專利名稱：：具有多功能或結(jié)合特異性的明確組成的改進的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的制作方法具有多功能或結(jié)合特異性的明確組成的改進的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)發(fā)明背景具有多功能或結(jié)合特異性的基于抗體的藥物的現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)，存在很多局限性。對于通過重組工程生產(chǎn)的藥物來說，這些局限可包括生產(chǎn)成本高，表達收率低，在血清中不穩(wěn)定，在溶液中不穩(wěn)定而導(dǎo)致有聚集體或離解亞基形成，因存在多種產(chǎn)物形式并含有污染副產(chǎn)物而導(dǎo)致不確定的批組成，由于位阻因素或構(gòu)型改變而導(dǎo)致的功能活性或結(jié)合親和力/親合力降低，等等。對于用不同化學(xué)交聯(lián)方法生產(chǎn)的藥物來說，兩個主要的局限是生產(chǎn)成本高與純化產(chǎn)物異質(zhì)性。近年來，對于能結(jié)合不止一個抗原決定簇(也稱為表位)的抗體或其它結(jié)合部分，人們的興趣不斷增加。一般來說，天然存在的抗體和單克隆抗體有識別同一表位的兩個抗原結(jié)合位點。相比語)是經(jīng)合成或基因工程改造的可結(jié)合兩個不同表位的結(jié)構(gòu)。因此，同一分子構(gòu)建體中存在能結(jié)合兩個不同抗原決定簇的能力。雙特異性抗體可用于許多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用。例如，具有腫瘤細胞表面抗原結(jié)合位點和T細胞表面受體結(jié)合位點的雙特異性抗體，能導(dǎo)致特定腫瘤細胞被T細胞溶解。識別膠質(zhì)瘤和T細胞CD3表位的雙特異性抗體，已成功地用于治療人類患者的腦腫瘤(Nitta等,Lancet.1990;355:368-371)。已知有多種生產(chǎn)雙特異性抗體的方法。構(gòu)建和利用雙特異性及多特異性抗體的方法，公開于例如美國專利申請公布號20050002945(2004年11月2日申請)，所述文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。雙特異性抗體可通過四源雜交瘤(quadroma)方法生產(chǎn)，該方法包括使兩個不同雜交瘤融合，每個雜交瘤都產(chǎn)生一種識別不同抗原性位點的單克隆抗體(Milstein和Cuello.Nature.1983;305:537-540)。該融合雜交瘤能合成兩個不同重鏈和兩個不同輕鏈，它們能隨機結(jié)合產(chǎn)生具有10種不同抗體結(jié)構(gòu)的異質(zhì)群體，其中只有一個(占全部抗體分子的1/8)是雙特異性的，因而必須進一步純化以與其它形式分開，即使這是可行的但也是不經(jīng)濟的。此外，在細胞遺傳學(xué)上融合雜交瘤經(jīng)常不如親代雜交瘤穩(wěn)定，導(dǎo)致生產(chǎn)細胞系在傳代時有很多問題。另一個生產(chǎn)雙特異性抗體的方法利用雜雙官能交聯(lián)劑，用化學(xué)鍵束縛兩個不同單克隆抗體，致使所得的雜交綴合物能結(jié)合兩個不同草巴標(Staerz等，Nature.1985;314:628-631;Perez等，Nature.1985;316:354-356)。用此方法產(chǎn)生的雙特異性抗體基本上是兩個IgG分子的異源綴合物，它緩慢擴散到組織中并迅速從循環(huán)中清除。雙特異性抗體也可通過如下方法制備將兩個親本單克隆抗體各自還原成相應(yīng)的半個分子，然后混合并氧化得到雜合體結(jié)構(gòu)，從而生產(chǎn)雙特異性抗體(Staerz和Bevan.ProcNatlAcadSciUSA.1986;83:1453-1457)。一個替代方法是利用合適接頭，使兩個或三個單獨純化的Fab'片段發(fā)生化學(xué)交聯(lián)。例如，歐洲專利申請0453082公開了應(yīng)用三-馬來酰亞胺化合物來制備雙特異性或三特異性抗體樣結(jié)構(gòu)。美國專利第6,511,663號提供了一種通過連接結(jié)構(gòu)使三個或四個Fab片段彼此共價連接來制備三價和四價單特異性抗原結(jié)合蛋白的方法。由于所有這些化學(xué)方法都有生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)過程繁復(fù)、純化步驟過多、收率低(<20%)及產(chǎn)物異質(zhì)性等缺點，因此不適于商業(yè)開發(fā)。其它方法包括通過逆轉(zhuǎn)錄病毒衍生的穿梭載體，將帶有不同選擇標記的基因轉(zhuǎn)移到相應(yīng)親本雜交瘤中并隨后使之融合，以提高雜合雜交瘤的生產(chǎn)效率(DeMonte等，ProcNatlAcadSciUSA.1990,87:2941-2945);或者用含有不同抗體的重鏈和輕鏈基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染雜交瘤細胞系。這些方法也面臨上述不可避免的純化問題。美國專利第5，582,9%號公開了產(chǎn)生重組雙特異性抗體的方法，該重組雙特異性抗體由來自相同或不同抗體的Fab片段組成，這些Fab片l殳通過插入該抗體重鏈恒定區(qū)的互補相互作用結(jié)構(gòu)域而締合?；パa相互作用結(jié)構(gòu)域選自交互的亮氨酸拉鏈或一對肽區(qū)段，其中一個含有一系列帶正電荷的氨基酸殘基，而另一個含有一系列帶負電荷的氨基酸殘基。該方法的一個局限性是，含有融合的互補相互作用結(jié)構(gòu)域的各個Fab亞基表現(xiàn)出對其靶抗原的親和力急劇下降，除非兩個亞基結(jié)合在一起。通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的抗體的離散VH區(qū)和VL區(qū)會彼此配對，形成具有結(jié)合能力的二聚體(重組Fv片段)(美國專利第4,642,334號)。然而，這樣非共價締合的分子在生理條件下不夠穩(wěn)定以致沒有實際用途。關(guān)聯(lián)VH區(qū)和VL區(qū)能通過具有合適長度(通常由多于12個氨基酸殘基組成)和合適組成的肽接頭連接起來，形成具有結(jié)合活性的單鏈Fv(scFv)。scFv的生產(chǎn)方法公開于美國專利第4,946，778號和美國專利第5,132,405號。將肽接頭長度減少到少于12個氨基酸殘基，可以避免同一鏈的Vh區(qū)和W區(qū)配對，而迫使Vh區(qū)和V^區(qū)與其它鏈的互補區(qū)配對，形成功能性多聚體。由3-12個氨基酸殘基接頭連接的VH區(qū)和VL區(qū)多肽鏈主要形成二聚體(稱為雙鏈抗體(diabodies))。0-2個氨基酸殘基接頭主要形成三聚體(稱為三鏈抗體(triabodies》和四聚體(稱為四鏈抗體(tetrabodies)),但是除了接頭長度外，寡聚化的確切形式看來還取決于V區(qū)的組成和取向(VH-接頭-Vi或V^接失-Vh)。用5個氨基酸殘基或更短的肽接頭，可得到多價單特異性雙鏈抗體、三鏈抗體和四鏈抗體。利用雙順反子(dicistronic)表達載體也制備了雙特異性雙鏈抗體，該雙特異性雙鏈抗體是兩個不同scFv的異源二聚體，其中每個scFv由一個抗體的VH區(qū)經(jīng)短肽接頭與另一抗體的Vl區(qū)連接而成；所述雙順反子表達載體中的一個順反子含有由Vw-接頭-Vu構(gòu)成的重組基因構(gòu)建體，而另一個順反子含有由VH2-接頭-Vu構(gòu)成的笫二重組基因構(gòu)建體(Holliger等，ProcNatlAcadSciUSA.1993;90:6444-6448;Atwell等，MolImmunol.1996;33:1301-1302;Holliger等，NatureBiotechnol.1997;15:632-631;Helfrich等，Int.JCancer.1998;76:232-239;Kipriyanov等，IntJCancer.1998;77:763-772;Holliger等，CancerRes.1999;59:2909-2916)。最近，也報道了具有雙特異性的四價串聯(lián)雙鏈抗體(稱為串聯(lián)雙鏈抗體(tandab))(Cochlovms等，CancerRes.2000;60:4336-4341)。該雙特異性串聯(lián)雙鏈抗體是兩個相同多肽的二聚體，每個多肽含有兩個不同抗體的四個可變區(qū)(VH,、Vu、VH2、VL2)，這四個可變區(qū)按一定方向連接，以便一旦自締合就形成各自針對兩個不同特異性的兩個潛在結(jié)合位點。迄今為止，尚未構(gòu)建得到表達雙特異性或三特異性三鏈抗體的載體。然而，含有膠原凝集素頸區(qū)(collectinneckregion)的多肽三聚化已有報道(H叩pe等，F(xiàn)EBSLetters.1994;344:191-195)。美國專利第6,190,886號公開了用含有膠原凝集素頸區(qū)的融合蛋白生產(chǎn)同源三聚體或異源三聚體。美國專利第5,844,094號、美國專利第5,837,242號和WO98/44001中公開了通過改變接頭長度，制備基于scFv的多價和多特異性藥物的方法。美國專利第5,989,830號和美國專利第6,239,259號公開了通過構(gòu)建兩條多肽鏈，制備基于scFv的多價和多特異性藥物的方法，其中一條多肽鏈含有來自至少兩個抗體的Vh區(qū)，另一條多肽鏈含有相應(yīng)的區(qū)。用現(xiàn)有技術(shù)產(chǎn)生基于scFv的多價和多特異性藥物的常見問題是表達水平低，產(chǎn)品形式不均一，在溶液中不穩(wěn)定導(dǎo)致聚集，在血清中不穩(wěn)定以及親和力降低。美國專利第6,809,185號公開了通過重組方法產(chǎn)生的雙特異性或三特異性抗體，該抗體中Fab的CHI和Q鏈的C端各自與來自相同或不同單克隆抗體的scFv融合。這項"三鏈體(Tribody)"技術(shù)的主要缺點包括附加的scFv結(jié)合親和性降低，產(chǎn)品形式不均一，在溶液中不穩(wěn)定導(dǎo)致聚集。因此，本領(lǐng)域仍然需要多所述特異性或功能性的多價結(jié)構(gòu)的制備方法，特別是雙特異性抗體的制備方法，這類多價結(jié)構(gòu)的組成確定，純度均一，親和性未改變，并且生產(chǎn)收率高而無需大量的純化步驟。此外，這類結(jié)構(gòu)物必須在血清中足夠穩(wěn)定，以便在體內(nèi)應(yīng)用。需要易于構(gòu)建和/或以相對純的形式獲得的多特異性或功能性的穩(wěn)定多價結(jié)構(gòu)。發(fā)明概述本發(fā)明提供定量產(chǎn)生穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)的平臺技術(shù)，所述結(jié)構(gòu)具有多功能或結(jié)合特異性。在優(yōu)選的實施方案中，通過兩個不同肽序列間特定的相互作用，將這類穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)制備成任何兩個組分(在本文中稱為A和B)的獨特二元復(fù)合物，這兩個肽序列中的一個稱、為二聚/ft和4亭靠結(jié)構(gòu)域(dimedzationanddockingdomain，DDD)，另一個稱為錨定結(jié)構(gòu)域(anchoringdomain,AD)。在更優(yōu)選的實施方案中，DDD序列(見圖1中的DDD1和DDD2)來自依賴cAMP的蛋白激酶(PKA)調(diào)節(jié)(R)亞基，而AD序列(見圖2中的AD1和AD2)來自不同A-激酶錨定蛋白(AKAP)中存在的特定區(qū)域，其介導(dǎo)與PKA的R亞基的締合。然而，技術(shù)人員將會知道，其它二聚化和停靠結(jié)構(gòu)域及錨定結(jié)構(gòu)域是已知的，任何這樣的已知結(jié)構(gòu)域可在本文要求保護的主題范圍之內(nèi)使用。其它示例性的4-螺旋束類型DDD結(jié)構(gòu)域可得自p53、DCoH(肝細胞核因子la(TCF1))的蝶呤4a甲醇胺脫水酶/二聚化輔因子)和HNF-1(肝細胞核因子l)。盡管S100蛋白也表現(xiàn)4螺旋-束DDD序列，但是這些蛋白質(zhì)都具有生物活性，例如使其無法實用的致癌性。具有潛在用途的其它AD序列可參見專利申請順序號US2003/0232420A1，所述文獻的全部內(nèi)容通過引用結(jié)合到本文中。在最優(yōu)選的實施方案中，二元復(fù)合物中的一個組分A是通過重組工程或者經(jīng)間隔基團進行化學(xué)綴合，將DDD序列與A的前體(稱為力)連接而產(chǎn)生的，結(jié)果產(chǎn)生爿/DDD結(jié)構(gòu)(在下文中稱為a)。因為a中的DDD序列影響二聚體的自發(fā)形成，所以A由32組成。二元復(fù)合物中的另一組分B是通過重組工程或者經(jīng)間隔基團進行化學(xué)綴合，將AD序列與B的前體(稱為S)連接而產(chǎn)生的，結(jié)果產(chǎn)生S/AD結(jié)構(gòu)(在下文中稱為b)。二聚體結(jié)構(gòu)包含在a2中，這一事實產(chǎn)生?？课稽c，用于結(jié)合b中所含的AD序列，導(dǎo)致a2與b迅速締合，形成由a2b組成的二元復(fù)合物。在不同實施方案中，這樣的結(jié)合事件還因后續(xù)反應(yīng)而進一步穩(wěn)定化，所述后續(xù)反應(yīng)共價保護了該裝配的兩個組分，例如通過二硫橋，所述反應(yīng)非常有效地發(fā)生，因為起始結(jié)合相互作用使活性硫醇基定向，以便進行位點特異性連接。為了將半胱氨酸殘基放置在DDD和AD序列(如DDD2和AD2所示)的戰(zhàn)略位置上，32與b間可通過二硫橋而發(fā)生共價結(jié)合相互作用，由此形成穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，這使得體內(nèi)應(yīng)用更可行。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)也保留了兩個前體和S的全部功能特性。本發(fā)明人無法公開的設(shè)計在自然界是模塊狀的，因為所選的兩個前體中的每個都可與DDD或AD連接并隨后組合。這兩個前體也可相同04=3)或不同G4-5)。當爿=5時，所得a2b復(fù)合物由穩(wěn)定束縛裝配的3個亞基組成，在下文中稱為a3。適合作為前體的材料包括蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、多核苷酸、RNAz、寡糖、天然或合成聚合物、納米粒、量子點(quantumdot)以及有機或無機化合物?？赡軕?yīng)用的前體的其它非限制性實例見下表6-10。除了使用二硫鍵以防組成性亞基解離之外，也可使用能增強a2b結(jié)構(gòu)的總體穩(wěn)定性的其它方法。例如，可選擇市售的或研究中使用的各種交聯(lián)劑或方法，用于這些目的?？赡苡杏玫脑噭┦俏於?，它已廣泛用于探究非共價締合的多聚體蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，即通過使組成性亞基交聯(lián)，形成穩(wěn)定的綴合物(Silva等，F(xiàn)oodTechnolBiotechnol.2004;42:M-56)。兩種涉及蛋白質(zhì)亞基氧化交聯(lián)的化學(xué)方法也令人感興趣。一個方法是近端標記#支術(shù)(proximitylabelingtechnique),采用六組氨酸標記的蛋白質(zhì)(Fancy等，ChemBiol.1996;3:551-559)或N端甘氨酸-甘氨酸-組氨酸標記的蛋白質(zhì)(Brown等，Biochemistry.1998;37:4397-4406)。這些標記與Ni(II)緊密結(jié)合，當用過酸氧化時，生成Ni(m),Ni(m)能介導(dǎo)各種氧化反應(yīng)，包括蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)。稱為picup(未修飾蛋白質(zhì)的光誘導(dǎo)交聯(lián))的另一技術(shù)采用[Ru(II)(bipy)3:T、過硫酸銨和可見光，以誘導(dǎo)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交聯(lián)(Fancy和Kodadek.ProcNatlAcadSciUSA.1999;96:6020-6024)。然而，如下所述，用于化學(xué)交聯(lián)肽、多肽、蛋白質(zhì)或其它各種大分子的多種方法是本領(lǐng)域已知的，任何這樣的已知方法都可用于使a2b結(jié)構(gòu)共價穩(wěn)定?？梢杂靡蟊Ｗo的方法和組合物開發(fā)各種產(chǎn)物。例如，考慮了至少6類基于蛋白質(zhì)或基于肽的產(chǎn)物，其由穩(wěn)定束縛裝配的基因工程結(jié)構(gòu)組成1類雙特異性三價321)復(fù)合物，由兩個來自同一單克隆抗體(mAb)的Fab或scFv片段以及一個來自不同mAb的Fab或scFv片段組成(參見例如表6);2A類多功能性a^復(fù)合物，由兩個來自同一mAb的Fab或scFv片段以及一個非免疫球蛋白或肽組成(參見例如表7A);2B類多功能性a^復(fù)合物，由兩個相同的非免疫球蛋白或肽以及一個來自mAb的Fab或scFv片段組成(參見例如表7B);3類多功能性321)復(fù)合物，由三個非免疫球蛋白或肽組成，這三個中有兩個是相同的(參見例如表8);4類三價33復(fù)合物，由三個來自同一mAb的Fab或scFv片段組成(參見例如表9);5類三價33復(fù)合物，由三個相同的非免疫球蛋白或肽組成(參見例如表10)。技術(shù)人員將會知道，盡管以上討論涉及Fab或scFv片段，但是在下文中詳細討論的其它類型的抗體和/或抗體片l殳也可被替代。一般來講，1類產(chǎn)物可用于需要雙特異性抗體的各種用途。例如，同時與活化血小板和組織纖溶酶原激活物(tPA)反應(yīng)的雙特異性抗體不僅能通過抑制血小板聚集而防止進一步形成血凝塊，而且能通過將內(nèi)源tPA募集到血小板表面而溶解現(xiàn)有的血凝塊(Neblock等，BioconjugateChem.1991,3:126-31)?！愣裕?A類和2B類產(chǎn)物可用于需要靶特異性遞送或結(jié)合非免疫球蛋白的各種用途。例如，由針對內(nèi)化胂瘤相關(guān)抗原(例如CD74)及與其連接的毒素(例如核糖核酸酶)的雙價抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)組成的穩(wěn)定束綽a2b復(fù)合物，對選擇性遞送毒素以破壞目標腫瘤細胞來說是很重要的。—般而言，3類產(chǎn)物可用于更需要兩種不同非免疫球蛋白組合、而非單個非免疫球蛋白的各種用途。例如，由IL-4R受體的可溶性組分(sIL-4R)以及IL-13受體的可溶性組分(sIL-13R)組成的穩(wěn)定束縛a2b復(fù)合物，將是治療哮喘或變態(tài)反應(yīng)的潛在治療藥?！愣?，4類和5類產(chǎn)物可用于更需要三價復(fù)合物、而非其單價類似物的各種用途。例如，與單價類似物(ReoPro,Centocor)或雙價類似物相比，由三個抗GPIIb/IIIaFab片段組成的穩(wěn)定束縛a3復(fù)合物結(jié)合結(jié)構(gòu)，在預(yù)防血凝塊形成中應(yīng)該更有效，因為后者具有更高結(jié)合親合力。在治療類風濕性關(guān)節(jié)炎和某些其它自身免疫性疾病(AID)中，對于抑制TNF方面來說，由TNFa-R的可溶性組分的三個拷貝組成的穩(wěn)定束縛a3復(fù)合物比Enbrel(Amgen)更有效。要求保護的方法和組合物也包括綴合物，所述綴合物由一種或多種效應(yīng)物或載體及與其連接的a2b或33形式的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)組成。效應(yīng)物或載體可與a2b或a3復(fù)合物非共〗介或共^介連^妄，例如通過化學(xué)交聯(lián)。根據(jù)所需用途，效應(yīng)物可選自診斷試劑、治療藥、化療藥、放射性同位素、放射性核素、顯像劑(imagingagent)、抗血管生成藥、細胞因子、趨化因子、生長因子、藥物、前體藥物、酶、結(jié)合分子、細胞表面受體的配體、螯合劑、免疫調(diào)節(jié)劑、寡核香酸、激素、光檢測標記、染料、肽、毒素、造影劑(contrastagent)、順磁標記、超聲標記、促凋亡劑(pro-apoptoticagent)、月旨質(zhì)體、纟內(nèi)米?；蚱浣M合。此外，綴合物可含有不止一種效應(yīng)物(效應(yīng)物可以相同或不同)或不止一種載體(載體可以相同或不同)。效應(yīng)物和載體也可存在于同一綴合物中。當效應(yīng)物是螯合劑時，所得綴合物通常還與金屬絡(luò)合，所述金屬可以是放射性或非放射性的。含有載體的綴合物還可與診斷或治療功能試劑聯(lián)合用于所需用途。在某些實施方案中，效應(yīng)物或載體可以在給予患者a2b復(fù)合物之后給予，例如在如下討論的預(yù)靶向(pre-targeting)策略中?？上葘2b復(fù)合物給予患者，讓其定位于例如患病組織，例如腫瘤。隨后添加效應(yīng)物或載體，讓其與定位的a2b復(fù)合物結(jié)合。盡管效應(yīng)物或載體與有毒部分(例如放射性核素)綴合，但是這種預(yù)靶向方法減少了患者對毒性的全身暴露，讓毒性劑按更大比例遞送到靶組織。在這樣的實施方案中，A亞基可含有例如腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合位點，而B亞基可含有效應(yīng)物或載體的結(jié)合位點或者含有與效應(yīng)物或載體綴合的半抗原的結(jié)合位點。本文所公開的方法和組合物能使任何兩個結(jié)構(gòu)與DDD/AD偶聯(lián)系統(tǒng)定點共價或非共價締合。DDD結(jié)構(gòu)特征的X類4-螺旋束二聚化基序(Newlon等，EMBOJ.2001;20:1651-1662;Newlon等，NatureStructBiol.1999;3:222-227)存在于其它類型的蛋白質(zhì)中，例如S100蛋白(例如S100B和鈣周期蛋白)和轉(zhuǎn)錄因子的肝細胞核因子(HNF)家族(例如HNF-la和HNF-1(3)。參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄活化的超過300種蛋白質(zhì)也含有6S-70個氨基酸的模塊，稱為不育oc基序(SAM)結(jié)構(gòu)域，其具有在二聚化界面上存在的X類4-螺旋束的變化。對于S100B,該X類4-螺旋束能使各二聚體以孩l摩爾親和力與來自c端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(殘基367-388)的兩個p53肽結(jié)合(Rustandi等，Biochemistry.1998;37:1951-1960)。同樣，HNF-loc的N端二聚化結(jié)構(gòu)域(HNF-pl)顯示出通過HNF-pl二聚體與DCoH二聚體(HNF-1的二聚化輔因子)締合(Rose等，NatureStructBiol.2000;7:744-748)。在替代實施方案中，這些天然存在的系統(tǒng)也可用于要求保護的方法和組合物，以提供具有多功能或結(jié)合特異性的穩(wěn)定的多聚體結(jié)構(gòu)。其它結(jié)合事件例如酶與其底物/抑制劑(例如角質(zhì)酶和膦酸西旨)間的結(jié)合事件(Hodneland等，ProcNatlAcdSciUSA.2002;99:5048-5052)也可用于產(chǎn)生兩個締合組分("?？?步驟)，其隨后經(jīng)共價穩(wěn)定化("鎖定"步驟)。在不同實施方案中，可將題述組合物給予疾病患者，用于治療和/或診斷目的。技術(shù)人員將會知道，可用多功能性、雙價、三價、多特異性或雙特異性復(fù)合物診斷和/或治療的任何疾病，都可用題述組合物治療。示例性的疾病包括但不限于癌癥、增生、神經(jīng)變性性疾病、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease)、脈管炎、病毒感染、真菌感染、細菌感染、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、自身免疫性疾病、炎性腸病、節(jié)段性回腸炎(Crohn，sdisease)、潰瘍性結(jié)腸炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、哮喘、水腫、肺動脈高壓、青少年糖尿病、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼裔、斯耶格倫綜合征(Sj6gren，ssyndrome)、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、膿毒病、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、遺傳性出血性毛細血管擴張(Osler-WebberSyndrome)、心肌血管生成、斑塊新血管形成、再狹窄、血管創(chuàng)傷后新內(nèi)膜形成、毛細管擴張、血友病性關(guān)節(jié)、血管纖維瘤、慢性炎癥相關(guān)的纖維化、肺纖維化、深部靜脈血栓形成或傷口肉芽形成。在具體實施方案中，本文所^開的方法和組合物可用于治療自身免疫性疾病(例如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜)、皮肌炎、小舞蹈病(Sydenham'schorea)、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、風濕熱、多腺性綜合征、大皰性類天皰癡、青少年糖尿病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonleinpurpura)、鏈球菌感染后的腎炎(post-streptococcalnephritis)、結(jié)節(jié)性紅斑、無脈病(Takayasu，sarteritis)、艾迪生病(Addison'sdisease)、類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、結(jié)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動脈炎、關(guān)節(jié)強硬性脊推炎、肺出血腎炎綜合征(Goodpasture'ssyndrome)、閉塞4生血才全'性月永管炎(thromboangitisubiterans)、斯耶格倫綜合征(Sjogren'ssyndrome)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本曱狀腺炎(Hashimoto'sthyroiditis),曱狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常性天皰齊、韋格納肉芽腫病(Wegener，sgranulomatosis)、膜性腎病、肌萎縮性側(cè)索硬化、脊髓癆、巨細胞動脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進性腎小球性腎炎、銀屑病或纖維性肺泡炎。在某些實施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用于癌癥的治療性治療。可以預(yù)料，可以靶向任何類型的腫瘤和任何類型的肺瘤抗原。可以耙向的示例性腫瘤類型包括急性成淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、膽嚢癌、乳癌、宮頸癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkm，slymphoma),肺癌、甲狀腺髓質(zhì)癌、非霍奇金淋巴瘤(Non-Hodgkin，slymphoma))、多發(fā)性骨髓瘤、腎癌、卵巢癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱癌?？梢园邢虻碾狭鱿嚓P(guān)抗原包括但不限于碳酸酐酶IX、A3、A33抗體特異性抗原、BrE3-抗原、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD45、CD74、CD79a、CD80、HLA-DR、NCA95、NCA90、HCG及其亞基、CEA(CEACAM-5)、CEACAM-6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP隱2、Ep-CAM、Ba733、HER2Zneu、低氧誘導(dǎo)因子(HIF)、KC4-抗原、KS-l-抗原、KSl-4、Le-Y、巨復(fù)細胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、PAM-4-抗原、PSA、PSMA、RS5、S100、TAG-72、p53、生腱蛋白、IL-6、IL-8、胰島素生長因子-1(IGF-1)、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、胎盤生長因子(P1GF)、17-lA-抗原、血管生成標記(例如ED-B纖連蛋白)、癌基因標記、癌基因產(chǎn)物和其它肺瘤相關(guān)抗原。目前對腫瘤相關(guān)抗原的報道包括Mizukami等(2005,NatureMed.11:992-97);Hatfield等(2005,Curr.CancerDrugTargets5:229-48);Vallbohmer等(2005,J.Clin.Oncol.23:3536-44);和Ren等(2005,Ann.Surg.242:55-63),所述各文獻通過引用結(jié)合到本文中。其它實施方案涉及治療患者的淋巴瘤、白血病或自身免疫病的方法，即通過給予患者一種或多種劑量的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，其中第二前體的結(jié)合位點與淋巴細胞抗原結(jié)合，第一前體的結(jié)合位點與相同或不同的淋巴細胞抗原結(jié)合。一個或多個結(jié)合位點可與選自以下的抗原的一個或多個獨特表位結(jié)合CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD46、CD52、CD54、CD74、C函、CD126、CD13S、CD154、B7、MUC1、Ia、Ii、固1.24、HLA-DR、生腱蛋白、VEGF、P1GF、ED-B纖連蛋白、癌基因、癌基因產(chǎn)物、NCA66a-d、壞死抗原、IL-2、T101、TAG、IL-6、MIF、TRAIL-R1(DR4)和TRAIL-R2(DR5)。可通過胃腸外給予組合物，劑量例如為每劑20-1500毫克蛋白、每劑20-500毫克蛋白、每劑20-100毫克蛋白、或每劑20-1500毫克蛋白。在又一些實施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用于治療例如細菌、病毒或真菌等病原生物感染的患者?？芍委煹氖纠哉婢ㄐ℃莅泳鷮?A/z'cmsporwm)、發(fā)褲菌屬(7>/c/o//^to")、表皮褲菌屬(五/7/de/7wo//2少to")、申克孑包子絲菌(iS/o/Y^n^:sc/^"ch7)、#f型隱3求菌(C7/7tococcMS/7eq/b/72(5fm1)、4丑3求孑包子菌(Cocc/力oz^fes1z'w,m'"力、莢刀莫組織胞漿菌(7iXsto//"5waca戸w/afMw)、皮炎芽生菌(5/osto附;;ces6fermfl"'^fo)或白色念珠菌(C朋WJaa/6Zcan)。示例性的病毒包括人免疫缺陷病毒(HIV)、皰滲病毒、巨細胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、仙臺病毒、貓白血病病毒、呼腸孤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人血清細小病毒樣病毒(parvo-likevirus)、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒、水痘帶狀皰滲病毒、登革熱病毒、風滲病毒、麻滲病毒、腺病毒、人T細胞白血病病毒、Epstein-Barr病毒、鼠白血病病毒、肥、腺炎病毒、皰滲性口腔炎病毒、辛德比斯病毒(Sindbisvirus)、淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒或藍舌病毒。示例性的細菌包括炭疽芽孢桿菌(5ac〃/ws朋f/irac/s)、無乳鏈球菌(Sfr，ococcwsaga/a"iae)、嗜肺軍團菌(Leg/cwe〃a/wew附o/7/^7/a)、酉良膿葡萄J求菌(5Treptococciw、大腸桿菌(五》c/^n'c/n'"co")、淋病奈瑟氏;求菌(A^/Me廠z'"go"o"/zoeae)、月S膜炎奈瑟氏3求菌(iVe""n'"wem'"gz."cfo)、月巿炎球菌(尸"ewOTococczws/7/7.)、；危感p耆血4干菌B(//ewo/^Z/zi1^)、蒼白密蟲累》走體(7>e/o"e/7ap"〃i(iMm)、萊姆病螺旋體(Lymediseasespirochetes)、綠膿々支單月包菌CP^w6fomo/7cwaerwg7'"ora)、麻風分4支4干菌(A^yco6actehwm/eprae)、流產(chǎn)布魯氏桿菌(3race〃a"/wm^)、結(jié)核分枝桿菌(A/j/coMcten'wwfw6en^/o57力或支原體(A^yco;7/as7wa)。這些穩(wěn)、定束縛結(jié)構(gòu)可包含例如針對病原體上一個或多個抗原決定簇的結(jié)合位點，并且可以與針對病原體的治療藥綴合或連接，所述治療藥例如抗病毒藥、抗生素或抗真菌藥?；蛘?，穩(wěn)定束縛綴合物可包含針對病原體抗原的第一結(jié)合位點和針對半抗原或載體的第二結(jié)合位點，所述半抗原或載體與一種或多種治療藥連接。所采用的針對感染性生物體的、并綴合或摻入或定向結(jié)合所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的治療藥，包括但不限于阿昔洛韋、阿苯達唑、金剛烷胺、阿米卡星、阿莫西林、兩性霉素B、氨千西林、氨曲南、阿奇霉素、桿菌肽、復(fù)方新諾明(bactrim)、巴特芬(Batmfen)⑤、聯(lián)苯千唑、羧千西林、卡泊芬凈、頭孢克洛、頭孢唑林、頭孢菌素類(cephalosporins),頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢噻肟、氯霉素、西多福韋、鹽酸環(huán)丙沙星制劑(Cipro)⑧、克拉霉素、克拉維酸、克霉唑、氯唑西林、多西環(huán)素、益康唑、erythrocycline、紅霉素、甲竭峻、氟康唑、氟胞嘧啶、膦曱酸、呋喃唑酮、更昔洛韋、慶大霉素、亞胺培南、異煙肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、林可霉素、利奈唑胺、美羅培南、咪康唑、米諾環(huán)素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、制霉菌素、奧塞米韋、苯唑西林、巴龍霉素、青霉素、噴他脒、喊拉西纟木-三唑巴坦、利福布汀、利福平、金剛乙胺、鏈霉素、磺胺甲嗯唑、柳氮磺吡啶、四環(huán)素、噻康唑、妥布霉素、托西拉酯、托萘酯、甲氧千啶-磺胺甲嗨唑、伐昔洛韋、萬古霉素、zanamir和zithromycin。盡管并非限制性的，在不同實施方案中，摻入到穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)中的前體可包含一種或多種蛋白質(zhì)，例如細菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、豹蛙酶(Rap)、Rap(N的Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、tPA、細胞因子、生長因子、可溶性受體組分、表面活性蛋白D、IL-4、sIL-4R、sIL-13R、VEGF121、TPO、EPO、溶血栓劑、酶、焚光蛋白、sTNFa-R、avimer、scFv、dsFv或納米抗體(nanobody)。在其它實施方案中，抗血管生成藥可形成前體的一部分或全部，或者可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)連接。使用的示例性抗血管生成藥包括血管生長抑素、baculostatin、人血管能抑素(canstatin)、乳腺絲抑蛋白、抗VEGF抗體或肽、抗胎盤生長因子抗體或肽、抗Flk-l抗體、抗Flt-l抗體或肽、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、IP-IO、Gro-p、血小板應(yīng)答蛋白(thrombospondin)、2-曱氧基雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、馬立馬司他、戊聚糖多聚石克酸酯(pentosanpolysulphate)、促血管生成素2、干擾素-ot、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可石威、染料木堿、TNP-470、內(nèi)皮生長抑素、紫杉醇、accutin、血管生長抑素、西多福韋、長春新堿、博來霉素、AGM-1470、血小板因子4或米諾環(huán)素。在又一些實施方案中，一種或多種例如以下的治療藥可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)綴合或者摻入到其中aplidin、阿4L立平、阿那曲唑、氮雜胞苷、博來霉素、硼替佐米(bortezomib)、苔蘚抑素-1、白消安、加利車霉素、喜樹堿、10-羥基喜樹堿、卡莫司汀、西樂葆、苯丁酸氮芥、順鉑、伊立替康(CPT-ll)、SN-38、卡鉑、克拉曲濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、多西他賽、放線菌素D、葡糖苷酸道諾霉素、柔紅霉素、地塞米松、己烯雌酚、多栗比星、二氫吡咯多柔比星(2P-DOX)、氰基嗎啉代多柔比星、葡糖普酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、依托泊苷、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3',5'-0-二油?；?FudR(FUdR-dO)、氟達拉濱、氟他胺、氟尿嘧啶、氟曱睪酮、吉西他濱、己酸羥孕酮、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、L-天冬酰胺酶、亞葉酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羥孕酮(medroprogesteroneacetate)、醋酸甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、6-巰基嘌呤、曱氨蝶呤、米托蒽醌、光輝霉素、絲裂霉素、米托坦、丁酸苯酯、潑尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、噴司他丁、PSI-341、司莫司汀、鏈佐星、他莫昔芬、紫杉烷類、泰素、丙酸睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、烏4立莫司汀、velcade、長春石成、長春瑞濱、長春新石咸、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶、onconase、mpLRl、DNA酶I、葡萄J求菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、反義寡核苷酸、干擾RNA或其組合。在其它實施方案中，第一前體可與患病組織相關(guān)抗原或其它靶標結(jié)合，而第二前體可設(shè)計成與可尋耙構(gòu)建體(targetableconstruct)結(jié)合，用于遞送一種或多種效應(yīng)物。給予穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)并定位于疾病相關(guān)細胞或組織之后，可以添加可尋耙構(gòu)建體，以結(jié)合定位的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)。任選可給予清除劑，以便從環(huán)境循環(huán)中清除未定位的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，然后再給予可尋靶構(gòu)建體。這些方法是本領(lǐng)域已知的，詳見美國專利第4,624,846號、WO92/19273和Sharkey等，Int.J.Cancer51:266(1992)。示例性的可尋草巴構(gòu)建體具有以下結(jié)構(gòu)X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2,其中該化合物在X或Y上包含硬酸陽離子螯合劑，在剩余X或Y上包含軟酸陽離子螯合劑；并且其中該化合物還包含至少一種診斷性或治療性陽離子，和/或一種或多種螯合的或化學(xué)結(jié)合的治療藥、診斷試劑或酶。診斷試劑可以是例如Gd(III)、Eu(III)、Dy(III)、Pr(III)、Pa(IV)、Mn(II)、Cr(m)、Co(III)、Fe(III)、Cu(II)、Ni(II)、Ti(III)、V(IV)離子或基團。第二個示例性的構(gòu)建體可以是下式X-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Y)-NH2，其中該化合物在X或Y上包含硬酸陽離子螯合劑或軟酸螯合劑，而在剩余X或Y上沒有；并且其中該化合物還包含至少一個診斷性或治療性陽離子，和/或一種或多種螯合的或化學(xué)結(jié)合的治療藥、診斷試劑或酶。不同實施方案可涉及用于誘導(dǎo)患病細胞凋亡的穩(wěn)定束縳結(jié)構(gòu)及其使用方法。詳情可參見美國專利申請公布號20050079184，所迷專利申請的全部內(nèi)容都通過引用結(jié)合到本文中。這類結(jié)構(gòu)可包含具有針對選自以下抗原的結(jié)合親和性的第一和/或第二前體CD2、CD3、CD8、CDIO、CD21、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD48、CD52、CD55、CD59、CD70、CD74、CD80、CD86、CD138、CD147、HLA-DR、CEA、CSAp、CA-125、TAG-72、EFGR、HER2、HER3、HER4、IGF-1R、c-Met、PDGFR、而C1、固C2、固C3、MUC4、TNFR1、TNFR2、NGFR、Fas(CD95)、DR3、DR4、DR5、DR6、VEGF、PIGF、ED-B纖連蛋白、生腱蛋白、PSMA、PSA、碳酸酐酶IX和IL-6。在更具體的實施方案中，用于誘導(dǎo)細胞凋亡的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)可包含單克隆抗體、Fab片段、嵌合抗體、人源化抗體或人抗體或片段。在優(yōu)選的實施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可包含以下抗體的組合抗CD74X抗CD20、抗CD74X抗CD22、抗CD22X抗CD20、抗CD20X抗HLA-DR、抗CD19X抗CD20、抗CD20X抗CD80、抗CD2X抗CD25、抗CD8X抗CD25和抗CD2X抗CD147。在更優(yōu)選的實施方案中，嵌合抗體、人源化抗體或人抗體或抗體片段可來自LL2(抗CD22)、LL1(抗CD74)或A20(抗CD20)的可變區(qū)。不同實施方案可涉及治療炎性和免疫失調(diào)疾病、感染性疾病、病理性血管生成或癌癥的方法。在本申請中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)與選自以下的兩個不同靶標結(jié)合(A)先天免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物，(B)凝血因子，(C)補體因子和補體調(diào)節(jié)蛋白，和(D)與炎性或免疫失調(diào)障礙或與病理性血管生成或癌癥特異性相關(guān)的靶標，其中后一靶標不是(A)、(B)或(C)。至少一個靶標是(A)、(B)或(C)。合適的靶標組合參見美國臨時申請第60/634,076(2004年12月8日申請，發(fā)明名稱為"MethodsandCompositionsforImmunotherapyandDetectionofInflammatoryandImmune-DysregulatoryDisease,InfectiousDisease,PathologicAngiogenesisandCancer"),所迷臨時申i青的內(nèi)容通過引用全部結(jié)合到本文中。結(jié)合分子可結(jié)合的先天免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物，可以是促炎效應(yīng)物細胞因子、促炎效應(yīng)物趨化因子或促炎效應(yīng)物受體。合適的促炎效應(yīng)物細胞因子包括MIF、HMGB-1(高遷移率族框蛋白1(highmobilitygroupboxproteinl))、TNF-a、IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IL隱8、IL-12、IL-15和IL-18。促炎效應(yīng)物趨化因子的實例包括CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-IO、GROB和嗜酸性粒細胞趨化因子(Eotaxin)。促炎效應(yīng)物受體包括IL-4R(白介素-4受體)、IL-6R(白介素-6受體)、IL-UR(白介素-13受體)、IL-15R(白介素-15受體)和IL-18R(白介素-18受體)。結(jié)合分子也可與至少一種凝血因子(尤其是組織因子(TF)或凝血酶)發(fā)生特異性反應(yīng)。在其它實施方案中，結(jié)合分子與至少一種補體因子或補體調(diào)節(jié)蛋白特異性反應(yīng)。在優(yōu)選的實施方案種，補體因子選自C3、C5、C3a、C3b和C5a。當結(jié)合分子與補體調(diào)節(jié)蛋白特異性反應(yīng)時，補體調(diào)節(jié)蛋白優(yōu)選選自CD46、CD55、CD59和mCRP。附圖簡述圖1顯示兩個示例性DDD序列。DDD1中加下劃線的序DDD2(SEQIDNO:2)在N端有兩個氨基酸與DDD1不同。圖2顯示兩個示例性AD序列。AD1中加下劃線的序列(SEQIDNO:3)對應(yīng)于AKAP-w，它是據(jù)報道Kd為0.4nM的優(yōu)化RII-選才奪性肽。也顯示了AD2(SEQIDNO:4)。圖3顯示RII的DDD與AKAP的AD之間相互作用的結(jié)構(gòu)模型。圖4顯示N-DDD2-Fab-hMN-14(A)以及由DDD2介導(dǎo)的二聚化而形成的推定的a2結(jié)構(gòu)(B)的示意圖。圖5顯示N-DDD2-VH-hMN-14-pdHL2質(zhì)粒表達載體的設(shè)計。圖6顯示C-DDD2-Fab-hMN-14(A)以及由DDD2介導(dǎo)的二聚化而形成的推定的a2結(jié)構(gòu)(B)的示意圖。圖7顯示C-DDD2-VH-hMN-14-pdHL2質(zhì)粒表達載體的設(shè)計。A)及其推定的結(jié)構(gòu)(B)的示意圖。圖9顯示h6"-VH-AD2-pdHL2質(zhì)粒表達載體的設(shè)計。圖10顯示用IMP-291-Affigel純化的h679-Fab-AD2的SE-HPLC分析。圖11顯示h679-Fab-AD2ds(A)通過還原而活化成h679-Fab-AD2(B)的示意圖。圖12顯示用CBindL(蛋白L纖維素)純化的N-DDD2-Fab-hMN-14中占優(yōu)勢存在34型。SE-HPLC描記圖也揭示了存在a2型，以及以單體形式和二聚體形式存在的游離輕鏈。圖13顯示當用5mMTCEP還原時，純化的N-DDD2-Fab-hMN-14中存在的34型解離成32型，5mMTCEP也將二聚體輕鏈轉(zhuǎn)化成單體輕鏈。圖14顯示當還原時，N-DDD2-Fab-hMN-14的a4型(A)轉(zhuǎn)化成a2型(B)的示意圖。圖15顯示用CBindL(蛋白L纖維素)純化的C-DDD2-Fab-hMN-14中占優(yōu)勢存在34型。SE-HPLC描記圖也揭示了存在a2型，以及以單體形式和二聚體形式存在的游離輕鏈圖16顯示當用5mMTCEP還原時，純化的C-DDD2-Fab-hMN-14中存在的34型解離成32型。圖17顯示(A)在還原條件下當N-DDD2-Fab-hMN-14與h679-Fab-AD2混合時所形成的非共價a2b復(fù)合物和(B)通過二6H橋形成的共價TF1結(jié)構(gòu)的示意圖?！?059]圖18顯示包括產(chǎn)生TF1的步驟的SE-HPLC分析。圖A顯示在添加TCEP之前含有N-DDD2-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD2的反應(yīng)混合物。圖B顯示在添加5mMTCEP之后，形成非共價a2b復(fù)合物。圖C顯示用10%DMSO處理后經(jīng)二斬J建連接的產(chǎn)物。圖D顯示經(jīng)IMP-291-親和色譜和制備型SE-HPLC后TF1的純度。圖19顯示在BIAcore分析所采用的條件下，僅共價TF1結(jié)構(gòu)能同時結(jié)合HSG(作為IMP-239固定在傳感器芯片上)和WI2(針對hMN-14的抗id)。N-DDDl-Fab-hMN-14與h679-Fab-ADl之間所形成的非共價a2b復(fù)合物未能捕獲WI2,雖然已與偶聯(lián)HSG的傳感器芯片結(jié)合。圖20顯示TF1含有hMN-14的兩個功能性結(jié)合位點，因為它能結(jié)合WI2的兩個Fab分子。圖21顯示在組分A和B的DDD和AD序列中戰(zhàn)略性放置半胱氨酸殘基的作用，以影響穩(wěn)定結(jié)構(gòu)(N-DDD2+AD2)的形成，該結(jié)構(gòu)在BIAcore分析所采用的條件下能同時結(jié)合HSG(作為IMP-239固定在傳感器芯片上)和WI2(針對hMN-14的抗id)。在DDD與AD特異性結(jié)合后，當組分A不能與組分B形成二硫鍵時，所得321>復(fù)合物在BIAcore分析所采用的條件下不夠穩(wěn)定，不能保持結(jié)合在一起。32與b解離是明顯的，因為復(fù)合物(N-DDD1+AD2)不能捕獲WI2。圖22顯示IMP-291親和純化之前(A)和之后(B)的SE-HPLC分析。將過量N-DDD2-Fab-hMN-14與h679-Fab-AD2混合，以保證在IMP-291親和色譜后，沒有游離h679-Fab-AD2與穩(wěn)定束縛復(fù)合物一起純化出來。圖23顯示TF2的示意圖。圖24顯示包括產(chǎn)生TF2的步驟的SE-HPLC分析。圖A顯示在添加TCEP之前含有C-DDD2-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD2的反應(yīng)混合物。圖B顯示在添加5mMTCEP之后形成非共價a2b復(fù)合物。圖25顯示對TF2的IMP-291親和純化的SE-HPLC分析。圖A顯示上樣到IMP-291-affigel之前的TF2。圖B顯示未結(jié)合流分。圖C顯示結(jié)合流分，僅包含TF2。圖26顯示TF2的(A)非還原性和(B)還原性SDS-PAGE分析。圖27顯示TF2的MALDI-TOF質(zhì)i普分析。圖28顯示通過BIAcore分析，TF2與HSG(固定在傳感器芯片上)和WI2的結(jié)合。圖29顯示TF2含有hMN-14的兩個功能性結(jié)合位點，因為它能結(jié)合WI2的兩個Fab分子。圖30顯示比較TF1、TF2和hMN-14IgG對CEA的親合力的竟爭性ELISA結(jié)果。圖31顯示在7天為一個周期，監(jiān)測TF2在合并人血清中的穩(wěn)定性結(jié)果。在濃度或雙特異性結(jié)合活性方面都沒有觀察到可;險測變化。圖32顯示注射99mTc-IMP-245的、用TF2預(yù)靶向的棵鼠體內(nèi)造影。給雌性無胸腺棵鼠皮下(s.c.)注射1x107LS-174T腫瘤細胞/小鼠。一周后，平均腫瘤大小為0.105±0.068cm3。給20只為一組的第一組小鼠每只注射80嗎125I-TF2(500pmol,2pCi),在給予TF2后16小時給予99mTc-IMP-245(40^Ci，92ng，50pmol)(圖像中上面一排)。笫二組小鼠僅給予99mTc-IMP-245,沒有TF^圖像中下面一排)。注射99mTc-IMP-245后1、4和24小時的圖像顯示出強的胂瘤特異性信號，TF2定位于腫瘤(上面一排)。不同于腫瘤，在1小時時僅膀胱具有強烈信號，表明從尿液中排出。在不存在TF2時僅觀察到非特異性分布(下面一排)。數(shù)據(jù)表明，TF2對體內(nèi)應(yīng)用來說是高度穩(wěn)定的，能提供良好的肺瘤造影。發(fā)明詳述在某些實施方案中，提供了新的a2b形式的穩(wěn)定束縛二元復(fù)合物及其制備方法。一般而言，二元復(fù)合物是由非共價連接的同型二聚體結(jié)構(gòu)(稱為A或a。與第二結(jié)構(gòu)(稱為B或b)經(jīng)位點特異性締合而形成。所得a2b結(jié)構(gòu)可經(jīng)A與B間非共價、或優(yōu)選共〗介相互作用(例如二硫鍵)而穩(wěn)定。A是由兩個相同亞基構(gòu)成，其中每個亞基都由前體與肽序列連接而組成，稱為二聚化和4f靠結(jié)構(gòu)域(DDD),在優(yōu)選實施方案中DDD來自依賴cAMP的蛋白激酶(PKA)。亞基中所含的DDD結(jié)構(gòu)域自發(fā)締合形成穩(wěn)定的同型二聚體，而這樣的締合又對肽序列產(chǎn)生具有高親和性的結(jié)合位點，稱為錨定結(jié)構(gòu)域(AD),該AD在例如各種A-激酶錨定蛋白(AKAP)中存在，而且在B中含有。因此，B由前體與AD連接而組成。通過AD肽與(DDD)2結(jié)合位點的相互作用，很容易地進行二元復(fù)合物的裝配。DDD肽可插入到幾乎任何多肽序列中或束縛到任何前體中，只要這樣的衍生不干擾其二聚化、以及與AD肽結(jié)合的能力。同樣，AD肽可插入到幾乎任何多肽序列中或束綽到任何前體中，只要這樣的衍生不干擾其與同型二聚體DDD結(jié)合位點的結(jié)合。該模塊方法是高度通用的，可用于將幾乎任何A與任何B結(jié)合形成二元裝配物，該二元裝配物含有來自A的前體的兩個亞基(32)和來自B的前體的一個亞基(b)。當A和B的前體都含抗體結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可與第二抗體結(jié)構(gòu)域締合產(chǎn)生抗原結(jié)合位點(例如Fab或scFv)，則所得a2b復(fù)合物是雙特異性和三價的。在某些實施方案中，二元復(fù)合物可通過例如化學(xué)綴合而與效應(yīng)物(例如配體或藥物)連接，與載體(例如葡聚糖或納米粒)連接，或同時與效應(yīng)物和載體連接，通過這樣的修飾而具有額外用途。因為二元復(fù)合物的穩(wěn)定性基本取決于A中所含的DDD對B中所含的AD的結(jié)合親和性，經(jīng)平衡尺寸排阻HPLC分析估計，對于兩種原型a2b結(jié)構(gòu)來說，其親和性不大于8nM(描述于實施例5)，這兩種原型是C端融合AD1構(gòu)建體(h679-Fab-ADl，參見實施例3)至C端或N端融合DDD1構(gòu)建體(C-DDDl-Fab-hMN-14或N-DDD1-Fab-hMN-14,都參見實施例4)而形成，共價連接a2b復(fù)合物中所含的A和B，將會防止各個亞基的不合要求的締合，因而方便體內(nèi)應(yīng)用。為了使二元復(fù)合物穩(wěn)定，可將半胱氨酸殘基引入DDD和AD序列的戰(zhàn)略位置上，使DDD與AD間能形成二好"建?？刹捎闷渌椒ɑ虿呗裕ㄟ^使32和b交聯(lián)而形成穩(wěn)定復(fù)合物。例如，采用戊二醛或PICUP方法，組成性亞基可以低特異性方式、以低效率，彼此共價連接。也可使用其它已知的共價交聯(lián)方法。定義在下面的描述中，使用各種術(shù)語，提供以下定義以便于理解本文所公開的內(nèi)容。尚未明確定義的術(shù)語按其通常含義來使用。包括復(fù)數(shù)形式。本文所用的術(shù)語"和"和"或"可用于指與(conjunctive)或析取(disjunctive)。也就是說，這兩個術(shù)語應(yīng)當理解為等同于"和/或"，除非另有說明。錨定結(jié)構(gòu)域(anchoringdomam,AD)是對二聚化DDD序列具有結(jié)合親和性的肽序列。盡管示例性AD序列可得自任何A-激酶錨定蛋白(AKAP),但也可使用其它已知AD序列。術(shù)語前體按其物質(zhì)的通常含義來使用，自該物質(zhì)能形成更穩(wěn)定而確定的產(chǎn)物或終產(chǎn)物。本文所用的結(jié)合分子、結(jié)合部分或靶向分子是可特異性結(jié)合耙分子、細胞、復(fù)合物和/或組織的任何分子。結(jié)合分子可包括但不限于抗體或其片段、類似物或模擬物、avimer、適體或把向肽。本文所述的抗體是指全長(即天然存在的或經(jīng)標準免疫球蛋白基因片段重組方法而形成的)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體)或免疫活性(即特異性結(jié)合)部分或免疫球蛋白分子類似物，例如抗體片段?？贵w片段是抗體部分，例如F(ab)2、F(ab')2、Fab、Fv、sFv等。無論其結(jié)構(gòu)如何，抗體片段所結(jié)合的抗原與完整抗體所識別的抗原相同。術(shù)語"抗體片段"也包括任何合成或基因工程蛋白質(zhì)，其作用類似于抗體，是通過結(jié)合特異性抗原而形成復(fù)合物。例如，抗體片段包括由可變區(qū)組成的分離的片段(例如由重鏈和輕鏈可變區(qū)組成的"Fv"片段)、重組單鏈多肽分子(其中輕鏈和重鏈可變區(qū)由肽接頭連接("scFv蛋白"))以及最小識別單元(由模擬超變區(qū)的氨基酸殘基組成)。效應(yīng)物是產(chǎn)生所選結(jié)果的原子、分子或化合物。效應(yīng)物可包括治療藥和/或診斷試劑。治療藥是可用于治療疾病的原子、分子或化合物。治療藥的實例包括抗體、抗體片段、肽、藥物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫調(diào)節(jié)劑、反義寡核苷酸、小干擾RNA(siRNA)、螯合劑、硼化合物、光敏劑、染料和放射性同位素。所采用的其它示例性治療藥和方法公開于美國專利公布號20050002945、20040018557、20030148409和20050014207，所述各專利通過引用結(jié)合到本文中。診斷試劑是可用于診斷疾病的原子、分子或化合物。有用的診斷試劑包括但不限于放射性同位素、染料(例如帶有生物素-鏈霉抗生物素復(fù)合物)、造影劑、熒光化合物或分子以及用于磁共振成像(MRI)的增強劑(例如順磁離子)。免疫綴合物是結(jié)合分子(例如抗體組分)與原子、分子或高級結(jié)構(gòu)(例如與載體、治療藥或診斷試劑)的綴合物。[OO卯]棵抗體是未與任何其它藥物或試劑綴合的抗體。載體是能與治療藥或診斷試劑締合、以便將這些藥物或試劑遞送到靶細胞的原子、分子或高級結(jié)構(gòu)。載體可包含脂質(zhì)(例如能形成高級結(jié)構(gòu)的兩親性脂質(zhì))、多糖(例如葡聚糖)、肽、蛋白質(zhì)或其它高級結(jié)構(gòu)，例如膠束(micelle)、脂質(zhì)體或納米粒。本文所用的術(shù)語抗體融合蛋白是重組產(chǎn)生的抗原結(jié)合分子，其中具有相同或不同特異性的兩個以上相同或不同scFv或抗體片段連接在一起。融合蛋白的價表示融合蛋白對單個抗原或表位具有多少結(jié)合臂或位點；即單價、雙價、三價或多價?？贵w融合蛋白的多價表明它在結(jié)合抗原時可利用多重相互作用，因此增加了結(jié)合抗原的親合力。特異性表示抗體融合蛋白能結(jié)合多少抗原或表位；即單特異性、雙特異性、三特異性、多特異性。使用這些定義，天然抗體(例如IgG)是雙價的，因為具有兩個結(jié)合臂，但卻是單特異性的，因為能結(jié)合一個表位。單特異性的多價融合蛋白具有不止一個表位結(jié)合位點，但只結(jié)合一個這樣的表位，例如雙鏈抗體具有能與同一抗原反應(yīng)的兩個結(jié)合位點。融合蛋白可包含單個抗體組分、不同抗體組分的多價或多特異性組合、或者同一抗體組分的多個拷貝。融合蛋白還可包含抗體或抗體片段以及治療藥。適用于這樣的融合蛋白的治療藥的實例包括免疫調(diào)節(jié)劑("抗體-免疫調(diào)節(jié)劑融合蛋白")和毒素("抗體-毒素融合蛋白")。一個優(yōu)選的毒素包括核糖核酸酶(RNA酶)，優(yōu)選重組RNA酶。多特異性抗體是能同時結(jié)合不同結(jié)構(gòu)的至少兩個靶標(例如兩種不同抗原、同一抗原的兩個不同表位、或半抗原和/或抗原或表位)的抗體。多價抗體是能同時結(jié)合相同或不同結(jié)構(gòu)的至少兩個耙標的抗體。雙特異性抗體是能同時結(jié)合不同結(jié)構(gòu)的兩個耙標的抗體。特別令人感興趣的雙特異性抗體和雙特異性抗體片段具有至少一個臂(該臂能特異性結(jié)合例如B細胞、T細胞、骨髓細胞、漿細胞和肥大細胞抗原或表位)以及至少一個其它臂(該臂能特異性結(jié)合攜帶治療藥或診斷試劑的可尋靶綴合物)。本文所用的功能性蛋白質(zhì)是具有生物活性的蛋白質(zhì)。如果所給予的劑量具有生理上的意義時，就可以說是以"治療有效量"給予抗體或免疫綴合物制劑或本文所述的組合物。當受體哺乳動物的生理狀態(tài)因一種藥物或試劑的存在而導(dǎo)致可檢測的變化時，該藥物或試劑就具有生理上的意義。具體地講，當抗體制劑的存在產(chǎn)生了抗腫瘤反應(yīng)或減輕自身免疫性疾病狀態(tài)的體征和癥狀時，該制劑就具有生理上的意義。生理意義的效果也可以是誘導(dǎo)受體哺乳動物的體液和/或細胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致生長抑制或靶細胞死亡。如果給予的組合物是受體患者可耐受的，就可以說該組合物是"藥學(xué)上可接受的載體"。無菌磷酸緩沖鹽溶液就是藥學(xué)上可接受的載體的一個實例。其它合適載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。參見例如REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,第19X反(MackPublishingCo.1995)和GoodmanandGilman的THEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS(Goodman等編著.MacmillanPublishingCo.,NewYork,1980和2001出版)。產(chǎn)生模塊亞基的穩(wěn)定束縛裝配的方法本文所公開的方法和組合物提供產(chǎn)生模塊亞基的穩(wěn)定束縛裝配的平臺技術(shù)。一個實施方案涉及由兩個確定組分(A和B)形成的穩(wěn)定束縛二元復(fù)合物，這兩個組分優(yōu)選分別制備。然而，在替代實施方案中，A和B可一起制備，例如通過用同時編碼A和B的載體、或者用分別編碼A和B的兩個不同載體轉(zhuǎn)染單細胞系。當A和B都是Fab片段時，優(yōu)選分別制備，否則，如果同時制備的話，將會因輕鏈顛倒(scrambling)而產(chǎn)生不同產(chǎn)物。在某些實施方案中，由兩個相同亞基(a》組成的A與由一個亞基(b)組成的B結(jié)合，形成a2b構(gòu)型的裝配。A與B的締合是位點特異性的，而且是自發(fā)的，因為A和B中分別構(gòu)建的DDD與AD序列間具有強烈的結(jié)合相互作用。A和B都可以是任何實體，連接DDD的A的前體可與連接AD的B的前體不同或相同。在后一種情況下，所得a2b復(fù)合物(稱為33)由三個亞基組成，每個亞基都含有相同前體，但都連接DDD和AD。要求保護的方法和組合物的模塊特性允許將任何A與任何B組合。對可連接A和B或者摻入其中的前體類型基本上沒有限制，只要它們不妨礙DDD二聚化或DDD與AD的結(jié)合。當經(jīng)重組工程而構(gòu)建時，可在不同宿主細胞中獨立制備(或者在如上所述的同一宿主細胞中制備)、純化并貯存A和B。然而，在裝配之前，并非絕對需要對A和B進行純化。在合適條件下，可將含有A和B的細胞提取物或培養(yǎng)物直接混合，從而形成二元復(fù)合物，然后在氧化后通過二硫鍵而穩(wěn)定該復(fù)合物，再進行純化。在某些應(yīng)用中，最好在純化之后、與A混合之前，將B與效應(yīng)物或載體綴合。或者，最好在純化之后、與B混合之前，將A與效應(yīng)物或載體綴合。最好在混合之前，還用效應(yīng)物或載體修飾A和B。另外，在某些應(yīng)用中，最好將a2b復(fù)合物與效應(yīng)物或栽體綴合。當在同一宿主細胞中制備A和B時，它們可自發(fā)裝配成321)復(fù)合物。優(yōu)選的實施方案利用依賴cAMP的蛋白激酶(PKA)調(diào)節(jié)亞基與天然存在的A-激酶錨定蛋白(AKAP)錨定結(jié)構(gòu)域之間的特定的蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用。PKA于1968年首次報道(參見Walsh等，J.Biol.Chem.243:3763-65(1968.))。在二十世紀七十年代中期才闡明全酶結(jié)構(gòu)，是由兩個催化亞基組成，這兩個亞基通過調(diào)節(jié)(R)亞基二聚體維持無活性形式(參見Corbin等，J.Biol.Chem.248:1813-21(1973))。發(fā)現(xiàn)兩類R亞基(RI和RII)，各自具有a和P同種型。已經(jīng)分離出R亞基，是穩(wěn)定二聚體，而且已經(jīng)知道二聚化結(jié)構(gòu)域是由前44個氨基端殘基組成(參見Hausken等，J.Biol.Chem.271:29016-22(1996))。作為廣譜絲氨g吏/蘇氨酸激酶的PKA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特異性，是通過全酶經(jīng)?？康鞍?稱為A-激酶錨定蛋白(AKAP》區(qū)室化而得到的(Scott等，J.Biol.Chem.265:21561-66(1990》。AKAP(微管相關(guān)蛋白-2)首先于1984年完成表征(Lohmann等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.81:6723-27(1984))。迄今為止，已經(jīng)鑒定出了超過50種結(jié)構(gòu)不同的AKAP，其物種范圍從酵母到人類(參見Wong等，NatRevMolCellBiol.12:959-70(2004》。AKAP的PKA錨定結(jié)構(gòu)域是14-18個殘基的兩親性螺旋(參見Carr等，J.Biol.Chem.266:14188-92(1991))。PKA錨定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在AKAP中是相當多變的，對RII二聚體的結(jié)合親和性范圍為2-90nM,而對RI二聚體的結(jié)合親和性低約100倍(參見Alto等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.100:4445-50(2003》。錨定結(jié)構(gòu)域與RII二聚體上由RII的氨基端前23個殘基所形成的疏水表面相結(jié)合(Colledge等，TrendsCellBiol.6:216-21(1999))。因此，RII二聚化結(jié)構(gòu)域和AKAP結(jié)合結(jié)構(gòu)域全都位于相同的44個氨基酸序列中。此外，AKAP只與RII二聚體結(jié)合，而不與單體結(jié)合。這種相互作用的結(jié)構(gòu)模型見圖3。通過DDD和AD序列相互作用而形成的a2b或a3復(fù)合物可以經(jīng)共價鍵穩(wěn)定，以允許體內(nèi)應(yīng)用?？赏ㄟ^將半胱氨酸殘基同時引入DDD和AD序列的戰(zhàn)略位置上而達到這一目的(如DDD2和AD2所示)，以便在^與b間形成二硫鍵?；蛘?，也可采用其它已知類型的共價交聯(lián)。當通過重組工程產(chǎn)生二元復(fù)合物的兩個組分(A和B)時，可在同一宿主細^^內(nèi)合成它們，或更優(yōu)選在兩個不同的宿主細^^系內(nèi)合成。指導(dǎo)A合成的表達載體含有目標多肽(J)的DNA序列，該序列與PKAR-亞基的DDD(例如DDDl或DDD2)編碼序列融合，其由RIa、RI(3、RIIa、RIip或任何天然或合成的功能類似物的前30個或更多氨基酸組成。DDD可以直接與j的氨基端或羧基端偶聯(lián)，或者優(yōu)選通過間隔區(qū)(其含有氨基酸殘基的合適長度或組成)與j的氨基端或羧基端偶聯(lián)?；蛘?，可將DDD放在融合蛋白內(nèi)部，只要不影響DDD的結(jié)合活性和多肽融合配偶體的所需活性。合成后，A/DDD融合蛋白將會與DDD1專一地形成穩(wěn)定的同型二聚體(32)或者與DDD2主要形成穩(wěn)定同型四聚體(a》。亞基的模塊特性允許任何DDD2-多肽二聚體與任何AD2-多肽組合。各種34/32和b模塊亞基的貯液可以純化產(chǎn)物形式或未純化的細胞培養(yǎng)物上清液形式分別保存，隨后視需要進行混合，以得到各種321)結(jié)構(gòu)。本文所公開的方法和組合物可用于提供基于重組抗體的多價結(jié)合結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以是單特異性或雙特異性的。例如，DDD2序列可以與單鏈Fv融合，得到34/1)2形式的單特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)。更通常的是，DDD序列可以與抗體可變區(qū)融合，其可與互補抗體可變區(qū)締合，形成抗原結(jié)合位點。例如，DDD1或DDD2序列可與含有VH區(qū)和CH1區(qū)的抗體序列融合(Fd/DDD),或可與Vl區(qū)和CL區(qū)融合(L/DDD)。Fd/DDD或L/DDD再可分別與互補L或Fd締合，形成Fab/DDD,然后形成Fab/DDD1二聚體或Fab/DDD2四聚體和/或二聚體。同樣，類似于AD2，AD序列可與單鏈Fv融合，或更常見的是與含有VH區(qū)和CH1區(qū)的抗體序列融合(Fd/AD2),當與關(guān)聯(lián)L-鏈配對時，其形成Fab/AD2?；蛘撸愃朴贏D2,AD序列可與含有區(qū)和CL區(qū)的抗體序列融合，當與關(guān)聯(lián)Fd鏈配對時，其形成Fab/AD2。將Fab/DDD2四聚體/二聚體與Fab/AD2混合，然后經(jīng)還原和氧化，產(chǎn)生三價結(jié)合結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定束綽裝配，該結(jié)構(gòu)可以是單特異性的(a》或雙特異性的(a2b)。結(jié)合結(jié)構(gòu)的VH區(qū)和、區(qū)可來自"人源化，，單克隆抗體或來自人抗體?；蛘?，Vh和/或區(qū)可包含來自從組合免疫球蛋白文庫中分離得到的人抗體片段序列。參見例如Barbas等，Methods:AcompaniontoMethodsinEnzymology2:119(1991)和Winter等，Ann.Rev.Immunol.12:433(1994)?？蓮睦鏢TRATAGENE克隆系統(tǒng)(LaJolla,Calif.)得到克隆載體和表達載體，用于產(chǎn)生人免疫球蛋白噬菌體文庫。人抗體Vh或Vt序列可來自小鼠產(chǎn)生的人單克隆抗體。這類抗體得自轉(zhuǎn)基因小鼠，該類小鼠已經(jīng)"工程改造"而在響應(yīng)抗原攻擊時產(chǎn)生特定人抗體。在該技術(shù)中，將人重鏈和輕鏈基因座元件引入源自胚胎干細胞系的小鼠品系中，該類胚胎干細胞系含有定向破壞的內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座。轉(zhuǎn)基因小鼠可合成對人抗原具有特異性的人抗體，而且小鼠可用于產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠得到人抗體的方法參見Green等，NatureGenet7:13(1994),Lonberg等，Nature368:856(1994)和Taylor等，Int.Immim.6:579(1994)。含有抗體片段的重組融合蛋白的通用制備方法可以通過本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)，得到編碼能識別特定表位的抗體片段的核酸序列。例如，可使用分泌具有所需特異性的抗體的雜交瘤，得到抗體編碼DNA,可用PCR或傳統(tǒng)cDNA克隆技術(shù)等已知技術(shù)來制備這樣的DNA。或者，可以構(gòu)建Fab'表達文庫或抗體噬菌體展示文庫，以篩選具有所需特異性的抗體片段。然后，可將編碼抗體片段的核酸與編碼DDD或AD的核酸直接連接，或通過編碼肽間隔區(qū)的序列間接連接。產(chǎn)生編碼這類融合蛋白的核酸序列的方法是本領(lǐng)域眾所周知的，而且在以下實施例中有進一步討論。在另一個實施方案中，可將額外氨基酸殘基添加在由爿/DDD或S/AD組成的模塊亞基的N端或C端，其中準確的融合位點取決于DDD或AD是否與N端或C端(或內(nèi)部位置)連接。額外氨基酸殘基可包括肽標記、信號肽、細胞因子、酶(例如前體藥物活化酶)、激素、毒素、肽藥物、膜相互作用肽或其它功能性蛋白。用所需宿主細胞制備重組蛋白的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。為了便于純化，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可含有合適肽標記，例如FLAG序列或多聚組氨酸序列，以便用相應(yīng)的親和柱進行純化。適于表達穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)組成性亞基的示例性表達系統(tǒng)是pdHL2載體，該載體具有可擴增的鼠dhfr基因，允許通過甲氨蝶呤處理而進行選擇和擴增。參見Gillies等，J.Immunol.Methods125:191(1989)。pdHL2載體提供兩個基因的依賴型表達，其由兩個金屬硫蛋白(metallothiomne)啟動子和IgH增強子獨立控制。用于穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)組成性亞基表達的合適宿主細胞或細胞系是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。采用人宿主細胞，使得任何表達的分子可經(jīng)人糖基化模式而修飾。然而，對于本文所公開的方法來說，這并非表示人宿主細胞是必需的或優(yōu)選的。正如所說明的，可通過電穿孔，用線狀pdHL2載體轉(zhuǎn)染鼠骨髓瘤細胞系(例如Sp2/0)，該載體編碼穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的組成性亞基。將細胞在含0.05-0.1piM甲氨蝶呤的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后48小時進行選擇。再通過逐步增加曱氨蝶呤的濃度至5iaM,擴增所選克隆。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的綴合物可將額外部分與如上所述的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)綴合。例如，藥物、毒素、放射性化合物、酶、激素、細胞毒性蛋白、螯合物、細胞因子和其它功能性試劑，均可與穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)的一個或多個模塊亞基綴合。可通過例如共價連接亞基側(cè)鏈上含有氨基、羧基、巰基或羥基的氨基酸殘基，來進行綴合。各種常規(guī)接頭可用于該目的，例如二異氰酸酯、二異硫氰酸酯、雙(羥基琥珀酰亞胺)酯、碳二亞胺、馬來酰亞胺-輕基琥珀酰亞胺酯、戊二醛等。藥物或試劑與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的綴合優(yōu)選不顯著影響未修飾結(jié)構(gòu)中所含的各亞基的活性。在形成穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)之前，32或b都可用于化學(xué)綴合。32和b也都可在混合之前綴合。也可在形成穩(wěn)定束縛a2b結(jié)構(gòu)之后進行綴合。另外，細胞毒劑可先與聚合物載體偶聯(lián)，然后再與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)綴合。對于該方法，參見Ryser等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75:3867-3870,1978,U.S.4,699,784和U.S.4,046,722，所述文獻通過引用結(jié)合到本文中?？赏ㄟ^用于將抗體與以下載體連接的已知方法來制備本文所述的綴合物脂質(zhì)、碳水化合物、蛋白質(zhì)、放射性核素或其它原子和分子。例如，本文所述的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可與本文所述的一種或多種載體(例如脂質(zhì)、聚合物、脂質(zhì)體、膠束或納米粒)連接，形成綴合物，再將其通過共價、非共價或其它方式與治療藥或診斷試劑結(jié)合?；蛘?，本文所述的任何穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以直接與本文所述的一種或多種治療藥或診斷試劑綴合。例如，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以用1311進行放射性標記并與脂質(zhì)綴合，使得所得綴合物形成脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體可摻入到一種或多種治療藥(例如藥物，例如FUdR-dO)或診斷試劑中?；蛘?，除了載體之外，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)還可與1311(例如在酪氨酸殘基上)和藥物(例如在賴氨酸殘基的s氨基上)綴合，然后將載體與額外治療藥或診斷試劑結(jié)合。治療藥和診斷試劑可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的一個或多個亞基共價締合。脂質(zhì)體和膠束的形成是本領(lǐng)域已知的。參見例如Wrobel和Collins,BiochimicaetBiophysicaActa(1995),1235:296-304;Lundberg等,J.Pharm.Pharmacol.(1999),51:1099-1105;Lundberg等，Int.丄Pharm.(2000),205:101-108;Lundberg,J.Pharm.Sci.(1994),83:72-75;Xu等，Molec.CancerTher.(2002),1:337-346;Torchilin等，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.(2003),100:6039-6044;U.S.5,565,215;U.S.6,379,698;和U.S.2003/0082154。也已描述了由聚合物、二氧化硅或金屬制成的納米?；蚣{米嚢，用于藥物遞送或造影。參見例如West等，ApplicationsofNanotechnologytoBiotechnology(2000),11:215-217;U.S.5,620，708;U.S.5,702,727;和U.S.6,530,944。已經(jīng)描述了將抗體或結(jié)合分子與脂質(zhì)體綴合，形成耙向載體，用于治療藥或診斷試劑。參見例如Bendas,Biodrugs(2001)，15:215-224;Xu等,Mol.CancerTher(2002),1:337-346;Torchilin等，Proc.NatlAcad.Sci.U.S.A.(2003)，100:6039-6044;Bally等，J.LiposomeRes.(1998),8:299-335;Lundberg,Int.J.Pharm.(1994),109:73-81;Lundberg,J.Pharm.Pharmacol.(1997),49:16-21;Lundberg,Anti-cancerDrugDesign(1998),13:453-461。另見U.S.6,306,393、美國專利申請順序號10/350,096、美國專利申請順序號09/590,284和美國專利申請順序號60/138,284(1999年6月9日申請)。所有這些參考文獻都通過引用結(jié)合到本文中?？煞奖愕厥褂酶鞣N診斷試劑和治療藥，以形成穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的綴合物，或者可將各種診斷試劑和治療藥與半抗原連接，該半抗原可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)上的識別位點結(jié)合。診斷試劑可包括放射性同位素、MRI增強劑或超聲成像的造影劑以及焚光化合物。許多合適造影劑是本領(lǐng)域已知的，它們與蛋白質(zhì)或肽的連接方法也是已知的(參見例如美國專利5,021,236和4,472,509,這兩篇文獻都通過引用結(jié)合到本文中)。某些連接方法包括使用金屬螯合物(例如有機螯合劑，例如DTPA)與蛋白質(zhì)或肽連接(美國專利4,472,509)。為了將放射性金屬或順磁離子加載到穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)上，可能需要先將其與栽體反應(yīng)，使已經(jīng)結(jié)合在載體上的多拷貝螯合基團與放射性金屬或順磁離子結(jié)合。這樣的載體可以是具有側(cè)基的聚賴氨酸、多糖或者經(jīng)衍生的或可衍生的聚合物，其側(cè)基上可結(jié)合螯合基團，例如1,2-乙二胺四乙酸(EDTA)、二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、雙縮氨基硫脲、聚肟等，已知可用于該目的。用標準化學(xué)方法，將含有螯合物的載體與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)偶聯(lián)，其方式是盡量減少聚集和損失免疫反應(yīng)性。于U.S.4,824，659,所述專利通過引用全部結(jié)合到本文中。特別有用的金屬-螯合物組合包括2-千基-DTPA及其一甲基和環(huán)己基類似物，與診斷用同位素一起使用，其通常的能量范圍為60-4,000keV。某些有用的診斷用核素可包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zr、94Tc、94mTc、99mTc或mIn。與非放射性金屬(例如錳、鐵和禮)絡(luò)合的相同螯合物可用于MRI，當單獨與本文所述的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)和載體一起使用時。大環(huán)螯合物(例如NOTA、DOTA和TETA)可與各種金屬和放射性金屬一起使用，尤其是鎵、釔和銅的放射性核素。通過針對目標金屬來定制環(huán)的大小，可以非常穩(wěn)定地制備這樣的金屬-螯合復(fù)合物?？墒褂闷渌h(huán)-型螯合物，例如用于絡(luò)合^Ra的大環(huán)聚醚。治療藥包括例如化療藥物，例如長春花屬生物堿、蒽環(huán)類、印idophyllotoxin、紫杉》克類、4元^^射物、》克4b劑、4元生素、Cox國2抑制劑、抗有絲分裂藥、抗血管生成藥和促凋亡劑、尤其是多柔比星、甲氨蝶呤、泰素、CPT-ll、喜樹生物堿類(camptothecans)以及其它這些類型和其它類型的抗癌藥等。其它癌癥化療藥物包括氮芥類、磺酸烷基酯類、亞硝基脲類、三氮烯類、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、鉑配位絡(luò)合物、激素等。合適的化療藥參見REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,第19版(MackPublishingCo.1995),和GoodmanandGilman的THEPHARMACOLOGICALBASISOFTHERAPEUTICS,第7版(MacMillanPublishingCo.1985),以及這些出版物的修訂版。其它合適的化療藥例如實驗性藥物是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，可采用本領(lǐng)域已知方法與本文所述的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)綴合。另一類治療藥由以下放射性核素組成發(fā)射a-粒子的放射性核素(例如212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra、225Ac)、發(fā)射(3-粒子的放射性核素(例如32P、33P、47Sc、67Cu、67Ga、89Sr、9°Y、mAg、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Ho、166Dy、177Lu、186Re、18SRe、1S9Re),或發(fā)射俄歇電子的放射性核素(例如mIn、125I、67Ga、191Os、193mPt、195mPt、195mHg)?？刹捎盟龇椒?，將穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)用一種或多種上述放射性核素標記，用于診斷試劑。含有可檢測標記(例如熒光分子)或細胞毒劑(例如放射性碘)的合適肽，可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)共價、非共價或其它方式締合。例如，通過將光敏劑或染料摻入到穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)上，可得到治療上有用的綴合物。已經(jīng)使用熒光組合物(例如熒光染料)和對可見光敏感的其它發(fā)色團或染料(例如卟啉)來檢測和治療病變，即用合適的光照射病變部位。在治療中，這4皮稱為光輻射、光療或光動力療法。參見Jori等(編著)，PHOTODYNAMICTHERAPYOFTUMORSANDOTHERDISEASES(LibreriaProgetto1985);vandenBergh,Chem.Britain(1986),22:430。此外，已將單克隆抗體與光敏染料偶聯(lián)，用于進行光療。參見Mew等，J.Immunol.(1983),130:1473;同上，CancerRes.(1985),45:4380;Oseroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986),83:8744;作者同上(idem.),Photochem.Photobiol.(1987),46:83;Hasan等，Prog.Clin.Biol.Res.(1989),288:471;Tatsuta等，LasersSurg.Med.(1989),9:422;Pelegrin等，Cancer(1991),67:2529。也包括內(nèi)窺鏡或腹腔鏡應(yīng)用。檢測和治療的內(nèi)窺鏡方法參見U.S.4，932,412、U.S.5,525,338、U.S.5,716,595、U.S.5,736,119、U.S.5,922,302、U.S.6,096,289和U.S.6,387,350，所述專利通過引用全部結(jié)合到本文中。治療藥藥物組合物在某些實施方案中，可將穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)和/或一種或多種其它治療藥給予患者，例如癌癥患者。這樣的藥物可以藥物組合物的形式給予。一般來說，需要制備基本上不含對人或動物有害的雜質(zhì)的組合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當知道，可通過包括口服或胃腸外(例如靜脈內(nèi))在內(nèi)的不同途徑將藥物組合物給予患者。在某些實施方案中，必須給予患者有效量的治療藥。"有效量"是藥物產(chǎn)生所需效果的用量。有效量取決于例如藥物的功效和所需效果。例如，治療增生性疾病(例如黃斑變性或子宮內(nèi)膜異位癥)可能需要較少量的抗血管生成藥，相比之下，癌癥治療則需要更大用量，以減少或消除實體瘤，或者防止或減少其轉(zhuǎn)移?？捎帽绢I(lǐng)域眾所周知的方法，確定具體藥物的有效量，用于特定目的?；熕幵谀承嵤┓桨钢校山o予化療藥。所用的抗癌化療藥包括但不限于5-氟尿嘧啶、博來霉素、白消安、喜樹堿、卡鉑、苯丁酸氮芥、順鉑(CDDP)、環(huán)磷酰胺、放線菌素D、柔紅霉素、多柔比星、雌激素受體結(jié)合劑、依托泊苷(VP16)、法尼基(famesyl)-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、吉西他濱、異環(huán)磷酰胺、氮芥、美法侖、曱氨蝶呤、絲裂霉素、諾維本、硝基脲、普卡霉素(plicomycin)、丙卡巴肼、雷洛昔芬、他莫昔芬、泰素、temazolomide(DTIC含水形式)、反柏、長春堿和曱氨蝶呤、長春新堿或上述藥物的任何類似物或衍生變異體。所采用的針對感染性生物體的化療藥包括但不限于阿昔洛韋、阿苯達唑、金剛烷胺、阿米卡星、阿莫西林、兩性霉素B、氨千西林、氨曲南、阿奇霉素、桿菌肽、復(fù)方新諾明、巴特芬⑧、聯(lián)苯千唑、羧千西林、卡泊芬凈、頭孢克洛、頭孢唑林、頭孢菌素類、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢p塞肟、氯霉素、西多福韋、Cipro⑧鹽酸環(huán)丙沙星制劑、克拉霉素、克拉維酸、克霉唑、氯唑西林、多西環(huán)素、益康唑、erythrocycline、紅霉素、曱硝唑、氟康唑、氟胞嘧咬、膦曱酸、呋喃唑酮、更昔洛韋、慶大霉素、亞胺培南、異煙肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、林可霉素、利奈唑胺、美羅培南、咪康唑、米諾環(huán)素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、奈替米星、呋喃妥因、制霉菌素、奧塞米韋、苯唑西林、巴龍霉素、青霉素、噴他脒、哌拉西林-三唑巴坦、利福布汀、利福平、金剛乙胺、鏈霉素、石黃胺曱噁唑、柳氮磺吡啶、四環(huán)素、噻康唑、妥布霉素、托西拉酯、托萘酯、曱氧千咬-磺胺曱嗯哇、伐昔洛韋、萬古霉素、zanamir和zithromycin?；熕幖捌浣o藥方法、劑量等是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見例如"PhysiciansDeskReference",GoodmanandGilman白勺"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics"和"Remington'sPharmaceuticalSciences",所述文獻的相關(guān)部分通過引用結(jié)合到本文中)。劑量上的某些變動取決于所治療患者的情況。負責給藥的人員在任何情況下都要為每個患者確定合適劑量。激素皮質(zhì)類固醇激素可提高其它化學(xué)治療藥的有效性，因此，它們經(jīng)常用于聯(lián)合治療。潑尼松和地塞米松是皮質(zhì)類固醇激素藥的實例。己酸羥孕酮、醋酸曱羥孕酮和醋酸曱地孕酮等孕酮類藥，已經(jīng)用于子宮內(nèi)膜癌和乳癌。己烯雌酚和炔雌醇等雌激素藥，已經(jīng)用于前列腺癌等癌癥。他莫昔芬等抗雌激素藥已經(jīng)用于乳癌等癌癥。丙酸睪酮和氟曱睪酮等雄激素藥也已用于治療乳癌。血管生成抑制劑在某些實施方案中，可采用例如以下的抗血管生成藥血管生長抑素、baculostatin、人血管能抑素(canstatin)、乳腺絲抑蛋白、抗VEGF抗體、抗P1GF肽和抗體、抗血管生長因子抗體、抗Flk-l抗體、抗Flt-l抗體和肽、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素-12、IP-IO、Gro-P、血小板應(yīng)答蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、carboxiamidotriazole、CM101、馬立馬司他、戊聚糖多聚硫酸酯、促血管生成素-2、干擾素-a、除莠霉素A、PNU1M1WE、WK催乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可堿、染料木堿、TNP-470、內(nèi)皮生長抑素、紫杉醇、accutin、血管生長抑素、西多福韋、長春新石咸、博來霉素、AGM-l470、血小板因子4或米諾環(huán)素。免疫調(diào)節(jié)劑本文所用的術(shù)語"免疫調(diào)節(jié)劑"包括細胞因子、干細月包生長因子、淋巴毒素和造血因子，例如白介素、集落刺激因子、干擾素(例如干擾素-ct、-p和-力和稱為"S1因子，，的干細胞生長因子。合適的免疫調(diào)節(jié)劑部分的實例包括IL-2、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-18、IL-21、干擾素-Y、TNF-a等。術(shù)語"細胞因子"是由一個細胞群體釋放、并作為細月包間介質(zhì)而作用于另一細胞的蛋白質(zhì)或肽的通稱。本文更廣泛采用的細胞因子的實例包括淋巴因子、單核因子、生長因子和傳統(tǒng)的多肽激素。細胞因子包括生長激素，例如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長激素；曱狀旁腺激素；曱狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，例如濾泡剌激激素(FSH)、甲狀腺刺激激素(TSH)和黃體激素(LH);肝生長因子；前列腺素、成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳激素、OB蛋白；腫瘤壞死因子-a和肺瘤壞死因子-p;米勒管抑制物(mullerian-inhibitingsubstance);小鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素(activin);血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長因子，例如NGF-(3;血小板-生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF),例如TGF-a和TGF-p;胰島素樣生長因子-I和-II;紅細胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)因子(osteoinductivefactor);千擾素，例如干擾素-oc、p和y;集落刺激因子(CSF)，例如巨噬細胞-CSF(M-CSF);粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF);和粒細胞-CSF(G-CSF);白介素(IL),例如IL-1、IL陽la、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-IO、IL-11、IL-12;IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、LIF、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、EPO、kit-配體或FLT-3、血管生長抑素、血小板應(yīng)答蛋白、內(nèi)皮生長抑素、肺瘤壞死因子和LT。本文所用的術(shù)語細胞因子包括天然來源或來自重組細胞培養(yǎng)物的蛋白質(zhì)以及天然序列細胞因子的生物活性等同物。趨化因子通常作為化學(xué)引誘物起作用，以將免疫效應(yīng)細胞募集到趨化因子表達的位點上。趨化因子包括但不限于RANTES、MCAF、MIPl-a、MIP1-P和IP-IO。技術(shù)人員將會知道，已知某些細胞因子也具有化學(xué)引誘效果，并且也可歸類于該術(shù)語趨化因子之內(nèi)。同樣，術(shù)語免疫調(diào)節(jié)劑和細胞因子在其各自成員中是重疊的。放射性同位素治療和放免治療在某些實施方案中，肽和/或蛋白質(zhì)可用于放射性核素治療或放免治療方法(參見例如Govindan等，2005,TechnologyinCancerResearch&Treatment,4:375-91;Sharkey和Goldenberg，2005,丄Nucl.Med.46:115S畫127S;Goldenberg等(JCiinOncol2006;24:823-834),"AntibodyPre扁targetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadioimmunotherapy"，所述各文獻通過引用結(jié)合到本文中)。在具體的實施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可直接用放射性同位素標記，然后給予患者。在替代實施方案中，可以如上所述的預(yù)靶向方法，采用帶有放射性標記的半抗原性肽或配體給予放射性同位素，并在給予雙特異性穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(其定位于患病組織表達增加的位點上)之后注射。用于治療患病組織的放射性同位素包括但不限于mIn、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、32P、33P、47Sc、mAg、67Ga、142Pr、153Sm、I61Tb、I66Dy、166Ho、186Re、188Re、189Re、212Pb、223Ra、225Ac、59Fe、75Se、77As、89Sr、"Mo、105Rh、109Pd、143Pr、149Pm、169Er、194Ir、19SAu、199Au和211Pb。治療性放射性核素優(yōu)選衰變能范圍為20-6，000keV，對于俄歇發(fā)射體的優(yōu)選范圍為60-200keV,對于P發(fā)射體為100-2,500keV,而對于a發(fā)射體為4,000-6,000keV。有用的(3粒子發(fā)射放射性核素的最大衰變能優(yōu)選為20-5,000keV,更優(yōu)選100-4,000keV,最優(yōu)選500-2,500keV。還優(yōu)選基本衰變俄歇發(fā)射粒子的放射性核素。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In畫lll、Sb-119、1-125、Ho-161、Os-189m和Ir-192。有用的(3粒子發(fā)射放射性核素的衰變能優(yōu)選<1,000keV,更優(yōu)選<100keV,最優(yōu)選<70keV。還優(yōu)選基本衰變a粒子的放射性核素。這樣的放射性核素包括但不限于Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213和Fm-255。有用的a粒子發(fā)射放射性核素的衰變能優(yōu)選為2,000-10,000keV,更優(yōu)選3,000-8,000keV,最優(yōu)選4,000-7,000keV。例如，67Cu因其半衰期為61.5小時和充足供應(yīng)P粒子和Y射線，被認為是用于放免治療的更有希望的放射性同位素，可采用螯合劑對溴乙酰氨基-芐基-四乙胺四乙酸(TETA)將67Cu與蛋白質(zhì)或肽綴合在一起?；蛘?，使用二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)，可將發(fā)射高能(3粒子的^Y與肽、抗體、融合蛋白或其片段綴合在一起。額外的潛在放射性同位素包括"C、I3N、150、"Br、I98Au、224Ac、126I、133I、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、l09Pd、105Rh、142Pr、143Pr、161Tb、166Ho、199Au、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201T1、225Ac、76Br、16、等。在另一個實施方案中，可使用輻射敏化劑。添加輻射敏化劑可導(dǎo)致功效增強。輻射敏化劑參見D.MGoldenberg(主編)，CANCERTHERAPYWITHRADIOLABELEDANTIBODIES,CRCPress(1995),所述文獻通過引用全部結(jié)合到本文中。通常以類似方式影響具有加載硼附加物的載體、用于熱中子活化治療的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)。然而，有利的是可以等待下去，直到非靶向免疫綴合物清除后再進行中子輻射。使用能結(jié)合配體的抗體可加速清除。參見美國專利第4,624，846號對該通用原理的描述。例如，硼附加物例如^友硼烷，可以與抗體連"l妄。可以用垂懸側(cè)4連上的羧基官能團，制備碳硼烷，正如本領(lǐng)域眾所周知的?？赏ㄟ^石炭硼烷的羧基活化并與載體上的胺縮合，使碳硼烷與載體(例如氨基葡聚糖)連接起來。然后將中間綴合物與抗體綴合。給予綴合物之后，通過熱中子輻射活化硼附加物并轉(zhuǎn)化成放射性原子，其通過a-發(fā)射衰變，產(chǎn)生高毒性、短射程效果。藥盒各種實施方案可涉及含有適于治療或診斷患者患病組織的組分的藥盒。示例性的藥盒可含有至少一種穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)。如果含有給藥組分的組合物并非配制成經(jīng)消化道(例如口服)給予，則可包括能夠通過某些其它途徑遞送藥盒組分的裝置。一類裝置(例如用于胃腸外給藥)是注射器，用于將組合物注射到患者體內(nèi)。也可使用吸入裝置?？蓪⑺幒薪M分包裝在一起，或分開包裝在兩個以上單獨容器中。在某些實施方案中，容器可以是含有適于重配的無菌凍干組合物制劑的小瓶(管)。藥盒也可含有適于重配和/或其它試劑稀釋的一種或多種緩沖劑?？墒褂玫钠渌萜靼ǖ幌抻诖?、盤、盒、管等?？蓪⑺幒薪M分無菌包裝并保存在容器內(nèi)?？砂ǖ牧硪徊糠质墙o藥盒使用人員的使用說明書。配制和給藥還可配制穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(包括其綴合物)，以得到包含一種或多種藥學(xué)上合適的賦形劑、一種或多種額外成分或它們的某些組合的組合物。這可通過已知方法來完成即制備藥學(xué)上有用的劑量，其中活性成分(即穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)或綴合物)與混合物中的一種或多種藥學(xué)上合適的賦形劑混合在一起。無菌磷酸緩沖鹽溶液就是藥學(xué)上合適的賦形劑的一個實例。其它合適賦形劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。參見例如Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS,第5版(Lea&Febiger1990),和Gennaro(主編)，REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,笫18片反(MackPublishingCompany1990)及其修訂X反。給予本文所述的組合物的優(yōu)選途徑是胃腸外注射。在胃腸外給藥中，組合物可與藥學(xué)上可接受的賦形劑一起配制成單位劑量注射用形式，例如溶液劑、混懸劑或乳劑。這類賦形劑是固有無毒、無治療性的。這類賦形劑的實例是鹽水、林格液、葡萄糖溶液和Hank液。也可使用非水賦形劑例如固定油和油酸乙酯。優(yōu)選的貝武形劑是5%葡萄糖鹽水。賦形劑可含有少量添加劑，例如增加等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，包括緩沖劑和防腐劑。也包括其它給藥方法(包括口服給藥)。所配制的包含穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的組合物可用于靜脈內(nèi)給藥，通過例如快速注射或連續(xù)輸注。注射用組合物可呈單位劑型，例如裝在安瓿中，或者裝在多劑量容器中并添加防腐劑。組合物也可采用在油或含水溶媒中的混懸劑、溶液劑或乳劑的形式，并且可含有配方劑(formulatoryagent),例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，組合物可呈粉劑形式，用于在使用前用合適溶媒(例如無菌無熱原水)配制。組合物可以溶液劑形式給予。溶液劑的pH應(yīng)該在pH5-9.5范圍內(nèi)，優(yōu)選在pH6.5-7.5范圍內(nèi)。其制劑應(yīng)該在具有合適藥學(xué)上可接受的緩沖劑的溶液中，所述緩沖劑例如磷酸鹽、三(羥甲基)氨基曱烷-HCl或檸檬酸鹽等。緩沖劑濃度應(yīng)當在1-100mM范圍內(nèi)。所配制的溶液也可含鹽，例如氯化鈉或氯化鉀，濃度為50-150mM。也可包含有效量的穩(wěn)定劑，例如甘油、白蛋白、球蛋白、去垢劑、明膠、魚精蛋白或魚精蛋白的鹽。所配制的組合物的系統(tǒng)給藥通常為每2-3天一次，或每周一次，如果采用抗體人源化形式作為穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)的模板的話。或者，可采用每日給藥。通常給藥是通過肌內(nèi)注射或血管內(nèi)輸注。可通過哺乳動物皮下或其它胃腸外途徑給予組合物。此外，可通過連續(xù)輸注或者單次或多次快速推注方式給藥?？捎糜诳姑庖呔Y合物、融合蛋白或棵抗體的人用劑量將取決于以下因素患者年齡、體重、身高、性別、基本身體狀況和先前的醫(yī)療史。通常最好給予受體的活性成分劑量的范圍約為1mg/kg-20mg/kg(單次靜脈內(nèi)輸注)，盡管視情況而定，也可給予更低或更高劑量。按照需要，該劑量可重復(fù)，例如每周一次、共4-10周，優(yōu)選每周一次、共8周，更優(yōu)選每周一次、共4周。也可給予更少次數(shù)，例如每兩周一次、共數(shù)月。可通過不同的胃腸外途徑給藥，并適當調(diào)整劑量和時間表。用于控制免疫綴合物或抗體的作用持續(xù)時間的藥學(xué)方法，適用于所配制的本文所述的組合物?？赏ㄟ^使用生物相容的聚合物以絡(luò)合或吸收免疫綴合物或棵抗體，達到控釋制劑，所述聚合物例如乙烯醋酸乙烯共聚物基質(zhì)和硬脂酸二聚體和癸二酸的聚酐共聚物基質(zhì)。參見Sherwood等，Bio/丁echnology(1992),10:1446。免疫綴合物或抗體從這類基質(zhì)中釋放的速率取決于免疫綴合物或抗體的分子量、免疫綴合物的數(shù)量、基質(zhì)內(nèi)的抗體和分散顆粒的大小。參見Saltzman等，Bi叩hys.J(1989),55:163;Sherwood等,出處同上。其它固體劑型參見Ansel等，PHARMACEUTICALDOSAGEFORMSANDDRUGDELIVERYSYSTEMS,第5版(Lea&Febiger1990),和Gennaro(主編)，REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,第18版(MackPublishingCompany1990)及其修訂片反。為了治療目的，將組合物以治療有效量給予哺乳動物。適于本文所公開的治療和診斷方法的患者通常是人患者，盡管也包括非人類動物患者。本文所公開的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)在治療自身免疫病的方法中是特別有用的，公開于待審的美國專利申請順序號09/590,284(2000年6月9日申i青，發(fā)明名稱為"ImmunotherapyofAutoimmuneDisordersusingAntibodiesthatTargetB-Cells"，所述文獻通過引用全部結(jié)合到本文中。含有所述結(jié)合結(jié)構(gòu)的組合物優(yōu)選經(jīng)"^爭脈內(nèi)或肌內(nèi)給予，劑量為20-5000mg。也可經(jīng)鼻內(nèi)或其它非胃腸外途徑給予。也可通過微球體、脂質(zhì)體或放置在特定組織(包括血液)中的其它4敬粒(microparticulate)給藥系統(tǒng)給予組合物?？赏ㄟ^氣溶膠給予組合物，以達到肺局部給予?？墒褂煤畾馊苣z或非水(例如氟代烴拋射劑)混懸劑。超聲噴霧器優(yōu)選用于制備氣溶膠，以盡量減少暴露組合物中的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，從而降低剪切力，該剪切力能導(dǎo)致降解和活性損失?！愣?，給藥劑量將取決于諸如以下的因素患者年齡、體重、身高、性別、基本身體狀況和先前的醫(yī)療史。優(yōu)選將穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的飽和劑量給予患者。通常最好給予受體劑量的范圍約為50-500毫克的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，盡管視情況而定，也可給予更低或更高劑量。劑量實例包括20-1500毫克蛋白/劑，20-500毫克蛋白/劑，20-100毫克蛋白/劑，20-1000毫克蛋白/劑，100-1500毫克蛋白/劑。在組合物包含放射性核素的實施方案中，劑量可用毫居里(milUcumes)度量。就9°Y而論，劑量可介于15-40mCi、10-30mCi、20-30mCi或10-20mCi之間。與放射性核素連接的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)對微生物治療特別有效。當已測定到穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)定位在患者體內(nèi)的一個或多個感染部位之后，注射更高劑量的標記組合物，通常為20mC1-l50mCi/劑(對于1311)，5mCi-30mCi/劑(對于卯Y),或5mCi-20mCi/劑(對于賜Re),都以70kg患者體重計。注射可以是靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、淋巴管內(nèi)、鞘內(nèi)或腔內(nèi)(即胃腸外)并可重復(fù)。對于某些治療來說，最好給予多次、分次劑量，從而提供更高的微生物毒性劑量，而對正常組織的輻射方面通常不引起比例增加?？稍诮o予組合物之前、期間或之后，給予未與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)化學(xué)連接的如下藥物化療藥、抗微生物藥、細胞因子、粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)、紅細胞生成素、血小板生成素等?；蛘撸@些藥物可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)連接。a2b形式的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)是特別合適的預(yù)靶向劑。示例性結(jié)構(gòu)由兩個scFv或Fab亞基(a。和一個scFv或Fab亞基(b)組成，其中32雙價結(jié)合靶組織或細胞，而b結(jié)合半抗原。對于治療方法，先將這種雙特異性三價結(jié)構(gòu)給予患者，任選再給予清除劑，最后給予診斷試劑或治療藥，所述診斷試劑中半抗原與功能性試劑(例如可一企測標記)結(jié)合。技術(shù)人員將會知道，使用穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，也可采用雙特異性抗體的其它已知方法。這些診斷和治療方法可用于幾乎任何情況下，其中已經(jīng)使用基于抗體的藥劑進行診斷或治療。治療和診斷用途不包括預(yù)耙向的應(yīng)用穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(包括其綴合物)適用于采用抗體或免疫綴合物的各種治療和診斷用途，不需要預(yù)耙向。例如，三價結(jié)構(gòu)可作為"棵"構(gòu)建體用于治療，即在所述結(jié)構(gòu)未與額外功能性試劑綴合的實施方案中，以與使用棵抗體相同的方式進行治療?；蛘?，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用一種或多種功能性試劑衍生，以便用于診斷或治療用途。額外試劑可與如上所述的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)共價連接。也包括使用放射性和非放射性診斷試劑，所述試劑與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)連接。合適的非放射性診斷試劑是那些用于磁共振成像(MRI)、計算機斷層掃描(CT)或超聲的試劑。MRI試劑包括例如非放射性金屬(例如例如錳、鐵和釓)，它們可與合適的螯合物(例如2-千基-DTPA及其一曱基和環(huán)己基類似物)絡(luò)合。參見美國專利申請順序號09/921,290(2001年10月10日申請)，所述專利通過引用全部結(jié)合到本文中。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可由用于診斷造影的放射性同位素進行標記。合適的放射性同位素可包括能量范圍為60-4,000keV的同位素，或更具體地講，包括18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、89Zj94mTe94Tc99mTc45rpimIni23I24Ii25IU1Ii54_158GdmLu、32P、188Re等或其組合。參見例如美國專利申請，發(fā)明名稱為"LabelingTargetingAgentswithGallium-68"陽發(fā)明人為G.L.Griffiths和WJ.McBride,以及美國臨時申請第60/342,104號，其中/>開了正電子發(fā)射體，例如18F、6SGa、94mTc等，用于造影目的；所述文獻通過引用全部結(jié)合到本文中)?？梢酝ㄟ^例如單光子發(fā)射計算機斷層掃描(SPECT)或正電子發(fā)射斷層掃描(PET)進行檢測。其應(yīng)用也可用于手術(shù)中診斷，以鑒定隱蔽的肺瘤。在另一實施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以用一種或多種放射性同位素進行標記，用于殺傷胂瘤或其它快速分裂的細胞，所述同位素包括(3-發(fā)射體(例如32p、33P、47Sc、67Cu、67Ga、89Sr、90Y、mAg、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、166Ho、166Dy、177Lu、186Re、環(huán)Re、189Re)，俄歇電子發(fā)射體(例如mIn、125I、67Ga、1910s、193mPt、195mPt、195mHg)，a-發(fā)射體(例如2"Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra、^Ac)或其組合。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用于MRI,即通過與一種或多種造影增強劑連接，所述增強劑可包括選自以下金屬的絡(luò)合物鉻(III)、錳(II)、鐵(in)、鐵(n)、鈷(ii)、鎳(n)、銅(n)、釹(m)、衫(ni)、鐿(ni)、釓(ni)、釩(ii)、鋱(ni)、鏑(m)、鈥(m)和鉺(in)。同樣，穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)可用于超聲成像，即通過與目前市場上銷售的一種或多種造影增強劑連接。美國專利第6,331,175號描述了MRI技術(shù)以及與MRI增強劑綴合的抗體制劑，所述專利通過引用全部結(jié)合到本文中。功能性蛋白質(zhì)(例如毒素)可以幾種方式存在于穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)中。例如，功能性蛋白質(zhì)可作為二元復(fù)合物組分的前體，即通過與DDD2或AD2融合，然后將其與耙向?qū)嶓w(分別由例如Fab/AD2或Fab/DDD2組成)結(jié)合?；蛘撸δ苄缘鞍踪|(zhì)可以與耙向結(jié)構(gòu)融合，作為A的前體，而且所得A任選與合適的B配對?？捎糜谠撃康牡亩舅匕ū吐槎镜鞍住⑾嗨级苟镜鞍?、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。(參見例如Pastan.等,Cell(1986)，47:641,以及Goldenberg,CA-ACancerJournalforClinicians(1994),44:43。適用于本文的額外毒素是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，公開于U.S.6,077,499，所述專利通過引用全部結(jié)合到本文中。其它功能性目標蛋白包括各種細胞因子、溶血栓劑、酶和焚光蛋白質(zhì)。也提供治療患者胂瘤的方法，即通過給予患者如上所述的"棵"穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)，其中至少一個抗原結(jié)合位點與選自以下的抗原結(jié)合碳酸肝酶IX、曱胎蛋白、A3、A33抗體特異性抗原、Ba733、BrE3-抗原、CA125、癌胚抗原(CEACAM5)、CEACAM6、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、結(jié)腸特異性抗原-p(CSAp)、EGFR、EGP-1、EGP-2、Flt畫l、Flt-3、葉酸受體、HER2/neu、HLA-DR、人絨毛膜促性腺激素、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰島素樣生長因子、KC4-抗原、KS-1、KSl-4、Le(y)、巨噬細胞-抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、壞死抗原、p53結(jié)合抗原、PAM-4抗體、胎盤生長因子、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TlOl、TAC、TAG-72、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、生腱蛋白、TRAIL受體、ED-B纖連蛋白、VEGF、17-lA-抗原、血管生成標記、癌基因標記或癌基因產(chǎn)物。針對TRAIL受體(例如TRAIL-R1和TRAIL-R2)的抗體是本領(lǐng)域眾所周知的。(參見例如Georgakis等，Br.J.Haematol.2005,130:501-510;Mori等，F(xiàn)EBSLett.2005,579:5379-84)。這類抗體或片段可單獨使用或與抗TAA抗體聯(lián)用，用于癌癥治療。瘤性疾病可選自癌癥、肉瘤、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病和黑素瘤?？砂邢虻氖纠阅[瘤類型包括急性成淋巴細胞性白血病、急性髓細胞性白血病、膽嚢癌、乳癌、宮頸癌、慢性淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、結(jié)腸直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、食道癌、胃癌、頭頸部癌、霍奇金淋巴瘤、肺癌、曱狀腺髓質(zhì)癌(medullarythyroid)、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、黑素瘤、肝癌、前列腺癌和膀胱癌。也提供治療患者的B細胞惡性肺瘤或B細胞免疫病或自身免疫病的方法，即通過給予患者一個或多個劑量的含有如上所述的穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)和藥學(xué)上可接受的載體的治療性組合物，所述穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)中各抗原結(jié)合位點與CD19、CD20、CD22或IL-17的不同表位結(jié)合?？山?jīng)胃腸外給予治療性組合物，劑量為20-1500毫克蛋白/劑，或20-500毫克蛋白/劑，或20-100毫克蛋白/劑?；颊呖芍貜?fù)接受胃腸外給予的20-100毫克蛋白/劑，或重復(fù)接受胃腸外給予的20-1500毫克蛋白/劑。在這些方法中，結(jié)合結(jié)構(gòu)部分可用放射性同位素標記，例如"P、33P、47Sc、67Cu、67Ga、90Y、mAg、mIn、125I、131I、142Pr、153Sm、161Tb、I66Dy、166Ho、177Lu、186Re、188Re、ls9Re、212Pb、212Bi、213Bi、211At、223Ra和225Ac或其組合。也提供檢測或診斷患者的B細胞惡性胂瘤或B細胞免疫病或自身免疫病的方法，即通過給予患者含有穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)、藥學(xué)上可接受的載體和放射性核素的診斷用組合物，所述穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)中各抗原結(jié)合位點與CD19、CD20、CD22或IL-17的不同表位結(jié)合；所述放射性核素選自18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga86Y89Zr94mTc94Tc""TcU1ln123I124I125I、131I、154-158Gd、177Lu、32P、45Ti和188Re或其組合。如上所述的SPECT或PET可進行檢測。其應(yīng)用也可用于手術(shù)中診斷，以鑒定隱蔽的腫瘤。也提供檢測或診斷患者的B細胞惡性腫瘤或B細胞免疫病或自身免疫病的方法，即通過給予患者含有穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)、藥學(xué)上可接受的載體和一種或多種造影增強劑的診斷用組合物，所述穩(wěn)定束縛結(jié)合結(jié)構(gòu)中各抗原結(jié)合位點與CD19、CDM、CD22或IL-17的不同表位結(jié)合；所述造影增強劑用于磁共振成像(MRI)。造影增強劑可選自上述造影增強劑。也提供診斷和/或治療患者的非瘤性疾病或障礙的方法，即通過給予患病的患者穩(wěn)定束綽結(jié)合結(jié)構(gòu)，其中連接可檢測標記或治療藥；并且一種或多種抗原結(jié)合位點對疾病的標記物具有特異性。疾病或障礙可由真菌或病毒所引起，所述真菌例如小孢子菌屬(A//croj/7on/w)、發(fā)辨菌屬(7Wc/20/7/_yto")、表皮褲菌屬(五/i(sferw(9/7/2;Ko")、申克孑包子絲菌0S^oraf/nxsc/]ewcA:/z')、新型隱3求菌(Oy/^ococcwi1"eq/bw/朋力、粗球孑包子菌(Cocc/^o/c^/w脂.to)、莢月莢組織月包漿菌(//"fo;Zasmaca尸sw/afwm)、皮炎芽生菌(別aWomycesderma"YW力和白色念珠菌(Ca"力(iaa/6z'c朋)；所述病毒例如人免疫擊夫陷病毒(HIV)、皰滲病毒、巨細胞病毒、狂犬病毒、流感病毒、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒、仙臺病毒、貓白血病病毒、呼腸孤病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、人血清細小病毒樣病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺腫瘤病毒、水痘帶狀皰瘆病毒、登革熱病毒、風滲病毒、麻滲病毒、^泉病毒、人T細月包白血病病毒、Epstein-Barr病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、皰滲性口腔炎病毒、辛德比斯病毒、淋巴細胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒和藍舌病毒。疾病或障礙可由細菌所引起，所述細菌例如炭疽芽孢桿菌(5acz7/w5a/if/7rac75)、無孝lj鏈3求菌(5^eptococcw51aga/art/ore)、p省月申軍團菌(Leg70/ie〃fl/wewmop/z7/a)、酉良膿葡萄3求菌(5^e;tococci/51、大腸桿菌(Es"c/m'c/2/aco//)、淋病奈瑟氏球菌(A^逗n'ago"o"/2oeae)、月鹵月荑炎奈瑟氏球菌(7Vezhenawem'"gz'"cfo)、肺炎3求菌(尸wew/wococcMSs戶p.)、';虎感p者血詳干菌B(//ewop/z7,5"z>//wezaeB)、蒼白密蟲累S走體(7>e/w"ewa/a〃Www)、萊姆病螺j走體(Lymediseasespirochetes)、纟錄膿々支單月包菌(7^ewdo附o"(ZS1aerwg/"osa)、麻風分牙支坤干菌(A^ycoZ(3"e廠/wm/e/rae)、流產(chǎn)布魯氏桿菌(Brace〃aa6ortz^)和結(jié)核分枝桿菌(A^yco6ac&n'wwfw6ercw/os7'力或支原體(A^yco//asma)。疾病或障礙可由寄生蟲所引起，例如瘧疾。疾病或障礙可以是自身免疫性疾病，例如急性特發(fā)性血小板減少性紫癜、慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜、皮肌炎、小舞蹈病、重癥肌無力、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎、風濕熱、多&，性綜合征、大皰性類天皰瘡、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、鏈3求菌感染后的腎炎、結(jié)節(jié)性紅斑、無脈病、艾迪生病、類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、結(jié)節(jié)病、潰瘍性結(jié)腸炎、多形性紅斑、IgA腎病、結(jié)節(jié)性多動脈炎、關(guān)節(jié)強硬性脊推炎、肺出血腎炎綜合征、閉塞性血栓性脈管炎、斯耶格倫綜合征、原發(fā)性膽汁性肝硬化、橋本曱狀腺炎、甲狀腺毒癥、硬皮病、慢性活動性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多軟骨炎、尋常性天皰瘡、韋格納肉芽腫病、膜性腎病、肌萎縮性側(cè)索硬化、脊髓癆、巨細胞動脈炎/多肌痛、惡性貧血、急進性腎小球性腎炎、銀屑病和纖維性肺泡炎。疾病或障礙可以是心肌梗塞、缺血性心臟病、或動脈粥樣硬化斑塊、或移植排斥、或阿爾茨海默病，或者是由特應(yīng)性組織所引起的。疾病或障礙可以是因活化粒細胞、單核細胞、淋巴樣細胞或巨噬細胞在炎癥部位增多所引起的炎癥，并且炎癥是由感染性因子所引起。另外，使用穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)，可以耙向表達特定受體或過量表達受體的細胞，所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)中A或B組分含有所述受體的配體，所述受體指導(dǎo)該結(jié)構(gòu)與帶有受體的細胞結(jié)合。治療藥或診斷試劑可以與該結(jié)構(gòu)的一個或多個亞基融合或綴合，以利于診斷和治療方法。治療和診斷用途包括預(yù)靶向的應(yīng)用預(yù)耙向是一種多步驟方法，起初是為解決直接靶向抗體在血中緩慢清除而開發(fā)的，后者對正常組織(特別是骨髓)具有不想要的毒性。有了預(yù)靶向，就可將放射性核素或其它治療藥與小的化合物連接，這樣在數(shù)分鐘內(nèi)即可從血中清除掉。首先給予除能識別靶抗原之外、還能識別小的放射性標記化合物的預(yù)輩巴向劑，稍后當預(yù)把向劑從血中充分清除時，再給予放射性標記化合物。已經(jīng)開發(fā)了預(yù)粑向方法，以增加檢測試劑或治療藥的耙:背景的比率。預(yù)靶向和生物素/抗生物素蛋白方法的實例參見例如Goodwin等，美國專利第4,863,713號；Goodwin等，J.Nucl.Med.29.226,1988;Hnatowich等,J.Nucl.Med.28:1294,1987;Oehr等,J.Nucl.Med.29:728,1988;Klibanov等,J.Nucl.Med.29:1951,1988;Sinitsyn等，J.Nucl.Med.30:66,1989;Kalofonos等，J.Nucl.Med.31:1791,1990;Schechter等，Int.J.Cancer48:167,1991;Pag認lli等，CancerRes.51:5960,1991;Paganelli等，Nucl.Med.Commun.12:211,簡;美國專利第5,256，395號；Stickney等，CancerRes.51:6650,1991;Yuan等，CancerRes.51:3119,1991;美國專利第6,077,499號；美國專利申請順序號09/597,580;美國專利申請順序號10/361,026;美國專利申請順序號09/337,756;美國專利申請順序號09/823,746;美國專利申請順序號10/116,116;美國專利申請順序號09/382,186;美國專利申請順序號10/150,654;美國專利第6,090,381號；美國專利第6,472，511號；美國專利申請順序號10/114,315;美國臨時申請第60/386,411;美國臨時申請第60/345,641號；美國臨時申請第60/3328,835號；美國臨時申請第60/426,379;美國專利申請順序號09/823,746;美國專利申請順序號09/337,756;美國臨時申請第60/342,103號；和美國專利第6,962,702號，所有這些文獻都通過引用結(jié)合到本文中。在一個具體的非限制性實例中，基于穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)的預(yù)靶向劑含有兩個相同腫瘤抗原結(jié)合位點(其對CEA具有特異性)和第三個結(jié)合位點(其對半抗原、組胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)具有特異性)。在替代實施方案中，可以用相同或不同半抗原靶向不同腫瘤相關(guān)抗原。對于預(yù)把向的應(yīng)用，可尋耙試劑(taretableagent)可以是脂質(zhì)體，其帶有與脂質(zhì)體脂質(zhì)膜外表面共價連接的雙價HSG-肽。脂質(zhì)體可以充滿氣體。如下提供治療或診斷患者的疾病或障礙的預(yù)輩巴向方法(l)給予患者如上所述的雙特異性三價結(jié)合結(jié)構(gòu)，其中兩個二聚體抗原結(jié)合位點指向?qū)膊【哂刑禺愋缘囊粋€或多個標記物，而其它抗原結(jié)合位點涉及含有雙價半抗原的可尋靶構(gòu)建體；(2)任選給予患者清除用組合物，讓該組合物從循環(huán)中清除結(jié)合結(jié)構(gòu)；和(3)給予患者含有雙價半抗原的可尋靶構(gòu)建體，其中可尋靶構(gòu)建體還含有一種或多種螯合或化學(xué)結(jié)合的治療藥或診斷試劑。疾病或障礙如上所迷。如下還提供抗體依賴型酶前體藥物治療(ADEPT)方法(1)給予患有腫瘤的患者上述結(jié)合結(jié)構(gòu)，其中該結(jié)構(gòu)含有能夠活化前體藥物的共價連接的酶，(2)任選給予患者清除用組合物，讓該組合物從循環(huán)中清除結(jié)合結(jié)構(gòu)，和(3)將前體藥物給予患者。其它用途—般而言，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可替代基于抗體的藥物，所述藥物已經(jīng)顯示有用于治療癌癥或非癌癥疾病的功效。眾所周知，放射性同位素、藥物和毒素可與抗體或抗體片段綴合，這些抗體或抗體片段能特異性結(jié)合癌細胞產(chǎn)生的或與癌細胞相關(guān)的標記物，而且這類抗體綴合物可用于將放射性同位素、藥物或毒素靶向腫瘤部位，以增強其療效并減少副作用。有關(guān)這些藥物和方法實例的綜述參見Wawrzynczak禾口Thorpe(載于IntroductiontotheCellularandMolecularBiologyofCancer,L.M.Franks和N.M.Teich主編，第18章，第378-410頁，OxfordUniversityPress.Oxford,1986)，載于Immunoconjugates.AntibodyConjugatesinRadioimagingandTherapyofCancer(C.W.Vogel主編，3-300,OxfordUniversityPress，N.Y.,1987)和載于Dillman,R.O.(CRCCriticalReviewsmOncology/Hematology1:357,CRCPress,Inc.,1984)。另見Pastan等，Cell(1986),47:641;Vitetta等,Science(1987):238:1098-1104;和Brady等，Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys.(1987),13:1535-1544。在某些實施方案中，多價穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用于正?；蚧疾〗M織和器官的治療和/或造影，例如采用參見以下文獻的方法美國專利號6,126,916、6,077,499、6,010,680、5，776,095、5,776,094、5,776,093、5,772,981、5,753,206、5,746,996、5,697,902、5,328,679、5，128,119、5,101,827和4,735,210,所述各專利通過引用結(jié)合到本文中。另外的方法參見美國專利申請順序號09/337,756(1999年6月申請)和美國專利申請順序號09/823,746(2001年4月3日申請)。通過直接標記穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)或通過預(yù)靶向造影方法，可以進行這樣的造影,參見Goldenberg等，"AntibodyPretargetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadiotherapy"G寺發(fā)表，J.Clin.Oncol.),另見美國專利乂>布號20050002945、20040018557、20030148409和20050014207,所述各文獻通過引用結(jié)合到本文中。在以下美國專利中已經(jīng)公開了免疫綴合物在癌癥和其它形式療法中的用途4,331,647、4,348,376、4,361,544、4,468,457、4，444,744、4,460,459、4,460,561、4,624,846、4,818,709、4,046,722、4,671,958、4,046,784、5,332,567、5,443,953、5,541，297、5,601,825、5,635,603、5,637,288、5,677,427、5,686,578、5,698,178、5,789,554、5,922,302、6,187,287和6,319,500。這些方法也可用于本文所公開的方法，即通過用本發(fā)明的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)替代先前方法中的基因工程抗體。在某些實施方案中，本文公開并要求保護的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)可用于放射性核素治療或放免治療方法(參見例如Govmdan等，2005,TechnologyinCancerResearch&Treatment,4:375-91;Sharkey和Goldenberg,2005,J.Nucl.Med.46:115S-127S;Goldenberg等(待發(fā)表,J.Clin.Oncol.),"AntibodyPretargetingAdvancesCancerRadioimmunodetectionandRadioimmunotherapy",戶斤述各文南史通過引用結(jié)合到本文中)。在另一個實施方案中，可將輻射敏化劑與棵的或綴合的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)、抗體或抗體片段聯(lián)用。例如，可將輻射敏化劑與放射性標記的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)聯(lián)用。與單用放射性標記的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)進行治療相比，添加輻射敏化劑可導(dǎo)致功效增強。輻射敏化劑參見D.M.Goldenberg(主編)，CANCERTHERAPYWITHRADIOLABELEDANTIBOD正S，CRCPress(1995)，所述文獻通過引用全部結(jié)合到本文中。用于任何要求保護的方法的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)可與抗微生物藥結(jié)合或一起給予。和免疫調(diào)節(jié)劑結(jié)合或一起給予。這些細胞因子和免疫調(diào)節(jié)劑至少包括干擾素-a、-P和-"f以及集落刺激因子。應(yīng)答。在一個實施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可包含抗獨特型抗體的抗原結(jié)合位點(ABS)。這類穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可模擬胂瘤相關(guān)抗原表位，以增強機體的免疫應(yīng)答。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用于目前使用抗體的許多免疫學(xué)方法。這些方法包括使用抗獨特型抗體和與抗體綴合的表位，以增強免疫系統(tǒng)。參見美國專利5,798,100、6,090,381和6,132,718。抗獨特型抗體也用作針對癌癥和感染性疾病的疫苗。參見美國專利6,440,416和6,472，511。此外，多特異性三聚體結(jié)合結(jié)構(gòu)可結(jié)合多藥轉(zhuǎn)運蛋白并征服細胞和病原體的多重藥物抗性表型。這些方法中的抗體可用本文所公開的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)來替代。不同實施方案涉及治療自身免疫病癥狀的方法。在該方法中，將穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)給予自身免疫病患者，所述結(jié)構(gòu)在給藥前可與藥學(xué)上可接受的載體混合。該方法中的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)應(yīng)含有對B細胞或T細胞的抗原表位具有結(jié)合特異性的至少一個ABS。B細胞抗原可以是CD22,而表位可以是CD22等的表位A、表位B、表位C、表位D和表位E。B細胞相關(guān)抗原也可以是另一細月包抗原，例如CD19、CD20、HLA-DR和CD74。T細胞抗原可包括CD25。在某些實施方案中，可選擇用于治療自身免疫性疾病的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，以結(jié)合IL-17。ABS可含有近似人類的靈長類、鼠單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體或人類來源的序列。例如，ABS可以來源于人源化LL2(抗CD22)、人源化LL1(抗CD74)或A20(抗CD20)單克隆抗體。可經(jīng)胃腸外給予20-2000mg/劑。可重復(fù)給藥，直至達到癥狀減輕的程度。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可用于治療對系統(tǒng)化學(xué)治療具有抗性或難治性的疾病。這些疾病包括各種病毒感染、真菌感染、細菌感染和原生動物感染、特別是寄生蟲感染。病毒感染包括以下病毒所引起的感染流感病毒、皰滲病毒、Epstein-Barr病毒和巨細月包病毒、狂犬病毒(彈狀病毒科(尺/^Z^oWmtoe》、乳頭瘤病毒和乳多空病毒，所有這些感染都難以用系統(tǒng)抗生素/細胞毒劑治療。采用多價結(jié)合結(jié)構(gòu)可提供對靶病毒的更高親合力，導(dǎo)致顯著增加的治療指數(shù)。采用具結(jié)構(gòu)的綴合物進行靶向放免治療，為抗病毒治療提供了新方法。可用本發(fā)明所述方法治療的原生動物包括例如癡原蟲(尤其是惡性瘧原蟲(尸/wmo力ww/a/cz/wn/m)，瘧疾寄生蟲)、鼠弓形體(roxop/os"wago"dz7,弓開j體病感染因子)、矛M十曼原蟲(丄e^/2mam'ae,利什曼病感染因子)和Escherichiahistolytica。在瘧疾不同時相中,使用穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可顯著增強對瘧疾的檢測和治療。能結(jié)合子孢子抗原的單克隆抗體(mAb)是已知的。然而，因為子孢子抗原并非血內(nèi)寄生蟲(bloodstageparasite)所共有，所以使用針對子孢子抗原的這類mAb來尋靶，僅局限在相對短時間內(nèi)，在此時間內(nèi)子孢子游離于循環(huán)中，這只是在剛注射后和在宿主肝細胞內(nèi)發(fā)育之前。因此，優(yōu)選使用靶向原生動物(例如惡性瘧原蟲)的不止一種寄生時相的mAb混合物，可以用具有多特異性的一種或多種穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)來達到該目的。使用綴合物可為造影(例如用""Tc)或治療(例如用川At或其它抗瘧藥，例如乙胺嘧啶)提供更多優(yōu)勢。弓形體病也對系統(tǒng)化學(xué)治療具有抗性。尚不清楚，能特異性結(jié)合鼠弓形體的mAb或天然宿主抗體是否在針對弓形體病的免疫應(yīng)答中起作用，但是在瘧原蟲的情況下，合適的靶向穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)是遞送治療藥的有效載體。血吸蟲病是廣泛流行的蠕蟲感染，它是由某些淡水螺所攜帶的自由泳動的尾蚴而引發(fā)的疾病。與癥疾的情況類似，在感染過程中也存在不同時相的尾蝴。可以將能結(jié)合多個時相的尾姆、任選結(jié)合在一種或多種尾蚴的表位上、優(yōu)選呈多特異性組成形式的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，與造影劑或治療藥綴合，用于有效尋耙并增加療效?？梢灾苽渑c一種或多種形式的克氏4,蟲(7>_y/7a"o^wacn^'),恰加斯病(Chagas'disease)的病原體)結(jié)合的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，用于檢測和治療該類纟斂生物感染。與不同時相錐蟲的細胞表面糖蛋白或其它表面抗原反應(yīng)的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，適用于將造影劑和治療藥靶向體內(nèi)寄生蟲浸潤部位。用合適藥物治療的另一非常難治的傳染性生物體就是麻風桿菌(麻風分枝桿菌(A^yco6ac化m/m/e/rae))?？梢灾苽淠芴禺愋越Y(jié)合麻風分枝桿菌表面多個表位的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)，單獨或聯(lián)合用于將造影劑和/或抗生素/細胞毒劑靶向該桿菌。用化療藥相當難治的腸道寄生蟲感染(例如類圓線蟲病(Strongyloidosis)和旋毛蟲病(Trichinosis》，是穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的合適革巴標。通過能特異性結(jié)合寄生蟲的一個、或優(yōu)選多個表位的合適穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)或綴合物，可以進行對它們的診斷和治療?？梢允褂谩⒒蛘呖梢匀菀椎禺a(chǎn)生這樣的抗體所述抗體能特異性結(jié)合引起大部分人類感染的大多數(shù)微生物和寄生蟲。它們許多先前已經(jīng)用于體外診斷目的，可以摻入到穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)中作為抗體綴合物組分，以將i貪斷試劑和治療藥耙向感染部位。人和哺乳動物的微生物病原體和無脊推動物寄生蟲是具有復(fù)雜生命周期的生物，在其不同時相表達多種抗原。因此，當制備能識別不同形式上的抗原決定簇的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(連接有合適的治療藥)、并以混合物或多特異性綴合物形式聯(lián)用時，最好進行耙向治療。同樣的原理也適用于使用包含用于測定感染部位的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的試劑，即通過連接造影劑(例如放射性核素)和/或MRI增強劑。其它實施方案涉及手術(shù)中鑒定患病組織的方法，即通過給予有效量的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)和可尋靶構(gòu)建體，其中該穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)包含能特異性結(jié)合靶組織的至少一個抗原結(jié)合位點以及能特異性結(jié)合可尋靶構(gòu)建體的至少一個其它抗原結(jié)合位點；并且所述至少一個抗原結(jié)合位點能結(jié)合靶細胞、組織或病原體上的互補結(jié)合部分，或者能結(jié)合由這些靶細胞、組織或病原體產(chǎn)生的或與它們締合的分子上的互補結(jié)合部分。又一些實施方案涉及用于內(nèi)窺鏡檢查患者的患病組織的方法，即通過給予有效量的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)并給予可尋靶構(gòu)建體。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)包含能特異性結(jié)合靶組織的至少一個抗原結(jié)合位點以及能特異性結(jié)合可尋靶構(gòu)建體的至少一個抗原結(jié)合位點；并且其中至少一個抗原結(jié)合位點顯示出能特異性結(jié)合靶細胞、組織或病原體上的互補結(jié)合部分，或者能結(jié)合由這些靶細胞、組織或病原體產(chǎn)生的或與它們締合的分子上的互補結(jié)合部分。檢測用途的一個替代方法是無線的膠嚢內(nèi)窺鏡(capsuleendoscopy),采用可咽下的膠嚢照相才幾/檢測器(capsulecamera/detector),這樣的照相才幾/檢測器是市售的，來自例如GivenImaging(NorcrossGA)。某些實施方案涉及用內(nèi)窺4竟鑒定患者患病組織的方法，即通過給予有效量的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)并給予可尋耙構(gòu)建體。在該實施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)包含能特異性結(jié)合耙組織的至少一個抗原結(jié)合位點以及能特異性結(jié)合可尋靶構(gòu)建體的至少一個抗原結(jié)合位點；并且其中至少一個抗原結(jié)合位點顯示出能特異性結(jié)合把細胞、組織或病原體上的互補結(jié)合部分，或者能結(jié)合由這些耙細胞、組織或病原體產(chǎn)生的或與它們締合的分子上的互補結(jié)合部分。替代實施方案涉及血管內(nèi)鑒定患者患病組織的方法，即通過給予有效量的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)和可尋靶構(gòu)建體。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)包含至少一個ABS,所述ABS能特異性結(jié)合耙細胞、組織或病原體上的互補結(jié)合部分，或者能特異性結(jié)合由這些把細胞、組織或病原體個ABS，所述ABS能特異性結(jié)合可尋耙構(gòu)建體。耙組織可以是正常組織，例如甲狀腺、肝、心、卵巢、胸腺、曱狀旁腺、子宮內(nèi)膜、骨髓、淋巴結(jié)或脾臟。某些實施方案涉及實施要求保護的方法的藥盒。藥盒可包含可尋靶構(gòu)建體。可尋靶構(gòu)建體可用適于上述可尋靶構(gòu)建體的任何試劑進行標記。此外，可尋靶構(gòu)建體也可不標記，但是藥盒可包含標記用試劑，以標記可尋耙構(gòu)建體。如果有的話，標記用試劑可含有標記和交聯(lián)劑。藥盒也可含有穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，其包含對可尋靶構(gòu)建體具有特異性的至少一個ABS和對可尋靶組織具有特異性的至少一個ABS。藥盒可任選含有清除用組合物，以從循環(huán)中除去穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的靶標涉及穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的耙標的額外公開內(nèi)容公開于臨時美國專利申請順序號60/634,076,"MethodsandCompositionsforImmunotherapyandDetectionofInflammatoryandImmune-dysregulatoryDisease,InfectiousDisease,PathologicAngiogenesisandCancer",Goldenberg等(2004年12月9日申請)，所述文獻的全部內(nèi)容都通過引用結(jié)合到本文中。在某些實施方案中，本文要求保護的穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)與兩種不同靶標特異性反應(yīng)。不同靶標可包括但不限于先天免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物、凝固因子、補體因子和補體調(diào)節(jié)蛋白，與炎性障礙或免疫失調(diào)障礙、與傳染性病原體或與病理性血管生成或癌癥特異性相關(guān)的靶標，其中這后一類靶標不是免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物或凝固因子。因此，在某些實施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)含有至少一個結(jié)合特異性(其與患病細胞、病理性血管生成或癌癥，或傳染性疾病相關(guān))以及至少一個特異性[其針對免疫系統(tǒng)組分(例如B細胞、T細胞、嗜中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞和樹突細胞的受體或抗原)，或凝固調(diào)節(jié)劑(例如凝血酶或組織因子)，或促炎細胞因子(例如IL-1、IL-6、IL-IO、HMGB-1和MIF)]。當穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)包含單個抗體的組合時，不包括這樣的組合所述組合中的一個組分靶向B細胞抗原，而另一組分靶向T細胞、漿細胞、巨噬細胞或炎性細胞因子，因為這樣的組合能引起免疫系統(tǒng)功能障礙。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以是棵露的，也可以與診斷造影劑(例如同位素、放射性造影劑)綴合，或者與治療藥綴合，所述治療藥包括放射性核素、硼化合物、免疫調(diào)節(jié)劑、肽、激素、激素拮抗劑、酶、寡核苷酸、酶抑制劑、光敏治療藥、細胞毒劑、血管生成抑制劑及其組合。穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)與靶標結(jié)合，可以下調(diào)或以其它方式影響免疫細胞功能，但是穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)也可結(jié)合其它靶標而不直接影響免疫細胞功能。例如，抗粒細胞抗體，例如針對CD66或CEACAM6(例如NCA90或NCA95)，可用于靶向受感染組織中的粒細胞，而且也可用于靶向表達CEACAM6的癌癥。在一個實施方案中，治療藥是寡核苷酸。例如，寡核苷酸可以是反義寡核苷酸或雙鏈干擾RNA(RNA/)分子。寡核苷酸可針對癌基因，例如bcl-2或p53。抑制bcl-2表達的反義分子參見美國專利第5,734,033號。可將其綴合，或形成穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的治療藥部分?；蛘?，.寡核苷酸可與穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)同時給予或序貫給予。在另一個實施方案中，治療藥是硼附加物，并且當治療藥定位后，治療需要用熱或超熱中子輻射。治療藥也可以是光敏治療藥，尤其是發(fā)色團或染料。在另一優(yōu)選實施方案中，治療藥是來自動物、植物和孩史生物來源的毒素。優(yōu)選的毒素包括蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、oc毒素、皂草毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素和假單胞菌內(nèi)毒素。治療藥可以是免疫調(diào)節(jié)劑，例如細胞因子、干細胞生長因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干擾素(IFN)、干細胞生長因子、紅細胞生成素、血小板生成素及其組合。所述淋巴毒素是腫瘤壞死因子(TNF)。造血因子可以是白介素(IL),集落刺激因子可以是粒細胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒細胞巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)),干擾素可以是干擾素-a、P或y,干細胞生長因子可以是S1因子?；蛘?，免疫調(diào)節(jié)劑可包括IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-IO、IL-12、IL-17、IL-18、IL-21、干擾素-y、TNF-a或其組合。優(yōu)選的治療用放射性核素包括p、a和俄歇發(fā)射體，其keV范圍為80-500keV。示例性的治療用放射性同位素包括"P、33P、47Sc、125I、131I、86Y、90Y、186Re、188Re、189Re、64Cu、67Cu、67Ga、mIn、川Ag、142Pr、153Sm、161Tb、166Dy、166Ho、177Lu、198Au、211At、212Pb、212Bi、213Bi、223Ra和225Ac及其組合。示例性的光敏治療藥選自生色團和染料。還優(yōu)選的治療藥是選自以下的酶蘋果酸脫氫酶、葡萄球菌核酸酶、S-V-甾體異構(gòu)酶、酵母醇脫氫酶、a-甘油磷酸脫氬酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、P-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、過氧化氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氬酶、葡糖淀粉酶和乙酰膽石威酯酶。治療用肽的各種實例是本領(lǐng)域已知的，任何這類已知藥物都可使用。示例性的治療用肽包括但不限于激素、生長因子、細胞因子、趨化因子、結(jié)合肽、封閉肽(blockmgpeptide)、毒素、血管生成因子、抗血管生成因子、抗生素、抗癌肽、抗病毒肽、藥用肽、酶、激動劑、拮抗劑、造血因子例如紅細胞生成素和許多其它臨床用化合物。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可與至少一個促炎效應(yīng)物細胞因子、促炎效應(yīng)物趨化因子或促炎效應(yīng)物受體特異性結(jié)合。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可結(jié)合的促炎效應(yīng)物細胞因子包括但不限于MIF、HMGB-1、TNF-a(腫瘤壞死因子a)、IL-1、IL畫4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17和IL-18。促炎效應(yīng)物趨化因子包括但不限于CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1(單核細胞趨化蛋白1)、RANTES、MIP-1A(巨噬細胞炎性蛋白1A)、MIP-1B(巨噬細胞炎性蛋白1B)、ENA-78(上皮嗜中性粒細胞活化肽78)、IP-IO、GROB(GRO(3)和嗜酸性粒細胞趨化因子。促炎效應(yīng)物受體包括但不限于IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R和IL-18R。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)也可與至少一個凝固因子(例如組織因子或凝血酶)特異性反應(yīng)。淋巴因子/細胞因子與免疫細胞上它們的受體反應(yīng)，導(dǎo)致活化，而抗體則可通過中和這些淋巴因子/細月包因子而阻斷活化?；蛘?，抗體可以與淋巴因子/細胞因子受體反應(yīng)而阻斷活化。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的不同靶標可以是相同或不同類型的效應(yīng)物和凝固因子。例如，穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的兩種或多種不同靶標可以選自同類效應(yīng)物或凝固因子，例如兩種或多種不同促炎效應(yīng)物細胞因子、兩種或多種不同促炎效應(yīng)物趨化因子、兩種或多種不同促炎效應(yīng)物受體、或兩種或多種凝固因子?；蛘撸瑑煞N或多種不同輩巴標可以選自不同類型的效應(yīng)物和凝固因子。例如，一種靶標可以是先天免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物，另一種靶標可以是凝固因子?；蛘?，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以與諸如以下的兩種不同類型的促炎效應(yīng)物特異性反應(yīng)至少一種促炎效應(yīng)物細胞因子和至少一種促炎效應(yīng)物趨化因子、至少一種促炎效應(yīng)物細胞因子和至少一種促炎效應(yīng)物受體、或者至少一種促炎效應(yīng)物趨化因子和至少一種促炎效應(yīng)物受體。也可有這種情況穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)特異性反應(yīng)的兩種不同靶標是先天免疫系統(tǒng)同一促炎效應(yīng)物的不止一個表位，或同一凝固因子的不止一個表位。因此，"兩個不同耙標"可指兩種不同抗原或同一抗原的兩個不同表位。多種抗體可針對同一抗原而使用，因此增加價位。例如，當耙向MIF或HMGB-1時，尤其是用于治療膿毒病、某些癌癥和動脈粥樣硬化斑塊時，結(jié)合靶標的兩個相同表位的兩個抗體可以摻入到穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)中，所述結(jié)構(gòu)帶有另一抗體，其具有針對不同抗原的一個或多個結(jié)合臂，所述抗原例如II類HLA恒定鏈抗原，例如CD74?？梢赃x擇抗體，以結(jié)合兩種不同抗原，例如針對MIF和CD74的抗體；針對HMGB-1和CD74的抗體。當促炎效應(yīng)物受體被輩巴向時，在一個優(yōu)選的實施方案中，真實把標可以是促炎效應(yīng)物受體的胞外區(qū)。在一個替代實施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可包含至少一個能與促炎效應(yīng)物受體反應(yīng)的分子。該分子可以是所述促炎效應(yīng)物受體的天然拮抗劑，或者該拮抗劑的片段或突變體，并且能與受體發(fā)生特異性相互作用。在一個優(yōu)選的實施方案中，天然拮抗劑是天然IL-1受體拮抗劑，或該拮抗劑的片段或突變體。在一個實施方案中，靶標可以是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的抗原或受體。在其它實施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的靶標可存在于先天免疫系統(tǒng)的細胞上，所述細胞例如粒細胞、單核細胞、巨謹細胞、樹突細胞和NK細胞。其它靶標包括血小板和內(nèi)皮細胞。而另一組耙標選自C5a、LPS、IFNy和B7。再一組合適的輩巴標包括CD2、CD4、CD14、CD18、CDlla、CD20、CD22、CD23、CD25、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147和CD154。CD是免疫細胞上的耙標，可將其阻斷以阻止免疫細胞反應(yīng)。CD83是特別有用的活化樹突細胞標記(Cao等，BiochemJ,Aug.23,2004(Epubaheadofprint);Zinser等，J.ExpMed.200(3):345-51(2004》。某些靶標特別令人感興趣，例如MIF、HMGB-1、TNF-a、補體因子和補體調(diào)節(jié)蛋白以及凝固因子。MIF是先天免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵性細胞因子，在炎癥反應(yīng)控制中起到重要作用。原先是作為抑制巨噬細胞隨機遷移的T淋巴細胞衍生因子而予以描述，稱為巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)的蛋白質(zhì)，在大約30多年以來一直是謎一樣的細胞因子。近年來，發(fā)現(xiàn)MIF是腦垂體腺前葉的產(chǎn)物，生物活性的重組MIF蛋白的克隆和表達，得出了它在體內(nèi)關(guān)鍵性生物學(xué)作用的定義。MIF具有獨特性質(zhì)，是由巨噬細胞和T淋巴細胞在受到糖皮質(zhì)激素刺激后釋放的。一旦釋放，MIF在體外能克服糖皮質(zhì)激素對TNF-a、IL-1(3、IL-6和IL-8產(chǎn)生的抑制效應(yīng)(這些TNF-a、IL-lp、IL-6和IL-8是由LPS刺激的單核細胞產(chǎn)生的)并在體內(nèi)抑制甾體對致死性內(nèi)毒素血癥的保護效應(yīng)。MIF在體外也拮抗T細胞增殖的糖皮質(zhì)激素抑制，即通過恢復(fù)產(chǎn)生IL-2和IFN卞MIF是第一種已鑒定的可反調(diào)節(jié)(counter-regulate)糖皮質(zhì)激素抑制效應(yīng)的介質(zhì)，因而在炎癥和免疫的宿主控制中起到關(guān)鍵性作用。MIF在治療癌癥、病理性血管生成和膿毒病或膿毒性休克中特別有用。HMGB-1是DNA結(jié)合核和胞質(zhì)溶膠蛋白，它是在IL-ip、TNF或LPS活化后由單核細胞和巨噬細胞釋放的一種促炎細胞因子。通過其B框結(jié)構(gòu)域，它誘導(dǎo)DC的表型成熟。它也可引起促炎細胞因子IL-la、IL-6、IL-8、IL-12、TNTF-a和RANTES的分泌增加。由壞死細胞釋放的HMGB-1可以是組織或細胞損傷的信號，這樣的信號當被DC感受到之后，能誘導(dǎo)和/或增強免疫反應(yīng)。Palumbo等報道了HMBG1誘導(dǎo)成血管細胞(mesoangioblast)遷移和增殖(JCellBiol,164:441-449(2004))。HMGB-1是內(nèi)毒素誘導(dǎo)的致死率的晚期介質(zhì)，它相對于TNF和IL-1(3表現(xiàn)出顯著延遲動力學(xué)。已經(jīng)證明，靶向特定早期炎性介質(zhì)(例如單獨的TNF和IL-1(3)的實驗性治療藥在臨床上是有效的，但穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可提高反應(yīng)，即通過同時靶向早期和晚期炎性介質(zhì)。靶向HMBG-1的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)在治療關(guān)節(jié)炎、尤其是膠原誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎中特別有用。包含HMBG-1的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)也可用于治療膿毒病和/或膿毒性休克。Yang等，PNASUSA101:296-301(2004);Kokkola等，ArthritisRheum,48:2052-8(2003);Czura等，JInfectDis，187Suppl2:S391-6(2003);Treutiger等，JInternMed,254:375-85(2003)。TNF-ot是參與全身炎癥和急性期反應(yīng)的一種重要細胞因子。TNF-ot由受刺激的單核細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞釋放。巨噬細胞、T細胞和B淋巴細胞、粒細胞、平滑肌細胞、嗜酸性粒細胞、軟骨細胞、成骨細胞、肥大細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和角質(zhì)細胞在受到刺激后也產(chǎn)生TNF-a。在損傷過程中，例如感染過程中，其釋放受到白介素-1和細菌內(nèi)毒素等其它幾種介質(zhì)的刺激。它在不同器官系統(tǒng)中具有許多作用，通常與白介素-1和-6在一起。TNF-a的作用之一是抑制食欲；因此用于治療惡病質(zhì)的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)優(yōu)選草巴向TNF-ot。它也刺激肝臟急性期反應(yīng)，導(dǎo)致C-反應(yīng)蛋白和多種其它介質(zhì)的增加。當治療膿毒病或膿毒性休克時，它也是有用的耙標。補體系統(tǒng)是復(fù)雜級聯(lián)，包括血清糖蛋白的蛋白水解(通常由細胞受體激活)。"補體級聯(lián)"是組成型而非特異性的，但它必須被活化，才能起作用。補體激活導(dǎo)致單向順序的酶促和生化反應(yīng)。在該級聯(lián)中，特定補體蛋白C5形成兩個高度活化的炎性副產(chǎn)物C5a和C5b,它們共同激活白細胞。這反過來又產(chǎn)生大量其它炎性副產(chǎn)物，包括有害的細胞因子、炎性酶和細胞粘附分子?？偠灾?，這些副產(chǎn)物可導(dǎo)致在許多炎性疾病中可見的組織破壞。該級聯(lián)最終引起對炎癥反應(yīng)、吞噬細胞趨化性和調(diào)理作用和細胞溶解的誘導(dǎo)。補體系統(tǒng)可通過兩個不同途徑而活化，即經(jīng)典途徑和替代途徑。大多數(shù)補體組分是有編號的(例如Cl、C2、C3等)，但有些則稱為"因子"。某些組分必需經(jīng)酶促切割以活化其功能；其它的則簡單結(jié)合以形成具有活性的復(fù)合物。經(jīng)典途徑的活性組分包括Clq、Clr、Cls、C2a、C2b、C3a、C3b、C4a和C4b。一,4戈途徑的活性組分包括C3a、C3b、因子B、因子Ba、因子Bb、因子D和備解素。各途徑的最后階段相同，都包括將組分裝配到膜攻擊復(fù)合體(membraneattackcomplex)。膜攻擊復(fù)合體的活性組分包括C5a、C5b、C6、C7、C8和C9n。盡管穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以靶向補體系統(tǒng)這些組分中的任一種，但是優(yōu)選某些補體組分。C3a、C4a和C5a使肥大細胞釋放趨化因子(例如組胺和5-羥色胺，這些因子攻擊吞噬細胞)、抗體和補體等。這些構(gòu)成一組優(yōu)選靶標。另一組優(yōu)選的靶標包括C3b、C4b和C5b,它們增強對外源細胞的吞噬作用。另一組優(yōu)選的靶標是這兩組的前體組分，即C3、C4和C5。C5b、C6、C7、C8和C9請導(dǎo)外源細胞溶解(膜攻擊復(fù)合體)并構(gòu)成又一組優(yōu)選的靶標。補體C5a，同C3a—樣，也是一種過敏毒素。它介導(dǎo)炎癥，是誘導(dǎo)嗜中性粒細胞釋放抗微生物蛋白酶和氧自由基的化學(xué)引誘物。因此，C5a及其前體C5是特別優(yōu)選的靶標。通過耙向C5，不僅C5a受影響，而且C5b也受影響，這引起膜攻擊復(fù)合體的裝配。因此，C5是另一優(yōu)選靶標。C3b及其前體C3也是優(yōu)選靼標，因為經(jīng)典和替代補體途徑依賴于C3b。三種蛋白質(zhì)影響該因子水平Cl抑制劑、蛋白H和因子I,它們也是本發(fā)明的優(yōu)選靶標。補體調(diào)節(jié)蛋白(例如CD46、CD55和CD59)可以是穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)所結(jié)合的耙標。凝固因子也是優(yōu)選耙標，尤其是組織因子(TF)和凝血酶。TF也稱為組織促凝血酶原激酶、CD142、凝固因子III或因子m。TF是膜內(nèi)在受體糖蛋白，是細胞因子受體超家族成員。TF的配體結(jié)合胞外域由兩個結(jié)構(gòu)模塊組成，其特征與TF的分類一致，都是2型細胞因子受體的成員。TF參與凝血蛋白酶級聯(lián)，引發(fā)外源性和內(nèi)源性凝血級聯(lián)，即通過形成TF胞外域與循環(huán)凝血因子、絲氨酸蛋白酶因子VII或因子Vila之間的高親和性復(fù)合物。這些酶促活性復(fù)合物再激活因子IX和因子X,導(dǎo)致凝血酶的產(chǎn)生和血凝塊的形成。TF由包括單核細胞、巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞在內(nèi)的不同細胞類型表達，并由IL-1、TNF-a或細菌脂多糖誘導(dǎo)。蛋白激酶C參與內(nèi)皮細胞TF表達的細胞因子活化。內(nèi)毒素和細胞因子誘導(dǎo)TF是引發(fā)革蘭氏陰性膿毒病患者中可見的彌散性血管內(nèi)凝血的重要機制。TF也表現(xiàn)出參與不同的非止血功能，包括炎癥、癌癥、腦功能、免疫應(yīng)答和腫瘤相關(guān)血管生成。因此，按照本發(fā)明，靶向TF的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)不僅在治療凝血病中有用，而且在治療膿毒病、癌癥、病理性血管生成和其它免疫和炎癥失調(diào)疾病中也有用。認為凝血途徑與細胞因子網(wǎng)絡(luò)間具有復(fù)雜的相互作用，因為幾種細胞因子影響各種細胞內(nèi)TF表達的能力以及配體對受體的結(jié)合作用。已經(jīng)報道了配體結(jié)合(因子VIIa)，以給出胞內(nèi)《丐信號，因此表明TF是真受體。在其它實施方案中，穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)結(jié)合I類MHC、II類MHC或輔助分子，例如CD40、CD54、CD80或CD86。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)也可結(jié)合T細胞活化細胞因子，或結(jié)合細胞因子介質(zhì)，例如NF-kB。在某些實施方案中，兩個不同靶標中的一個可以是癌細胞受體或癌癥相關(guān)抗原，尤其是選自以下的一個B-細胞譜系抗原(CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等)、VEGFR、EGFR、癌胚抗原(CEA)、胎盤生長因子(PLGF)、生腱蛋白、EER-2/"ew、EGP-1、EGP-2、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD45、CD52、CD74、CD80、CD138、NCA66、CEACAM6(癌胚抗原相關(guān)性細胞粘附分子6)、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC16、IL-6、甲胎蛋白(AFP)、A3、CA125、結(jié)腸特異性抗原-p(CSAp)、葉酸受體、HLA-DR、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、Ia、EL-2、胰島素樣生長因子(ILGF)和ILGF受體、KS-1、Le(y)、MAGE、壞死抗原、PAM-4、前列腺酸性褲酸酶(PAP)、Prl、前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、SIOO、TlOl、TAC、TAG72、TRAIL受體和碳酸酐酶IX。膿毒病和免疫失調(diào)以及其它免疫性疾病相關(guān)的靶標包括MIF、IL-1、IL-6、IL-8、CD74、CD83和C5aR。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)針對C5aR的抗體和抑制劑能提高患有膿毒病的嚙齒動物的生存率(Huber-Lang等，F(xiàn)ASEBJ2002;16:1567-1574;Riedemann等，JClmInvest2002;110:101-108),并提高患有膿毒性休克和成人呼吸窘迫綜合征的猴子的生存率(Hangen等，JSurgRes1989;46.195-199;Stevens等，JClinInvest1986;77:1812-1816)。因此，對于膿毒病，兩個不同輩巴標之一優(yōu)選是感染相關(guān)靶標，例如LPS/C5a。其它優(yōu)選靶標包括HMGB-l、TF、CD14、VEGF和IL-6,它們各自與敗血癥或膿毒性休克相關(guān)。優(yōu)選穩(wěn)定束縳結(jié)構(gòu)是那些靶向兩個或更多以下靶標的結(jié)構(gòu)HMGB-1、TF和MIF,例如MIF/TF和HMGB-1/TF。在另一些實施方案中，兩個不同靶標之一可以是移植物抗宿主病或移植排斥相關(guān)靶標，例如MIF(Lo等，BoneMarrowTransplant,30(6):375-80(2002))。這兩個不同把標之一也可以是以下疾病相關(guān)靶標急性呼吸窘迫綜合征相關(guān)靶標，例如IL-8(Bouros等，PMCPulmMed,4(1):6(2004),動脈粥樣硬化或再狹窄相關(guān)靶標，例如MIF(Chen等，ArtenosclerThromhVaseBiol,24(4):709-14(2004),哮喘相關(guān)輩巴標，例如IL-18(Hata等，IntImmunol,Oct.11,2004Epubaheadofprint),肉芽腫性疾病相關(guān)靶標，例如TNF-a(Ulbricht等，ArthritisRheum,50(8):2717-8(2004)，神經(jīng)病相關(guān)靶標，例如氨曱?；疎PO(紅細胞生成素)(Leist等，Science305(5681):164-5(2004)或惡病質(zhì)相關(guān)靶標，例如IL-6和TNF-a。其它耙標包括C5a、LPS、IFN-y、B7;CD2、CD4、CD14、CD18、CDlla、CDllb、CD〗]c、CD14、CD18、CD27、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147、CD154?？梢酝ㄟ^針對CD18、CD11b或CD11c的抗體，在某種程度上抑制某些微生物抗原(包括LPS)對單核細胞的活化，因此涉及p2-整聯(lián)蛋白(Cuzzola等，JImmunol2000;164:5871-5876;Medvedev等，JImmunoll998;160:4535-4542)。已經(jīng)知道CD83在巨細胞動脈炎(GCA)中起作用，這是一種影響中動脈到大動脈(主要是主動脈弓顱外分枝及其主動脈本身)的全身性脈管炎，導(dǎo)致血管狹窄并隨后造成組織缺血以及失明、中風和主動脈弓綜合征的嚴重并發(fā)癥(Weyand和Goronzy,NEnglJMed2003;349:160-169;Hunder禾口Valente，載于InflammatoryDiseasesofBloodVessels.G.S.Hoffman禾口C.M.Weyand主編，MarcelDekker,NewYork,2002;255-26"。發(fā)現(xiàn)抗CD幻的抗體在人GCA的SCID小鼠模型中能消除脈管炎(Ma-Krupa等，JExpMed2004;199:173-183),向這些研究人員表明，樹突細胞(當激活時表達CD83)在GCA中是重要的抗原加工細胞。在這些研究中，他們使用小鼠抗CD83Mab(IgGl克隆HB15e，來自ResearchDiagnostics)。CD154是TNF家族成員，在CD4-陽性T淋巴細胞表面表達，已經(jīng)報道了針對CD154的人源化單克隆抗體在活動性系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者中產(chǎn)生明顯的臨床益處(Grammar等，JClinInvest2003;112:1506-1520)。也表明該抗體可用于其它自身免疫性疾病(Kelsoe,JClinInvest2003;112:1480-1482)。實際上，也報道了該抗體在難治性免疫血小板減少性紫癜患者中是有效的(Kuwana等，Blood2004;103:1229-1236)。在類風濕性關(guān)節(jié)炎中，重組白介素-1受體拮抗劑IL-IRa即阿那白滯素(anakmra)(Kineret)已經(jīng)顯示出活性(Cohen等，AnnRheumDis2004;63:1062-8;Cohen,RheumDisClinNorthAm2004;30:365-80)。在治療這些患者(至今需要同時用曱氨蝶呤治療)方面的一個改進，就是將阿那白滯素與一種或多種抗促炎效應(yīng)物細胞因子或抗促炎效應(yīng)物趨化因子(如上表所示)結(jié)合起來使實。實際上，在類風濕性關(guān)節(jié)炎的抗體治療的綜述中，Taylor(CurrOpinPharmacol2003;3:323-328)指出，除了TNF之外，還可使用針對以下細胞因子的其它抗體IL-1、IL-6、IL-8、IL-15、IL-17和IL-18。某些更優(yōu)選靶標的組合包括下文所述的組合。這是優(yōu)選組合的實例，但并非是窮盡性的。<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以是含有至少兩種分離的抗體和/或受體或它們的配體的混合物，其結(jié)合不同靶標。在一個優(yōu)選的實施方案中，靶標選自先天免疫系統(tǒng)的促炎效應(yīng)物、凝固因子、補體因子和補體調(diào)節(jié)蛋白，以及與炎性障礙或免疫失調(diào)障礙、與病理性血管生成或癌癥或傳染性疾病特異性相關(guān)的靶標。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可結(jié)合受體或結(jié)合其靶分子，例如對于LPS,IL-1、IL-IO、IL-6、MIF、HMGB1、TNF、IFN、組織因子、凝血酶、CD14、CD27和CD134。它們許多在血液中同時以受體和可溶性形式存在。穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)的結(jié)合導(dǎo)致從血中快速清除，然后由穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的第二組分靶向另一細胞(例如巨噬細胞)，用于通過細胞、尤其是溶酶體進行轉(zhuǎn)運和降解。這在第二靶向組分是針對由巨噬細胞和樹突細胞表達的內(nèi)化抗原(例如CD74)時，特別有效。這與Hansen在美國專利6,458,933中公開的內(nèi)容一致，但是集中在炎性細胞因子和其它免疫調(diào)節(jié)分子和受體(對于免疫失調(diào)疾病)和癌癥抗原(對于這些癌癥的免疫治療)。用于治療癌癥的優(yōu)選穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)包含針對CD55和任何以上癌癥抗原的抗體、針對CD46和任何以上癌癥抗原的抗體、針對CD59和任何以上癌癥抗原的抗體、針對MIF和任何以上癌癥抗原的抗體、針對NF-kB和任何以上癌癥抗原的抗體，以及針對IL-6和任何以上癌癥抗原(并非IL4)的抗體。穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)可以與一種或多種第二治療藥聯(lián)用。這第二治療藥可以是影響先天免疫系統(tǒng)組分的藥物。或者，它可影響適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的組分。第二治療藥也可以是影響凝血、癌癥或自身免疫性疾病的組分，例如細胞毒性藥物。可以用藥盒形式提供帶有診斷試劑或治療藥的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，用于人或哺乳動物治療和診斷用途，所述結(jié)構(gòu)在藥學(xué)上可接受的注射用溶媒中，所述溶媒優(yōu)選生理pH和濃度的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)。優(yōu)選的制劑是無菌的，尤其是人用制劑。這類藥盒的任選組分包括穩(wěn)定劑、緩沖劑、標記用試劑、放射性同位素、順磁化合物、用于提高清除率的第二抗體，以及常規(guī)注射器、柱、小瓶(管)等。噬菌體展示在某些替代實施方案中，可用本領(lǐng)域眾所周知的噬菌體展示技術(shù)，來確定用于構(gòu)建DDD和/或AD結(jié)構(gòu)域的結(jié)合肽。例如，可以通過針對DDD二聚體的噬菌體展示淘選，鑒定能結(jié)合DDD結(jié)構(gòu)域、并因此可替代天然存在的AD序列的肽，并選擇具有高結(jié)合親和性的噬菌體?？梢酝ㄟ^針對所選靶標的噬菌體展示淘選，來檢測其它類型的結(jié)合肽，所述肽對特定靶分子具有選擇性或特異性。用于產(chǎn)生多樣化肽群體的各種噬菌體展示方法和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，美國專利第5,223,409、5,622,699和6,068,829號(所述各專利通過引用結(jié)合到本文中)公開了制備噬菌體文庫的方法。噬菌體展示技術(shù)包括對噬菌體進行遺傳操作，使得小肽可以表達在其表面(Smith和Scott,1985,Science228:1315-1317;Smith和Scott,1993,Meth.Enzymol.21:228-257)。最近十幾年來，在噬菌體展示肽文庫的構(gòu)建和用該肽文庫分離肽配體的篩選方法的開發(fā)方面已有很大進展。例如，使用肽文庫可以表征許多蛋白質(zhì)內(nèi)的相互作用位點和受體-配體結(jié)合基序，所述蛋白質(zhì)例如參與炎癥反應(yīng)的抗體或介導(dǎo)細胞粘附的整if關(guān)蛋白。該方法也已用于鑒定新的肽配體，這可導(dǎo)致對肽模擬藥物或造影劑的開發(fā)(Arap等，1998a,Science279:377-380)。除了肽之外，更大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域(例如單鏈抗體)也可展示在噬菌體顆粒表面(Arap等，1998a)。可以通過淘選，來分離對給定靶分子具有選擇性的靶向氨基酸序列(Pasqualmi和Ruoslahti,1996,Nature380:364-366;Pasqualmi，1999，TheQuart.J.Nucl.Med.43:159-162)。簡而言之，將含有推定靶向肽的噬菌體文庫暴露給靶分子，收集含有結(jié)合噬菌體的樣品。可將靶分子連接在例如96孔板的微量滴定孔底部?？梢韵疵撆c靶標連接的噬菌體，然后通過在宿主菌中培養(yǎng)而擴增。在某些實施方案中，可以在幾輪淘選之間在宿主菌中使噬菌體增殖。細菌不被噬菌體裂解，而是分泌多拷貝噬菌體，這些噬菌體展示特定插入物。如有必要，可再次將擴增的噬菌體暴露給靶分子，并收集起來用于進一步多輪淘選?？梢赃M行多輪淘選，直至得到選擇性或特異性結(jié)合物群體。可以對噬菌體基因組中靶向肽插入物的相應(yīng)DNA進行測序，從而確定肽的氨基酸序列。然后可通過標準蛋白質(zhì)化學(xué)技術(shù)產(chǎn)生經(jīng)鑒定的靶向肽作為合成肽(Ar叩等,1998a,Smith等，1985)。適體在某些實施方案中，構(gòu)建體形成的前體可包括適體。構(gòu)建和測定適體結(jié)合特性的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。例如，這類技術(shù)參見美國專利第5,582，981、5,595,877和5,637,459號，所述各專利通過引用結(jié)合到本文中。可用合成、重組和純化等任何已知方法制備適體，適體最少需要約3個核苷酸、優(yōu)選至少5個核苷酸以達到特異性結(jié)合?？梢允褂眯蛄卸逃?0個堿基的適體，盡管優(yōu)選10、20、30或40個核苦酸的適體。適體需含有賦予結(jié)合特異性的序列，但也可以用側(cè)翼區(qū)來延伸或其它衍生方式來延伸。在優(yōu)選的實施方案中，適體的結(jié)合序列可以鄰接引物-結(jié)合序列，以便用PCR或其它擴增技術(shù)來擴增適體。在另一個實施方案中，側(cè)翼序列可包含這樣的特定序列該序列優(yōu)先識別或結(jié)合一個部分，使適體更牢固地固定在基質(zhì)上。可以經(jīng)分離、測序和/或擴增或合成，使適體成為常規(guī)DNA或RNA分子?；蛘?，目標適體可包含經(jīng)修飾的寡聚體。適體中通常存在的任何羥基都可被膦酸酯基團取代，磷酸酯基被標準保護基保護起來，或者被活化以便與其它核苷酸額外連接，或者可以與固體支持物綴合。一種或多種磷酸二酯鍵可以被其它連接基團置換，例如P(O)O被以下基團置換P(O)S、P(0)NR2、P(O)R、P(O)OR'、CO或CNR2，其中R是H或烷基(1-20C),而R'是烷基(1-20C);另外，該基團可通過o或s與相鄰核苷酸連接。寡聚體中并非所有連接都要相同。能結(jié)合特定目標靶的適體的制備和篩選方法是眾所周知的，例如美國專利第5,475,096號和美國專利第5,270,163號，所述各專利通過引用結(jié)合到本文中。技術(shù)通常包括從候選適體混合物中進行選擇并逐步重復(fù)結(jié)合，將結(jié)合的適體與未結(jié)合適體分離開來并擴增。因為在混合物中，對應(yīng)于最高親和力適體來說只有少量序列(可能僅有一分子適體)存在，通常最好是設(shè)定劃分標準，使得在分離期間，保留混合物中有效量的適體(約5-50%)。每輪都濃縮了對耙標具有高親和性的適體?？芍貜?fù)3-6輪選擇和擴增循環(huán)，以產(chǎn)生能以高親和力和高特異性結(jié)合靶標的適體。Avimcrs在某些實施方案中，本文所述的前體、組分和/或復(fù)合物可包含一種或多種avimer序列。Avimer是一類結(jié)合蛋白，在對不同靶分子的親和力和特異性方面有點類似于抗體。通過體外外顯子改組和噬菌體展示，從人胞外受體結(jié)構(gòu)域中開發(fā)得到Avimer。(Silverman等，2005,Nat.Biotechnol.23:1493-94;Silverman等，2006,Nat.Biotechnol.24:220)。所得多結(jié)構(gòu)域蛋白包含多個獨立結(jié)合結(jié)構(gòu)域，與單一表位結(jié)合蛋白相比，多結(jié)構(gòu)域蛋白表現(xiàn)出改進的親和力(在某些情況下低于毫微摩爾級)和特異性。(出處同上)。在不同實施方案中，avimer可與例如AD和/或DDD序列連接，用于本文要求保護的方法和組合物。有關(guān)avimer的構(gòu)建和使用方法的更多細節(jié)公開于例如美國專利申請公布號20040175756、20050048512、20050053973、20050089932和20050221384,所述各文獻的實施例部分通過引用結(jié)合到本文中。蛋白質(zhì)和肽在本文要求保護的方法和組合物的范圍內(nèi)，可以使用各種多肽或蛋白質(zhì)。在某些實施方案中，蛋白質(zhì)可包含抗體或含有抗原結(jié)合位點的抗體片段。在其它實施方案中，蛋白質(zhì)或肽可以是效應(yīng)物分子，例如酶、激素、細胞因子、結(jié)合蛋白或毒素。本文所用的蛋白質(zhì)、多肽或肽通常是指但不限于大于約200個氨基酸到自基因翻譯出的全長序列的蛋白質(zhì)；大于約100個氨基酸的多肽；和/或約3至約100個氨基酸的肽。為了方便起見，術(shù)語"蛋白質(zhì)，，、"多肽"和"肽"在本文可互換使用。因此，術(shù)語"蛋白質(zhì)或肽"包括氨基酸序列，所述序列包含天然蛋白質(zhì)中存在的20種常見氨基酸中的至少一種，或至少一個修飾的或稀有氨基酸。本文所用的"氨基酸殘基"是指本領(lǐng)域已知的任何天然存在的氨基酸、任何氨基酸衍生物或任何氨基酸模擬物。在某些實施方案中，蛋白質(zhì)或肽殘基是連續(xù)的，沒有任何非氨基酸間插在氨基酸殘基序列中。在其它實施方案中，序列可包含一個或多個非氨基酸部分。在具體實施方案中，蛋白質(zhì)或肽殘基序列可以間插一個或多個非氨基酸部分。因此，術(shù)語"蛋白質(zhì)或肽"包括這樣的氨基酸序列其包含天然蛋白質(zhì)中存在的20種常見氨基酸中的至少一種，或至少一個修飾或稀有氨基酸，包括但不限于2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、p-丙氨酸、P-氨基-丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、哌咬酸(pipendmicacid)、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基異丁酸、3-氨基異丁酸、2-氨基庚二酸、2，4-二氨基丁酸、鎖鏈素、2,2'-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基天冬酰胺、羥基賴氨酸、另'卜羥基賴氨酸、3-羥基脯氨酸、4-羥基脯氨酸、異鎖鏈素、另'卜異亮氨酸、N-甲基甘氨酸、肌氨酸、N-甲基異亮氨酸、6-N-曱基賴氨酸、N-甲基纈氨酸、正纈氨酸、正亮氨酸和鳥氨酸?；蛘?，除了天然存在的L-氨基酸之外，蛋白質(zhì)或肽還可包含一種或多種D-氨基酸。產(chǎn)生摻入D-氨基酸的肽的方法公開于例如美國專利申請公布號20O50025709,McBride等(2004年6月14日申請)。可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法制備蛋白質(zhì)或肽，所述方法包括通過標準分子生物學(xué)技術(shù)表達蛋白質(zhì)、多肽或肽，從天然來源分離出蛋白質(zhì)或肽，或者化學(xué)合成蛋白質(zhì)或肽。先前已經(jīng)公開了對應(yīng)于不同基因的核苷酸和蛋白質(zhì)、多肽和肽序列，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道，可以在計算機數(shù)據(jù)庫中找到它們。一個這樣的數(shù)據(jù)庫就是國立生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的Genbank禾口GenPept凄t才居庫。采用本文所公開的技術(shù)或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知技術(shù)，可以擴增和/或表達已知基因的編碼區(qū)?；蛘?，各種市售的蛋白質(zhì)、多肽和肽制劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。肽模擬物多肽制備的另一實施方案是采用肽模擬物。模擬物是含肽分子，其模擬蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)組件。參見例如Johnson等，"PeptideTurnMimetics"載于BIOTECHNOLOGYANDPHARMACY,Pezzuto等主編，ChapmanandHall，NewYork(1993),所述文獻通過引用結(jié)合到本文中。使用肽模擬物的基本原理是，蛋白質(zhì)肽主鏈的存在，主要能適應(yīng)氨基酸側(cè)鏈，以便于分子的相互作用，例如抗體與抗原的以采用這些原理來改造第二代分子，所述分子具有本文所公開的結(jié)合肽的許多天然特性，但也具有改變或改進的特性，例如通過胃或腸的吸收增加和/或提高了體內(nèi)穩(wěn)定性或活性。融合蛋白不同實施方案可涉及融合蛋白。這些分子通常具有肽的全部或重要部分，其在N-端或C-端與第二多肽或蛋白質(zhì)的全部或部分連接。例如，融合可用來自其它物種的前導(dǎo)序列，以^^在異源宿主中進行蛋白質(zhì)的重組表達。另一可用的融合包括加入免疫活性區(qū)，例如抗體表位。而另一有用的融合形式可包括連接用于純化的部分，例如FLAG表位(Prickett等，1989,Biotechniques7:580-589;Castrucci等，1992,JVirol66:4647-46)。融合蛋白的另一用途涉及本文要求4呆護的束縛復(fù)合物的組分構(gòu)建，例如提供與第一單體連接的DDD序列和與第二單體連接的AD序列。融合蛋白的制備方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。按照以下實施例所述，這些蛋白質(zhì)可通過如下方式制備例如通過使用雙官能交聯(lián)劑的化學(xué)連接，通過從頭合成完整融合蛋白，或者通過將編碼第一蛋白質(zhì)或肽的DNA序列與編碼第二肽或蛋白質(zhì)的DNA序列連接在一起，再進行完整融合蛋白的表達。合成肽按照常規(guī)技術(shù)，可以合成完整或部分蛋白質(zhì)或肽，可以是在溶液中或在固體支持物上合成。各種自動合成儀是市售的，可按照已知方案來使用。參見例如Stewart和Young，(1984,SolidPhasePeptideSynthesis,第2版，PierceChemicalCo.);Tam等(1983,丄Am.Chem.Soc,105:6442);Memfield(1986,Science,232:341-347);和Barany和Merrifield(1979,ThePeptides,GrossandMeienhofer主編，AcademicPress,NewYork,第1-284頁)。按照這些方法，可以容易地合成通常約6至約35-50個氨基酸的短肽序列?；蛘?，可以采用重組DNA技術(shù)，其中將編碼目標肽的核苷酸序列插入表達載體中，轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染到合適宿給予肽要求保護的方法和/或組合物的不同實施方案涉及給予患者的一種或多種基于肽的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何途徑給予，包括但不限于口服、鼻腔、口腔含化劑、吸入、直腸、陰道、局部、正位(orthotopic)、皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、動月永內(nèi)、鞘內(nèi)或"l爭脈內(nèi)注射。口服給予患者的未修飾的肽可在消化道中降解，根據(jù)序列和結(jié)構(gòu)可表現(xiàn)出穿過腸道內(nèi)襯的吸收差。然而，肽的化學(xué)修飾方法是眾所周知的，所迷方法使肽對內(nèi)源性蛋白酶降解的壽文感性更低或者更容易通過消化道吸收(參見例如Blondelle等，l"5,Biophys.J.69:604-11;Ecker和Crooke，1995,Biotechnology13:35卜69;Goodman和Ro,1995，BURGER'SMEDICINALCHEMISTRYANDDRUGDISCOVERY,第I巻，Wollf編著，JohnWiley&Sons;Goodman和Shao,1996,Pure&Appl.Chem.68:1303-08)。也已描述了肽類似物文庫的制備方法，所述肽例如含有D-氨基酸的肽；由模擬肽結(jié)構(gòu)的有機分子組成的肽模擬物；或類肽(peptoid)，例如插烯型類肽(vmylogousp印toid);該方法可用于構(gòu)建適于口服給予患者的基于肽的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)。在某些實施方案中，標準肽鍵連接可以被一種或多種替代連接基團置換，所述基團例如CH2-NH、CH2-S、CH2-CH2、CH-CH、CO-CH2、CHOH-CH2等。肽模擬物的制備方法是眾所周知的(例如Hmby,1982，LifeSci31:189-99;Holladay等,1983，TetrahedronLett.24:4401-04;Jenmngs隱White等，1982,TetrahedronLett.23:2533;Almqmest等，1980,丄Med.Chem.23:1392-98;Hudson等，1979,Int.J.Pept.Res.14:177-185;Spatola等，1986,LifeSci38:]243-49;美國專利號5,169,862、5,539,085、5,576,423、5,051,448、5,559,103,所述各文獻通過引用結(jié)合到本文中)。與其肽類似物相比，肽模擬物表現(xiàn)出穩(wěn)定性提高和/或體內(nèi)吸收增加。或者，可經(jīng)口服給予肽，使用N端和/或C端封端(capping)以防止外肽酶活性。例如，C-端可以用酰胺肽去于端，而N-端可以通過肽的乙酰化封端。也可將肽環(huán)化以阻斷外肽酶，例如通過形成環(huán)酰胺、二硫化物、醚、硫化物等。也可通過用D-氨基酸替代天然存在的L-氨基酸，而使肽穩(wěn)定化，尤其是在已知內(nèi)肽酶起作用的位置上發(fā)生取代。內(nèi)肽酶結(jié)合和切割序列是本領(lǐng)域已知的，已經(jīng)描述了摻入D-氨基酸的肽的制備和使用方法(例如美國專利申請公布號20050025709，McBnde等，2004年6月14日申請，所述文獻通過引用結(jié)合到本文中)。在某些實施方案中，肽和/或蛋白質(zhì)可以通過與蛋白酶抑制劑和/或肽酶抑制劑共同配制，經(jīng)口服給予?？诜o予治療用肽的其它方法公開于Mehta("OraldeliveryandRecombinantproductionofpeptidehormones",June2004,BioPharmInternational)?？梢阅c溶衣的固體劑型主合予肽和貝武形劑，所述賦形劑調(diào)節(jié)腸道蛋白水解活性并增加肽穿過腸壁而轉(zhuǎn)運。用該技術(shù)，完整肽的相對生物利用度范圍為給藥劑量的1%-10%。使用含有膽酸鈉和蛋白酶抑制劑的腸溶衣微膠嚢劑，已經(jīng)成功將胰島素給予狗(Ziv等，1994,J.BoneMiner.Res.18(增刊2):792-94。用?；舛緣A作為滲透增強劑和腸溶衣，已經(jīng)完成了口服給予肽(￡11(^扭1^00-55,RohmPharmaPolymers,參見Mehta,2004)。用于口服給予肽的賦形劑通常包括一種或多種腸道蛋白酶抑制劑/肽酶抑制劑以及去垢劑或其它試劑，以提高肽的溶解度或吸收，它們可以包裝在腸溶衣膠囊或片劑中(Mehta,2004)。膠嚢中可以包含有機酸，一旦膠嚢在腸道中溶解時，這些有機酸就可酸化腸道并抑制腸道蛋白酶活性(Mehta,2004)?？诜o予肽的另一替代方法包括與基于綴合聚乙二醇(PEG)的兩親寡聚體綴合，該兩親寡聚體增加吸收和對酶促降解的抗性(Soltero和Ekwuribe,2001,Pharm.Technol.6:110)。在又一些實施方案中，可以通過與某些蛋白質(zhì)(例如IgGl的Fc區(qū))綴合而修飾肽，用于口服或吸入給藥(參見實施例3_7)。肽-Fc綴合物的制備和使用方法公開于例如Low等(2005,Hum.Reprod.20:1805-13)和Dumont等(2005,J.Aerosol.Med.18:294-303),所述各文獻通過引用結(jié)合到本文中。Low等(200"公開了采用在CHO細胞中的重組表達，將FSH的a和(3亞基與IgGlFc區(qū)(單鏈或異型二聚體形式)綴合。Fc綴合的肽通過新生Fc受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)吸收到肺或腸道上皮細胞中。與天然肽相比，F(xiàn)c綴合的肽表現(xiàn)出穩(wěn)定性提高，體內(nèi)吸收增加。還觀察到異型二聚體綴合物要比單鏈形式的活性高。交聯(lián)劑在某些實施方案中，可以使用本領(lǐng)域已知的各種交聯(lián)劑，使蛋白質(zhì)、肽或其它大分子共價交聯(lián)，所述交聯(lián)劑例如同型-雙官能交聯(lián)劑、雜雙官能交聯(lián)劑和/或光活化交聯(lián)劑。這類試劑的非限制性實例包括雙亞氨酸酯(bisimidates);1,5-二氟-2,4-(二硝基苯)；辛二酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯；酒石酸二琥珀酰亞胺酯；二曱基-3,3'-二硫-雙亞氨丙酸酯(bispropionimidate);N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡"定基二硫)丙酸酯；4-(溴氨基乙基)-2-硝基苯疊氮；和4-疊氮基乙二醛。在一個示例性的實施方案中，碳二亞胺交聯(lián)劑，例如DCCD或EDC,可用于將酸性殘基與氨基或其它基團交聯(lián)。這些試劑可以改性以連接不同類型的標"i己，例如熒光標記。雙官能交聯(lián)劑已經(jīng)廣泛用于各種目的。攜帶兩個相同官能團的同型雙官能試劑已經(jīng)證明能高效誘導(dǎo)相同或不同大分子或大分子的亞基間的交聯(lián)，并將多肽配體與其特異性結(jié)合位點連接。雜雙官能試劑含有兩個不同官能團。通過利用兩個不同官能團的不同反應(yīng)性，可以有選擇性地、按順序控制交聯(lián)。按官能團的特異性，可將雙官能交聯(lián)劑分為例如氨基、巰基、胍基、吲哚基、羧基特異性基團。其中，針對游離氨基的試劑尤其常用，因為它們是市售的，容易合成并且它們可用于溫和反應(yīng)條件。大部分雜雙官能交聯(lián)劑都含有伯氨基反應(yīng)基團和巰基反應(yīng)基團。在另一實例中，已經(jīng)描述了雜雙官能交聯(lián)劑及其使用方法(美國專利5,889,155)。交聯(lián)劑將親核酰肼殘基與親電子馬來酰亞胺殘基連接起來，在一個實例中讓醛與游離巰基偶聯(lián)。這些交聯(lián)劑可以改性以交聯(lián)不同官能團?？贵w不同實施方案可涉及靶標的抗體配體。本文所用的術(shù)語"抗體"是指具有抗原結(jié)合區(qū)的抗體樣分子，包括抗體片段，例如Fab'、Fab、F(ab')2、單域抗體(DAB)、Fv、scFv(單鏈Fv)等。各種基于抗體的構(gòu)建體和片段的制備和使用技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的?？贵w的制備和表征方法也是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如Harlowe和Lane,1988,Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory)。所用的抗體也可以是市售的，得自各種已知來源。例如，各種抗體分泌的雜交瘤系可得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC,Manassas,VA)?？贵w片段的制備要求保護的方法和/或組合物的某些實施方案可涉及抗體片段。這類抗體片段可用常規(guī)方法由胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化完整抗原而獲得。例如，抗體片段可通過將抗體用胃蛋白酶酶促切割而得到，以提供5S片段(稱為F(ab')2)。該片段還可用巰基還原劑切割，并且任選將封閉基團用于來自二硫鍵分解得到的巰基，以產(chǎn)生3.5SFab'單價片段?；蛘撸梦傅鞍酌傅拿复偾懈町a(chǎn)生兩個單價Fab片段和Fc片段。抗體片段的示例性制備方法公開于美國專利第4,036,945號；美國專利第4,331，647號；Nisonoff等,1960,Arch.Biochem.Biophys.,89:230;Porter,1959,Biochem.J.,73:119;Edelman等，1967,METHODSINENZYMOLOGY,第422頁(AcademicPress)和Coligan等(編著)，1991,CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY,(JohnWiley&Sons)。也可采用切割抗體的其它方法，例如分離重鏈以形成單價輕鏈-重鏈片段、進一步切割片段或其它酶促、化學(xué)或遺傳技術(shù)，只要片段能結(jié)合被完整抗體識別的抗原。例如，F(xiàn)v片段包括Vh和Vl鏈的締合。該締合可以是非共價的，參見Inbar等，l972,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA,69:2659?；蛘?，可變《連可以由分子間二辟"建連接或由化學(xué)試劑(例如戊二醛)交聯(lián)。參見Sandhu,l992,Cnt.Rev.Biotech.,12:437。優(yōu)選的Fv片段包含由肽接頭連接的VJ連和V^鏈。通過構(gòu)建包含DNA序列的結(jié)構(gòu)基因，制備這些單鏈抗原結(jié)合蛋白(sFv),所述DNA序列編碼VH區(qū)和VL區(qū)，這兩區(qū)由寡核苷酸接頭序列連接。將結(jié)構(gòu)基因插入到表達載體中，隨后導(dǎo)入宿主細胞例如大腸桿菌內(nèi)。重組宿主細胞合成單一多肽鏈，其具有接頭肽連接兩個V區(qū)。sFv的制備方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見Whitlow等，1991,Methods:ACompaniontoMetnodsinEnzymology2:97;Bird等，1988,Science,242:423;美國專利第4,946,778號；Pack等，1993,Bio/Technology,11:1271和Sandhu，1992,Cnt.Rev.Biotech.,12:437。另一形式的抗體片段是編碼單個互補決定區(qū)(CDR)的肽。通過構(gòu)建目標抗體CDR的編碼基因可以得到CDR肽("最小識別單元")。通過例如聚合酶鏈式反應(yīng)制備這類基因，再由產(chǎn)生抗體的細胞的RNA合成可變區(qū)。參見Larrick等，l"l,Methods:ACompaniontoMethodsinEnzymology2:106;Ritter等(編著)，1995,MONOCLONALANTIBODIES:PRODUCTION,ENGINEERINGANDCLINICALAPPLICATION,第166-179頁(CambridgeUniversityPress);Birch等(編著)，1995,MONOCLONALANTIBODIES:PRINCIPLESANDAPPLICATIONS,第137-185頁(Wiley畫Liss，Inc)。嵌合抗體和人源化抗體嵌合抗體是其中人抗體可變區(qū)已經(jīng)被例如小鼠抗體的可變區(qū)取代的重組蛋白，所述重組蛋白包含小鼠抗體的互補決定區(qū)(CDR)。當給予患者時，嵌合抗體表現(xiàn)出免疫原性降低，穩(wěn)定性增加。嵌合抗體的構(gòu)建方法是本領(lǐng)域眾所周知的(例如Leung等，I994,Hybndoma13:469)。可以使嵌合單克隆抗體人源化，即通過將來自小鼠免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的小鼠CDR轉(zhuǎn)移到人抗體相應(yīng)可變區(qū)。嵌合單克隆抗體中的小鼠構(gòu)架區(qū)(FR)也用人FR序列取代。為了保護人源化單克隆的穩(wěn)定性和抗原特異性，一種或多種人FR殘基可以用小鼠相應(yīng)殘基取代。人源化單克隆抗體可用于患者的治療性治療。通過選擇性修飾CDR序列也可提高人源化抗體對靶標的親和性(WO0029584Al)。產(chǎn)生人源化單克隆抗體的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。(參見例如Jones等，1986，Nature,321:522;Riechmann等，Nature,1988,332:323;Verhoeyen等，1988,Science,239:1534;Carter等，1992,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA,89:4285;Sandhu,Crit.Rev.Biotech.,1992,12:437;Tempest等，1991,Biotechnology9:266;Singer等，J.Immun.,1993,150:2844)。其它實施方案可涉及非人類靈長類抗體。在狒狒中產(chǎn)生治療上有用的抗體的通用技術(shù)可參見例如Goldenberg等，WO91/11465(簡)和Losman等，Int.丄Cancer46:310(1990)。在另一個實施方案中，抗體可以是人單克隆抗體。這類抗體得自轉(zhuǎn)基因小鼠，已對這些小鼠進行改造，以在響應(yīng)抗原性攻擊時產(chǎn)生特定人抗體。在該技術(shù)中，將人重鏈和輕鏈基因座元件導(dǎo)入源自胚胎干細胞系的小鼠品系中，該類胚胎干細胞系含有定向破壞的內(nèi)源重鏈和輕鏈基因座。轉(zhuǎn)基因小鼠可合成對人抗原具有特異性的人抗體，而且小鼠可用于產(chǎn)生分泌人抗體的雜交瘤。從轉(zhuǎn)基因小鼠獲得人抗體的方法參見Green等，NatureGenet.7:13(I994),Lonberg等，Nature368:856(1994)和Taylor等，Int.Immun.6:579(1994)。人抗體用組合方法或經(jīng)人免疫球蛋白基因座轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因動物來產(chǎn)生完整人抗體的方法是本領(lǐng)域已知的(例如Mancini等，2004,NewMicrobiol.27:315-28;Conrad和Scheller,2005,Comb.Chem.HighThroughputScreen.8:117隱26;Brekke和Loset,2003,Curr.Opm.Phamacol.3:544-50;所述各文獻通過引用結(jié)合到本文中)。與嵌合抗體或人源化抗體相比，這樣的完整人抗體有望表現(xiàn)出更少的副作用并且象內(nèi)源性人抗體一樣在體內(nèi)起作用。在某些實施方案中，要求在一個替代方案中，如上所述的噬菌體展示技術(shù)可用于產(chǎn)生人抗體(例如Dantas-Barbosa等，2005,Genet.Mol.Res.4:126-40，所述文獻通過引用結(jié)合到本文中)。人抗體可以由正常人或表現(xiàn)出特定疾病狀態(tài)例如癌癥的病人來產(chǎn)生(Dantas-Barbosa等，2005)。由患病個體來構(gòu)建人抗體的優(yōu)點是對于針對疾病相關(guān)抗原的抗體，循環(huán)抗體庫(repertoire)可以優(yōu)先。在該方法的一個非限制性實例中，Dantas-Barbosa等(2005)構(gòu)建了來自骨肉瘤患者的人Fab抗體片段的噬菌體展示文庫。一般來說，總RNA得自循環(huán)血淋巴細胞(出處同上)。從屮y和K鏈抗體庫克隆重組Fab庫，并將其插入噬菌體展示文庫(出處同上)。采用針對重鏈和輕鏈免疫球蛋白序列的特定引物，將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA并用于制備FabcDNA文庫(Marks等，1991,J.Mol.Biol.222:581-97,所述文獻通過引用結(jié)合到本文中)。按照以下文獻所述方法構(gòu)建文庫Andris-Widhopf等(2000,載于PhageDisplayLaboratoryManual,Barbas等(主編)，第1版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY第9.1-9.22頁，所述文獻通過引用結(jié)合到本文中)。最終Fab片段用限制性內(nèi)切核酸酶消化，插入到噬菌體基因組中，制備噬菌體展示文庫。這樣的文庫可以用如上所述的標準噬菌體展示方法來篩選。技術(shù)人員將會知道該技術(shù)僅僅是示例性的，任何通過噬菌體展示來制備和篩選人抗體或抗體片段的已知方法都可使用。在另一替代方案中，使用如上所述的標準免疫方案，經(jīng)基因工程改造以產(chǎn)生人抗體的轉(zhuǎn)基因動物可用于產(chǎn)生針對幾乎任何免疫原性靶標的抗體。這類系統(tǒng)的非限制性實例是來自Abgemx(Fremont,CA)的XenoMouse(例如Green等，1999,J.Immunol.Methods231:11-23,所述文獻通過引用結(jié)合到本文中)。在XenoMouse⑧和類似動物中，小鼠抗體基因已經(jīng)被鈍化并被功能性人抗體基因取代，而小鼠免疫系統(tǒng)的其余部分仍保留完整d用種系配置的YAC(酵母人工染色體)轉(zhuǎn)化XenoMouse,所述YAC含有部分人IgH和IgK基因座，包含大部分可變區(qū)序列，輔助基因和調(diào)節(jié)序列。人可變區(qū)庫可用于產(chǎn)生能產(chǎn)生抗體的B細胞，所述細胞可用已知技術(shù)加工成雜交瘤。用耙抗原免疫的XenoMouse⑧將由正常免疫應(yīng)答產(chǎn)生人抗體，可以收獲這類抗體和/或通過如上所述的標準技術(shù)來制備。XenoMouse⑧的各種品系都是可得的，它們每個都能產(chǎn)生不同類別的抗體。這類人抗體可以通過化學(xué)交聯(lián)或其它已知方法與其它分子偶聯(lián)。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的人抗體已經(jīng)顯示出具有治療潛力，同時又保留正常人抗體的藥代動力學(xué)特性(Green等，1999)。技術(shù)人員將會知道，要求保護的組合物和方法不限于使用XenoMouse系統(tǒng)，也可使用經(jīng)基因工程改造以產(chǎn)生人抗體的任何轉(zhuǎn)基因動物。用于克隆、基因轉(zhuǎn)移和表達的栽體在某些實施方案中，可以使用表達載體來表達肽或蛋白質(zhì)，例如融合蛋白，然后再對其進行純化和使用。表達需要的合適信號是由載體提供的，包括各種調(diào)節(jié)元件，例如來自病毒或哺乳動物來源的增強子/啟動子，它們驅(qū)動目標基因在宿主細胞中表達。也已知道設(shè)計用于優(yōu)化信使RNA在宿主細胞中的穩(wěn)定性和可翻譯性的元件。調(diào)節(jié)元件術(shù)語"表達構(gòu)建體"或"表達載體"是指包括含有基因產(chǎn)物編碼核酸的任何類型的遺傳構(gòu)建體，其中部分或全部核酸編碼序列能夠被轉(zhuǎn)錄。在優(yōu)選的實施方案中，編碼基因產(chǎn)物的核酸處于啟動子的轉(zhuǎn)錄控制之下。"啟動子"是指由這樣的DNA序列所述DNA序列是由細胞合成機器識別的、或?qū)牒铣蓹C器中的，所述DNA序列是啟動基因的特異性轉(zhuǎn)錄所必需的。術(shù)語"處于轉(zhuǎn)錄控制之下"是指啟動子相對于核酸來說處于正確位置和方向，以控制RNA聚合酶啟動和基因表達。用于控制目標核酸序列表達的特定啟動子并不認為是重要的，只要它能指導(dǎo)核酸在中靶細胞中的表達。因此當靶向人體細胞時，優(yōu)選將核酸編碼區(qū)放置在啟動子附近并處于啟動子控制之下，使其能在人體細胞中表達。一般來說，這類啟動子可包括人或病毒啟動子。在不同實施方案中，人巨細胞病毒(CMV)即時早期基因啟動子、SV40早期啟動子、勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)序列、大鼠胰島素啟動子和甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子，都可用于得到目標編碼序列的高水平表達。也包括使用本領(lǐng)域熟知的其它病毒啟動子或哺乳動物細胞啟動子或噬菌體啟動子，以達到目標編碼序列的表達，只要表達水平足以滿足預(yù)定目的。當使用cDNA插入序列時，通常包含聚腺苷酸化信號，以引起基因轉(zhuǎn)錄物的適當聚腺苷酸化。對于本發(fā)明的成功實施來說，并不認為聚腺普酸化信號的特性是關(guān)鍵性的，任何這類序列都可使用，例如人生長激素和SV40聚腺苷酸化信號。也考慮到表達構(gòu)建體元件是終止子。這些元件可起到增加信使水平并減少從構(gòu)建體到其它序列的閱讀的作用。選捧標記在某些實施方案中，可通過在表達構(gòu)建體中包含標記，在體外或體內(nèi)鑒定含有核酸構(gòu)建體的細胞。這類標記賦予細胞可鑒定的變化，便于容易鑒定含有表達構(gòu)建體的細胞。通常包含的藥物選擇標記目的在于克隆和轉(zhuǎn)化子的選擇。例如，賦予以下藥物抗性的基因是有用的選^i奪標記新霉素、嘌羅霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素(zeocin)和組氨醇。或者，可以使用酶，例如單純皰滲病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。也可使用免疫學(xué)標記。并不認為所用的選擇標記是重要的，只要它能與編碼基因產(chǎn)物的核酸同所引用的所有參考文獻，包括專利和專利申請，全都通過引用結(jié)合到本文中。實施例提供以下實施例，用于說明而非限制要求保護的本發(fā)明。由3個Fab亞基組成的非共價a2b復(fù)合物的制備方法實施例1.產(chǎn)生模塊Fab亞基的通用策略產(chǎn)生了融合蛋白形式的Fab模塊，其中含有DDD或AD序列。對每種Fab融合蛋白都開發(fā)了獨立的轉(zhuǎn)基因細胞系。模塊一旦產(chǎn)生后，如有必要可以純化模塊，或者保留在細胞培養(yǎng)上清液中。任何(Fab-DDD)2模塊在產(chǎn)生出來之后，都可與任何Fab-AD模塊結(jié)合產(chǎn)生雙特異性三價Fab(bsTF)。質(zhì)粒載體pdHL2已用于產(chǎn)生各種抗體和基于抗體的構(gòu)建體。參見Gillies等，JImmunolMethods(1989)，125:191-202;Losman等，Cancer(Phila)(l997),80:2660_6。雙順反子哺乳動物表達載體指導(dǎo)IgG重鏈和輕鏈的合成。對于許多不同IgG-pdHL2構(gòu)建體來說，載體序列大部分都相同，僅在可變區(qū)(VH和VJ序列中存在差異。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分子生物學(xué)工具，可將這些IgG表達載體轉(zhuǎn)化成Fab-DDD或Fab-AD表達載體。為了產(chǎn)生Fab-DDD表達載體，將重鏈的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的編碼序列，用編碼鉸鏈的前4個殘基、14個殘基的Gly-Ser接頭和人RIIa前44個殘基的序列取代(稱為DDD1,圖1)。為了產(chǎn)生Fab-AD表達載體，將IgG的鉸鏈、CH2和CH3區(qū)的序列，用編碼鉸鏈的前4個殘基、15個殘基的Gly-Ser接頭和17殘基合成AD(稱為^^-/》的序列取代(稱為AD1,圖2),所述序列用生物信息學(xué)和肽陣列技術(shù)來產(chǎn)生，并表現(xiàn)出以很高的親和力與RIIoc二聚體結(jié)合(0.4nM)。參見Alto等，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.(2003),100:4445-50。設(shè)計了兩個穿梭載體，以便將如上所述的IgG-pdHL2載體轉(zhuǎn)化成Fab-DDD1或Fab-AD1表達載體。CH1的制備通過PCR擴增CH1區(qū)，用pdHL2質(zhì)粒載體作為模板。PCR左引物由CH1區(qū)上游(5')和SacII限制性內(nèi)切核酸酶位點組成，它是CH1編碼序列的5'。右引物由編碼鉸鏈的前4個殘基的序列(PKSC)、接著是GGGGS以及包含BamHI限制位點的最后兩個密碼子(GS)組成。CH1左引物的5'5，gaacctcgcggacagttaag-3，(seqIDn0:5)CHI+G4S-Bam右5，ggatcctccgccgccgcagctcttaggtti;cttgtccaccttggtgttgctgg-3，(seqidno:6)將410bpPCR擴增產(chǎn)物克隆到pGemTPCR克隆載體(Promega,Inc.)中，篩選以T7(5')方向插入的克隆。(G4S)2DDD1的構(gòu)建由SigmaGenosys(Haverhill,UK)合成雙《連體寡核苷酸(稱為(G4S)2DDD1)以編碼DDD1的氨基酸序列，DDD1之前是接頭肽的11個殘基，其中包含BamHI限制位點的前兩個密碼子。終止密碼子和Eagl限制位點附加在3'端。所編碼的多肽序列如下所示。GSGGGGSGGGGSHIOIPPGLTELLOGYTVEVLROOPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQIDNO:7)合成了兩個寡核苷酸(稱為RIIA1-44上鏈和RIIA1-44下鏈)，在其3'端有30堿基對的重疊(SigmaGenosys),結(jié)合以包含174bpDDD1序列的中間154石成基對。將寡核苷酸退火，用Taq聚合酶進行引物延伸反應(yīng)。RIIA1-44上鏈5,GTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCAGGGCTACACGGTGGAGGTGCTGCGACAG-3，(SEQIDNO:8)RIIA1-44下鏈AGGCGGCTGCTGTCGCAGCACCTCCACCGTGTAGCCCTG-3'(SEQ1DNO:9)引物延伸后，通過PCR擴增雙鏈體，使用以下引物G4SBam-左5'陽GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3，(SEQIDNO:IO)1-44stopEag右5'-CGGCCGTCAAGCGCGAGCTTCTCTCAGGCG-3'(SEQIDNO:11)將該擴增產(chǎn)物克隆到pGemT中，篩選以T7("方向插入的克隆。(G4S)2-AD1的構(gòu)建合成了雙鏈體寡核苷酸(稱為(G4SVAD1)(SigmaGenosys)以編碼AD1的氨基酸序列，AD1之前是接頭肽的11個殘基，其中包含BamHI限制位點的前兩個密碼子。終止密碼子和Eagl限制位點附加在3'端。所編碼的多肽序列如下所示。GSGGGGSGGGGSOIEYLAKOrVDNAIOOA(SEQIDNO:12)合成兩個互補重疊寡核苷酸(稱為AKAP-IS上鏈和AKAP-IS下鏈)。AKAP-IS上鏈5'GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGTGGCAGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCTGACGGCCG-3'(SEQIDNO:13)AKAP-IS下鏈GATCTGGCTGCCACCTCCGCCAGACCCGCCACCTCCGGATCC-3，(SEQIDNO:14)通過PCR擴增雙鏈體，使用以下引物G4SBam-左5，-GGATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGAGGT-3，(SEQIDNO:15)AKAP-ISstopEag右5，-CGGCCGTCAGGCCTGCTGGATG-3，(SEQIDNO:16)將該擴增產(chǎn)物克隆到pGemT載體中，篩選以T7("方向插入的克隆。將DDD1與CHI連接用BamHI和Notl限制酶從pGemT上切下編碼DDD1序列的190bp片段，與CHl-pGemT上的相同位點連接，產(chǎn)生穿梭載體CHl-DDDl匿pGemT。將ADl與CHI連接用BamHI和Notl限制酶從pGemT上切下含有ADl序列的110bp片段，與CHl-pGemT上的相同位點連接，產(chǎn)生穿梭載體CHl-ADl漏pGemT。將CH1-DDD1或CH1-AD1克隆到基于pdHL2的載體中使用該模塊設(shè)計，將CH1-DDD1或CH1-AD1摻入到pdHL2載體的任何IgG構(gòu)建體中。完整重鏈恒定區(qū)用以上一個構(gòu)建體取代，即通過從pdHL2上除去SacII/Eagl限制片段(CH1-CH3)并將其用CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/Eagl片段取代，所述CH1-DDD1或CH1-AD1的SacII/Eagl片段是從相應(yīng)pGemT穿梭載體上切割下來的。N端DDD結(jié)構(gòu)域DDD或AD的位置不限于CH1的羧基端。構(gòu)建體經(jīng)改造，其中DDD1序列連接在VH區(qū)的氨基端。實施例2:表達栽體h679-Fd-ADl-pdHL2的構(gòu)建1]679-Fd-ADl-pdHL2是一種產(chǎn)生h679Fab的表達載體，其中AD1通過由14個氨基酸殘基組成的柔性Gly/Ser肽間隔區(qū)與FdCH1區(qū)羧基端連接。通過用CH1-AD1片段取代SacII/Eagl片段，將含有h679可變區(qū)的基于pdHL2的栽體轉(zhuǎn)化成h679-Fd-ADl-pdHL2，所述CH1-AD1是用SacII和Eagl從CH1-AD1-SV3穿梭載體上切割下來的。C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2的構(gòu)建C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2是一種產(chǎn)生穩(wěn)定二聚體的表達載體，其包含兩個拷貝的融合蛋白C-DDDl-Fab-hMN-14,其中DDD1在CH1的羧基端通過柔性肽間隔區(qū)與hMN-14Fab連接。通過用SacII和Eagl限制性內(nèi)切核酸酶消化以除去CH1-CH3區(qū)并插入CH1-DDD1片段，將已用于產(chǎn)生hMN-14IgG的質(zhì)粒載體hMN14(I)-pdHL2，轉(zhuǎn)化成C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2，所述CH1-DDD1片段是用SacII和Eagl從CHl-DDDl-SV3穿梭載體上切割下來的。N腸DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2的構(gòu)建[OMO]N-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2是一種產(chǎn)生穩(wěn)定二聚體的表達載體，其包含兩個拷貝的融合蛋白N-DDDl-Fab-hMN-14,其中DDD1在VH的氨基端通過柔性肽間隔區(qū)與hMN-14Fab連接。如下所示進行表達載體的改造。通過PCR擴增DDD1區(qū)，用如下所示的兩個引物。DDDl-Nco左5，CCATGGGCAGCCACATCCAGATCCCGCC-3，(SEQIDNO:17)DDDl-G4SBam右G-3'(SEQIDNO:18)作為PCR的結(jié)果，將Ncol限制位點和含有BamHI限制位點的部分接頭(G4S)2的編碼序列分別附加在5'和3'端。將170bpPCR擴增產(chǎn)物克隆到pGemT載體中，篩選以T7(5')方向插入的克隆。用Ncol和Sail限制酶從pGemT載體上切下194bp插入片段并克隆到SV3穿梭載體中，所述載體已用同樣的酶消化而制備，產(chǎn)生中間栽體DDD1-SV3。通過PCR,使用如下所示的寡核苷酸引物，擴增hMN-14Fd序列。hMN-14VH左G4SBam5，-GGATCCGGCGGAGGTGGCTCTGAGGTCCAACTGGTGGAGAGCGG-3'(SEQIDNO:19)CH1-CstopEag5，-CGGCCGTCAGCAGCTCTTAGGTTTCTTGTC-3，(SEQIDNO:20)作為PCR的結(jié)果，將BamHI限制位點和部分接頭(G4S)的編碼序列附加在擴增產(chǎn)物的5'端。將終止密碼子和Eagl限制位點附加在3'端。將1043bp擴增產(chǎn)物克隆到pGemT中。用BamHI和Eagl限制酶從pGemT上切下hMN-14-Fd插入片段并與DDD1-SV3載體連接，所述載體已用同樣的酶消化制備，產(chǎn)生構(gòu)建體N-DDDl-hMN-14Fd畫SV3。用Xhol和Eagl限制酶切割N-DDDl-hMN-14Fd序列，將1.28kb插入片段與載體片段連接，所述載體片段是用同樣的酶消化C-hMN-14-pdHL2而制備的。最終的表達載體是N-DDDl-Fd-hMN-14-pDHL2。實施例3.h679-Fab-ADl的制備和純化用SalI限制性內(nèi)切核酸酶消化，使h679-Fd-ADl-pdHL2載體線性化，然后通過電穿孔轉(zhuǎn)染到Sp/EEE骨髓瘤細胞中。該雙順反子表達載體指導(dǎo)h679K輕鏈和h679Fd-AD1的合成和分泌，它們結(jié)合形成h679Fab-AD1。電穿孔后，將細胞接種在96孔組織培養(yǎng)板上，用0.05甲氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)染子克隆。通過ELISA,使用包被BSA-IMP-260(HSG)綴合物的微量滴定板，篩選克隆的蛋白質(zhì)表達，并用HRP-綴合的山羊抗人Fab進行檢測。通過測定注射稀釋培養(yǎng)基樣品所得的起始斜率，將用HSG(IMP-"9)傳感器芯片的BIAcore分析用于測定生產(chǎn)率。最高產(chǎn)量的克隆的起始生產(chǎn)率約為30mg/L。經(jīng)一步IMP-291親和色譜，總共從4.5升滾瓶培養(yǎng)物中純化出230mgh679-Fab-ADl。通過超濾將培養(yǎng)基濃縮約10倍，然后上樣到IMP-291-affigel柱上。用PBS洗滌柱子到基線，用1M咪唑、1mMEDTA、0.1MNaAc(pH4.5)洗脫出h679-Fab-ADl。對洗出液進行SE-HPLC分析顯示，保留時間為9.63min的單個尖峰與50kDa蛋白質(zhì)一致。經(jīng)還原型SDS-PAGE分析證明，僅有兩個條帶代表h679-ADl的多肽組分。實施例4.N-DDDl-Fab-hMN-14和C-DDDl-Fab-hMN-14的制備和純化通過電穿孔，將C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2和N-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2載體轉(zhuǎn)染到Sp2/0衍生的骨髓瘤細胞中。C-DDDl-Fd-hMN-14-pdHL2是雙順反子表達載體，指導(dǎo)hMN-14K輕鏈和hMN-14Fd-DDD1的合成和分泌，它們結(jié)合形成C-DDDl-hMN-14Fab。N-DDDl-hMN-14-pdHL2是雙順反子表達載體，指導(dǎo)hMN-14K輕鏈和N-DDDl-Fd-hMN-14的合成和分泌，它們結(jié)合形成N-DDDl-Fab-hMN-14。每種融合蛋白通過DDD1結(jié)構(gòu)域相互作用形成穩(wěn)定的同型二聚體。電穿孔后，將細胞接種在96孔組織培養(yǎng)板上，用0.05曱氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)染子克隆。通過ELISA,使用包被WI2(針對hMN-14的大鼠抗id單克隆抗體)的微量滴定板，篩選克隆的蛋白質(zhì)表達，并用HRP-綴合的山羊抗人Fab進行檢測。C-DDDl-Fab-hMN14Fab和N-DDDl-Fab-hMN14Fab克隆最高產(chǎn)量的克隆的起始生產(chǎn)率分別為60mg/L和6mg/L。用AD1-Affigel對N-DDDl-hMN-14和C-DDDl-hMN-14進^f亍親和純化。DDD/AD相互作用用于親和純化含有DDDl的構(gòu)建體。ADl-C是經(jīng)合成制備的肽，由AEM序列和羧基端半胱氨酸殘基組成(參見實施例6)，用于在巰基與氯乙酸酐反應(yīng)之后將肽與Affigel偶聯(lián)。含有DDD的32結(jié)構(gòu)在中性pH時與AD1-C-Affigel樹脂特異性結(jié)合，而在低pH(例如pHl"時可被洗脫。經(jīng)一步AD1-C親和色譜，總共從1.2升滾瓶培養(yǎng)物中純化出81mgC-DDDl-Fab-hMN-14。通過超濾將培養(yǎng)基濃縮約10倍，然后上樣到ADl-C-affigel柱上。用PBS洗滌柱子到基線，用0.1M甘氨酸(pH2.5)洗脫出C-DDDl-Fab-hMN-14。對洗出液進行SE-HPLC分析顯示，保留時間為8.7mm的單個蛋白質(zhì)峰與107kDa蛋白質(zhì)一致。經(jīng)還原型SDS-PAGE也證實了其純度，表明在分子大小上僅有兩個條帶預(yù)期代表C-DDDl-Fab-hMN-14的兩種多肽組分。經(jīng)如上所述的一步ADl-C親和色i普，總共從1.2升滾瓶培養(yǎng)物中純化出10mgN-DDDl-hMN-14。對洗出液進行SE-HPLC分析顯示，保留時間為8.77mm的單個蛋白質(zhì)峰類似于C-DDD1-Fab-hMN-14,與107kDa蛋白質(zhì)一致。還原型SDS-PAGE顯示僅兩個條帶代表N-DDDl-Fab-hMN-14的多肽組成。通過SE-HPLC分析，測定樣品中C-DDDl-Fab-hMN-14的結(jié)合活性，其中將試驗品與不同數(shù)量的WI2混合。將WI2Fab與C-DDDl-Fab-hMN-14按照O.":l的摩爾比混合，制備樣品，顯示3個峰，代表未結(jié)合C-DDDl-Fab-hMN14(8.71min)、與一個WI2Fab結(jié)合的C-DDDl-Fab-hMN-14(7.95min)和與兩個WI2Fab結(jié)合的C-DDDl-Fab-hMN14(7.37min)。當分析含有WI2Fab和C-DDDl-Fab-hMN-14的摩爾比為4的樣品時，僅見一個峰(7.36分鐘)。這些結(jié)果證明hMN14-Fab-DDDl是二聚體，具有兩個活性結(jié)合位點。當該實驗用N-DDDl-Fab-hMN-14重復(fù)時，得到非常類似的結(jié)果。竟爭性ELISA證明C-DDDl-Fab-hMN-14和N-DDDl-Fab-hMN-14與CEA結(jié)合的親合力類似于hMN-14IgG,顯著大于單價hMN-14Fab。ELISA板用含有CEA表位(A3B3)的融合蛋白包被，h.MN-14對該表位具有特異性。實施例5.a2b復(fù)合物的形成對含有等摩爾量的C-DDDl-Fab-hMN-14(作為a。和h679-Fab-ADl(作為b)的混合物進行SE-HPLC分析，首次提供了a2b復(fù)合物形成的證據(jù)。當分析這種樣品時，可見單個峰(保留時間8.40分鐘)，這與新蛋白的形成是一致的，大于單獨的h679-Fab-ADl(9.55mm)或C-DDDl-Fab-hMN-14(8.73min)。當h顧-14F(ab')2與h679-Fab-AD1或C-DDDl-Fab-hMN-14與679-Fab-NEM混合時，沒有觀察到高磁場位移(upfieldshift),證明相互作用是通過DDD1和AD1結(jié)構(gòu)域特異性介導(dǎo)的。用h679-Fab-ADl和N-DDDl-Fab-hMN-14得到非常類似的結(jié)果。BIAcore用于進一步證明和表征DDl與AD1融合蛋白間特異性相互作用。該實驗進行如下首先讓h679-Fab-ADl或679-Fab-NEM與高密度的偶聯(lián)HSG的(IMP239)傳感器芯片表面結(jié)合，然后再注射C-DDDl-Fab-hMN-14或hMN-14F(ab')2。不出所料，僅h679-Fab-ADl和C-DDDl-Fab-hMN-14的組合，在響應(yīng)單元中產(chǎn)生進一步增加(當注射后者時)。用N-DDDl-Fab-hMN-14和h679-Fab-AD1得到類似結(jié)果。進行平衡SE-HPLC實驗，確定相應(yīng)融合蛋白中存在的AD1與DDD1間特異性相互作用的結(jié)合親和性。h679-Fab-ADl與C-DDDl-Fab-hMN-14、N-DDDl-hMN-14和重組人RIIot市售樣品結(jié)合的解離常數(shù)(Kd)分別為15nM、8nM和30nM。其它相關(guān)方法實施例6.Di-AD1的產(chǎn)生在本實施例中，經(jīng)合成制備具有如下所示氨基酸序列的小多肽(AD1-C)。艦2-K0IEYLAK0IVDNAI00AKGC-C00HfSE0IDNO:29)在AD1-C中,AD1氨基酸序列(加下劃線部分)鄰接N-端賴氨酸殘基和羧基端KGC三肽。為了增加溶解度而引入兩個賴氨酸(K)殘基，為了增加柔性而將甘氨酸(G)殘基插入在C端半胱氨酸之前。用DMSO處理后，AD1-C氧化成為二聚體，稱為Di-AD1，用RP-HPLC純化。Di-AD1的示意結(jié)構(gòu)如下所示(=表示二硫橋)NH2-KOIEYLAKOIVDNAIOOAKGOCGKAOOIANDVIOKALYEIOK-Nm(S￡QIDNO:21)Di-AD1或AD1-C中存在大量官能團，可用于進一步修飾。例如，Di-AD1和AD1-C分別含有8個和4個伯氨基，可用于偶聯(lián)藥物、毒素、蛋白質(zhì)或其它效應(yīng)物。此外，Di-AD1和AD卜C分別具有2個和1個酪氨酸殘基，可用于放射性碘化。最終，AD1-C含有游離半胱氨酸殘基，也可用于偶聯(lián)效應(yīng)物或形成含有效應(yīng)物的Di-AD1類似物。實施例7.新的預(yù)靶向方法本發(fā)明的方法適用于新的預(yù)靶向方法。以下提供了預(yù)耙向系統(tǒng)的實例，它們采用親和力增強系統(tǒng)(LeDo畫l等，JNuclMed(1989),30:1358-66)而無須半抗原結(jié)合抗體。C-DDD1-Fab-hMN-14或N-Fab-DDD2-hMN-14的二聚體(按照實施例4而制備)可用于預(yù)靶向腫瘤。先將107kDa蛋白經(jīng)靜脈內(nèi)給予患者，讓其與腫瘤上的CEA結(jié)合，同時從血和正常組織中清除掉。稍后，經(jīng)靜脈內(nèi)給予二價肽，例如攜帶治療用放射性同位素(例如9°Y)或診斷用放射性同位素(例如"'In)的Di-AD1的DOTA綴合物。小肽(~5000Da)，在從血和正常組織中快速清除的同時，定位在腫瘤上，因為它含有預(yù)期與C-DDD1-Fab-hMN-14特異性相互作用的兩個AD序列，所述C-DDD1-Fab-hMN-14已由肺瘤保留。經(jīng)SE-HPLC證明C-DDD1-Fab-hMN-14與Di-AD1在體外交聯(lián)。當C-DDD1-Fab-hMN-14與Di-AD1混合時，蛋白質(zhì)峰從8.67min變?yōu)?.95min，表明形成了交聯(lián)結(jié)構(gòu)。當hMN-14F(ab')2與Di-AD1混合時則沒有這樣的變化，證明交聯(lián)是由DDD1與AD1間的相互作用所介導(dǎo)。為了證實峰的改變事實上是因為C-DDD1-Fab-hMN-14的特異性交聯(lián)，用DTT還原復(fù)合物以切割Di-AD1的二硫鍵，導(dǎo)致峰又變回8.67min。實施例8.DDD或AD融合蛋白的親和純化通過產(chǎn)生DDD或AD蛋白，可開發(fā)通用親和純化系統(tǒng)，其具有更低親和力?？?。與RIIa相比，由RIa二聚體形成的DDD與AKAP-IS(AD1)的親和力要低500倍(225nM)。因此，可以產(chǎn)生由前44個氨基酸殘基形成的RIa二聚體，并與樹脂偶聯(lián)以制備具有吸引力的親和基質(zhì)，用于任何含有AD1的融合蛋白的純化。自然界存在許多更低親和力(O.lpM)AKAP錨定結(jié)構(gòu)域。必要時，可引入高度可預(yù)測的氨基酸取代，進一步降低結(jié)合親和性。可以通過合成或生物學(xué)方法產(chǎn)生低親和力AD,并與樹脂偶聯(lián)，用于任何DDD1融合蛋白的親和純化。制備穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的相關(guān)方法實施例9.產(chǎn)生由三個Fab片段組成的二硫化物穩(wěn)定化結(jié)構(gòu)的載體N畫DDD2國Fd畫hMN-14畫pdHL2N-DDD2-hMN-14-pdHL2是一種產(chǎn)生N-DDD2-Fab-hMN-14的表達載體，具有DDD2的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域序列，其中DDD2附加在Fd的氨基端(圖4A)。DDD2通過15個氨基酸殘基Gly/Ser肽接頭與VH區(qū)偶聯(lián)。DDD2在二聚化和?？啃蛄兄熬哂幸粋€半胱氨酸殘基，這與DDD1相同。所分泌的融合蛋白由兩個相同拷貝的hMN-14Fab通過DDD2結(jié)構(gòu)域的非共價相互作用連接在一起(圖4B)。如下所述對表達載體進行改造。合成制備兩個重疊互補寡核苷酸(DDD2上鏈(DDD2T叩)和DDD2下《il(DDD2Bottom)),其包含DDD2的殘基1-13。將寡核苷酸退火，用T4多核苷酸激酶(PNK)磷酸化，導(dǎo)致在5'和3'端產(chǎn)生突出端(overhang)，這適于分別用限制性內(nèi)切核酸酶Ncol和Pstl進行DNA消化后的連接。DDD2上鏈5'CATGTGCGGCCACATCCAGATCCCGCCGGGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3'(SEQIDNO:22)DDD2下鏈5，GCAGCTCCGTGAGCCCCGGCGGGATCTGGATGTGGCCGCA-3'(SEC)IDNO:23)將雙鏈體DNA與載體片段DDDl-hMN14Fd-SV3連接起來(后者是用Ncol和Pstl消化而制備的)，產(chǎn)生中間構(gòu)建體DDD2-hMN14Fd-SV3。用Xhol和Eagl限制性內(nèi)切核酸酶，從中間構(gòu)建體上切下含有DDD2-hMN14Fd編碼序列的1.28kb插入片段，與用相同的酶消化而制備的hMN14-pdHL2載體DNA連接在一起。最終的表達載體是N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2(圖5)。C畫DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2是一種產(chǎn)生C-DDD2-Fab-hMN-14的表達載體，具有DDD2的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域序列，其中DDD2通過14個氨基酸殘基Gly/Ser肽接頭附加在Fd的羧基端(圖6A)。所分泌的融合蛋白由兩個相同拷貝的hMN-14Fab通過DDD2結(jié)構(gòu)域的非共價相互作用連接在一起(圖6B)。如下所述對表達載體進行改造。合成制備兩個重疊互補殘基1-13。將寡核苷酸退火，用T4PNK磷酸化，導(dǎo)致在5'和3'端產(chǎn)生突出端，這適于分別用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI和Pstl進行DNA消化后的連接。G4S-DDD2上鏈GGGCTCACGGAGCTGCTGCA-3'(SEQIDNO:24)G4S陽DDD2下鏈CCGCCACCTCCG-3，(SEQIDNO:25)將雙鏈體DNA與穿梭載體CHl-DDDl-pGemT連接起來(后者是用BamHI和Pstl消化而制備的)，產(chǎn)生穿梭載體CH1-DDD2-pGemT。用SacII和Eagl從CHl-DDD2-pGemT上切下507bp片段，與用SacII和Eagl消化而制備的IgG表達載體hMN14(I)-pdHL2連接在一起。最終的表達構(gòu)建體是C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2(圖7)。h679國Fd-AD2-pdHL2設(shè)計了h679-Fab-AD2作為B與N-DDD2-Fab-hMN-14或C畫DDD2-Fab-hMN-14配對。h679-Fd-AD2-pdHL2是一種產(chǎn)生h679-Fab-AD2的表達載體，具有AD2錨定結(jié)構(gòu)域序列，其中AD2通過14個氨基酸殘基Gly/Ser肽接頭附加在CH1區(qū)的羧基端(圖8)。AD2具有兩個半胱氨酸殘基，其中一個在AD1錨定結(jié)構(gòu)域序列之前，而另一個在AD1錨定結(jié)構(gòu)域序列之后。如下所述對表達載體進行改造。合成制備兩個重疊互補寡核苷酸(AD2上鏈和AD2下鏈)，其包含AD2的編碼序列和部分接頭序列。將寡核苷酸退火，用T4PNK磷酸化，導(dǎo)致在5'和3'端產(chǎn)生突出端，這適于分別用限制性內(nèi)切核酸酶BamHI和Spel進行DNA消化后的連接。AD2上鏈5'GATCCGGAGGTGGCGGGTCTGGCGGATGTGGCCAGATCGAGTACCTGGCCAAGCAGATCGTGGACAACGCCATCCAGCAGGCCGGCTGCTGAA-3'(SEQIDNO:26)AD2下鏈CGATCTGGCCACATCCGCCAGACCCGCCACCTCCG-3，(SEQIDNO:27)將雙鏈體DNA與穿梭載體CHl-ADl-pGemT連接起來(后者是用BamHI和Spel消化而制備的)，產(chǎn)生穿梭載體CHI-AD2-pGemT。用SacII和Eagl從穿梭質(zhì)粒上切下含有CH1和AD2編碼序列的429堿基對片段，與用相同酶消化而制備的h679-pdHL2載體連接在一起。最終的表達載體是h679-Fd-AD2-pdHL2(圖9)。實施例10.h679-Fab-AD2的產(chǎn)生通過電穿孔，將h679-Fd-AD2-pdHL2載體轉(zhuǎn)染到Sp/EEE骨髓瘤細胞中。該雙順反子表達載體指導(dǎo)h679K輕鏈和h679Fd-AD2的合成和分泌，兩者結(jié)合形成h679-Fab-AD2。在AD兩端的半胱氨酸殘基提供兩個潛在的反應(yīng)性巰基。電穿孔后，將細胞接種在96孔組織培養(yǎng)板上，用0.05pM甲氨蝶呤(MTX)選擇轉(zhuǎn)染子克隆。通過ELISA，使用包被BSA-IMP-260(HSG)綴合物的微量滴定板，篩選克隆的蛋白質(zhì)表達，并用山羊抗人Fab-HRP進行檢測。通過測定注射稀釋培養(yǎng)基樣品所得的起始斜率，將用HSG(IMP-239)傳感器芯片的BIAcore分析用于測定生產(chǎn)率。最高產(chǎn)量的克隆的起始生產(chǎn)率約50mg/L。經(jīng)一步IMP-291親和色譜，總共從2.9升滾瓶培養(yǎng)物中純化出160mgh679-Fab-AD2。通過超濾將培養(yǎng)基濃縮約10倍，然后上樣到IMP-29卜affigel柱上。用PBS洗滌柱子到基線，用1M咪唑、1mMEDTA、0.1MNaAc(pH4.5)洗脫出h679-AD2。SE-HPLC分析顯示，保留時間約為10min的單尖峰與50kDa蛋白質(zhì)一致(圖10)。當該物質(zhì)與hMN14-Fab-DDDl混合時，僅I/3具有反應(yīng)性，因為在SE-HPLC圖譜上明顯可見由二元復(fù)合物產(chǎn)生的一個新峰。然而，用TCEP還原h(huán)679-Fab-AD2，可得到100%活性。這表明(l)AD2的兩個半胱氨酸殘基間可形成分子內(nèi)二硫鍵(圖IIA)，阻止了與DDD的結(jié)合但也保護了巰基不與其他物質(zhì)反應(yīng)；和(2)還原反應(yīng)可打斷該分子內(nèi)二硫橋，產(chǎn)生帶有兩個游離巰基的DDD-反應(yīng)性錨定結(jié)構(gòu)域(圖IIB)。通過電穿孔，將N-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2載體轉(zhuǎn)染到Sp/EEE骨髓瘤細胞中。該雙順反子表達載體指導(dǎo)hMN-14K輕鏈和N-DDD2-hMN-14Fd的合成和分泌，二者結(jié)合形成N-DDD2-hMN14Fab。通過DDD2可以預(yù)期經(jīng)二聚化形成八2結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生由每個DDD2中的半胱氨酸殘基提供的兩個潛在的反應(yīng)性巰基。電穿孔后，將細胞接種到96孔組織培養(yǎng)板中，用0.05nM曱氨蝶呤(MTX)篩選轉(zhuǎn)染子克隆。通過ELISA,使用包被WI2(hMN-14抗Id)的微量滴定板，篩選克隆的蛋白質(zhì)表達，并用山羊抗人Fab-HRP進行檢測。最高產(chǎn)量的克隆的起始生產(chǎn)率約10mg/L。通過蛋白L親和色譜，總共從1.8升滾瓶培養(yǎng)物中純化出16mgN-DDD2-hMN-14。通過超濾將培養(yǎng)基濃縮約10倍，然后上樣到蛋白L親和色i普柱上。用PBS洗滌柱子到基線，用1mMEDTA、0.1MNaAc(pH2.5)洗脫出N-DDD2-hMN14,然后立即用Tris-HCl中和。SE-HPLC分析顯示4個蛋白質(zhì)峰(圖12),其中2個隨后被鑒定為N-DDD2-Fab-hMN-14的34形式(7.9min)和32形式(8.8mm),另兩個分別是K鏈的二聚體和單體。該混合物顯示出對h679-Fab-ADl幾乎沒有結(jié)合活性，除非加入巰基還原劑(例如TCEP)，將大部分的34形式轉(zhuǎn)變?yōu)?2形式(圖13)。這些數(shù)據(jù)表明(l)通過DDD2中存在的半胱氨酸連接兩個a2結(jié)構(gòu)而形成a4，從而阻止與AD的締合但也保護了巰基不與其它物質(zhì)反應(yīng)(圖14A);和(2)還原反應(yīng)可打斷該分子內(nèi)二硫橋，產(chǎn)生帶有兩個游離巰基的AD-反應(yīng)性DDD二聚體的32結(jié)構(gòu)(圖14B)。注意這一副產(chǎn)物(a,)由四個活性Fab亞基組成。即使在高TCEP濃度和長反應(yīng)時間時，約15%的總N-DDD2-Fab-hMN-14仍在還原后保持八4形式(圖13)。這表明，除了二碌u橋外，還有其它才幾制例如結(jié)構(gòu)域交換(domainsw叩ping)也可導(dǎo)致34形式的形成。實施例12.C-DDD2-Fab-hMN-14的制備通過電穿孔，將C-DDD2-Fd-hMN-14-pdHL2載體轉(zhuǎn)染到Sp/EEE骨髓瘤細胞中。該雙順反子表達載體指導(dǎo)hMN-14K輕鏈和C-DDD2-Fd-hMN-14的合成和分泌，二者結(jié)合形成C-DDD2-Fab-hMN14。象N-DDD2-Fab-hMN-14—樣，通過DDD2可以預(yù)期經(jīng)二聚化形成32結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生由每個DDD2中的半胱氨酸殘基提供的兩個潛在的反應(yīng)性巰基。電穿孔后，將細胞接種到96孔組織培養(yǎng)板中，用0.05曱氨蝶呤(MTX)篩選轉(zhuǎn)染子克隆。通過ELISA，使用包被WI2(固N-14抗Id)的微量滴定板，篩選克隆的蛋白質(zhì)表達，并用山羊抗人Fab-HRP進行檢測。最高產(chǎn)量的克隆的起始生產(chǎn)率約為100mg/L,這比N-DDD2-Fab-hMN-14高出10倍。按照實施例3所述，通過蛋白L親和色語，總共從1.8升滾瓶培養(yǎng)物中純化出200mgC-DDD2-hMN-14。蛋白L-純化的C-DDD2-Fab-hMN-14的SE-HPLC分布圖(圖15)類似于N-DDD2-Fab-hMN-14。4個蛋白質(zhì)峰中有兩個經(jīng)鑒定為C-DDD2-Fab-hMN-14的a4形式(8.40min)和32形式(9.26min),另兩個分別是K鏈的二聚體和單體。該混合物顯示出對h679-ADl幾乎沒有結(jié)合活性，除非加入巰基還原劑(例如TCEP),將大部分的34形式轉(zhuǎn)變?yōu)?2形式(圖16)，然后緊密結(jié)合h679-ADl。這些數(shù)據(jù)表明，C-DDD2-Fab-hMN-14是N-DDD2-hMN-14的功能性等同物。實施例13.TF1的產(chǎn)生設(shè)計了h679-Fab-AD2作為B組分與a2組分例如N-DDD2-hMN-Fab-14或C-DDD2-hMN-14配對，它們一旦結(jié)合將易締合在一起形成a2b結(jié)構(gòu)(圖17A),其還可經(jīng)誘導(dǎo)而通過二硫鍵共價結(jié)合(圖17B)。因為N-DDD2-和AD2-構(gòu)建體的表征證明，各自的還原作用是達到完全DDD/AD相互作用所需要的，所以過程還包括還原步驟。首先，用固定化TCEP作為還原劑，以節(jié)省除去還原劑所需要的時間。在室溫下還原小時后，離心除去TCEP-瓊脂糖，將DMSO加入到反應(yīng)液中，終濃度達10%。BIAcore分析證明是共價連接a2b復(fù)合物(下文稱為TF1)存在的第一個證據(jù)。在小規(guī)模反應(yīng)中使用固定化TCEP確定了可行性之后，如下所述對TF1進行大規(guī)模生產(chǎn)。首先按照大致的化學(xué)計量濃度將N-DDD2-Fab-hMN-14(蛋白L-純化的)與h679-Fab-AD2(IMP-291-純化的)在含lmMEDTA的PBS(pH7.4)中混合。加入TCEP之前，SE-HPLC未顯示出321)形成的任何證據(jù)(圖18A)。而是具有代表34(7.97mm;200kDa)、a2(8.91mm;100kDa)和b(10.01min;50kDa)的峰。加入5mMTCEP快速導(dǎo)致a2b復(fù)合物的形成，與150kDa蛋白一致的、在8.43mm的新峰證明了這一點(圖18B)。該實驗中顯然有過量的B，因為h679-Fab-AD2(9.72min)所產(chǎn)生的峰仍是明顯的，但是對于32或a4則未見明顯的峰。還原反應(yīng)1小時后，針對幾次更換的PBS進行透析過夜，除去TCEP。所得溶液加入10%DMSO并在室溫下保存過夜。當用SE-HPLC分析時(圖18C),代表321)的峰明顯變尖，保留時間稍微降低了0.1min,變?yōu)?.31mm(圖18C)，根據(jù)我們先前的發(fā)現(xiàn)，這表示結(jié)合親和性提高了。該復(fù)合物通過IMP-291親和色i普進一步純化以除去K鏈雜質(zhì)。不出所料，過量h679-AD2—起被純化出來，然后用制備型SE-HPLC除去(圖18D)。圖19清楚地證明TF1是高度穩(wěn)定的復(fù)合物。當測定TF1與HSG(IMP-239)傳感器芯片結(jié)合時，在樣品注射結(jié)束之后所觀察的響應(yīng)未見明顯降低，相比之下，當在類似條件下測定含有等摩爾混合物的C-DDDl-Fab-hMN-14和h679-Fab-ADl的溶液時，在樣品注射期間和剛注射完后，所觀察到的響應(yīng)單元的增加伴隨著可檢測的下降，表明開始形成的a2b結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。此外，盡管隨后注射WI2，在針對TF1的響應(yīng)單元中引起大幅度的增力口，但是對于C-DDD1/AD1混合物來說沒有明顯增加。因WI2與固定在傳感器芯片上的TF1結(jié)合而導(dǎo)致的響應(yīng)單元的額外增加，對應(yīng)于兩個完整的功能性結(jié)合位點，其各自是由N-DDD2-Fab-hMN-14的一個亞基引起的。TF1與WI2的兩個Fab片段的結(jié)合能力證實了這一點，如圖20所示。在含有M79-AD2和N-DDDl-hMN14的混合物被還原和氧化成為TF1后，當用BIAcore分析時，WI2幾乎沒有額外結(jié)合(圖21),表明二硫鍵穩(wěn)定的a2b復(fù)合物(例如TF1)僅通過DDD2與AD2的相互作用而形成。對該過程進行了兩個改進，以減少過程的時間和效率。首先，用34/32結(jié)構(gòu)混合物中存在的稍微過量摩爾數(shù)的N-DDD2-Fab-hMN-14與h679-Fab-AD2反應(yīng)，使得沒有游離的h679-Fab-AD2存在，而未束縛在h679-Fab-AD2的任何34/32結(jié)構(gòu)以及輕鏈，都用IMP-291親和色i普除去。第二，疏水作用色諳(HIC)代替透析或滲濾，在還原反應(yīng)后用于除去TCEP,這不僅縮短過程時間，而且增加了潛在病毒的去除步驟。N-DDD2-Fab-hMN-14與679-Fab-AD2混合，用5mMTCEP在室溫下還原1小時。溶液加入0.75M^L酸銨，然后上樣到丁基FFHIC柱上。用含0.75M硫酸銨、5mMEDTA的PBS洗柱，以除去TCEP。用PBS從HIC柱上洗脫還原蛋白，加入10%DMSO。在室溫下孵育過夜后，用IMP-291親和色譜分離出高度純化的TF1(圖22)。無需額外的純化步驟，例如凝膠過濾。實施例14.TF2的產(chǎn)生如下所述，經(jīng)中試生產(chǎn)一批TF2，收率〉90%。將蛋白L-純化的C-DDD2-Fab-hMN-14(200mg)與h679-Fab-AD2(60mg)按照1.4:1的摩爾比混合?？偟鞍诐舛葹?.5mg/ml含有1mMEDTA的PBS。后續(xù)步驟包括TCEP還原、HIC色譜、DMSO氧化和IMP-291親和色譜，都與TF1所述相同。加入TCEP之前，SE-HPLC未顯示出a2b形成的任何證據(jù)(圖24A)。而是具有代表a4(8.40min;215kDa)、a2(9.32min;107kDa)和b(10.33min;50kDa)的峰。加入5mMTCEP快速導(dǎo)致a2b復(fù)合物的形成，正如在8.77min的新峰所證明的那樣(圖24B)，該峰與二元結(jié)構(gòu)所預(yù)期的l57kDa蛋白是一致的。圖25A中的圖"i普顯示從HIC和DMSO處理洗脫后收集的流分量。用IMP-291親和色譜將TF2純化至幾乎均一(圖25C)。對IMP-291未結(jié)合流分進行的SE-HPLC分析證明從產(chǎn)物中除去了a4、a2和游離K鏈(圖25B)。非還原型SDS-PAGE分析證明，大多數(shù)TF2以大的共價結(jié)構(gòu)形式存在，相對遷移率類似于IgG(圖26A)。額外的條帶表明，在實驗條件下，二硫鍵形成不完全。還原型SDS-PAGE顯示，在非還原型凝膠中明顯的任何額外條帶都與產(chǎn)物相關(guān)(圖26B),因為僅一個代表TF2的組成性多肽的條帶是明顯的。然而，4個多肽中每一個的相對遷移率都非常接近，以致于無法分辨。MALDI-TOF質(zhì)譜(圖27)揭示了156,434Da的單峰，是在TF2的計算分子量(157,319Da)的99.5%之內(nèi)。按照TF1所述的BIACORE測定TF2的功能，結(jié)果見圖28。將TF2、C-DDD-hMN-14+h679-ADl(用作非共價321)復(fù)合物的對照樣品)或C-DDD2-hMN-14+h679-AD2(用作非還原32和b組分的對照樣品)稀釋至1)Lig/ml(總蛋白)并通過固定了HSG的傳感器芯片。對TF2的響應(yīng)是兩個對照樣品反應(yīng)的約2倍，表明對照樣品中僅有h679-Fab-AD組分與傳感器芯片結(jié)合并保留在其上。隨后注射WI2IgG,證明僅有TF2具有能與h679-Fab-AD緊密結(jié)合的DDD-Fab-hMN-14組分，正如額外的信號響應(yīng)所示。因WI2與固定在傳感器芯片上的TF2結(jié)合而導(dǎo)致的響應(yīng)單元的額外增加，也對應(yīng)于兩個完整的功能性結(jié)合位點，每個都是由C-DDD2-Fab-hMN-14的一個亞基引起的。TF2與WI2的兩個Fab片段的結(jié)合能力證實了這一點，如圖29所示。通過竟爭性EL1SA測定TF2的相對CEA-結(jié)合親合力(圖30)。用含有CEA的A3B3結(jié)構(gòu)域的融合蛋白包被各板(0.5嗎/孔)，所述蛋白被hMN-14識別。連續(xù)稀釋TF1、TF2和hMN-14IgG,—式四份，在含有綴合HRP的hMN-14IgG(1nM)的孔中孵育。數(shù)據(jù)顯示TF2結(jié)合CEA的親合力與IgG相比至少相等，比TF1強2倍。這毫不奇怪，因為先前在類似測定中，與hMN-14IgG相比，發(fā)現(xiàn)C-DDDl-Fab-hMN-14具有更強的CEA-結(jié)合親合力，這反過來比N-DDDl-Fab-hMN-14結(jié)合得更緊密。C-DDD-Fab-hMN-14比親本IgG親合力明顯增加的一個可能的解釋就是前者中的Gly/Ser接頭提供了比IgG更柔性的分子。盡管N-DDD變異體也具有柔性肽接頭，但CEA結(jié)合位點的位置彼此接近并鄰近DDD二聚體，導(dǎo)致親合力下降。將TF1和TF2設(shè)計成可用于體內(nèi)的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，其中在血液和組織中會發(fā)生大量稀釋。用BIACORE評價人血清中TF2的穩(wěn)定性，結(jié)果見圖31。將TF2用新鮮人血清(是從4個供體合并而獲得的)稀釋至O.lmg/ml并在5%C02、37。C孵育數(shù)天。每天取樣按1:25進行稀釋，通過BIACORE進行分析，使用IMP-239HSG傳感器芯片。注射W12IgG,用于定量測定完整而完全活性的TF2量。將血清樣品與從貯液直接稀釋的對照樣品進行比較。TF2在血清中是高度穩(wěn)定的，7天后仍保持98%的雙特異性結(jié)合活性。TF1在人或小鼠血清中也得到類似結(jié)果。實施例16.TF2在荷瘤小鼠體內(nèi)的生物分布在攜帶皮下(s.c.)人結(jié)腸直腸腺癌異種移植物(LS174T)的雌性無胸腺棵鼠中，對TF2進行生物分布研究。在組織培養(yǎng)物中擴增細胞，直到細胞生長到足以皮下(s.c.)注射50只小鼠，1x107細胞/小鼠。一周后測量腫瘤，將小鼠分為每時間點5只小鼠一組。該研究開始時，平均腫瘤大小為0.141±0.044cm^給所有小鼠都注射40嗎125I-TF2(250pmol,2pCi)。然后，在注射后0.5、2、4、16、24、48和72小時處死小鼠并進行尸檢。該研究總共使用35只小鼠。取出胂瘤以及不同組織并放在Y-計數(shù)器中，以測定組織中各時間點的％注射劑量/克CK)ID/g)。125I-TF2的放射性碘化產(chǎn)生2.7%未結(jié)合同位素，比活1.48mCi/mg。然后將標記樣品單獨進行SE-HPLC，以及在與20倍摩爾數(shù)過量的CEA混合后再進行SE-HPLC。約83%TF2在保留時間為10.1分鐘時洗脫下來。在標記TF2中有9%聚集物(11丁=9.03min)和8%低分子量物(RT44.37mm)。當與CEA混合時，95%的標記TF2變成高分子量物質(zhì)(11丁=7.25min)。這些結(jié)果表明，標記制劑對于給予荷瘤小鼠來說是可接受的。表1列出腫瘤和不同組織中的。/。ID/g計算值。腫瘤峰攝取發(fā)生在注射后4h(10.3±2.1%ID/g)。在注射后16-24小時間，腫瘤中的TF2含量沒有明顯不同(5.3士l.lo/oID/g和5.37±0.7%ID/g),表明在這兩個時間點之間可按血中的數(shù)值給予肽，而不影響腫瘤靶向。TF2從正常組織中的攝取和清除非常類似于先前對TF1進行的觀察。TF1和TF2看來都證實通過RES系統(tǒng)(脾和肝)清除。也評價了TF2在荷瘤小鼠中的血PK,發(fā)現(xiàn)它們表現(xiàn)出乂又一目;青除。用WmNonlinNonlinearEstimationProgram(v.4.1)t是供的二室分析，對這些數(shù)據(jù)進行了分析，所測參數(shù)見表2。實施例17.在荷瘤小鼠中用TF2進行預(yù)靶向在攜帶皮下(s.c.)人結(jié)腸直腸腺癌異種移植物(LS174T)的雌性無胸腺棵鼠中，用TF2進行預(yù)靶向研究。在組織培養(yǎng)物中擴增細胞，直到細胞生長到足以皮下(s.c.)注射55只小鼠，1x107細胞/小鼠。一周后測量腫瘤，將小鼠分為每時間點5只小鼠一組。該研究開始時，平均腫瘤大小為0.105±0.068cm3。給20只小鼠注射80jig125I-TF2(500pmol,2|iCi)，然后在16小時后給予99mTc-IMP-245(40pCi、92ng、50pmol)。在注射肽后0.5、1、4和24小時處死小鼠并進4亍尸才企。另外，24小時時間點組的3只小鼠在注射后1、4和24小時用y-照相機照相。作為對照，3只額外小鼠僅接受99mTc-IMP-245(無預(yù)輩巴向)并在注射后1、4和24小時照相，照相后24小時再進行尸檢。取出胂瘤以及不同組織并放在Y-計數(shù)器中，以測定組織中各時間點的Q/。ID/g。測定125I-TF2和用125I-TF2預(yù)耙向的99mTc-IMP-245的%ID/g值，分別概述于表3和4。在注射肽后前4小時(或給予TF2后20h)，TF2水平保持相對不變，范圍為6.7±1.6%ID/g(在注射肽后0.5h,即給予TF2后16.5h)至6.5±1.5%ID/g(在4h時間點，即給予TF2后20h)。在注射肽后0.5、1、4和24小時，用TF2預(yù)靶向的IMP誦245的肺瘤攝取值(o/oID/g)為22±3%、30±14%、25±4%和16±3%。對于正常組織來說，在每個時間點進行檢測，在用TF2預(yù)輩巴向的小鼠中，肝、肺和血液中肽含量明顯低于用迄今為止開發(fā)的其它預(yù)靶向劑所得到的結(jié)果(Rossi等，ClinCancerRes.2005;ll(增刊19):7122s-7129s)。這些數(shù)據(jù)表明TF2通過正常器官有效清除，未留下與隨后給予的肽結(jié)合的任何殘余片段。高的胂瘤攝取以及在正常組織的低水平，導(dǎo)致良好的胂瘤:非胂瘤(T/NT)比率(表5),因而確認TF2是合適的預(yù)靶向劑，用于將基于di-HSG的效應(yīng)物定位到產(chǎn)生CEA的腫瘤上。實施例18.用谷胱甘肽氧還系統(tǒng)產(chǎn)生TF2作為以上實施例13和14中公開方法的一個替代實施方案，可用谷胱甘肽氧還系統(tǒng)產(chǎn)生穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(例如TF1或TF2),以形成特異性二硫鍵連接的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)。如下所述，完成了產(chǎn)生TF2的簡便有效方法。全部過程都在室溫下進行。首先按照大致的化學(xué)計量濃度將C-DDD2-Fab-hMN-14(蛋白L-純化的)與h679-Fab-AD2(IMP-291-純化的)在含lmMEDTA的PBS(pH7.4)中混合。加入還原型谷胱甘肽至終濃度1mM。30分鐘后，加入氧化型谷胱甘肽至終濃度2mM。BIACORE分析證明，在加入氧化型谷胱甘肽后2分鐘，TF2的形成完成了50%,在4小時內(nèi)完成100%。按照以上實施例14所述，用IMP-291親和色i普將TF2純化至幾乎均一。實施例19.粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的位點特異性PEG化重組人GM-CSF(14kDa)在臨床上用于治療各種血液病。目前GM-SCF產(chǎn)品的一個局限是循環(huán)半衰期短，因此為了最佳療效必須每天注射給予患者。已用于延長蛋白質(zhì)治療藥循環(huán)半衰期的一種方法是用聚乙二醇(PEG)修飾蛋白質(zhì)以增加其有效粒徑。然而，目前將PEG與蛋白質(zhì)綴合(PEG化)的所有方法并非最佳的，并且通常需要修飾目標蛋白以達到位點特異性偶合(Doherty等，BioconjugateChem.2005,16:1291-1298)。即便有這些修飾，綴合收率也是不同的，而所得產(chǎn)物也不是均質(zhì)的。通過以下概述的DNL技術(shù)可以定量收率實現(xiàn)GM-CSF的位點特異性PEG化。DDD2序列通過間隔區(qū)與GM-CSFC-端融合，產(chǎn)生GM-SCF二聚體，創(chuàng)建了一個AD2?？课稽c，其再與PEG綴合得到PEG-AD2。在用于TF2的所述類似條件下，通過結(jié)合GM-CSF-DDD2和PEG-AD2導(dǎo)致PEG化GM-CSF的形成。注意到，除了延長循環(huán)半衰期外，PEG化產(chǎn)物中GM-CSF二聚體結(jié)構(gòu)比目前的單體GM-CSF結(jié)構(gòu)具有更高效力。該策略可用于其它細胞因子(例如重組人IL-2)、酶(例如重組人精氨酸酶)或生物活性肽(例如血小板生成素受體肽激動劑，參見Cwirta等，Science1997,276:1696-1699)或那些需要更長循環(huán)半衰期以改進療效的肽模擬物。實施例20.用于免疫-PCR、LAMP和IDAT的生物分子的位點特異性共價連接共價DNA-標記抗體可用于放大PCR測定響應(yīng)(參見Nucl.AcidRes.1995,23:522-529;Nucl.AcidRes.1999,27:4553-4561)。這樣的嵌合體可用綴合化學(xué)方法制得，該方法常導(dǎo)致產(chǎn)物在化學(xué)計量上不確定，具有未知的連接位點，因而不適于定量測定。近年來，已開發(fā)了產(chǎn)生確定的DNA-蛋白嵌合體(稱為蝌蚪(tadpole))的方法(參見Burbulis等，Nat.Methods2005,2:31-37),并證明能夠檢測和計數(shù)少量的分子。蝌蚪方法利用包括內(nèi)含肽(mtein)化學(xué)在內(nèi)的復(fù)雜流程，將雙鏈DNA片段位點特異性地連接目標蛋白。本發(fā)明的方法和組合物也可用于將DNA以位點特異性方式與蛋白質(zhì)共價連接，產(chǎn)生確定組合物的均質(zhì)產(chǎn)物，也比辦枓方法簡單得多。通過改變連接的DNA，利用免疫-PCR、LAMP(環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(loop-mediatedisothermalamplification))(參見Nucl.AcidRes.2000,28:e63)或IDAT(T7RNA聚合酶擴增的免疫檢測)技術(shù)(參見Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001,98:5497-5502)，本發(fā)明產(chǎn)生的DNA-蛋白嵌合體可用于檢測和定量檢測非常少量(ioo-iooo)的分子。各試劑如下配制。(i)通過將DDD2與目標蛋白(例如hMN-14Fab、hA20Fab等)的結(jié)合結(jié)構(gòu)融合，制備組分A(ii)通過間隔基團，將AD2與所選雙鏈DNA進行化學(xué)綴合，制備組分B。許多這類可直接用于綴合的DNA片段是市售的。其它的可通過化學(xué)合成。(in)A與B在巰基還原劑存在的條件下進行混合，再氧化，得到最終產(chǎn)物，其組成為一個拷貝的A和一個拷貝的B，A含有兩個相同亞基，每個亞基都具有耙分子結(jié)合位點，B則通過合適PCR技術(shù)進行擴增。實施例21.具有生物學(xué)功能的納米粒本說明書提供了通用而有效的方法，用于顯示具有特定生物學(xué)功能的惰性生物相容材料。相當大的努力都致力于納米粒的合理的表面修飾與包被，以調(diào)節(jié)其藥代動力學(xué)特性、毒性、免疫原性和靶向能力。例如，已報道了綴合抗體或肽的輩巴向納米粒成功實現(xiàn)體外傳感。然而，對于體內(nèi)應(yīng)用還存在諸多障礙(WeisslederR等，Nat.Biotechnol.2005;23:1418-1423)。這些挑戰(zhàn)之一是目前化學(xué)技術(shù)有待優(yōu)化，尤其是有關(guān)位點特異性偶聯(lián)，快速表面修飾以及降低成本，這些可按以下概述來實現(xiàn)。在EDC(l-乙基-3-(3-二曱氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽)和sulfo-NHS(磺基琥珀酰亞胺酯)存在的條件下，通過C端羧基與環(huán)形AD2反應(yīng)，將在表面修飾的具有游離氨基的納米粒與AD2連接。純化后，該AD2-納米粒與含有已經(jīng)連接DDD2的目標結(jié)合結(jié)構(gòu)的A組分混合，還原，再氧化，得到終產(chǎn)物，該終產(chǎn)物從A獲得耙向能力并保留納米粒的特性。潛在應(yīng)用包括用焚光》茲顆粒進行把細胞體內(nèi)造影以及用大孔徑顆粒把藥物遞送到耙細胞(Tsapis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002;99:12001-12005)。實施例22.新的用DNL技術(shù)激活的免疫藥物制備允許綴合目標細胞毒性藥物的融合蛋白作為B組分，與制備作為A組分的靶向蛋白偶聯(lián)，產(chǎn)生下述新的免疫藥物。首先，選擇良好表達的免疫球蛋白人輕鏈作為支架(scafold)或載體蛋白，在其C-端與AD2序列融合。為了避免形成輕鏈二聚體，末端半胱氨酸(它與Fd鏈形成二硫鍵)被絲氨酸取代。此外，至少一個N-糖基化位點(三肽序列N-X-T)被改造成到輕鏈以便能添加寡糖，它能以重組方式高收率地制備并純化為單一組分，用作通過適當化學(xué)方法進行藥物綴合的底物，例如Shih等所描述的將蒽環(huán)與氨基-葡聚糖綴合(CancerRes.1991;51:4192-4198)。這類含有藥物的B-組分可結(jié)合各種A組分，該A組分含有已連接到具有靶向和內(nèi)化功能的結(jié)合結(jié)構(gòu)的DDD2?；蛘撸肁D2衍生的含有藥物的氨基-葡聚糖與合適的A組分組合，以便進行靶特異性藥物治療。其它良好表達的重組分子也可選做藥物綴合的支架或載體蛋白。實施例23.將病原體靶向嗜中性粒細胞以殺死病原體最近報道了包含重組人表面活性蛋白片段D(rfhSP-D)和抗CD89抗體Fab的化學(xué)綴合物，作為廣譜抗感染藥物，潛在用于治療由各種病原體引起的疾病，所述病原體包括曱型流感病毒、白色念珠菌和大腸桿菌(Tacken等，J.Immunol.2004,172:4934-4940)。如下所述，DNL技術(shù)可用于生產(chǎn)穩(wěn)定束縛的復(fù)合物，該復(fù)合物也可將病原體靶向嗜中性粒細胞以殺死病原體。將含有巻曲螺旋型a-螺;旋頸區(qū)(a-helicalcoiledcoilneckdomain)和C端泮唐識別區(qū)(CRD)的hSP-D截短片段，在N-端與DDD2融合，產(chǎn)生能通過CRD多價結(jié)合病原體的A結(jié)構(gòu)。為了耙向嗜中性粒細胞上的FcR，將A結(jié)構(gòu)與由抗CD89Fab與AD2融合蛋白組成的B組分連接，產(chǎn)生由兩個hSP-DCRD和一個抗CD89Fab組成的穩(wěn)定復(fù)合物。用人表面活性蛋白A(hSP-A)替代hSP-D和其它抗體(例如針對CD3和CD64的抗體)，可制備類似的抗感染藥。實施例24.用DNL技術(shù)制備的蛋白質(zhì)微陣列蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)的一個迫切問題就是成功開發(fā)切實可行的方法，用于有效地將蛋白質(zhì)固定在玻璃表面，同時保持這些蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。因為如果不是適當而穩(wěn)定地連接到合適表面上，蛋白質(zhì)就會失去活性，所以已經(jīng)測試了多種策略，看它們在微陣列中產(chǎn)生均一而穩(wěn)定的蛋白質(zhì)固定化效果。例如，Zhu等人在其酵母菌微陣列的研究工作中，利用Ni-NTA-包被的玻片讓(HisV標記的蛋白質(zhì)進行位點特異性地連接(Science2001;293:2101-2105)。然而，(HisV標記與Ni-NTA間的非共價相互作用僅允許與這類微陣列相容的有限數(shù)量的下游篩選技術(shù)。也已經(jīng)報道了幾種穩(wěn)定和位點特異性蛋白質(zhì)固定化的替代策略。Mrksich等人將角質(zhì)酶-融合蛋白質(zhì)固定在含有膦酸酯的玻璃表面上，該策略是通過絲氨酸酯酶角質(zhì)酶與帶有膦酸酯配體的自裝配單層細胞結(jié)合，然后經(jīng)過取代反應(yīng)將配體共價束縛到酶活性位點上(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2002;99:5048-5052)。Kindermann等(J.Am.Chem.Soc.2003;125:7810-781l)報道的另一方法,是基于人O6-烷基鳥。票呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶(hAGT)的不常見機制，該機制將其底物烷基鳥。票呤或千基鳥。票呤的烷基不可逆地轉(zhuǎn)移給hAGT的反應(yīng)性半胱氨酸殘基。通過將千基連接到表面，hAGT融合蛋白將其自身以特異性和共價的方式固定。Yin等(J.Am.Chem.Soc.2004;126:7754-7755)報道了另一種基于酶的策略，用于固定含有肽載體蛋白(PCP)的融合蛋白，該方法利用固定在表面的磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶(S^)和磷酸泛酰巰基乙胺綴合物。利用截短形式的核糖核酸酶S，Soellner等(J.Am.Chem.Soc.2003;125:11790-11791)證明通過Staudmger連接固定位點特異性蛋白質(zhì)，其中疊氮化物與硫代亞膦酸酯(phosphinothioester)反應(yīng)生成穩(wěn)定的酰胺。Tan等(B證g.Med.Chem.Lett.2004;14:6067-6070)報道了改進的方法，利用內(nèi)含肽介導(dǎo)的化學(xué)方法使蛋白質(zhì)發(fā)生位點特異性生物素化，隨后固定在包被有抗生物素蛋白的表面而得到蛋白質(zhì)微陣列。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本說明書提供具有幾個優(yōu)越性的位點特異性和共價固定蛋白質(zhì)的通用方法更加簡單、高效、通用等?？赏ㄟ^下述方法制備蛋白質(zhì)微陣列。在EDC和sulfo-NHS存在的條件下，用環(huán)形AD2處理含有反應(yīng)性氨基的合適表面，通過其C端羧基共價連接AD2。AD2-衍生表面隨后與含有親和-識別域(例如Fab片段)和DDD2的融合蛋白一起孵育，還原并再氧化，引起融合蛋白的共價和位點特異性固定化。用金包被的玻片也適用于AD2的衍生化。實施例25.用并非源自PKA和AKAP的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生的多價、多特異性結(jié)構(gòu)包括兩個基本策略。第一個策略是尋找和評價適于替代DDD和AD作用的其它天然存在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域。例如，HNF-la的N端二聚化結(jié)構(gòu)域可替代DDD，而HFN-1二聚化輔因子(DcoH)可替代AD。第二個策略概述如下。人p53是由不同的功能性結(jié)構(gòu)域組成的模塊蛋白。人p53C端殘基32S355(流程1)稱為四聚體化結(jié)構(gòu)域(pS3tet)，在溶液中自動形成四聚體，它實際上是兩個二聚體的二聚體，其間只有微弱的親和力(Kd2uM)。然而，每個二聚體中的兩個單體卻緊密相連，據(jù)報道Kd小于10.'5M(Brokx等，J.Biol.Chem.2003;278:2327-2332)。因此，預(yù)期含有p53tet的融合蛋白會形成非常緊密結(jié)合的二聚體，如同含有人PKARIIa的DDD序列的融合蛋白那樣。為了將第二結(jié)構(gòu)與p53tet二聚體連接在一起，通過酵母2-雜交系統(tǒng)或合適的噬菌體展示文庫，選擇含有15-50個殘基的針對p53tet的結(jié)合肽，Kd^1ILiM。必要時，用半胱氨酸衍生具有最高親合力(即最低的Kd值)的肽，再與目標蛋白融合，就能被穩(wěn)定束綽到p53tet二聚體上。流程IGEYFTLQIRGRERFEMFRELNEALELKDAQA(SEQIDNO:28)表1.帶有LS174T腫瘤的棵鼠中125I-TF2的腫瘤攝取和組織清除率<table>tableseeoriginaldocumentpage132</column></row><table>表3.帶有LS174T腫瘤的棵鼠中TF2的腫瘤攝取和組織清除率<table>tableseeoriginaldocumentpage133</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage134</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage135</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage136</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage137</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage138</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage139</column></row><table>權(quán)利要求1.一種包含穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)的組合物，所述結(jié)構(gòu)包含a)同型二聚體，所述同型二聚體的每個第一單體包含與第一前體連接的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域(DDD)；b)第二單體，包含與第二前體連接的錨定結(jié)構(gòu)域(AD)，AD與DDD共價或非共價連接。2.權(quán)利要求1的組合物，其中AD通過二硫鍵與DDD結(jié)合。3.權(quán)利要求1的組合物，其中DDD與第一前體共價結(jié)合，AD與第二前體共價結(jié)合。4.權(quán)利要求3的組合物，其中第一單體是包含第一前體和DDD的融合蛋白，第二單體是包含第二前體和AD的融合蛋白。5.權(quán)利要求3的組合物，其中第一前體與DDD化學(xué)交聯(lián)，笫二前體與AD化學(xué)交聯(lián)。6.權(quán)利要求l的組合物，其中第一和第二前體選自蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、多核苷酸、RNA/、寡糖、天然或合成聚合物、納米粒、量子點、以及有機或無機化合物。7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述蛋白質(zhì)選自細菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、豹蛙酶(Rap)、Rap(N69Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、tPA、細胞因子、生長因子、可溶性受體組分、表面活性蛋白D、IL-4、sIL-4R、sIL-13R、VEGF121、TPO、EPO、；容血才全劑、酶、焚光蛋白、sTNFa-R、avimer、scFv、dsFv和納米抗體。8.權(quán)利要求1的組合物，其中第一和笫二前體選自抗體、IgG抗體、抗體片段、單克隆抗體、人源化抗體、人抗體、嵌合抗體、抗體的抗原結(jié)合區(qū)、納米4元體、scFv、scFv-Fc融合物、Fab、Fab'、dsFv、單鏈抗體和F(ab')2。9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述抗體片段選自以下抗體的抗體片段hMN-14、L19、hA20、hLL2、L243、hCC49、7E3、hLLl、hPAM4、hRS7、rHl、L49、抗CD14、抗CD111、Humira、REMICADE、Xolair、Synagis⑧和hMN-15。10.權(quán)利要求1的組合物，其中DDD序列來源于依賴cAMP的蛋白激酶(PKA)調(diào)節(jié)亞基。11.權(quán)利要求1的組合物，其中AD序列來源于A-激酶錨定蛋白(AKAP)序列。12.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體和第二前體具有針對抗原的結(jié)合親和性。13.權(quán)利要求12的組合物，其中第一前體和第二前體具有針對相同抗原的親和性。14.權(quán)利要求12的組合物，其中第一前體和第二前體具有針對兩種不同抗原的親和性。15.權(quán)利要求12的組合物，其中所述抗原選自碳酸酐酶IX、曱胎蛋白、A3、A33抗體特異性抗原、Ba733、BrE3-抗原、CA125、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、結(jié)腸特異性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Flt-l、Flt-3、葉酸受體、HLA-DR、人絨毛膜促性腺激素(HCG)及其亞基、HER2/neu、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-I)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰島素生長因子-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-l-抗原、KSl-4、Le-Y、巨嗟細胞抑制因子(MIF)、MAGE、而C1、MUC2、固C3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗體特異性抗原、胎盤生長因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受體、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、腫瘤壞死抗原、VEGF、ED-B纖連蛋白、17-lA-抗原、血管生成標記、癌基因標記或癌基因產(chǎn)物。16.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體包含與免疫球蛋白CH1序列連接的免疫球蛋白Vh序列。17.權(quán)利要求16的組合物，其中第一前體與免疫球蛋白輕鏈連接。18.權(quán)利要求17的組合物，其中所述輕鏈包含與CK或CL序列連接的V^序列。19.權(quán)利要求17的組合物，其中第一前體通過二硫鍵與所述輕鏈連接。20.權(quán)利要求l的組合物，其中第一前體具有腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合位點。21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述腫瘤相關(guān)抗原選自碳酸酐酶IX、曱胎蛋白、A3、A33抗體特異性抗原、Ba"3、BrE3-抗原、CA125、CD1、CDla、CD3、CD5、CD15、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD33、CD38、CD45、CD74、CD79a、CD80、CD138、結(jié)腸特異性抗原-p(CSAp)、CEA(CEACAM5)、CEACAM6、CSAp、EGFR、EGP-1、EGP-2、Ep-CAM、Flt-l、Flt-3、葉酸受體、HLA-DR、人絨毛膜促性腺激素(HCG)及其亞基、HER2/neu、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-I)、Ia、IL-2、IL-6、IL-8、胰島素生長因子-1(IGF-1)、KC4-抗原、KS-l-抗原、KSl-4、Le-Y、巨噬細胞抑制因子(MIF)、MAGE、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、NCA66、NCA95、NCA90、PAM-4抗體特異性抗原、胎盤生長因子、p53、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PSMA、RS5、SIOO、TAC、TAG-72、生腱蛋白、TRAIL受體、Tn抗原、Thomson-Friedenreich抗原、肺瘤壞死抗原、VEGF、ED-B纖連蛋白、17-lA-抗原、血管生成標記、癌基因標記或癌基因產(chǎn)物。22.權(quán)利要求1的組合物，其中第二前體具有半抗原的結(jié)合位點。23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述半抗原與治療藥連接。24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述治療藥選自相思豆毒蛋白、金剛烷胺、阿莫西林、兩性霉素B、氨千西;f木、aplidin、阿扎立平、阿那曲唑、氮雜胞苷、氨曲南、阿奇霉素、桿菌肽、復(fù)方新諾明、巴特芬⑧、聯(lián)苯芐唑、博來霉素、硼替佐米、苔蘚抑素-1、白消安、加利車霉素、喜樹堿、10-羥基喜樹堿、羧千西林、卡泊芬凈、卡莫司汀、頭孢克洛、頭孢唑林、頭孢菌素類、頭孢吡肟、頭孢曲松、頭孢噻肟、西樂葆、苯丁酸氮芥、氯霉素、鹽酸環(huán)丙沙星制劑⑧、順鉑、伊立替康(CPT-ll)、SN-38、卡鉑、克拉曲濱、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達卡巴嗪、多西他賽、放線菌素D、葡糖苷酸道諾霉素、柔紅霉素、地塞米松、己烯雌酚、白喉毒素、DNA酶I、多柔比星、2-二氫吡咯多柔比星(2P-DOX)、多西環(huán)素、氰基嗎啉代多柔比星、葡糖苷酸多柔比星、葡糖苷酸表柔比星、炔雌醇、雌莫司汀、雌激素受體結(jié)合劑、依托泊普、葡糖苷酸依托泊苷、磷酸依托泊苷、erythrocyclme、紅霉素、甲硝唑、法尼基-蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑、氟尿苷(FUdR)、3',5'-0-二油?；?FudR(FUdR-dO)、氟達拉濱、氟他胺、氟尿嘧啶、氟曱睪酮、更昔洛韋、慶大霉素、多花白樹毒蛋白、吉西他濱、己酸羥孕酮、羥基脲、伊達比星、異環(huán)磷酰胺、異煙肼、伊曲康唑、卡那霉素、酮康唑、L-天冬酰胺酶、亞葉酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、6-巰基嘌呤、曱氨蝶呤、米托蒽醌、光輝霉素、絲裂霉素、米托坦、米諾環(huán)素、萘替芬、萘啶酸、新霉素、諾維本、硝基脲、制霉菌素、onconase、苯唑西林、巴龍霉素、青霉素、噴他脒、哌拉西林-三唑巴坦、丁酸苯酯、潑尼松、丙卡巴肼、紫杉醇、噴司他丁、美洲商陸抗病毒蛋白、PSI-341、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、雷洛昔芬、rapLRl、核糖核酸酶、蓖麻毒蛋白、司莫司汀、利福布汀、利福平、金剛乙胺、鏈霉素、磺胺曱嗯唑、柳氮磺吡啶、葡萄球菌腸毒素-A、鏈佐星、他莫昔芬、紫杉烷類、泰素、丙酸睪酮、四環(huán)素、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、替尼泊苷、托泊替康、反鉑、曱氧千啶-磺胺曱噁唑、烏拉莫司汀、伐昔洛韋、萬古霉素、velcade、長春堿、長春瑞濱、長春新;威、zanamir、zithromycin、反義寡核香酸、干擾RNA或其組合。25.權(quán)利要求22的組合物，其中所述半抗原與造影劑連結(jié)。26.權(quán)利要求25的組合物，其中所述造影劑選自鉻(ni)、錳(II)、鐵(in)、柳)、鈷(n)、鎳(n)、銅(n)、釹(m)、衫(m)、鐿(ni)、釓(ni)、釩(ii)、鋱(iii)、鏑(m)、鈥(ni)、鉺(m)、鑭(m)、金(in)、鉛(n)和鉍(ni)。27.權(quán)利要求22的組合物，其中所述半抗原與造影用或治療用放射性同位素連接。28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述放射性同位素選自225Ac、211At、212Bi、213Bi、14C、51Cr、36C1、45Ti、57Co、58Co、62Cu、64Cu、67Cu、166Dy、152Eu、18F、67Ga、68Ga、195mHg、166Ho、3H、mIn、123I、124I、125I、131I、52Fe、59Fe、177Lu、1910s、212Pb、32P、33P、l42Pr、195mPt、223Ra、l86Re、188Re、189Re、47Sc、75Se、mAg、153Sm、89Sr、35S、161Tb、94mTc、99mTc、86Y、卯Y和89Zr。29.權(quán)利要求22的組合物，其中所述半抗原與抗血管生成藥連接。30.權(quán)利要求29的組合物，其中所述抗血管生成藥選自血管生長抑素、baculostatin、人血管能抑素、乳腺絲抑蛋白、抗VEGF抗體或肽、抗胎盤生長因子抗體或肽、抗Flk-l抗體、抗Flt-l抗體或肽、層粘連蛋白肽、纖連蛋白肽、纖溶酶原激活物抑制劑、組織金屬蛋白酶抑制劑、干擾素、白介素12、IP-IO、Gro畫P、血小板應(yīng)答蛋白、2-曱氧基雌二醇、增殖蛋白相關(guān)蛋白、carboxiamidotriazole、CMIOI、馬立馬司他、戊聚糖多聚硫酸酯、促血管生成素2、干擾素-a、除莠霉素A、PNU145156E、WK催乳素片段、利諾胺、沙利度胺、己酮可可堿、染料木堿、TNP-470、內(nèi)皮生長抑素、紫杉醇、accutin、血管生長抑素、西多福韋、長春新堿、博來霉素、AGM-1470、血小板因子4和米諾環(huán)素。31.權(quán)利要求22的組合物，其中所述半抗原與光檢測標記連接。32.權(quán)利要求l的組合物，其中第一前體選自細菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、抗gpl20、抗P1GF、抗(3-淀粉狀蛋白、hMN-14、L19、hA20、hLL2、L243、hCC49、7E3、hLLl、hPAM4、hRS7、rHl、L49、豹蛙酶(Rap)、Rap(N69Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、tPA、細胞因子、生長因子、可溶性受體組分、表面活性蛋白D、IL-4、sIL-4R、sIL-13R、抗VEGF12I、抗CD14、抗CD川、HUMIRA、REMICADE⑧、XOLAIR⑧、SYNAGIS⑧、hMN-15、TPO、EPO、溶血栓劑、酶、焚光蛋白和sTNFa-R。33.權(quán)利要求1的組合物，其中第二前體選自細菌毒素、植物毒素、蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、核糖核酸酶(RNA酶)、DNA酶I、葡萄球菌腸毒素-A、美洲商陸抗病毒蛋白、多花白樹毒蛋白、白喉毒素、假單胞菌外毒素、假單胞菌內(nèi)毒素、溶血栓蛋白、尿激酶、水蛭素、h679、h734、hA20、Sll、P4B6、Rap、Rap(N69Q)、PE38、dgA、DT390、PLC、鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白、HRP、AP、GFP、tPA、細胞因子、生長因子、可溶性受體組分、羧肽酶G2、青霉素酰胺酶、P-內(nèi)酰胺酶、胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶、大腸桿菌P-半乳糖香酶、綠色焚光蛋白(GFP)、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、鏈霉抗生物素蛋白、人羧基酯酶2、抗gp120、抗P1GF、抗VEGF^、hLLl、hLL2、hPAM4、hRS7、hRl、7E3、ot-CD89、IL-4、sIL誦13R、sIL-4R、志賀樣毒素、白喉毒素、抗CD14、抗CD1U、HUMIRA、REMICADE⑧、XOLA鵬、SYNAGIS、hMN-15、TPO、EPO、溶血栓劑、酶、熒光蛋白和sTNFa-R。34.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體具有針對以下物質(zhì)的結(jié)合親和性細胞表面受體、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶、tpA、鏈激酶、水蛭素、尿激酶、CA19-9、CEA、CEACAM6、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD40、CD74、ED-B纖連蛋白、EGFR、EpCAM/17-lA、GD2、G250、HER2/neu、hTR、II類HLA、HMWMAA、HN歸V、IGF1R、IL-2R/Tac、IL-17、MUC1、PSMA、M13外殼蛋白、GpIIb/IIIa、CD74、EGP隱1、IGF1R、CD25/Tac、LeY、間皮素、Erb-B2、EpCAM、GP240、GPII固a、p97、CD3、IL-4R、IL-4、IL-13、VEGFR-2、CD14、CDlll/柄蛋白-l、葉酸受體a、Gpl20、IL-6、IL-5、IL-8、CD154、IgE、LFA-1、(3-類胰蛋白酶、CD105/內(nèi)皮糖蛋白、TNFa、RSVF-蛋白、CEA的A1B1、CEA的N結(jié)構(gòu)域、P歸P-1、TAG-72、MUC1、固C2、固C3、MUC4、VEFGR1諸、VEGFR2/KDR或VEGRF3/Flt-4。35.權(quán)利要求1的組合物，其中第二前體具有針對以下物質(zhì)的結(jié)合親和性IL-17、組胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)、銦-DTPA、CD22、CD20、EGFR、IGF1R、VEFGR1/Fltl、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt陽4、CD3、CD16、CD64、CD89、CD2、腺病毒纖突結(jié)、M13外殼蛋白、GpIIb/IIIa、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、P-半乳糖苷酶、tpA、鏈激酶、水蛭素或尿激酶。36.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體具有針對選自以下的細胞表面抗原的親和性CEA、ED-B纖連蛋白、CD20、CD22、CD19、EGFR、IGF1R、VEFGR1/Fltl、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt-4、HER2/腿、CD30、CD33、PfMSP-I、HN/NDV、EpCAM/17畫lA、hTR、IL-2R/Tac、CA19-9、固C1、II類HLA、GD2、G250、TAG誦72、PSMA、CEACAM6、HMWMAA、CD40、M13外殼蛋白和GPIIb/IIIa;第二前體具有針對選自組胺-琥珀酰-甘氨酸(HSG)和銦-DTPA的半抗原的親和性，或者具有針對選自以下的細胞表面抗原的親和性CD22、CD20、EGFR、IGF1R、VEFGR1/Fltl、VEGFR2/KDR、VEGRF3/Flt國4、CD3、CD16、CD64、CD89、CD2和腺病毒纖突結(jié)。37.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體具有針對選自M13夕卜殼蛋白和GpIIb/IIIa的細胞表面抗原的親和性，或者具有針對選自以下的生物分子的親和性堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、(3-半乳糖香酶、tpA、鏈激酶、水蛭素和尿激酶；第二前體具有針對選自M13外殼蛋白和GpIIb/IIIa的細胞表面抗原的親和性，或者具有針對選自以下的生物分子的親和性堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、P-半乳糖香酶、tpA、鏈激酶、水蛭素和尿激酶。38.權(quán)利要求l的組合物，其中第一前體具有針對以下物質(zhì)的親和性CD3、CD74、CD19、CD22、MUC1、EGP-1、IGF1RCD30、CD25/Tac、LeY、卩-淀粉狀蛋白、間皮素、Erb-B2、EpCAM、GP240、GPIIb/IIIa或p97;第二前體是核糖核酸酶、豹蛙酶、基因工程豹蛙酶、細菌毒素、植物毒素、PE38、dgA、DT390、磷脂酶C(PLC)、多花白樹毒蛋白、溶血栓蛋白、tPA、尿激酶或水蛭素。39.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體具有針對疾病或病癥相關(guān)的任何細胞表面抗原的親和性；第二前體選自細胞因子、生長因子、羧肽酶G2、青霉素酰胺酶、p-內(nèi)酰胺酶、胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶、P-半乳糖苷酶、綠色熒光蛋白(GFP)、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶和鏈霉抗生物素蛋白。40.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體選自核糖核酸酶、細菌毒素、植物毒素、細胞因子、生長因子和表面活性蛋白D(Sp-D);第二前體具有針對疾病或病癥相關(guān)的任何細胞表面抗原的親和性。41.權(quán)利要求1的組合物，其中第一前體選自細胞表面受體的配體、IL-4、VEGF121、可溶性受體組分、sIL-4R、sIL國13R、毒素、PE38、志賀樣毒素和白喉毒素；第二前體選自細胞表面受體的配體、IL-4、VEGF121、可溶性受體組分、sIL-4R、sIL-13R、毒素、PE38、志賀樣毒素和白喉毒素。42.權(quán)利要求1的組合物，其中第一和第二前體相同，并且選自以下物質(zhì)的結(jié)合分子CD14、CDll/柄蛋白-l、葉酸受體a、gpl20、IL-6、IL-5、IL-8、CD154、IgE、LFA-1、(3-類胰蛋白酶、CD105/內(nèi)皮糖蛋白、GpIIb/IIIa、TNFa、RSVF-蛋白、CEA的A1B1和CEA的N結(jié)構(gòu)域。43.權(quán)利要求l的組合物，其中第一和笫二前體相同，并且選自細胞因子、生長因子、可溶性受體組分、tPA、TPO、EPO和sTNFa-R。44.權(quán)利要求1的組合物，所述組合物還包含通過共價或非共價鍵與所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)綴合的一種或多種效應(yīng)物或載體。45.權(quán)利要求44的組合物，其中所述效應(yīng)物是診斷試劑、治療藥、化療藥、放射性同位素、顯像劑、抗血管生成藥、細胞因子、趨化因子、生長因子、藥物、前體藥物、酶、結(jié)合分子、細胞表面受體的配體、螯合劑、免疫調(diào)節(jié)劑、寡核苷酸、激素、光檢測標記、染料、肽、毒素、造影劑、順磁標記、超聲標記、促凋亡劑、脂質(zhì)體、納米?；蚱浣M合。46.權(quán)利要求44的組合物束縛結(jié)構(gòu)化學(xué)交聯(lián)。47.權(quán)利要求44的組合物效應(yīng)物或兩個以上載體連才妻。48.權(quán)利要求47的組合物效應(yīng)物是相同或不同的。49.權(quán)利要求44的組合物一種診斷試劑或治療藥。50.—種方法，所述方法包括a)獲取權(quán)利要求1的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)；和b)將所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)給予疾病患者；其中所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)對疾病具有治療效果。51.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是癌癥、增生、糖尿病性一見網(wǎng)膜病、黃斑變性、炎性腸病、節(jié)l殳性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、哮喘、水腫、肺動脈高壓、青少年糖尿,其中所述效應(yīng)物或載體與所述穩(wěn)定,其中所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)與兩個以上,其中所述兩個以上載體或兩個以上,其中所述一種或多種載體包含至少病、銀屑病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、斯耶格倫綜合征、多發(fā)性硬化、重癥肌無力、膿毒病、角膜移植排斥、新生血管性青光眼、遺傳性出血性毛細血管擴張、心肌血管生成、斑塊新血管形成、再狹窄、血管創(chuàng)傷后新內(nèi)膜形成、毛細管擴張、血友病性關(guān)節(jié)、血管纖維瘤、慢性炎癥相關(guān)的纖維化、肺纖維化、深部靜脈血栓形成或傷口肉芽形成。52.權(quán)利要求51的方法，其中所述疾病是癌癥，而且第一前體具有針對腫瘤相關(guān)抗原的結(jié)合親和性。53.權(quán)利要求52的方法，所述方法還包括給予一種或多種抗癌治療與所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)聯(lián)用。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述治療是化療藥、細胞因子、肽、免疫調(diào)節(jié)劑、放療、免疫治療、放免治療、局部高溫、激光照射、抗血管生成藥或手術(shù)切除。55.權(quán)利要求51的方法，所述方法還包括給予所述患者能結(jié)合第二前體的半抗原。56.權(quán)利要求55的方法，其中在所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)定位到疾病相關(guān)組織之后再給予所述半抗原。57.權(quán)利要求56的方法，其中所述半抗原與選自以下的物質(zhì)連接抗血管生成藥、化療藥、細胞因子、藥物、前體藥物、毒素、酶、寡核苷酸、放射性同位素、免疫調(diào)節(jié)劑、激素、結(jié)合分子、脂質(zhì)、聚合物、膠束、脂質(zhì)體、納米粒或其組合。58.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是由真菌引起的。59.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是由病毒引起的。60.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是由細菌引起的。61.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是自身免疫性疾病。62.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是神經(jīng)變性性疾病。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述疾病是阿爾茨海默病。64.權(quán)利要求63的方法，其中所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)具有至少一個針對p-淀粉狀蛋白的結(jié)合位點。65.權(quán)利要求50的方法，其中所述疾病是心肌梗塞、缺血性心臟病、動脈粥樣;更化斑塊、脈管炎、移植排斥、特應(yīng)性組織或者因活化粒細胞、單核細胞、淋巴樣細胞、NK細胞或巨噬細胞增多所引起的炎癥。66.權(quán)利要求50的方法，其中給予所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)以誘導(dǎo)輩巴細胞群體凋亡。67.權(quán)利要求66的方法，其中所述穩(wěn)定束綽結(jié)構(gòu)包含選自以下的抗體或抗體片段組合抗CD74X抗CD20、抗CD74X抗CD22、抗CD22X抗CD20、抗CD20X抗HLA-DR、抗CD19X抗CD20、抗CD20X抗CD80、抗CD2X抗CD25、抗CD8X抗CD25和抗CD2X抗CD147。68.權(quán)利要求66的方法，其中第一前體和/或第二前體具有針對選自以下抗原的結(jié)合親和性CD2、CD3、CD8、CDIO、CD21、CD23、CD24、CD25、CD30、CD33、CD37、CD38、CD40、CD48、CD52、CD55、CD59、CD70、CD74、CD80、CD86、CD138、CD147、HLA畫DR、CEA、CSAp、CA國125、TAG-72、EFGR、HER2、HER3、HER4、IGF-1R、c-Met、PDGFR、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、TKFR1、TNFR2、NGFR、Fas(CD95)、DR3、DR4、DR5、DR6、VEGF、PIGF、ED-B纖連蛋白、生腱蛋白、PSMA、PSA、碳酸酐酶IX和IL-6。69.—種診斷疾病的方法，所述方法包括a)獲得一種包含同型二聚體的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，所述同型二聚體的每個第一單體含有與第一前體連接的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域(DDD)，所述二元復(fù)合物還包含第二單體，第二單體含有與第二前體連接的錨定結(jié)構(gòu)域(AD),AD與DDD共價連接，其中笫一前體與疾病相關(guān)抗原結(jié)合，第二前體與診斷用半抗原結(jié)合；b)將所述復(fù)合物給予懷疑患有疾病的患者；c)給予同一患者能結(jié)合所述二元復(fù)合物的診斷用半抗原；和d)檢測與所述二元復(fù)合物結(jié)合的半抗原的存在；其中所述半抗原定位于疾病相關(guān)組織，即診斷所述患者患有所述疾病。70.權(quán)利要求69的方法，其中所述半抗原與放射性核素綴合。71.權(quán)利要求69的方法，其中放射性核素用同位素檢測器進行檢測，或者用單光子發(fā)射計算機斷層掃描或正電子發(fā)射斷層掃描來成像。72.權(quán)利要求69的方法，其中所述疾病是癌癥，而且笫一前體與腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合。73.權(quán)利要求69的方法，其中所述半抗原與磁共振成像(MRI)造影劑綴合，通過MRI檢測與二元復(fù)合物結(jié)合的半抗原。74.權(quán)利要求69的方法，其中所述半抗原與超聲成像增強劑綴合，通過超聲成像檢測與二元復(fù)合物結(jié)合的半抗原。75.權(quán)利要求74的方法，其中所述超聲成像增強劑是脂質(zhì)體。76.權(quán)利要求69的方法，其中第一前體或第二前體具有針對CD19、CD20、CD22或IL-17的結(jié)合親和性。77.權(quán)利要求69的方法，所述方法還包括采用體內(nèi)內(nèi)窺鏡檢查、手術(shù)中檢查或者手術(shù)中檢查及治療，來檢測結(jié)合半抗原。78.—種體外診斷的方法，所述方法包括a)獲得包含同型二聚體的二元復(fù)合物，所述同型二聚體的每個第一單體含有與第一前體連接的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域(DDD),所述二元復(fù)合物還包含第二單體，第二單體含有與笫二前體連接的錨定結(jié)構(gòu)域(AD)，AD與DDD共價連接，其中第一前體與疾病相關(guān)抗原結(jié)合，第二前體與診斷用半抗原結(jié)合；b)將所述復(fù)合物給予來自懷疑患有疾病的患者的樣品；c)給予能結(jié)合所述二元復(fù)合物的診斷用半抗原；和d)檢測與所述二元復(fù)合物結(jié)合的半抗原的存在；其中所述半抗原與所述樣品結(jié)合，即診斷所述患者患有所述疾病。79.—種診斷疾病的方法，所述方法包括a)獲得包含同型二聚體的二元復(fù)合物，所述同型二聚體的每個第一單體含有與第一前體連接的二聚化和?？拷Y(jié)構(gòu)域(DDD)，所述二元復(fù)合物還包含第二單體，第二單體含有與第二前體連接的錨定結(jié)構(gòu)域(AD),AD與DDD共價連接，其中第一前體與疾病相關(guān)抗原結(jié)合，第二前體包含可檢測部分；b)將所述復(fù)合物給予來自懷疑患有疾病的患者；和c)檢測所述診斷部分的存在；其中所述診斷部分定位于疾病相關(guān)組織，即i貪斷所述患者患有所述疾病。全文摘要本發(fā)明涉及針對穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)(stablytetheredstructure)的方法和組合物，所述穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)具有明確的組成及多功能性和/或結(jié)合特異性。具體的實施方案涉及包含第一單體的同型二聚體和第二單體的穩(wěn)定束縛結(jié)構(gòu)，其中第一單體包含與第一前體連接的二聚化和停靠結(jié)構(gòu)域(dimerizationanddockingdomain)，第二單體包含與第二前體連接的錨定結(jié)構(gòu)域。第一前體和第二前體實際上可以是任何分子或結(jié)構(gòu)，例如抗體、抗體片段、抗體類似物或模擬物、適體、結(jié)合肽、結(jié)合蛋白的片段、蛋白質(zhì)或其它分子的已知配體、酶、可檢測標記或標簽、治療藥、毒素、藥物、細胞因子、白介素、干擾素、放射性同位素、蛋白質(zhì)、肽、肽模擬物、多核苷酸、RNAi、寡糖、天然或合成聚合物、納米粒、量子點(quantumdot)、有機或無機化合物，等等。本文所公開的方法和組合物提供以簡單易純化方式獲得任何二元化合物(與任何單體化合物相連接)或者任何三元化合物。文檔編號C07K2/00GK101583376SQ200680019839公開日2009年11月18日申請日期2006年3月29日優(yōu)先權(quán)日2005年4月6日發(fā)明者D·M·戈登伯格,E·A·羅西,H·C·錢,W·J·麥布賴德申請人:Ibc藥品公司