專利名稱：人類原癌基因trg及其編碼的蛋白的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種新的表現(xiàn)誘導癌發(fā)生和癌轉移能力的原癌基因，及其編 碼的蛋白質。
背景技術：
通常，已知高級動物，包括人，具有大約30,000個基因，但每個個體只 能表達大約15%的基因。因此，已經發(fā)現(xiàn)根據(jù)何種基因被選擇和表達決定所 有的生命現(xiàn)象，即發(fā)育、分化、穩(wěn)態(tài)、對刺激的反應、細胞周期的控制、老 化和凋亡(一種程序性細胞死亡)等(Liang, P.and A.B.Pardee, >SWe ce 257: 967-971， 1992)。
由遺傳變異引起的如腫瘤發(fā)生病理現(xiàn)象，導致基因表達的改變。因此，
法。例如，由Liang和Pardee ^是出的mRNA差異顯示方法(Liang, P和 A.B.Pardee, Science 257: 967-971， 1992 )現(xiàn)在已經有效用于尋找腫瘤抑制基因、 與細胞周期調節(jié)有關的基因和與凋亡有關的轉錄調節(jié)基因等，并同樣在確定 只在單細胞出現(xiàn)的多種基因之間的關系中得到廣泛應用。
將腫瘤發(fā)生的多種結果綜合起來，有報道稱如特定染色體雜合性的丟失、 原癌基因的活化以及包括p53基因的其他腫瘤抑制基因的失活的多種基因改 變在腫瘤組織內積聚，導致人類腫瘤的形成(Bishop, J.M.， Cell 64: 235-248, 1991; Hunter, T.， Cell 64: 249-270， 1991 )。同樣，有報道稱10-30%的癌癥是由 原癌基因通過原癌基因的擴增而激活從而誘導的，并且因此原癌基因的活化 在多種癌癥的病因學研究中起著重要的作用。因此，人們已經試圖確定這種 作用。
因此，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在原癌基因水平研究產生宮頸癌的機制，并且因此
命名為人類轉化相關基因(TRG)的原癌基因只在癌細胞中表現(xiàn)出特定升高 的表達水平。該原癌基因可以有效用于診斷、預防和治療例如子宮癌、白血 病、淋巴瘤、結腸癌、肺癌、皮膚癌等的多種癌癥。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明試圖解決現(xiàn)有技術的問題，因此本發(fā)明的一個目的是提供 一種新的原癌基因及其片段。
本發(fā)明的另 一 目的是提供一種包含所述原癌基因及其片段的重組載體； 和一種被該重組載體轉化的微生物。
本發(fā)明的又一目的是提供一種由所述原癌基因編碼的蛋白質；及其片段。
本發(fā)明的又一 目的是提供一種用于診斷癌癥的包括所述原癌基因或其片 段的試劑盒。
本發(fā)明的再一目的是提供一種用于診斷癌癥的包括所述蛋白質或其片段 的試劑盒。
為了完成上述目的之一，本發(fā)明提供了具有選自由SEQIDNO: 1、SEQID NO: 5、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 45、 SEQ ID NO: 49、 SEQ ID NO: 53、 SEQ ID NO: 57和SEQ
ID NO: 61組成的組的DNA序列的原癌基因及其片段。
根據(jù)上述的另一目的，本發(fā)明提供一種包含原癌基因或其片段的重組載 體；和一種被該重組載體轉化的微生物。
根據(jù)上述的又一 目的，本發(fā)明提供一種含有選自由SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 18、 SEQIDNO:22、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO:42、 SEQ ID NO: 46、 SEQ ID NO: 50、 SEQ ID NO: 54、 SEQ ID NO: 58和SEQ
ID NO: 62組成的組的氨基^列的蛋白質及其片段，該蛋白質及其片段分別 由所述的原癌基因編碼。
根據(jù)上述的又一目的，本發(fā)明提供一種包括所述原癌基因或其片段的用 于診斷癌癥的試劑盒。
根據(jù)上述的又一目的，本發(fā)明提供一種包括所述原癌蛋白或其片段的用 于診斷癌癥的試劑盒。
根據(jù)上述的又一目的，本發(fā)明提供一種反義基因，該基因具有與全部或 部分由原癌蛋白或其片4殳轉錄而來的mRNA序列互補的DNA序列，并與 mRNA結合而抑制原癌蛋白或其片段的表達。
根據(jù)上述的再一目的，本發(fā)明提供一種包括作為活性成分的反義基因的 抗癌和抗轉移的組合物。
以下，將參照附圖詳細描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案。
1. TRG3
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因3 (以下，稱為TRG3)，具有表 示為SEQ ID NO: 1的1，703畫bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO: 1的DNA序列中，與從113至1522核苷酸序列位置相對 應的開放閱讀框(1520-1522:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋白 質編碼區(qū)產生的氨基S吏序列表示為SEQ ID NO: 2，且包含469個氨基酸(以 下稱為"TRG3蛋白質")。
SEQ ID NO: 1的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫 數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY189688(預定發(fā)布日期2005年4月8日)，該DNA 堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號為BC011681的人 類CGI-51蛋白基因的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG3原癌基因在包括 子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，但在多種正常組織中其表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有469個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 2的氨基S吏序列，并且其分子量約為52kDa。
2. TRG4
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因4 (以下，稱為TRG4)，具有表 示為SEQ ID NO: 5的2，576-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO: 5的DNA序列中，與乂人87至482核苷酸序列位置相對應 的開放閱讀框(480-482:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋白質 編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 6，且包含131個氨基酸(以下 稱為"TRG4蛋白質")。
SEQIDNO: 5的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫 數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY1896卯(預定發(fā)布日期2005年4月8日)，該DNA 石咸基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號為NM—022463的 人類核氧還蛋白(nucleoredoxin) ( NXN )基因的相似，但彼此的蛋白質序列完 全不同。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG4原癌基因在包括子宮癌的多種人類 腫瘤中高表達，但在多種正常組織中表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有131個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，并且其分子量大約為14kDa。
3. TRG5
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因5 (以下，稱為TRG5)，具有表 示為SEQ ID NO: 9的l，334-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO: 9的DNA序列中，與從88至1,092核苷酸序列位置相對 應的開放閱讀框(1,090-1,092:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋 白質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQIDNO: 10,且包含334個氨基酸(以 下稱為"TRG5蛋白質")。 SEQIDNO:9的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因庫 數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY189689(預定發(fā)布日期2005年4月8日)，該DNA 堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號為NM—002300的 人類乳酸脫氫酶B (LDHB )基因的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG5原 癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，但在多種正常組織中表達明 顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有334個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 10的氨基S臾序列，并且其分子量大約為37kDa。
4. TRG6
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因6 (以下，稱為TRG6)，具有表 示為SEQ ID NO: 13的3,309-bp的全長DNA序列。在SEQ ID NO: 13的DNA 序列中，與從233至481核苷酸序列位置相對應的開放閱讀框(479-481:終 止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋白質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表 示為SEQ ID NO: 14,且包含82個氨基酸(以下稱為"TRG6蛋白質")。
SEQ ID NO: 13的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因 庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY191222 (預定發(fā)布日期2005年4月8日)，該 DNA堿基序列結果顯示其DNA序列中某些序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號 為AL354928的9號染色體上的RP11-175D17克隆的相似。但是，由此研究 結果發(fā)現(xiàn)TRG6原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，但在多種 正常組織中表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有82個氨基酸,具有表示為SEQ ID NO: 14的氨基酸序列，并且其分子量大約為9kDa。
5. TRG7
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因7 (以下，稱為TRG7)，具有表 示為SEQ ID NO: 17的1,334-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO: 17的DNA序列中，與從42至1,422核苷酸序列位置相對 應的開放閱讀框(1,420-1,422:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋 白質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 18，且包含175個氨基Si(以 下稱為"TRG7蛋白質")。
SEQ ID NO: 17的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因 庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY191223 (預定發(fā)布日期2005年4月8日)，該 DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號為AK074557 的人類cDNAFLJ90076fis ，克隆HEMBA1004444的相似。但是，由此研究 結果發(fā)現(xiàn)TRG7原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，但在多種 正常組織中表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有175個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 18的氨基酸序列，并且其分子量大約為20kDa。
6. TRG9
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因9 (以下，稱為TRG9)，具有表 示為SEQ ID NO: 21的l，582-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO: 21的DNA序列中，與從17至1，576核苷酸序列位置相對 應的開放閱讀框(1,574-1,576:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋 白質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 22,且包含519個氨基酸(以 下稱為"TRG9蛋白質")。
SEQ ID NO: 21的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因 庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY272044 (預定發(fā)布日期2005年3月31日)，該 DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號為 NM—003100的人類分類樣i管連接蛋白2 (sorting nexin 2) ( SNX2 )的相似。 但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG9原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高 表達，但在多種正常組織中表達明顯降低。 由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有519個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，并且其分子量大約為58kDa。
7. TRG10
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因IO(以下，稱為TRGIO)，具有 3，979-bp的全長DNA序列表示為SEQ ID NO: 25。
在SEQ ID NO: 25的DNA序列中，與從1,100至1,270核苷酸序列位置 相對應的開放閱讀框(1,268-1,270:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由 此蛋白質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 26，且包含56個氨基 酸(以下稱為"TRGIO蛋白質，，)。
SEQ ID NO: 25的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因 庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY277593 (預定發(fā)布日期2005年3月31日)，該 DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號為 NM一033346的人類骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體II型(絲氨酸/蘇氨酸激酶X BMPR2 )、 轉錄變異2基因的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG10原癌基因在包括子 宮癌的多種人類腫瘤中高表達，但在多種正常組織中表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有56個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 26的氨基酸序列，其分子量大約為6kDa。
8. TRG11
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因11 (以下，稱為TRGll)，具有 表示為SEQ ID NO: 29的235-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO: 29的DNA序列中，與從26至214核脊酸序列位置相對 應的開放閱讀框(227-229:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋白 質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 30，且包含62個氨基酸(以 下稱為"TRGll蛋白質")。
SEQIDNO: 29的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因 庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY277594 (預定發(fā)布日期2005年3月31日)，該 DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號為BC022205 的人類IMAGE:5258564基因克隆的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG11 原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，但在多種正常組織中表達 明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有62個氨基酸，具有表示為SEQID NO:30的氨基酸序列，其分子量大約為7kDa。
9. TRG12
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因12(以下，稱為TRGll)，具有 510-bp的全長DNA序列表示為SEQIDNO:33。
在SEQ ID NO: 33的DNA序列中，與從80至475核苷酸序列位置相對 應的開放閱讀框(473-475:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋白 質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 34,且包含131個氨基酸(以 下稱為"TRG12蛋白質")。
SEQ ID NO: 33的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因 庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY277595 (預定發(fā)布日期2005年3月31日)，該 DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號為AY358674 的人類DNA59497MY047(UNQ577)的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG12 原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，但在多種正常組織中表達 明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有131個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 34的氨基酸序列，其分子量大約為14kDa。
10. TRG13
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因13 (以下，稱為TRG13),具有 l，301-bp的全長DNA序列表示為SEQIDNO: 37。
在SEQ ID NO: 37的DNA序列中，與從18至1,193核苷S交序列位置相對 應的開放閱讀框(1,191-1,193:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋 白質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 38，且包含391個氨基酸(以 下稱為"TRG13蛋白質")。
SEQ ID NO: 37的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因 庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY277596 (預定發(fā)布日期2005年3月31日)，該 DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號分別為 BC002940和BCO12729的人類MGC11349基因和人類MGC11349基因的相 似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG13原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤 中高表達，但在多種正常組織中表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有391個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 38的氨基酸序列，其分子量大約為40kDa。
11. TRG14
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因14(以下，稱為TRG13)，具有 表示為SEQ ID NO: 41的1,206-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO: 41的DNA序列中，與從18至1,202核普酸序列位置相對 應的開放閱讀框(1,200-1，202:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋 白質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 42，且包含394個氨基酸(以 下稱為"TRG14蛋白質")。
SEQ ID NO: 41的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因 庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY277597 (預定發(fā)布日期2005年3月31日)，該 DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號為 NM—006096的人類N-myc下游調控基因1 (NDRG1 )基因的相似。但是，由
此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG 14原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，但 在多種正常組織中表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有394個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 42的氨基酸序列，其分子量大約為43kDa。
12. TRG15
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因15 (以下，稱為TRG15)，具有 表示為SEQ ID NO: 45的1,104-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO: 45的DNA序列中，與從1至1,104核苷酸序列位置相對 應的開放閱讀框(1,102-1,104:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋 白質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 46，且包含367個氨基酸(以 下稱為"TRG15蛋白質")。
SEQ ID NO: 45的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因 庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY277598 (預定發(fā)布日期2005年3月31日)，該 DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號為 NM—017952的人類FLJ20758蛋白基因的相似。FLJ20758蛋白基因的功能仍 待被認定。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG15原癌基因在包括子宮癌的多種人 類腫瘤中高表達，但在多種正常組織中表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有367個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 46的氨基酸序列，其分子量大約為42kDa。
13. TRG16
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因16(以下，稱為TRG16),具有 表示為SEQ ID NO: 49的l，064-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO: 49的DNA序列中，與從92至1,064核苷酸序列位置相對 應的開放閱讀框(1,062-1,064:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋
白質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 50，且包含324個氨基酸(以 下稱為"TRG16蛋白質")。
SEQ ID NO: 49的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的基因 庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY277601 (預定發(fā)布日期2005年3月31日)，該 DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的收錄號為AF318376 的人類pp9320 mRNA基因的相似。pp9320基因的功能仍待被認定。但是，由 此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG 16原癌基因在包括子宮癌的多種人類肺瘤中高表達，但 在多種正常組織中表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有324個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 50的氨基S臾序列，其分子量大約為36kDa。
14. TRG17
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因17(以下，稱為TRG17)，具有 表示為SEQ ID NO: 53的432-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO: 53的DNA序列中，與^v 1至408核苷酸序列位置相對應 的開放閱讀框(406-408:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋白質 編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 54,且包含135個氨基酸(以下 稱為"TRG17蛋白質")。SEQ ID NO: 53的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生研 究院(NIH)的基因庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY277599 (預定發(fā)布日期2005 年3月31日)，該DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫內的 收錄號分別為NM—032286和BC003353的人類MGC5309 (MGC5309)基因 和人類MGC5309基因的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG17原癌基因在 包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，但在多種正常組織中表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有135個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 54的氨基酸序列，其分子量大約為16kDa。
15. TRG18
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因18(以下，稱為TRG18),具有 表示為SEQIDNO: 57的1,141-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO: 57的DNA序列中，與從20至1,141核香酸序列位置相對 應的開放閱讀框是全長的蛋白質編碼區(qū)(1,139-1,141:終止密碼子)，由此蛋 白質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 58，且包含373個氨基酸(以 下稱為"TRG18蛋白質，，)。SEQ ID NO: 57的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生 研究院(NIH)的基因庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY277600 (預定發(fā)布日期 2005年3月31日)，該DNA堿基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫 內的收錄號為AJ131389的人類PEX3蛋白的mRNA的相似。但是，由此研究 結果發(fā)現(xiàn)TRG18原癌基因在包括子宮癌的多種人類腫瘤中高表達，但在多種 正常組織中表達明顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有373個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 58的氨基酸序列，其分子量大約為42kDa。
16. TRG20
本發(fā)明的原癌基因，人類轉化相關基因20 (以下，稱為TRG20)，具有 表示為SEQ ID NO: 61的449-bp的全長DNA序列。
在SEQ ID NO: 61的DNA序列中，與從42至449核苷酸序列位置相對 應的開放閱讀框(447-449:終止密碼子)是全長的蛋白質編碼區(qū)，由此蛋白 質編碼區(qū)產生的氨基酸序列表示為SEQ ID NO: 62，且包含135個氨基酸(以 下稱為"TRG20蛋白質")。SEQ ID NO: 61的DNA序列已經由美國國立衛(wèi)生 研究院(NIH)的基因庫數(shù)據(jù)庫保存，收錄號為AY453397 (預定發(fā)布日期 2005年3月31日)，該DNA44基序列結果顯示其DNA序列和保存在數(shù)據(jù)庫 內的收錄號分別為NM—032286和BC003353的人類假定蛋白MGC5309基因 和人類假定蛋白MGC5309基因的相似。但是，由此研究結果發(fā)現(xiàn)TRG20原
癌基因在包括子宮癌的多種人類肺瘤中高表達，但在多種正常組織中表達明 顯降低。
由本發(fā)明的原癌基因表達的蛋白質含有135個氨基酸，具有表示為SEQ ID NO: 62的氨基酸序列，其分子量大約為16kDa。
同時，由于密碼子的簡并性，或考慮到生物表達原癌基因的密碼子偏愛 性，可以對本發(fā)明的原癌基因在編碼區(qū)進行多種修飾而不改變編碼區(qū)表達的 致癌蛋白的氨基酸序列，并且也可以對除編碼區(qū)外的區(qū)域在不影響基因表達 的范圍內進行多種修飾或變化。這樣修飾的基因同樣包括在本發(fā)明的范圍內。 因此，本發(fā)明也包括具有與上述原癌基因基本相同的DNA序列的多核苷酸； 及其片段。詞語"基本相同的多核苷酸"是指具有同編碼與SEQIDNO:2相同 的翻"i奪蛋白產物的SEQIDNO: 1的DNA至少80%、優(yōu)選至少90%，及最優(yōu) 選至少95%的序列同源性。
同樣，在不影響蛋白質功能的區(qū)域內，甚至在本發(fā)明的蛋白質氨基酸序 列中可以有一個或多個氨基酸被取代、添加或去除，并且根據(jù)其用途只有一 些蛋白可以被利用。這樣被修飾的氨基酸序列同樣包括在本發(fā)明的范圍內。 因此，本發(fā)明也包括具有與致癌蛋白質大致相同的氨基酸序列的多肽；及其 片段。詞語"大致相同的多肽"是指具有至少80%、優(yōu)選至少90%、最優(yōu)選至 少95%的同源序列的多肽。
本發(fā)明的原癌基因和蛋白質可以從人類癌癥組織中被分離出來，或者根 據(jù)已知的合成DNA或肽的方法被同樣合成。同樣，在本領域中已知，制備的 基因因此可以被插入載體以便在微生物內表達，以獲得表達載體，然后表達 載體被導入如大腸桿菌、酵母細胞等適合的宿主細胞。本發(fā)明基因的DNA可 以大量復制或者在這樣的轉化宿主內其蛋白可以以商品化數(shù)量產生。
就構建表達載體而言，根據(jù)產生原癌基因或蛋白質的宿主細胞的種類可 以適當選擇和結合如啟動子和終止子的表達調控序列、自主復制序列、分泌 信號等。
由于發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的基因很少在正常外宮頸組織表達，但在如RNA印跡法 等這樣的分析方法中其在宮頸癌組織和子宮癌細胞系中過表達，因此本發(fā)明 的基因被證明在子宮癌形成中具有強大的誘發(fā)腫瘤能力。除了如宮頸癌的上 皮組織，本發(fā)明的原癌基因在其他如白血病、結腸癌等的癌性肺瘤中高表達。 因此，本發(fā)明的原癌基因被認為是在多種肺瘤發(fā)生中的共同的致癌基因，并 且可以有效的用于診斷多種癌癥、產生轉化動物以及用于反義基因治療等。
例如，使用原癌基因診斷癌癥的方法包括的步驟是使用多種本領域中 已知的技術，在將用作探針的全部或部分原癌基因與自受試者提取的體液中 的核酸雜交后，確定受試者是否具有本發(fā)明的原癌基因。使用放射性同位素、 酶等標記的探針可以容易的確定組織樣本中該基因的存在。因此，本發(fā)明也 提供用于診斷癌癥的包括全部或某些該原癌基因的試劑盒。
可以通過將本發(fā)明的原癌基因導入例如如大鼠的嚙齒類動物的哺乳動物 來獲得轉化動物，并且該原癌基因優(yōu)選在受精卯階段至少是在8-細胞階段之 前被導入。這樣制備的轉化動物因此可以有效地用于尋找如抗氧化劑的致癌 物質或抗癌物質。
本發(fā)明也提供有效用于基因治療的反義基因。在本申請中，詞語"反義基 因，，是指具有與部分或全部由原癌基因或其片段轉錄來的mRNA序列互補的 DNA序列的多核苷酸，并且通過向患者導入具有可以和mRNA蛋白質結合區(qū) 結合的DNA序列來破壞原癌基因的開放閱讀框(ORF)，可以用于預防和治 療由原癌基因表達引起的癌癥。本發(fā)明也提供通過給患者施用有效治療劑量 的本發(fā)明的反義基因來治療或預防癌癥或癌癥轉移的方法。
在本發(fā)明的反義基因治療中，使用常規(guī)方法給患者施用本發(fā)明的反義基 因來阻止原癌基因的表達。例如，通過靜電吸引的方法將反義寡聚脫氧核苷
酸(ODN)和聚-左旋-賴氨酸衍生物混合，根據(jù)公開的方法(J. s. Kim等人，J. Controlled Release 53: 175-182， 1998)對患者靜脈施用得到的混合物。
同樣，在本發(fā)明的實質和范圍內，本發(fā)明的藥物組合物包括含有與藥學 上可接受的載體、賦形劑或非必需的其他添加劑連接的本發(fā)明反義基因的抗 癌組合物。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選制備成注射劑型。
根據(jù)多種相關因素如治療的狀況、施用途徑、患者的年齡和體重、狀況 的嚴重程度等，實際施用的反義基因的量是不同的。
由本發(fā)明的原癌基因派生出的蛋白質可以作為產生抗體的診斷工具被有 效使用。使用含有本發(fā)明原癌基因或其片段表達的氨基酸序列的蛋白質，才艮 據(jù)本領域已知的常規(guī)方法，可以以單克隆或多克隆抗體制備本發(fā)明的抗體， 并且通過使用本領域已知的如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定 (RIA)、夾心法測定、蛋白質印跡法或聚丙烯酰胺凝膠免疫印跡法等的方法， 來確定受試者體液樣本中是否有該蛋白質的表達，因此那些抗體可以用于診 斷癌癥。
同樣，本發(fā)明的原癌基因可以用于建立可無控制生長的癌細胞系，例如， 使用經原癌基因轉染的成纖維細胞在棵鼠背部形成腫瘤組織，并可以由此腫 瘤組織制備該細胞系。該癌細胞系可以有效用于尋找抗癌劑等。
以下，將參考優(yōu)選實施例對本發(fā)明進行詳細描述，但這里提出的描述僅 是為了對優(yōu)選實施例進行舉例說明，無意對發(fā)明的范圍進行限制。
附圖簡述
在以下的詳細描述中將參考附圖對本發(fā)明的優(yōu)選實施例的這些和其他特 征、技術方案和優(yōu)點進行更全面的描述。在附圖中


圖1至16為顯示確定H20-121 DNA片l殳(圖1 )、 H93-811 DNA片l殳(圖 2 )、 HI 17-321 DNA片段(圖3 )、 H38-211 DNA片段(圖4 )、 H38-621 DNA 片段(圖5)、 H96 DNA片段(圖6 )、 H94 DNA片段(圖7)、 H42 DNA片 段(圖8 )、 H109 DNA片段(圖9 )、 H119 DNA片段(圖10 )、 H201 DNA片 段(圖11 )、 H151 DNA片4殳(圖12)、 H132DNA片#殳(圖13 )、 H141 DNA 片段(圖14)、 H181 DNA片段(圖15)和H134DNA片段(圖16)分別是 否在正常外宮頸組織、宮頸腫瘤組織、轉移'淋巴結腫瘤組織和CUMC-6癌細 胞中表達的差異顯示反轉錄-多聚酶鏈反應(DDRT-PCR)結果的圖。
圖17至32為顯示確定本發(fā)明的原癌基因TRG3 (圖17的上部)、TRG4
(圖18的上部)、TRG5 (圖19的上部)、TRG6 (圖20的上部)、TRG7 (圖 21的上部)、TRG9 (圖22的上部)、TRGIO (圖23的上部)、TRGll (圖24 的上部)、TRG12 (圖25的上部)、TRG13 (圖26的上部)、TRG14 (圖27 的上部)、TRG15 (圖28的上部)、TRG16 (圖29的上部)、TRG17 (圖30 的上部)、TRG18 (圖31的上部)和TRG20 (圖32的上部)分別是否在正常 外宮頸組織、子宮癌組織、轉移宮頸淋巴結組織和宮頸癌細胞系中表達的RNA 印跡法結果的圖；圖17至32的下部是表示通過將與圖17至32的上部圖中 相同的樣本分別與(3-肌動蛋白探針雜交獲得的RNA印跡法結果的圖。
圖33至48是顯示確定本發(fā)明的原癌基因TRG3(圖33)、 TRG4(圖34)、 TRG5 (圖35 )、 TRG6 (圖36 )、 TRG7 (圖37 )、 TRG9 (圖38 )、 TRGIO (圖 39)、 TRGll (圖40)、 TRG12 (圖41 )、 TRG13 (圖42 )、 TRG14 (圖43 )、 TRG15 (圖44 )、 TRG16 (圖45 )、 TRG17 (圖46 )、 TRG18 (圖47 )、 TRG20
(圖48)分別是否在正常人12泳道多組織中表達的RNA印跡法結果的圖； 圖33至48的下部是表示通過將圖33至48上部的圖中的相同樣本分別與卩-肌動蛋白探針雜交獲得的RNA印跡法結果的圖。
圖49至64是顯示確定本發(fā)明的原癌基因TRG3 (圖49 )、 TRG4 (圖50 )、 TRG5 (圖51 )、 TRG6 (圖52 )、 TRG7 (圖53 )、 TRG9 (圖54 )、 TRG10 (圖 55 )、 TRG11 (圖56 )、 TRG12 (圖57 )、 TRG13 (圖58 )、 TRG14 (圖59 )、 TRG15 (圖60 )、 TRG16 (圖61 )、 TRG17 (圖62 )、 TRG18 (圖63 )和TRG20
(圖64)分別是否在人癌細胞系中表達的RNA印跡法結果的圖表；圖49至 64的下部是表示通過將與圖49-64的上部圖表中的相同樣本分別與(3-肌動蛋 白探針雜交獲得的RNA印跡法的結果的圖表。
圖65至80是顯示確定本發(fā)明的原癌基因TRG3(圖65 )、 TRG4(圖66)、 TRG5 (圖67 )、 TRG6 (圖68 )、 TRG7 (圖69 )、 TRG9 (圖70 )、 TRG10 (圖 71 )、 TRG11 (圖72 )、 TRG12 (圖73 )、 TRG13 (圖74 )、 TRG14 (圖75 )、 TRG15 (圖76 )、 TRG16 (圖77 )、 TRG17 (圖78 )、 TRG18 (圖79 )和TRG20
(圖80)被分別轉化入大腸桿菌(&c/^Wc/z/a co//)后，于左旋-阿拉伯糖誘 導前和誘導后表達的蛋白質大小的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳
(SDS-PAGE)結果的圖。
具體實施例方式
以下，將參考附圖詳細描述本發(fā)明的優(yōu)選實施例。
但是，這里提出的描述僅是為了對優(yōu)選實施例進行舉例說明，無意對發(fā) 明的范圍進行限制。
實施例1:腫瘤細胞的培養(yǎng)和總RNA的分離 (步驟1)肺瘤細胞的培養(yǎng)
為了進行mRNA差異顯示方法，由接受子宮切除手術的子宮肌瘤患者獲 得正常外宮頸組織，并且由外科手術期間未接受前期抗癌化學治療和/或放射 治療的子宮癌患者獲得原發(fā)宮頸腫瘤組織和轉移淋巴結腫瘤組織。在差異顯 示方法中使用CUMC-6 ( Kim, J. w.等人，G戸co/. 62: 230-240, 1996 )
作為人宮頸癌細胞系。
由獲得組織得到的細胞和CUMC-6細胞系，在含有2mM谷氨酰胺、 100IU/mL青霉素、100|ug/mL鏈霉素和10%胎牛血清(Gibco，美國)的 Waymouth's MB 752/1培養(yǎng)基(Gibco)中生長。本實驗中使用的培養(yǎng)細胞處 在指數(shù)生長階段，并且這里使用的是在臺盼藍染中表現(xiàn)出至少95%生活力的 纟田月包(Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique"第2 W反, A.R. Liss，紐約，1987)。
(步驟2 ) RNA的分離和mRNA差異顯示方法
使用市售可得的系統(tǒng)RNeasy總RNA試劑盒(Qiagen公司，德國)將總 RNA樣本從步驟1獲得的各正常外宮頸組織、原發(fā)宮頸癌組織、轉移淋巴結 腫瘤組織和CUMC-6細胞中分離出來。使用信息清潔(message clean)試劑 盒(GenHunter公司，Brookline, MA，美國)自RNA樣本中去除DNA污染物。
實施例2:差異顯示反轉錄-多聚酶鏈反應(DDRT-PCR)
使用由Liang, P.和A. B. Pardee提出的經過些微改變的反轉錄-多聚酶鏈 反應(RT-PCR)來進行差異顯示反轉錄。
2-1.TRG3
首先，使用含有表示為SEQ ID NO: 3的DNA序列的錨定引物H-T11A (5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'， RNAimage試劑盒，Genhunter,公司，MA，美 國)作為錨定oligo-dT引物，對在實施例1的步驟1中獲得的0.2嗎總RNA 進行反轉錄。
其次，使用相同的錨定引物和隨機5'-13-mer引物(RNAimage引物1-5 ) H-AP 1至40中含有表示為SEQ ID NO: 4的DNA序列的H-AP20 (5'-AAGCTTGTTGTGC-3')的引物，在0.5mM [ a -35S] dATP (1200 Ci/mmole) 存在下進行PCR反應。該PCR反應在以下條件下進行全部40個擴增循環(huán) 由在95°C進行40秒的變性步驟、在40°C進行2分鐘的退火步驟和在72°C進
行40秒的延長步驟組成，并且其后是一個在72 C進行5分鐘的最終延長步 驟。
PCR-擴增片段溶解在6%的聚丙烯酰胺測序凝膠中，然后使用放射自顯影 確定差異表達條帶的位置。
自干燥的凝膠中切除含有H20-121 cDNA ( SEQ ID NO: 1的從1,342至 1,599的石威基位)的258-i咸基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H20-121 cDNA，然后除了這里不4吏用[a -35S]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20jiM dNTP夕卜，該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復，以再擴增 H20-121 cDNA。
2-2.TRG4
除了這里使用表示為 SEQ ID NO: 7的錨定引物H-T11G (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage試劑盒，Genhunter，公司，MA,美 國)和表示為SEQ ID NO: 8的引物H-AP9 (5'-AAGCTTCATTCCG-3')夕卜，采用 同實施例2-l中相同的方法重復PCR反應。
自干燥的凝月交中切除含有H93-811 cDNA ( SEQ ID NO: 5的從2,086至 2，478的堿基位)的393-堿基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H93-811 cDNA,然后除了這里不使用[a -358]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20|iM dNTP外，該PCR反應使用相同的引物在上述的相同條件下重復，以再擴增 H93-811 cDNA。
2-3.TRG5
除了這里4吏用含有表示為SEQIDNO: 11 DNA序列的錨定引物H-T11C (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage試劑盒，Genhunter,公司，MA，美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 12 DNA序歹l)的引物H-AP11 (5'-AAGCTTCGGGTAA-3')外，采用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反應。自干燥的凝膠中切除含有HI 17-321 cDNA ( SEQ ID NO: 9的從933至 1,224的堿基位)的292-堿基對(bp)條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫 HI 17-321 cDNA,然后除了這里不使用[a -358]-標記的dATP (1200 Ci/mmole) 和20(iM dNTP夕卜，該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復， 以再擴增HI 17-321 cDNA。
2-4.TRG6
除了這里使用含有表示為SEQ ID NO: 15 DNA序列的錨定引物H-Tl 1A (5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'， RNAimage試劑盒，Genhunter,公司，MA,美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 16 DNA序歹'J的引物 H-AP38 (5'-AAGCTTCCAGTGC-3')外，采用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反應。
自干燥的凝膠中切除含有H38-211 cDNA ( SEQ ID NO: 13的從2,823至 3,133的堿基位)的311-堿基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H38-211 cDNA,然后除了這里不4吏用[a -358]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20pM dNTP外，該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復，以再擴增 H38-211 cDNA。
2-5.TRG7
除了這里4吏用含有表示為SEQ ID NO: 19 DNA序列的錨定引物H-T11G (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG畫3', RNAimage試劑盒，Genhunter,公司，MA,美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 20 DNA序歹'J的引物 H-AP38 (5'-AAGCTTCCAGTGC-3')外，采用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反應。
自干燥的凝膠中切除含有H38-621 cDNA ( SEQ ID NO: 17的從1,404至 1，695的石咸基位)的292-石咸基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H38-621 cDNA,然后除了這里不使用[a-35S]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20(iM dNTP夕卜，該PCR反應使用相同的引物在上述的相同條件下重復，以再擴增 H3 8-621 cDNA。2-6.TRG9
除了這里使用含有表示為SEQ ID NO: 23 DNA序列的錨定引物H-T11A (5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'， RNAimage試劑盒，Genhunter，公司，MA,美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 24 DNA序歹'J的引物H-AP9 (5'-AAGCTTCATTCCG-3')外，采用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反 應。
自干燥的凝膠中切除含有H96 cDNA ( SEQ ID NO: 21從1,225至1,499 的堿基位)的275-堿基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H96 cDNA， 然后除了這里不使用[a-35S]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20|iM dNTP外， 該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復，以再擴增H96 cDNA。
2-7.TRG10
除了這里使用含有表示為SEQ ID NO: 27 DNA序列的錨定S1物H-Tl 1A (5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage試劑盒，Genhunter,公司，MA,美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 28 DNA序歹'J的引物 H-AP9 (5'-AAGCTTCATTCCG-3')外，采用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反 應。
自干燥的凝膠中切除含有H94 cDNA( SEQ ID NO: 25的從3,528至3,879 的堿基位)的352-堿基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H94 cDNA, 然后除了這里不4吏用[a-35S]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20)aM dNTP外， 該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復，以再擴增H94 cDNA。
2-8.TRG11
除了這里使用含有表示為SEQ ID NO: 31 DNA序列的錨定引物H-Tl 1C (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3'， RNAimage試劑盒，Genhunter，公司，MA，美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 32 DNA序歹ll的引物H-AP4 (5'-AAGCTTCTCAACG-3')外，采用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反應。
自干燥的凝膠中切除含有H42 cDNA( SEQ ID NO:29的從83至229的堿 基位)的147-堿基對(bp)條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H42cDNA, 然后除了這里不使用[a-35S]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20pM dNTP外， 該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下進行，以再擴增H42 cDNA。
2-9.TRG12
除了這里使用含有表示為SEQ ID NO: 35 DNA序列的錨定引物H-T11G (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage試劑盒，Genhunter,公司，MA,美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 36 DNA序歹'J的引物H-AP10 (5'-AAGCTTCCACGTA-3')外，采用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反 應。
自干燥的凝膠中切除含有H109 cDNA ( SEQ ID NO: 33的從284至495 的堿基位)的212-堿基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H109 cDNA， 然后除了這里不使用[a-35s]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20|iM dNTP外， 該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復，以再擴增H109 cDNA。
2-10.TRG13
除了這里使用含有表示為SEQ ID NO: 39 DNA序列的錨定引物H-T11C (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage試劑盒，Genhunter,公司，MA,美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 40 DNA序歹'J的引物 H-AP11 (5'-AAGCTTCGGGTAA-3')外，釆用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反 應。
自干燥的凝膠中切除含有HI 19 cDNA ( SEQ ID NO: 37的從1,004至 1,235的堿基位)的232-堿基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫HI 19 cDNA，然后除了這里不使用[a-"S]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20|_iM
dNTP夕卜，該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復，以再擴增 H119cDNA。 2-11.TRG14
除了這里使用含有表示為SEQIDNO: 43 DNA序列的錨定引物H-T11G (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG匿3'，認Aimage試劑盒，Genhunter，公司，MA,美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 44 DNA序歹'J的引物H-AP20 (5'-AAGCTTGTTGTGC-3')外，采用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反 應。
自干燥的凝月交中切除含有H201 cDNA ( SEQ ID NO: 41的從卯2至1,096 的堿基位)的195-堿基對(bp)條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H201 cDNA, 然后除了這里不使用[a-35S]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20|iM dNTP 外，該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復，以再擴增H201 cDNA。
2-12.TRG15
除了這里使用含有表示為SEQ ID NO: 47 DNA序列的錨定引物H-Tl 1A (5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'， RNAimage試劑盒，Genhunter,公司，MA，美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 48 DNA序歹'J的引物H-AP15 (5'-AAGCTTACGCAAC-3')外，采用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反 應。
自干燥的凝膠中切除含有H151 cDNA ( SEQ ID NO: 45的從848至1,099 的堿基位)的252-堿基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫HI51 cDNA， 然后除了這里不使用[a-35S]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20[iM dNTP外， 該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復，以再擴增H151 cDNA。
2-13.TRG16
除了這里使用含有表示為SEQ ID NO: 51 DNA序列的錨定引物H-Tl 1C
(5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3'， RNAimage試劑盒，Genhunter,公司，MA,美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 52 DNA序歹'J的引物H-AP13 (5'-AAGCTTCGGCATA-3')外，采用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反 應。
自干燥的凝膠中切除含有H132 cDNA ( SEQ ID NO:49的從813至1,039 的堿基位)的227-堿基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H132 cDNA, 然后除了這里不使用[a-35S]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20(iM dNTP外， 該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復，以再擴增H132 cDNA。 2-14.TRG17
除了這里^吏用含有表示為SEQ ID NO: 55 DNA序列的錨定引物H-Tl 1G (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG-3',脂Aimage試劑盒，Genhunter,公司，MA，美國) 和含有表示為 SEQ ID NO: 56 DNA序歹'J的引物 H-AP14 (5'-AAGCTTGGAGCTT-3')外，采用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反應。
自干燥的凝膠中切除含有H141 cDNA ( SEQ ID NO: 53的從235至419 的堿基位)的185-堿基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H141 cDNA， 然后除了這里不4吏用[a-35S]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20(iM dNTP外， 該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復，以再擴增HI41 cDNA。
2-15.TRG 18
除了這里使用含有表示為SEQ ID NO: 59 DNA序列的錨定引物H-Tl 1C (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage試劑盒，Genhunter,公司，MA,美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 60 DNA序歹'J的引物H-AP18 (5'-AAGCTTAGAGGCA-3')外，釆用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反應。
自干燥的凝膠中切除含有H181 cDNA ( SEQ ID NO: 57的從902至1,128 的堿基位)的227^咸基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H181 cDNA,
然后除了這里不使用[a-35s]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20^M dNTP外， 該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復，以再擴增H181 cDNA。 2-16.TRG20
除了這里使用含有表示為SEQIDNO: 63 DNA序列的錨定引物H-Tl 1A (5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'， RNAimage試劑盒，Genhunter，公司，MA,美 國)和含有表示為 SEQ ID NO: 64 DNA序歹'J的引物H-AP13 (5'-AAGCTTCGGCATA-3')外，采用同實施例2-1中相同的方法重復PCR反應。
自干燥的凝膠中切除含有H134 cDNA ( SEQ ID NO: 61的從232至417 的堿基位)的186-石威基對(bp )條帶。提取的凝膠加熱15分鐘洗脫H134 cDNA, 然后除了這里不^f吏用[a畫35s]-標記的dATP (1200 Ci/mmole)和20pM dNTP夕卜， 該PCR反應使用相同的引物在上述相同的條件下重復，以再擴增H134 cDNA。
實施例3:克隆
使用TA克隆系統(tǒng)(Promega,美國)，根據(jù)制造商的手冊，分別將所有 如上述再擴增的H20-121產物、H93-811產物、Hl 17-321產物、H38-211產 物、H38-621產物、H96產物、H94產物、H42產物、H 109產物、H119產 物、H201產物、H151產物、H132產物、H141產物、H181產物和H134 PCR 產物插入pGEM-T EASY載體。 (步驟1 )連接反應
將所有在實施例2中再擴增的H20-121產物、H93-811產物、Hl 17-321產物、 H38-211產物、H38-621產物、H96產物、H94產物、H42產物、H109產物、 H119產物、H201產物、H151產物、H132產物、H141產物、H181產物和 H134PCR產物各2pL, lpLpGEM-TEASY載體(50ng) , lpLT4DNA連 接酶緩沖液(10x )和ljaL T4 DNA連接酶(3維斯單位/[iL; Promega)置入 0.5ml試管中，并且于其中加入蒸餾水至終體積為10pL。連接反應混合物在 14°C溫育過夜。 (步驟2) TA克隆的轉化
大腸桿菌JM109 (Promega， WI,美國)在10mL LB肉湯培養(yǎng)基(10g細 菌用胰酶解胨，5g細菌用酵母提取物，5g氯化鈉)中培養(yǎng)，直到600nm光密 度達到大約0.3 ~ 0.6。溫育的混合物在冰中保存約10分鐘，然后4°C下10分 鐘，4°C下4,000 rpm離心10分鐘，然后棄上清液并收集細胞。收集的細胞沉 淀物暴露在10ml用冰預冷的O.IM的氯化鈣中大約30分鐘至1小時，以制備 感受態(tài)細胞。得到的產物在4°C下4,000rpm再次離心10分鐘，然后棄去上 清液，并收集細胞，使其懸浮在2ml0.1M用冰預冷的氯化鈣中。
將200|iL感受態(tài)細胞混懸液轉移到新的小離心管中，于其中加入2(iL在 步驟1中制備的各連接反應的產物。得到的混合物在42°C水浴中溫育90秒 鐘，然后在0°C淬火。于其中加入800pL SOC培養(yǎng)基(2.0g細菌用胰酶解胨， 0.5g細菌用酵母提取物，1M的氯化鈉lmL, 1M的氯化鉀0.25mL， 97mL TDW, 2M的Mg2+ lmL, 2M的葡萄糖lmL ),得到的混合物在37°C 220rpm的旋轉 震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45分鐘。
用玻璃棒將25pL的X-gal (保存在40mg/ml的二曱基曱酰胺中)涂布在 補加氨芐青霉素、預先保存在37。C培養(yǎng)箱中的LB平板上，然后于其中添加 25pL各轉化細胞，再次使用玻璃棒涂布，然后在37。C培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)后，選 擇3 ~4個成型的白色菌落，然后各選中的細胞在補加氨千青霉素的LB平板 上進行種子培養(yǎng)。為了構建質粒，那些被證明形成菌落的已將連接反應的產 物分別導入上述菌落中的菌林，稱為轉化的大腸桿菌菌株JM109/H20-121、 JM109/H93-811 、 JM109/H117-321 、 JM109/H38-211 、 JM109/H38-621 、 JM109/H96、 JM109/H94、 JM109/H42、 JM109/H109、 JM109/H119、 JM109/H201 、 JM109/H151、 JM109/H132、 JM109/H141、 JM109/H181和JM109/H134,選擇 所述的菌抹在10mL極好的肉湯培養(yǎng)基(卯OmLTDW、 12g細菌用胰酶解胨、 24g細菌酵母提取物、4mL甘油、0.17MKH2PO4、 100ml 0.72g NK2HP04)中
培養(yǎng)。
實施例4:重組質粒DNA的分離
使用Wizard Plus MiniprepsDNA提純試劑盒(Promege，美國)，根據(jù) 制造商的手冊4艮據(jù)制造商的手冊將各質粒DNA H20-121 、 H93-811 、 HI 17-321 、 H38隱211、 H38_621、 H96、 H94、 H42、 H109、 HI 19、 H201、 H151、 H132、 H141、 H181、和H134自轉化的大腸桿菌菌株中分離出來。
確定將少量的各分離的質粒DNA用限制性酶ECoRI處理，然后在2%凝 膠中進行電泳以證明H20-121、 H93-811、 HI 17-321、 H38-211、 H38-621、 H96、 H94、 H42、 H109、 H119、 H201、 H151、 H132、 H141、 H181和H134的部 分序列被分別插入到質粒中。
實施例5: DNA堿基序列分析
5-1. TRG3
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H20-121 PCR產物進行擴增、克隆， 然后再擴增。根據(jù)雙脫氧鏈終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒 (United States Biochemical, Cleveland, OH,美國)對產物H20-121 PCT片段
進行測序。
該基因的DNA序列與SEQIDNO: 1的從1,342至1,599的核苷酸序列位 置相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H20-121"。
使用5'-隨機引物H-AP20和3'-錨定引物H-T11A,將上述獲得的258-bp 的cDNA片段，即H20-121,進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR )， 然后用電泳i正實。
如圖l所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋巴 結組織和CUMC-6細胞中為差異表達。在圖1中可見，258-bp的cDNA片段 H20-121在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組 織中非常罕見表達。
5-2. TRG4
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H93-811 PCR產物進行擴增、克隆， 然后再擴增。才艮據(jù)雙脫氧鏈終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒 (United States Biochemical, Cleveland, OH,美國)對產物H93-811 PCT片段
進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 5的從2，086至2,478的核苷酸序列位 置相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H93-811"。
使用5'-隨機引物H-AP9和3'-錨定引物H-T11G,將上述獲得的393-bp 的cDNA片段，即H93-811,進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR )， 然后用電泳i正實。
如圖2所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋巴 結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖1中可見，393-bp的cDNA片段 H93-811在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組 織中非常罕見表達。
5-3. TRG5
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H117-321 PCR產物進行擴增、克隆， 然后再擴增。根據(jù)雙脫氧鏈終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒 (United States Biochemical, Cleveland, OH,美國)對產物HI 17-321 PCT片段
進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 9的從933至1,224的核苷酸序列位置 相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H117-321"。
使用5'-隨機引物H-AP11和3'-錨定引物H-T11C,將上述獲得的292-bp 的cDNA片段，即H117-321,進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應 (DDRT-PCR),然后用電泳證實。
如圖3所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋巴
結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖3中可見，292-bp的cDNA片段 H117-321在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組 織中非常罕見表達。 5-4. TRG6
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H38-211 PCR產物進行擴增、克隆， 然后再擴增。根據(jù)雙脫氧鏈終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒 (United States Biochemical, Cleveland, OH,美國)對產物H38-211 PCT片段
進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 13的從2,823-3,133的核苷酸序列位 置相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H38-211"。使用5'-隨機引物H-AP38 和3'-錨定引物H-T11A,將上述獲得的311-bp的cDNA片段，即H38-211, 進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR),然后用電泳證實。
如圖4所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋巴 結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖4中可見，311-bp的cDNA片段 H38-211在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組
織中非常罕見表達。 5-5. TRG7
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H38-621 PCR產物進行擴增、克隆， 然后再擴增。根據(jù)雙脫氧鏈終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒 (United States Biochemical, Cleveland, OH，美國)對產物H38-621 PCT片段
進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 17的從1,404-1,695的核苷酸序列位 置相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H3 8-621"。
使用5'-隨機引物H-AP38和3'-錨定引物H-T11G，將上述獲得的292-bp 的cDNA片段，即H38-621,進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR),
然后用電泳i正實。
如圖5所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋巴 結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖5中可見，292-bp的cDNA片段 H38-621在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細月包中表達，^旦在正常組 織中非常罕見表達。
5-6. TRG9
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H96PCR產物進行擴增、克隆，然 后再擴增。才艮據(jù)雙脫氧《連終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH,美國)對產物H96 PCT片段進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 21的從1，225至1,499的核芬酸序列 位置相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H96"。
使用5'-隨機引物H-AP9和3'-錨定引物H-T11A,將上述獲得的275-bp 的cDNA片段，即H96,進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR)， 然后用電泳i正實。
如圖6所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋巴 結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖6中可見，275-bp的cDNA片段 H96在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組織中 非常罕見表達。
5-7. TRG10
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H94PCR產物進行擴增、克隆，然 后再次擴增。才艮據(jù)雙脫氧鏈終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒 (United States Biochemical, Cleveland, OH,美國)對產物H94 PCT片段進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 25的從3,528至3，879的核苦酸序列 位置相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H94"。
使用5'-隨機引物H-AP9和3'-錨定引物H-T11A，將上述獲得的352-bp 的cDNA片段，即H94，進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR)， 然后用電泳i正實。
如圖7所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋巴 結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖7中可見，352-bp的cDNA片段 H94在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組織中 非常罕見表達。
5-8. TRG11
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H42PCR產物進行擴增、克隆，然 后再擴增。根據(jù)雙脫氧鏈終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH,美國)對產物H42 PCT片^殳進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 29的從83至229的核苦酸序列位置 相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H42"。
使用5'-隨機引物H-AP4和3'-錨定引物H-T11C,將上述獲得的147-bp 的cDNA片段，即H42，進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR), 然后用電泳i正實。
如圖8所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋巴 結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖8中可見，147-bp的cDNA片段 H42在宮頸癌、轉移'淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組織中 非常罕見表達。
5-9. TRG12
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H109PCR產物進行擴增、克隆，然 后再擴增。才艮據(jù)雙脫氧《連終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH,美國)對產物HI09 PCT片段進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 33的乂人284至495的核苷酸序列位置
相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H109"。
使用5'-隨機引物H-AP10和3'-錨定引物H-T11G，將上述獲得的212-bp 的cDNA片段，即H109,進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR), 然后用電泳i正實。
如圖9所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋巴 結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖9中可見，212-bp的cDNA片段 H109在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組織中 非常罕見表達。
5-10. TRG13
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H119PCR產物進行擴增、克隆，然 后再擴增。才艮據(jù)雙脫氧《連終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH，美國)對產物HI 19 PCT片段進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 37從1,004至1,235的核苷酸序列位 置相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H119"。
使用5'-隨機引物H-AP11和3'-錨定引物H-T11C，將上述獲得的232-bp 的cDNA片段，即HI 19，進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR )， 然后用電泳i正實。
如圖10所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋 巴結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖10中可見，232-bp的cDNA片 ,殳HI 19在宮頸癌、轉移'淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組 織中非常罕見表達。
5-11. TRG14
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H201 PCR產物進行擴增、克隆，然 后再擴增。才艮據(jù)雙脫氧《連終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH，美國)對產物H201 PCT片段進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 41的從902至1,096的核苦酸序列位 置相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H201"。
使用5'-隨機引物H-AP20和3'-錨定引物H-T11G,將上述獲得的195-bp 的cDNA片段，即H201，進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR)，
然后用電泳i正實。
如圖11所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋 巴結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖11中可見，195-bp的cDNA片 段H201在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組 織中非常罕見表達。
5-12. TRG15
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H151 PCR產物進行擴增、克隆，然 后再擴增。根據(jù)雙脫氧鏈終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH，美國)對產物HI51 PCT片段進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 45的從848至1,099的核苦酸序列位 置相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H151"。
使用5'-隨機引物H-AP15和3'-錨定引物H-T11A,將上述獲得的252-bp 的cDNA片段，即H151，進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR)， 然后用電泳i正實。
如圖12所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋 巴結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖12中可見，252-bp的cDNA片 段H151在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組 織中非常罕見表達。
5-13. TRG16
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H132PCR產物進行擴增、克隆，然 后再擴增。根據(jù)雙脫氧鏈終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒(United
States Biochemical, Cleveland, OH，美國)對產物HI32 PCT片段進行測序。 該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 49的從813至1,039的核苷酸序列位
置相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H132"。
使用5'-隨機引物H-AP13和3'-錨定引物H-T11C,將上述獲得的227-bp
的cDNA片段，即H132,進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR),
然后用電泳i正實。
如圖13所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋 巴結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖13中可見，227-bp的cDNA片 段H132在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組
織中非常罕見表達。 5-14. TRG17
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H141 PCR產物進行擴增、克隆，然 后再擴增。根據(jù)雙脫氧鏈終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH,美國)對產物H141 PCT片段進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 53的從235至419的核苷酸序列位置 相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H141"。
使用5'-隨機引物H-AP14和3'-錨定引物H-T11G，將上述獲得的185七p 的cDNA片段，即H141,進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR)， 然后用電泳i正實。
如圖14所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋 巴結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖14中可見，185-bp的cDNA片 段H141在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組 織中非常罕見表達。
5-15. TRG18
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H181 PCR產物進行擴增、克隆，然
后再擴增。根據(jù)雙脫氧鏈終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH,美國)對產物HI81 PCT片段進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 57從卯2至1,128的核芬酸序列位置 相對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H181"。
使用5'-隨^L引物H-AP18和3'-錨定引物H-T11C，將上述獲得的227-bp 的cDNA片段，即H181，進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR)， 然后用電泳i正實。
如圖15所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋 巴結組織和CUMC-6細月包中差異表達。在圖15中可見，227-bp的cDNA片 段H181在宮頸癌、轉移'淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組 織中非常罕見表達。
5-16. TRG20
根據(jù)常規(guī)方法將在實施例2中獲得的H134PCR產物進行擴增、克隆，然 后再擴增。根據(jù)雙脫氧鏈終止法，使用測序酶2.0版本DNA測序試劑盒(United States Biochemical, Cleveland, OH，美國)對產物HI34 PCT片段進行測序。
該基因的DNA序列與SEQ ID NO: 61從232至417的核苷酸序列位置相 對應，在本發(fā)明中將該基因稱為"H134"。
使用5'-隨機引物H-AP13和3'-錨定引物H-T11A，將上述獲得的186-bp 的cDNA片段，即H134，進行差異顯示反轉錄-聚合酶鏈反應(DDRT-PCR)， 然后用電泳i正實。
如圖16所示，差異顯示(DD)表明該基因在正常外宮頸組織、轉移淋 巴結組織和CUMC-6細胞中差異表達。在圖16中可見，186-bp的cDNA片 段H134在宮頸癌、轉移淋巴結組織和CUMC-6癌細胞中表達，但在正常組 織中非常罕見表達。
實施例6:全長TRG原癌基因的cDNA序列分析
6畫1.TRG3
使用"P-標記的H20-121作為探針對噬菌體X gtll人胚肺成纖維細胞 (human lung embryonic fibroblast) cDNA文庫進行篩查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989) 。 乂人人胚肺成纖維細胞cDNA文庫中獲得將l，703-bp片段 插入到pCEV-LAC載體的全長TRG3 cDNA克隆，隨后于2002年12月2日 保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為AY189688 (預定發(fā)布日期為2005年 4月8曰)。
插入到XpCEV載體的TRG3克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式從噬菌體中分離出來。包含TRG3基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接 酶連接以制備TRG3質粒DNA,然后用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5a。
由l，703bp組成的TRG3的全長DNA序列表示為SEQ ID NO: 1 。
在SEQ ID NO: 1的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱 讀框與從113至1,522的核苦酸序列位置相對應，并編碼由469個氨基酸組成 的SEQ ID NO: 2的蛋白質。
6-2.TRG4
使用"P-標記的H93-811作為探針對噬菌體X gtll人胚肺成纖維細胞 cDNA文庫進行篩查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )。從人胚肺成纖 維細胞cDNA文庫中獲得將2，576-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG4 cDNA克隆，隨后于2002年12月2日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為 AY189690 (預定發(fā)布日期為2005年4月8日)。插入到人pCEV載體的TRG4 克隆用限制性酶Notl切割，并以氨芐青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體 (Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)的形式從噬菌體中分離出來。包含 TRG4基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接酶連接以制備TRG4質粒DNA， 然后用連"t妻的克隆轉化大腸桿菌DH5 a。由2,576bp組成的TRG4的全長DNA 序列表示為SEQ ID NO: 5。在SEQ ID NO: 5的DNA序列中，估計本發(fā)明的 原癌基因的全長開放閱讀框與從87至482的核苷酸序列位置相對應，并編碼 由131個氨基酸組成的SEQ ID NO: 6蛋白質. 6隱3.TRG5
使用"P-標記的HI 17-321作為探針對噬菌體X gtll人胚肺成纖維細胞 cDNA文庫進行篩查(Miki，T.等人,Gene83: 137-146， 1989)。從人胚肺成纖 維細胞cDNA文庫中獲得將1 ，334-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG5 cDNA克隆，隨后于2002年12月2日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為 AY189689 (預定發(fā)布日期為2005年4月8日)。
插入到入pCEV載體的TRG5克隆用限制性酶Not I切割，并以氨節(jié)青霉 素抗性pCEV-LAC p藍菌粒載體(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式從噬菌體中分離出來。包含TRG5基因的pCEV-LAC載體被T4 DNA連接 酶連接以制備TRG5質粒DNA,然后用連接的克隆轉化轉化大腸桿菌DH5 a。 由l,336bp組成的TRG5的全長DNA序列表示為SEQ ID NO: 9。
在SEQ ID NO: 9的DNA序列中，已證明本發(fā)明的原癌基因的全長開放 閱讀框與從88至1,092的核芬酸序列位置相對應，并編碼由334個氨基酸組 成的SEQ ID NO: IO蛋白質。
6-4.TRG6
使用"P-標記的H38-211作為探針對噬菌體X gtll人胚肺成纖維細胞 cDNA文庫進行篩查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989 )。從人胚肺成纖 維細胞cDNA文庫中獲得將3,309-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG6 cDNA克隆，隨后于2002年12月5日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為 AY191222 (預定發(fā)布日期為2005年4月8日)。插入到XpCEV載體的TRG6 克隆用限制性酶Notl切割，并以氨千青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體 (Miki,T.等人，Gene 83: 137-146, 1989)的形式從噬菌體中分離出來。
包含TRG6基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接酶連接以制備TRG6 質粒DNA，然后用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5a。
由3,309bp組成的TRG6的全長DNA序列表示為SEQ ID NO: 13。
在SEQ ID NO: 13的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱 讀框與從233-481的核苷酸序列位置相對應，并編碼由82個氨基酸組成的SEQ IDNO:14蛋白質。
6-5.TRG7
使用3￥-標記的H38-621作為探針對噬菌體X gtll人胚肺成纖維細胞 cDNA文庫進行篩查(Miki， T.等人，Gene 83: 137-146， 1989 )。從人胚肺成纖 維細胞cDNA文庫中獲得將l，778-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG7 cDNA克隆，隨后于2002年12月5日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為 AY191223 (預定發(fā)布日期為2005年4月8日)。插入到XpCEV載體的TRG7 克隆用限制性酶Notl切割，并以氨千青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體 (Miki，T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)的形式從噬菌體中分離出來。
包含TRG7基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接酶連4妄以制備TRG7 質粒DNA，然后用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 a。由1,778bp組成的TRG7 的全長DNA序列表示為SEQIDNO: 17。
在SEQ ID NO: 17的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱 讀框與從42至1,422的核苦酸序列位置相對應，并編碼由175個氨基酸組成 的SEQ ID NO: 18蛋白質。
6-6.TRG9
使用"P-標記的H96作為探針對噬菌體X gtll人胚肺成纖維細胞cDNA 文庫進行篩查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989)。從人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫中獲得將1，582-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG9 cDNA克隆，隨后于2003年4月9日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為
AY272044 (預定發(fā)布日期為2005年3月31日)。
插入到人pCEV載體的TRG9克隆用限制性酶Not I切割，并以氨卡青霉 素抗性pCEV-LAC p盆菌粒載體(Miki，T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式從噬菌體中分離出來。包含TRG9基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接 酶連接以制備TRG9質粒DNA，然后用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 a。
由1，582bp組成的TRG9的全長DNA序列表示為SEQ ID NO: 21。
在SEQ ID NO: 21的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱 讀框與從17-1,576的核普酸序列位置相對應，并編碼由519個氨基酸組成的 SEQ ID NO: 22蛋白質。
6-7.TRG10
使用32P-標記的H94作為探針對噬菌體人gtll人胚肺成纖維細胞cDNA 文庫進行篩查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)。從人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫中獲得將3，979-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG10 cDNA克隆，隨后于2003年4月12日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為 AY277593 (預定發(fā)布日期為2005年3月31日)。
插入到XpCEV載體的TRG10克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989 )的形 式從噬菌體中分離出來。
包含TRG10基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接酶連接以制備TRG10 質粒DNA,然后用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 a。
由3，979bp組成的TRG10的全長DNA序列表示為SEQ ID NO: 25。
在SEQ ID NO: 25的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱 讀框與從1,100至1,270的核苷酸序列位置相對應，并編碼由56個氨基酸組 成的SEQ IDNO:26蛋白質。
6-8.TRG11
使用"P-標記的H42作為探針對噬菌體人gtll人胚肺成纖維細胞cDNA 文庫進行篩查(Miki，T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)。從人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫中獲得將235-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG11 cDNA克隆，隨后于2003年4月13日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為 AY277594 (預定發(fā)布日期為2005年3月31日)。
插入到XpCEV載體的TRG11克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體(Miki， T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式從噬菌體中分離出來。
包含TRG11基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接酶連接以制備TRG11 質粒DNA,然后用連4妻的克隆轉化大腸桿菌DH5 a。
由235bp組成的TRG11的全長DNA序列表示為SEQIDNO: 29。
在SEQ ID NO: 29的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱 讀框與從26至214的核苦酸序列位置相對應，并編碼由62個氨基酸組成的 SEQ ID NO: 30蛋白質。
6-9.TRG12
使用3￥-標記的H109作為探針對噬菌體X gtll人胚肺成纖維細胞cDNA 文庫進行篩查(Miki，T.等人，Gene 83: 137-146, 1989)。從人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫中獲得將510-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG12 cDNA克隆，隨后于2003年，4月13日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號 為AY277595 (預定發(fā)布日期為2005年3月31日)。
插入到XpCEV載體的TRG12克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式從噬菌體中分離出來。
包含TRG12基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接酶連接以制備TRG12 質粒DNA，然后用連^^的克隆轉化大腸桿菌DH5 a。
由510bp組成的TRG12的全長DNA序列表示為SEQIDNO: 33。
在SEQ ID NO: 33的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱
讀框與從80至475的核普酸序列位置相對應，并編碼由131個氨基酸組成的
SEQ ID NO: 34蛋白質。 6-10.TRG13
使用"P-標記的HI 19作為探針對噬菌體入gtl 1人胚肺成纖維細胞cDNA 文庫進行篩查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989)。從人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫中獲得將1,301-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG13 cDNA克隆，隨后于2003年4月13日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為 AY277596 (預定發(fā)布日期為2005年3月31日)。
插入到XpCEV載體的TRG13克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體(Miki，T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式從噬菌體中分離出來。
包含TRG13基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接酶連接以制備TRG13 質粒DNA,然后用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 a。
由1,301bp組成的TRG13的全長DNA序列表示為SEQ ID NO: 37。
在SEQ ID NO: 37的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱 讀框與從18至1,193的核香酸序列位置相對應，并編碼由391個氨基酸組成 的SEQ ID NO: 38蛋白質。
6-11.TRG14
使用3￥-標記的H201作為探針對噬菌體人gtll人胚肺成纖維細胞cDNA 文庫進行篩查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)。從人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫中獲得將l，206-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG14 cDNA克隆，隨后于2003年4月13日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為 AY277597 (預定發(fā)布日期為2005年3月31日)。
插入到XpCEV載體的TRG14克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式從噬菌體中分離出來。
包含TRG14基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接酶連接以制備TRG14 質粒DNA,然后用連^t妻的克隆轉化大腸桿菌DH5 a。
由1,206bp組成的TRG14的全長DNA序列表示為SEQIDNO:41。
在SEQ ID NO: 41的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱 讀框與從18至1,202的核苷酸序列位置相對應，并編碼由394個氨基酸組成 的SEQ ID NO: 42蛋白質。
6-12.TRG15
使用3￥-標記的H151作為探針對噬菌體X gtl 1人胚肺成纖維細胞cDNA 文庫進行篩查(Miki，T.等人，Gene 83: 137-146, 1989)。從人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫中獲得將l，104-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG15 cDNA克隆，隨后于2003年4月13日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為 AY277598 (預定發(fā)布日期為2005年3月31日)。
插入到XpCEV載體的TRG15克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989 )的形 式從噬菌體中分離出來。
包含TRG15基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接酶連接以制備TRG15 質粒DNA，然后用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 a。
由1，104bp組成的TRG15的全長DNA序列表示為SEQ ID NO: 45。
在SEQ ID NO: 45的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱 讀框與從1至1,104的核苦酸序列位置相對應，并編碼由367個氨基酸組成的 SEQ ID NO: 46蛋白質。
6-13.TRG16
使用3￥-標記的H132作為探針對噬菌體X gtl 1人胚肺成纖維細胞cDNA 文庫進行篩查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)。從人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫中獲得將1，064-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG16 cDNA克隆，隨后于2003年4月13日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為 AY277601 (預定發(fā)布日期為2005年3月31日)。
插入到人pCEV載體的TRG16克隆用限制性酶Not I切割，并以氨節(jié)青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989 )的形 式從噬菌體中分離出來。
包含TRG16基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接酶連接以制備TRG16 質粒DNA,然后用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 a。
由1,064bp組成的TRG 16的全長DNA序列表示為SEQIDNO: 49。
在SEQ ID NO: 49的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱 讀框與從92至1,064的核苷酸序列位置相對應，并編碼由324個氨基酸組成 的SEQIDNO:50蛋白質。
6-14.TRG17
使用"P-標記的H141作為探針對噬菌體X gtl 1人胚肺成纖維細胞cDNA 文庫進行篩查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989)。從人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫中獲得將432-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG17 cDNA克隆，隨后于2003年4月13日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為 AY277599(預定發(fā)布日期為2005年3月31日)。插入到入pCEV載體的TRG17 克隆用限制性酶Notl切割，并以氨芐青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體 (Miki,T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)的形式從噬菌體中分離出來。
包含TRG17基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接酶連接以制備TRG17 質粒DNA,然后用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5ou
由432bp組成的TRG17的全長DNA序列表示為SEQ ID NO: 53。 在SEQ ID NO: 53的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱 讀框與從1至408的核苦酸序列位置相對應，并編碼由135個氨基酸組成的 SEQ ID NO: 54蛋白質。
6-15.TRG18
使用"P-標記的H181作為探針對噬菌體X gtl 1人胚肺成纖維細胞cDNA 文庫進行篩查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)。從人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫中獲得將1,141-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG18 cDNA克隆，隨后于2003年4月13日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號為 AY277600 (預定發(fā)布日期為2005年3月31日)。
插入到XpCEV載體的TRG18克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式從噬菌體中分離出來。
質粒DNA,然后用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 a。
由1,141bp組成的TRG18的全長DNA序列表示為SEQ ID NO: 57。
在SEQ ID NO: 57的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱
讀框與從20至1,141的核苷酸序列位置相對應，并編碼由373個氨基酸組成
的SEQ ID NO: 58蛋白質。 6-16.TRG20
使用"P-標記的H134作為探針對噬菌體X gtl 1人胚肺成纖維細胞cDNA 文庫進行篩查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)。從人胚肺成纖維細 胞cDNA文庫中獲得將449-bp片段插入到pCEV-LAC載體的全長TRG20 cDNA克隆，隨后于2003年IO月29日保存在美國基因庫數(shù)據(jù)庫中，收錄號 為AY453397 (預定發(fā)布日期為2005年3月31日)。
插入到XpCEV載體的TRG20克隆被限制性酶Not I切割，并以氨千青霉
素抗性pCEV-LAC噬菌粒載體(Miki， T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式從噬菌體中分離出來。
包含TRG20基因的pCEV-LAC載體用T4 DNA連接酶連接以制備TRG20 質粒DNA,然后用連接的克隆轉化大腸桿菌DH5 a。
由449bp組成的TRG20的全長DNA序列表示為SEQ ID NO: 61 。
在SEQ ID NO: 61的DNA序列中，估計本發(fā)明的原癌基因的全長開放閱 讀框與從42至449核苷酸序列位置相對應，并編碼由135個氨基酸組成的SEQ ID NO: 62蛋白質。
實施例7:多種細胞中TRG基因的RNA印跡分析
采用同實施例1中相同的方法，將總RNA樣本從正常外宮頸組織、宮頸 癌組織、轉移宮頸'淋巴結組織以及宮頸癌細月包系CaSki(ATCC CRL 1550)和 CUMC-6中4是取出來。
為確定各TRG基因的表達水平，取由組織和細胞系中提取的各總變性 RNA樣本20iig，于1%曱醛瓊脂糖凝膠中進行電泳，然后將得到的瓊脂糖凝 膠轉移到尼龍膜(Boehringer-Mannheim,德國)上。然后使印跡與"P-標記和 使用Rediprime II隨機引物標記系統(tǒng)(Amersham,英國)制備的隨機引物的 全長TRG cDNA探針進行雜交。重復兩次RNA印跡分析，然后將得到的印 跡由密度計進行定量并用P-肌動蛋白進行標準化。
圖17的上部顯示的是確定TRG3原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌組 織、轉移宮頸淋巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達的 RNA印跡的結果。如圖17所示，顯示TRG3原癌基因的表達水平增加，也就 是說，大小為大約1.7kb的優(yōu)勢TRG3 mRNA轉錄物在宮頸癌組織以及宮頸癌 細胞系CaSki和CUMC-6中過表達。圖17中，"正常"泳道代表正常外宮頸組 織，"癌"泳道代表宮頸癌組織，"轉移"泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以及各 "CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖17的下部顯示的是由相同樣
本和P-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。 圖33顯示的是確定TRG3原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech) 如腦、心臟、橫紋"幾、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和 外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡的結果。圖33的下部顯示的是由 相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明|3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印 跡結果。如圖33所示，顯示TRG3 mRNA轉錄物(大小為大約1.7kb的優(yōu)勢 TRG3 mRNA轉錄物)在如心臟和肌肉的正常組織中表達，但是在如腦、大腸、 胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞的正常組織中罕 見表達。
圖49顯示的是確定TRG3原癌基因在人癌細胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361 (Clontech)中是否表達的RNA印跡 的結果。圖49的下部顯示的是由相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動 蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖19a所示，顯示TRG3 mRNA 轉錄物(大小為大約1.7kb的優(yōu)勢TRG3 mRNA轉錄物)在如早幼粒白血病細 胞系HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細 胞白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、 肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為非常高的表達。
圖18的上部顯示的是確定TRG4原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌組 織、轉移宮頸、淋巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達的 RNA印跡的結果。如圖18所示，顯示TRG4的表達水平增高，也就是說，大 小為大約3.0kb的優(yōu)勢TRG4 mRNA轉錄物在宮頸癌組織和宮頸癌細胞系 CaSki和CUMC-6中過表達。圖18中，"正常"泳道代表正常外宮頸組織，"癌" 泳道代表宮頸癌組織，"轉移"泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以及各"CaSki，，和 "CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖18的下部顯示的是由相同樣本和P-肌 動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。 圖34顯示的是確定TRG4原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech ) 如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和 外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡的結果。圖34的下部顯示的是由 相同樣本和p-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印 跡結果。如圖34所示，顯示TRG4 mRNA轉錄物(大小為大約3.0kb的優(yōu)勢 TRG4mRNA轉錄物)在如腦、心臟、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、 胎盤、肺和外周血白細胞的正常組織中表達。
圖50顯示的是確定TRG4原癌基因在人癌細胞系如HL-60、 HeLa、 K-562 、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361 (Clontech)中是否表達的RNA印跡 的結果。圖50的下部顯示的是由相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動 蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖50所示，顯示TRG4 mRNA轉 錄物(大小為大約3.0kb的優(yōu)勢TRG4 mRNA轉錄物)在HeLa子宮癌細胞系、 慢性髓性白血病細胞系K-562和結腸癌細胞系SW480中為非常高的表達。
圖19的上部顯示的是確定TRG5原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌組 織、轉移宮頸;休巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達的 RNA印跡的結果。如圖19所示，顯示TRG5原癌基因的表達水平增高，也就 是說，大小為大約1.4kb的優(yōu)勢TRG5 mRNA轉錄物在宮頸癌組織以及宮頸癌 細胞系CaSki和CUMC-6中為過表達。圖19中，"正常，，泳道代表正常外宮頸 組織，"癌"泳道代表宮頸癌組織，"轉移，，泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以及各 "CaSki，，和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖19的下部顯示的是由相同樣 本和P-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。
圖35顯示的是確定TRG5原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech)如 腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和外 周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡的結果。圖35的下部顯示的是由相 同樣本和p-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡
結果。如圖35所示，顯示TRG5mRNA轉錄物(大小為大約1.4kb的優(yōu)勢TRG5 mRNA轉錄物)在如腦、心臟、肌肉和腎臟的正常組織中表達，但是在如大 腸、胸腺、脾臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞的正常組織中罕見 表達。
圖51顯示的是確定TRG5原癌基因在人癌細胞系如HL-60、HeLa、K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結 果。圖51的下部顯示的是由相同樣本和p-肌動蛋白探針雜交表明p-肌動蛋白 mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖51所示，顯示TRG5 mRNA轉錄物 (大小為大約1.4kb的優(yōu)勢TRG5 mRNA轉錄物)在如早幼粒白血病細胞系 HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞白 血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺 癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為非常高的表達。
圖20的上部顯示的是確定TRG6原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌組 織、轉移宮頸淋巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達的 RNA印跡的結果。如圖20所示，顯示TRG6原癌基因的表達水平增高，也就 是說，大小為大約7.0kb的優(yōu)勢TRG6 mRNA轉錄物在宮頸癌組織以及宮頸癌 細胞系CaSki和CUMC-6中為過表達。圖20中，"正常"泳道代表正常外宮頸 組織，"癌"泳道代表宮頸癌組織，"轉移"泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以及各 "CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖20的下部顯示的是由相同樣 本和P-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。
圖36顯示的是確定TRG6原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech)如 腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和外 周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖36的下部顯示的是由相同 樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結 果。如圖36所示，TRG6 mRNA轉錄物(大小為大約7.0kb的優(yōu)勢TRG6 mRNA轉錄物)顯示在如腦、心臟、肌肉、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、 胎盤、肺和外周血白細胞的正常組織中無表達。
圖52顯示的是確定TRG6原癌基因在人癌細胞系如早幼粒白血病細胞系 HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞白 血病細胞系MOLT-4、伯基特'淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、月申 癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡的結 果。圖52的下部顯示的是由相同樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白 mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖52所示，顯示TRG6 mRNA轉錄物 (大小為大約7.0kb的優(yōu)勢TRG6 mRNA轉錄物)在HeLa子宮癌細胞系和皮 膚癌細胞系G361中為非常高的表達。
圖21的上部顯示的是確定TRG7原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌組 織、轉移宮頸;休巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達的 RNA印跡的結果。如圖21所示，顯示TRG7原癌基因的表達水平增高，也就 是說，大小為大約2.0kb的優(yōu)勢TRG7 mRNA轉錄物在宮頸癌組織以及宮頸癌 細胞系CaSki和CUMC-6為過表達。圖21中，"正常，，泳道代表正常外宮頸組 織，"癌，，泳道代表宮頸癌組織，"轉移，，泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以及各 "CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖17的下部顯示的是由相同樣 本和P-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡。
圖37顯示的確定TRG7原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech)如腦、 心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和外周血 白細胞組織中是否表達的RNA印跡的結果。圖37的下部顯示的是由相同樣 本和P-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。 如圖37所示，顯示TRG7 mRNA轉錄物(大小為大約2.0kb的優(yōu)勢TRG7 mRNA 轉錄物)在如心臟、肌肉、腎臟和胎盤的正常組織中表達，并且同時大小為 大約2.4kb的優(yōu)勢TRG7 mRNA轉錄物也罕見表達，^f旦是其在如腦、大腸、胸
腺、脾臟、肝臟、小腸、肺和外周血白細胞的正常組織中無表達。
圖53顯示的是確定TRG7原癌基因在人癌細胞系如HL-60、HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡的 結果。圖53的下部顯示的是由相同樣本和p-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋 白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖53所示，顯示TRG7 mRNA轉錄 物(大小為大約2.0kb的優(yōu)勢TRG7 mRNA轉錄物)在早幼粒白血病細胞系 HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞白 血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺 癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為非常高的表達。同時，大小為大約 2.4kb的TRG7 mRNA轉錄物在人癌細胞系中也為過表達。
圖22的上部顯示的是確定TRG9原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌組 織、轉移宮頸:林巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達的 RNA印跡的結果。如圖22所示，顯示TRG9原癌基因的表達水平增高，也就 是說，大小為大約2.4kb的優(yōu)勢TRG9 mRNA轉錄物在宮頸癌組織和宮頸癌細 胞系CaSki和CUMC-6中為過表達。圖22中，"正常"泳道代表正常外宮頸組 織，"癌，，泳道代表宮頸癌組織，"轉移，，泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以及各 "CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖22的下部顯示的是由相同樣 本和p-肌動蛋白探針雜交表明p-肌動蛋白mRNA是否轉的RNA印跡結果。
圖38顯示的是確定TRG9原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech)如 腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和外 周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖38的下部顯示的是由相同 樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明p-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結 果。如圖38所示，顯示TRG9 mRNA轉錄物(大小為大約2.4kb的優(yōu)勢TRG3 mRNA轉錄物)在如心臟、肌肉、腎臟和胎盤的正常組織中罕見表達，但在 如腦、大腸、胸腺、月年臟、肝臟、小腸、肺和外周血白細胞的正常組織中幾乎不表達。
圖54顯示的是確定TRG9原癌基因在人癌細胞系如HL-60、HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA印跡結 果。圖54的下部顯示的是由相同樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明p-肌動蛋白 mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖54所示，顯示TRG3 mRNA轉錄物 (大小為大約2.4kb的優(yōu)勢TRG9 mRNA轉錄物)在早幼粒白血病細胞系 HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞白 血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、肺 癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為非常高的表達。并且，同時大小為 大約2.0kb的TRG9 mRNA轉錄物也存在表達。
圖23的上部顯示的是確定TRG10原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌 組織、轉移宮頸淋巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達 的RNA印跡的結果。如圖23所示，顯示TRG3原癌基因的表達水平增高， 也就是說，大小為大約6.0kb的優(yōu)勢TRG10 mRNA轉錄物在宮頸癌組織和宮 頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中過表達。圖23中，"正常，，泳道代表正常外宮 頸組織，"癌，，泳道代表宮頸癌組織，"轉移，，泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以及 各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖23的下部顯示的是由相同 樣本和p-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結 果。
圖39顯示的是確定TRG10原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech) 如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和 外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖39的下部顯示的是由相 同樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡 結果。如圖39所示，TRG10mRNA轉錄物(大小為大約6.0kb的優(yōu)勢TRG10 mRNA轉錄物)顯示在如心臟、肝臟、外周血白細胞和脾臟的正常組織中表
達，但在如腦、肌肉、大腸、胸腺、腎臟、小腸、胎盤和肺的正常組織中不 表達。
圖55顯示的是確定TRG10原癌基因在人癌細胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA 印跡的結果。圖55的下部顯示的是由相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖55所示，顯示TRG10 mRNA 轉錄物(大小為大約6.0kb的優(yōu)勢TRG10 mRNA轉錄物)在HeLa子宮癌細 胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562和淋巴母細胞白血病細胞系MOLT-4中 為非常高的表達，在早幼粒白血病細胞系HL-60、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、 結腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為高表達。 大小為大約3.0kb的TRG10 mRNA轉錄物也在癌細胞系中存在表達。
圖24的上部顯示的是確定TRG11原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌 組織、轉移宮頸淋巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達 的RNA印跡結果。如圖24所示，顯示TRGll原癌基因的表達水平增高，也 就是說，大小為大約1.5kb的優(yōu)勢TRGll mRNA轉錄物在宮頸癌組織、轉移 宮頸癌組織以及宮頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中過表達。圖24中，"正常" 泳道代表正常外宮頸組織，"癌，，泳道代表宮頸癌組織，"轉移"泳道代表轉移宮 頸淋巴結組織以及各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖24的下 部顯示的是由相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉 錄的RNA印跡結果。
圖40顯示的是確定TRG11原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech) 如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和 外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡的結果。圖40的下部顯示的是由 相同樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明|3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印 跡結果。如圖40所示，顯示TRG11 mRNA轉錄物(大小為大約1.5kb的優(yōu)勢 TRG11 mRNA轉錄物)在如心臟、肝臟的正常組織中表達，但在如腦、肌肉、 大腸、胸腺、脾臟、腎臟、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞的正常組織中幾 乎不表達。
圖56顯示的是確定TRG11原癌基因在人癌細胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA 印跡的結果。圖56的下部顯示的是由相同樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明卩-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖56所示，顯示TRG11 mRNA 轉錄物(大小為大約1.5kb的優(yōu)勢TRGllmRNA轉錄物)在早幼粒白血病細 胞系HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細 胞白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、 肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為高表達。并且，大小為大約1.3kb 的TRG11 mRNA轉錄物在癌細胞系中罕見表達。
圖25的上部顯示的是確定TRG12原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌 組織、轉移宮頸淋巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達 的RNA印跡的結果。如圖25所示，顯示TRG12原癌基因的表達水平增高， 也就是說，大小為大約5.0kb的優(yōu)勢TRG12mRNA轉錄物在宮頸癌組織和宮 頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中過表達。圖25中，"正常，，泳道代表正常外宮 頸組織，"癌，，泳道代表宮頸癌組織，"轉移，，泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以及 各"CaSki"和"CUMC-6，，泳道代表子宮癌細胞系。圖25的下部顯示的是由相同 樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結 果。
圖41顯示的是確定TRG12原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech) 如腦、心臟、橫統(tǒng)肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和 外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡的結果。圖41的下部顯示的是由 相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印
跡結果。如圖41所示，顯示TRG12mRNA轉錄物(大小為大約5.0kb的優(yōu)勢 TRG12mRNA轉錄物)在如腦、心臟、肌肉、腎臟、肝臟、胎盤和外周血白 細胞的正常組織中罕見表達，但在如大腸、胸腺、脾臟、小腸和肺的正常組 織中幾乎不表達。
圖57顯示的是確定TRG12原癌基因在人癌細胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA 印跡的結果。圖57的下部顯示的是由相同樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖57所示，顯示TRG12 mRNA 轉錄物(大小為大約5.0kb的優(yōu)勢TRG12 mRNA轉錄物)在早幼粒白血病細 胞系HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細 胞白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、 肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為非常高的表達。
圖26的上部顯示的是確定TRG13原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌 組織、轉移宮頸淋巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達 的RNA印跡的結果。如圖26所示，顯示TRG13原癌基因的表達水平增加， 也就是"i兌，在宮頸癌組織和宮頸癌細^^系CaSki和CUMC-6中，大小為大約 4.0kb的優(yōu)勢TRG13 mRNA轉錄物過表達。圖26中，"正常，，泳道代表正常外 宮頸組織，"癌，，泳道代表宮頸癌組織，"轉移"泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以 及各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖26的下部顯示的是由相 同樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡 結果。
圖42顯示的是確定TRG13原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech) 如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和 外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡的結果。圖42的下部顯示的是由 相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印
跡結果。如圖42所示，顯示TRG13 mRNA轉錄物(大小為大約4.0kb的優(yōu)勢 TRG13 mRNA轉錄物)在如心臟和肌肉的正常組織中表達，但在如腦、大腸、 胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤和外周血白細胞的正常組織中罕見表 達。并且，同時大小為大約5.0kb的TRG13mRNA轉錄物罕見表達。
圖58顯示的是確定TRG13原癌基因在人癌細胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA 印跡的結果。圖58的下部顯示的是由相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明卩-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖58所示，顯示TRG13 mRNA 轉錄物(大小為大約4.0kb的優(yōu)勢TRG13mRNA轉錄物)在早幼粒白血病細 胞系HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細 胞白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、 肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為非常高的表達。同時大小為大約 5.0kb的TRG13 mRNA也為高表達。
圖27的上部顯示的是確定TRG14原癌基因正常外宮頸組織、宮頸癌組 織、轉移宮頸淋巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否在表達 的RNA印跡的結果。如圖27所示，顯示TRG14原癌基因的表達水平增高， 也就是說，大小為大約3.5kb的優(yōu)勢TRG14 mRNA轉錄物在宮頸癌組織和宮 頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中過表達。圖27中，"正常"泳道代表正常外宮 頸組織，"癌，，泳道代表宮頸癌組織，"轉移，，泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以及 各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖27的下部顯示的是由相同 樣本和|3-肌動蛋白4笨針雜交表明p-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結 果。
圖43顯示的是確定TRG14原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech) 如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和 外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡的結果。圖43的下部顯示的是由
相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印 跡結果。如圖43所示，顯示TRG14mRNA轉錄物(大小為大約3.5kb的優(yōu)勢 TRG14 mRNA轉錄物)在如心臟和肌肉的正常組織中表達，但在如腦、大腸、 胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞的正常組織中罕 見表達。
圖59顯示的是確定TRG14原癌基因在人癌細胞系如HL-60、 HeLa、 K隱562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA 印跡的結果。圖59的下部顯示的是由相同樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明卩-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖59所示，顯示TRG14 mRNA 轉錄物(大小為大約3.5kb的優(yōu)勢TRG14mRNA轉錄物)在早幼粒白血病細 胞系HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細 胞白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、 肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為非常高的表達。
圖28的上部顯示的是確定TRG15原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌 組織、轉移宮頸淋巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達 的RNA印跡的結果。如圖28所示，顯示TRG15原癌基因的表達水平增高， 也就是說，大小為大約3.5kb的優(yōu)勢TRG15 mRNA轉錄物在宮頸癌組織和宮 頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中過表達。圖28中，"正常"泳道代表正常外宮 頸組織，"癌，，泳道代表宮頸癌組織，"轉移"泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以及 各"CaSki，，和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖28的下部顯示的是由相同 樣本和p-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結 果。
圖44顯示的是確定TRG15原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech) 如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和 外周血白細胞組織中是否表達的 RNA 印跡的結果。
圖44的下部顯示的是由相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白 mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖44所示，顯示TRG15 mRNA轉錄物 (大小為大約3.5kb的優(yōu)勢TRG15 mRNA轉錄物)在如心臟和肌肉的正常組 織中表達，但在如腦、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和 外周血白細胞的正常組織中非常罕見表達。同時大小為大約3.0kb和4.0kb的 TRG15 mRNA轉錄物也非常罕見表達。
圖60顯示的是確定TRG15原癌基因在人癌細胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA 印跡的結果。圖60的下部顯示的是由相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明卩-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖60所示，顯示TRG15 mRNA 轉錄物(大小為大約3.5kb的優(yōu)勢TRG15 mRNA轉錄物)在早幼粒白血病細 胞系HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細 胞白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、 肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為非常高的表達。同時，大小為大 約3.0kb和4.0kb的TRG15 mRNA轉錄物也為非常高的表達。
圖29的上部顯示的是確定TRG16原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌 組織、轉移宮頸淋巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達 的RNA印跡的結果。如圖29所示，顯示TRG16原癌基因的表達水平增高， 也就是說，大小為大約4.5kb的優(yōu)勢TRG16 mRNA轉錄物在宮頸癌組織和宮 頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中過表達。圖29中，"正常，，泳道代表正常外宮 頸組織，"癌，，泳道代表宮頸癌組織，"轉移"泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以及 各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖29的下部顯示的是由相同 樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結 果。
圖45顯示的是確定TRG16原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech)
如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和
外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡的結果。圖45的下部顯示的是由 相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印 跡結果。如圖45所示，顯示TRG16mRNA轉錄物(大小為大約3.5kb的優(yōu)勢 TRG16mRNA轉錄物)在如腦和心臟的正常組織中表達，但在如肌肉、大腸、 胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞的正常組織中非 常罕見表達。同時大小為大約5.0kb的TRG16mRNA轉錄物也非常罕見表達。
圖61顯示的是確定TRG16原癌基因在人癌細胞系如HL-60、 HeLa、 K畫562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA 印跡的結果。圖61的下部顯示的是由相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明卩-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖61所示，顯示TRG16 mRNA 轉錄物(大小為大約4.5kb的優(yōu)勢TRG16 mRNA轉錄物)在HeLa子宮癌細 胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細胞白血病細胞系MOLT-4、結 腸癌細胞系SW480、肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為非常高的表 達。同時，大小為大約5.0kb的TRG16 mRNA轉錄物也為高表達。
圖30的上部顯示的是確定TRG17原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌 組織、轉移宮頸'淋巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達 的RNA印跡的結果。如圖30所示，顯示TRG17原癌基因的表達水平增高， 也就是說，大小為大約1.3kb的優(yōu)勢TRG17 mRNA轉錄物在宮頸癌組織和宮 頸癌細^^系CaSki和CUMC-6中為過表達。圖30中，"正常"泳道代表正常外 宮頸組織，"癌，，泳道代表宮頸癌組織，"轉移，，泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以 及各"CaSki，，和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖30的下部顯示的是由相 同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡 結果。
圖46顯示的是確定TRG17原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech)
如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和
外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡的結果。圖46的下部顯示的是由 相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印 跡結果。如圖46所示，顯示TRG17mRNA轉錄物(大小為大約1.3kb的優(yōu)勢 TRG17 mRNA轉錄物)在如腦、心臟和肌肉的正常組織中表達，但在如大腸、 胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞的正常組織中非 常罕見表達。
圖62顯示的是確定TRG17原癌基因在人癌細胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 M0LT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA 印跡的結果。圖62的下部顯示的是由相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明卩-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖62所示，顯示TRG17 mRNA 轉錄物(大小為大約1.3kb的優(yōu)勢TRG17mRNA轉錄物)在早幼粒白血病細 胞系HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細 胞白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、 肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為非常高的表達。
圖31的上部顯示的是確定TRG18原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌 組織、轉移宮頸;休巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達 的RNA印跡的結果。如圖31所示，顯示TRG18原癌基因的表達水平增高， 也就是說，大小為大約2.4kb的優(yōu)勢TRG18 mRNA轉錄物在宮頸癌組織和宮 頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中為過表達。圖31中，"正常，，泳道代表正常外 宮頸組織，"癌，，泳道代表宮頸癌組織，"轉移"泳道代表轉移宮頸淋巴結組織以 及各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖31的下部顯示的是由相 同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡 結果。
圖47顯示的是確定TRG18原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech)
如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和 外周血白細胞組織中是否表達的認A印跡的結果。圖47的下部顯示的是由
相同樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印 跡結果。如圖47所示，顯示TRG18mRNA轉錄物(大小為大約2.4kb的優(yōu)勢 TRG18 mRNA轉錄物)在如腦、心臟、肌肉、腎臟、肝臟和胎盤的正常組織 中罕見表達，但在如大腸、胸腺、脾臟、小腸、肺和外周血白細胞的正常組 織中無表達。同時，大小為大約1.5kb的TRG18mRNA轉錄物也非常罕見表 達。
圖63顯示的是確定TRG18原癌基因在人癌細胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA 印跡的結果。圖63的下部顯示的是由相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明卩-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖63所示，顯示TRG18 mRNA 轉錄物(大小為大約2.4kb的優(yōu)勢TRG18 mRNA轉錄物)在早幼粒白血病細 胞系HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細 胞白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、 肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為非常高的表達。同時，大小約為 1.5kb的TRG18 mRNA轉錄物也為高表達。
圖32的上部顯示的是確定TRG20原癌基因在正常外宮頸組織、宮頸癌 組織、轉移宮頸淋巴結組織和宮頸癌細胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表達 的RNA印跡的結果。如圖32所示，顯示TRG20原癌基因的表達水平增高， 也就是說，大小為大約1.3kb的優(yōu)勢TRG20mRNA轉錄物在宮頸癌組織以及 宮頸癌細胞系CaSki和CUMC-6中為過表達。圖32中，"正常"泳道代表正常 外宮頸組織，"癌"泳道代表宮頸癌組織，"轉移"泳道代表轉移宮頸淋巴結組織 以及各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宮癌細胞系。圖32的下部顯示的是由 相同樣本和(3-肌動蛋白探針雜交表明(3-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印
跡結果。
圖48顯示的是確定TRG20原癌基因在正常人12-泳道多組織(Clontech) 如腦、心臟、橫紋肌、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝臟、小腸、胎盤、肺和 外周血白細胞組織中是否表達的RNA印跡結果。圖48的下部顯示的是由相 同樣本和J3-肌動蛋白探針雜交表明P-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡 結果。如圖48所示，顯示TRG20 mRNA轉錄物(大小為大約1.3kb的優(yōu)勢 TRG20 mRNA轉錄物)在如腦、心臟、肌肉、大腸、胸腺、脾臟、腎臟、肝 臟、小腸、胎盤、肺和外周血白細胞的正常組織中非常罕見表達或無表達。
圖64顯示的是確定TRG20原癌基因在人癌細胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表達的RNA 印跡的結果。圖64的下部顯示的是由相同樣本和P-肌動蛋白探針雜交表明卩-肌動蛋白mRNA是否轉錄的RNA印跡結果。如圖64所示，顯示TRG20 mRNA 轉錄物(大小為大約1.3kb的優(yōu)勢TRG20 mRNA轉錄物)在早幼粒白血病細 胞系HL-60、 HeLa子宮癌細胞系、慢性髓性白血病細胞系K-562、淋巴母細 胞白血病細胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤細胞系Raji、結腸癌細胞系SW480、 肺癌細胞系A549和皮膚癌細胞系G361中為非常高的表達。
實施例8:對TRG原癌基因轉化大腸桿菌后表達的蛋白質大小的確定
將SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO: 5、 SEQ IDNO: 9、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 17、 SEQIDNO:21、 SEQ ID NO: 25、 SEQIDNO:29、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 41 、 SEQ ID NO: 45、 SEQ ID NO: 49、 SEQ ID NO: 53、 SEQ ID NO: 57和SEQ ID NO: 61的各TRG原癌基因插入pBAD/thio-Topo 載體(Invitrogen，美國)的多克隆位點，然后由各得到的pBAD/thio-T叩o載體 轉化大腸桿菌ToplO (Invitrogen，美國)。將表達蛋白質，HT-硫氧還蛋白插入 pBAD/thio-T叩o載體多克隆位點的上游區(qū)。各轉化的大腸桿菌菌抹在LB肉 湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)同時震蕩，然后各得到的培養(yǎng)物按1/100的比例稀釋并再培養(yǎng)
3小時。于其中加入0.5mM左旋-阿拉伯糖(Sigma)以促進其蛋白質的生成。 在左旋-阿拉伯糖誘導前/后將大腸桿菌細胞在培養(yǎng)基中超聲處理，然后經 超聲處理的勻漿進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE )。
圖65顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG3載體轉化的大腸桿菌 ToplO菌抹中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為67kDa的融合蛋白條帶。67-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-石克氧還蛋白和分子量大約為52kDa的TRG3 蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG3載體中。
圖66顯示的是確定在由pBAD/thio-T叩o/TRG4載體轉化的大腸桿菌 ToplO菌抹中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為29kDa的融合蛋白條帶。29-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為14kDa的TRG4 蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG4載體中。
圖67顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG5載體轉化的大腸桿菌 T叩IO菌抹中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為52kDa的融合蛋白條帶。52-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為37kDa的TRG5 蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG5載體中。
圖68顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG6載體轉化的大腸桿菌 ToplO菌抹中蛋白質表達模式的SDS-PAGE的結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘 導后可以清楚的觀察到分子量大約為24kDa的融合蛋白條帶。24-kDa的融合 蛋白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為9kDa的 TRG6蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG6載體中。
圖69顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG7載體轉化的大腸桿菌ToplO菌林中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為35kDa的融合蛋白條帶。35-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為20kDa的TRG7 蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG7載體中。
圖70顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG9載體轉化的大腸桿菌 Top10菌抹中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為73kDa的融合蛋白條帶。73-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為58kDa的TRG9 蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG9載體中。
圖71顯示的是確定在由pBAD/thio-T叩o/TRG10載體轉化的大腸桿菌 Top10菌抹中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為21kDa的融合蛋白條帶。21-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為6kDa的TRG10 蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG 10載體中。
圖72顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG11載體轉化的大腸桿菌 Top10菌抹中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為22kDa的融合蛋白條帶。22-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為7kDa的TRG11 蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG 11載體中。
圖73顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG12載體轉化的大腸桿菌 Top10菌株中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為29kDa的融合蛋白條帶。29-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為14kDa的 TRG12蛋白，將各蛋白插入pBAD他io-Topo/TRG 12載體中。
圖74顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG13載體轉化的大腸桿菌
ToplO菌林中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為55kDa的融合蛋白條帶。55-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為40kDa的 TRG13蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG13載體中。
圖75顯示的是確定在由pBAD/thio-T叩o/TRG14載體轉化的大腸桿菌 ToplO菌抹中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為58kDa的融合蛋白條帶。58-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為43kDa的 TRG14蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG 14載體中。
圖76顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG15載體轉化的大腸桿菌 ToplO菌林中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為57kDa的融合蛋白條帶。57-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為42kDa的 TRG15蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRGl 5載體中。
圖77顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG16載體轉化的大腸桿菌 ToplO菌抹中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為51kDa的融合蛋白條帶。51-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為36kDa的 TRG16蛋白，將各蛋白被插入pBAD/thio-T叩o/TRG16載體。
圖78顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG17載體轉化的大腸桿菌 ToplO菌林中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為31kDa的融合蛋白條帶。31-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為16kDa的 TRG17蛋白，將各蛋白插入pBAD池io-T叩o/TRG 17載體中。
圖79顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG18載體轉化的大腸桿菌
ToplO菌株中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為57kDa的融合蛋白條帶。57-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為42kDa的 TRG18蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRGl8載體中。
圖80顯示的是確定在由pBAD/thio-Topo/TRG20載體轉化的大腸桿菌 Top10菌抹中蛋白質表達模式的SDS-PAGE結果，其中在左旋-阿拉伯糖誘導 后可以清楚的觀察到分子量大約為31kDa的融合蛋白條帶。31-kDa的融合蛋 白包括分子量大約為15kDa的HT-硫氧還蛋白和分子量大約為16kDa的 TRG20蛋白，將各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG20載體中。
工業(yè)可行性
如上所述，本發(fā)明的原癌基因，已知是與人類癌發(fā)生有關并同時表現(xiàn)出 誘導癌癥轉移的能力，可以有效的用于診斷包括子宮癌、白血病、淋巴瘤、 結腸癌、肺癌、皮膚癌等的多種癌癥。
權利要求
1、一種人原癌蛋白，具有選自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ ID NO18、SEQ ID NO22、SEQID NO26、SEQ ID NO30、SEQ ID NO34、SEQ ID NO38、SEQ IDNO42、SEQ ID NO46、SEQ ID NO50、SEQ ID NO54、SEQ ID NO58和SEQ ID NO62組成的組的氨基酸序列。
2、 一種人原癌基因，其編碼權利要求1中限定的原癌蛋白。
3、 根據(jù)權利要求2所述的人原癌基因，其含有選自由與SEQ ID NO: 1從113至1,522核苦酸序列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 5 從87至482核苷酸序列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 9從88 至1,092核苷酸序列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 13從233 至481核苷酸序列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 17從42至 1,422核苷酸序列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 21從17至 1,576核苷酸序列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 25從1100 至1，270核苷酸序列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 29從26 至214核苷酸序列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 33從80至 475核苷酸序列位置對應DNA序列、與SEQ ID NO: 37從18至1,193 核苷酸序列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 41從18至1,202 核苷酸序列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 45從1至1,104核 苷酸序列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 49從92至1,064核苷 酸序列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 53 乂人1至408核苷酸序 列位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 57從20至1,141核苷酸序列 位置對應的DNA序列、與SEQ ID NO: 61從42至449核苷酸序列位 置對應的DNA序列組成的組中的DNA序列。
4、 根據(jù)權利要求2所述的人原癌基因，其具有選自由SEQ ID NO.' 1、 SEQ ID NO: 5、 SEQIDNO:9、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 21 、 SEQ ID NO: 25 、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 33 、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 45、 SEQ ID NO: 49、 SEQ ID NO: 53 、 SEQ ID NO: 57和SEQ ID NO: 61組成的組的DNA序列。
5、 一種載體，其包括權利要求2至4中任一項限定的原癌基因。
6、 一種用于診斷癌癥的試劑盒，其包括權利要求1中限定的原癌 蛋白。
7、 一種用于診斷癌癥的試劑盒，其包括權利要求2至4中任一項 限定的原癌基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種原癌基因和由該基因編碼的蛋白質。已知本發(fā)明的原癌基因與人類癌發(fā)生有關，可有效的用于診斷包括子宮癌、白血病、淋巴瘤、結腸癌、肺癌、皮膚癌等的多種癌癥。
文檔編號C07K14/435GK101184773SQ200680018673
公開日2008年5月21日 申請日期2006年3月30日 優(yōu)先權日2005年3月30日
發(fā)明者金弦起, 金振宇 申請人:金弦起