30；SEQ ID NO34；SEQ ID NO38；SEQ ID NO42；SEQ ID NO46；SEQ ID NO50；SEQ ID NO54；SEQ ID NO58；SEQ ID NO62；SEQID NO66；SEQ ID NO70；SEQ ID NO74；SEQ ID NO78；和SEQ ID NO82組成的組的氨基酸序列。
2.一種人類原癌基因，其具有選自由對應于SEQ ID NO1的68～1,252核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO5的875～1,063核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO9的25～1,953核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO13的20～337核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO17的33～998核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQID NO21的6～2,150核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO25的37～2,232核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO29的25～1,956核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO33的36～1,541核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO37的57～758核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO41的55～1,512核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO45的5～1,297核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO49的56～826核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO53的57～1,694核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO57的2～595核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO61的38～1,840核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO65的15～485核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO69的1～1,008核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO73的27～1,370核苷酸序列位置的DNA序列；對應于SEQ ID NO77的3～1,244核苷酸序列位置的DNA序列；以及對應于SEQID NO81的15～734核苷酸序列位置的DNA序列組成的組的DNA序列，其中該DNA序列分別編碼如權利要求1所述的原癌蛋白。
3.一種用于診斷癌癥的試劑盒，其包括如權利要求1所述的原癌蛋白。
4.一種用于診斷癌癥的試劑盒，其包括如權利要求2所述的原癌基因。
全文摘要
本發(fā)明披露了一種新的原癌基因和該原癌基因編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的原癌基因可有效地用于診斷包括乳腺癌、白血病、子宮癌、惡性淋巴瘤等的多種癌癥。
文檔編號C07K14/435GK101184772SQ200680018552
公開日2008年5月21日 申請日期2006年3月30日 優(yōu)先權日2005年3月30日
發(fā)明者金弦起, 金振宇 申請人:金弦起