專利名稱：：血小板反應(yīng)蛋白-1的衍生肽以及治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用基質(zhì)細(xì)胞蛋白(matricellularprotein)血小板反應(yīng)蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)及相關(guān)組合物的治療，其用于穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，由此降低導(dǎo)致如心肌梗死、中風(fēng)和急性肢體缺血的斑塊破裂事件的發(fā)生。此外，本發(fā)明涉及用于在多種情況下(包括上述疾病狀態(tài))穩(wěn)定斑塊的多種肽，包括某些合成肽。
背景技術(shù)：
：可危及生命的動(dòng)脈粥樣硬化并發(fā)癥如急性心肌梗死和中風(fēng)是由誘發(fā)局部血管炎癥的膽固醇及其氧化磷脂的長(zhǎng)期沉積所引起[1。動(dòng)脈壁中的動(dòng)脈粥樣硬化病變部分地通過(guò)其細(xì)胞與胞外基質(zhì)(ECM)組分之間的相互作用而形成和發(fā)展[1,2]。發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，血管壁的細(xì)胞組分及ECM組分均發(fā)生改變。公認(rèn)ECM是影響動(dòng)脈粥樣硬化病變內(nèi)細(xì)胞行為的細(xì)胞結(jié)合蛋白及生長(zhǎng)因子庫(kù)[3,4。對(duì)這些過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)可能進(jìn)而對(duì)細(xì)胞-細(xì)胞以及細(xì)胞-ECM相互作用^f直接影響，這又可能進(jìn)而影響動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的表型，因?yàn)檫@可能涉及其破裂傾向以及后繼的下游事件，如心肌梗死和中風(fēng)。為細(xì)胞提供關(guān)于其環(huán)境的特定背景(contexual)信息的ECM次要蛋白組分已命名為"基質(zhì)細(xì)胞"蛋白[4]?；|(zhì)細(xì)胞蛋白與其他ECM組分、多種特異性細(xì)胞表面受體以及生長(zhǎng)因子相互作用，以調(diào)節(jié)細(xì)胞-基質(zhì)相互作用。這些蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，但是看來(lái)并不像其他ECM組分如原纖維、膠原和彈性蛋白那樣直接影響結(jié)構(gòu)的組織或物理特性[5。這些蛋白質(zhì)在細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞表面之間的界面處發(fā)揮功能，以調(diào)節(jié)細(xì)胞行為。此外，結(jié)構(gòu)蛋白對(duì)正常的血管發(fā)育具有關(guān)鍵作用，然而基質(zhì)細(xì)胞蛋白在成人血管中卻僅在受到損傷時(shí)表達(dá)[6。特別地，這些細(xì)胞的主要功能似乎是在組織修復(fù)中，并發(fā)揮背景作用，以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞-基質(zhì)相互作用來(lái)影響細(xì)胞功能。因此，在種系中定向破壞結(jié)構(gòu)性ECM蛋白導(dǎo)致嚴(yán)重或致死的表型，然而敲除編碼基質(zhì)細(xì)胞蛋白的基因卻產(chǎn)生表觀正?；蜉p微變化的表型[7-1。TSP-1是具有多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的原型基質(zhì)細(xì)胞蛋白[3,12。TSP-1在受到損傷時(shí)被誘導(dǎo)。該蛋白無(wú)效突變的純合小鼠沒(méi)有顯著的發(fā)育缺陷；這些小鼠中主要的表型是肺中的急性和機(jī)化性肺炎斑。然而，在多種疾病模型中，這些小鼠產(chǎn)生明顯的表型[IO。例如，在創(chuàng)傷修復(fù)模型中，TSP-1缺乏與炎性細(xì)胞應(yīng)答的改變以及創(chuàng)傷愈合延遲有關(guān)。其他研究已經(jīng)顯示TSP-1抑制血管發(fā)生[13-19]。因此，在瘤性細(xì)胞中定向表達(dá)TSP-1具有臨床意義，其改良形式目前正接受評(píng)估用于II期臨床試驗(yàn)[20。就冠心病而言，最近的相關(guān)性研究和描述性研究提出，TSP-1在動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死中具有作用(盡管尚不明確)[21,22]。首先，病例對(duì)照的遺傳變異研究提出，該基因中的錯(cuò)義"突變"與動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗死二者風(fēng)險(xiǎn)的提高相關(guān)[211。其次，使用人類樣品的病理學(xué)研究顯示，TSP-1在動(dòng)脈粥樣硬化病變中存在，而在天然血管壁中則不然[23,24。然而，目前動(dòng)脈粥樣硬化表型的斑塊內(nèi)TSP-1表達(dá)的意義仍然未知。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供利用TSP-1和相關(guān)組合物穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和降低動(dòng)脈粥樣硬化病變破裂傾向(可以在任何血管床中，例如冠脈、腦部或外周四肢)的方法。本發(fā)明還提供利用TSP-1和與TSP-1有關(guān)的相關(guān)肽(包括某些合成肽)的組合物。這些肽在多種情況下(包括疾病狀態(tài)，如心肌梗死、中風(fēng)和急性肢體缺血)具有穩(wěn)定斑塊的效用。這些肽中的一些包含與調(diào)節(jié)如TGF-pi和MMP-9活性的TSP-1活性位點(diǎn)相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供已發(fā)現(xiàn)影響MMP-9活化的肽序列(基于TSP-1)。我們推測(cè)，其活性機(jī)制是通過(guò)TSP-1上獨(dú)特的(52整合素結(jié)合位點(diǎn)，它與MMP-9結(jié)合動(dòng)脈粥樣硬化病變中白細(xì)胞(主要是單核細(xì)胞)的能力竟?fàn)?。此外，在某些?shí)施方案中，本發(fā)明提供已知調(diào)節(jié)TGF-pl活性的基于TSP-1中序列的肽序列。這些序列可用于穩(wěn)定斑塊。最后，我們提供基于上文討論的活性位點(diǎn)的多種特定的合成肽，它們?cè)隗w內(nèi)模仿TSP-1的TGF-pi和MMP-9活性及其斑塊穩(wěn)定效應(yīng)。圖1顯示可能與動(dòng)脈粥樣硬化病變的形成直接相關(guān)的多個(gè)TSP-1細(xì)胞及細(xì)胞因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域。圖2顯示TSR-1和TSP-1中的兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域中發(fā)生的相關(guān)突變。(A)在TSR-l和TSR-2中有兩個(gè)推測(cè)的p2整合素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。注意這兩個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域與兩個(gè)TGF-pi結(jié)合結(jié)構(gòu)域相鄰(并且有一個(gè)氨基酸的重疊)。我們突變了如方框中所示的兩個(gè)DxGW基序。(B)我們使用小鼠巨噬細(xì)胞系(Raw)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染發(fā)現(xiàn)TSP-1降低MMP-9活性，p<0.05(活性MMP-9/總MMP-9ELISA)。TSP突變體DM和Mutl(后者程度稍低)消除了這種效應(yīng)。(C)我們使用同一細(xì)胞體系觀察到TSP-1提高TGF-pi活性，p<0.05(使用細(xì)胞裂解液測(cè)量由TGF-pi啟動(dòng)子應(yīng)答元件誘導(dǎo)的螢光素酶活性[39])。TSP-1突變體Mutl和Mut2均可消除這種效應(yīng)。綜上所述，在這種細(xì)胞測(cè)定系統(tǒng)中，看來(lái)TSR-1和TSR-2中的DxGW基序介導(dǎo)TSP-1在TGF-卩1激活和MMP-9抑制上的效應(yīng)。圖3顯示TSP-1缺乏在動(dòng)脈粥樣硬化病變上的組織學(xué)特征。(A)蘇木精和伊紅染色的主動(dòng)脈瓣前尖(aorticcusp)切片。右側(cè)的柱狀圖代表病變面積(內(nèi)膜)。沒(méi)有檢測(cè)到病變的變化。(B)Moma，2抗體染色(綴合了PE，代表紅色熒光)顯示在TSP-1缺陷小鼠中主動(dòng)脈瓣前尖中的巨噬細(xì)胞增加(p<0.01)。(C)與巨噬細(xì)胞的增加一致，Red-O染色顯示在TSP-1缺陷小鼠中病變內(nèi)的脂質(zhì)沉積增加(即泡沫細(xì)胞，p<0.05)。(D)平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白抗體染色(綴合FITC，顯示為綠色熒光)。在內(nèi)膜病變中無(wú)平滑肌細(xì)胞(smoothmusclecell,smc)染色，中膜內(nèi)的總smc含量在兩組之間沒(méi)有變化。(E)主動(dòng)脈瓣前尖病變內(nèi)膠原的苦味酸天狼猩紅極化染色揭示膠原損失(減弱的黃-紅染色)(p<0.01)。注意在兩個(gè)小鼠林系中在尖部和瓣葉周圍均有強(qiáng)烈(黃-紅)染色。但在TSP敲除小鼠中在病變內(nèi)(以箭頭指出)有減弱的染色。(F)彈性蛋白的Verhoeff染色顯示，在TSP-1缺乏的病變發(fā)生區(qū)域的中層和內(nèi)膜部分中彈性蛋白(黑-藍(lán)染色)的喪失增加(p<0.05)。圖4顯示來(lái)自ApoE-/-TSP-/-(n=3只小鼠)和ApoE-A小鼠(n=3只小鼠)主動(dòng)脈弓組織裂解液的TGF-Belisa結(jié)果。兩組小鼠之間在總TGF-Bl水平上沒(méi)有差異，但在ApoE-/-TSP-/J、鼠主動(dòng)脈中活性TGF-Bl的水平顯著降低(p<0.05)。圖5顯示來(lái)自ApoE-/-TSP-/-(n=3只小鼠)和ApoE-A小鼠(n=3只小鼠)主動(dòng)脈弓組織裂解液的MMP-9western印跡結(jié)果。每個(gè)泳道4戈表單個(gè)小鼠。在TSP-A小鼠中Pro-MMP9(105kb)和活性MMP-9(95kb)條帶均增加。圖6顯示粘附測(cè)定的結(jié)果，其中孔分別用TSP-1(40pg/ml)、BSA(5%)或纖連蛋白(O.l^g/ml)預(yù)先包被。對(duì)于肽實(shí)驗(yàn)，在引入TSP畫(huà)l孔之前將懸浮細(xì)胞與各個(gè)肽(0.01M)混合30分鐘。圖7展示了TSP-1和Pro-MMP9竟?fàn)幗Y(jié)合巨噬細(xì)胞上aM|52整合素位點(diǎn)的機(jī)制(A)。TSP-1增加時(shí)，TSP-1結(jié)合提高，MMP-9激活降低，TGF-pi激活提高(B)。在proMMP-9增加的情況下，MMP-9結(jié)合提高，TSP-1介導(dǎo)的TGF-pi激活降低，MMP-9激活提高(C)。發(fā)明詳述為了便于回顧本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案，并且了解產(chǎn)生和使用本發(fā)明中所用的多種要素和組分，本發(fā)明說(shuō)明書(shū)中使用的以下術(shù)語(yǔ)具有以下含義。定義治療病毒感染的方法在本文中包括"預(yù)防性"治療或"治療性"治療。"預(yù)防性"治療是對(duì)未顯示疾病體征或顯示疾病早期體征的受試者施用的治療，用于降低發(fā)生該疾病相關(guān)病理情況的風(fēng)險(xiǎn)。本文使用的術(shù)語(yǔ)"治療性"指對(duì)顯示病理體征的受試者施用的治療，用于減輕或消除這些特征。本文使用的術(shù)語(yǔ)"治療有效量，，指足以對(duì)施用化合物的受試者提供有益效果的該化合物的量。有益效果指穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。本文使用的術(shù)語(yǔ)"肽"、"多肽"和"蛋白質(zhì)"可互換使用，表示以酰胺鍵共價(jià)連接的至少兩個(gè)氨基酸的序列聚合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)"同源"指兩個(gè)肽之間的氨基酸序列相似性。當(dāng)兩個(gè)肽中的氨基酸位置被相同氨基酸占據(jù)時(shí)，它們?cè)谠撐恢蒙暇褪峭吹摹Ｒ虼?基本同源"指大部分(但不完全)同源，并保留其同源序列的多數(shù)活性或全部活性的氨基酸序列。本文使用的術(shù)語(yǔ)"基本同源"指序列與參照肽至少80%相同，優(yōu)選至少卯％、更優(yōu)選98。/。的同源性。多肽在本文中以氨基酸序列公開(kāi)。這些序列以從氨基端到羧基端的方向從左向右書(shū)寫(xiě)。才艮據(jù)標(biāo)準(zhǔn)命名法，以下文指出的單字母代碼或三字母代碼命名氨基酸序列?？梢栽诒景l(fā)明多肽的結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生修飾和改變，但仍獲得具有TSP-1肽樣特征的分子。例如，可以將序列中的某些氨基酸替換為其他氨基酸，而沒(méi)有明顯的肽活性損失。限定多肽生物功能活性的是該多肽的相互作用能力和性質(zhì)，因此可以在多肽序列(或者當(dāng)然也可以是其背后的DNA一SJ代務(wù)ARNDCO-EGHILKMFPSTWYV字單碼代a母^字A￡犯&.sGHnLLMPPSTO-s基殘胺酸酸胺酸酸酸酸酸酸酰氣氣酰酸酸酸氣酸酸氣氨酸酸lli亂氣冬冬胱l氨氣l亮氣l疏丙氣t氨丙眷天天半n甘組異亮賴甲苯脯絲酸酸酸氛氛氨色酪纈編碼序列)中產(chǎn)生某些氨基酸序列替換，但卻仍然獲得具有相似特性的多肽。在產(chǎn)生這些改變時(shí)，可以考慮氨基酸的水合指數(shù)(hydropathicindex)。7JC合氨基酸指數(shù)在賦予多肽相互作用生物功能上的重要性是本領(lǐng)域普遍了解的(Kyte，J.和R.RDoolittle1982)。已知某些氨基酸可用于替換7jc合指數(shù)或分?jǐn)?shù)相似的其他氨基酸，而仍然得到生物活性相似的多肽。每種氨基酸都已經(jīng)基于其疏水性和電荷特征給出了水合指數(shù)。這些指數(shù)是異亮氨酸(+4.5);纈氨酸(+4.2);亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);蘇氨酸(-0.7);絲氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);組氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);賴氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。相信氨基酸的相對(duì)7K合特征決定所得到多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，二級(jí)結(jié)構(gòu)又進(jìn)而限定了多肽與其他分子(如酶、底物、受體、抗體、抗原等)的相互作用。本領(lǐng)域眾所周知，氨基酸可以替換為7jC合指數(shù)相似的另一氨基酸，而仍然獲得在功能上等價(jià)的多肽。在這樣的改變中，優(yōu)選7jC合指數(shù)在+-2以內(nèi)的氨基酸替換，特別優(yōu)選十-1以內(nèi)的替換，甚至更優(yōu)選+-0.5以內(nèi)的替換。也可以基于親水性產(chǎn)生相似氨基酸的替換，特別是其產(chǎn)生的生物功能性等價(jià)多肽或肽意圖用于免疫學(xué)實(shí)施方案的情況下。以參考方式并入本文的U.S.專利No.4,554,101指出，多肽的最高局部平均親水性(由其臨近氨基酸的親水性決定)與其免疫原性和抗原性相關(guān)，即與多肽的生物特性相關(guān)。U.S.專利No.4,554,101詳細(xì)描述了對(duì)氨基酸殘基給出以下親水性值精氨酸(+3.0);賴氨酸(+3.0);天冬氨酸(+3.0.+-.1);谷氨酸(+3.0.+-.1);絲氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2);甘氨酸(0);脯氨酸(-0.5.+-.1);蘇氨酸(-0.4);丙氨酸(-0.5);組氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);纈氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);異亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。應(yīng)該理解，氨基酸可以用于替換親水性值相似的另一氨基酸，并仍然獲得生物學(xué)等價(jià)(特別是免疫學(xué)等價(jià))的多肽。在這樣的改變中，優(yōu)選親水性指數(shù)在+-2以內(nèi)的氨基酸替換，特別優(yōu)選十-1以內(nèi)的替換，甚至更優(yōu)選+-0.5以內(nèi)的替換。如前述，氨基酸替換因此通常基于氨基酸側(cè)鏈取代基的相對(duì)相似性，例如其疏水性、親水性、電荷、大小等?？紤]多種前述特征的示例性替換為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，包括精氨酸和賴氨酸;谷氨酸和天冬氨酸；絲氨酸和蘇氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺以及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸(見(jiàn)下文表l)。因此本發(fā)明考慮了如下文公開(kāi)的功能等價(jià)物或生物學(xué)等價(jià)物。表l原妙fl泉條例教瞽換<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>多肽的生物學(xué)等價(jià)物或功能等價(jià)物也可以使用位點(diǎn)特異性誘變來(lái)制備。位點(diǎn)特異性誘變是可用于制備源自其序列的第二代多肽或者生物功能等價(jià)多肽或肽的技術(shù)，這通過(guò)特異性誘變其背后的DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)。如上文所指出，在期望進(jìn)行氨基酸替換時(shí)，這樣的改變可能是理想的。該技術(shù)還提供制備和測(cè)試序列變體的便捷能力，例如通過(guò)在DNA中引入一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列改變來(lái)納入一個(gè)或多個(gè)前述的考慮因素。位點(diǎn)特異性誘變?cè)试S通過(guò)使用以下材料產(chǎn)生突變體編碼含有所需突變的DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足夠數(shù)目的臨近核苦酸，以提供具有足夠大小和序列復(fù)雜性的引物序列，從而在所跨越的缺失連接處的兩側(cè)均形成穩(wěn)定雙鏈體?？梢酝ㄟ^(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)在本發(fā)明TSP-l肽中加入或缺失氨基酸殘基，而不改變肽的功能性。例如，可以移除TSP-1肽的末端部分以產(chǎn)生截短肽，然而，所述截短肽保留本發(fā)明TSP-1肽的功能活性，包括通過(guò)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)TGF-pl或MMP-9,以及穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。本發(fā)明的多肽通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。這些技術(shù)包括但不僅限于從已知含有該多肽的組織中分離和純化、使用轉(zhuǎn)化細(xì)胞由編碼這些多肽的克隆DNA進(jìn)行表達(dá)或者使用合成肽產(chǎn)生系統(tǒng)。TSP-1結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域及其基質(zhì)結(jié)合配偶體TSP-1是鏈分子量為150kda的三聚體。該蛋白的每個(gè)亞基由若干結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域組成[12。這些結(jié)構(gòu)域可以寬泛地定義為氨基端結(jié)構(gòu)域、前膠原結(jié)構(gòu)域、l型、2型和3型重復(fù)序列和羧基端結(jié)構(gòu)域[25，26。已經(jīng)顯示每個(gè)結(jié)構(gòu)域在大量細(xì)胞功能的改變中都是重要的，如圖l所示。此外，對(duì)TSP-1定義了特異性配體結(jié)合位點(diǎn)(圖1)。它們包括脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)、CD36、卩3整合素以及整合素相關(guān)蛋白(IAP)和細(xì)胞因子，包括TGF-pi和PDGF[3，12，27，28]。通過(guò)其多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，TSP-1看來(lái)是在細(xì)胞表面發(fā)揮功能，使膜蛋白和細(xì)胞因子聯(lián)系在一起。TSP-1以這種方式影響細(xì)胞表型，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄。由于每種細(xì)胞表達(dá)不同的受體組成成分，因此TSP-1所形成復(fù)合物的組成及其各自的細(xì)胞應(yīng)答隨每種細(xì)胞類型變化。例如，TSP-1增強(qiáng)平滑肌細(xì)胞的遷移，但抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移[29-31。在目前研究的多數(shù)器官系統(tǒng)中，TSP-1生物學(xué)情況的主要一部分是由于其胞外激活TGF-pi[10,13-15。具體地，已經(jīng)顯示TSP-1的喪失降低TGF-pi活性并模擬各個(gè)器官系統(tǒng)中的TGF-pi喪失表型。例如，在TSP-1敲除小鼠研究中，TSP-1的喪失引起與TGF-pi敲除小鼠中所見(jiàn)方式類似的局部肺泡炎癥和慢性肺炎[IO。此外，用已顯示足以激活TGF-pi的TSP-1短肽片段(對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基430—433的KRFK，參考圖2)進(jìn)行生物學(xué)互補(bǔ)可挽回這一表型一一提示TGF-卩1的激活是這種情況下決定表型變化的關(guān)鍵細(xì)胞過(guò)程13,15]。TSP-1還能調(diào)節(jié)胞外蛋白酶包括基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)的活性[32,33。在腫瘤血管發(fā)生的情況中，TSP-1的靼向表達(dá)與MMP-9活性降低相關(guān)，這與其抗血管發(fā)生特征一致。MMP-2和MMP-9均已顯示與TSP-1結(jié)合[33。然而，TSP-1與MMP的結(jié)合位點(diǎn)尚未確定，其調(diào)節(jié)這些蛋白酶活性的機(jī)制也未確定。有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，TGF-pi和MMP-9在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊表型中均發(fā)揮作用，包括(但不僅限于)基質(zhì)轉(zhuǎn)換、白細(xì)胞募集和平滑肌細(xì)胞遷移。此外，如前述，已顯示TSP-1應(yīng)答于組織損傷而調(diào)節(jié)這些配體中每一種的活性。我們確定了TSP-1在小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中具有斑塊穩(wěn)定作用。此外，我們鑒定了TSP-1中調(diào)節(jié)這些涉及TGF-pi和MMP-9的活性的活性肽結(jié)構(gòu)域。最后，我們?cè)O(shè)計(jì)了含有基于這些活性結(jié)構(gòu)域的肽序列的肽，并且能夠顯示代表性合成肽在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中模擬體內(nèi)TSP-1的效應(yīng)。TSP-1缺乏改變動(dòng)脈粥樣硬化斑塊我們已經(jīng)能夠顯示，TSP-1細(xì)胞外基質(zhì)蛋白具有斑塊穩(wěn)定效應(yīng)。我們產(chǎn)生了雙敲除18-/-人？0￡-/-小鼠，并檢查了TSP-1缺乏在病變的形成和組成中的作用。在喂備24周狗食(3%脂肪)后，處死TSP-/-ApoE-/-小鼠和ApoE一對(duì)照。在TSP敲除小鼠和對(duì)照動(dòng)物之間的體重、總膽固醇、HDL膽固醇和甘油三酯沒(méi)有顯著差異。使用H&E染色對(duì)主動(dòng)脈竇中動(dòng)脈粥樣硬化病變程度的表征顯示了兩組中相似的病變形成(TSP敲除小鼠的701,000nm2±95，000^1112相比于對(duì)照小鼠的724,000nm2±103,000nm2)。我們對(duì)主動(dòng)脈竇的病變組成進(jìn)行了詳細(xì)形態(tài)學(xué)評(píng)估(圖3)。TSP-1的喪失對(duì)內(nèi)膜和中膜中的病變形態(tài)均有顯著影響。具體地，在TSP敲除小鼠中，(1)內(nèi)膜病變中炎癥(巨噬細(xì)胞)增加(2)內(nèi)膜病變內(nèi)的脂質(zhì)沉積提高(3)病變內(nèi)的基質(zhì)(以膠原和彈性蛋白衡量)減少(4)中膜膨脹，并伴隨著中膜喪失，通過(guò)這些小鼠中膜區(qū)膠原和彈性蛋白含量的降低證明和(5)中膜內(nèi)總的平滑肌細(xì)胞含量沒(méi)有變化。綜上所述，這些結(jié)果提示TSP-1缺乏改變斑塊內(nèi)炎癥和纖維化的平衡。這引起細(xì)胞外基質(zhì)含量降低的炎性斑塊表型。我們推測(cè)，在這種情況下TSP-1益處的機(jī)理主要(但不僅限于)在于兩點(diǎn)(a)在TSP-1不存在時(shí)動(dòng)脈粥樣硬化病變內(nèi)TGF-pi激活的降低，(b)在TSP-1不存在時(shí)MMP-9激活的提高。在18-/-人？0￡-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變內(nèi)TGF-pi的激活降低已經(jīng)討論過(guò)，在體內(nèi)組織損傷中TSP-1的其他研究中，表型所見(jiàn)大部分是由于TSP-1在損傷位點(diǎn)局部激活TGF-pi的能力。此外，已經(jīng)顯示中和TGF-pi活性可在動(dòng)脈粥樣硬化病變中增加炎癥并減少基質(zhì)，與我們?cè)?8-/-入口0￡-/-小鼠中的初步發(fā)現(xiàn)相似[34,351。因此，我們?cè)趤?lái)自18-/40￡-/-動(dòng)物的組織中測(cè)量了總體及活性TGF-pi水平。我們將來(lái)自主動(dòng)脈弓(已知易于形成動(dòng)脈粥樣硬化的區(qū)域)的樣品勻漿，并將裂解液用于ELISA測(cè)定。在這些小鼠中總體(潛伏及活性)TGF-卩l(xiāng)水平?jīng)]有變化，但在TSP-/-ApoE-/J、鼠中活性TGF-pi水平降低(圖4)。與使用動(dòng)脈粥樣硬化病變裂解液的結(jié)果相反，在TSP-/-ApoE-A和ApoE-Z-小鼠之間活性TGF-pi的全身(血清)水平無(wú)差異(225±87pg/ml與186±138pg/ml)。這些數(shù)據(jù)提示TSP-1的喪失引起血管壁內(nèi)TGF-pi激活的局部降低。18卩-/4口0￡-/-小鼠中提高的MMP-9激活免疫沉淀實(shí)驗(yàn)顯示明膠酶-B(MMP-9)與TSP-1結(jié)合[33。此外已經(jīng)顯示TSP-1能控制pro-MMP-9向活性形式的轉(zhuǎn)化[32]。然而，TSP-1對(duì)MMP-9的這種翻譯后調(diào)節(jié)的機(jī)制尚未確定。由于TSP-/-ApoE-/」J、鼠病變內(nèi)的基質(zhì)顯著喪失(圖3e)，我們使用來(lái)自主動(dòng)脈弓勻漿物的組織裂解液在western印跡中檢查了MMP-9水平。在這些小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化病變中總體及活性MMP-9的水平均有所提高，如圖5所示。這些結(jié)果表明，TSP-1的喪失引起動(dòng)脈粥樣硬化病變內(nèi)MMP-9激活的局部提高，這與TSP-1對(duì)MMP-9活性的潛在抑制效應(yīng)一致。在apoE敲除小鼠中進(jìn)行的MMP-9缺乏研究顯示，MMP-9的喪失與巨噬細(xì)胞數(shù)目的降低和膠原合成的提高相關(guān)[36。作為對(duì)我們的發(fā)現(xiàn)的進(jìn)一步補(bǔ)充，我們開(kāi)始建立TSP-l影響TGF-pi和MMP-9活性的"活性"位點(diǎn)。我們推測(cè)，TSP-1調(diào)節(jié)這些配體的胞外機(jī)制是通過(guò)斑塊內(nèi)的細(xì)胞表面相互作用實(shí)現(xiàn)的，我們利用了使用鼠巨噬細(xì)胞(RAW細(xì)胞)的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，因?yàn)樗鼈兪俏覀兊捏w內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊模型中的優(yōu)勢(shì)細(xì)胞類型。我們鑒定了TSP-1調(diào)節(jié)TGF-pi活性(先前報(bào)道的)的活性位點(diǎn)以及影響MMP-9活性(我們確定的)的位點(diǎn)。TSP-1通過(guò)其推測(cè)的P2整合素結(jié)合基序D(D/E)(G/L)W與巨噬細(xì)胞結(jié)合TSP-1具有用于結(jié)合巨噬細(xì)胞的多個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)，包括CD44、IAP和CD36(圖1)。然而，在TSP-1中沒(méi)有描述過(guò)先前已確定的P2整合素結(jié)合基序。使用噬菌體序列測(cè)定的在先研究報(bào)道了，肽基序D(D/E)(G/L)W與pro-MMP-9竟?fàn)幗Y(jié)合p2整合素[40。通過(guò)對(duì)完整TSP-1肽序列的序列搜索，我們確定TSP-1具有兩個(gè)這樣的推測(cè)的P2整合素結(jié)合位點(diǎn)一個(gè)在TSR-1中(DDGW,完全一致)，另一個(gè)在TSR-2中(DGGW，近似一致，2位進(jìn)行了替換)，如圖2所示。我們使用細(xì)胞粘附測(cè)定來(lái)評(píng)估TSP-1與巨噬細(xì)胞的結(jié)合(圖6)。使用這種測(cè)定，我們能夠顯示D-Xaa-G-W基序?qū)SP-1與巨噬細(xì)胞粘附的影響。具體地，我們能夠顯示，肽序列DDGW足以抑制細(xì)胞對(duì)TSP-1的粘附。通過(guò)肽序列DDGA不干擾巨噬細(xì)胞與TSP-1的結(jié)合以及序列ADGW的部分干擾顯示了這種竟?fàn)幍奶禺愋?。TSP-1存在下巨噬細(xì)胞對(duì)proMMP-9激活的降低是通過(guò)TSR-1中的DDGW基序介導(dǎo)對(duì)TSP-1調(diào)節(jié)MMP-9的機(jī)制仍然知之甚少。然而已經(jīng)顯示proMMP-9通過(guò)其D(D/E)(L/G)W基序與細(xì)胞表面aMp2和aLp2整合素結(jié)合，引起其激活[37,38。我們已經(jīng)顯示TSP-1通過(guò)同一基序與巨噬細(xì)胞結(jié)合，我們推測(cè)TSP-1抑制MMP-9活性的一種潛在機(jī)制可能涉及通過(guò)竟?fàn)幗Y(jié)合從細(xì)胞表面上置換pro-MMP-9(圖7)。為了測(cè)試這種假說(shuō)，我們產(chǎn)生了涉及TSP-1中一種或兩種潛在P2整合素結(jié)合基序的多種TSP-1突變體(圖2)。用TSP-1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染RAW細(xì)胞(巨噬細(xì)胞系)降低了pro-MMP-9向活性形式的轉(zhuǎn)變。這種效應(yīng)可通過(guò)突變TSR-1基序來(lái)逆轉(zhuǎn)，但TSR-2基序的突變則并不盡然。這些結(jié)果證明了DxGW基序(特別是TSR-1中的)對(duì)于TSP-1可能通過(guò)與pro-MMP-9竟?fàn)幗Y(jié)合|52整合素來(lái)抑制MMP-9激活的重要性。TSR-2中WSPW基序的突變消除了TSP-1對(duì)TGF-pi的激活先前已顯示TSP-1中的WSxW基序?qū)τ赥GF-pi激活具有重要性。為了測(cè)試這種假說(shuō)，我們采取組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)證明TSP-1事實(shí)上在活化巨噬細(xì)胞存在下激活TGF-pi。此外，我們使用我們的突變體觀察到，TSR-2中的WSPW基序主要負(fù)責(zé)TSP-1對(duì)TGF-pi的激活?；谶@些數(shù)據(jù)，我們推測(cè)TSR-1內(nèi)的DDGW基序與白細(xì)胞上的aM|32整合素結(jié)合，并通過(guò)這種結(jié)合影響細(xì)胞表面介導(dǎo)的MMP-9活性。此外，TSR-2中的WSPW基序?qū)τ赥GF-pi激活具有重要性。這樣，我們鑒定了TSP-1中對(duì)于(1)降低MMP-9活性以及(2)激活TGF-pi具有重要性的兩個(gè)活性位點(diǎn)。使用這一知識(shí)，可以設(shè)計(jì)并合成多種具有斑塊穩(wěn)定特性的肽。我們?cè)O(shè)計(jì)并合成了組合這兩個(gè)活性位點(diǎn)的代表性合成序列KRFKQDDGWSPWSEW。我們推測(cè)，組合這兩個(gè)TSP-1功能關(guān)鍵活性位點(diǎn)的這種肽片段可能與完整蛋白一樣在體內(nèi)發(fā)揮斑塊穩(wěn)定的有益效果。為了測(cè)試這一點(diǎn)，我們首先測(cè)試并證實(shí)了這種肽在組織培養(yǎng)物中(1)激活TGF-pi和(2)抑制MMP-9激活的能力。我們接著使用alzet輸液泵以8-25ng/天的濃度對(duì)TSP-A小鼠注射這種肽5周，并且我們能夠顯示這種肽足以挽回TSP-/-ApoE一小鼠的表型(巨噬細(xì)胞減少，病變中基質(zhì)增加)。此外，在apoE-Z-小鼠中，輸注這種肽也具有有益效果，證實(shí)了該化合物甚至在內(nèi)源性TSP-1存在下穩(wěn)定斑塊的能力。換言之，與未處理的TSP-A小鼠相比，(1)內(nèi)膜病變中炎癥(巨噬細(xì)胞)減少，(2)內(nèi)膜病變中脂質(zhì)沉積減少，和(3)病變中基質(zhì)(以膠原和彈性蛋白衡量)沉積增加?？傊覀兊慕Y(jié)果證明TSP-1(1)能對(duì)穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊具有有益效果，并且(2)組合TSP-1中其調(diào)節(jié)MMP-9和TGF-(31活性的重要活性位點(diǎn)的至少一種合成肽能夠在該疾病的小鼠模型中穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。一般而言，"被穩(wěn)定的斑塊"由病變位置處的有限炎癥和/或斑塊內(nèi)的顯著纖維化來(lái)證明。這些特征可以通過(guò)比較TSP-1缺陷型對(duì)照系統(tǒng)(例如前述TSP-A小鼠)來(lái)觀察。一般地，可以通過(guò)比較處理及未處理動(dòng)物中的纖維化和炎癥來(lái)鑒定凈皮穩(wěn)定的斑塊。斑塊內(nèi)纖維化與炎癥之間的平衡公認(rèn)是多種不同動(dòng)物模型中斑塊破裂傾向的代用標(biāo)志物[41-43。其他實(shí)施方案肽序列本發(fā)明提供多種新的肽。它們可包括多種結(jié)合結(jié)構(gòu)域和激活序列及其同系物中的一個(gè)或多個(gè)。具有結(jié)合或激活TGF-p和/或MMP-9的序列(結(jié)構(gòu)域)的肽。第1類。與TSP-1和/或MMP-9上發(fā)現(xiàn)的用于結(jié)合p2-整合素(特別是aM|52和aLp2-整合素)的結(jié)構(gòu)域相對(duì)應(yīng)的序列。這些序列提供與P2-整合素上MMP-9正常結(jié)合的位點(diǎn)相結(jié)合的結(jié)構(gòu)域?；蛘?，所述結(jié)構(gòu)域可以提供與p2-整合素上一些其他位置結(jié)合的位點(diǎn)，但這樣可阻斷天然MMP-9與(52-整合素的結(jié)合。多種序列中可包含這樣的結(jié)構(gòu)域。一些這樣的序列可見(jiàn)于天然MMP-9。其他這樣的序列可見(jiàn)于TSP-1，特別是在l型重復(fù)結(jié)構(gòu)域中。在一個(gè)實(shí)例中，該結(jié)構(gòu)域包含表示為D-Xaa-(L/G)-W、(D/E)-(D/E)-(G/L)-W或D-(D/E)-(L/G)-W的四氨基酸序列。這些序列的具體實(shí)例包括DDGW、DGGW和DELW。第2類。在本發(fā)明的新肽序列中可以提供的另一結(jié)構(gòu)域與天然TGF-P結(jié)合。某些這些序列可見(jiàn)于TSP-1的1型重復(fù)結(jié)構(gòu)域中。在一個(gè)具體實(shí)例中，所述序列包含W-S-Xaal-W-S-Xaa2-W。在一個(gè)具體實(shí)例中，Xaal為P或H，Xaa2為E或P。這些肽的非常具體的實(shí)例為WSPWSEW。第3類。在本發(fā)明的新肽中可以利用的其他序列包含激活TGF-p潛伏形式的氨基酸序列。一些這樣的序列可見(jiàn)于TSP-1的1型重復(fù)結(jié)構(gòu)域中。這些序列的實(shí)例包括KRFK和KRFKQ。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案，在本發(fā)明的新肽或肽組合中可以利用上述三類序列/結(jié)構(gòu)域的多種組合。在第一個(gè)實(shí)例中，所述肽(或包含肽組合的組合物)僅包含來(lái)自上述第l類的序列，即對(duì)應(yīng)于卩2-整合素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列。這樣的肽將不包含來(lái)自上述第2類和/或第3類的其他序列。在第二個(gè)實(shí)例中，所述肽(或包含肽組合的組合物)包含來(lái)自上述第l類和第2類的序列。換言之，單個(gè)肽序列(或包含肽組合的組合物)包含對(duì)應(yīng)于p2-整合素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的亞序列以及與TGF-p結(jié)合的不同亞序列。本發(fā)明的第三類肽(或包含肽組合的組合物)包含來(lái)自上述第l類和第3類的序列。換言之，這些肽(或包含肽組合的組合物)包含對(duì)應(yīng)于p2-整合素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的亞序列以及激活TGF-p的另一亞序列。本發(fā)明的另一類肽(或包含肽組合的組合物)包含來(lái)自上述第1類、第2類和第3類中每一種的組合。這些肽(或包含肽組合的組合物)將包含對(duì)應(yīng)于卩2-整合素結(jié)合結(jié)構(gòu)域的序列、TGF-p的結(jié)合位點(diǎn)以及將潛伏TGF-p轉(zhuǎn)化成活性TGF-(i的激活序列。注意在任何使用兩個(gè)或更多結(jié)合或激活結(jié)構(gòu)域的肽中，允許各個(gè)亞序列或結(jié)構(gòu)域之間存在一些重疊。例如，該肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸可由兩個(gè)或更多的結(jié)合或激活位點(diǎn)共享。在包括p2-整合素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和TGF-p結(jié)合結(jié)構(gòu)域的具體實(shí)例中，本發(fā)明的肽可以含有序列DGGWSPWSEW,其中第一個(gè)W(色氨酸)由兩個(gè)亞序列共享。如前述，已經(jīng)證實(shí)在穩(wěn)定斑塊中有活性的本發(fā)明一種具體肽含有序列KRFKQDDGWSPWSEW。序列中的某些殘基就保留活性而言比其他殘基更為重要。因此，這種序列的改變會(huì)保留活性。由于該序列相對(duì)短小，因此本領(lǐng)域技術(shù)人員無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)就可以容易地鑒定多種插入、缺失、替換和延伸。例如，可以對(duì)序列內(nèi)的個(gè)體氨基酸進(jìn)行多種替換。優(yōu)選地，這些替換使用總體上具有與堿基序列KRFKQDDGWSPWSEW中的氨基酸相同的大小和/或化學(xué)特性的氨基酸。以一種廣義形式表示，本發(fā)明的肽具有Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6國(guó)Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaal0-Xaall-Xaal2-Xaal3-Xaal4-Xaa15的形式。Xaal、Xaa2和Xaa4優(yōu)選為堿性非環(huán)狀氨基酸。實(shí)例包括R和K。Xaa3、Xaa9、Xaall、Xaal2和Xaal5優(yōu)選為中性、非極性、環(huán)狀的大氨基酸。它們包括F、W,并且可能還有P。Xaa5優(yōu)選為中性、極性、非環(huán)狀的大氨基酸。實(shí)例包括T、N和Q。Xaa6、Xaa7和Xaal4優(yōu)選為酸性氨基酸。該類別中天然存在氨基酸的具體實(shí)例為D和E。最后，Xaa8、XaalO和Xaal3優(yōu)選為中性、極性并且較小。這樣的氨基酸的天然存在實(shí)例為G、S和C。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，Xaa2為R。在另一具體實(shí)施方案中，Xaa6為D。在另一具體實(shí)施方案中，Xaa7為D。在另一具體實(shí)施方案中，Xaa9為W。在另一具體實(shí)施方案中，Xaal2為W。在另一具體實(shí)施方案中，Xaal5為W。在另一具體實(shí)施方案中，Xaa2為R，Xaa7為D,Xaa9為W。注意本發(fā)明的肽不僅限于包括20種天然存在氨基酸的殘基。某些普遍遇到的非天然氨基酸也可以摻入本發(fā)明的化合物中，例如脫氨酪氨酸(desTyr)、精胺(Agm)、n-甲酰色氨酸(f-Trp)、oc-氨基異丁酸(Aib)和肌氨酸(Sar)、statine、鳥(niǎo)氨酸(Orn)、高賴氨酸、高絲氨酸、高精氨酸、正亮氨酸(Nle)、正纈氨酸。本發(fā)明范圍內(nèi)的肽可通過(guò)以其他方式修飾所公開(kāi)序列、而保留所得化合物的活性來(lái)獲得。例如，盡管這些化合物中的氨基酸通常為天然的L光學(xué)異構(gòu)體形式，但其中一個(gè)或多個(gè)也可替換為光學(xué)異構(gòu)體D形式，或者可以在包含該肽的分子中提供D，L-外消旋混合物。此外，在本發(fā)明的化合物中可以存在或不存在二硫鍵，只要保持活性即可。所述肽中(特別是羧基或氨基酸端)包含的氨基酸殘基還可以通過(guò)曱基化、酰胺化、乙?；蛱鎿Q為其他化學(xué)基團(tuán)來(lái)進(jìn)行修飾，例如，所述化學(xué)基團(tuán)能改變所述化合物的循環(huán)半衰期、對(duì)蛋白酶的抗性以及溶解度，而不對(duì)其活性產(chǎn)生不利影響。任何上述肽均優(yōu)選包含至少7個(gè)氨基酸殘基。在其他實(shí)施方案中，所述肽包含約7個(gè)至25個(gè)殘基，約7個(gè)至20個(gè)殘基，約7個(gè)至14個(gè)殘基，約10個(gè)至12個(gè)殘基，約10個(gè)至25個(gè)殘基，約15個(gè)至25個(gè)殘基以及約15個(gè)至20個(gè)殘基。本發(fā)明的肽包含7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個(gè)氨基酸殘基。本發(fā)明限定基本支架的肽優(yōu)選設(shè)計(jì)為適當(dāng)?shù)乇┞兑粋€(gè)或多個(gè)上述結(jié)合和激活序列(第l、2、3類)，以用于與卩2-整合素/或TGF-p相互作用。本發(fā)明的化合物可以自身發(fā)生同聚作用(即(肽)n)，或者可以彼此發(fā)生雜聚作用(即肽l-肽2)。上述化合物也可以通過(guò)二石危鍵或其他方式環(huán)化。該化合物也可以綴合生物相容性分子，例如脂肪酸和/或聚乙二醇(PEG)。本發(fā)明范圍內(nèi)的肽可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的手段(如固相肽合成)化學(xué)合成。在其他實(shí)施方案中，可以通過(guò)表達(dá)按照熟知方法制備的重組DNA構(gòu)建體來(lái)產(chǎn)生選定的本發(fā)明化合物。化合物可以便利地通過(guò)手動(dòng)技術(shù)合成，或者按照生產(chǎn)商說(shuō)明手冊(cè)中的說(shuō)明使用例如可得自AppliedBiosystems(FosterCity,Calif.)的多種產(chǎn)品自動(dòng)化合成。肽合成領(lǐng)域的普通技術(shù)人員容易意識(shí)到，在本發(fā)明化合物的合成過(guò)程中，根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容構(gòu)建的中間體本身就是有用的化合物，因此在本發(fā)明的范圍內(nèi)。治療方法如前述，本發(fā)明的實(shí)施方案涉及使用TSP-1、其部分或相關(guān)肽(如上文指出的)進(jìn)行的治療方法。一般地，施用TSP-1和本發(fā)明的肽以穩(wěn)定動(dòng)脈壁上的斑塊。因此，它們可用于在患病動(dòng)物中穩(wěn)定斑塊的方法。這應(yīng)該與治療動(dòng)脈粥樣硬化的方法區(qū)分開(kāi)來(lái)。在某些實(shí)施方案中，可以施用本發(fā)明的新肽以實(shí)現(xiàn)除斑塊穩(wěn)定以外的其他結(jié)果。例如，含有上文第1類中所指出基序的合成肽(如含有D-Xaa-(L/G)-W的肽，例如DDGW、DGGW和DELW)可用于在體內(nèi)影響MMP-9活性。因此，這些肽可用于治療例如癌癥和血管發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，含有D-Xaa-(L/G)-W基序并可用于體內(nèi)治療的合成肽包含至少7個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選約7至20個(gè)殘基，并且在特定實(shí)施方案中包含約10至15個(gè)殘基。本發(fā)明提供含有有效量的TSP-1及本發(fā)明肽(包括其無(wú)毒的加成鹽、酰胺和酯)的組合物，其本身就有可能提供上述斑塊穩(wěn)定效應(yīng)。這樣的組合物還可以與生理上可耐受的液體、凝膠或固體溶劑、佐劑和賦形劑一起提供。這些組合物可以用與其他治療劑相似的方式施用于動(dòng)物用于獸醫(yī)用途(例如家畜)，以及在人中用于臨床用途。一般地，療效所需劑量的范圍為約1Hg至300mg/kg,更經(jīng)常為10jig至30mg/kg宿主體重?；蛘?，可以在延長(zhǎng)的時(shí)間(通常超過(guò)24小時(shí))中通過(guò)恒量輸注施用這些范圍內(nèi)的劑量，直至獲得所需的治療益處。這樣的組合物一般制備為液體溶液或懸液的注射劑；還可以制備為適于在注射前溶于或懸于液體中的固體形式。所述制劑還可以是經(jīng)乳化的?；钚猿煞纸?jīng)常與生理上可耐受并與該活性成分相容的稀釋劑或賦形劑混合。例如，合適的稀釋劑和賦形劑為水、鹽水、葡萄糖、甘油等及其組合。此外，必要時(shí)，所述組合物可含有少量輔助物質(zhì)，如濕潤(rùn)劑或乳化劑、穩(wěn)定劑或pH緩沖劑等。所述組合物一般通過(guò)注射(如皮下或靜脈內(nèi))腸胃外給藥。示于其他給藥模式的其他制劑包括栓劑、鼻內(nèi)氣霧劑以及在某些情況下為口服制劑。就栓劑而言，傳統(tǒng)粘合劑和賦形劑可包括如聚亞烷基二醇或甘油三酯，可以由含有0.5%至10%、優(yōu)選1%至2%活性成分的混合物形成這樣的栓劑?？诜苿┌ㄟ@些正常使用的賦形劑，例如藥物級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物采取溶液劑、懸劑、片劑、丸劑、膠嚢劑、持續(xù)釋放制劑或粉劑的形式，并含有10%至95%、優(yōu)選25%至70%的活性成分。這些口服制劑包括設(shè)計(jì)用于為肽提供保護(hù)直至其可被吸收的制劑。所述肽化合物可以以中性或鹽形式配制到所述組合物中?？伤幱脽o(wú)毒鹽包括酸加成鹽(與游離氨基形成)以及與無(wú)機(jī)酸如鹽酸或磷酸或者有機(jī)酸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等形成的鹽。與游離羧基形成的鹽可來(lái)自無(wú)機(jī)堿如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水、氫氧化鈣、或氫氧化鐵，或者有機(jī)堿如異丙胺、三曱胺、2-乙基氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。結(jié)論應(yīng)該理解，上述描述旨在說(shuō)明而非限制。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種實(shí)施方案和修"沛，而不背離本發(fā)明的范圍和精神。因此，本發(fā)明范圍的確定不應(yīng)參考上文描述中的具體實(shí)施方案，而是應(yīng)該參考這些實(shí)施方案的等價(jià)方式的完整范圍。本文提到的所有出版物均出于描述和7>開(kāi)可能與本發(fā)明相關(guān)的生物機(jī)制、治療、方法和概念的目的而引用。本文中的內(nèi)容均不應(yīng)解釋為同意這些參考文獻(xiàn)構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。除非另外指明，對(duì)任何目的而言本文中的每件參考文獻(xiàn)均以其整體通過(guò)參考方式并入本文。參考文獻(xiàn)以下參考文獻(xiàn)的完整公開(kāi)內(nèi)容均以參考方式并入本文。Theentiredisclosureofeachofthefollowingreferencesisincorporatedhereinbyreference.1.Libby，P.,Atheroma:morethanmush.Lancet'1996.348Suppl1:p.s4-7.2.Ross,R,，Atheroscierosis—aninflammatorydisease.NEnglJMed，1999-340(2):p.115-2<3,3.Bomstein，P.,Thrombospondinsasmatricellularmodulatorsofcellfunction.JClinInvest,篇.107(8):p，929-34,4.Sage,E.H.,Regulationofinteractionsbetweencellsandextracellularmatrix:acommandperformanceonseveralstages.JQinInvest,2001,107(7):p,781-3.5.Muiphy-Ullrich,工R，Thede-adhesiveactivityofmatricellularproteins:isintermediatecdladhesionanadaptivestateJClinInvest,2001.107(7):p，785-90,6.Elzie，C,A.andJ.E,Murphy-Ullrich,TheN-terminusofthrombospondin:thedomainstandsapart.IntJBiochemCellBiol>2004,36(6):p-IO卯-IOI.7.Li，D.Y.,G.Faury,D.G.Taylor,E,C,Davis,W.A.Boyle，ILP.Mccham，P.Stenzel，B.BoakandM,T.Keating,NovelarterialpathologyinmiceandhumanshemizygousforelasUn.JClinInvest,1998.102(10):p.1783'7.8.As幼di,A.,D.Chan,E.Hunziker,Jf.F.Bateman,andR.Fassler,Colagennisessentialfortheremovalofthe加tochordandtheformationofintervertebraldiscs.JCellBiol,1998-143(5):p.1399412.9.Forsberg,E.,E.Hirsch,L.FroWich,M.Meyer，P.Ekblon、，A.Aszodi,S.W加cr,andR.F咖ler，SkinwoundsaiuiseverednerveshealTmrmaUyinmicelackingtcnas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癥和/或血管發(fā)生的病癥或這種病癥的素因。58.用于調(diào)節(jié)TGF-pi和/或MMM-9活性的方法，所述方法包括使動(dòng)物接觸包含權(quán)利要求l、11、14至19或21中任一項(xiàng)的肽的組合物或藥物制劑。59.權(quán)利要求58的方法，其中所述動(dòng)物患有至少部分特征在于存在癌癥和/或血管發(fā)生的病癥或這種病癥的素因。60.權(quán)利要求58的方法，其中所述動(dòng)物患有至少部分特征為內(nèi)膜病變中存在炎癥、脂質(zhì)沉積或膠原和彈性蛋白沉積減少的疾病。61.權(quán)利要求60的方法，其中所述疾病包含心肌梗死、中風(fēng)和急性肢體缺血中的一種或多種，或這種疾病的素因。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了利用基質(zhì)細(xì)胞蛋白血小板反應(yīng)蛋白-1(TSP-1)及相關(guān)組合物的治療，其用于穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和降低導(dǎo)致如心肌梗死、中風(fēng)和急性肢體缺血的斑塊破裂事件的發(fā)生。還公開(kāi)了與TSP-1相關(guān)的多種肽，包括某些合成肽。這些肽在多種情況下(包括上述疾病狀態(tài))具有穩(wěn)定斑塊的效用。這些肽中的一些包含與調(diào)節(jié)如TGF-β1和MMP-9活性的TSP-1活性位點(diǎn)相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)序列。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，代表性肽通過(guò)全身性注射該肽而提供有益效果。文檔編號(hào)C07K14/00GK101267829SQ200680022807公開(kāi)日2008年9月17日申請(qǐng)日期2006年6月23日優(yōu)先權(quán)日2005年6月24日發(fā)明者拉姆廷·阿加申請(qǐng)人:卡迪拉保健公司