專利名稱：：高親和力Melan-AT細胞受體的制作方法髙親和力Melan-AT細胞受體本發(fā)明涉及具有結合AAGIGILTV-HLA-A*0201特性并含有至少一個TCRa鏈可變區(qū)和/或至少一個TCR卩鏈可變區(qū)的T細胞受體(TCR)，其特征在于，所述TCR對所述AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物的KD小于或等于3和/或解離速率(k。ff)為1X1(T3S—i或更慢。
背景技術：
：AAGIGILTV肽衍生自由大多數(shù)黑色素瘤新鮮樣品和約60%黑色素瘤細胞系以及正常黑色素細胞所表達的Melan-A(Mart-1)蛋白(Coulie等，(1994)J.￡xp.Met/.180:(1)1-4和Kawakami等，(1994)尸iVA5f/SJ91:3515)。這些癌性細胞的I類HLA分子呈遞含有AAGIGILTV(SEQIDNO:43)(Melan-A27.35)的來自該蛋白的肽。AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物看來是黑色素瘤特異性T細胞的免疫顯性靶標(Kawakami等，(1994)/WW園91:3515)和(Rivoltini等，(1995)丄^mtmo/154:2257)。因此，例如為向癌細胞遞送細胞毒性或免疫刺激性藥物，該肽-HLA復合物提供了TCR所能靶向的一種癌癥標記。然而，對于該目的，如果與對肽-HLA復合物具有特異的天然TCR相比，該TCR對該復合物具有更高親和力和/或更慢的解離速率則更理想。發(fā)明簡述本發(fā)明首次利用了與AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物相互作用具有小于或等于3pM的高親和力(KD)和/或?qū)υ搹秃衔锏慕怆x速率(k。ff)為1X10—3S—1或更慢的TCR。這種TCR可單用或與治療性藥物聯(lián)用來靶向呈遞該復合物的癌細胞。發(fā)明詳述本發(fā)明提供具有結合AAGIGILTV-HLA-A*0201特性并含有至少一個TCRa鏈可變區(qū)和/或至少一個TCRp鏈可變區(qū)的T細胞受體(TCR)，其特征在于，所述TCR對所述AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物的KD小于或等于3和/或?qū)AGIGILTV-HLA-A*0201復合物的解離速率(off-rate)(k。ff)為1X1(T3S"或更慢。在本發(fā)明的另一實施方式中，所述TCR對AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物的Kd小于或等于1pM?？赏ㄟ^任何己知的方法測定KD。優(yōu)選方法是實施例4的表面等離振子共振(Biacore)方法。為了比較，通過實施例4的Biacore方法測定天然MELTCR(TCRa鏈見SEQIDNO:9和TCR卩鏈見SEQIDNO:IO)的二硫鍵連接的可溶性變體與AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物相互作用的KD約為4pM。AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物的特異性天然MELTCR具有以下Voc鏈和V|3鏈基因應用(geneusage)(使用TcellreceptorFactsbook(《T細胞受體手冊》)，(2001)LeFranc禾口LeFranc，AcademicPress,ISBN0-12誦441352-8中的術語，參見下文)a鏈-TRAV12-2(3鏈:-TRBV30。天然MELTCR可用作模板在其中引入各種突變從而使得本發(fā)明TCR和AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物之間相互作用的親和力高和/或解離速率慢。因此，與天然MELTCRa鏈可變區(qū)(見附圖la和SEQIDNo:1)和/或|3鏈可變區(qū)(見附圖lb和SEQIDNO:2)相比，本發(fā)明包括的TCR在其至少一個互補決定區(qū)(CDR)和/或可變區(qū)框架區(qū)中發(fā)生突變。還考慮了本發(fā)明TCR可變區(qū)中的其它超變區(qū)，例如超變4(HV4)區(qū)，可發(fā)生突變從而能產(chǎn)生高親和力的突變體。天然TCR以異二聚體a(3或YS形式存在。然而，由一條TCRa鏈或TCR卩鏈構成的重組TCR已顯示能與肽MHC分子結合。在一個實施方案中，本發(fā)明TCR同時包含a鏈可變區(qū)和TCRp鏈可變區(qū)。本領域技術人員明顯可知TCRa鏈序列和/或TCR卩鏈序列中的突變可以是一個或多個取代、缺失或插入?？捎萌魏魏线m的方法來產(chǎn)生這些突變，包括但不限于基于聚合酶鏈式反應(PCR)、基于限制性內(nèi)切酶克隆或不依賴于連接反應的克隆(LIC)方法。這些方法詳述于許多標準的分子生物學教材中。關于聚合酶鏈式反應(PCR)誘變和基于限制性內(nèi)切酶克隆的其它細節(jié)可見(Sambrook和Russell，(2001)，MolecularCloning-ALaboratoryManual(《分子克隆-實驗室手冊》)，(第三版)，CSHLPress)。LIC方法的其它信息可見(Rashtchian，(1995)，CwrrQp/"所o/ec/z"o/，6(1):30-6)。噬菌體展示為產(chǎn)生TCR變體文庫提供了一種手段。(Li箏，(2005)A^/we23(3):349-354)和WO2004/04404詳述了適于噬菌體展示和隨后的TCR變體文庫篩選的方法，所述各TCR變體均含有非天然鏈間二硫鍵。應注意含有與天然MELTCR相似的Va和V卩基因應用和因此相同的氨基酸序列的任何a(3TCR可用作方便的模板TCR。然后可能將產(chǎn)生本發(fā)明突變的高親和力TCR所需的改變引入編碼模板apTCR的一個或兩個可變區(qū)的DNA中。本領域技術人員顯然知道可通過許多方法，例如定點誘變，來引入所需的突變。除非有相反陳述，本文的TCR氨基酸序列一般含有N-末端甲硫氨酸(Met或M)殘基。本領域技術人員可知該殘基可在重組蛋白的產(chǎn)生過程中除去。本領域技術人員也顯然知道，可將其C-末端和/或N-末端的序列截短1、2、3、4、5或更多個殘基，而基本上不影響該TCR的pMHC結合性能，本發(fā)明包括所有這些變化細微的變體。本文所用的術語"可變區(qū)"應理解為包括某給定TCR中不包含在由TCRa鏈的TRAC基因或TCR(3鏈的TRBC1或TRBC2基因所編碼的恒定區(qū)內(nèi)的所有氨基酸。(TcellreceptorFactsbook(《T細胞受體手冊》)，(2001)，LeFranc和LeFranc,科學出版社，ISBN0-12-441352-8)。本文所用的術語"可變域"應理解為包括某給定TCR中由TCRoc鏈的TRAC基因或TCRp鏈的TRBV基因所編碼的所有氨基酸。(TcellreceptorFactsbook(《T細胞受體手冊》)，(2001)，LeFranc和LeFranc，科學出版社，ISBN0-12-441352-8)。本發(fā)明的實施方式包括含有對應于以下的一個或多個a鏈可變區(qū)氨基酸發(fā)生突變的突變TCR:28D、29R、30G、31S、49M、511、53S、54N、72Y、94V、95A、96G、97K、98S和99T，例如對應于以下的突變28D—F,28D—Y，28D—S，28D—N，29R—Q，29R—L,29R—I，29R—F,30G—H，31S—A,49M—I，511—T，53S—R，54N—E，72Y—H，94V—D,94V—P，94V—S,94V—L，94V—N，95A—G，95A—S，95A~>E，96G~>N，96G—P，96G一V，96G—M，96G—L，96G—R，97K—R，97K—Y，97K—V，97K—L，97K—H，97K—G,97K—I,97K~>P，98S—L，98S—M，98S—R,99T—L或99T—R以上采用的編號與圖la和SEQIDNo:1所示相同。本發(fā)明實施方式包括含有對應于以下的一個或多個TCR卩鏈可變區(qū)氨基酸發(fā)生突變的突變TCR:45L、51S、52V、53G、541、761、100G、101T、102G、103E、104L和105F，所采用的編號如SEQIDNO:2所示，例如對應于以下的突變45L—P，51S—Y，51S—F，51S—W,52V—G,53G—P,541—F，54—Y，761—V，100G—N,101T—M，101T—L，101T—V，102G—S，102G—N，102G—T，103E—G,104L—W，105F—S,105F—A，105F—Q,105F~>D或105F—E以上采用的編號與圖lb和SEQIDNo:2所示相同。本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式是含有圖6(SEQIDNo:11-24)或圖20(SEQIDNO:47-53)所示突變的oc鏈可變區(qū)氨基酸序列的TCR。這種TCR的表型沉默(phenotypicallysilent)變體也構成本發(fā)明一部分。本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式是含有圖21(SEQIDNo:54-67)所示突變的|3鏈可變區(qū)氨基酸序列之一的TCR。這種TCR的表型沉默變體也構成本發(fā)明一部分。天然TCR以異二聚體a(3或YS形式存在。然而，由aa或即同質(zhì)二聚體構成的重組TCR己顯示能與肽MHC分子結合。因此，本發(fā)明的一個實施方式是TCRaa或TCR(3[3同質(zhì)二聚體。本發(fā)明的其它優(yōu)選實施方式是含有下列a鏈可變區(qū)氨基酸序列和p鏈可變區(qū)氨基酸序列組合的TCR，這種TCR的表型沉默變體也構成本發(fā)明一部分a鏈可變區(qū)序列，<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>優(yōu)選實施方式提供含有以下部分的本發(fā)明TCR:SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:2所示的(3鏈可變區(qū)。SEQIDNO:47所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:2所示的|3鏈可變區(qū)。SEQIDNO:48所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:2所示的f3鏈可變區(qū)。SEQIDNO:53所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:2所示的|3鏈可變區(qū)。SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:54所示的(3鏈可變區(qū)。SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:55所示的卩鏈可變區(qū)。SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:56所示的(3鏈可變區(qū)。SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:57所示的(3鏈可變區(qū)。SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:58所示的(3鏈可變區(qū)。SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:62所示的卩鏈可變區(qū)。SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:65所示的(3鏈可變區(qū)。SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:66所示的卩鏈可變區(qū)?；蛞陨先我籘CR的表型沉默變體。在另一優(yōu)選實施方式中，含有以上詳述的可變區(qū)組合的本發(fā)明TCR還含有圖7a所示a鏈恒定區(qū)氨基酸序列(SEQIDNO:25)和圖7b和7c所示p鏈氨基酸恒定區(qū)序列之一(SEQIDNO:26和27)或其表型沉默變體。本文所用的術語"表型沉默變體"應理解為指對所述AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物的KD小于或等于3^lM的那些TCR。例如，與以上詳述的那些TCR相比，本領域技術人員已知可能產(chǎn)生在其恒定和/或可變區(qū)中摻入了微小變化但不改變與AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物相互作用的親和力和/或解離速率的TCR。本發(fā)明范圍包括這類變化細微的變體。其中含有一個或多個保守取代的那些TCR也構成本發(fā)明一部分。就廣義而言，本發(fā)明TCR可以采取如WO04/033685和WO03/020763所述的單鏈TCR(scTCR)或二聚體TCR(dTCR)形式。合適的scTCR形式包括由對應于TCRoc鏈可變區(qū)的氨基酸序列構成的第一區(qū)段，由對應于TCR|3鏈可變區(qū)序列并與對應于TCRP鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構成的第二區(qū)段，和連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端的接頭序列。或者，所述第一區(qū)段可由對應于TCRp鏈可變區(qū)的氨基酸序列構成；所述第二區(qū)段可由對應于TCRct鏈可變區(qū)序列并與對應于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的氮基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構成。以上scTCR在第一和第二鏈之間還可含有二硫鍵，所述二硫鍵在天然a(3T細胞受體中沒有等價鍵，其中該接頭序列的長度和該二硫鍵的位置應使第一和第二區(qū)段的可變區(qū)序列的相互取向基本上如天然apT細胞受體中的那樣。更具體地說，第一區(qū)段可由對應于TCRct鏈可變區(qū)序列并與對應于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構成，第二區(qū)段可由對應于TCRp鏈可變區(qū)序列并與對應于TCRp鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構成，和在第一和第二鏈之間可以存在天然a(3T細胞受體中沒有等價鍵的二硫鍵。在以上scTCR形式中，接頭序列可連接第一區(qū)段C末端和第二區(qū)段N末端，其可如式-PGGG-(SGGGG)n-P-所示，其中n是5或6，P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是絲氨酸。-PGGG隱SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG隱P(SEQIDNO:41)-PGGG-SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG-P(SEQIDNO:42)本發(fā)明TCR的合適dTCR形式含有第一多肽，其中對應于TCRa鏈可變區(qū)序列的序列與對應于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合；和第二多肽，其中對應于TCRp鏈可變區(qū)序列的序列與對應于TCRp鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合；該第一和第二多肽通過在天然a(3T細胞受體中沒有等價鍵的二硫鍵相連。所述第一多肽可含有與對應于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合的TCRa鏈可變區(qū)序列，而第二多肽中對應于TCRp鏈可變區(qū)序列的序列與對應于TCR|3鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合，該第一和第二多肽通過取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵或其非人等價鍵相連。("TRAC"等在本文根據(jù)TcellreceptorFactsbook(《T細胞受體手冊》)，(2001)，LeFranc禾口LeF認c，AcademicPress,ISBN0-12-441352-8命名)。本發(fā)明TCR的dTCR或scTCR形式可具有對應于人apTCR胞外恒定和可變區(qū)序列的氨基酸序列，和在天然TCR中沒有等價鍵的二硫鍵可連接所述恒定區(qū)序列的氮基酸殘基。與在天然TCR中其(3碳原子距離小于0.6nm的氨基酸殘基相對應的半胱氨酸殘基之間存在二硫鍵，例如在取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基或其非人等價物之間。就TCRoc鏈而言，可引入半胱氨酸形成二硫鍵的其它位點是TRACM1外顯子l中的以下殘基，就TCR(3鏈而言，是TRBC"Ol或TRBC2*01外顯子1中的以下殘基<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>本發(fā)明的具體實施方式提供的本發(fā)明TCR是dTCR，其含有第一多肽，其中對應于TCRa鏈可變區(qū)序列的序列與對應于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合；和第二多肽，其中對應于TCRp鏈可變區(qū)序列的序列與對應于TCR(3鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合；該第一和第二多肽通過取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2W1外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵或其非人等價鍵相連，所述二硫鍵在天然a[3T細胞受體中沒有等價鍵。除了以上提及的非天然二硫鍵外，本發(fā)明TCR的dTCR或scTCR形式可在對應于天然TCR中通過二硫鍵連接的那些殘基的殘基之間含有二硫鍵。本發(fā)明TCR的dTCR或scTCR形式優(yōu)選不含有對應于天然TCR的跨膜或細胞質(zhì)序列的序列。目前本發(fā)明優(yōu)選實施方式提供包含以下部分的可溶性TCR:SEQIDNO:29所示a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:10所示卩鏈氨基酸序列；SEQIDNO:68所示a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:10所示卩鏈氨基酸序列；SEQIDNO:69所示a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:10所示(3鏈氨基酸序列；SEQIDNO:70所示a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:10所示卩鏈氨基酸序列；SEQIDNO:29所示a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:71所示卩鏈氨基酸序列'，SEQIDNO:29所示a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:72所示卩鏈氨基酸序列；SEQIDNO:29所示a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:73所示卩鏈氨基酸序列；SEQIDNO:29所示a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:74所示卩鏈氨基酸序列；SEQIDNO:29所示a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:75所示卩鏈氨基酸序列；SEQIDNO:29所示a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:76所示(3鏈氨基酸序列；SEQIDNO:29所示a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:77所示卩鏈氨基酸序列；SEQIDNO:29所示a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:78所示卩鏈氨基酸序列。還提供了編碼本發(fā)明TCR的一種或多種核酸。所述一種或多種核酸可以經(jīng)改造而以適合于在原核或真核宿主細胞中表達的形式提供。合適的宿主細胞包括但不限于細菌、酵母菌、哺乳動物或昆蟲細胞。例如，宿主細胞可以是人T細胞或人造血干細胞。使這種經(jīng)改造的一種或多種核酸發(fā)生突變，從而反映了引入其中的宿主細胞的密碼子偏愛。引入的突變是不影響所編碼的一種或多種多肽的氨基酸序列的沉默突變。GeneArt(Regensburg，德國)提供合適的核酸優(yōu)化服務(GeneOptimizer)。GeneArt擁有的WO2004/059556進一步提供了該優(yōu)化方法的細節(jié)。目前優(yōu)選的本發(fā)明其它實施方式提供了由SEQIDNo:33、35或37(分別是圖12a、13a或14a)所示全長TCRa鏈DNA序列之一和SEQIDNo:39(圖15a所示)所示全長TCRJ3鏈DNA序列構成的核酸。與上述核酸互補的核酸或相應的RNA序列也構成本發(fā)明一部分。此外，本領域技術人員明顯知道編碼本發(fā)明TCR的所述一種或多種核酸也可含有非編碼(內(nèi)含子)序列。SEQIDNo:31、33、35、37和39所示的全長野生型和高親和力MELTCR鏈DNA序列分別編碼SEQIDNo:32、34、36、38和40所示的氨基酸序列。(分別是圖llb、12b、13b、14b和15b)。SEQIDNo:33、35和37所示的氨基酸序列分別包含SEQIDNo:11、15和23所示的高親和力MELTCRa鏈可變區(qū)。本領域技術人員明顯知道這種全長TCR鏈DNA序列編碼以下序列前導序列和胞外、跨膜和胞質(zhì)TCR序列。本文提供的全長DNA序列還包含限制性內(nèi)切酶識別序列以促進連接入所選擇的載體中。P￡G化游rcw卓伴在一具體實施方式中，本發(fā)明TCR與至少一條聚亞垸基二醇鏈結合。本領域技術人員已知有許多方法可產(chǎn)生這種結合。在一優(yōu)選實施方式中，一條或多條所述聚亞烷基二醇鏈與TCR共價相連。在另一實施方式中，本發(fā)明該方面的聚乙二醇鏈含有至少兩個聚乙烯重復單位。多份rc/復合激本發(fā)明一方面提供含有至少兩個本發(fā)明TCR的多價TCR復合物。在該方面的一個實施方式中，至少兩個TCR分子經(jīng)接頭部分相連形成多價復合物。這些復合物優(yōu)選為水溶性的，所以應照此選擇接頭部分。此外，接頭部分優(yōu)選能與TCR分子上確定的位置相連，從而盡可能降低所形成復合物的結構多樣性。該方面的一個實施方式所提供的本發(fā)明TCR復合物中聚合物鏈或肽接頭序列延伸于各TCR中不位于該TCR可變區(qū)序列中的氨基酸殘基之間。由于本發(fā)明復合物可用作藥物，接頭部分的選擇應考慮它們的藥學適用性，例如它們的免疫原性。本領域已知能滿足以上所需標準的接頭部分的例子，例如連接抗體片段的技術。兩類接頭優(yōu)選用于產(chǎn)生本發(fā)明的多價TCR分子。其中的TCR通過聚亞垸基二醇鏈相連的本發(fā)明TCR復合物提供了該方面的一個實施方式。第一類是親水性聚合物，例如聚亞垸基二醇。此類中最常用的基于聚乙二醇或PEG，其結構如下式所示。HOCH2CH20(CH2CH20)n-CH2CH2OH其中n大于2。然而，其它聚合物可以是基于其它合適的、任選取代的聚亞烷基二醇，包括聚丙二醇，和乙二醇與丙二醇的共聚物。這種聚合物可用于處理或偶聯(lián)治療劑，特別是多肽或蛋白質(zhì)治療劑來有益地改變該治療劑的PK分布，例如降低腎廓清率、延長血漿半衰期、降低免疫原性和改善溶解性。據(jù)信，一個或多個PEG分子圍繞治療劑形成的"外殼"能在立體上阻礙此治療劑與免疫系統(tǒng)反應并降低蛋白水解降解，從而改善PEG-治療劑偶聯(lián)物的PK分布。(Casey等，(2000)，r"mwT^g"""g，4235-244)。所用親水性聚合物的大小可根據(jù)TCR復合物預定的治療應用來具體選擇。因此，例如當要該產(chǎn)品離開循環(huán)(系統(tǒng))滲入組織時，如用于治療腫瘤時，宜使用5KDa級的低分子量聚合物。已有許多綜述文章和書籍詳細描述了PEG和類似分子在藥物制劑中的應用。例如，參見Harris,(1992)，尸o(y"/zy/eneG(yco/C7zem^"-B/ofecAm'ca/awt/5/ome<i/c/^^//cfl//om(《聚乙二醇化學-生物技術和生物醫(yī)藥應用》)，Plenum,紐約，紐約州或Harris禾口Zalipsky，(1997)，CTze/m^^yaw/q/"尸0/3;e^y/eweG/_yc0/」C^>o/b(《聚乙二醇化學和生物學應用ACS手冊》)，華盛頓，哥倫比亞特區(qū)。所用的聚合物可具有線形或分支構型?？赏ㄟ^加入分支部分，包括甘油和甘油寡聚物、季戊四醇、山梨醇和賴氨酸來誘生分支PEG分子或其衍生物。該聚合物一般在其結構中，例如在其一端或兩端，和/或骨架的支鏈處具有化學反應活性基團，從而使該聚合物能與TCR中的靶位點相連。如下所示，所述一個或多個化學反應活性基團可與親水性聚合物直接相連，或者在親水性聚合物和反應活性化學(基團)之間可以具有間隔基團/部分反應活性化學(基團)-親水性聚合物-反應活性化學(基團)反應活性化學(基團)-間隔物-親水性聚合物-間隔物-反應活性化學(基團)用于形成以上概述類型的構建物的間隔物可以是無反應活性、化學穩(wěn)定的、鏈狀的任何有機部分。這種間隔物包括但不限于以下基團-(CH2)n-，其中r^2到5-(CH2)3NHCO(CH2)2其中二價亞垸基間隔基團位于聚亞烷基二醇鏈和其與該復合物的TCR連接點之間的本發(fā)明TCR復合物是該方面的另一種實施方式。其中聚亞垸基二醇鏈含有至少兩個聚乙二醇重復單位的本發(fā)明TCR復合物是該方面的另一實施方式。本發(fā)明可用的直接或經(jīng)間隔物與反應活性化學(基團)相連的親水性聚合物有許多商業(yè)供應商。這些供應商包括NektarTherapeutics(加利福尼亞州，美國)、NOFCorporation(日本)、Sunbio(韓國)和EnzonPharmaceuticals(新澤西州，美國)。本發(fā)明所用直接或經(jīng)間隔物與反應活性化學(基團)相連的可市售購得的親水性聚合物包括但不限于以下聚合物<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>可利用各種偶聯(lián)化學(基團)將聚合物分子偶聯(lián)于蛋白質(zhì)和肽療劑。選擇最合適的偶聯(lián)化學(基團)在很大程度上取決于所需的偶聯(lián)部位。例如，以下偶聯(lián)化學(基團)已用于連接PEG分子(來源Nektar分子工程目錄2003(NektarMolecularEngineeringCatalogue2003))的一個或多個末端N-馬來酰亞胺乙烯基砜苯并三唑碳酸酯琥珀酰亞胺丙酸酯(Succinimidy1proprionate)琥珀酰亞胺丁酸酯(Succinimidy1butanoate)硫代酯乙醛丙烯酸酯生物素伯胺如上所述，非PEG基聚合物也可為本發(fā)明TCR的多聚化提供合適接頭。例如，可用含有通過脂族鏈相連的馬來酰亞胺末端的部分，例如BMH和BMOE(Pierce,產(chǎn)品號22330和22323)。肽接頭是另一類TCR接頭。這些接頭由氨基酸鏈組成，其作用是在要連接的TCR分子上產(chǎn)生簡單的接頭或多聚化結構域。己采用生物素/鏈霉親和素系統(tǒng)來產(chǎn)生體外結合研究用的TCR四聚體(參見WO/99/60119)。然而，鏈霉親和素是微生物來源的多肽，因此用于治療劑中并不理想。其中的TCR通過源自人多聚化結構域的肽接頭連接的本發(fā)明TCR復合物提供了該方面的另一種實施方式。有許多含多聚化結構域的人蛋白質(zhì)可用于產(chǎn)生多價TCR復合物。例如，p53的四聚化結構域已用于產(chǎn)生scFv抗體片段的四聚體，與單體scFV片段相比，該四聚體顯示血清存留期增加和解離速率明顯降低。(Willuda等，(2001)所o/.C/zem.276(17)14385-14392)。血紅蛋白的四聚化結構域也可能用于該類應用。含有至少兩個TCR的本發(fā)明多價TCR復合物提供了該方面的最后一個實施方式，其中至少一個所述TCR與治療劑結合。一方面，本發(fā)明TCR(或其多價復合物)可選地或者額外地可在其a或(3鏈的C-末端或N-末端包含反應活性半胱氨酸。珍銜稀#鄉(xiāng)一方面，本發(fā)明TCR可以與治療劑或可檢測部分結合。例如，所述治療劑或可檢測部分可與TCR共價相連。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述治療劑或可檢測部分與一條或兩條TCR鏈的C-末端共價相連。一方面，可用可檢測部分，例如適用于診斷目的的標記物，來標記本發(fā)明TCR的scTCR或一條或兩條dTCR鏈。這種標記的TCR可用于檢測AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物的方法中，該方法包括使TCR配體與該TCR配體的特異性TCR(或多聚高親合力TCR復合物)接觸；和檢測與該TCR配體的結合情況。在例如利用生物素化的異二聚體形成的四聚體TCR復合物中，可利用熒光鏈霉親和素提供可檢測標記。這種熒光標記的TCR四聚體適用于FACS分析，例如檢測攜帶這些高親和力TCR的特異性AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物的抗原呈遞細胞?？蓹z測本發(fā)明可溶性TCR的另一種方法是利用TCR特異性抗體，特別是單克隆抗體。有許多可市售購得的抗-TCR抗體，例如aFl和(3Fl可分別識別a和卩鏈的恒定區(qū)。在另一方面，本發(fā)明TCR(或其多價復合物)可選或者額外地可與治療劑結合(例如，共價或其它方式相連)，所述治療劑可以是，例如用于殺傷細胞的毒性部分，或免疫效應分子，如白介素或細胞因子。與非多聚野生型或本發(fā)明的T細胞受體異二聚體相比，本發(fā)明多價TCR復合物對TCR配體的結合能力提高。因此，本發(fā)明多價TCR復合物特別可用于在體外或體內(nèi)追蹤或靶向呈遞特定抗原的細胞，也可用作中間體來產(chǎn)生具有這種用途的其它多價TCR復合物。因此，這些TCR或多價TCR復合物可以體內(nèi)應用的藥學上可接受的制劑提供。本發(fā)明也提供將治療劑遞送至靶細胞的方法，該方法包括在允許潛在的靶細胞與本發(fā)明TCR或多價TCR復合物結合的條件下使二者接觸，所述TCR或多價TCR復合物對AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物具有特異性并結合有治療劑。具體地說，本發(fā)明的可溶性TCR或多價TCR復合物可用于將治療劑遞送至呈遞特定抗原的細胞部位。這可用于許多情況，特別是對付腫瘤。遞送的治療劑應可在局部施加其作用而不只對與其結合的細胞起作用。因此，一種具體方案設想可將抗腫瘤分子與腫瘤抗原特異性的本發(fā)明TCR或多價TCR復合物相連。為此應用，可利用許多治療劑，例如放射性化合物，酶(例如，穿孔素)或化療劑(例如，順鉑)。為保證只在所需部位發(fā)揮毒性作用，可將毒素包裹在與鏈霉親和素相連的脂質(zhì)體內(nèi)從而緩慢釋放該化合物。這防止了毒素在體內(nèi)轉運期間的破壞作用并且保證了TCR與相關的抗原呈遞細胞結合后毒素具有最大作用。其它合適的治療劑包括小分子細胞毒性藥物，即分子量小于700道爾頓，能殺傷哺乳動物細胞的化合物。這種化合物也可包含具有細胞毒性作用的毒性金屬。此外，應該理解這些小分子細胞毒性藥物也包括藥物前體，即能在生理條件下分解或轉變從而釋放細胞毒性藥物的化合物。這種藥物的例子包括順鉑、美登素衍生物、拉奇霉素(rachelmycin)、刺孢霉素、多西他賽、鬼臼亞乙苷、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、依利替康、苯丙氨酸氮芥、米托蒽醌、sorfimer卟啉鈉II(sorfimersodiumphotofrin11)、替莫哇胺、托泊替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreateglucuronate)、奧利斯他汀E(auristatinE)、長春新堿和阿霉素；肽類細胞毒素，即能殺傷哺乳動物細胞的蛋白質(zhì)或其片段。包括但不限于蓖麻毒素、白喉毒素、假單胞菌細菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，即一些元素的不穩(wěn)定同位素，其衰減時發(fā)射一種或多種cc或卩粒子，或Y射線。包括但不限于碘131、錸186、銦lll、銥90、鉍210和213、錒225和砍213;也可利用螯合劑來促進這些放射性核素與高親和力TCR或其多聚體結合；藥物前體，包括但不限于抗體定向的酶藥物前體；免疫刺激劑，即能激活免疫應答的部分。包括但不限于細胞因子，例如IL-2和IFN;超抗原及其突變體；pHLA復合物和趨化因子，例如IL-8、血小板因子4、黑色素瘤生長刺激蛋白等；抗體或其片段；補體激活劑；異種蛋白結構域；同種蛋白結構域；病毒/細菌蛋白結構域；病毒/細菌肽和抗T細胞決定簇抗體(例如，抗-CD3或抗-CD28)。功^性貧沐并皮,變沐適用于本文所述組合物和方法的抗體片段和變體/類似物包括但不限于以下。本領域技術人員已知可能產(chǎn)生基本上保留了親代抗體相同結合特性的某給定抗體的片段。下文提供了這種片段的細節(jié)微型抗體(minibody)——這些構建物由具有截短的Fc部分的抗體組成。同樣，它們保留了其所衍生自抗體的完整結合結構域。Fab片段——這些(構建物)包含與免疫球蛋白重鏈的一部分共價相連的一條免疫球蛋白輕鏈。因此，F(xiàn)ab片段包含一個抗原結合位點。Fab片段定義為可用木瓜蛋白酶處理IgG而釋放的那部分。這種片段一般可用重組DNA技術生產(chǎn)。(Reeves等，(2000)，丄ec","jVwmo"/mww"o/ogy(《免疫學講稿》)，(第四版)，BlackwellScienceF(ab')2片段一一這些(構建物)同時包含一種抗體的抗原結合位點和絞鏈區(qū)。F(ab')2片段定義為可用胃蛋白酶處理IgG而釋放的部分。這種片段一般可用重組DNA技術生產(chǎn)。(Reeves等，(2000)，丄ec/wreo"/wim/"o/ogy(《免疫學講稿》)，(第四版)，BlackwellScience出版)。Fv片段一一這些(構建物)包含與免疫球蛋白輕(鏈)可變區(qū)共價相連的免疫球蛋白重(鏈)可變區(qū)。已作出了許多Fv設計。這些(構建物)包括通過引入二硫鍵來增強兩結構域之間締合的dsFv?；蛘?，可利用肽接頭將兩個結構域結合到一起成為一條多肽來形成scFv。還產(chǎn)生了含有免疫球蛋白重鏈或輕鏈的可變區(qū)，與相應的免疫球蛋白重鏈或輕鏈的可變或恒定區(qū)相結合的Fv構建物。FV也可多聚化形成雙抗體或三抗體(Maynard等，(2000)，^""wiev5/om^五"g,2339-376)。Nanobodies——由Ablynx(比利時)投入市場的這些構建物包含衍生自駱駝科(camelid)(例如，駱駝或美洲駝)抗體的一個合成的免疫球蛋白重(鏈)可變區(qū)。結構域抗體——由Domantis(比利時)投入市場的這些構建物包含親和力成熟的一個免疫球蛋白重(鏈)可變區(qū)或免疫球蛋白輕(鏈)可變區(qū)。拔伴變沐^7類欽激本發(fā)明抗體的明確功能特性是它們能特異性結合靶配體。本領域技術人員已知可能將這種結合特性工程改造加入到許多其它蛋白質(zhì)中。適用于本發(fā)明組合物和方法的抗體變體和類似物的例子包括但不限于以下?；诘鞍踪|(zhì)支架的結合多肽一一該結合構建物家族包括含天然結合環(huán)的蛋白質(zhì)的突變類似物。例子包括由Affibody(瑞典)投入市場的Affibodies，其是基于衍生自金黃色葡萄球菌OSY"http://^/ococcma"rw力蛋白A的一個IgG結合結構域的三螺旋基序。另一例子是由EvoGenix(澳大利亞)投入市場的Evibodies，其是基于CTLA-4胞外結構域，在該結構域中移植了類似于抗體結合環(huán)的結構域。最后一個例子是由RegeneronPharmaceuticals(美國)投入市場的CytokineTraps,其將細胞因子受體結構域移植入抗體支架中。(Nygren等，(2000)CwreWC>p/m'owS/rw"wra/6/0/0gy，7463-469)是利用支架來工程改造蛋白質(zhì)中新結合位點的綜述。該綜述提及以下蛋白質(zhì)作為支架來源CP1鋅指(結構)、淀粉酶抑制肽(Tendamistat)、Z結構域(蛋白A類似物)、PST1、巻曲螺旋、LACI-D1和細胞色素bs62。其它蛋白質(zhì)支架研究報道采用纖連蛋白、綠色熒光蛋白(GFP)和錨蛋白重復(單位)。本領域技術人員已知可以產(chǎn)生能與某給定蛋白配體不同部分結合的抗體或其片段，變體或類似物。例如，可產(chǎn)生針對形成該復合物的任一多肽鏈(即，y、S、s、C和"CD3鏈)的抗-CD3抗體。能與sCD3鏈結合的抗體是本發(fā)明組合物和方法所用的優(yōu)選抗-CD3抗體。本發(fā)明的可溶性TCR或多價TCR復合物可與能將藥物前體轉化為藥物的酶相連。這可使藥物前體只在所需部位轉變?yōu)樗幬?即，通過sTCR耙向)。預計本文披露的髙親和力AAGIGILTV(SEQIDNO:43)-HLA-A*0201特異性TCR可用于癌癥的診斷和治療方法。對于癌癥治療，將毒素或免疫刺激劑定位在腫瘤或轉移(性腫瘤)附近可提高其效力。對于疫苗遞送，將疫苗抗原定位在抗原呈遞細胞附近可提高該抗原的效力。該方法也可應用于成像目的。一個實施方式提供了呈遞本發(fā)明TCR的分離的細胞。例如，所述細胞可以是人T細胞或人造血干細胞。本發(fā)明的其它實施方式提供了含有以下組分的藥物組合物本發(fā)明的TCR或多價TCR復合物(任選與治療劑結合)，或多個呈遞至少一種本發(fā)明TCR的細胞，或編碼本發(fā)明TCR的一種或多種核酸，及藥學上可接受的載體。本發(fā)明也提供一種癌癥治療方法，包括給予患這種癌癥的對象有效量的本發(fā)明TCR或多價TCR復合物(任選與治療劑結合)，或能呈遞至少一種本發(fā)明TCR的多個細胞，或編碼本發(fā)明TCR的一種或多種核酸。在一相關實施方式中，本發(fā)明提供本發(fā)明的TCR或多價TCR復合物(任選與治療劑結合)，或能呈遞至少一種本發(fā)明TCR的多個細胞，或編碼本發(fā)明TCR的一種或多種核酸在制備治療癌癥的組合物中的應用。本領域技術人員明顯知道適合用包含本發(fā)明TCR的組合物治療的癌癥是Melan-A+癌癥。本發(fā)明的治療性或成像TCR—般可作為通常含有藥學上可接受的載體的無菌藥物組合物的一部分提供。該藥物組合物可采用任何合適的形式(取決于給予患者的所需方法)。該藥物組合物可以單位劑型提供，一般裝在密封容器中或作為試劑盒的一部分提供。這種試劑盒通常(雖然不是必須)裝有使用說明書。其可裝有多個所述單位劑型。該藥物組合物適于用任何合適的途徑給藥，例如胃腸外、透皮或通過吸入給藥，優(yōu)選經(jīng)胃腸外途徑(包括皮下、肌肉內(nèi)或最優(yōu)選靜脈內(nèi)給藥)。可用藥學領域中已知的任何方法制備該組合物，例如在無菌條件下混合活性成分與一種或多種載體或賦形劑。本發(fā)明物質(zhì)的劑量可根據(jù)待治療的疾病或病癥、待治療個體的年齡和情況等而在較大范圍內(nèi)變動，醫(yī)師可最終確定所用的合適劑量。本發(fā)明的scTCR或dTCR(優(yōu)選由對應于人序列的恒定區(qū)或可變區(qū)序列構成)可以是基本純形式、或作為純化或分離的制品提供。例如，可以基本上不含其它蛋白質(zhì)的形式提供。本發(fā)明也提供鑒定具有結合AAGIGILTV-HLA-A*0201特性的高親合力TCR的方法，其特征在于，該TCR(i)含有至少一個TCRot鏈可變區(qū)和/或至少一個TCRp鏈可變區(qū)和(ii)對所述AAGIGILTV-HLA-A*0201夏合物的Kd小于或等于3|aM:所述方法包括(a)制備含有MELTCR的a和p鏈可變區(qū)的TCR的多樣性文庫，其中所述a和p鏈可變區(qū)之一或二者含有一個或多個突變；(b)在適合于TCR與AAGIGILTV-HLA-A*0201結合的條件下使所述TCR的多樣性文庫與AAGIGILTV-HLA-A*0201接觸；和(c)測定該相互作用的KD。本發(fā)明各方面的優(yōu)選特征與己作了必要修正的其它各方面的一樣，本文提及的現(xiàn)有技術文件按照法律所允許的最大程度納入。實施例以下實施例進一步描述了本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下文參考了附圖，其中圖la和lb分別提供了天然MELTCR的oc鏈可變區(qū)氨基酸序列和p鏈可變區(qū)氨基酸序列。圖2a和2b分別提供了可溶形式的天然MELTCRa鏈和卩鏈的DNA序列。圖3a和3b分別提供了從圖2a和2b所示DNA序列產(chǎn)生的MELTCRa和(3鏈胞外氨基酸序列。圖4a和4b分別提供了可溶形式的MELTCRa鏈和卩鏈的DNA序列，其經(jīng)突變而包含了額外的半胱氨酸殘基從而形成非天然二硫鍵。陰影表示各鏈中突變的密碼子，引入的限制性內(nèi)切酶識別位點以下劃線標出。圖5a和5b分別顯示了從圖4a和4b所示DNA序列產(chǎn)生的MELTCRot鏈和卩鏈胞外氨基酸序列。陰影表示各鏈中引入的半胱氨酸。圖6提供了高親和力MELTCR變體的a鏈可變區(qū)氨基酸序列。突變的殘基以下劃線標出。圖7a提供了截短形式的TRAC的氨基酸序列。圖7b提供了截短形式的TRBCl的氨基酸序列。圖7c提供了截短形式的TRBC2的氨基酸序列。圖8a提供述了pEX202質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜。圖8b提供述了pEX202質(zhì)粒的DNA序列。圖9a詳細描述了優(yōu)選的可溶性高親和力MELTCR變體的oc鏈氨基酸序列。圖9b詳細描述野生型可溶性MELTCR的(3鏈氨基酸序列，其采用了經(jīng)肽接頭與野生型人IL-2融合的TRBC2編碼的恒定區(qū)。接頭和IL-2序列以斜體字表示。圖10提供了野生型二硫鍵連接的可溶性MELTCR與HLA-AAGIGILTV-HLA-A*0201相互作用產(chǎn)生的Biacore響應曲線。圖lla和llb分別提供了全長野生型MELTCRa鏈DNA序列及其編碼的氨基酸序列，所述DNA序列經(jīng)突變從而提高了在人細胞中的表達。圖12a和12b分別提供了全長高親和力clMELTCRoc鏈DNA序列及其編碼的氨基酸序列，所述DNA序列經(jīng)突變從而提高了在人細胞中的表達。圖13a和13b分別提供了全長高親和力cldMELTCRot鏈DNA序列及其編碼的氨基酸序列，所述DNA序列經(jīng)突變從而提高了在人細胞中的表達。圖14a和14b分別提供了全長高親和力c9MELTCRcx鏈序列及其編碼的氨基酸序列，所述ot鏈序列經(jīng)突變從而提高了在人細胞中的表達。圖15a和15b分別提供了全長c9MELTCRa鏈序列及其編碼的氨基酸序列，所述a鏈序列經(jīng)突變從而提高了在人細胞中的表達。圖16提供的ELISPOT試驗證明可溶性二硫鍵連接形式的高親和力clWTMelTCR抑制MEL特異性CTL克隆激活的能力。圖17a和17b分別提供了編碼全長野生型MELTCRa鏈ORF的DNA序列和編碼野生型MELTCRp鏈ORF的DNA序列。圖18提供了編碼全長clMELTCRa鏈ORF的DNA序歹J，其含有野生型DNA密碼子而不含編碼突變氨基酸的那些密碼子。圖19a提供了通過用未進行密碼子優(yōu)化的DNA轉染Jurkat細胞獲得的TCR表達水平的FACS數(shù)據(jù)，所述DNA編碼cla/WTpMELTCR。圖1%提供了通過用進行密碼子優(yōu)化的DNA轉染Jurkat細胞獲得的TCR表達水平的FACS數(shù)據(jù)，所述DNA編碼cla/WTpMELTCR。圖20提供其它高親和力MELTCRa鏈的可變區(qū)氨基酸序列。突變的殘基以下劃線標出。圖21提供高親和力MELTCR卩鏈的可變區(qū)氨基酸序列。突變的殘基以下劃線標出。圖22提供了可溶性高親和力MELTCRa鏈的氨基酸序列，其含有非天然半胱氨酸殘基。該非天然半胱氨酸突出表示，突變的殘基以下劃線標出。圖23提供了可溶性高親和力MELTCRp鏈的氨基酸序列，其含有非天然半胱氨酸殘基。該非天然半胱氨酸突出表示，突變的殘基以下劃線標出。劍吝包f天然7kffi丄^"^"^游二疏鑌遂接游^",絲rc7圖4a和4b提供了野生型MELTCR的可溶性二硫鍵連接的a和p鏈的DNA序列，該TCR對AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物具有特異性?？捎啥鄠€承包研究公司(contractresearchcompany),例如GeneArt(德國雷根斯堡)從頭合成這些DNA序列。還可在這些DNA序列中加入限制性內(nèi)切酶識別位點，從而使得這些DNA序列易于連接入基于pGMT7的表達質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有能在大腸桿菌菌株BL21-DE3(pLysS)中高水平表達的T7啟動子(Pan等，歷Wec/2"/《w^(2000)29(6):1234-8)。將用A^/e/和歷"必//切割的編碼各TCR鏈的DNA序列連接入也用A^e/和//^////切割的不同pEX202基于pGMT7的載體(pEX202的質(zhì)粒圖譜見圖8a，該載體的DNA序列見圖8b(SEQIDNO:28))。在編碼^^絲妤生遭M^XrCR鏈游ZWJ^導A銜劍性A坊艨設劍位點-CATATG飾孤-AAGCTT遂麥將連接的質(zhì)粒轉化入感受態(tài)大腸桿菌菌株XLl-藍細胞，接種于含100mg/ml氨芐西林的LB/瓊脂平板。37。C培育過夜后，挑取單菌落，用含100mg/ml氨芐西林的10mlLB于37"C搖動培養(yǎng)過夜。用Miniprep試劑盒(Qiagen)純化克隆的質(zhì)粒，用自動化DNA測序儀(LarkTechnologies)測序插入物。圖5a和5b分別顯示了由圖4a和4b所示DNA序列產(chǎn)生的可溶性二硫鍵連接的野生型MELTCRa和(5鏈胞外氨基酸序列。這些DNA序列中的限制性內(nèi)切酶識別序列以下劃線標出。實i,"-劍吝二藏楚遂^游f,絲M化rc/游羸者浙力,沐可將如實施例1所述制備的二硫鍵連接的可溶性天然MELTCR用作模板，從該模板制備對AAGIGILTV(SEQIDNO:43)-HLA-A*0201復合物的親和力提高的本發(fā)明TCR。噬菌體展示是制備HIVGagTCR變體文庫從而能鑒定高親和力突變體的一種方法。例如，可修改Li等((2005)Wa化"B/otec/z23(3):349-354)描述的TCR噬菌體展示和篩選方法，將其用于HIVGagTCR。圖6列出了與野生型MEL卩可變區(qū)結合時，對AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物顯示高親和力的突變TCRa鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNo:11-24)。本領域技術人員己知可通過定點誘變將產(chǎn)生這些突變鏈所需的必需密碼子變化導入編碼這些鏈的DNA中(QuickChangeTM，Stratagene的定點誘變試劑盒)。簡言之，可通過用能摻入所需一個或多個密碼子變化的引物和含相關MELTCR鏈DNA的pEX202質(zhì)粒作為誘變模板來實現(xiàn)采用以下條件進行誘變50ng質(zhì)粒模板、1pl的10mMdNTP、由廠商提供的5pi的10XPfuDNA聚合酶緩沖液、25pmol的正向引物、25pmol的反向引物、1pi的pfuDNA聚合酶，總體積為50nl。95'C進行2分鐘的初始變性后，進行25輪如下反應變性(95。C，10秒)、退火(55。C，10秒)和延伸(72°C，8分鐘)。用Dpnl限制性內(nèi)切酶消化所得產(chǎn)物以去除模板質(zhì)粒，將得到的產(chǎn)物轉化入大腸桿菌菌株XLl-藍中。通過測序驗證誘變結果。實盧樹3-^,絲rc^游表達、重芥違浙錄眾將實施例1或2制備的含有MELTCRa鏈和MELTCR(3鏈的pEX202表達質(zhì)粒分別轉化入大腸桿菌菌株BL21pLysS，37。C用TYP培養(yǎng)基(含100pg/ml氨芐西林)培養(yǎng)具有氨芐西林抗性的單菌落至OD柳為0.4，然后用0.5mMIPTG誘導蛋白質(zhì)表達。誘導后3小時用BeckmanJ-6B以4000rpm離心30分鐘收集細胞。將細胞沉淀物重懸在含有50mMTris-HCl、25%(w/v)蔗糖、1mMNaEDTA、0.1%(w/v)疊氮鈉、10mMDTT，pH8.0的緩沖液中。經(jīng)凍融過夜步驟后，在MilsonixXL2020超聲波儀中用標準的12mm直徑探頭超聲破碎重懸的細胞1分鐘，總共脈沖式超聲約IO分鐘。用BeckmanJ2-21離心機以13000rpm離心30分鐘回收包涵體沉淀物。然后用洗滌劑洗滌三次以去除細胞碎片和膜組分。每次用Triton緩沖液(50mMTris-HCl、0.5%Triton-X100、200mMNaCl、10mMNaEDTA、0.1%(w/v)疊氮鈉、2mMDTT，pH8.0)勻漿包涵體沉淀物，然后用BeckmanJ2-21以13000rpm離心15分鐘使其沉淀。然后用如下緩沖液進行類似洗滌以去除洗滌劑和鹽50mMTris-HCl、1mMNaEDTA、0.1%(w/v)疊氮鈉、2mMDTT，pH8.0。最后，將包涵體分成30mg等分，-70°。冷凍。用6M鹽酸胍溶解并通過Bradford染料結合測試(PerBio)定量測定包涵體蛋白融化溶有約30mgTCR|3鏈和60mgTCRa鏈的包涵體的冷凍儲備物，然后混合樣品，用15ml胍溶液(6M鹽酸胍、lOmM醋酸鈉、10mMEDTA)稀釋該混合物以確保鏈完全變性。然后將含有完全還原并變性的TCR鏈的胍溶液注入1升以下重折疊緩沖液中100mMTrispH8.5、400mML-精氨酸、2mMEDTA、5mM還原谷胱甘肽、0.5mM氧化谷胱甘肽、5M尿素、0.2mMPMSF。加入氧化還原對(2-巰乙胺和胱胺(其終濃度分別為6.6mM和3.7mM)，約5分鐘后加入變性的TCR鏈。溶液靜置5小時±15分鐘。5°C±3°C，在Spectrapor1膜(Spectmm;產(chǎn)品編號132670)中用10L10mMTrispH8.1透析重折疊的TCR18隱20小時。然后將透析緩沖液換為新鮮的10mMTrispH8.1(10L)，在5°C±3。C下繼續(xù)透析20-22小時。將透析的重折疊物加樣于POROS50HQ陰離子交換柱上，用Akta純化儀(Pharmacia)以50倍以上柱體積的0-500mMNaCl梯度液洗脫結合的蛋白質(zhì)從而將sTCR與降解產(chǎn)物和雜質(zhì)分開。將諸峰組分保存于4°C，用考馬斯染色SDS-PAGE分析，然后合并與濃縮。最后，用HBS-EP緩沖液(10mMHEPESpH7.4，150mMNaCl，3.5mMEDTA，0.05%乙基苯基聚乙二醇(nonidetp40))預平衡的Superdex200HR凝膠過濾柱純化和表征sTCR。合并與濃縮相對分子量約50kDa的洗脫峰后通過BIAcore表面等離振子共振分析來表征。用表面等離振子共振生物傳感器(Biacore3000)分析可溶性MELTCR與同源肽-MHC配體的結合情況。制備以半定向方式固定在鏈霉親和素包被結合表面上的單種pMHC復合物(描述于下文)有助于該項分析，從而能同時有效測試可溶性T-細胞受體與多達4種不同pMHC(固定在不同的流動小室上)的結合情況。手動注入HLA復合物易于操控固定的I類分子的精確水平。體外重折疊來自含有組成型亞單位蛋白和合成肽的細菌表達的包涵體中的生物素化的I類HLA-A*0201分子，然后純化并在體外進行酶促生物素化(O，Callaghan箏(1999)^"fl/.266:9-15)。所表達的HLA-A承0201-重鏈的C末端具有生物素化標簽，其以合適的結構替代了該蛋白質(zhì)的跨膜和胞質(zhì)結構域。獲得的包涵體表達水平約75mg/升細菌培養(yǎng)物。還在大腸桿菌中從合適構建物表達了作為包涵體的MHC輕鏈或p2-微球蛋白，其水平約為500mg/升細菌培養(yǎng)物。裂解大腸桿菌細胞，純化包涵體至約80%純度。用6M鹽酸胍、50mMTrispH8.1、100mMNaCl、10mMDTT、10mMEDTA使包涵體的蛋白質(zhì)變性，通過在低于5r將變性蛋白一次脈沖加入重折疊緩沖液0.4ML-精氨酸-HCl、100mMTrispH8.1、3.7mM胱胺、6.6mM卩-半胱胺，負載于HLA-A*0201分子所需的4mg/mlAAGIGILTV肽，以30mg/升重鏈、30mg/升卩2m的濃度進行重折疊。重折疊在4"C進行至少1小時方能完成。用IO倍體積的10mMTrispH8.1透析更換緩沖液。為充分降低溶液的離子強度，緩沖液需更換兩次。然后將蛋白質(zhì)溶液通過1.5pm乙酸纖維素濾膜過濾，加樣于POROS50HQ陰離子交換柱上(床體積8ml)。用0-500mMNaCl線性梯度液洗脫蛋白。HLA-A"201-肽復合物大約在250mMNaCl處洗脫，收集諸峰組分，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)，將各組分冷藏于冰上。用以相同緩沖液平衡的Pharmacia快速脫鹽柱將含生物素化標簽的pMHC分子的緩沖液更換為10mMTrispH8.1、5mMNaCl。洗脫后立即將含有蛋白質(zhì)的組分冷藏于冰上，加入蛋白酶抑制劑混合物(Calbiochem)。然后加入生物素化試劑1mM生物素、5mMATP(緩沖至pH8)、7.5mMMgCl2和5jig/mlBirA酶(按照O，Callaghan等，(1999)，*a/,266:9-15純化)。然后室溫培育混合物過夜。采用凝膠過濾層析純化生物素化的pHLA-A*0201分子。用已過濾的PBS預平衡PharmaciaSuperdex75HR10/30柱，加載1ml生物素化反應混合物，用PBS以0.5ml/分鐘展開。生物素化pHLA-A*0201分子在約15ml時作為單峰洗脫。合并含有蛋白質(zhì)的組分，在冰上冷藏，加入蛋白酶抑制劑混合物。采用考馬斯結合試驗(PerBio)測定蛋白質(zhì)濃度，將生物素化的pHLA-AM201分子等份試樣冷凍保存在-2(TC。采用標準的胺偶聯(lián)方法(aminecouplingmethod)固定鏈霉親和素。這種固定的復合物能結合T-細胞受體和輔助受體CD8oux，可將二者注射入溶解相。即使在低濃度(至少40叫/ml)也能獲得TCR的特異性結合，提示該TCR較穩(wěn)定。如果采用溶解相或固定相的sTCR，觀察到sTCR的pMHC結合特性在質(zhì)量和數(shù)量上相似。這是對可溶性物質(zhì)的部分活性至關重要的控制，也提示生物素化的pMHC復合物與非生物素化的復合物的生物活性相同。在Biacore3000TM表面等離振子共振(SPR)生物傳感器上分析含有新的鏈間鍵的可溶性MELTCR與其同源pMHC或無關的pMHC混合物(制備方法如上所述)之間的相互作用。在一流動小室中，用SPR檢測傳感器表面附近以響應單位(RU)表示的折光率變化，該原理可用于檢測受體配體相互作用和分析它們的親和力以及動力學參數(shù)。所述探針流動小室如下制備通過交聯(lián)到p2m上的生物素與己化學交聯(lián)到流動小室的活化表面上的鏈霉親和素之間的結合，將各HLA-肽復合物固定在不同的流動小室中。然后使sTCR以恒定流速通過不同流動小室的表面，并測定該情況下的SPR響應以進行測試。^漱^薪錄^賞,制備野生型或突變的MELsTCR的系列稀釋液，以5pl/分鐘的恒定流速注入兩個不同的流動小室；一個流動小室用約1000RU的特異性AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物包被，第二個用約1000RU的非特異性HLA-A2-肽復合物包被。用對照小室的測定值對各濃度的響應進行標準化。制作標準化數(shù)據(jù)響應與TCR樣品濃度相關圖，擬合成雙曲線(hyperbola)以計算平衡結合常數(shù)，KD。(Price&Dwek，/V/w一/esa"c/ZVo6/e薦/"尸/z戸'ca/C7zew^^y/or肌oc/ze薦^^(2ndEdition),《生物化學家的物理化學原理和問題》第二版，1979，ClarendonPress,牛津)。澄腦力學參教通過試驗檢測解離速率常數(shù)kd和結合速率常數(shù)ka來確定高親和力TCR的Kd。平衡常數(shù)KD計算為kd/ka。注射TCR流過兩個不同小室，一個用約300RU的特異性HLA-A2-AAGIGILTV復合物包被，第二個用約300RU的非特異性HLA-A2-肽復合物包被。流速設置為50iLd/分鐘。通常注入約3)iM濃度的250nlTCR。然后使緩沖液流過直到響應回復到基線。用Biaevaluation軟件計算動力學參數(shù)。也將解離相擬合為單指數(shù)衰變方程式從而能計算半衰期。錄菜采用上述方法分析二硫鍵連接的可溶性野生型MELTCR(由SEQIDNO:9和10分別詳述的a和卩TCR鏈組成)與AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物之間的相互作用，顯示Ko為4iiM。(Biacore響應曲線見圖12)。含有下表所述可變區(qū)應用的TCR的Kd小于或等于3pM。根據(jù)對高親和力TCR而非本文MELTCR的經(jīng)驗(參見例如Li等，7Va&re歷o&c/z200523(3):349-354)，預計下表所述一些或所有TCR的k。ff為1Xl(T3S"或更慢，實際上通過制備含有這些可變區(qū)的可溶性TCR已顯示是這樣的情況(參見下表1)。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>表l一含有所述可變區(qū)的可溶性二硫鍵連接的高親和力MELTCR與同源AAGIGILTV-HLA-A*0201肽-MHC相互作用的Biacore數(shù)據(jù)寬潘樹5-劍吝^"潘性庸襲浙力M￡LTO-勞生遭乂/^合歪Z^可用基本上如實施例1-3中所述的方法制備可溶性高親和力MELTCR-野生型(WT)人IL-2融合蛋白。簡言之，將編碼所需接頭和WT人IL-2的DNA加到二硫鍵連接的可溶性野生型MELTCRp鏈DNA序列的3'端，直接位于TAA("終止")密碼子之前。圖9b提供了融合蛋白的氨基酸序列，該融合蛋白包含通過接頭序列融合到WT人IL-2的二硫鍵連接的野生型MELTCR卩鏈(SEQIDNO:30)。該融合蛋白的接頭和IL-2部分用斜體表示。然后可將編碼該構建物的DNA連接入pEX202。然后可采用基本上如實施例3所述的方法，使該卩鏈融合蛋白與含有圖6詳述的任何可變區(qū)(SEQIDNO:11-24)的二硫鍵連接的可溶性高親和力MELTCRa鏈相結合，從而表達此可溶性高親和力MELTCR-IL-2融合蛋白。例如，圖9a(SEQIDNO:29)提供了含有SEQIDNO:11詳述的可變區(qū)的二硫鍵連接的可溶性高親和力MELTCRa鏈的氨基酸序列。實嚴樹6-沐^伊仿^溶絲葛—襲^7力Me/C7c『rMe/7T7滯翁二銀游毒絲r激應(T7X);^眾游五丄/S尸(9r試邀以下方法提供了評估MelclcWT高親和力MelTCR抑制AAGIGILTV-HLA-A*0201反應性T細胞克隆活化的能力的一種手段。該實驗所用的可溶性MelclcWT高親和力MelTCR含有分別如(SEQIDNO:ll)和(SEQIDNO:2)所示的MelTCRa鏈可變區(qū)和WTMelTCR卩鏈可變區(qū)。圖9a(SEQIDNO:29)和圖5b(SEQIDNO:10)分別提供了該二硫鍵連接的可溶性TCR的TCRa和(3鏈的全部氨基酸序列。試抓試驗培養(yǎng)基10。/。FCS(熱滅活的，Gibco，目錄號10108-165)，88%RPMI1640(Gibco，目錄號42401-018)，1%谷氨酰胺(Gibco，目錄號25030-024)和1°/0青霉素/鏈霉素(Gibco，目錄號15070-063)。洗滌緩沖液0,01MPBS/0.05。/o吐溫20(將Sigma,目錄號P-3563的1包含吐溫20的磷酸緩沖鹽水，pH7.4溶解于1升蒸餾水得到最終組合物0.01MPBS、0.138MNaCl、0.0027MKC1、0.05%吐溫20)。PBS(Gibco，目錄號10010-015)DiacloneEliSpot試劑盒(IDS),EliSpot試劑盒裝有所需的所有其它試劑，即捕捉和檢測抗體，脫脂奶粉、BSA、鏈霉親和素-堿性磷酸酶、BCIP/NBT溶液(人IFN-yPVDFEli-spot20x96孔板(IDS目錄號DC-856.051.020，DC-856.000.000)。以下方法依據(jù)各試劑盒所裝的生產(chǎn)商使用說明書，但有些改進。方法每平板用10ml無菌PBS稀釋100pl捕捉抗體。將100W稀釋的捕捉抗體等份加入各孔，4'C靜置過夜，或在室溫靜置2小時。然后使用450pl洗滌緩沖液，Ultrawash96-孔板洗滌儀(ThermoLifeSciences)洗滌各平板三次以除去多余的捕捉抗體。然后將100^12%脫脂奶加入各孔。(將ELISPOT試劑盒提供的一小瓶脫脂奶粉溶解于50ml無菌PBS中)。然后在室溫培育各平板2小時，再用450pi洗滌緩沖液，Ultrawash96-孔板洗滌儀(ThermoLifeSciences)洗滌各板三次。用胰蛋白酶將Mel624和Mel526靶癌細胞與它們的組織培養(yǎng)瓶分離，用試驗培養(yǎng)基通過離心(280Xg，10分鐘)洗滌一次，以lX106/ml重懸在相同培養(yǎng)基中。然后將50ul該懸液加入試驗平板得到的靶細胞總數(shù)為50,000個細胞/孔。ELAGIGILTV-脈沖的T2靶細胞也用作對照。由于該類似肽對HLA-A*0201的親和力髙于野生型肽而使用該類似肽。用試驗培養(yǎng)基通過離心(280Xg，IO分鐘)洗滌這些肽脈沖的細胞一次，以lX10Vml重懸在相同培養(yǎng)基中。然后將50ul該懸液加入試驗平板得到的耙細胞總數(shù)為50,000個細胞/孔。通過離心(280Xg，IO分鐘)收集用ELAGIGILTV肽進行自體刺激產(chǎn)生的T細胞克隆(KA/C5)(效應細胞)，將其以1Xl()S個細胞/ml重懸在試驗培養(yǎng)基中，將50ul加入試驗平板時得到5000個細胞/孔。用試驗培養(yǎng)基以3X濃度稀釋可溶性MelclcWT高親和力MelTCR，當將50ul加入平板時得到1X終(濃度)，終體積為150pl。所測試的高親和力MelTCR的濃度范圍是1^M-1nM。然后制備含有以下物質(zhì)的各孔，(各孔中最終反應體積為lOOpl):濕存刷鍵詹AJ50|ilMel624或Mel526耙細胞50ul所需濃度的可溶性高親和力MelclcWTTCR50ulKA/C5T細胞克隆效應細胞50pl靶細胞50ul最高濃度的可溶性高親和力MelclcWTTCR50(il試驗培養(yǎng)基禾口50pl效應細胞50pl最高濃度的可溶性高親和力MelclcWTTCR50pl試驗培養(yǎng)基禾口50(il效應細胞50pl靶細胞50^最高濃度的可溶性無關(HLA-AM201-Tax-特異性)高親和力mTCR50pl試驗培養(yǎng)基銜絲對,銜50plMel624、Mel526或肽脈沖的T2耙細胞50^效應細胞50(il試驗培養(yǎng)基然后將各板在37°C/5%C02下培育過夜。再用洗滌緩沖液洗滌各板6次，隨后輕拍出多余的緩沖液。然后向ELISPOT試劑盒提供的各小瓶檢測抗體中加入550pl蒸餾水以制備稀釋溶液。再用每平板10mlPBS/1%BSA稀釋100pi稀釋的檢測抗體溶液，將100pl稀釋的檢測抗體溶液等份加入各孔。然后在室溫培育各平板卯分鐘。然后用450(il洗滌緩沖液，Ultrawash96-孔板洗滌儀(ThermoLifeSciences)洗滌各板三次，輕拍至干。然后每平板用10mlPBS/1%BSA稀釋10pi鏈霉親和素-堿性磷酸酶，將100pl稀釋的鏈霉親和素加入各孔，室溫下培育l小時。然后用450pl洗滌緩沖液再洗滌各平板3次，輕拍至干。向各孔中加入100plBCIP/NBT補充溶液，用箔片覆蓋各平板，靜置顯影5-15分鐘。在此期間，有規(guī)律地檢查各平板的斑點形成以決定何時終止反應。然后用自來水徹底洗滌各平板，振蕩，然后分開，靜置于工作臺上干燥。干燥后，用ELISPOT讀數(shù)計(AutoimmunDiagnotistika，德國)對平板讀數(shù)。各孔中的斑點數(shù)目與激活的T細胞成比例。因此，含有高親和力MelTCR的各孔中斑點數(shù)目的任何降低表明抑制了KA/C5CTL克隆活化。錄菜如圖16所示，可溶性clcWT高親和力MelTCR能有效抑制KA/C5CTL克隆活化。這些數(shù)據(jù)表明利用1^M可溶性clcWT高親和力MelTCR能100%抑制CTL活化。實蘑樹7-^編碼,,關//7力^7"r印」MMrCW游麥^7汰眾,〃密藥f^汰眾游zwj轉糴j"^w，應游rc^表這jf^/r麥將培養(yǎng)于含10%熱滅活胎牛血清RMPI培養(yǎng)基的4X106個培養(yǎng)Jurkat細胞用無血清的培養(yǎng)基洗滌并用以下質(zhì)粒轉染a)5叫無內(nèi)毒素的質(zhì)粒pCIneo(其含有編碼MELacl突變型全長TCRa鏈的密碼子未優(yōu)化的序列)加上5pg無內(nèi)毒素的質(zhì)粒pCI(其含有編碼MEL(3野生型全長TCR鏈的密碼子未優(yōu)化的序列)(這些序列的ORF分別見圖18(SEQIDNO:46)和圖17b(SEQIDNO:45));或b)5pg無內(nèi)毒素的質(zhì)粒pCIneo(其含有ORF密碼子優(yōu)化的MELacl突變型全長TCRa鏈)加上5嗎無內(nèi)毒素的質(zhì)粒pCI(其含有ORF密碼子優(yōu)化的MEL(3野生型全長TCR鏈)(這些序列的ORF分別見圖12a(SEQIDNO:33)和圖15a(SEQIDNO:39))。用BioRadGenepulser裝置，以0.27kV和975的條件，用0.4cm小杯進行電穿孔轉染。37°C，將細胞置于6ml含20%熱滅活胎牛血清的RPMI中72小時。在體積為100^的PBS中用1pl(0.54jug)PE-標記的鏈霉親和素p/HLA-A2四聚體染色細胞(肽是變態(tài)(heteroclytic)MEL肽ELAGIGILTV或陰性對照NY-ESO肽SLLMWITQC)。室溫下靜置20分鐘后，用5mlRPMI洗滌細胞一次，將其重懸在800piRPMI中，用FC500BeckmanCoulter儀器分析。錯菜圖19a和圖19b所示的FACs染色數(shù)據(jù)是用編碼cla/WT(3MELTCR的密碼子未優(yōu)化和密碼子優(yōu)化的DNA轉染Jurkat細胞獲得的同源pMHC四聚體染色水平。這些數(shù)據(jù)證明與使用相應的密碼子未優(yōu)化DNA達到的TCR表面表達水平相比，用密碼子優(yōu)化的DNA達到高表達水平。權利要求1.一種T細胞受體(TCR)，其具有結合AAGIGILTV-HLA-A*0201特性并含有至少一個TCRα鏈可變區(qū)和/或至少一個TCRβ鏈可變區(qū)，其特征在于，所述TCR對所述AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物的KD小于或等于3μM和/或解離速率(koff)為1×10-3S-1或更慢。2.如權利要求1所述的T細胞受體(TCR)，其特征在于，所述TCR對所述AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物的Kd小于或等于1pM。3.如權利要求1或2所述的TCR，其特征在于，其同時含有a鏈可變區(qū)和TCR(3鏈可變區(qū)。4.如權利要求1或2所述的TCR，其特征在于，所述TCR是aa或pp同質(zhì)二聚體。5.如以上權利要求中任一項所述的T細胞受體(TCR)，其特征在于，通過表面等離振子共振檢測所述Kd和/或k。ff。6.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，與天然MELTCRa鏈可變區(qū)(SEQIDNo:1)和/或(3鏈可變區(qū)(SEQIDNO:2)相比，所述TCR在其至少一個互補決定區(qū)中發(fā)生突變。7.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，與天然MELTCRa鏈可變區(qū)(SEQIDNo:1)和/或(3鏈可變區(qū)(SEQIDNO:2)相比，所述TCR在其至少一個可變區(qū)框架區(qū)中發(fā)生突變。8.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，采用SEQIDNO:l所示的編號，一個或多個如下的a鏈可變區(qū)氨基酸發(fā)生突變28D、29R、30G、31S、49M、511、53S、54N、72Y、94V、95A、96G、97K、98S禾卩99T。9.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，采用SEQIDNO:2所示的編號，一個或多個如下的(3鏈可變區(qū)氨基酸發(fā)生突變45L、51S、52V、53G、541、761、100G、101T、102G、103E、104L和105F。10.如權利要求1-7中任一項所述的TCR，其特征在于，采用SEQIDNO:1所示的編號，所述TCR含有對應于以下的一個或多個cx鏈可變區(qū)突變28D—F、28D—Y、28D—S、28D—N、29R—Q、29R—L、29R—I、29R—F、30G—H、31S—A、49M—I、511—T、53S—R、54N—E、72Y—H、94V—D、94V—P、94V—S、94V—L、94V~>N、95A—G、95A—S、95A—E、9G6—N、96G—P、96G—V、96G—M、96G—L、96G—R、97K—R、97K—Y、97K—V、97K—L、97K—H、97K—G、97K—I、97K—P、98S—L、98S—M、98S—R、99T—L或99T~>R。11.如權利要求1-7或10中任一項所述的TCR，其特征在于，采用SEQIDNO:2所示的編號，所述TCR含有對應于以下的一個或多個|3鏈可變區(qū)突變45L—P、51S—Y、51S—F、51S—W、52V—G、53G—P、54I—F、54—Y、716—V、100G—N、101T—M、101T—L、101T—V、102G—S、102G—N、102G—T、103E—G、104L—W、105F—S、105F—A、105F—Q、105F—D或105F—E。12.如權利要求1-7中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:11-24或47-53所示a鏈可變區(qū)氨基酸序列之一。13.如權利要求1-7或12中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:54-67所示(3鏈可變區(qū)氨基酸序列之一。14.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有下表所示的a和卩鏈可變區(qū)配對<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>15.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:11所示的oc鏈可變區(qū)和SEQIDNO:2所示的卩鏈可變區(qū)。16.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:47所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:2所示的卩鏈可變區(qū)。17.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:48所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:2所示的卩鏈可變區(qū)。18.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:53所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:2所示的卩鏈可變區(qū)。19.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:54所示的卩鏈可變區(qū)。20.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:55所示的(3鏈可變區(qū)。21.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:56所示的(3鏈可變區(qū)。22.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:57所示的卩鏈可變區(qū)。23.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:58所示的卩鏈可變區(qū)。24.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:62所示的卩鏈可變區(qū)。25.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:65所示的卩鏈可變區(qū)。26.如權利要求3所述的TCR，其特征在于，所述TCR含有SEQIDNO:11所示的a鏈可變區(qū)和SEQIDNO:66所示的卩鏈可變區(qū)。27.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR還含有SEQIDNO:25所示的a鏈恒定區(qū)氨基酸序列和/或SEQIDNO:26和27所示的卩鏈恒定區(qū)氨基酸序列之一。28.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR是二聚體T細胞受體(dTCR)或單鏈T細胞受體(scTCR)。29.如權利要求5-28中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR是scTCR，其含有由對應于TCRa鏈可變區(qū)的氨基酸序列構成的第一區(qū)段，由對應于TCR(3鏈可變區(qū)序列并與對應于TCR卩鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構成的第二區(qū)段，和連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端的接頭序列。30.如權利要求5-28中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR是scTCR，其含有由對應于TCRP鏈可變區(qū)的氨基酸序列構成的第一區(qū)段，由對應于TCRa鏈可變區(qū)序列并與對應于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的氨基酸序列的N末端相融合的氨基酸序列構成的第二區(qū)段，和連接該第一區(qū)段C末端與該第二區(qū)段N末端的接頭序列。31.如權利要求29或30所述的TCR，其特征在于，所述TCR在第一和第二鏈之間還含有二硫鍵，所述二硫鍵在天然apT細胞受體中沒有等價鍵，其中該接頭序列的長度和該二硫鍵的位置使第一和第二區(qū)段的可變區(qū)序列的相互取向基本上如天然a(3T細胞受體中的那樣。32.如權利要求29-31中任一項所述的scTCR，其特征在于，在結合部分中，所述接頭序列連接該第一區(qū)段的C末端和該第二區(qū)段的N末端。33.如權利要求29-32中任一項所述的scTCR，其特征在于，在結合部分中，所述接頭序列如式-PGGG-(SGGGG)5-P-(SEQIDNO:41)或-PGGG-(SGGGG)6-P-(SEQIDNO:42)所示，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸，S是絲氨酸。34.如權利要求1-3或5-28中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR是dTCR，其含有第一多肽，其中對應于TCRa鏈可變區(qū)序列的序列與對應于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合；和第二多肽，其中對應于TCR(3鏈可變區(qū)序列的序列與對應于TCRp鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合；該第一和第二多肽通過在天然apT細胞受體中沒有等價鍵的二硫鍵相連。35.如權利要求34所述的TCR，其特征在于，所述二硫鍵連接所述恒定區(qū)序列的氨基酸殘基，該二硫鍵在天然TCR中沒有等價鍵。36.如權利要求35所述的TCR，其特征在于，所述二硫鍵存在于與天然TCR中其(3碳原子距離小于0.6nm的氨基酸殘基相對應的半胱氨酸殘基之間。37.如權利要求35所述的TCR，其特征在于，所述二硫鍵存在于取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基或其非人等價物之間。38.如權利要求1-3或5-28中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR是dTCR，其含有第一多肽，其中對應于TCRa鏈可變區(qū)序列的序列與對應于TCRa鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合；和第二多肽，其中對應于TCRp鏈可變區(qū)序列的序列與對應于TCRp鏈恒定區(qū)胞外序列的序列的N末端相融合；該第一和第二多肽通過在天然apT細胞中沒有等價鍵的二硫鍵相連，所述二硫鍵在取代TRAC*01外顯子1的Thr48和取代TRBC1*01或TRBC2*01外顯子1的Ser57的半胱氨酸殘基或其非人等價物之間。39.如權利要求14-38中任一項所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR結合部分在對應于天然TCR中通過二硫鍵相連的那些殘基的殘基之間含有二硫鍵。40.如權利要求14-39中任一項所述的TCR，其特征在于，所述dTCR或scTCR結合部分不含有對應于天然TCR的跨膜或胞質(zhì)序列的序列。41.一種可溶性TCR，其含有SEQIDNO:29所示的a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:IO所示的(3鏈氨基酸序列。42.—種可溶性TCR，其含有SEQIDNO:68所示的a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:IO所示的卩鏈氨基酸序列。43.—種可溶性TCR，其含有SEQIDNO:69所示的a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的卩鏈氨基酸序列。44.一種可溶性TCR，其含有SEQIDNO:70所示的a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:10所示的(3鏈氨基酸序列。45.—種可溶性TCR，其含有SEQIDNO:29所示的a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:71所示的卩鏈氨基酸序列。46.—種可溶性TCR，其含有SEQIDNO:29所示的a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:72所示的p鏈氨基酸序列。47.—種可溶性TCR，其含有SEQIDNO:29所示的a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:73所示的(3鏈氨基酸序列。48.—種可溶性TCR，其含有SEQIDNO:29所示的a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:74所示的(3鏈氨基酸序列。49.一種可溶性TCR，其含有SEQIDNO:29所示的a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:75所示的卩鏈氨基酸序列。50.—種可溶性TCR，其含有SEQIDNO:29所示的a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:76所示的卩鏈氨基酸序列。51.—種可溶性TCR，其含有SEQIDNO:29所示的a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:77所示的(3鏈氨基酸序列。52.—種可溶性TCR，其含有SEQIDNO:29所示的a鏈氨基酸序列和SEQIDNO:78所示的|3鏈氨基酸序列。53.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR與至少一條聚亞垸基二醇鏈相連。54.如權利要求53所述的TCR，其特征在于，所述聚亞垸基二醇鏈與所述TCR共價相連。55.如權利要求53或54所述的TCR，其特征在于，所述聚亞垸基二醇鏈含有至少兩個聚乙二醇重復單位。56.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR在其a或P鏈的C末端或N末端還含有反應活性半胱氨酸。57.如以上權利要求中任一項所述的TCR，其特征在于，所述TCR與治療劑或可檢測部分相連。58.如權利要求57所述的TCR，其特征在于，所述TCR與治療劑或可檢測部分共價相連。59.如權利要求57所述的TCR，其特征在于，所述治療劑或可檢測部分與一條或兩條TCR鏈的C末端共價相連。60.如權利要求57-59中任一項所述的TCR，其與治療劑相連，其特征在于，所述治療劑是免疫效應分子。61.如權利要求60所述的TCR，其特征在于，所述免疫效應分子是細胞因子。62.如權利要求60所述的TCR，其特征在于，所述免疫效應分子是IL-2或其功能性變體或片段。63.如權利要求57-59中任一項所述的TCR，其特征在于，所述治療劑是細胞毒素劑。64.如權利要求57-59中任一項所述的TCR，其特征在于，所述治療劑是放射性核素。65.—種多價TCR復合物，其含有至少兩個如以上權利要求中任一項所述的TCR。66.—種多價TCR復合物，其含有至少兩個如以上權利要求中任一項所述的TCR，所述TCR通過非肽聚合物鏈或肽接頭序列相連。67.如權利要求65所述的TCR復合物，其特征在于，所述聚合物鏈或肽接頭序列延伸于各TCR中不位于該TCR可變區(qū)序列中的氨基酸殘基之間。68.如權利要求66或67所述的TCR復合物，其特征在于，所述TCR通過聚亞烷基二醇鏈或衍生自人多聚化結構域的肽接頭相連。69.如權利要求68所述的TCR復合物，其特征在于，二價亞烷基間隔基團位于聚亞垸基二醇鏈和其與該復合物的TCR連接點之間。70.如權利要求68或69所述的TCR復合物，其特征在于，所述聚亞烷基二醇鏈含有至少兩個聚乙二醇重復單位。71.—種多價TCR復合物，其含有權利要求1-56中任一項所述的至少兩個TCR，其中(i)如權利要求57-64中任一項所述，至少一個所述TCR與治療劑相連。72.—種分離的細胞，其呈遞權利要求1-52中任一項所述的TCR。73.如權利要求72所述的分離的細胞，其特征在于，所述細胞是人T細胞或人造血干細胞。74.—種或多種核酸，其編碼以上權利要求中任一項所述的TCR。75.如權利要求74所述的一種或多種核酸，其特征在于，所述核酸適應于在細菌、酵母菌、哺乳動物或昆蟲細胞中表達。76.如權利要求74所述的一種或多種核酸，其特征在于，所述核酸適應于在人T細胞或人造血干細胞中表達。77.如權利要求76所述的核酸，其特征在于，所述核酸由SEQIDNo33、35或37所示的全長TCRa鏈DNA序列之一和SEQIDNo39所示的TCR卩鏈DNA序列或與其互補的核酸或相應的RNA序列構成。78.—種藥物組合物，其特征在于，所述組合物含有權利要求1-71中任一項所述的TCR或多價TCR復合物，或多個權利要求72或73所述的細胞，或權利要求74-77中任一項所述的一種或多種核酸，以及藥學上可接受的載體。79.—種癌癥治療方法，其包括給予患這種癌癥的對象有效量的權利要求1-71中任一項所述的TCR或多價TCR復合物，或多個權利要求72或73所述的細胞，或權利要求74-77中任一項所述的一種或多種核酸。80.權利要求1-71中任一項所述的TCR或多價TCR復合物，或多個權利要求72或73所述的細胞，或權利要求74-77中任一項所述的一種或多種核酸在制備治療癌癥的藥物中的應用。81.—種鑒定具有結合AAGIGILTV-HLA-A*0201特性的高親和力TCR的方法，其特征在于，所述TCR(i)含有至少一個TCRa鏈可變區(qū)和/或至少一個TCR|3鏈可變區(qū)，(ii)對所述AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物的KD小于3pM，所述方法包括(a)制備含有MELTCR的a和p鏈可變區(qū)的TCR的多樣性文庫，其中所述a和卩鏈可變區(qū)之一或二者含有一個或多個突變；(b)在適合于TCR與AAGIGILTV-HLA-A*0201結合的條件下，使所述TCR的多樣性文庫與AAGIGILTV-HLA-A*0201接觸；和(c)測定該相互作用的KD。全文摘要本發(fā)明提供對AAGIGILTV-HLA-A*0201復合物的親和力(K_D)小于或等于3μM和/或解離速率(k_off)為1×10^-3S^-1或更慢的TCR。這些TCR單用或與治療劑聯(lián)用可靶向呈遞這些復合物的癌細胞。文檔編號C07K14/725GK101189261SQ200680019562公開日2008年5月28日申請日期2006年5月31日優(yōu)先權日2005年6月1日發(fā)明者B·K·雅各布森,N·R·利迪申請人:麥迪金有限公司