專利名稱：：抗體多肽文庫篩選和選擇的抗體多肽類的制作方法抗體多肽文庫篩選和選擇的抗體多肽類本發(fā)明進(jìn)一步提供了篩選抗體多肽文庫中的動(dòng)態(tài)。本發(fā)明還提供了可提供本發(fā)明方法獲得的新的分離的抗體多肽類。指定為本申請(qǐng)人的WO99/20749中描述了使用一般配體，例如抗體或抗體片段或包含來自抗體的一種或多種特異性結(jié)合位點(diǎn)的任意物質(zhì)篩選抗體文庫(例如抗體重鏈可變域文庫)的方法。將"抗體"定義為使用這類抗體的結(jié)合(可變)區(qū)的構(gòu)建。將WO99/20749披露的內(nèi)容引入本文作為參考，特別是文庫生成("本發(fā)明文庫的構(gòu)建")，從文庫中選擇多肽類("本發(fā)明多肽類的選擇")，配體選擇("用作多肽選擇中的配體的抗體")和工業(yè)化應(yīng)用("按照本發(fā)明選擇的多肽類的應(yīng)用")中披露的內(nèi)容。明確地將所有這些部分引入本申請(qǐng)以便提供可用于本發(fā)明的特征的披露，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員易于認(rèn)識(shí)到-在本申請(qǐng)權(quán)利要求的上下文中-那些可以用于本發(fā)明的特征。文獻(xiàn)中已經(jīng)描述了非常規(guī)抗體類型-重鏈抗體。已經(jīng)在具有重鏈疾病的患者，EBV轉(zhuǎn)化的B-細(xì)胞的血清，且更重要的是在駱駝科(Camelidae)(駱駝，美洲駝羊)的血清中發(fā)現(xiàn)了這些高滴度的抗體。這些重鏈抗體不含重鏈，但僅含單一對(duì)的相同重鏈。這些重鏈與常用的IgGs的中的那些不同之處在于它們?nèi)狈υ诮閷?dǎo)重鏈上輕鏈配對(duì)中起作用的恒定域l(CHl)。因此，所得重鏈抗體不含輕鏈可變域，而僅含兩個(gè)未配對(duì)的重鏈可變域。有關(guān)免疫接種駱駝科血清的研究已經(jīng)證實(shí)，盡管不存在輕鏈，但是這些重鏈抗體確實(shí)特異性結(jié)合具有中度到高度親和力的抗原。未配對(duì)的重鏈可變域(稱作VHH)在進(jìn)化的自始至終進(jìn)行了遺傳適應(yīng)許多氨基酸取代在通常與VL結(jié)構(gòu)域發(fā)生相互作用的部分中發(fā)生(甚至在種系水平上)在VHs中保守的L45被Arg取代。其它位置通常發(fā)生突變V37突變成Phe,G44突變成Glu且W47突變成Gly。最終，來自駱駝(但不限于美洲駝羊)的VHHs的CDR3平均而言比鼠和人VHS的那些(分別為9和12個(gè)氨基酸)長(16-17個(gè)氨基酸)，由此補(bǔ)償了不存在的VL結(jié)構(gòu)域以便結(jié)合抗原。參照WO05044858Al，WO04062551A2,WO04041867A2,WO04041865A2,WO04041863A2,WO04041862A2,WO03050531A2和EP0656946中有關(guān)CamelidVHH結(jié)構(gòu)域的描述。自從1989以來，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到抗體的單一可變域具有治療潛能。由于其小尺寸，所以它們停靠在難以接近的常規(guī)抗體的抗原部位上(裂，峽谷，活性位點(diǎn))。這些結(jié)構(gòu)域還可以形成根據(jù)需要制成的一定范圍的產(chǎn)物例如可以使它們多聚化(通過化學(xué)或遺傳方式)以便增加親和力，同時(shí)保持相對(duì)小的總體尺寸?？梢酝ㄟ^聚乙二醇化(以便增加流體大小)或通過與血清蛋白質(zhì)，諸如展示出延長半衰期(在人體內(nèi)達(dá)19天)的血清清蛋白共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合調(diào)節(jié)血清中的持久性。最終，可以使單一可變域重新形成IgG以便得益于Fc-效應(yīng)子功能。在所有情況中，有權(quán)使用的抗原特異性抗體可變域的遺傳信息為對(duì)所有上述提及的策略而言絕對(duì)必須具備的條件。已經(jīng)研發(fā)了幾種方法來分離編碼抗原-特異性抗體的抗體可變域的基因。這些方法之一基于早期的觀察結(jié)果，即在其研發(fā)過程中，B-淋巴細(xì)胞各自表達(dá)其細(xì)胞表面上單一類型的抗體(由與膜錨定肽的遺傳融合體介導(dǎo)結(jié)合)。結(jié)合抗原(和T輔助細(xì)胞參與)介導(dǎo)B-淋巴細(xì)胞的抗原-特異性增殖，在隨后階段發(fā)育成熟為血漿細(xì)胞。這些細(xì)胞不表達(dá)表面-結(jié)合的抗體，而是大量分泌它們。因此，在其發(fā)育過程中，可以將B-淋巴細(xì)胞視為遺傳展示包裝，其中表型(抗體)與基因型連接(抗體基因)。因此，為了分離編碼抗原-特異性抗體的基因，已經(jīng)研發(fā)了方法，其中(i)使B-淋巴細(xì)胞采集物(分離自免疫接種的動(dòng)物)接觸抗原(可以在細(xì)胞或固相上免疫接種或可以用染料標(biāo)記)；(ii)抗原-特異性B-淋巴細(xì)胞結(jié)合抗原；(iii)從未結(jié)合的B-淋巴細(xì)胞中分離結(jié)合的抗原-特異性B-淋巴細(xì)胞；(iv)將結(jié)合的抗原-特異性B-淋巴細(xì)胞回收入貯器。試管，孔或平亞；和(v)從分離的B-淋巴細(xì)胞中回收編碼抗原-特異性抗體可變域的基因(可以作為單克隆或多克隆群體儲(chǔ)存)。使用該方案的方法的實(shí)例為下列文獻(xiàn)中描述的那些(i)Babcook等(1996)爿cadOSL493，7843-7848。SLAM通過能夠從任意種類中分離在體內(nèi)免疫應(yīng)答過程中生成的高親和力抗體克服了雜交瘤技術(shù)和細(xì)菌表達(dá)的抗體文庫的局限。SLAM能夠使單一淋巴細(xì)胞產(chǎn)生具有所需特異性或功能的抗體以便在淋巴樣細(xì)胞大群體和編碼從該淋巴細(xì)胞中恢復(fù)的抗體特異性的遺傳信息內(nèi)得以鑒定，例如能夠?qū)⑺鲞z傳信息克隆入表達(dá)載體，以便能夠表達(dá)大量的抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生抗體的細(xì)胞結(jié)合選擇的抗原并且使用適合的溶血菌斑試馬t法檢測(Jerne和Nordin(1963)Sc/ewce140，405)。在該試-瞼中，使用選擇的抗原包^皮紅細(xì)胞并且將其與產(chǎn)生抗體的細(xì)胞群和補(bǔ)體源一起孵育。根據(jù)溶血菌噬菌斑的形成鑒定產(chǎn)生單一抗體的細(xì)胞。使用倒置顯微鏡鑒定裂解的紅細(xì)胞噬菌斑，并且使用顯微操作技術(shù)取出在噬菌斑的中心上關(guān)注的產(chǎn)生單一抗體的細(xì)胞，然后用于接種包被了EL4-B5T細(xì)胞的單一孔(提供有活力的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用和用于B-細(xì)胞表達(dá)的可溶性因子)。平均而言，給每個(gè)孔接種0.3B-細(xì)胞以確?？寺》植肌Ｈ缓笸ㄟ^逆轉(zhuǎn)錄抗體PCR克隆來自這些克隆平展的B細(xì)胞中的基因。用于檢測產(chǎn)生單一抗體的具有所需功能的細(xì)胞的其它方法已經(jīng)描述在國際專利說明書WO92/02551中。(ii)deWildt等(1997)丄/mmw"o/.Me^oA2073，61-67。所述方法包括下列步驟(i)從人供體中采集B-淋巴細(xì)胞；(ii)用安裝了自動(dòng)細(xì)胞分配部件的熒光活化的流式細(xì)胞儀(FACS儀器)檢測CD19+ZCD20+細(xì)胞；(iii)將CD19+/CD20+B細(xì)胞各自調(diào)配在包被了EL4-B5T細(xì)胞的單一孔中，所述EL4-B5T細(xì)胞提供細(xì)胞-細(xì)胞相互作用(CD40-CD40L)和可溶性生長因子；(iv)使單一B-細(xì)胞各自擴(kuò)充以便增加mRNA的量；和(v)通過RT-PCR回收抗體基因。應(yīng)注意步驟4(B-細(xì)胞擴(kuò)充)為任選的，只要可以將PCR方法設(shè)計(jì)成可有效地對(duì)來自單一細(xì)胞的抗體基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。(iii)Lawson等WO2004106377。在該專利申請(qǐng)中，作者已經(jīng)通過流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(deWildt等(1997)丄/www"o/.M"/oA,2073,61畫67)或生物淘選(Lagerkvist等(1995)腸&c—腦18,862-869)分離了抗原-特異性B-細(xì)胞。與這兩種手段相反，Lawson等的方法無需分離各B細(xì)胞。每孔中B細(xì)胞的數(shù)量在100-20,000的范圍-仍然是在B-細(xì)胞擴(kuò)充后，抗體可變基因的RT-PCR揭示出在大部分孔中的單克隆抗體序列。所有這些方法均使用了抗原來分離呈遞抗體的B-細(xì)胞亞群。這種手段未考慮到，在抗原-特異性B-細(xì)胞群內(nèi)，展示的抗體在未直接涉及抗原結(jié)合的區(qū)中可以不同。例如，常用抗體由K或X輕鏈構(gòu)成。僅基于抗原的選擇由此不能分選不同的B-細(xì)胞亞群。然后必須測試各抗原-選擇的B-淋巴細(xì)胞，以便隨后用于輕鏈同種型。根據(jù)對(duì)免疫接種的駱駝科的觀察結(jié)果指定了更重要的實(shí)例在駱駝中，認(rèn)為20。/o的B-淋巴細(xì)胞在其表面上表達(dá)和/或分泌重鏈抗體。剩余的B-淋巴細(xì)胞展示/表達(dá)常規(guī)的四-鏈抗體。因此，基于抗原的選擇無法在那些表達(dá)重鏈抗體的那些B-細(xì)胞之間進(jìn)行區(qū)分，所述重鏈抗體來自那些表達(dá)常規(guī)抗體的B-細(xì)胞。使用本發(fā)明可以解決這一問題。還參照以Celltech名義的下列公開文獻(xiàn)WO04051268A1:ASSAYFORIDENTIFYINGANTIBODYPRODUCINGCELL,該文獻(xiàn)披露了用于鑒定產(chǎn)生結(jié)合選擇的抗原的抗體的細(xì)胞的同源性測定，該方法包括將產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與抗原和標(biāo)記的抗-抗體抗體一起孵育。WO04106377A1:METHODSFORPRODUCINGANTIBODY,該文獻(xiàn)披露了通過下列步驟獲得具有所需功能的抗體使B細(xì)胞接觸俘獲試劑，分離俘獲的B細(xì)胞并且培養(yǎng)和篩選俘獲的B細(xì)胞以便鑒定產(chǎn)生抗體的細(xì)胞以便獲得所需的抗體。WO05019823A1:METHODSFOROBTAININGANTOBODY,該文獻(xiàn)披露了富集B細(xì)胞群，該B細(xì)胞群用于產(chǎn)生通過接觸細(xì)胞識(shí)別所關(guān)注的抗原的抗體，所關(guān)注的抗原和抗體-顆粒復(fù)合物的細(xì)胞，其中抗體識(shí)別所關(guān)注的抗原。WO05019824A1:METHODSFOROBTAININGANTIBODY,該文獻(xiàn)披露了在產(chǎn)生識(shí)別所關(guān)注的抗原的抗體的細(xì)胞中富集B細(xì)胞群，該方法包括使用對(duì)B細(xì)胞標(biāo)記和抗原具有特異性的抗體標(biāo)記細(xì)胞并且分離雙重標(biāo)記的細(xì)胞?？贵w的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)單獨(dú)的區(qū)可以為Vk或V人)的重鏈可變域(VH)和輕鏈可變域(VL)?？乖Y(jié)合部位自身由6個(gè)多肽環(huán)構(gòu)成3個(gè)來自VH結(jié)構(gòu)域(基因片段的1重排。VH基因由重組Hl,H2和H3產(chǎn)生)且3個(gè)來自VL結(jié)構(gòu)域(L1、L2和L3)。編碼VH和VL結(jié)構(gòu)域的V基因的不同的初級(jí)所有組成成分(repertoire)通過合并三種基因片段VH，D和JH產(chǎn)生。在人中，存在約51個(gè)功能性VH片段(Cook和Tomlinson(1995)7b&》16:237),25個(gè)功能性D片段(Corbett等(1997)J.Afo/.Ao/.,268:69)和6個(gè)功能性Jh片段(Ravetch等(1981)細(xì)胞，27:583),這取決于單元型。VH片段編碼構(gòu)成VH結(jié)構(gòu)域(Hl和H2)的笫一或第二抗原結(jié)合環(huán)的多肽鏈區(qū)，而vh，D和Jh片段合17并成VH結(jié)構(gòu)域(H3)的第三抗原結(jié)合環(huán)。VL基因通過重組僅兩種基因片段VL和JL產(chǎn)生。在人中，存在約40個(gè)功能性VK片段(Schable和Zachau(1993)C/zem.//0//7e-Sey/w,374:1001),31個(gè)功能性V入片段(Williams等(1996)M/.,264:220;Kawasaki等(1997)Ge"ome"仏，7:250)，5個(gè)功能性Jic片段(Hieter等(1982)J.5/。/.C/ze肌，257:1516)和4個(gè)功能性J人片段(Vasicek和Leder(1990)Ex/.，172:609)，這取決于單元型。VL片l殳編碼構(gòu)成VL結(jié)構(gòu)域(L1和L2)的第一或第二抗原結(jié)合環(huán)的多肽鏈區(qū)，而VL和JL片段合并成VL結(jié)構(gòu)域(L3)的第三抗原結(jié)合環(huán)。認(rèn)為這一初級(jí)所有組成成分中選擇的抗體足以不同地結(jié)合幾乎所有具有至少中度親和力的抗原。通過重排基因的"親和力成熟"產(chǎn)生高親和力抗體，其中基于改善的結(jié)合由免疫系統(tǒng)生成并且選擇點(diǎn)突變。對(duì)抗體結(jié)構(gòu)和序列的分析已經(jīng)證實(shí)6個(gè)抗原結(jié)合環(huán)(H1、H2、Ll、L2和L3)中的5個(gè)具有有限數(shù)量的主鏈構(gòu)象或規(guī)范結(jié)構(gòu)(Chothia和Lesk(1987)丄編.編.,196:901;Chothia等(1989)淑騰，342:877)。根據(jù)如下條件確定主鏈構(gòu)象(i)抗原結(jié)合環(huán)的長度；和(ii)在抗原結(jié)合環(huán)和抗體構(gòu)架中的某些關(guān)鍵位置上的特定殘基或殘基類型。對(duì)環(huán)長度和關(guān)鍵殘基的分析能夠使我們預(yù)測由大部分人抗體序列編碼的Hl，H2,Ll,L2和L3的主鏈構(gòu)象(Chothia辨1992)丄Mo/.歷o/.,227:799;Tomlinson等(1995)￡A^(9丄，14:4628;Williams等(1996)J.Mo/.Ao/.，264:220)。盡管H3區(qū)在序列，長度和結(jié)構(gòu)方面遠(yuǎn)不同(因使用D片段)，但使它還構(gòu)成有限量的短環(huán)長度的主鏈構(gòu)象，這取決于長度和環(huán)和抗體構(gòu)架上關(guān)鍵位置上存在的特定殘基或殘基類型(Martin爭(1996)丄A/o/.263:800;Shimi等(1996)F￡^S399:1)。對(duì)人抗體序列中側(cè)鏈多樣性的類似分析能夠從通過體細(xì)胞高度突變生成的模式中分離初級(jí)所有組成成分中的序列多樣性模式。發(fā)現(xiàn)兩種模式互補(bǔ)在初級(jí)所有組成成分中的多樣性集中在抗原結(jié)合中心，而體細(xì)胞高度突變將多樣性傳遞給在初級(jí)所有組成成分中高度保守的周邊區(qū)(Tomlinson等(1996)丄編.Ao/.,256:813;Ignatovich等(1997)Mo/.Sz'o/，268:69)。這種互補(bǔ)性看起來作為查詢序列空間的有效策略發(fā)展，從而獲得了可在任意指定時(shí)間可利用于選擇的有限數(shù)量的B細(xì)胞。因此，首先基于結(jié)合位點(diǎn)中心上的多樣性從初級(jí)所有組成成分中選擇抗體。然后保持體細(xì)胞高度突變以便在不破壞初級(jí)應(yīng)答過程中建立的有利相互作用的情況下優(yōu)化周邊上的殘基。噬菌體展示技術(shù)的出現(xiàn)(Sm池(1985)5"c/e"ce,228:1315;Scott和Smith(1990)&,e"ce,249:386;McCafferty等(1990)A^we,348:552)使得在體外從"單罐"文庫中選擇針對(duì)廣泛靶抗原的抗體?？梢詫⑦@些噬菌體-抗體文庫分成兩類使用采集自人B細(xì)胞的重排V基因的天然文庫(Marks等(1991)J.M/.5/。/.,222:581;Vaughan等(1996)淑臟AoMc/z.,14:309)或種系V基因片段為體外'重排'(Hoogenboom&Winter(1992)丄A/o/.歷o/.,227:381;Nissim等(1994)EA^(9丄，13:692;Griffiths等(1994)五A/5(9丄，13:3245;DeKruif等(1995)丄Mo/.Ao/.,248:97)或合成CDRs摻入單一重排V基因(Barbas等(1992)尸rac.A^/.Jcad.Sc/.L/"&4，89:4457)的合成文庫。盡管合成文庫有助于克服可能限制由重排V基因構(gòu)建的噬菌體文庫有效大小的天然所有組成成分的內(nèi)在偏性，但是它們需要使用通常將堿基-對(duì)缺失導(dǎo)入裝配的V基因的長簡并PCR引物。這種高度隨機(jī)化還可能導(dǎo)致不能正確折疊且由此也為非功能性的抗體生成。此外，從這些文庫中選擇的抗體難以表達(dá)，并且在許多情況中，這些抗體包含構(gòu)架突變，這些突變?cè)谟糜谌睡煼〞r(shí)可以影響抗體免疫原性。在合成文庫手段的擴(kuò)展中，提示(WO97/08320,Morphosys)可以通過合成一組'主基因'預(yù)優(yōu)化人抗體構(gòu)架，該組'主基因'具有共有構(gòu)架序列并且摻入顯示出可改善折疊和表達(dá)的氨基酸取代。然后使用寡核苷酸摻入CDRs的多樣性。由于需要產(chǎn)生不會(huì)由人免疫系統(tǒng)識(shí)別為外源性的人工人抗體，所以在大部分情況中并非相當(dāng)于任何天然構(gòu)架的共有構(gòu)架的應(yīng)用是這一手段的缺點(diǎn)。此外，由于可能的情況是，CDR多樣性也對(duì)折疊和/或表達(dá)具有作用，所以優(yōu)選在V基因完全裝配后優(yōu)化折疊和/或表達(dá)(并且除去任何移碼或終止密碼子)。為了這一目的，需要選擇系統(tǒng)，它可以消除文庫中非功能性或難以折疊/表達(dá)的成員，此后使用耙抗原進(jìn)行篩選。使用現(xiàn)有技術(shù)的文庫的額外問題在于，因?yàn)橹麈湗?gòu)象為異源性的，所以三維結(jié)構(gòu)模型化是困難的，這是因?yàn)楹线m的高分辨率晶體學(xué)數(shù)據(jù)無法利用。這是H3區(qū)的特定問題，其中大部分；來源于天然或合成抗體文庫的抗體具有中等長度或長環(huán)且由此不能模型化。發(fā)明概述本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了從多肽類的所有組成成分中選擇結(jié)合第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)上的耙配體和第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)上的一般配體的功能性多肽類群體的方法，所述一般配體能夠結(jié)合所有組成成分的結(jié)合功能性成員，但與靶配體的特異性無關(guān)，該方法包括下列步驟a)使所有組成成分接觸一般配體并且選擇與之結(jié)合的功能性多肽類；和b)使選擇的功能性多肽類接觸靶配體并且選擇結(jié)合耙配體的多肽類群體。本發(fā)明由此提供了方法，通過該方法，按照如結(jié)合一般配體的能力測定的預(yù)選擇多肽類的所有組成成分，且然后按照結(jié)合靶配體的能力用于額外的選擇周期。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，盡管首先使用一般配體選擇所有組成成分，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見，可以使所有組成成分以相反的順序接觸配體，即在接觸一般配體前接觸耙配體。本發(fā)明允許本領(lǐng)域技術(shù)人員從選擇的多肽類的所有組成成分中除去那些為非功能性的多肽類，例如，作為導(dǎo)入移碼突變，終止密碼子，折疊突變體或表達(dá)突變體的結(jié)果，它們可能基本上不能或不能結(jié)合任意的靶配體。這類非-功能性突變體通過用于構(gòu)建多肽所有組成成分的正常隨機(jī)化和可變操作步驟產(chǎn)生。同時(shí)，本發(fā)明允許本領(lǐng)域技術(shù)人員為那些屬于功能性的，充分折疊的和高度表達(dá)的多肽類富集選擇的多肽類所有組成成分。優(yōu)選多肽類的兩個(gè)或多個(gè)亞組通過本發(fā)明的方法獲自所有組成成分，例如通過使用兩種或多種一般配體預(yù)篩選所有組成成分或通過使所有組成成分在不同條件下接觸一般配體。有利的是，由此獲得的多肽類亞組合并成額外的多肽類所有組成成分，可以通過接觸靶和/或一般配體對(duì)其進(jìn)一步篩選。優(yōu)選本發(fā)明的文庫包含免疫球蛋白超家族的多肽類，諸如抗體多肽類或T-細(xì)胞受體多肽類。有利的是，該文庫可以包含各免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，諸如抗體的VH或VL結(jié)構(gòu)域或T-細(xì)胞受體的Vp或Va結(jié)構(gòu)域。因此，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，例如，可以使用一般配體各自預(yù)篩選VH和VL多肽類的所有組成成分，且然后合并而產(chǎn)生包含VH和VL多肽類的功能性所有組成成分。然后使用靶配體篩選這類所有組成成分，以便分離包含VH和VL結(jié)構(gòu)域和并且具有所需結(jié)合特異性的多肽類。在一個(gè)有利的實(shí)施方案中，為用于免疫球蛋白所有組成成分選擇的一般配體為超抗原。超抗原能夠結(jié)合功能性免疫球蛋白分子或其包含特定主鏈構(gòu)象的亞組，而與靶配體特異性無關(guān)?；蛘咭话闩潴w可以選自能夠結(jié)合多肽類一般結(jié)構(gòu)的任意配體，所述多肽類構(gòu)成任意指定的所有組成成分，諸如抗體自身，金屬離子基質(zhì)，有機(jī)化合物，包括蛋白質(zhì)或肽類等。本發(fā)明在第二個(gè)方面中提供了文庫，其中功能性成員具有一般和靶配體的結(jié)合位點(diǎn)。為該目的通過下列方式設(shè)計(jì)文庫例如，構(gòu)建具有由指定超抗原識(shí)別的主鏈構(gòu)象的抗體文庫，或構(gòu)建文庫，其中基本上所有可能的功能性成員具有可由抗體配體識(shí)別的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明在第三個(gè)方面中提供了檢測，固定，純化或免疫沉淀預(yù)先按照本發(fā)明選擇的多肽類所有組成成分中的一個(gè)或多個(gè)成員的方法，包含使該成員結(jié)合一般配體。本發(fā)明在第四個(gè)方面中提供了包含免疫球蛋白超家族的多肽類所有組成成分的文庫，其中所有組成成分中的成員具有已知的主鏈構(gòu)象。本發(fā)明在第五個(gè)方面中提供了從多肽類所有組成成分中選擇具有所需一般和/或靶配體結(jié)合位點(diǎn)的多肽的方法，包含下列步驟a)表達(dá)本發(fā)明上述方面的文庫；b)使多肽類接觸一般和/或靶配體并且選擇結(jié)合一般和/或耙配體的那些；和c)任選擴(kuò)增結(jié)合一般和/或靶配體的選擇的多肽；d)任選重復(fù)步驟a)陽c)。有利地生成和維持核酸文庫形式的多肽類的所有組成成分。因此，本發(fā)明在第六個(gè)方面中提供了編碼多肽類所有組成成分的核酸文庫。本發(fā)明在第七個(gè)方面中提供了從抗體多肽類的所有組成成分中選擇結(jié)合靶配體和一般配體的功能性可變域群體的方法，該一般配體能夠結(jié)合所有組成成分中的結(jié)合功能性成員，而與靶配體的特異性無關(guān)，該方法包括下列步驟a)使所有組成成分接觸所述一般配體并且選擇與之結(jié)合的功能性可變域；和b)使選擇的功能性可變域接觸靶配體并且選擇結(jié)合靶配體的可變域；其中，(i)可變域?yàn)橹劓溈勺冇蚯乙话闩潴w為抗體輕鏈可變域；或(ii)可變域?yàn)檩p鏈可變域且一般配體為抗體重鏈可變域；且其中任選在(i)中，重鏈可變域?yàn)镃amelid可變域(VHH)或來源于Camelid重鏈抗體(H2抗體)；或任選在(i)和(ii)中，可變域各自為人可變域或來源于人。優(yōu)選首先使抗體多肽類的所有組成成分接觸靶配體且然后接觸一般配體。優(yōu)選一般配體結(jié)合可變域所有組成成分的亞組。優(yōu)選兩個(gè)或多個(gè)亞組選自多肽類的所有組成成分。優(yōu)選使用兩種或多種一般配體，任選兩種或多種輕鏈可變域(就選項(xiàng)i)而言)或兩種或多種重鏈可變域(就選項(xiàng)(ii)而言)進(jìn)行選擇。優(yōu)選在選擇后合并兩個(gè)或多個(gè)亞組以便產(chǎn)生額外的多肽類所有組成成分。優(yōu)選使多肽類的兩種或多種所有組成成分接觸一般配體且然后合并由此獲得的多肽類亞組。在笫七個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，選擇抗體重鏈可變域群體并且選擇抗體輕鏈可變域群體，且然后合并由此獲得的群體。本發(fā)明在第八個(gè)方面中還提供了從多肽類的所有組成成分中選擇結(jié)合靶配體和一般配體的功能性T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域群體的方法，該一般配體能夠結(jié)合所有組成成分中的功能性成員，而與靶配體的特異性無關(guān)，該方法包括下列步驟a)使所有組成成分接觸所述一般配體并且選擇與之結(jié)合的功能性T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域；和b)使選擇的功能性T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域接觸靶配體并且選擇結(jié)合耙配體的T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域群體；其中，(i)T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域?yàn)閂a結(jié)構(gòu)域且一般配體為T-細(xì)胞受體V卩結(jié)構(gòu)域；或(ii)T-細(xì)胞結(jié)構(gòu)域?yàn)門-細(xì)胞受體Vp結(jié)構(gòu)域且一般配體為T-細(xì)胞受體Va結(jié)構(gòu)域；且其中任選在(i)中，T-細(xì)胞受體Va結(jié)構(gòu)域?yàn)閬碓从贑amelid的Camelid結(jié)構(gòu)域；或任選在(i)和(ii)中，T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域各自為人結(jié)構(gòu)域或來源于人。在第八個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，選擇T-細(xì)胞受體Va結(jié)構(gòu)域群體并且選擇T-細(xì)胞受體Vp結(jié)構(gòu)域群體，且然后合并由此獲得的群體。本發(fā)明在第九個(gè)方面中還提供了從抗體多肽類群體中選擇至少一種抗體重鏈可變域的方法，該方法包括a)使所述群體接觸抗體輕鏈可變域；和b)選擇至少一種結(jié)合輕鏈可變域的抗體重鏈可變域。在一個(gè)實(shí)施方案中，粑抗原用于對(duì)抗體多肽類的起始群體進(jìn)行SLAM(選擇的淋巴細(xì)胞抗體方法)，以便選擇結(jié)合靶抗原的抗體多肽類群體；并且將選擇的群體用作接觸輕鏈可變域的步驟a)中的抗體多肽類群體。優(yōu)選在步驟a)前，存在使抗體多肽類接觸耙配體并且選擇結(jié)合靶配體的抗體多肽類的步驟，由此提供步驟a)中使用的所述抗體多肽類群體。優(yōu)選在步驟b)后，存在使在步驟b)中選擇的抗體重鏈可變域接觸把配體并且選擇結(jié)合耙配體的重鏈可變域的步驟。優(yōu)選在步驟b)中選擇的重鏈結(jié)構(gòu)域各自來自下組來源于Camelid的重鏈可變域；VHH結(jié)構(gòu)域；Nanobody;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH。優(yōu)選在步驟b)中選擇的重鏈結(jié)構(gòu)域各自為人源化Camelid或鼠重鏈可變域或人源化NanobodyTM。優(yōu)選在步驟b)中選擇的重鏈結(jié)構(gòu)域各自為人重鏈可變域。鏈可變域，所述FW2序列與由種系基因序列DPK9編碼的FW2相同。優(yōu)選輕鏈可變域?yàn)镃amelid輕鏈可變域或來源于Camelid。優(yōu)選步驟a)中的群體由B-細(xì)胞群提供。優(yōu)選B-細(xì)胞為外周血淋巴細(xì)胞。優(yōu)選B-細(xì)胞分離自已經(jīng)免疫接種靶抗原的動(dòng)物。優(yōu)選B-細(xì)胞分離自未免疫接種耙抗原的動(dòng)物。優(yōu)選步驟a)中使用的群體由以合成方式重排的抗體基因編碼的抗體多肽類的所有組成成分提供。優(yōu)選步驟a)中使用的群體由包含展示所述抗體多肽類的噬菌體的噬菌體展示文庫體。優(yōu)選步驟a)中使用的群體包含(i)各自包含至少一種未與輕鏈可變域配對(duì)的重鏈可變域的抗體多肽類；和(ii)各自包含與輕鏈可變域配對(duì)的重鏈可變域的抗體多肽類。優(yōu)選步驟a)中使用的群體包含Camelid重鏈單一可變域(VHH)或NanobodiesTM。優(yōu)選步驟a)中使用的群體由包含人重鏈單一可變域(VH)。優(yōu)選在步驟b)中，選擇的抗體重鏈可變域中的至少一種與蛋白質(zhì)部分融合或綴合。優(yōu)選蛋白質(zhì)部分選自噬菌體外被蛋白、一種或多種抗體結(jié)構(gòu)域、抗體Fc結(jié)構(gòu)域、酶、毒素、標(biāo)記和效應(yīng)基團(tuán)。優(yōu)選在步驟b)中，選擇的抗體重鏈可變域中的至少一種為抗體部分或抗體片l殳，其選自IgG、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab,)2、scFv、Fv和二硫鍵鍵合的Fv。本發(fā)明的第九個(gè)方面的特別優(yōu)選的實(shí)施方案在該實(shí)施方案中，步驟a)中使用的群體由B-細(xì)胞群，優(yōu)選已經(jīng)分離自免疫接種靶抗原的Camelid(例如美洲駝羊或駱駝)的外周血淋巴細(xì)胞提供。在該實(shí)施方案中，優(yōu)選靶抗原選自TNFa、血清清蛋白、馮維勒布蘭德因子(vWF)、IgE、干擾素y、EGFR、IgE、MMP12、PDK1和淀粉樣蛋白(3(A-(3)的靶配體或附錄1中所列的靶標(biāo)中的任意一種。步驟b)中使用的輕鏈可變域?yàn)槿溯p鏈可變域；來源于人；具有FW2序列的輕鏈可變域，所述FW2序列與由種系基因序列DPK9編碼的FW2相同；或Camelid、家兔或小鼠輕鏈可變域。因此，該實(shí)施方案關(guān)注來自外周血淋巴細(xì)胞群在步驟a)中的應(yīng)用，其來自使用人輕鏈可變域(或至少具有人界面區(qū)(按照Kabat該區(qū)包括44-47位氨基酸)的輕鏈結(jié)構(gòu)域，即該區(qū)通常與人VH/VL配對(duì)中的VH結(jié)構(gòu)域分界面)選擇的免疫接種的Camelid。本發(fā)明的一個(gè)方面提供了從Camelid抗體多肽類群體中選擇至少一種Camelid抗體VHH結(jié)構(gòu)域的方法，所述Camelid抗體多肽類群體由分離自已經(jīng)免疫接種耙抗原的Camelid的B-細(xì)胞提供，該方法包括a)使所述群體基礎(chǔ)抗體輕鏈可變域；和b)選擇至少一種結(jié)合輕鏈可變域的VHH結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選輕鏈可變域?yàn)槿溯p鏈可變域。優(yōu)選將B-細(xì)胞提供在多個(gè)孔或儲(chǔ)器中，其中各孔或儲(chǔ)器平均包含一種B-細(xì)胞類型。優(yōu)選在步驟b)中，選擇的抗體重鏈可變域中的至少一種與蛋白質(zhì)部分融合或綴合。優(yōu)選蛋白質(zhì)部分選自噬菌體外被蛋白、一種或多種抗體結(jié)構(gòu)域、抗體Fc結(jié)構(gòu)域、酶、毒素、標(biāo)記和效應(yīng)基團(tuán)。優(yōu)選在步驟b)中，選擇的抗體重鏈可變域中的至少一種為抗體部分或抗體片段，其選自IgG、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv和二硫鍵鍵合的Fv。本發(fā)明在第十各方面中提供了分離的抗體多肽，其包含抗體重鏈可變域或由抗體重鏈可變域組成，其中多肽可通過本發(fā)明第九個(gè)方面的方法獲得，其中在該方法中的輕鏈可變域?yàn)槿溯p鏈可變域且重鏈可變域來自非-人的哺乳動(dòng)物。優(yōu)選抗體多肽的重鏈可變域來自下組來源于Camelid的重鏈可變域；VHH結(jié)構(gòu)域；NanobodyTM;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH。優(yōu)選將抗體多肽的重鏈可變域作為CamelidIgG的部分或來源于Camelid的IgG提供。優(yōu)選將抗體多肽的重鏈可變域作為人IgG的部分或來源于人的IgG體，并且其中重鏈可變域在IgG中與不同于用于本發(fā)明第九個(gè)方面的方法的輕鏈可變域配對(duì)。本發(fā)明還提供了抗體多肽的衍生物，其中該衍生物與第十個(gè)方面的抗體多肽可變域的CDR3相比具有CDR3突變。本發(fā)明還提供了通過第十個(gè)方面的抗體多肽的親和力成熟產(chǎn)生的衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中的本發(fā)明抗體多肽(例如第10或第12個(gè)方面)作為藥物使用或用于人疾病或疾患的治療和/或預(yù)防。在本發(fā)明的方法，應(yīng)用或抗體多肽的一個(gè)實(shí)施方案中，重鏈可變域結(jié)合選自下組的靶配體TNFa、血清清蛋白、馮維勒布蘭德因子(vWF)、IgE、干擾素Y、EGFR、IgE、MMP12、PDK1和淀粉樣蛋白(3(A-卩)的耙配體或附錄1中所列的粑標(biāo)中的任意一種。本發(fā)明在第十一個(gè)方面中提供了從抗體多肽類群體中選擇至少一種抗體輕鏈可變域的方法，該方法包括a)使所述群體接觸抗體重鏈可變域；和b)選擇至少一種結(jié)合重鏈可變域的抗體輕鏈可變域。優(yōu)選在步驟a)前，存在使抗體多肽類接觸耙配體并且選擇結(jié)合靶配體的抗體多肽類的步驟，由此提供步驟a)中使用的所述抗體多肽類群體。優(yōu)選在步驟b)后，存在使在步驟b)中選擇的抗體輕鏈可變域接觸耙配體并且選擇結(jié)合粑配體的輕鏈可變域的步驟。優(yōu)選在步驟b)中選擇的輕鏈結(jié)構(gòu)域各自來源于Camelid。優(yōu)選在步驟b)中選擇的輕鏈結(jié)構(gòu)域?yàn)槿溯p鏈可變域。優(yōu)選重鏈可變域?yàn)槿酥劓溈勺冇?；來源于人；具有FW2序列的重鏈可變域，所述FW2序列與種系基因序列DP47編碼的FW2相同；或具有與種系基因序列DP47編碼的44，45和47位相同的44,45和47位的重鏈可變域。優(yōu)選重鏈可變域?yàn)镃amelid重鏈可變域(VHH或VH)或來源于Camelid。優(yōu)選在步驟a)中的群體由B-細(xì)胞群提供。優(yōu)選B-細(xì)胞為外周血淋巴細(xì)胞。優(yōu)選B-細(xì)胞分離自已經(jīng)免疫接種了靶抗原的動(dòng)物。優(yōu)選B-細(xì)胞分離自未免疫接種靶抗原的動(dòng)物。優(yōu)選步驟a)中使用的群體由以合成方式重排的抗體基因編碼的抗體多肽類的所有組成成分提供。優(yōu)選步驟a)中使用的群體由包含展示所述抗體多肽類的噬菌體的噬菌體展示文庫提供。優(yōu)選步驟a)中使用的群體包含(i)各自包含未與重鏈可變域配對(duì)的至少一種輕鏈可變域的抗體多肽類；和(ii)各自包含與重鏈可變域配對(duì)的輕鏈可變域的抗體多肽類。優(yōu)選步驟a)中使用的群體包含人輕鏈單一可變域(VL)。優(yōu)選在步驟b)中，選擇的抗體輕鏈可變域中的至少一種與蛋白質(zhì)部分融合或綴合。優(yōu)選蛋白質(zhì)部分選自噬菌體外被蛋白、一種或多種抗體結(jié)構(gòu)域、抗體Fc結(jié)構(gòu)域、酶、毒素、標(biāo)記和效應(yīng)基團(tuán)。優(yōu)選在步驟b)中，選擇的抗體重鏈可變域中的至少一種為抗體部分或抗體片l殳，其選自IgG、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv和二硫鍵鍵合的Fv。在第十一個(gè)方面的一個(gè)實(shí)施方案中，靶抗原用于對(duì)起始抗體多肽類進(jìn)行SLAM(選擇的淋巴細(xì)胞抗體方法)，以便選擇結(jié)合革巴抗原的抗體多肽類群體；并且將選擇的群體用作與重鏈可變域接觸的步驟a)中的抗體多肽類群體。本發(fā)明在第十二個(gè)方面中提供了分離的抗體多肽，其包含抗體輕鏈可變域或由抗體輕鏈可變域組成，其中多肽可通過本發(fā)明第十一個(gè)方面的方法獲得，其中在該方法中的重鏈可變域?yàn)槿酥劓溈勺冇蚯逸p鏈可變域來自非-人的哺乳動(dòng)物。優(yōu)選抗體多肽的輕鏈可變域來自Camelid。優(yōu)選將抗體多肽的輕鏈可變域作為CamelidIgG的部分或來源于Camelid的IgG提供。優(yōu)選將抗體多肽的輕鏈可變域作為人IgG的部分或來源于人的IgG提供，并且其中使輕鏈可變域在IgG中與不同于用于本發(fā)明第十一個(gè)方面的重鏈可變域的重鏈可變域配對(duì)。本發(fā)明還提供了第十二個(gè)方面的抗體多肽的衍生物，其中該衍生物與第十二個(gè)方面的多肽可變域的CDR3相比具有CDR3突變。本發(fā)明還提供了通過第十二個(gè)方面的抗體多肽的親和力成熟產(chǎn)生的衍生物。本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了多肽，其包含與第10或第12個(gè)方面的抗體多肽連接的半衰期延長的部分或衍生物,其中該部分選自PEG;抗體恒定域；抗體Fc區(qū)；蛋白或其片段；結(jié)合清蛋白的肽或抗體片段、清蛋白片段；新生兒Fc受體；轉(zhuǎn)運(yùn)；或轉(zhuǎn)運(yùn)受體。優(yōu)選多肽為藥物或用于人疾病或疾患的治療和/或預(yù)防。優(yōu)選抗體多肽的可變域結(jié)合選自下組的靶配體TNFoc、血清清蛋白、馮維勒布蘭德因子(vWF)、IgE、千擾素Y、EGFR、IgE、MMP12、PDK1和淀粉樣蛋白(3(A-卩)的耙配體或附錄1中所列的把標(biāo)中的任意一種。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包含產(chǎn)生選擇的可變域的突變體或衍生物的步驟。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中使用B-細(xì)胞群，將B-細(xì)胞群提供在多個(gè)孔或儲(chǔ)器中，其中各孔或儲(chǔ)器包含單一B-細(xì)胞類型。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中使用B-細(xì)胞群，將B-細(xì)胞群提供在多個(gè)孔或儲(chǔ)器中，其中各孔或儲(chǔ)器平均包含一種B-細(xì)胞類型。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供了從包含單一可變域和IgG的抗體多肽類的群體中的抗體單一可變域中分離IgG的方法，該方法包括a)使所述群體接觸一般配體；和b)選擇結(jié)合一般配體的亞群，由此從單一可變域中分離IgG;其中一般配體基因?qū)贵wCH1結(jié)構(gòu)域，輕鏈恒定域(CL),IgG絞鏈或抗體輕鏈可變域的結(jié)合特異性。優(yōu)選一般配體選自蛋白質(zhì)L,蛋白質(zhì)L結(jié)構(gòu)域或結(jié)合輕鏈可變域的蛋白質(zhì)L衍生物；蛋白質(zhì)G;蛋白質(zhì)G結(jié)構(gòu)域或結(jié)合CH1的蛋白質(zhì)G衍生物；抗體和抗體片段；affibody;LDL受體結(jié)構(gòu)域；和EGF結(jié)構(gòu)域。優(yōu)選一般配體選自dAb、NanobodyTM、scFv、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv或二硫鍵鍵合的Fv。優(yōu)選可變域?yàn)槿藛我豢勺冇蚯襂gG為人IgG。輕鏈恒定域(CL)、IgG絞鏈或抗體輕鏈可變域。優(yōu)選一般配體以1微摩爾或1微摩爾以下的親和力結(jié)合抗體CH1結(jié)構(gòu)域、輕鏈恒定域(CL)、IgG絞鏈或抗體輕鏈可變域。優(yōu)選一般配體以100nM或100nM以下的親和力結(jié)合抗體CHl結(jié)構(gòu)域、輕鏈恒定域(CL)、IgG絞鏈或抗體輕鏈可變域。本發(fā)明在第十三各方面中提供了從包含CamelidVHH結(jié)構(gòu)域和IgG的抗體多肽類的群體中的IgG中分離CamelidVHH單一可變域的方法，該方法包4舌a)使所述群體接觸一般配體；和b)選擇結(jié)合一般配體的亞群，由此從IgG中分離單一可變域。優(yōu)選一般配體選自抗體輕鏈可變域，抗體和抗體片段。優(yōu)選一般配體選自dAb、NanobodyTM、scFv、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab')2、scFv、Fv或二硫鍵鍵合的Fv。優(yōu)選一^:配體以lmM或lmM以下的親和力結(jié)合VHH或重鏈抗體CH2)絞鏈。優(yōu)選一般配體以1微摩爾或1微摩爾以下的結(jié)合VHH或重鏈抗體(H2)絞鏈。優(yōu)選一般配體以100nM或100nM以下的親和力結(jié)合VHH或重鏈抗體(H2)絞鏈。優(yōu)選抗體多肽群體由B細(xì)胞提供。優(yōu)選可變域?yàn)镃amelidVHH且IgG為CamelidIgG。優(yōu)選可變域由Camelid重鏈(H2)抗體提供。優(yōu)選標(biāo)記(labelled)或標(biāo)記(tagged)—4殳配體。在本發(fā)明的方法，抗體多肽，衍生物或應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施方案中，一般配體為選自附錄2a),c),d)或e)的抗體可變域。本發(fā)明在第十四個(gè)方面中提供了從抗體多肽類的所有組成成分中選擇結(jié)合耙配體和一般配體的單一可變域的方法，該方法包括下列步驟域^和b)使選擇的可變域接觸一般配體并且選擇結(jié)合一般配體的可變域；其中一般配體為選自附錄2(c)或(e)的抗體可變域；且其中(i),當(dāng)選擇的可變域?yàn)橹劓溈勺冇驎r(shí)，一般配體為輕鏈可變域；或(ii)當(dāng)選擇的可變域?yàn)檩p鏈可變域時(shí)，一般配體為重鏈可變域。優(yōu)選抗體多肽類的所有組成成分為重鏈可變域的所有組成成分,一般配體為輕鏈可變域。優(yōu)選抗體多肽類的所有組成成分為輕鏈可變域的所有組成成分，一般配體為重鏈可變域。優(yōu)選該方法包括產(chǎn)生選擇的可變域的突變體或衍生物的步驟。優(yōu)選一般配體結(jié)合與選擇的可變域相同的耙配體種類。優(yōu)選一般配體結(jié)合與選擇的可變域不同的靶配體種類。優(yōu)選該方法包括下列步驟合并選擇的可變域與和一般配體相同的抗體可變域或其衍生物，以便產(chǎn)生基因耙配體結(jié)合特異性的產(chǎn)物。29本發(fā)明在第十五個(gè)方面中提供了生產(chǎn)附錄2(c)(i)-(iv)中結(jié)合靶配體的抗體或抗體片段衍生物的方法，該方法包括a)使用所述抗體或片段的重鏈可變域或相同的可變域作為第14個(gè)方面的方法中的一般配體，并且其中用于步驟a)中的靶配體為抗體或片段結(jié)合的靶配體，由此選擇結(jié)合靶配體和重鏈可變域的輕鏈單一可變結(jié)構(gòu)域；和b)用選擇的輕鏈可變域；相同的輕鏈可變域或其衍生物取代抗體或片段輕鏈可變域中的至少一種。本發(fā)明在第十六個(gè)方面中提供了生產(chǎn)附錄2(c)(i)-(iv)中任意相中的多特異性抗體或抗體片段衍生物的方法，該方法包括a)使用所述抗體或片段的重鏈可變域(或相同的可變域)作為第14個(gè)方面方法中的一般配體，并且其中用于步驟a)中的靶配體為不同于抗體或片段結(jié)合的耙配體的耙配體，由此選擇結(jié)合不同靶配體和重鏈可變域的輕鏈單一可變域；和b)用選擇的輕鏈可變域；相同的輕鏈可變域或其衍生物取代抗體或片段輕鏈可變域中的至少一種，由此產(chǎn)生多特異性產(chǎn)物。優(yōu)選在第15和第16個(gè)方面中，輕鏈可變域選自人輕鏈可變域；來源于人的輕鏈可變域；具有FW2序列的輕鏈可變域，所述FW2序列與由種系基因序列DPK9編碼的FW2相同；Camelid輕鏈可變域；來源于Camelid的輕鏈可變域；和人源化Camelid或鼠輕鏈可變域。本發(fā)明在第十七個(gè)方面中提供了生產(chǎn)附錄2(c)(i)-(iv)中的任意項(xiàng)中結(jié)合華巴配體的抗體或抗體片段衍生物的方法，該方法包括a)使用所述抗體或片段的輕鏈可變域(或相同可變域)作為第14個(gè)方面的方法中的一般配體，并且其中用于步驟a)中的耙配體為抗體或片段結(jié)合的草巴配體，由此選擇結(jié)合耙配體和輕鏈可變域的重鏈單一可變域；和b)用選擇的重鏈可變域；相同重鏈可變域或其衍生物取代抗體或片段重鏈可變域中的至少一種。本發(fā)明在笫十八個(gè)方面中提供了生產(chǎn)附錄2(c)(i)-(iv)中的任意項(xiàng)中的抗體或抗體片段度特異性衍生物的方法，該方法包括a)使用所述抗體或片段的輕鏈可變域(或相同可變域)作為權(quán)利要求94的方法中的一般配體，并且其中用于步驟a)中的靶配體為不同于抗體或片l殳結(jié)合的靶配體的靶配體，由此選4奪結(jié)合不同耙配體和輕鏈可變域的重鏈單一可變域；和b)用選擇的重鏈可變域；相同重鏈可變域或其衍生物取代抗體或片段重鏈可變域中的至少一種，由此產(chǎn)生多特異性產(chǎn)物。優(yōu)選在第17和第18個(gè)方面中，重鏈可變域選自來源于Camelid的重鏈可變域；VHH結(jié)構(gòu)域；NanobodyTM;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH;人源化Camelid或鼠重鏈可變域；人源化NanobodyTM;人重鏈可變域；來源于人的重鏈可變域；具有FW2序列的重鏈可變域，所述FW2序列與種系基因序列DP47編碼的FW2相同；或具有與種系基因序列DP47編碼的44、45和47位相同的44、45和47位的重鏈可變域。優(yōu)選在笫15-18個(gè)方面中，a)選擇的可變域?yàn)橹劓溈勺冇蚯铱贵w或片段的重鏈可變域各自被選擇的重鏈可變域；相同的重鏈可變域或其衍生物取代；或b)選擇的可變域?yàn)檩p鏈可變域且抗體或片段的輕鏈可變域各自被選擇的輕鏈可變域；相同的輕鏈可變域或其衍生物取代。本發(fā)明還提供了可提供第15-第18個(gè)方面中任意一項(xiàng)的方法獲得的4汙生物。本發(fā)明在第十九個(gè)方面中提供了抗體或抗體片段的衍生物，其選自PanorexTM;RituxinTM;ZevalinTM;MylotargTM;CampathTM;Herceptin;ReoPro;Synagis;Xolair;Remicade;Simulect;OKT3TM;Orthoclone;Zenapax;Humira;Bexxar;Raptiva;Antegren;ErbituxTM;和Avastin,它可提供本發(fā)明第15-第18個(gè)方面中的任意一項(xiàng)獲得。本發(fā)明在第二十個(gè)方面中提供了所述衍生物或產(chǎn)物在人疾病或疾患的治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用。本發(fā)明在第二十一個(gè)方面中提供了所述衍生物或產(chǎn)物在人疾病或疾患的治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用。本發(fā)明在第二十二個(gè)方面中提供了所述衍生物或產(chǎn)物在人疾病或疾患的治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用，其中所述疾患為對(duì)附錄2(c)(i)中抗體或抗體片段所列的疾患。如果本發(fā)明涉及VH或VHH—般配體在選擇VL結(jié)構(gòu)域或反之亦然中的應(yīng)用，那么可以通過這類結(jié)構(gòu)域經(jīng)界面區(qū)內(nèi)在配對(duì)有利于選擇，例如，相關(guān)界面區(qū)可以包含VH和VHH結(jié)構(gòu)域(和VL結(jié)構(gòu)域的等效區(qū))的44、45和47位，這類編號(hào)遵循Kabat。因此，具有人界面的VL(例如44G、45L和47W)的應(yīng)用可以用于從文庫中選擇CamelidVHH結(jié)構(gòu)因此，這選擇了VHH結(jié)構(gòu)域中的人-類特征，由此為我們提供了人中有用的VHH產(chǎn)品(例如用于疾病療法)和/或用于人的相容性產(chǎn)品的進(jìn)一步研發(fā)的有用的主導(dǎo)。附圖簡述圖1:表示表現(xiàn)出廣泛天然多樣性并且能夠接觸抗原的人抗體所有組成成分vh和vk區(qū)中的位置的棒形圖(參見Tomlinson等(1996)/.tWo/.Ao/.,256:813)。在該示意圖中顯示了H3和L3末端，不過，它們也是高度不同的并且能夠接觸抗原。盡管人X基因中的序列多樣性已經(jīng)得到充分表征(參見Ignatovich等(1997)丄A/o/.Ao/,268:69)，但是就三維入結(jié)構(gòu)而言，目前幾乎沒有有關(guān)抗原接觸的數(shù)據(jù)存在。圖2:構(gòu)成本發(fā)明文庫基礎(chǔ)的scFv序列。目前存在兩種形式的文庫"初級(jí)"文庫，其中18個(gè)位置發(fā)生改變；和"體細(xì)胞"文庫，其中12個(gè)位置發(fā)生改變。顯示了6個(gè)環(huán)區(qū)H1，H2,H3,Ll,L2和L3。給根據(jù)Kabat定義的CDR區(qū)(Kabat等(1991)'Se《we"c^o//rato'朋o//mwwwo/og/ca//她reW,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)加下劃線。圖3:使用一般配體蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)選擇前后本發(fā)明文庫中的功能性分析。此處的蛋白質(zhì)L位于ELISA平板上，scFv上清液與之結(jié)合并且使用蛋白質(zhì)A-HRP檢測scFv結(jié)合。因此，僅那些能夠結(jié)合蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)L的scFv產(chǎn)生ELISA信號(hào)。圖4:在使用牛遍在蛋白，大鼠BIP,牛組蛋白，NIP-BSA,FITC-BSA,人瘦蛋白，人甲狀腺球蛋白，BSA,雞卵溶菌酶，小鼠IgG32和人IgG淘選后選自本發(fā)明文庫的克隆的序列。在序列上加的下劃線表示在相應(yīng)文庫中改變的位置。圖5:5a:宿主細(xì)胞中由未選擇和預(yù)選擇的"初級(jí)，，DVT文庫產(chǎn)生的scFv濃度的比較。5b:作為根據(jù)已知標(biāo)準(zhǔn)品測定的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖6:來自預(yù)選擇和未選擇的"初級(jí)"DVT文庫的噬菌體的蛋白質(zhì)印跡，使用抗-噬菌體pIII抗體探測所述文庫以便測定具有scFv的噬菌體百分比。發(fā)明詳述定義所有組成成分(repertoire)所有組成成分為不同變體的群體，例如在核苷酸序列上不同的核酸變體或在氨基酸序列方面不同的多肽變體。本發(fā)明的文庫包括多肽類或核酸的所有組成成分。按照本發(fā)明設(shè)計(jì)多肽類的所有組成成分，以便具有一般配體的結(jié)合位點(diǎn)和靶配體的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合位點(diǎn)可以在分子的相同區(qū)內(nèi)重疊或位于其中，但其特異性不同。生物體本文所用的術(shù)語"生物體"意旨所有的細(xì)胞生命形式，諸如原核細(xì)胞和真核細(xì)胞；以及非-細(xì)胞的含核酸的本，諸如噬菌體和病毒。功能性本文所用的術(shù)語"功能性"意旨具有天然產(chǎn)生的其類型的蛋白質(zhì)的天然生物活性或任意特異性所需活性的多肽，例如根據(jù)下文定義的其結(jié)合配體分子的能力判定。"那些"多肽類的實(shí)例包括通過其抗原結(jié)合部位特異性結(jié)合抗原的抗體，結(jié)合其特征配體的受體分子(例如T-細(xì)胞受體)和結(jié)合其底物的酶。為了按照將多肽分類為本發(fā)明的功能性，遵循首先必須對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)加工處理和折疊以便保持其總體結(jié)構(gòu)完整性，正如根據(jù)也如下文定義的其結(jié)合一般配體的能力判定的。為避免疑問，功能性并非與結(jié)合靶配體的能力等效。例如，功能性抗-CEA單克隆抗體不能特異性結(jié)合靶配體，諸如細(xì)菌LPS。然而，因?yàn)樗軌蚪Y(jié)合靶配體(即它能夠結(jié)合CEA,只要CEA為靶配體)，所以將其分類為"功能性"抗體分子并且可以如下所述根據(jù)結(jié)合一般配體選擇。一般而言，非-功能性抗體分子不能結(jié)合任何靶配體。一般配體一般配體為結(jié)合指定所有組成成分中的大部分功能性成員的配體。因此，相同的一般配體可以結(jié)合所有組成成分中的許多成員，而與其靶配體特異性無關(guān)(參見下文)。一般而言，存在功能性一般配體結(jié)合位點(diǎn)表明所有組成成分成員得到正確表達(dá)和折疊。因此，一般配體與其結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合提供了從多肽類的所有組成成分中預(yù)選擇功能性多肽類的方法。把配體耙配體為所有組成成分中的特異性結(jié)合成員或多個(gè)成員得以鑒定的配體。如果所有組成成分中的成員為抗體分子，那么靶配體可以為抗原，并且如果所有組成成分中的成員為酶，那么靶配體可以為底物。結(jié)合耙配體依賴于如上文一疾癡傳中所述所有組成成分中成員為功能性的，并且依賴于靶配體的結(jié)合位點(diǎn)的精確特異性。亞組亞組為所有組成成分的組成部分。就本發(fā)明而言，通常的情況是，僅所有組成成分的亞組為功能性的且由此具有功能性一般配體結(jié)合位點(diǎn)。此外，還可能的是，僅所有組成成分的功能性成員的部分(明顯超過結(jié)合指定的耙配體)結(jié)合一般配體。能夠按照本發(fā)明選擇這些亞組?？梢院喜⒒蚣衔膸靵喗M以便產(chǎn)生新的按照所需標(biāo)準(zhǔn)預(yù)選擇的所有組成成分。合并或集合的所有組成成分可以為通過一般配體結(jié)合預(yù)選擇的多肽成員的單一混合物，或可以操作以便合并兩個(gè)多肽亞組。例如，可以各自預(yù)篩選VH和VL多肽類且隨后在遺傳水平上在單一載體上合并，使得它們作為合并的VH-VL二聚體，諸如scFv得以表達(dá)。文庫術(shù)語文庫意旨異源多肽類或核酸的混合物。該文庫由具有單一多肽或核酸序列的成員組成。就這一程度而言，義岸與摩^"逸^成為、為同義詞。文庫成員之間序列差異導(dǎo)致文庫中存在的多樣性。該文庫采用可多肽類或核酸的單一混合物或可以為使用核酸文庫轉(zhuǎn)化的生物體或相同的形式，例如細(xì)菌、病毒、動(dòng)物或才直物細(xì)月包等。優(yōu)選各生物體或相同各自僅包含該文庫中的一個(gè)成員。有利的是，將核酸摻入表達(dá)載體，以便能夠表達(dá)由所述核酸編碼的多肽類。因此，在一個(gè)優(yōu)選的方面中，文庫可以采用宿主生物體群體的形式，各生物體包含表達(dá)載體的一個(gè)或多個(gè)拷貝，所述表達(dá)載體包含可以表達(dá)以便產(chǎn)生其相應(yīng)的多肽成員的核酸形式的文庫中的單一成員。因此，宿主生物體群體具有編碼遺傳上不同的多肽變體的大量所有組成成分的潛能。免疫球蛋白超家族其意旨保持免疫球蛋白(抗體)分子的免疫球蛋白折疊特性的多肽類家族，其包含兩個(gè)P折疊和通常保守的二硫鍵。免疫球蛋白超家族中的成員涉及體內(nèi)細(xì)胞和非-細(xì)胞相互作用的許多方面，包括在免疫系統(tǒng)中的廣泛作用(例如抗體，T-細(xì)胞受體分子等)，涉及細(xì)胞黏著(例如ICAM分子)和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)(例如受體分子，諸如PDGF受體)。本發(fā)明適合于所有免疫球蛋白超家族分子，因?yàn)槠渲械淖兓灶愃频姆绞綄?shí)現(xiàn)。優(yōu)選本發(fā)明涉及免疫球蛋白(抗體)。主鏈構(gòu)象主鏈構(gòu)象意旨三維形式的結(jié)構(gòu)的C口骨架痕跡。當(dāng)考慮到抗體或TCR分子的各高變環(huán)時(shí)，主鏈構(gòu)象與規(guī)范結(jié)構(gòu)為同義詞。諸如Chothia和Lesk(1987)丄A/o/.S,o/.，196:901和Chothia等(1989)A^we,342:877所述，抗體展示出有限數(shù)量的規(guī)范結(jié)構(gòu)，其6各高變環(huán)中有5個(gè)(H1,H2，Ll,L2和L3),不過，在環(huán)自身中存在相當(dāng)?shù)膫?cè)鏈多樣性。顯示出的精確的規(guī)范結(jié)構(gòu)依賴于環(huán)的長度和涉及其包裝的某些關(guān)鍵殘基的個(gè)性。更不用說第6個(gè)環(huán)(H3)在長度和序列方面具有的不同，且由此僅表現(xiàn)出某些短環(huán)長度的規(guī)范結(jié)構(gòu)(Martin爭(1996)丄Mo/.5/o/.，263:800;Shirai等n996)FE^S丄e"eM,399:1)。在本發(fā)明中，所有6個(gè)環(huán)優(yōu)選具有規(guī)范結(jié)構(gòu)且由此已知完整抗體分子的主鏈構(gòu)象。抗體多肽抗體為由B細(xì)胞產(chǎn)生并且構(gòu)成脊推動(dòng)物宿主免疫防御系統(tǒng)的中心組成部分的免疫球蛋白。本文所用的抗體多肽為多肽，其為修飾或未修飾的抗體或抗體部分。因此，術(shù)語抗體多肽包括重鏈輕鏈，重鏈-輕鏈二聚體，F(xiàn)ab片段，F(xiàn)(ab')2片段，Dab片段或Fv片段，包括單鏈Fv(scFv)。構(gòu)建這類抗體分子的方法為本領(lǐng)域眾所周知的。超抗原超抗原為大部分為在細(xì)菌中表達(dá)的毒素形式的抗原，它們?cè)谶@些分子的常用配體結(jié)合位點(diǎn)外部與免疫球蛋白超家族中的成員發(fā)生相互作用。葡萄球菌屬(Staphylococcal)腸毒素類與T-細(xì)胞受體發(fā)生相互作用并且具有刺激CD4+T-細(xì)胞的作用?？贵w的超抗原包括結(jié)合IgG恒定區(qū)的分子蛋白質(zhì)G(Bjorck和Kronvall(1984)丄/附mw"o/,133:969;Reis等(1984)丄/mmw"o/.,132:3091),IgG恒定區(qū)和VH結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)A(Forsgren和Sjoquist(1966)/mmw"o/.,97:822)和結(jié)合VL結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)L(Bjorck(1988)丄/mm柳o/.,140:1994)。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明提供了消除多肽文庫中的非-功能性或難以折疊/表達(dá)的成員(或顯著減少其比例)，同時(shí)在對(duì)"靶配體"的特異性進(jìn)行選擇前富集功能性的，折疊的和充分表達(dá)的成員的選擇系統(tǒng)。使多肽分子的所有組成成分接觸"一般配體"，即具有對(duì)所有功能性常見的結(jié)構(gòu)特征的親和力的蛋白質(zhì)，例如完全和/或正確折疊的相關(guān)類型的蛋白質(zhì)。注意術(shù)語"配體"在涉及用于本發(fā)明的分子時(shí)廣泛術(shù)語。本文所用的術(shù)語"配體"意旨結(jié)合多肽文庫中的成員或被它們所結(jié)合的任意本體。存在于最初所有組成成分中的缺陷蛋白質(zhì)中的大量成員難以結(jié)合一般配體且由此被消除。這種從文庫中選擇性除去非-功能性多肽類導(dǎo)致其實(shí)際大小明顯減小，同時(shí)其功能性大小得以維持，其中其質(zhì)量相應(yīng)提高。通過結(jié)合一般配體保持的多肽類構(gòu)成了原始所有組成成分的'首先選擇的集合，或'亞組'。因此，富集這一'亞組，的最初所有組成成分中功能性的，充分折疊和充分表達(dá)的的成員。隨后使首先選擇的集合或亞組多肽類接觸至少一種"粑配體"，該耙配體結(jié)合具有指定功能特異性的多肽類。這類靶配體包括，但不限于半數(shù)受體/配體對(duì)(例如激素或其它細(xì)胞-信號(hào)傳導(dǎo)分子，諸如神經(jīng)遞質(zhì)及其關(guān)連受體)中的各自，細(xì)胞黏著分子結(jié)合對(duì)中的各自，由針對(duì)定向于的特定抗體的酶、蛋白質(zhì)、肽或小有機(jī)化合物乃至抗體自身。因此，這類文庫的應(yīng)用在時(shí)間和材料方面比常規(guī)的文庫勞動(dòng)強(qiáng)度更低并且更經(jīng)濟(jì)。此外，與未使用一般配體選擇的所有組成成分相比，因?yàn)槭紫冗x擇的集合包含遠(yuǎn)高于那些不能結(jié)合靶配體的比例的能夠結(jié)合耙配體的分子，所以在使用"靶配體"選擇過程中的背景顯著降低。本發(fā)明還關(guān)注組合選擇方案?？梢允褂貌煌话愫?或靶配體平行或串連相同最初多肽所有組成成分的多重選擇。因此，可以首先使用單——般配體選擇所有組成成分，且然后隨即使用不同靶配體進(jìn)行平行選擇。然后單獨(dú)或組合使用所得亞組，其中該組合的亞組具有一定范圍的靶配體特異性，并且具有單——般配體特異性?；蛘撸梢允紫仁褂脝我话信潴w選擇所有組成成分，且然后隨即使用不同一般配體進(jìn)行平行選擇。然后單獨(dú)或組合使用所得亞組，其中該組合的亞組具有一定范圍的一般配體特異性，并且具有單一靶配體特異性。還關(guān)注更^r細(xì)方案的應(yīng)用。例如，可以^使用兩種不同的一^:配體對(duì)最初所有組成成分進(jìn)行兩個(gè)循環(huán)的選擇，隨后使用靶配體進(jìn)行選擇。該過程產(chǎn)生一個(gè)亞組，其中所有成員既結(jié)合一般配體，又結(jié)合靶配體?；蛘?，如果使用兩種一般配體對(duì)最初所有組成成分進(jìn)行平行選擇并且合并所得亞組且然后使用耙配體進(jìn)行選擇，那么所得亞組結(jié)合兩種一般配體和耙配體中的至少一種。合并或集合的所有組成成分可以為所述亞組的單一混合物或可以才乘作以{更以物理方式連接亞組。例如，可以通過結(jié)合兩種不同的一般配體平行地各自選擇VH和VL多肽類，且隨后以遺傳水平合并在單一載體上，使得它們作為合并的VH-VL得以表達(dá)。然后可以對(duì)耙配體選擇這種所有組成成分，使得選擇的成員既能夠結(jié)合一般配體，又能夠結(jié)合靶配體。本發(fā)明包括通過上文廣泛描述的方法選擇的或可通過上述方法選擇的功能性多肽類的文庫，以及編碼可以用于按照這些方法進(jìn)行的選擇的多肽分子(優(yōu)選包含第一耙配體結(jié)合位點(diǎn)和第二一般配體結(jié)合位點(diǎn)的分子)的核酸文庫。此外，本發(fā)明提供了檢測，固定，純化或免疫沉淀使用本發(fā)明的一般或靶配體選擇的功能性多肽類所有組成成分中的一個(gè)或多個(gè)成員的方法。本發(fā)明特別適合于富集免疫球蛋白超家族中的分子文庫。這在有關(guān)生成抗體和T-細(xì)胞受體群體方面是特別確切的，所述抗體和T-細(xì)胞受體為功能性的并且具有所需的特異性，因?yàn)檫@是用于診斷，治療或預(yù)防操作所需的。為了達(dá)到這一目的，本發(fā)明提供了抗體和T-細(xì)胞受體文庫，其中所有的成員均具有天然構(gòu)架和已知主鏈構(gòu)象的環(huán)，并且本發(fā)明提供了起始序列的有用誘變和由此生成的功能性變體的隨后選擇的策略。這類多肽文庫可以包含VH或Vp結(jié)構(gòu)域，或可選擇的是，它可以包含VL或Va結(jié)構(gòu)域乃至兩種VH或Vp和VL或Va結(jié)構(gòu)域。在本領(lǐng)域中存在對(duì)改善的抗體或T-細(xì)胞受體分子文庫的需求。例如，盡管在生成"單罐"噬菌體-抗體文庫中存在進(jìn)展，但是仍然存在幾個(gè)問題。使用采集自人B細(xì)胞的重排V基因的天然文庫(Marks等(1991)7.A/o/.5/o/.，222:581;Vaughan等(1996)A^m^Ao&c/z.,14:309)因體內(nèi)B細(xì)胞的正和負(fù)選擇而高度偏移。這一結(jié)果可以限制由重排V基因構(gòu)建的噬菌體文庫的有效大小。此外，來源于天然文庫的克隆不變地包含構(gòu)架突變，在用于人療法時(shí)，這些突變可以影響抗體免疫原性。合成文庫0^00經(jīng)6111300111&Winter(1992)丄M/.Ao/.,227:381;Barbas等(1992)尸rac.Ato/.爿cm/.Sc.t/&4,89:4457;Nissim等(1994)EA^(9J.,13:692;Griffiths等(1994)EMB(9J.，13:3245;DeKruif等(1995)J.Mo/.Ao/.,248:97)可以克服偏性問題，但它們需要使用長的簡并PCR引物，這些引物通常將堿基-對(duì)導(dǎo)入裝配的V基因。這種高度的隨機(jī)化還可以導(dǎo)致不能正確折疊且由此還為非功能性的抗體生成。在許多情況中，可能的情況是，這些非-功能性成員在數(shù)目上超過文庫中的功能性成員。盡管可以通過使用共有構(gòu)架序列合成一組'主基因'并且通過摻入所示的氨基酸取代來改善折疊和表達(dá)而預(yù)優(yōu)化構(gòu)架的折疊和/或表達(dá)(W097/08320,Morphosys)，但是仍然存在免疫原性的問題，因?yàn)樵诖蟛糠智闆r中，共有序列并不相當(dāng)于任何天然構(gòu)架。此外，由于CDR多樣性也基因折疊和/或表達(dá)作用是可能的，所以在完全裝配V基因后可優(yōu)先優(yōu)化折疊和/或表達(dá)(并且除去任何移碼或終止密碼子)。使用現(xiàn)存文庫的另一個(gè)問題在于，因?yàn)橹麈湗?gòu)象為異源的，所以三維結(jié)構(gòu)的模型化是困難的，因?yàn)闊o法獲得合適的高分辨率晶體學(xué)數(shù)據(jù)。這是H3區(qū)的具體問題，其中大部分來源于天然或合成抗體文庫的抗體具有中等長度或長環(huán)且由此不能模型化。使用現(xiàn)存文庫的另一個(gè)問題在于對(duì)用于檢測表達(dá)的抗體片段的附加表位(諸如myc、FLAG或HIS標(biāo)記)的依賴。因?yàn)樗鼈兺ǔＮ挥诳贵w片段的N或C末端上，所以它們趨向易于發(fā)生蛋白酶剪切。超抗原，諸如蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)可以用于通過結(jié)合折疊結(jié)構(gòu)域自身而檢測表達(dá)的抗體片段，但因?yàn)樗鼈優(yōu)閂H和VL家族特異性所以在任何現(xiàn)存抗體文庫中，僅相對(duì)少量成員會(huì)結(jié)合這些試劑之一且甚至較少比例結(jié)合它們兩者。為了這一目的，需要擁有選擇系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以消除文庫中非-功能性或難以折疊/表達(dá)的成員(或減少其比例)，此后對(duì)靶可以進(jìn)行選擇，同時(shí)富集其中能夠結(jié)合一般配體，諸如超抗原蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)L的功能性的，折疊的和充分表達(dá)的所有成員。此外，有利的是構(gòu)建抗體文庫，其中所有成員具有天然構(gòu)架并且具有具備已知主鏈構(gòu)象的環(huán)。本發(fā)明由此提供了方法，通過該方法可以選擇多肽所有組成成分以便除去非-功能性成員。這導(dǎo)致實(shí)際的文庫大小顯著減小(且文庫質(zhì)量相應(yīng)增加)，但不會(huì)減小功能性文庫大小。本發(fā)明還提供了生成新的多肽所有組成成分的方法，其中所有功能性成員能夠結(jié)合指定的一般配體。相同的一般配體可以用于隨后所有組成成分中的任意一個(gè)或多個(gè)成員的檢測、固定、純化或免疫沉淀。任意'純的，或'免疫，抗體所有組成成分可以用于本發(fā)明，以便富集功能性成員和/或富集結(jié)合指定的一般配體或多種配體的成員。實(shí)際上，由于僅較小百分比的所有人種系VH片段以高親和力結(jié)合蛋白質(zhì)A，并且僅較小百分比的所有人種系VL片段以高親和力結(jié)合蛋白質(zhì)L,這些超抗原是高度有利的?；蛘?，通過使用附加表位預(yù)選擇能夠從合成文庫中除去非-功能性變體。易于預(yù)選擇的文庫包括，但不限于由Marks等(1991)J.Mo/.,222:581和Vaughan等(1996)A^we，14:309所述類型的體內(nèi)重排的V基因組成的文庫；合成文庫，其中種系V基因片段在體外'重排'(Hoogenboom&Winter(1992)丄A/o/.AW.,227:381;Nissim等(1994)￡A^OJ.,13:692;Griffiths等(1994)五Affi(9J.,13:3245;DeKruif等(1995)A^/.Ao/.,248:97)或?qū)⑵渲泻铣蒀DRs摻入單一重排的V基因(Barbas等(1992)尸rac.A^/.jcat/.Scz.89:4457)或摻入多個(gè)主構(gòu)架(W097/08320,Morphosys)。本發(fā)明多肽類的選擇一旦生成了變體的多肽類集合，就施用本發(fā)明的選擇。兩種廣泛的選擇操作步驟基于一般和靶配體所施用的順序；有關(guān)這些方案的組合變化形式包括在指定選擇步驟中使用多個(gè)一般和/或靶配體。當(dāng)使用組合方案時(shí)，例如，可以使多肽分子即刻或各自單獨(dú)串連地集合接觸幾種耙配體；在后一種情況中，可以單獨(dú)保存所得的選擇的多肽類集合，或收集它們自身。可以將這些選擇方案概括如下a.選擇搡作l-.使用一般配體的初級(jí)多肽選擇39為了除去文庫中的非-功能性成員，選擇一般配體，使得一般配體僅由功能性分子結(jié)合。例如，一般配體可以為金屬離子，抗體(單克隆抗體或抗體多克隆混合物形式)，半數(shù)酶/配體復(fù)合物或有機(jī)物；注意這些類型中的任意種的配體另外或可選擇地用作本發(fā)明的靶配體。在下文中詳細(xì)討論了抗體產(chǎn)生和金屬親和色譜法。實(shí)際上，在文庫成員上的這些配體結(jié)合位點(diǎn)(例如肽標(biāo)記或超抗原結(jié)合位點(diǎn))具有恒定結(jié)構(gòu)或序列，該結(jié)構(gòu)在非-功能性成員中易于不存在或改變。就抗體文庫而言，該方法具有從僅那些具有指定超抗原或單克隆抗體的結(jié)合位點(diǎn)的功能性成員的文庫中選擇的應(yīng)用；這類手段用于從天然和合成集合中選擇功能性抗體多肽類。超抗原蛋白質(zhì)A和/或蛋白質(zhì)L在本發(fā)明中具有作為選擇抗體所有組成成分的一般配體的應(yīng)用，因?yàn)樗鼈兎謩e正確結(jié)合折疊的VH和VL結(jié)構(gòu)域(屬于某些VH和VL家族)，而與靶配體結(jié)合位點(diǎn)的序列和結(jié)構(gòu)無關(guān)。此外，蛋白質(zhì)A或另一種超抗原蛋白質(zhì)G具有作為一般配體的應(yīng)用，所述一般配體可通過結(jié)合抗體的重鏈恒定域選擇折疊和/或表達(dá)。抗-k和抗-X抗體也具有在選擇輕鏈恒定域中的應(yīng)用?？贵w或其它結(jié)合蛋白，諸如蛋白質(zhì)A的小有機(jī)分子才莫擬物(Li等(1998)A^w^Ao&c/z.,16:190)也是有用的。當(dāng)使用這一選擇操作時(shí)，一般配體因其確切的性質(zhì)而能夠結(jié)合預(yù)選擇的所有組成成分中的所有功能性成員；因此，該一般配體(或其某些綴合物)可以用于檢測，固定，純化或免疫沉淀來自所有組成成分的任意成員或成員群體(無論是否通過結(jié)合指定靶配體選擇，如下所述)。可以通過下文討論的有關(guān)測試抗體選擇配體在本發(fā)明中的應(yīng)用的技術(shù)進(jìn)行通過免疫測定技術(shù)的蛋白質(zhì)檢測和對(duì)本發(fā)明所有組成成分的成員多肽類的免疫沉淀(參見"Antibodyforuseasligandsinpolypeptideselection")。通過所有組成成分多肽成員與本發(fā)明一般或靶配體的特異性結(jié)合進(jìn)行固定，所述本發(fā)明一般或靶配體自身與固相或半固相支持體連接，諸如濾膜(例如硝化纖維或尼龍濾膜)或色譜支持體(包括，但不限于纖維素，聚合物，樹脂或二氧化硅支持體)；可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的化學(xué)交聯(lián)劑中的任意成員使成員多肽與一般或靶配體進(jìn)行共價(jià)結(jié)合。在技術(shù)親和色語支持體上的固定如下所述(參見"Metallicligandsasusefortheselectionofpolypeptides")。純化可以包含這些技術(shù)中的任意種或其組合，特別是免疫沉淀和通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知方法進(jìn)4亍的色i普。使用這一手段，可以使用多種一般配體交替進(jìn)行選擇，以便生成所有組成成分，其中所有成員單獨(dú)平行地結(jié)合兩種或多種一般配體，以便隨后可以合并亞組(就此而言，預(yù)選擇的所有組成成分中的成員結(jié)合一般配中的至少一種)或隨后被分別摻入相同的多肽鏈，由此在大功能性文庫中，所有成員能夠結(jié)合預(yù)選擇過程中使用的所有一般配體。例如，可以使用結(jié)合抗體分子的重鏈和輕鏈的不同一般配體(參見下文)從一種或多種文庫中選擇亞組，且任何合并成重鏈/輕鏈文庫，其中，例如通過使用單鏈Fv背景中的VH和VL結(jié)構(gòu)域使重鏈和輕鏈非-共價(jià)結(jié)合或共價(jià)結(jié)合。使用耙配體的二次多肽選擇在使用一般配體的選擇步驟后，篩選文庫以便鑒定結(jié)合靶配體的成員。因?yàn)樵谑褂靡话闩潴w選擇后富集功能性多肽類，所以有利的是在使用靶配體選擇過程中減少非特異性("背景")。此外，由于使用一般配體的選擇使實(shí)際文庫大小產(chǎn)生顯著減小(和相應(yīng)的文庫質(zhì)量提高)，而不會(huì)減小功能性文庫大小，所以較小的所有組成成分應(yīng)引起與較大起始所有組成成分(包含許多非-功能性和難以折疊/表達(dá)的成員)相同的靶配體特異性和親和力多樣性。一種或多種耙配體可以用于從使用一般配體生成的首次選擇的多肽集合中選擇多肽類。在兩種或多種靶配體用于生成許多不同亞組的情況中，可以將這些亞中的兩種或多種合并成單一的更復(fù)雜的亞組。單——般配體能夠結(jié)合所得合并亞組中的每一成員；然而，指定的靶配體僅結(jié)合亞組的文庫成員。b.選擇操作2:使用耙配體的所有組成成分成員的最初選擇此處，在使用一般配體選擇;i:進(jìn)行使用靶配體的選擇。顯然，相同組的多肽類可以由任一方案產(chǎn)生，只要這類結(jié)果是理想的。使用這一手段，可以平行或通過混合用于選擇的靶配體進(jìn)行使用多種靶配體的選擇。如果平行進(jìn)行，那么，如果需要，可以合并所得亞組。使用一般配體的二次多肽選擇然后可以使用一種或多種一般配體進(jìn)行隨后的靶配體結(jié)合亞組選擇。盡管這并非功能的選擇，但是由于能夠結(jié)合靶配體的所有組成成分成員具有確定的功能性，所以它能夠成為結(jié)合分離的不同一般配體的亞組。因此，可以用一種一般配體或用兩種或多種一^1配體選擇耙配體選擇的群體。在此情況中，可以交替使用一般配體以便生成所有組成成分，其中所以成員結(jié)合或單獨(dú)平行地結(jié)合靶配體和兩種或多種一般配體，以便生成不同的(單可能是重疊)結(jié)合靶配體和不同一般配體的亞組。然后可以合并它們(就此而言，成員結(jié)合一般配體中的至少一種)。免疫球蛋白-家族多肽文庫成員的選擇蛋白超家族分子，特別是抗體多肽^或T-細(xì)胞受體多肽類。就^體而言，預(yù)計(jì)本發(fā)明的方法可以適合于本領(lǐng)域中公知的現(xiàn)存抗體文庫中的任意種(無論是天然的還是合成的)或適合于使用一般配體具體設(shè)計(jì)的抗體文庫(參見下文)。本發(fā)明文庫的構(gòu)建a.主鏈構(gòu)象的選擇免疫球蛋白超家族中的成員均共有其多肽鏈的類似折疊。例如，盡管抗體在其基本序列方面非常不同，但是序列對(duì)比和晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)揭示出，與預(yù)計(jì)的相反，抗體的6個(gè)抗原結(jié)合環(huán)中的5個(gè)(H1，H2，Ll,L2和L3)采用了有限數(shù)量的主鏈構(gòu)象或規(guī)范結(jié)構(gòu)(Chothia和Lesk(1987),參見上文；Chothia等(1989),參見上文)。對(duì)環(huán)長度和關(guān)鍵殘基的分析由此能夠預(yù)測在大部分人抗體中發(fā)現(xiàn)的HI,H2,Ll,L2和L3的主鏈構(gòu)象(Chothia等(1992)，參見上文；Tomlinson等(1995),參見上文；Williams等(1996),參見上文)。盡管H3區(qū)在序列，長度和結(jié)構(gòu)方面遠(yuǎn)不同(因D片段的應(yīng)用所致)，但是它也形成用于短環(huán)長度的有限數(shù)量的主鏈構(gòu)象，這取決于特定殘基或殘基類型的長度和存在，在環(huán)上的關(guān)鍵位置和抗體構(gòu)架(Martin等(1996),參見上文；Shirai等(1996),參見上文)。按照本發(fā)明設(shè)計(jì)抗體多肽類文庫，其中選擇一定的環(huán)長度和關(guān)鍵殘基以確保已知成員的主鏈構(gòu)象。有利的是，它們?yōu)閷?shí)際發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白超家族分子的確切構(gòu)象，從而將它們?yōu)槿缟纤龇枪δ苄缘臋C(jī)會(huì)降至最低限度。種系V基因片段用作構(gòu)建抗體或T-細(xì)胞受體文庫的一種合適的基礎(chǔ)構(gòu)架；其它序列也是有用的。變化可以以低頻率發(fā)生，使得少量功能性成員可以具有改變的主鏈構(gòu)象，但這不會(huì)影響其功能。規(guī)范結(jié)構(gòu)原理也應(yīng)用于本發(fā)明，以便評(píng)價(jià)由抗體編碼的不同主鏈構(gòu)象中的成員，從而預(yù)測基于抗體序列的主鏈構(gòu)象并且選擇用于不影響規(guī)范結(jié)構(gòu)的多樣化的殘基。目前已知，在人VK結(jié)構(gòu)域中，Ll環(huán)可以采用4種規(guī)范結(jié)構(gòu)之一，L2環(huán)具有單一規(guī)范結(jié)構(gòu)且90%的人Vk結(jié)枸域采用4或5種用于L3環(huán)的規(guī)范結(jié)構(gòu)之一(Tomlinson等(1995),參見上文)；因此，在單獨(dú)的VK結(jié)構(gòu)域中，不同規(guī)范結(jié)構(gòu)可以合并成一定范圍的不同主鏈構(gòu)象。由于V、結(jié)構(gòu)域編碼不同范圍的Ll,L2和L3環(huán)的規(guī)范構(gòu)象且Vk和V、結(jié)構(gòu)域可以與可編碼Hl和H2環(huán)的幾種規(guī)范結(jié)構(gòu)的任意VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)，所以度這5種環(huán)觀察到的規(guī)范結(jié)構(gòu)組合數(shù)量極大。這意味著主鏈構(gòu)象中產(chǎn)生多樣性對(duì)產(chǎn)生廣泛的結(jié)合特異性而言可能是必不可少的。然而，與預(yù)測的相反，通過構(gòu)建基于單一已知主鏈構(gòu)象的抗體文庫，發(fā)現(xiàn)在主鏈構(gòu)象中的多樣性并非生成可主要靶向所有抗原的足夠多樣性所需的。甚至更令人意外的是，單一主鏈構(gòu)象不必為共有結(jié)構(gòu)-單一天然存在的構(gòu)象可以用作完整文庫的基礎(chǔ)。因此，本發(fā)明在一個(gè)優(yōu)選的方面中提供了文庫，其中的成員編碼單一已知的主鏈構(gòu)象。然而，應(yīng)理解可以發(fā)生偶然的變化，使得少量功能性成員可以具有可選擇的可能是未知的主鏈構(gòu)象。選擇的單一主鏈構(gòu)象優(yōu)選在所述免疫球蛋白超家族類型分子中是常規(guī)的。構(gòu)象在觀察到大量天然存在的分子采用它時(shí)為常規(guī)的。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的方面中，單獨(dú)考慮天然存在的免疫球蛋白超家族分子的各結(jié)合環(huán)的不同主鏈構(gòu)象，且然后選擇具有用于不同環(huán)的所需主鏈構(gòu)象組合的天然存在的免疫球蛋白超家族。如果無一可利用，那么可以選擇最接近的等效物。因?yàn)楝F(xiàn)有技術(shù)的免疫球蛋白-家族多肽文庫的缺陷在于許多成員具有非天然構(gòu)架或包含構(gòu)架突變(參見上文)，所以就抗體或T-細(xì)胞受體而言，優(yōu)選通過選擇編碼所需主鏈構(gòu)象的種系基因片段生成用于不同環(huán)的主鏈構(gòu)象的所需組合。更優(yōu)選頻繁表達(dá)選擇的種系基因片段并且最優(yōu)選它們?yōu)樽铑l繁表達(dá)的。因此。在設(shè)計(jì)抗體文庫中，可以單獨(dú)考慮6個(gè)抗原結(jié)合環(huán)各自的不同主鏈構(gòu)象的發(fā)生率。就H1、H2、Ll、L2和L3而言，選擇由天然存在分子的20%-100%的抗原結(jié)合環(huán)采用的指定構(gòu)象。一般而言，其觀察到的發(fā)生率高于35%(即35%-100%),并且實(shí)際上，高于50%乃至高于65%。因?yàn)榇蟛糠諬3環(huán)不具有規(guī)范結(jié)構(gòu)，所以優(yōu)先選擇在確實(shí)展示出規(guī)范結(jié)構(gòu)的那些環(huán)中為常規(guī)的主鏈構(gòu)象。就各環(huán)而言，由此選擇大部分通常在天然所有組成成分中觀察到的構(gòu)象。在人抗體中，各環(huán)的最常見的規(guī)范結(jié)構(gòu)(CS)如下Hl-CS1(79%的表達(dá)的所有組成成分)；H2畫CS3(46%);VJ勺Ll畫CS2(39%);L2-CS1(100%);Vk的L3-CS1(36%),計(jì)算推定K:人之比為70:30，Hood等(1967)CoW印n"g//a^or0^"A48:133)。就具有規(guī)范結(jié)構(gòu)的H3環(huán)而言，具有殘基94到殘基101的鹽-橋的7個(gè)殘基的CDR3長度(Kabat等(1991)iS^wewceso//rc^e/;wo//wmwwo/og/ca//爐reW,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)顯然最為常見。在EMBL數(shù)據(jù)文庫中存在至少16種具有所需H3長度和關(guān)鍵殘基的人抗體序列以便構(gòu)成這種構(gòu)象，并且在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中存在至少兩種可以用作抗體模型化基礎(chǔ)的晶體結(jié)構(gòu)(2cgr和ltet)。最頻繁表達(dá)的種系基因片段，即這種規(guī)范結(jié)構(gòu)的組合為VH片段3-23(DP-47),JH片段JH4b，Vk片段02/012(DPK9)和JK片段JK1。這些片段由此可以作為構(gòu)建具有所需單一主鏈構(gòu)象的文庫的基礎(chǔ)組合使用。或者，將天然存在的主鏈構(gòu)象組合用作選擇單一主鏈構(gòu)象的基礎(chǔ)，而不是基于分離中結(jié)合環(huán)各自的天然存在的不同主鏈構(gòu)象選擇單一主鏈構(gòu)象。就抗體而言，例如，可以確定抗原結(jié)合環(huán)中任意兩種，三種，四種，五種或所有6種的天然存在的規(guī)范結(jié)構(gòu)組合。此處，優(yōu)選選擇的構(gòu)象為天然存在的抗體中常見的并且最優(yōu)選在天然所有組成成分中最頻繁觀察到的。因此，在人抗體中，例如，當(dāng)考慮到五種抗原結(jié)合環(huán)Hl,H2,Ll,L2和L3的天然組合時(shí)，確定最頻繁的規(guī)范結(jié)構(gòu)的組合且然后與H3環(huán)的最常見構(gòu)象合并，作為選擇單一主鏈構(gòu)象的基礎(chǔ)。b.規(guī)范序列的多樣化由于選擇了幾種已知的主鏈構(gòu)象，或優(yōu)選單一已知的主鏈構(gòu)象，所以通過改變分子的結(jié)合位點(diǎn)以便生成具有結(jié)構(gòu)和/或功能多樣性的所有組成成分來構(gòu)建本發(fā)明的文庫。這意味著生成變體，使得它們?cè)谄浣Y(jié)構(gòu)和/或其功能方面具有足夠的多樣性，使得它們能夠提供一定范圍的活性。例如，如果所述多肽類細(xì)胞-表面受體，那么它們可以具有多樣的靶配體結(jié)合特異性。一般通過在一個(gè)或多個(gè)位置上改變選擇的分子產(chǎn)生所需的多樣性。可以隨機(jī)選擇或優(yōu)先選擇改變的位置。然后可以通過隨機(jī)化進(jìn)行改變，在此過程中，用天然或合成的氨基酸或其類似物取代固有的氨基酸，從而產(chǎn)生大量變體或通過用確定亞組的氨基酸取代固有的氨基酸，從而產(chǎn)生更有限數(shù)量的變體。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了引入這類多樣性的各種方法。易錯(cuò)PCR(Hawkins等(1992)M/.編.,226:889),化學(xué)誘變(Deng等(1994)丄C/z綴,269:9533)或細(xì)菌增變抹(Low等(1996)丄Mo/.Ao/.,260:359)可以用于將隨機(jī)突變導(dǎo)入編碼分子的基因。使選擇的位置突變的方法也為本領(lǐng)域眾所周知的并且包括使用錯(cuò)配的寡核苷酸或簡并寡核普酸，其中使用或不使用PCR。例如，已經(jīng)通過使突變靶向抗原結(jié)合環(huán)生成了幾種合成抗體文庫。已經(jīng)使人破傷風(fēng)類毒素-結(jié)合Fab的H3區(qū)隨機(jī)化而產(chǎn)生了一定范圍的新結(jié)合特異性(Barbas等(1992),參見上文)。已經(jīng)使隨機(jī)或半-隨機(jī)H3和L3區(qū)附加于種系V基因片段上而產(chǎn)生具有未突變的構(gòu)架區(qū)的大文庫(Hoogenboom和Winter(1992)，參見上文；Nissim等(1994)，參見上文；Griffiths等(1994),參見上文；DeKruif等(1995),參見上文)。已經(jīng)使這類多樣化擴(kuò)展以便包括某些或全部其它抗原結(jié)合環(huán)(Crameri等(1996)Mm^eA^ed，2:100;Riechmann等(1995)5/o/7fec/mo/ogy,13:475;Morphosys,WO97/08320,參見上文)。由于環(huán)隨機(jī)化具有生成約10"個(gè)以上單獨(dú)的H3結(jié)構(gòu)和類似大量的其它五種環(huán)的變體的潛能，所以使用目前的轉(zhuǎn)化技術(shù)乃至通過使用不含細(xì)胞的相同產(chǎn)生代表所有可能組合的文庫并非切實(shí)可行。例如，在迄今為止構(gòu)建的最大文庫之一中，產(chǎn)生了6x101()個(gè)不同的抗體，這僅為這種設(shè)計(jì)的文庫的可能多樣性的部分(Griffiths等(1994)，參見上文)。除了除去非-功能性成員和使用單一已知的主鏈構(gòu)象外，本發(fā)明還通過僅使那些直接設(shè)計(jì)產(chǎn)生或改變分子的所需功能的殘基多樣化而解決了這些限制。就許多分子而言，功能為結(jié)合靶配體且由此多樣性應(yīng)集中于耙配體結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)避免改變對(duì)分子總體包裝或維持選擇的主鏈構(gòu)象而言決定性的殘基；因此，本發(fā)明提供了文庫，其中改變的選擇位置可以為那些構(gòu)成靶配體結(jié)合位點(diǎn)的位置。在應(yīng)用于抗體時(shí)規(guī)范序列的多樣化就抗體文庫而言，靶配體的結(jié)合位點(diǎn)最常見的為抗原結(jié)合部位。因此，在非常優(yōu)選的方面中，本發(fā)明提供了抗體文庫，其中僅那些抗原結(jié)合部位上的殘基改變。這些殘基在人抗體所有組成成分中極其不同，并且已知允許接觸高分辨率抗體/抗原復(fù)合物。例如，在L2中已知50和53位在天然存在的抗體中不同并且觀察到允許接觸抗原。相反，常規(guī)的手段使相應(yīng)的Kabat等定義的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR1)中的所有殘基多樣化(1991,參見上文)，本發(fā)明文庫中兩種多樣化相比有約七種殘基。這代表了產(chǎn)生一定范圍的抗原結(jié)合特異性所需的功能多樣性方面的顯著改善。實(shí)際上，抗體多樣性為兩種過程的結(jié)果種系V,D和J基因片段的體細(xì)胞重組而生成純的初級(jí)所有組成成分(所謂的種系和體細(xì)胞重組)；和所得重排V基因的體細(xì)胞高度突變。分析人抗體序列已經(jīng)證實(shí)初級(jí)所有組成成分中的多樣性集中在抗原結(jié)合部位的中心上，而體細(xì)胞高度突變將多樣性傳遞至在初級(jí)所有組成成分中高度保守的抗原結(jié)合部位的周邊上的區(qū)(參見Tomlinson等(1996),參見上文)。這種互補(bǔ)性可能作為查詢序列空間的有效策略發(fā)展，并且盡管對(duì)抗體而言顯而易見是唯一的，但是它易于適合于本發(fā)明的其它多肽所有組成成分。按照本發(fā)明，改變的殘基為構(gòu)成靶配體的結(jié)合位點(diǎn)的那些的亞組。如果需要，靶配體結(jié)合位點(diǎn)中不同(包括重疊)亞組的殘基在選擇構(gòu)成中的不同階段多樣化。就抗體所有組成成分而言，本發(fā)明的兩-步法于人免疫系統(tǒng)中抗體成熟類似。產(chǎn)生最初的'純，的所有組成成分，而抗原結(jié)合部位中殘基中的某些，但并非全部多樣化。在本文上下文中使用的術(shù)語"純"意旨不具有預(yù)定靶配體的抗體分子。這些分子類似于由未進(jìn)行免疫多樣化的個(gè)體免疫球蛋白基因編碼的那些，就此而言，使用胎兒和新生兒個(gè)體，其免疫系統(tǒng)尚未受到各種抗原刺激物的攻擊。然后對(duì)一定范圍的抗原46選擇該所有組成成分。如果需要，隨后在最初所有組成成分中多樣化的區(qū)外部導(dǎo)入額外的多樣性?？梢赃x擇改變功能，特異性或親和力的這種成熟的所有組成成分。本發(fā)明提供了抗體的兩種不同的純所有組成成分，其中抗原結(jié)合部位中的殘基中的某些或全部發(fā)生改變。"初級(jí)"文庫模擬天然初級(jí)所有組成成分，其中多樣性限于在抗原結(jié)合部位中心上的殘基，它們?cè)诜N系V基因片段中不同(種系多樣性)或在重組過程中多樣化(連接多樣性)。那些多樣化的殘基包括，但不限于H50,H52,H52a,H53,H55,H56,H58,H95,H96，H97，H98,L50,L53,L91,L92，L93，L94和L96。在"體細(xì)胞"文庫中，多樣性限于在重組過程中多樣化(連接多樣性)或發(fā)生高度體細(xì)胞突變的殘基)。那些多樣化的殘基包括，但不限于H31，H33,H35,H95,H96,H97,H98,L30，L31,L32,L34和L96。已知上述作為適合于這些文庫中多樣化的所有殘基可接觸一種或多種抗體-抗原復(fù)合物。由于在兩種文庫中，并非所有的抗原結(jié)合部位中的殘基改變，所以在選擇過程中，通過改變剩余的殘基摻入額外的多樣性，只要需要如此。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是任意這些殘基的任意亞組(或包含抗原結(jié)合部位的額外殘基)可以用于最初和/或隨后的抗原結(jié)合部位多樣化。在構(gòu)建本發(fā)明文庫中，一般通過改變指定多肽序列的編碼序列在核酸水平上實(shí)現(xiàn)選擇位置的多樣化，使得可以將可能的氨基酸數(shù)量(所有20種或其亞組)引入該位置。使用IUPAC命名法，最通用的密碼子為編碼所有的氨基酸的NNK以及TAG終止密碼子。優(yōu)選使用NNK密碼子，以便引入所需的多樣性。實(shí)現(xiàn)同一目的的其它密碼子也是有用的，包括NNN密碼子，它產(chǎn)生額外的終止密碼子TGA和TAA。人抗體抗原結(jié)合部位中的側(cè)鏈多樣性特征為有利于某些氨基酸殘基的顯著偏性。如果總計(jì)VH，Vk和V、區(qū)各自中的10個(gè)最具變化的位置的氨基酸組成，那么76%以上的側(cè)鏈多樣性僅來源于7種不同的殘基，它們是絲氨酸(24%)，酪氨酸(14%),天冬酰胺(11%)，甘氨酸(9%)，丙氨酸(7°/。)，天冬氨酸(6%)和蘇氨酸(6%)。這種對(duì)親水性殘基和少量可以提供主鏈靈活性的偏性可能反映出表面的進(jìn)化，所述表面易于結(jié)合廣泛的抗原并且有助于解釋初級(jí)所有組成成分中抗體的所需混雜性。由于優(yōu)選模擬這種氨基酸分布，所以本發(fā)明提供了文庫，其中在改變位置上的氨基酸分布模擬在抗體抗原結(jié)合部位中觀察到的氨基酸分布。這類在允許對(duì)一定范圍靶配體選擇某些多肽類(并非只是抗體多肽類)的氨基酸取代中的偏性易于應(yīng)用于本發(fā)明任意的多肽所有組成成分。存在各種用于使改變位置上的氨基酸分布偏移的方法(包括使用三核苦酸誘變，WO97/08320,Morphosys,參見上文)，其中因合成的便利性而優(yōu)選的方法為使用成員的簡并密碼子。通過比較由所以簡并密碼子組合編碼的氨基酸分布型(使用在每一位置上等比例的單，雙，三和四重簡并性)與天然氨基酸的應(yīng)用，能夠計(jì)算最具代表性的密碼子。密碼子(AGT)(AGC)T,(AGT)(AGC)C和(AGT)(AGC)(CT)—即分別使用IUPAC命名法的DVT,DVC和DVY-為最接近所需氨基酸分布型它們編碼22%的絲氨酸和11%的酪氨酸，天冬酰胺，甘氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，蘇氨酸和半胱氨酸。因此，優(yōu)選使用多樣化位置各自上的DVT,DVC或DVY密碼子構(gòu)建文庫。如上所述，構(gòu)成本發(fā)明抗體文庫的多肽類可以為完整的抗體或其片段，諸如Fab、F(ab')2、Fv或scFv片段或單獨(dú)的VH或VL結(jié)構(gòu)域，其中的任意種為修飾或未修飾的。其中單鏈Fv片段或scFvs具有特定的應(yīng)用。ScFv片段和其它抗體多肽類可靠地通過本領(lǐng)域眾所周知的抗體改造方法生成。通過使用編碼適當(dāng)設(shè)計(jì)的連接肽，諸如(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)3或等效的連接肽的寡核苷酸連接VH和VL基因構(gòu)成scFv。接頭按照VH-接頭-VL或VL-接頭-VH的次序橋連第一個(gè)V區(qū)的C-末端和第二個(gè)V區(qū)的N-末端。scFv的結(jié)合位點(diǎn)主要可以可靠地再現(xiàn)相應(yīng)完整抗體的特異性，并且反之亦然。構(gòu)建Fv,Fab和F(ab')2片段和嵌合抗體分子的類似技術(shù)未本領(lǐng)域眾所周知的。當(dāng)表達(dá)Fv片段時(shí)，應(yīng)謹(jǐn)慎考慮以確保正確的鏈折疊和連接。就Fab和F(ab')2片段而言，將VH和VL多肽類與可以分離自重排基因，種系C基因或由有關(guān)V區(qū)片段的抗體序列數(shù)據(jù)合成的恒定區(qū)片段合并。本發(fā)明的文庫可以未VH或VL文庫。因此，可以構(gòu)建包含單一VH和VL結(jié)構(gòu)域的單獨(dú)文庫，并且它們?nèi)芜x分別包括CH或Cl結(jié)枸域，/人而生成Dab分子。c.本發(fā)明的文庫載體系統(tǒng)本發(fā)明的文庫可以用于使一般和/或靶配體直接篩選或用于包括遺傳展示包裝的選擇方案?？梢匀缟纤鲋苯訉⒓?xì)菌噬菌體入表達(dá)系統(tǒng)作為噬斑篩選或作為溶素原菌落直接篩選Huse等(1989jS"ewce,246:1275;Caton和Koprowski(1990)尸rac.Ato/.」c^f."S.A，87;Mullinax等(1990)A^/.爿c"d".S.爿二，87:8095;Persson等(1991)尸rac.Ato/.爿cat/."S.A，88:2432)并且它們?cè)诒景l(fā)明中是有用的。盡管這類表達(dá)系統(tǒng)可以用于篩選達(dá)106個(gè)不同成員的文庫，^f旦是它們實(shí)際上并不適合于篩選較大的數(shù)量(大于106個(gè)成員)。其它篩選系統(tǒng)依賴于例如文庫成員的直接化學(xué)合成。一種早期的方法包括一組針或桿形肽類，諸如WO84/03564中所述。涉及在珠上的肽合成的類似方法描述在美國專利US4,631,211中，該方法形成肽文庫，其中珠各自為各文庫成員，并且相關(guān)的方法描述在WO92/00091中。基于珠的方法的顯著改進(jìn)包括使用唯一的鑒定標(biāo)記，諸如寡核苷酸標(biāo)記每一珠，以便有利于各文庫成員的氨基酸序列的鑒定。這些改進(jìn)的基于珠的方法描述下WO93/06121中。另一種化學(xué)合成方法包括按照將不同文庫成員(例如唯一的肽序列)置于陣列中分散的預(yù)定位置上的方式在表面上合成肽(或素?cái)M肽)的陣列。根據(jù)陣列中的空間位置確定各文庫成員的身份。測定預(yù)定分子(例此基于i間位置鑒定反應(yīng)性文庫成員的序列。這些方法描述在美國專利US5,143,854;WO90/15070和WO92/10092;Fodor等(1991)Sc/e"ce，251:767;Dower和Fodor(199i;M肌她t/.CTz，.，26:271中。在本發(fā)明文庫構(gòu)建中特別有用的是選擇展示系統(tǒng)，它們能夠使核酸與它所表達(dá)的多肽連接。本文所用的選擇展示系統(tǒng)為允許通過適當(dāng)展示方式根據(jù)結(jié)合一般和/或靶配體選擇文庫中各成員的系統(tǒng)。任意的選擇展示系統(tǒng)可以與本發(fā)明文庫聯(lián)用。用于分離大文庫中所需成員的選擇方案為本領(lǐng)域中公知的，以通過噬菌體展示技術(shù)為典型。已經(jīng)證實(shí)這類系統(tǒng)，其中不同肽序列展示在絲狀噬菌體表面上(Scott和Smith(1990),參見上文)，可用于生成抗體片段(和編碼它們的核苷酸序列)的文庫，以便結(jié)合靶抗原的特異性抗體片段的體外選擇和擴(kuò)增。編碼VH和VL區(qū)的核苷酸序列與編碼前導(dǎo)信號(hào)的基因片段連接，所述49前導(dǎo)信號(hào)使它們定向于大腸桿菌(五.CO/0周質(zhì)空間，且作為結(jié)果，所得抗體片段展示在噬菌體表面上,一般作為與噬菌體外被蛋白(例如pin或pvm)的融合體。或者，抗體片段展示入噬菌體衣殼(噬菌體)夕卜部上?；谑删w的展示系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)在于，因?yàn)樗鼈優(yōu)樯锵到y(tǒng)，所以可以單純通過使在細(xì)菌細(xì)胞中包含選擇的文庫成員的噬菌體生長擴(kuò)增選擇的文庫成員。此外，由于表面多肽文庫成員的核苷酸序列包含在噬菌體或噬菌粒載體上，所以測序，表達(dá)和隨后的遺傳操作相對(duì)直接。構(gòu)建噬菌體抗體展示文庫和入噬菌體表達(dá)文庫的方法為本領(lǐng)域眾所周知的(McCafferty等(1990)，參見上文；Kang等(1991)淑/.」cat/."S丄88:4363;Clackson等(1991)胸訓(xùn)，352:624;Lowman等(1991)Aoc/ze加W^,30:10832;Burton等(1991)尸rac.iVa".爿cat/.Sc/88:10134;Hoogenboom等(1991)NucleicAcidsRes.,19:4133;Chang等(1991)丄/mmw朋/.，147:3610;Breitling等(1991)104:147;Marks等(1991),參見上文；Barbas等(1992),參見上文；Hawkins和Winter(1992)丄/mmw"o/.,22:867;Marks等，1992，J.Ao/.CAem.,267:16007;Lerner等(1992)258:1313,將這些文獻(xiàn)引入本文作為參考)。一種特別有利的手段為使用scFv噬菌體-文庫(Huston等.，1988,Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,85:5879-5883;Chaudhary等(1990)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.,87:1066-1070;McCafferty等(1990),參見上文；Clackson等(1991),參見上文；Marks等(1991),參見上文；Chiswell等(1992)TrendsBiotech.,10:80;Marks等(1992),參見上文)。已經(jīng)描述了在噬菌體外被蛋白上展示的scFv文庫的各種實(shí)施方案。例如，噬菌體展示手段的精華如WO96/06213和WO92/01047(MedicalResearchCouncil等)和WO97/08320(Morphosys,參見上文)中所述，將這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。用于生成多肽類或核苷酸文庫的其它系統(tǒng)包括使用不含細(xì)胞的用于體外合成文庫成員的酶促器。在一種方法中，通過對(duì)靶配體選擇的交替循環(huán)和PCR擴(kuò)增選擇RNA分子(Tuerk和Gold(1990)Scze"ce,249:505;Ellington和Szostak(1990)A^we,346:818)。類似的技術(shù)可以用于鑒定結(jié)合預(yù)定的人轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列(Thiesen和Bach(1990)M/c/e/cfAi^y.，18:3203;Beaudry和Joyce(1992)257:635;WO92/05258和W092/14843)。按照類似的發(fā)方式，體外翻譯可以用于合成多肽類作為生成大文庫的方法。這些一般包含穩(wěn)定的聚核糖體復(fù)合物的方法進(jìn)一步描述在WO88/08453,WO90/05785,WO90/07003,WO91/02076,WO91/05058和WO92/02536中。并非基于噬菌體的交替展示系統(tǒng)，諸如披露在W095/22625和W095/11922(Affymax)中的那些使用聚核糖體展示用于選擇的多肽類。另外將這些和所有上述對(duì)比文件《I入本文作為參考。本發(fā)明由此提供了從多肽類的所有組成成分中選擇具有所需一般和/或粑配體結(jié)合位點(diǎn)的多肽的方法，該方法包括下列步驟a)表達(dá)本發(fā)明上述方面的文庫；b)使所述多肽類與一般和/或靶配體接觸并且選擇結(jié)合一般和/或耙配體的那些；和c)任選擴(kuò)增結(jié)合一般和/或靶配體的選擇的多肽(類)；d)任選重復(fù)步驟a)-c)。優(yōu)選使用噬菌體展示系統(tǒng)進(jìn)行步驟a)-d)。由于本發(fā)明提供了對(duì)一般和靶配體均具有結(jié)合位點(diǎn)的多肽類的文庫，所以上述選擇方法可以適合于使用一般配體或耙配體的選擇。因此，可以使用一i&配體，且然后4吏用耙配體或4吏用草巴配體，且然后l吏用一般配體選擇最初的文庫。本發(fā)明還提供了在使用耙配體選擇前或之后平行或串連使用不同一般配體的多重選擇。優(yōu)選本發(fā)明的方法進(jìn)一步包含使選擇的多肽(類)進(jìn)行額外的變化(如本文所述)和重復(fù)步驟a)-d)的步驟。由于一般配體根據(jù)其確切的性質(zhì)能夠結(jié)合使用一般配體選擇的所有文庫成員，所以本發(fā)明的方法進(jìn)一步包含使用一般配體(或其某些綴合物)檢測，固定，純化或免疫沉淀來自所述文庫的任意功能性成員或成員群體(無論是否通過結(jié)合粑配體選擇的)。由于本發(fā)明提供了文庫，其中成員具有已知的主鏈構(gòu)象，所以本發(fā)明的方法進(jìn)一步包含產(chǎn)生文庫中的任意功能性成員的三維結(jié)構(gòu)模型(無論是否通過結(jié)合靶配體選擇的)。優(yōu)選這類模型的構(gòu)建包括同源性模型化和/或分子置換。可以通過用二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測或通過篩選結(jié)構(gòu)文庫比較多肽序列與已知三維結(jié)構(gòu)的序列而生成主鏈構(gòu)象的初步模型。還可以將計(jì)算軟件由于預(yù)測多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。為了預(yù)測可變位置上的側(cè)鏈構(gòu)象，可以使用側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫。一般而言，用于實(shí)施本發(fā)明所需的核酸分子和載體構(gòu)建體為本領(lǐng)域中可利用的并且可以如標(biāo)準(zhǔn)實(shí)-驗(yàn)室手冊(cè)，諸如Sambrook等(1989」Mo/ecw/arC7om'"g.'J丄a6orato^yAfowwa/,ColdSpringHarbor,USA中所述構(gòu)建和操作。一般在重組載體中進(jìn)行本發(fā)明中的核酸操作。本文所用的載體意旨用于將異源DNA導(dǎo)入細(xì)胞以便其表達(dá)和/或復(fù)制的分散元件。選擇或構(gòu)建且隨后使用這類載體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。大量載體為公眾可利用的，包括細(xì)菌質(zhì)粒，噬菌體，人工染色體和附加型載體。這類載體可以用于單純克隆和誘變；或者，作為載體的典型，其中攜帶本發(fā)明的所有組成成分(或前-所有組成成分)成員，使用基因表達(dá)載。可以選擇適應(yīng)所需大小的多肽編碼序列的本發(fā)明使用的載體，所需的大小一般為0.25千堿基(kb)-40kb長度。在體外克隆操作后使用所述載體轉(zhuǎn)化合適的宿主。各載體包含不同的功能性成分，它們一般包括克隆(或"多接頭")位點(diǎn)，復(fù)制起點(diǎn)和至少一種可選擇的標(biāo)記基因。如果指定的載體為表達(dá)載體，那么它還具有如下中的一種或多種增強(qiáng)子元件；啟動(dòng)子；轉(zhuǎn)錄終止和信號(hào)序列，它們各自位于克隆位點(diǎn)附近，使得它們可操作地與編碼本發(fā)明多肽所有組成成分成員的基因連接?？寺『捅磉_(dá)載體一般均包含能夠使該載體在一種或多種選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。一般在克隆載體中，該序列為能夠使載體獨(dú)立于宿主染色體DNA復(fù)制的序列并且包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。眾所周知這類序列用于各種細(xì)菌，酵母和病毒。來自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大部分革蘭氏陰性菌，2微米質(zhì)粒起點(diǎn)適合于酵母，且各種病毒起點(diǎn)(例如SV40，腺病毒)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。一般而言，復(fù)制起點(diǎn)并非哺乳動(dòng)物表達(dá)載體所需的，除非它們用于能夠復(fù)制高水平DNA的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，諸如COS細(xì)胞。有利的是，克隆或表達(dá)載體可以包含也稱作可選標(biāo)記的選擇基因。該基因編碼在選擇培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞存活或生長所必需的蛋白質(zhì)。典型的選擇基因編碼賦予抗生素和其它毒素抗性的蛋白質(zhì)，所述抗生素和其它毒素例如為氨千西林、新霉素、曱氨蝶呤或四環(huán)素；補(bǔ)充營養(yǎng)缺陷型缺乏或提供生長培養(yǎng)基中無法獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)物。由于本發(fā)明載體的復(fù)制最便利地在大腸桿菌中進(jìn)行，所以大腸桿菌-可選標(biāo)記，例如，賦予抗生素氨千西林抗性的(3-內(nèi)酰胺酶基因是有用的。它們可以獲自大腸桿菌質(zhì)粒，諸如pBR322或pUC質(zhì)粒，諸如pUC18或pUC19。表達(dá)載體通常包含由宿主生物體識(shí)別并且可操作地與所關(guān)注的編碼序列連接的啟動(dòng)子。這類啟動(dòng)子可以為誘導(dǎo)型或組成型的。術(shù)語"可操作地連接"意旨并列，其中所述成分為相關(guān)性的，允許它們按照其指定方式起作用。按照在與控制序列相容的條件下進(jìn)行編碼序列表達(dá)這類方式連接"可操作地連接"編碼序列的控制序列。適用于真核宿主的啟動(dòng)子包括，例如，(3-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)；堿性磷酸酶；色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)；和雜合啟動(dòng)子，諸如tac啟動(dòng)子。用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動(dòng)子一般也包含可操作地與編碼序列連接的SD序列。在本發(fā)明的文庫中，優(yōu)選的載體為能夠表達(dá)相當(dāng)于多肽文庫成員的核普酸序列的表達(dá)載體。因此，可以通過表達(dá)多肽文庫成員的單一克隆的單獨(dú)增殖和表達(dá)或通過使用任意選擇展示系統(tǒng)進(jìn)行使用一般和/或靶配體的選擇。如上所述，優(yōu)選的選擇展示系統(tǒng)為噬菌體展示。因此，可以使用噬菌體或噬菌粒載體。優(yōu)選的載體為具有大腸桿菌復(fù)制起點(diǎn)(用于雙鏈復(fù)制)和另外的噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(用于產(chǎn)生單鏈DNA)的噬菌粒載體。這類載體的操作和表達(dá)為本領(lǐng)域眾所周知的(Hoogenboom和Winter(1992),參見上文；Nissim等(1994),參見上文)。簡言之，該載體包含在噬菌粒上賦予選擇性的(3-內(nèi)酰胺酶基因和表達(dá)彈夾的lac啟動(dòng)子下游，該表達(dá)彈夾由pe舊前導(dǎo)序列(使表達(dá)的多肽定向于周質(zhì)空間)，多克隆位點(diǎn)(用于克隆文庫成員的核苷酸形式)，任選一種或多種肽標(biāo)記(用于檢測)，任選一種或多種TAG終止密碼子和噬菌體蛋白質(zhì)pIII組成(N-C末端)。因此，使用大腸桿菌的不同抑制和非-抑制菌抹并且添加葡萄糖，異丙基硫代-(3-D-半乳糖苦(IPTG)或輔助噬菌體，諸如VCSM13,所述載體能夠在不表達(dá)的情況下作為質(zhì)粒復(fù)制，僅產(chǎn)生大量多肽文庫成員或產(chǎn)生噬菌體，其中的某些包含在其表面上的多肽-pIII融合體的至少一種拷貝。本發(fā)明載體的構(gòu)建使用了常規(guī)的連接技術(shù)。裂解分離的載體或DNA片段，構(gòu)成并且連接成產(chǎn)生所需載體所需的形式。如果需要，可以按照已知方式進(jìn)行證實(shí)正確序列存在于構(gòu)建的載體中的分析。用于構(gòu)建表達(dá)載體，制備體外轉(zhuǎn)錄物，將DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞和進(jìn)行評(píng)價(jià)表達(dá)和功能的分析的合適的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。檢測樣品中操作的基因序列或通過常規(guī)方法定量的其擴(kuò)增和/或表達(dá)，所述常規(guī)方法諸如DNA或RNA分析，蛋白質(zhì)印跡，DNA、RNA或蛋白質(zhì)的斑點(diǎn)印跡，原位雜交，免疫細(xì)胞化學(xué)或核酸或蛋白質(zhì)分子的序列分析。如果需要，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于預(yù)計(jì)如何改進(jìn)這些方法。使用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的誘變一旦選擇載體系統(tǒng)并且將編碼所關(guān)注的和多肽類的一種或多種核酸序列克隆入文庫載體，就可以通過在表達(dá)前采取誘變?cè)诳寺〉姆肿觾?nèi)產(chǎn)生多樣性；或者，如上所述，可以在誘變前表達(dá)和選擇編碼的蛋白質(zhì)并且進(jìn)行額外的選擇循環(huán)。如上所述，通過標(biāo)準(zhǔn)分子方法進(jìn)行編碼結(jié)構(gòu)優(yōu)化的多肽類的核酸序列的誘變。特別有用的是聚合酶反應(yīng)或PCR(Mullis和Faloona(1987)她fW""z戸o/.,155:335，將該文獻(xiàn)引入本文作為參考)。使用熱穩(wěn)定性DNA-依賴性DNA聚合酶催化的多個(gè)DNA復(fù)制循環(huán)擴(kuò)增所關(guān)注的靶序列的PCR為本領(lǐng)域眾所周知的。用于本發(fā)明的寡核苷酸引物為單鏈DNA或RNA分子，它們與核酸模板雜交以便引起第二鏈核酸的酶促合成。該引物與存在于用于制備本發(fā)明陣列組的核酸分子庫中的靶分子的部分互補(bǔ)。關(guān)注通過合成方法制備這類分子，無論是化學(xué)方法還是酶促方法。或者，這類分子或其片段天然存在并且分離自其天然來源或購自商品供應(yīng)商。盡管不同長度的寡核苷酸是有用的，但是誘變寡核苷酸引物為15-100個(gè)核苷酸長度，理想的是20-40個(gè)核苷酸。一般而言，在兩種核酸序列基本上互補(bǔ)(在至少14-25個(gè)核香酸的一段序列內(nèi)至少約65%為互補(bǔ)的，優(yōu)選至少約75%,更優(yōu)選至少約90%為互補(bǔ)的)時(shí)，發(fā)生選擇性雜交。參見Kanehisa(1984)A^c/e/c爿"'AA"12:203,將該文獻(xiàn)引入本文作為參考。作為結(jié)果，預(yù)計(jì)在引發(fā)位點(diǎn)上的一定程度的錯(cuò)配是可接受的。這類錯(cuò)配可以為小的，諸如一-,二-或三-核苷酸?；蛘?，它可以包含核苦酸環(huán)，我們定義為區(qū)，其中錯(cuò)配包括4個(gè)或4個(gè)以上核苷酸的連續(xù)串?？傊?，5個(gè)因素影響引物與第二種核酸分子雜交的有效性和選擇性。這些因素為(i)引物長度；(ii)核苷酸序列和/或組成；(iii)雜交溫度；(iv)緩沖劑化學(xué)；和(v)需要引物所雜交的區(qū)中位阻的可能性，這些因素在設(shè)計(jì)非隨機(jī)引發(fā)序列時(shí)相當(dāng)重要的。性；較長的序列;有高于^交短序列的解鏈溫度(TM),并且在指定靶序列內(nèi)重復(fù)的可能性較低，由此將雜亂的雜交減少至最低限度。具有高G-C含量或包含回文序列的引物序列趨向于自我雜交，如其趨向于指定的耙位點(diǎn)，因?yàn)閱畏肿佣请p分子雜交動(dòng)力學(xué)一般在溶液中是有利的；同時(shí)，重要的是設(shè)計(jì)引物，其包含足夠數(shù)量的G-C核苷酸配對(duì)以便緊密結(jié)合靶序列，因?yàn)檫@類對(duì)各自通過三個(gè)氫鍵，而非兩個(gè)在A和T堿基配對(duì)時(shí)發(fā)現(xiàn)的氬鍵結(jié)合。雜交溫度與引物退化效率成反比改變，如同可以包括在雜交混合物中的有機(jī)溶劑，例如曱酰胺的濃度一樣，而鹽濃度的雜交有利于結(jié)合。在嚴(yán)格雜交條件下，較長的探針比較短的探針在更為許可的條件下充分的雜交效率高。嚴(yán)格的雜交條件一般包括低于約1M,更通常的是低于約500mM且優(yōu)選低于約200mM的鹽濃度。雜交溫度低至0°C-高于22。C,高于約30°C且(最通常的是)超過約37°C。較長的片段可能需要較高的雜交溫度以便進(jìn)行特異性雜交。作為影響雜交嚴(yán)格性的幾個(gè)因素，參數(shù)的組合比任意一種單獨(dú)的絕對(duì)測量值更為重要。使用這些思維中的考慮設(shè)計(jì)引物。盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員可以開動(dòng)腦筋對(duì)大量序列的相對(duì)優(yōu)劣性進(jìn)行評(píng)估，但是已經(jīng)設(shè)計(jì)了計(jì)算機(jī)程序輔助評(píng)價(jià)這幾個(gè)參數(shù)并且優(yōu)化引物序列。這類程序的實(shí)例為DNAStarTM軟件包的"PrimerSelect"(DNAStar,Inc.;Madison,WI)和OLIGO4.0(NationalBiosciences,Inc.)。一旦進(jìn)4亍了i殳計(jì)，就通過合適的方法制備寡核苦酸，例如Beaucage和Carruthers(1981)7^ra/zet/ra"丄e".，22:1859)所述石舞酰胺酸法或Matteucci和Caruthers(1981)J.爿m.C/ew.Soc.,103:3185的三酯法，將這兩篇文獻(xiàn)引入本文作為參考；或通過使用商購自動(dòng)化寡核苷酸合成儀的其它化學(xué)方法或VLSIPSTM技術(shù)。使用模板DNA(至少lfg;更有用的是1-1000ng)和至少25pmol寡核苷酸引物進(jìn)行PCR;有利的是在引物庫明顯為異源的時(shí)使用大量引物，因?yàn)樾蛄懈髯詢H由庫中的少部分分子表示，并且量在隨后的擴(kuò)增循環(huán)中變得有限。典型的反應(yīng)混合物包括2^1DNA,25pmol寡核苷酸引物，2.5(ilofIOXPCR緩沖液l(Perkin國Elmer,FosterCity,CA),0.4(il1.25dNTP,0.15jal(或2.5個(gè)單位)TaqDNA聚合酶(PerkinElmer,FosterCity，CA)和去離子水至25pi總體積。覆蓋礦物油并且使用程序可控的熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR。實(shí)際上按照嚴(yán)格性的要求調(diào)整PCR循環(huán)各步驟中的長度和溫度以及循環(huán)次數(shù)。根據(jù)預(yù)計(jì)引物退火至模板的效率和可接受的錯(cuò)配程度確定退火溫度和時(shí)限；顯然，當(dāng)同時(shí)擴(kuò)增和誘變核酸分子時(shí)，至少在第一個(gè)合成循環(huán)中需要錯(cuò)配。在嘗試使用誘變引物的混合庫擴(kuò)增分子群體的過程中，對(duì)引物至非靶位點(diǎn)的序列的混雜退火稱重在嚴(yán)格性(高溫)退火條件下僅可能因低解鏈溫度產(chǎn)生的可能突變產(chǎn)物損耗。優(yōu)化引物退火條件的嚴(yán)格性的能力充分屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍。使用30C-72。C的退火溫度。模板分子的起始變性通常在92°C-99°C下發(fā)生4分鐘，隨后是由變性(94-99。C下15秒-1分鐘)，退火(確定的溫度如上所述；1-2分鐘)和伸展(72。C下1-5分鐘，這取決于擴(kuò)增產(chǎn)物的長度)組成的20-40個(gè)循環(huán)。最終的伸展一般為在72°C下4分鐘且隨后可以為在4°C下的不確定的(0-24小時(shí))步驟。所有組成成分成員的結(jié)構(gòu)分析由于本發(fā)明提供了已知主鏈構(gòu)象的所有組成成分，所以易于生成所有組成成分中的任意成員的三維結(jié)構(gòu)模型。一般而言，這類模型的構(gòu)建包括同源性模型化和/或分子置換。通過比較多肽序列于已知三維結(jié)構(gòu)的類似序列，通過二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測或通過篩選結(jié)構(gòu)文庫生成主鏈構(gòu)象的預(yù)備模型。分子模型化軟件包為商購的并且用于預(yù)測多肽二級(jí)結(jié)構(gòu)。為了預(yù)測可變位置上側(cè)鏈的構(gòu)象，可以使用側(cè)鏈旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體文庫。用作多肽選擇中的配體的抗體用于本發(fā)明多肽選擇的一般或靶配體自身可以為抗體。這對(duì)一般配體而言特別確切，它們結(jié)合在為包含本發(fā)明所有組成成分選擇的功能性多肽類中基本上為保守的結(jié)構(gòu)特征。如果合適的抗體并非為公眾可得到，那么可以通過噬菌體展示方法(參見上文)或如下生產(chǎn)它重組蛋白或那些來源于天然來源的蛋白可以用于使用本領(lǐng)域中那些眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)生成抗體。例如，給予蛋白質(zhì)(或"免疫原")以便攻擊哺乳動(dòng)物，諸如猴子，山羊，家兔或小鼠?？梢詫⑺每贵w收集為多克隆血清，或可以使來自攻擊的動(dòng)物的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞無限增殖化(例如通過與無限增殖化融合配偶體融合以便產(chǎn)生雜交瘤)，該細(xì)胞隨后產(chǎn)生單克隆抗體。a.多克隆抗體抗原蛋白質(zhì)可以單獨(dú)使用或與常用載體綴合以便增加其免疫原性，并且如上所述使對(duì)該肽-載體綴合物的抗血清在動(dòng)物中增加?？梢匀缢鲞M(jìn)行肽與載體蛋白偶聯(lián)并且免疫接種(Dymecki等(1992)J.S/o/.C7zem.,267:4815)。通過ELISA，或可選擇的通過斑漬或點(diǎn)跡對(duì)蛋白質(zhì)抗原滴定血清(Boersma和VanLeeuwen(1994)/A^wtos"'.A/"/ot^，51:317)。通過ELISA,例如，按照Green等的操作步驟(1982)Cell,28:477證實(shí)血清與合適的肽類發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)。b.單克隆抗體制備單克隆抗體的技術(shù)為眾所周知的，并且可以使用任意候選抗原，優(yōu)選與載體結(jié)合的抗原，如Arnheiter等(1981)A^we,294,278所述制備單克隆抗體。單克隆抗體一般獲自雜交瘤組織培養(yǎng)物或來自獲自導(dǎo)入雜交瘤組織的動(dòng)物腹水流體。然而，可以將單克隆抗體描述為"對(duì)蛋白質(zhì)增加"或"由蛋白質(zhì)誘導(dǎo)"。在增加后，通過許多方式中的任意種測試單克隆抗體的功能和特異性。類似的操作步驟也可以用于測試通過噬菌體展示或其它體外選擇技術(shù)產(chǎn)生的重組抗體。同樣可以篩選產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤(或多克隆血清)的與免疫原結(jié)合的抗體。特別優(yōu)選的免疫試驗(yàn)包括酶聯(lián)免疫測定(ELISA),免疫印跡和免疫沉淀(參見Voller,(1978)D&g"o加c//on'zows，2:1,A/z'cra6/o/og/ca/A卵c/"to^w"/Yer(y尸w結(jié)ca〃'ow,Walkersville，MD;Voller等(1978)丄C/z".尸W/zo/.,31:507;U.S.ReissuePat,No.31,006;UKPatent2,019,408;Butler(1981)A^Ws五w矽腳/.，73:482;Maggio,E.(ed.),(1980)EVz，e/w膽"oos，，CRCPress,BocaRaton,FL)或radioimmunoassays(RIA)(Weintraub,B.,Principlesofradioimmunoassays,SeventhTrainingCourseonRadioligandAssayTechniques,TheEndocrineSociety,March1986,pp.1-5,46-49和68-78),所有這些方法僅檢測了抗體與使其增加的免疫原的結(jié)合。本領(lǐng)域技術(shù)于標(biāo)記抗體分子的技術(shù)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言眾所周知(參見Harlour和Lane(1989y)爿油力oJ^，ColdSpringHarborLaboratory,pp.1-726)?；蛘?，其它技術(shù)可以用于檢測與免疫原的結(jié)合，由此證實(shí)用作本發(fā)明一般抗原或靶抗原的抗體的完整性。它們包括色譜法，諸如SDSPAGE,等電聚焦，蛋白質(zhì)印跡，HPLC和毛細(xì)管電泳。將"抗體"在本文中定義為使用這類抗體的結(jié)合(可變)區(qū)的構(gòu)建體和其它抗體修飾物。因此，用于本發(fā)明的抗體可以包含完整抗體，抗體片段，多功能性抗體聚集物或一般而言為包含，來自抗體的一個(gè)或多個(gè)特異性結(jié)合位點(diǎn)的任意物質(zhì)?？贵w片段可以為片段，諸如Fv,Fab和F(ab')2片段或其任意的衍生物，諸如單鏈Fv片段。抗體或抗體片段可以為非-重組，重組或人源化的。該抗體可以具有任意的免疫球蛋白同種型，例如IgG,IgM等。此外，如果合適，可以-使用免疫球蛋白的聚集物，聚合物，衍生物和綴合物或其片段。在下列實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，目的僅在于解釋。作為用于多肽類選擇的配體的金屬離子如上所述，非抗體的配體在本發(fā)明多肽類選擇中是有用的。一種這類配體為金屬離子。例如，希望使用Ni-NTA基質(zhì)對(duì)存在的功能性組氨酸(HIS)標(biāo)記預(yù)選擇所有組成成分。固定化的金屬親和色譜(IMAC;Hubert和Porath(1980,丄CTzramWograp/^,98:247)利用了在暴露的大量蛋白質(zhì)表面上，組氨酸和半胱氨酸氨基酸殘基以及其它可以結(jié)合金屬的氨基酸殘基的金屬結(jié)合特性。它使用樹脂，一般為瓊脂糖，其包含配位金屬離子的二齒金屬螯合劑(例如亞氨基二乙酸，IDA，二羧酸基團(tuán))，以便生成本發(fā)明的具有金屬-離子的樹脂，將瓊脂糖/IDA與金屬鹽(例如，CuCl22H20)混合，IDA螯合來自其中的二價(jià)陽離子。一種商購的瓊脂糖/IDA制品為"CHELATINGSEPHAROSE6B，，(PharmaciaFineChemicals;Piscataway,NJ)。有用的金屬離子包括，但不限于二價(jià)陽離子Ni2+,Cu2+,Zn"和Co2+。用主要由0.1-1.0M濃度的鹽(一般為NaCl或KCl)和弱配體(諸如Tris或氨)組成的結(jié)合緩沖液制備多肽分子庫，在結(jié)合緩沖液中的后者對(duì)樹脂的金屬離子具有親和力，但程度低于本發(fā)明選擇的多肽。弱配體在結(jié)合緩沖液中的有用濃度在0.01-0.1M的范圍。使多肽庫在允許具有金屬結(jié)合域(參見下文)的多肽類結(jié)合的條件下接觸樹脂；在洗滌掉雜質(zhì)后，使用緩沖液洗脫選擇的多肽類，在緩沖液中，弱配體以高于在結(jié)合緩沖液中的濃度存在，特別地，盡管對(duì)金屬離子的結(jié)合親和力較低，但是其濃度對(duì)弱配體而言足以取代選擇的多肽類。弱配體在洗脫緩沖液中的有用濃度高于在結(jié)合緩沖液中10--50-倍，一般為0.1-0.3M;注意鹽在洗脫緩沖液中的濃度等于在結(jié)合緩沖液中的濃度。按照本發(fā)明的方法，樹脂的金屬離子一般用作一般配體；然而，關(guān)注它們也可以用作靶配體。使用標(biāo)準(zhǔn)色譜裝置(柱，通過它由重力抽吸緩沖液，通過真空吸引或通過壓力驅(qū)動(dòng))進(jìn)行IMAC;或者，使用大批量操作，其中將具有金屬的樹脂域來自選擇本發(fā)明所有組成成分成員的多肽庫混合成淤漿形式。已經(jīng)描述了通過IMAC部分純化血清T4蛋白質(zhì)(Staples等，美國專利US5,169,936);然而，包含表面暴露的金屬結(jié)合域的廣譜蛋白質(zhì)還包括其它可溶性T4蛋白，人血清蛋白(例如IgG,結(jié)合球蛋白，血液結(jié)合素，Gc-球蛋白,Clq,C3,C4)，人desmoplasmin,Z)o"c/zo"i/o層凝集素，鋅-抑制的Tyr(P)磷酸酶，酚酶，羧肽酶同工酶，Cu,Zn超氧化物歧化酶(包括人和所有其它真核生物的那些)，二磷酸核苦酶，白細(xì)胞干擾素，乳鐵蛋白，人血漿ot2-SH糖蛋白，(32-巨球蛋白，ot廣抗胰蛋白酶，纖溶酶原激活物，胃腸道多肽類，胃蛋白酶，人和牛血清清蛋白，來自粒細(xì)胞的顆粒蛋白，溶菌酶，非組蛋白質(zhì)，人血纖蛋白原，人血清運(yùn)鐵蛋白，人淋巴毒素，釣調(diào)蛋白，蛋白質(zhì)A,抗生物素蛋白，肌球蛋白，生長調(diào)節(jié)素類，人生長激素，轉(zhuǎn)化生長因子，血小板衍生生長因子，a-人心房鈉尿多肽，心舒血管素等。此外，可以使用IMAC純化膜結(jié)合蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域序列。注意可以按照本發(fā)明的非生產(chǎn)包含上述蛋白質(zhì)中的^i種或其金屬結(jié)合變體的所有組成成分。在洗脫后，從金屬結(jié)合緩沖液中取出選擇的多肽類并且放入適合于其下一步應(yīng)用的緩沖液。如果金屬離子用于生成本發(fā)明首先選擇的多肽庫，那么將該庫中的分子放入為結(jié)合用于選擇功能性多肽所有組成成分成員的第二種配體的緩沖液。而如果將金屬用于第二選擇步驟，那么將所有組成成分的多肽類轉(zhuǎn)入適合于儲(chǔ)存的緩沖液(例如0.5%甘氨酸緩沖液)或指定它們的應(yīng)用。這類緩沖液包括，但不限于水，有機(jī)溶劑，水與水易于溶混的有機(jī)溶劑的混合物，生理鹽水緩沖液和蛋白質(zhì)/核酸或蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)結(jié)合緩沖液?；蛘?，可以使多肽分子脫水(即通過凍干)或固定在固體或半固體支持物，諸如硝化纖維或尼龍濾膜或凝膠基質(zhì)(即瓊脂糖或聚丙烯酰胺基質(zhì))上或與色譜樹脂交聯(lián)。可以通過本領(lǐng)域中許多公知的方法從洗脫緩沖液中取出多肽分子。可以對(duì)水或另一種選擇的溶液透析多肽洗脫液；如果凍干多肽類，那么使用加入了蛋白酶抑制劑(例如胃酶抑素，抑肽酶，亮抑蛋白酶肽等)的水?；蛘?，可以使樣品進(jìn)行本領(lǐng)域眾所周知的硫酸銨沉淀，此后在在的介質(zhì)中重新懸浮。本發(fā)明選擇的多肽類的應(yīng)用按照本發(fā)明方法選擇的多肽類可以用于基本上任意的方法，其包括配體-多肽結(jié)合，包括體內(nèi)治療和預(yù)防應(yīng)用，體外和體內(nèi)診斷應(yīng)用，體外測定和試劑應(yīng)用等。例如，就抗體而言，按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，抗體分子可以用于基于抗體的測定技術(shù)，諸如ELISA技術(shù)。如上所述，本發(fā)明選擇的分子具有診斷，預(yù)防和治療操作中的應(yīng)用。例如，可以4吏用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)在體外或體內(nèi)測定通過這些方法生成和選擇的酶變體的活性，通過這些方法，將它們與候選底物分子孵育并且分析底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化?？梢栽谂囵B(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)選擇的細(xì)胞-表面受體或黏著分子，且然后測試其對(duì)生化刺激的反應(yīng)的能力或它們與其它細(xì)胞類型的親和力，所述其它細(xì)胞類型表達(dá)可以預(yù)計(jì)未多樣化黏著分子所分別結(jié)合的細(xì)胞-表面分子。本發(fā)明選擇的抗體多肽類在通過標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)操作的蛋白質(zhì)印跡分析和原位蛋白質(zhì)檢測中具有診斷應(yīng)用；為了用于這些應(yīng)用，可以按照本領(lǐng)域公知的技術(shù)標(biāo)記選擇的所有組成成分的抗體。此外，當(dāng)與色譜支持物，諸如樹脂復(fù)合時(shí)，可以按照親和力色譜操作步驟以制備方式使用這類抗體多肽類。所有這類技術(shù)均為本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。本發(fā)明制備的蛋白質(zhì)的治療和預(yù)防應(yīng)用包括對(duì)接受者哺乳動(dòng)物，諸如人給予本發(fā)明選擇的多肽類。在這方面具體應(yīng)用的有抗體；其它受體(包括，但不限于T-細(xì)胞受體)，并且就此而言，其中抗體或受體用作一般或耙配體；結(jié)合它們的蛋白質(zhì)。優(yōu)選具有至少90-95%同質(zhì)性的基本上純的抗體或結(jié)合蛋白給予哺乳動(dòng)物，且最優(yōu)選98-99%或99%以上同質(zhì)性用于藥物應(yīng)用，尤其是當(dāng)哺乳動(dòng)物為人時(shí)。一旦根據(jù)需要部分純化或至同質(zhì)性，就可以在診斷或治療(包括體外)中或在研發(fā)和進(jìn)行測定操作，免疫熒光染色等中使用選擇的多肽類(Lefkovite和Pernis,(1979和1981)ImmunologicalMethods,VolumesI和II，AcademicPress,NY)。本發(fā)明選擇的抗體或其結(jié)合蛋白一般應(yīng)用于預(yù)防，抑制或治療炎癥狀態(tài)，過敏性超敏反應(yīng)，癌癥，細(xì)菌或病毒感染和自身免疫疾病(包括，但不限于I型糖尿病，多發(fā)性硬化，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，克羅恩病和重癥肌無力)。在本申請(qǐng)中，術(shù)語"預(yù)防"包括在誘發(fā)疾病前給予預(yù)防性組合物。"抑制"意旨在誘發(fā)情況后，但在疾病的臨床表現(xiàn)前給予組合物。"治療"包括在疾病癥狀變得明顯后給予預(yù)防性組合物。可利用可以用于篩選抗體或其結(jié)合蛋白在預(yù)防或治療疾病的動(dòng)物模型系統(tǒng)。用于測試易感小鼠中系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的方法為本領(lǐng)域公知的(Knight等(1978)丄￡"平她么147:1653;Rei訓(xùn)ten等(1978)臉wE"g.丄A/W.,299:515)。通過使用來自另一種類的可溶性AchR蛋白質(zhì)誘發(fā)疾病測試SJL/J雌性小鼠的重癥肌無力(MG)(Lindstrom等(1988)爿A./mmwo/.,42:233)。通過注射II型膠原蛋白在易感小鼠品系中誘發(fā)關(guān)節(jié)炎(Stuart等(1984)/附mw"o/.,42..233)。已經(jīng)描述了通過注射分支桿菌熱激蛋白在易感大鼠中誘發(fā)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型(VanEden等(1988)淑匿,331:171)。通過如所述給予甲狀腺球蛋白在小鼠中誘發(fā)甲狀腺炎(Maron等(1980)丄Exp.A^A,152:1115)。胰島素依賴性糖尿病(IDDM)自然發(fā)生或可以在某些品系的小鼠中誘發(fā)，諸如Kanasawa等所述那些(1984)D,a6"o/og/a，27:113。小鼠和大鼠中的EAE用作人MS的模型。在該模型中，通過給予髓磷脂堿性蛋白誘發(fā)脫骨逸革肖病(參見Paterson(1986)re;c^ooA:o//mww"o;^^/zo/ogy,Mischer等.，eds.,Grune和Stratton,NewYork，pp.179-213;McFarlin等(1973)S"e"ce,179:478:和Satoh等(1987)J./mmw"o/.,138:179)。本發(fā)明選擇的抗體，受體(包括，但不限于T-細(xì)胞受體)或其結(jié)合蛋白還可以與其它抗體聯(lián)用，特別是與導(dǎo)致疾病的人細(xì)胞上的其它標(biāo)記反應(yīng)的單克隆抗體(MAbs)。例如，合適的T-細(xì)胞標(biāo)記可以包括分類成所謂的"分化簇"的那些，根據(jù)FirstInternationalLeukocyteDifferentiationWorkshop命名(Bernhard等(1984)7)^/wg,SpringerVerlag,NY》一般而言，本發(fā)明選擇的抗體，受體或結(jié)合蛋白以純化形式與藥理學(xué)合適的載體一起使用。一般而言，這些載體包括水或醇/水溶液，乳劑或混懸液，任意包括鹽水和/或緩沖介質(zhì)。非腸道媒介物包括氯化鈉溶液，林-f各葡萄糖液，葡萄糖和氯化鈉以及乳酸林;格。如果為將多肽復(fù)合物保持在混懸液中所必要，那么合適的生理學(xué)可接受的佐劑可以選自增稠劑，諸如羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、明膠和藻酸鹽。靜脈內(nèi)J某介物包括流體和營養(yǎng)補(bǔ)充物和電解質(zhì)補(bǔ)充物，諸如基于林格葡萄糖液的那些。還可以存在防腐劑和其它添加劑，諸如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體(Mack(1982)Ae脂"g^wSScrees,16Edition)。可以將本發(fā)明選擇的多肽類作為單獨(dú)的給藥組合物使用或與其它活性劑聯(lián)用。它們可以包括各種免疫治療藥，諸如環(huán)孢菌素、曱氨蝶呤、阿霉素或順柏和免疫毒素類。藥物組合物可以包括各種細(xì)胞毒性劑或其它活性劑與本發(fā)明選擇的抗體，受體或其結(jié)合蛋白，乃至本發(fā)明具有不同特異性的選擇的多肽類，諸如使用不同靶配體選擇的多肽類的組合的"混合物"，無論是否在給藥前收集它們。本發(fā)明藥物組合物的給藥途徑可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員通常公知的那些。就療法而言，包括，但不限于免疫療法，可以按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)任意的患者給予本發(fā)明選擇的抗體，受體或其結(jié)合蛋白。給藥可以通過任意合適的方式，包括非腸道，靜脈內(nèi)，肌肉，腹膜內(nèi)，透皮，通過肺部途經(jīng)，或也可以通過使用導(dǎo)管直接輸注。給藥劑量和頻率取決于患者的年齡，性別和情況，同時(shí)給予的其它藥物，禁忌癥和臨床醫(yī)師所考慮到的其它參數(shù)?？梢詾閮?chǔ)存將本發(fā)明選擇的多肽類凍干并且在使用前再溶解。已經(jīng)證實(shí)這種技術(shù)在使用常規(guī)的免疫球蛋白和公認(rèn)的凍干法時(shí)是有效的并且可以使用再溶解技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解凍干和再溶解可以導(dǎo)致不同程度的抗體活性缺失(例如使用常用的免疫球蛋白，IgM抗62體趨向于具有大于IgG抗體的活性缺失)并且必須向上調(diào)整應(yīng)用水平以便補(bǔ)償?？梢詾轭A(yù)防和/或預(yù)防性治療給予包含本發(fā)明選擇的多肽類或其混合物的組合物。在選擇的細(xì)胞群的某些治療應(yīng)用中，進(jìn)行至少并非抑制，阻滯，調(diào)節(jié)，殺傷或某些其它可測定的參數(shù)的足夠量定義為"治療有效劑量"。達(dá)到這一劑量所需的量取決于疾病的嚴(yán)重性和患者自身免疫系統(tǒng)的一般狀況，但一般在0.005-5.0mg選擇的抗體，受體(例如T-細(xì)胞受體)或其結(jié)合蛋白/千克體重的范圍，更常用的劑量為0.05-2.0mg/kg/劑量。為了進(jìn)行預(yù)防性應(yīng)用，還可以以類似或適度降低的劑量給予包含本發(fā)明選擇的多肽類或其混合物的組合物?？梢詫景l(fā)明選擇的多肽的組合物用于預(yù)防和治療環(huán)境，以便輔助改變哺乳動(dòng)物中選擇的耙細(xì)胞群，使其失活，殺傷或除去它們。此外，可以在體外使用本文所述多肽類中選擇的所有組成成分或選擇在體外殺傷，耗盡乃至從異源細(xì)胞群中有效除去靶細(xì)胞群。可以在體外將來自哺乳動(dòng)物的血液與選擇的抗體，細(xì)胞-表面受體或其結(jié)合蛋白合并，由此按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)殺傷不需要的細(xì)胞乃至從血液中除去它們以使哺乳動(dòng)物恢復(fù)。在下列實(shí)施例中進(jìn)一步描述本發(fā)明，目的僅在于解釋。實(shí)施例1抗體文庫設(shè)計(jì)A.主鏈構(gòu)象就人抗體的6種抗原結(jié)合環(huán)中的5種(L1、L2、L3、Hl和H2)而言，存在有限數(shù)量的主鏈構(gòu)象或規(guī)范結(jié)構(gòu)((Chothia爭(1992)丄Mo/.S,力/.，227:799;Tomlinson等(1995)EAffi(9丄，14:4628;Williams等(1996)丄A'o/.,264:220)。這些環(huán)各自的最常見的主鏈構(gòu)象用于提供本發(fā)明單一已知的主鏈構(gòu)象。它們?yōu)镠l-CS1(79%表達(dá)的所有組成成分)，H2國CS3(46%),Vk的Ll-CS2(39%)，L2畫CS1(100%)，Vk的L3-CS1(36%)。H3環(huán)構(gòu)成有限數(shù)量的短環(huán)長度的主鏈構(gòu)象(Martin辨1996)J.Mo/.263:800;Shirai等(1996)FESS丄e"e^，399:1)。因此，如果H3具有7個(gè)殘基的CDR3長度(如Kabat等(1991)所定義的。Se《wewceso//rafe/7wo/z'mmwwo/og/ca//w/e^s"U.S.DepartmentofHealthandHumanServices)并且在H94位上具有賴氨酸或精氨酸殘基和在H101位上具有天冬氨酸殘基，那么在這兩種殘基之間形成鹽橋，并且在大部分情況中，能夠產(chǎn)生單一主鏈構(gòu)象。在EMBL數(shù)據(jù)文庫中至少存在16種具有所需H3長度和關(guān)鍵殘基的構(gòu)成該構(gòu)象的人抗體序列，且在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中至少存在兩種可以用作抗體模型化基礎(chǔ)的晶體結(jié)構(gòu)(2cgr和ltet)。在這種情況中，最頻繁表達(dá)的編碼所需環(huán)長度和關(guān)鍵殘基以便產(chǎn)生所需的規(guī)范結(jié)構(gòu)組合的種系基因片段為VH片段3-23(DP-47),JH片段JH4b,Vk片段02/012(DPK9)和Jk片段JK1。這些片段由此可以組合使用以便作為構(gòu)建具有所需單一主鏈構(gòu)象的文庫的基礎(chǔ)。VK片段02/012(DPK9)為VK1家族中的成員且由此結(jié)合超抗原蛋白質(zhì)L。VH片段3-23(DP-47)為VH3家族中的成員且由此應(yīng)結(jié)合超抗原蛋白質(zhì)A,然后可以用作一般配體。B.變體位置的選擇人VH和VK序列分析顯示在成熟所有組成成分中大部分不同的位置為允許最廣泛地接觸抗原的那些(參見Tomlinson等.，(1996)丄Mo/.AW.，256:813;圖1)。這些位置構(gòu)成了功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)且由此為側(cè)鏈多樣化選擇(圖2)。H54為遠(yuǎn)離選擇的H2規(guī)范結(jié)構(gòu)3中抗原結(jié)合部位的關(guān)鍵的殘基和點(diǎn)(在該位置上觀察到的多樣性是因規(guī)范結(jié)構(gòu)1,2和4所致，其中H54點(diǎn)指向結(jié)合位點(diǎn))。在這種情況中，而H55(指向結(jié)合位點(diǎn))多樣化。在這些位置上的多樣性因在初級(jí)所有組成成分中的種系或連接多樣性或體細(xì)胞高度突變而產(chǎn)生(Tomlinson等.，(1996)丄AA/.歷o/.，256:813;圖1)。由此抗原結(jié)合部位中的兩個(gè)不同殘基亞組改變成兩種不同的文庫形式。在"初級(jí)"文庫中，為變化選擇的殘基來自H2,H3,L2和L3(這些環(huán)中的多樣性主要是種系或連接多樣性的結(jié)果)。在該文庫中改變的位置為H50,H52，H52a,H53,H55,H56,H58，H95,H96,H97,H98,L50,L53，L91,L92,L93,L94和L96(總計(jì)18個(gè)殘基，圖2)。在"體細(xì)胞"文庫中，為變化選擇的殘基來自HI,H3，Ll和L3的末端(此處的多樣性主要是體細(xì)胞高度突變或連接多樣性的結(jié)果)。在該文庫中改變的位置為H31,H33,H35，H95,H96,H97，H98,L30,L31,L32,L34和L96(總計(jì)12個(gè)殘基，圖2)。C.改變位置上的氨基酸應(yīng)用的選擇通過摻入密碼子NNK(編碼所有的20種氨基酸，包括TAG終止密碼子，但非TGA和TAA終止密碼子)或密碼子DVT(編碼22%的絲氨酸和11%的酪氨酸，天冬酰胺，甘氨酸，丙氨酸，天冬氨酸，蘇氨酸和半胱氨酸并且在各位置上使用等比例的單，雙重，三重和四重簡并性，最接近地模擬天然人抗體抗原結(jié)合部位中的氨基酸殘基分布)將側(cè)鏈多樣性引入"初級(jí)，，和"體細(xì)胞，，文庫。實(shí)施例2文庫構(gòu)建和使用一般配體的選擇通過表1中所列寡核苷酸和種系V基因片段DPK9的PCR裝配"初級(jí)"和"體細(xì)胞"文庫(Cox等(1994)丄/畫畫/.,24:827)和DP-47(Tomlinson等(1992)J.Mo/.Ao/.,227:7768)。簡言之，使用5'(反向)引物與NNK或DVT3'(正向)引物對(duì)與相應(yīng)的種系V基因片段作為模板進(jìn)行第一個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增(參見表1)。這一過程產(chǎn)生8個(gè)單獨(dú)的各自用于NNK和DVT文庫中的DNA片段。然后使用表1中所示的5'(反向)引物與和3'(正向)引物與來自笫一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)的純化片段中的兩個(gè)進(jìn)行第二個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。這一過程產(chǎn)生4個(gè)單獨(dú)的各自用于NNK和DVT文庫中的DNA片段("初級(jí)"VH片段，5A;"初級(jí)"Vk片段，6A;"細(xì)胞"VH片段，5B;和"體細(xì)胞"VK片段，6B)。切割這些片段中的每一種且然后連入pCLEANVH(就VH片段而言)或pCLEANVK(就Vk片段而言)，其包含相應(yīng)的不含任何TAG密碼子或肽標(biāo)記的pHENl形式的虛擬VH和VK結(jié)構(gòu)域(Hoogenboom&Winter(1992)丄Mo/.S/o/.，227:381)。然后將這種連接電穿孔入非抑制劑的大腸桿菌菌抹HB2151。產(chǎn)生來自這些文庫中的每一種的噬菌體并且單獨(dú)使用免疫管(immunotubes)選擇，所述免疫管包被了分別用于VH和Vk文庠的10itig/ml—般配體蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)L。然后由感染了選擇的噬菌體的大腸桿菌制備DNA并且切割，以便用相應(yīng)的VK文庫取代虛擬的Vk插入片段。這些文庫的電傳機(jī)產(chǎn)生如下插入片段文庫大小9.21x1()8("初級(jí)"NNK),5.57x1()8("初級(jí)"DVT)，1.00xl()9("體細(xì)胞"NNK)和2.38x108("體細(xì)胞"DVT)。作為預(yù)選擇的對(duì)照組，生成4種額外文庫，但不使用一般配體蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)L選擇這些文庫的插入片段文庫大小為1.29x109("初級(jí)"NNK),2.40x1()8("初級(jí)"DVT),1.16x109("體細(xì)胞"NNK)和2.17x1()8("體細(xì)胞"DVT)。為了驗(yàn)證預(yù)選擇步驟的成功，將來自選擇和未選擇的"初級(jí)"NNK文庫的DNA克隆入基于pUC的表達(dá)載體并且電穿孔入HB2151。以隨機(jī)方式從各再克隆的文庫中挑選96個(gè)克隆并且誘導(dǎo)它們以便表達(dá)可溶性scFv片段。通過使用蛋白質(zhì)L的ELISA測定功能性scFv的產(chǎn)生以便俘獲scFv和隨后的蛋白質(zhì)A-HRP綴合物以便檢測結(jié)合。僅表達(dá)功能性VH和Vk結(jié)枸域的scFv(無移碼，終止密碼子，折疊或表達(dá)突變)產(chǎn)生使用該測定法的信號(hào)。各文庫中功能性抗體的成員(高于背景的ELISA信號(hào))在使用未選擇的"初級(jí)"NNK文庫時(shí)為5°/。且使用相同的選擇形式時(shí)為75%(圖3)。在本測定法中為陰性的克隆的測序證實(shí)存在移碼，終止密碼子，在抗原結(jié)合部位中關(guān)鍵構(gòu)架殘基和氨基酸上必須防止折疊和/或表達(dá)的PCR突變。實(shí)施例3對(duì)耙配體的文庫選擇使用不同濃度的包被在免疫管上的5種抗原(牛遍在蛋白，大鼠BIP,牛組蛋白，NIP-BSA和雞卵溶菌酶)單獨(dú)選擇"初級(jí)"和"體細(xì)胞"NNK文庫(無預(yù)選擇)。在2-4個(gè)選擇循環(huán)后，獲得針對(duì)除雞卵溶菌酶外的所有抗原的高度特異性的抗體。隨機(jī)選擇克隆以便測序，從而證實(shí)對(duì)各抗原的抗體范圍(圖4)。在二期中，將來自預(yù)選擇的NNK和DVT文庫的噬菌體按照1:1混合以便生成單一"初級(jí)"文庫和單一"體細(xì)胞"文庫。然后使用不同濃度的包被在免疫管上的7種抗原(FITC-BSA，人瘦蛋白，人曱狀腺球蛋白，BSA,雞卵溶菌酶，小鼠IgG和人IgG)單獨(dú)選擇這些文庫。在2-4個(gè)選擇循環(huán)后，獲得所有抗原的高度特異性的抗體，所述所有抗原包括在早期選擇中難以產(chǎn)生陽性的雞卵溶菌酶，其中早期選擇使用的文庫未使用一般配體進(jìn)行預(yù)選擇。隨才幾選擇克隆以便測序，從而證實(shí)對(duì)各抗原的不同抗體范圍(圖4)。實(shí)施例4預(yù)選擇對(duì)scFv表達(dá)和具有scFv的噬菌體產(chǎn)生的作用為了進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)選擇的結(jié)果，將來自未選擇的和預(yù)-選擇的"初級(jí)"DVT文庫的DNA克隆入基于pUC的表達(dá)載體并且電穿孔入HB2151,在兩種情況中均產(chǎn)生105個(gè)克隆。以隨機(jī)方式從各再克隆的文庫中挑選96個(gè)克隆并且誘導(dǎo)它們以便表達(dá)可溶性scFv片段。使用蛋白質(zhì)L在測測定功能性scFv的產(chǎn)生以便俘獲scFv，隨后使用蛋白質(zhì)A-HRP檢測結(jié)合的scFv。功能性抗體在各文庫中的百分比為35.4%(未選擇的)和84.4%(預(yù)-選擇的)，表明作為使用蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)L預(yù)-選擇的結(jié)果，功能性成員的數(shù)量增加了2.4倍(這種增加明顯低于等效的NNK文庫，因?yàn)镈VT密碼子不編碼TAG終止密碼子。在未選擇的NNK文庫中，在非抑制的菌林，諸如HB2151中存在TAG終止密碼子導(dǎo)致終止且由此防止功能性scFv表達(dá)。NNK文庫的預(yù)選擇除去了包含TAG終止密碼子的克隆而產(chǎn)生文庫，其中高比例的成員表達(dá)可溶性scFv)。為了評(píng)價(jià)"初級(jí)"DVT文庫預(yù)選擇對(duì)總體scFv表達(dá)的作用，誘導(dǎo)再克隆的未選擇的和預(yù)-選擇的文庫(在基于pUC的表達(dá)載體中各自包含105個(gè)克隆)以便進(jìn)行scFv片段的多克隆表達(dá)。然后通過在蛋白質(zhì)L包被的ELISA平板上孵育上清液的2倍稀釋液(圖5a中的1-12欄)，隨后使用蛋白質(zhì)A-HRP檢測測定表達(dá)的scFv在上清液中的濃度，平行檢測已知濃度的ScFvs以便對(duì)scFv在未選擇的和預(yù)-選擇的DVT文庫中的表達(dá)水平定量。將它們用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5b)并且從其中將未選擇的和預(yù)-選擇的"初級(jí)，，DVT文庫中的表達(dá)水平分別計(jì)算為12.9|ug/ml和67.1pg/ml，即因使用蛋白質(zhì)A和蛋白質(zhì)L預(yù)選擇而導(dǎo)致表達(dá)增加5.2倍。為了評(píng)價(jià)具有scFv的噬菌體的量，使未選擇的和預(yù)-選擇的"初級(jí)"DVT文庫生長并且產(chǎn)生多克隆噬菌體。在使用MES電泳緩沖液的4-12%Bis-TrisNuPAGE凝膠上和變性條件下運(yùn)行來自兩個(gè)文庫的等體積的噬菌體。將所得凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，使用抗-pIII抗體探測并且在X光片曝光(圖6)。在每種情況中下面的帶相當(dāng)于單獨(dú)的pIII蛋白質(zhì)，而較高處的帶包含pIII-scFv融合蛋白。使用軟件包NIH影像對(duì)帶強(qiáng)度的定量表示預(yù)-選擇導(dǎo)致存在于噬菌體中的融合蛋白的量增加11.8倍。實(shí)際上，在預(yù)-選擇的噬菌體中總pIII中的43%作為pIII-scFv融合體存在，從而提示大部分噬菌體顆粒具有至少一種在表面上展示的scFV。因此，不僅使用一般配體預(yù)-選擇能夠從所有組成成分中富集功能性成員，而且導(dǎo)致對(duì)那些充分表達(dá)的成員優(yōu)先選擇且(如果需要)能夠在噬菌體表面上引起高水平的展示，但不被細(xì)菌蛋白酶裂解。<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCCTGGAGCCTGGCGGACCCAMNNCATMNNATAMNNGCTAAAGGTGAATCCAGAGCTGGAGCCTGGCGGACCCAABHCATABHATAABHGCTAAAGGTGAATCCAGAG2BDP-47W服3丫j2場參TGGGTCCGCCAGGCTCCAGTCCCTGGCCCCAGTAGTCAAAMNNMNNMNNMNNTTTCGCACAGTAATATACGGTCCCTGGCCCCAGTAGTCAAAABHABHABHABHTTTCGCACAGTAATATACGG3BDPK95V^向//^GACATCCAGATGACCCAGTCCTGGTTTCTGCTGATACCAMNNTAAMNNMNNMNNAATGCTCTGACTTGCCCGGCTGGTTTCTGCTGATACCAABHTAAABHABHABHAATGCTCTGACTTGCCCGG4BDPK95丫《場//參TGGTATCAGCAGAAACCAGGGCTTGGTCCCTTGGCCGAACGTMNNAGGGGTACTGTAACTCTGTTGACAGTAGTAAGTTGCCTTGGTCCCTTGGCCGAACGTABHAGGGGTACTGTAACTCTGTTGACAGTAGTAAGTTGC200680037900.7勢溢1被57/101:a;每/妄嘗a謹(jǐn)as舉/i發(fā)5"WV￡V9有利的是能夠選擇未配對(duì)或松散配對(duì)的來自抗體多肽類群體的抗體單一可變域。還能夠選擇未配對(duì)或松散配對(duì)的來自T-細(xì)胞受體多肽類群體的T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域(Va或Vp)。本發(fā)明滿足了這些需求。在本文所述本發(fā)明的所有實(shí)施方案和方面中，其中提及了靶配體，該耙配體選自TNFa血清清蛋白、馮維勒布蘭德因子(vWF)、IgE、干擾素Y、EGFR、IgE、MMP12、PDK1和淀粉樣蛋白(3(A-p)或附錄1中所列的耙標(biāo)中的任意一種。參照WO05044858A1,WO04062551A2，WO04041867A2，WO04041865A2,WO04041863A2，WO04041862A2,WO03050531A2和EP0656946中有關(guān)CamelidVHH結(jié)構(gòu)域和Nanobodies的描述。特別將VHH和Nanobodies的這些披露內(nèi)容和定義以及披露的序列和實(shí)例引入本文作為參考。就本發(fā)明的方法而言，在一個(gè)實(shí)施方案中，多肽類(例如抗體多肽類)群體由B細(xì)胞(例如外周血淋巴細(xì)胞)提供，其中將B-細(xì)胞群提供在多個(gè)孔或儲(chǔ)器中，各孔或儲(chǔ)器包含單一B-細(xì)胞類型或平均包含一種B-細(xì)胞類型。參照deWildt等(1997)j.Immunol.Methods2073，61-67和Babcook等(7996」尸rac.A^/.爿c^/.t/&47S43-7WS中有關(guān)如何控制B細(xì)胞平均值的披露內(nèi)容。將這些參考文獻(xiàn)完整地引入本文作為參考。本發(fā)明選擇例如來自Camelids的B細(xì)胞群的具體應(yīng)用本發(fā)明在一個(gè)方面中提供了選擇系統(tǒng)，它可消除抗原-特異性B-細(xì)胞(作為亞群)(或顯著減少它們的比例)，所述抗原-特異性B-細(xì)胞(作為亞群)不會(huì)展示出優(yōu)選的抗體類型，同時(shí)富集那些確實(shí)展示出優(yōu)選抗體類型的抗原-特異性B-細(xì)胞(作為亞群)。使用一般配體進(jìn)行這種富集方法，所述一般配體即蛋白質(zhì)或小化學(xué)分子，它們對(duì)常見于所有確實(shí)展示出優(yōu)選的抗體類型的抗原-特異性B-細(xì)胞和并非常見于所有未展示出優(yōu)選抗體類型的所有抗原-特異性B-細(xì)胞具有親和力。例如，一般配體可以對(duì)抗體結(jié)構(gòu)域或抗體表面斑具有親和力，所述抗體結(jié)構(gòu)域或抗體表面斑常見于所有確實(shí)展示出優(yōu)選抗體類型的抗原-特異性B-細(xì)胞且并非常見于所有未展示出優(yōu)選抗體類型的抗原-特異性B-細(xì)胞。顯然，在選擇抗原結(jié)合活性前，過程中或之后進(jìn)行使用一般配體的選擇，最終的結(jié)果在于表達(dá)具有所需類型的抗體的抗原-特異性B-細(xì)胞亞群。在有關(guān)展示出常用抗體或重鏈抗體的駱駝科B-細(xì)胞的上下文中，可以預(yù)計(jì)富集兩種亞群之一的兩種方法在第一種手段中，超抗原蛋白質(zhì)G在本發(fā)明中用作一般配體。蛋白質(zhì)G結(jié)合重鏈中的CH1恒定域。已經(jīng)證實(shí)(Hamers-Casterman等(1993)A^^",363,446-448)較大比例的重鏈抗體不會(huì)結(jié)合蛋白質(zhì)G(也不會(huì)結(jié)合蛋白質(zhì)A),并且這種差異用于在分析動(dòng)物血清時(shí)通過色譜方式從重鏈駱駝抗體中分離常用的駱駝抗體。顯然，重鏈抗體中的CH1結(jié)構(gòu)域中的缺失導(dǎo)致不存在結(jié)合固定化蛋白質(zhì)G。在本發(fā)明中，蛋白質(zhì)G(優(yōu)選固定在固相支持體上)可以用于富集表達(dá)常用的抗體的B-細(xì)胞(這些細(xì)胞結(jié)合蛋白質(zhì)G)或富集表達(dá)重鏈抗體的B-細(xì)胞(這些細(xì)胞不結(jié)合蛋白質(zhì)G)?；蛘撸梢杂脽晒馊玖?諸如熒光素，Cy3,Cy5,得克薩斯紅等)標(biāo)記蛋白質(zhì)G并且與B-細(xì)胞群一起孵育。然后可以通過使用熒光活化的細(xì)胞分選儀(FACS)分選不同亞群從表達(dá)重鏈抗體的B-細(xì)胞中分離表達(dá)常用抗體的B-細(xì)胞。顯然，可以使用對(duì)駱駝科抗體CH1結(jié)構(gòu)域增加的單克隆抗體或多克隆抗血清而非蛋白質(zhì)G。通過擴(kuò)展這一手段，對(duì)抗體輕鏈(輕鏈可變域，輕鏈恒定域或它們兩者)增加的單克隆抗體或多克隆抗血清也能夠從表達(dá)重鏈抗體的B-細(xì)胞亞群中分離表達(dá)常規(guī)結(jié)構(gòu)域的B-細(xì)胞亞群。在第二種手段中，輕鏈可變域在本發(fā)明中是有用的。正如本發(fā)明引言部分中所述，始終在常用抗體中發(fā)現(xiàn)作為與重鏈可變域配對(duì)的可變輕鏈結(jié)構(gòu)域。相反，重鏈抗體不具有輕鏈可變域。因此，在一方面-常用抗體—VH結(jié)構(gòu)域上的VL結(jié)合位點(diǎn)被VL結(jié)構(gòu)域占據(jù)，而在重鏈抗體中，VHH結(jié)構(gòu)域上的VL結(jié)合位點(diǎn)仍然未被占據(jù)。駱駝科重鏈的VHH可變域已經(jīng)在認(rèn)為防止VL結(jié)合的VL-結(jié)合位點(diǎn)上獲得。然而，值得指出的是在VHH結(jié)構(gòu)域，這些突變(在37,44,45和47位上-Kabat編號(hào))并非始終相同且更重要的是，并非始終同時(shí)存在于所有位置上。這種變異性程度提示盡管這種標(biāo)記對(duì)生物物理學(xué)特性，，諸如在溶液中的溶解度和單體狀態(tài)而言是有益的，但是它可以有利地被其它特征替代，諸如長CDR3，在W103位(Kabat編號(hào))上的突變且還有CDRs內(nèi)的氨基酸組成。這類駱駝VHH序列的實(shí)例可以在專利中找到(WO2004041862的表1，4，5,6;WO2004041865—表4;WO2004041863-表4,5,7,8)。因此，較大比例的camelid重鏈可變域提供了與常用抗體重鏈可變域VL-界面類似的上述VL-界面。這就產(chǎn)生了如下結(jié)論可以通過接觸固定化分離的VL結(jié)構(gòu)域(來自駱駝科或來自其它哺乳動(dòng)物)或染料標(biāo)記的VL結(jié)構(gòu)域從表達(dá)常用抗體的B-細(xì)胞中分離這類B-細(xì)胞亞群。VL和VH結(jié)構(gòu)域根據(jù)其組合性質(zhì)而言是混雜的，能夠通過鏈改組使常用抗體親和力成熟(Marks等(1992)Biotechnology(NY)10,779-783)。因此，對(duì)這類選擇而言發(fā)現(xiàn)混雜的輕鏈可變域的可能性是相對(duì)良好的。還應(yīng)注意，盡管VL結(jié)構(gòu)域與單體重鏈VHH的單體相互作用低于VL結(jié)構(gòu)域與常用VH結(jié)構(gòu)域的相互作用，但是提出的選擇方案可以緩解這一問題。實(shí)際上，通過固定VL結(jié)構(gòu)域和通過使其接觸B-細(xì)胞，較大的親和力作用會(huì)因在B-細(xì)胞表面上展示出許多相同的抗體拷貝而出現(xiàn)。本發(fā)明的一個(gè)有意義的實(shí)施方案在于使用VL結(jié)構(gòu)域也可以在B-細(xì)胞表面上不同類型的常用抗體之間區(qū)分。VL結(jié)構(gòu)域?qū)H結(jié)構(gòu)域的親和力可以改變(解離常數(shù)為10-9M-IO-6M-由Pliickthun(1992)/mww"o/.Aev.130，151-188綜述)。因此，可以預(yù)計(jì)，甚至在常用抗體內(nèi)也存在具有不同程度的VL與VH結(jié)構(gòu)域配對(duì)的亞群。通過用固定化VL結(jié)構(gòu)域選擇展示出常用抗體的B-細(xì)胞，可以分離那些表達(dá)常用抗體的B-細(xì)胞，其中抗體內(nèi)VL與VH結(jié)構(gòu)域之間的配對(duì)較弱，而-由于固定化VL結(jié)構(gòu)域大量過量，VH結(jié)構(gòu)域與固定化VL結(jié)構(gòu)域配對(duì)會(huì)得以促進(jìn)，由此導(dǎo)致B-細(xì)胞固定。這種手段特別有意義，因?yàn)樗兄谶x擇表達(dá)具有非?；祀s的VH結(jié)構(gòu)域的常用抗體的B-細(xì)胞亞群，這在認(rèn)為單一可變域格式變換時(shí)具有重要性。I.使用抗體輕鏈可變域的選擇本發(fā)明在一個(gè)實(shí)施方案這提供了用于從抗體多肽類的所有組成成分中選擇結(jié)合靶配體和一般配體的功能性可變域群體的方法，所述一般配體能夠結(jié)合所有組成成分中的功能性成員，而與靶配體特異性無關(guān)，該方法包括下列步驟a)使所有組成成分接觸所述一般配體并且選擇與之結(jié)合的功能性可變域；和b)使選擇的功能性可變域接觸靶配體并且選擇結(jié)合靶配體的可變域；其中可變域?yàn)橹劓溈勺冇蚯乙话闩潴w為抗體輕鏈可變域。本發(fā)明關(guān)注選擇的重鏈可變域可以存在于IgG,Fab,Fab，，F(xiàn)(ab)2,F(ab，)2,scFv,Fv和二石危鍵鍵合的Fv,即具有至少一種重鏈和輕鏈可變域配對(duì)的抗體或抗體片段上。不希望受到任何理論約束，認(rèn)為在這些配對(duì)的某些實(shí)例中，可變域配對(duì)為+〉散互補(bǔ)的，即結(jié)構(gòu)域可以-f又通過抗原結(jié)合主要銜接抗原或主要銜接可變域之一，但并非銜接配對(duì)中的另一個(gè)至任何突出的程度。例如，在某些VH/VL配對(duì)中，例如在某些人或Camelid4-鏈IgG中，重鏈可變域可以提供主要的/唯一的與抗原的結(jié)合接觸。因此，本申請(qǐng)具有從抗體多肽群體中選擇本說明書中的抗體或抗體片段的應(yīng)用，因?yàn)橛糜诓襟Ea)中的輕鏈可變域結(jié)合至少一種具有疏松VH/VL互補(bǔ)性的抗體或片段(IgG,Fab,Fab，，F(xiàn)(ab)2,F(ab，)2,scFv,Fv或二硫鍵鍵合的Fv)提供的VH。這提供了選擇VH的有用的方式，所述VH可以用作單一可變域(dAb或NanobodyTM)診斷，治療和/或預(yù)防產(chǎn)品或研發(fā)它們的起點(diǎn)。選擇的抗體或抗體片段自身可以具有這類產(chǎn)品的用途，例如找到抗原，其中"存活能力或疏松VH/VL配對(duì)可能有利的。因此，例如，本發(fā)明用于能夠進(jìn)行這類作為來自IgG群體的亞組的理想的IgG的這類選擇，所述IgG群體例如一膝駝或人IgG或人源化或嵌合IgG群體。作為這一概念的延伸，本文在I和II部分中所述本發(fā)明可以用于選擇抗體或抗體片段(例如IgG,Fab，F(xiàn)ab，，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)(ab，)2,雙特異抗體，scFv配對(duì)二聚體)，其包含如WO03002609A2,WO04003019A2和WO04058821A2中任意一篇中才皮露的雙特異性配體，其中該雙特異性配體具有至少一種VH/VL或VH/VH或VL/VL配對(duì)，其中配對(duì)中的可變域各自結(jié)合相應(yīng)的抗原?？乖N類可以相同(例如均結(jié)合TNFa,vWF,血清清蛋白的VH和VL或本文披露的任意其它靶抗原)或可變域可以結(jié)合不同抗原種類，例如結(jié)合血清清蛋白和其它TNFa的抗原或任意其它耙抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體多肽類群體為抗體單一可變域群體。因此，該群體可以為Camelid或人抗體重鏈可變域群體。在一個(gè)實(shí)施方案中，其為VHH結(jié)構(gòu)域或NanobodiesTM群體。任選步驟b)中的重鏈可變域?yàn)镃amelid可變域(VHH)，Nanobodiestm或來源于Camelid重鏈抗體(H2抗體)；或任選重鏈可變域各自為人可變域或來源于人。優(yōu)選首先使抗體多肽類的所有組成成分接觸靶配體且然后接觸一般配體?；蛘撸箍贵w多肽類接觸一般配體且然后接觸靶配體。優(yōu)選一般配體結(jié)合所有組成成分中的可變域亞組。在一個(gè)實(shí)例中，重鏈可變域的兩個(gè)或多個(gè)亞組選自多肽類的所有組成成分。在這種情況中的選擇可以使用兩種或多種一般配體，即兩種或多種不同的輕鏈可變域進(jìn)行。優(yōu)選在選擇后合并兩個(gè)或多個(gè)亞組以便產(chǎn)生多肽類的額外所有組成成分，然后按照本發(fā)明對(duì)輕鏈可變域選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，使多肽類中的兩種或多種所有組成成分接觸一般配體(相同或不同的一般配體)且然后合并由此獲得的多肽類亞組。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中提供了從抗體多肽類群體中選擇至少一種抗體重鏈可變域的方法，該方法包括a)使所述群體接觸抗體輕鏈可變域；和b)選擇至少一種結(jié)合輕鏈可變域的抗體重鏈可變域。與上述實(shí)施方案一樣，關(guān)注選擇的重鏈可變域可以存在于IgG,Fab,Fab，，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)(ab，)2,scFv，F(xiàn)v和二石危鍵鍵合的Fv，即具有至少一種重鏈和輕鏈可變域配對(duì)的抗體或抗體片段上。上述有關(guān)從疏松VH/VL配對(duì)中選擇VH的討論在此處也是適合的。優(yōu)選在步驟a)前，存在使抗體多肽類接觸靶配體和選擇結(jié)合靶配體的抗體多肽類的步驟，由此提供所述用于步驟a)的抗體多肽類群體。優(yōu)選在步驟b)后，存在使步驟b)中選擇的抗體重鏈可變域接觸靶配體和選擇結(jié)合耙配體的重鏈可變域的步驟。優(yōu)選步驟b)中選擇的重鏈結(jié)構(gòu)域各自來自下組來源于Camelid的重鏈可變域；VHH結(jié)構(gòu)域；Nanobody;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH。編號(hào)按照Kabat編號(hào)規(guī)則進(jìn)行(Kabat等.，1991,SequencesofImmunologicalInterest,5thed.U.S.Dept.Health&人Services,Washington,D.C.)。優(yōu)選步驟b)中選擇的重鏈結(jié)構(gòu)域各自為人源化Camelid或鼠重鏈可變域或人源化NanobodyTM。優(yōu)選步驟b)中選擇的重鏈結(jié)構(gòu)域各自為人重鏈可變域；來源于人的重鏈可變域；和人源化重鏈可變域(例如人源化Camelid或鼠可變域)。優(yōu)選輕鏈可變域?yàn)槿溯p鏈可變域；來源于人；具有FW2序列的輕鏈可變域，所述FW2序列與種系基因序列DPK9編碼的FW2相同；或具有人界面區(qū)(即通常與人VH/VL配對(duì)的VH結(jié)構(gòu)域分界面的區(qū))的輕鏈結(jié)構(gòu)域(例如Camelid-衍生的VL)。在另一個(gè)實(shí)例中，輕鏈可變域?yàn)镃amelid輕鏈可變域或來源于Camelid。優(yōu)選步驟a)中的群體由B-細(xì)胞群，例如外周血淋巴細(xì)胞提供。在一個(gè)實(shí)例中，B-細(xì)胞分離自已經(jīng)免疫接種靶抗原的哺乳動(dòng)物(例如小鼠或Camelid,例如美洲駝羊或駱駝)。在另一個(gè)實(shí)例中，B-細(xì)胞分離自尚未免疫接種靶抗原的哺乳動(dòng)物(例如小鼠或Camelid,例如美洲駝羊或駱駝)。在一種選擇中，步驟a)中使用的群體由通過合成方式重排的抗體基因編碼的抗體多肽類的所有組成成分提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中使用的群體由包含展示所述抗體多肽類的噬菌體的噬菌體展示文庫提供。這類文庫的實(shí)例披露在WO99/20749中。還參照WO04003019A2，WO05044858A1，WO04062551A2,WO04041867A2，WO04041865A2,WO04041863A2和WO04041862A2中有關(guān)噬菌體展示文庫的實(shí)例。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中是使用的群體包含(i)各自包含不與輕鏈可變域配對(duì)的至少一種重鏈可變域的抗體多肽類；和(ii)各自包含與輕鏈可變域配對(duì)的抗體多肽類。因此，例如，本發(fā)明的方法用于從還包含例如IgG形式的配對(duì)V結(jié)構(gòu)域的混合群體中選出抗體單一可變域(即未配對(duì)的V結(jié)構(gòu)域)。因此，本發(fā)明應(yīng)用于從還包含Camelid4-鏈IgG(具有配對(duì)的VH/VL結(jié)構(gòu)域)的混合群體(例如由B-細(xì)胞，諸如外周血淋巴細(xì)胞提供)中選擇VHH單一可變域。類似地，存在從還包含人4-鏈IgG的混合群體中選擇人VH的應(yīng)用。如果選擇單一可變域與IgG,其中VH/VL配對(duì)為如上所述"有活力的"，那么在步驟b)后可以存在額外的步驟，其中從選擇的IgG中分離單一可變域(例如基于大小或通過任意其它常規(guī)技術(shù))?？梢詮腂-細(xì)胞或噬菌體(或酵母或任意其它用于連接表型與基因型的文庫的系統(tǒng))中分離使用本發(fā)明任意實(shí)施方案的編碼選擇的單一可變域的核普酸序列并且插入表達(dá)可變域的表達(dá)載體。任選可以使核苷酸序列突變(例如在CDR3和/或FW中引入一種或多種突變)和/或可操作地與一種或多種抗體結(jié)構(gòu)域(例如另一種單一可變域)，抗體Fc結(jié)構(gòu)域，標(biāo)記或效應(yīng)基團(tuán)連接，此后從表達(dá)載體中表達(dá)。優(yōu)選用于步驟a)的群體包含camelid重鏈單一可變域(VHH)或NanobodiesTM。優(yōu)選用于步驟a)的群體包含包含人重鏈單一可變域(VH)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了從Camelid抗體多肽類群體中選擇至少一種Camelid抗體VHH結(jié)構(gòu)域的方法，所述Camelid抗體多肽類由分離自已經(jīng)免疫接種靶抗原的Camelid的B-細(xì)胞提供，該方法包括a)使所述群體接觸抗體輕鏈可變域；和b)選擇至少一種結(jié)合輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的VHH結(jié)構(gòu)域。在該優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選輕鏈可變域?yàn)槿溯p鏈可變域。在該優(yōu)選的實(shí)施方案中，優(yōu)選將B-細(xì)胞提供在多個(gè)孔或儲(chǔ)器中，其中各孔或儲(chǔ)器中平均包含一種B-細(xì)胞類型。本發(fā)明還提供了方法，包含(i)使用靶抗原對(duì)抗體多肽類的起始抗體多肽類群體；和(ii)使用選擇的群體作為用于本發(fā)明方i步驟a、)中的抗體多肽類群體。在本發(fā)明的方法中，在步驟b)中，優(yōu)選使選擇的抗體重鏈可變域中的至少一種與蛋白質(zhì)部分融合或與之綴合。優(yōu)選蛋白質(zhì)部分選自噬菌體外被蛋白、一種或多種抗體結(jié)構(gòu)域、抗體Fc結(jié)構(gòu)域、酶、毒素、標(biāo)^己和步支應(yīng)基團(tuán)。優(yōu)選在步驟b)中，選擇的抗體重鏈可變域中的至少一種為抗體部分或抗體片段，其選自IgG、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv和二硫鍵鍵合的Fv。本發(fā)明還提供了包含抗體重鏈可變域或由其組成的分離的抗體多肽，其中多肽可通過包含步驟a)和b)的方法獲得，其中該方法中的輕鏈可變域?yàn)槿溯p鏈可變域且重鏈可變域來自非人的哺乳動(dòng)物，例如Camelid。優(yōu)選重鏈可變域來自下組來源于Camelid的重鏈可變域；VHH結(jié)構(gòu)域；Nanobody;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH。優(yōu)選將重鏈可變域作為CamelidIgG或來源于Camelid的IgG的組成部分提供。優(yōu)選將重鏈可變域作為人IgG或來源于人的IgG的組成部分提供，并且其中使重鏈可變域在IgG中與不同于該方法步驟a)中使用的輕鏈可變域的輕鏈可變域配對(duì)。本發(fā)明還提供了這類抗體多肽作為藥物的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了這類抗體多肽在人疾病或疾患治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用?？蛇m合的疾患和疾病披露在WO04003019A2，WO05044858A1,WO04062551A2,WO04041867A2,WO04041865A2,WO04041863A2和WO04041862A2中，如遞送，給藥和制劑途徑。將所有這些具體的披露內(nèi)容明確地引入本說明書作為應(yīng)用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)膶?shí)例參考。II.使用抗體重鏈可變域的選擇在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了從抗體多肽類的所有組成成分中選擇結(jié)合靶配體和一般配體的功能性可變域群體的方法，所述一般配體能夠結(jié)合所有組成成分中的功能性成員，而與靶配體特異性無關(guān)，該方法包括下列步驟a)使所有組成成分接觸所述一般配體并且選擇與之結(jié)合的功能性可變域；和b)使選擇的功能性可變域接觸靶配體并且選擇結(jié)合靶配體的可變域群體；其中可變域?yàn)檩p鏈可變域且一般配體為抗體重鏈可變域。本發(fā)明關(guān)注選擇的輕鏈可變域可以存在于IgG，F(xiàn)ab,Fab，，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)(ab，)2,scFv,Fv和二硫鍵鍵合的Fv，即具有至少一種重鏈和輕鏈可變域配對(duì)的抗體或抗體片段上。不希望受到任何理論約束，認(rèn)為在這79些配對(duì)的某些實(shí)例中，可變域配對(duì)為矛〉散互補(bǔ)的，即結(jié)構(gòu)域可以僅通過抗原結(jié)合主要銜接抗原或主要銜接可變域之一，但并非銜接配對(duì)中的另一個(gè)至任何突出的程度。例如，在某些VH/VL配對(duì)中，例如在某些人或Camelid4-鏈IgG中，輕鏈可變域可以提供主要的/唯一的與抗原的結(jié)合接觸。因此，本申請(qǐng)具有從抗體多肽群體中選擇本說明書中的抗體或抗體片段的應(yīng)用，因?yàn)橛糜诓襟Ea)中的重鏈可變域結(jié)合至少一種具有疏松VH/VL互補(bǔ)性的抗體或片段(IgG,Fab,Fab，，F(xiàn)(ab)2,F(ab，)2,scFv，F(xiàn)v或二硫鍵鍵合的Fv)提供的VL。這提供了選擇VL的有用的方式，所述VL可以用作單一可變域(dAb或NanobodyTM)診斷，治療和/或預(yù)防產(chǎn)品或研發(fā)它們的起點(diǎn)。選擇的抗體或抗體片段自身可以具有這類產(chǎn)品的用途，例如找到抗原，其中"活力或疏松VH/VL配對(duì)可能有利的。因此，例如，本發(fā)明用于能夠進(jìn)行這類作為來自IgG群體的亞組的理想的IgG的這類選擇，所述IgG群體例如駱駝或人IgG或人源化或嵌合IgG群體。作為這一概念的延伸，本文在I和II部分F(ab)2,F(ab，):，、艱特異抗體f'scFv配對(duì)二聚體)，其包含如WO03002609A2,WO04003019A2和WO04058821A2中任意一篇中才皮露的雙特異性配體，其中該雙特異性配體具有至少一種VH/VL或VH/VH或VL/VL配對(duì)，其中配對(duì)中的可變域各自結(jié)合相應(yīng)的抗原?？乖N類可以相同(例如均結(jié)合TNFa,vWF,血清清蛋白的VH和VL或本文披露的任意其它耙抗原)或可變域可以結(jié)合不同抗原種類，例如結(jié)合血清清蛋白和其它TNFa的抗原或任意其它粑抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體多肽類群體為抗體單一可變域群體。因此，該群體可以為Camelid或人抗體輕鏈可變域群體。任選步驟b)中的輕鏈可變域?yàn)镃amelid輕鏈可變域(VHH)或來源于Camelid;或任選輕鏈可變域各自為人可變域或來源于人。優(yōu)選首先使抗體多肽類的所有組成成分接觸靶配體且然后接觸一般配體。或者，使抗體多肽類接觸一般配體且然后接觸粑配體。優(yōu)選一^:配體結(jié)合所有組成成分中的可變域亞組。在一個(gè)實(shí)例中，重鏈可變域的兩個(gè)或多個(gè)亞組選自多肽類的所有組成成分。在這種情況中的選擇可以使用兩種或多種一般配體，即兩種或多種不同的重鏈可變域進(jìn)行。優(yōu)選在選擇后合并兩個(gè)或多個(gè)亞組以便產(chǎn)生多肽類的額外所有組成成分，然后按照本發(fā)明對(duì)重鏈可變域選擇。在一個(gè)實(shí)施方案中，使多肽類中的兩種或多種所有組成成分接觸一般配體(相同或不同的一般配體)且然后合并由此獲得的多肽類亞組。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中提供了從抗體多肽類群體中選擇至少一種抗體輕鏈可變域的方法，該方法包括a)使所述群體接觸抗體重鏈可變域；和b)選擇至少一種結(jié)合重鏈可變域的抗體輕鏈可變域。與上述實(shí)施方案一樣，關(guān)注選擇的輕鏈可變域可以存在于IgG,Fab，F(xiàn)ab，，F(xiàn)(ab)2，F(xiàn)(ab，)2,scFv,Fv和二硫鍵鍵合的Fv,即具有至少一種重鏈和輕鏈可變域配對(duì)的抗體或抗體片段上。上述有關(guān)從疏松VH/VL配對(duì)中選擇VL的討論在此處也是適合的。優(yōu)選在步驟a)前，存在使抗體多肽類接觸耙配體和選擇結(jié)合靶配體的抗體多肽類的步驟，由此提供所述用于步驟a)的抗體多肽類群體。優(yōu)選在步驟b)后，存在使步驟b)中選擇的抗體輕鏈可變域接觸靶配體和選擇結(jié)合耙配體的輕鏈可變域的步驟。優(yōu)選步驟b)中選擇的輕鏈結(jié)構(gòu)域?yàn)槿嗽椿疌amelid或鼠輕鏈可變域。優(yōu)選步驟b)中選擇的輕鏈結(jié)構(gòu)域各自為人輕鏈可變域；來源于人的輕鏈可變域；或人源化輕鏈可變域(例如人源化Camelid或鼠可變域)。優(yōu)選重鏈可變域?yàn)槿酥劓溈勺冇?；來源于人；具有FW2序列的輕鏈可變域，所述FW2序列與種系基因序列DP47編碼的FW2相同；或具有與種系基因序列DP47編碼的44,45和47位相同的44,45和47位的重鏈可變域；或具有人界面區(qū)(即通常與人VH/VL配對(duì)重的VL結(jié)構(gòu)域分界面的區(qū))的重鏈結(jié)構(gòu)域(例如Camelid-衍生的VH)。在另一個(gè)實(shí)例重，重鏈可變域?yàn)镃amelid重鏈可變域或來源于Camelid。優(yōu)選步驟a)中的群體由B-細(xì)胞群，例如外周血淋巴細(xì)胞提供。在一個(gè)實(shí)例中，B-細(xì)胞分離自已經(jīng)免疫接種靶抗原的哺乳動(dòng)物(例如小鼠或Camelid,例如美洲駝羊或駱駝)。在另一個(gè)實(shí)例中，B-細(xì)胞分離自尚未免疫接種耙抗原的哺乳動(dòng)物(例如小鼠或Camelid,例如美洲駝羊或駱駝)。在一種選擇中，步驟a)中使用的群體由通過合成方式重排的抗體基因編碼的抗體多肽類的所有組成成分提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中使用的群體由包含展示所述抗體多肽類的噬菌體的噬菌體展示文庫提供。這類文庫的實(shí)例披露在WO99/20749中。還參照WO04003019A2,WO05044858A1,WO04062551A2,WO04041867A2,WO04041865A2,WO04041863A2和WO04041862A2中有關(guān)噬菌體展示文庫的實(shí)例。在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟a)中是使用的群體包含(i)各自包含不與重鏈可變域配對(duì)的至少一種輕鏈可變域的抗體多肽類；和(ii)各自包含與輕鏈可變域配對(duì)的重鏈可變域的抗體多肽類。因此，例如，本發(fā)明的方法用于從還包含例如IgG形式的配對(duì)V結(jié)構(gòu)域的混合群體中選出抗體單一可變域(即未配對(duì)的V結(jié)構(gòu)域)。因此，本發(fā)明應(yīng)用于從還包含Camelid4-鏈IgG(具有配對(duì)的VH/VL結(jié)構(gòu)域)的混合群體(例如由B-細(xì)胞，諸如外周血淋巴細(xì)胞提供)中選擇VL單一可變域。如果選擇單一可變域與IgG,其中VH/VL配對(duì)為如上所述"有活力的"，那么在步驟b)后可以存在額外的步驟，其中從選擇的IgG中分離單一可變域(例如基于大小或通過任意其它常規(guī)技術(shù))?？梢詮腂-細(xì)胞或噬菌體(或酵母或任意其它用于連接表型與基因型的文庫的系統(tǒng))中分離使用本發(fā)明任意實(shí)施方案的編碼選擇的單一可變域的核苦酸序列并且插入表達(dá)可變域的表達(dá)載體。任選可以使核苷酸序列突變(例如在CDR3和/或FW中引入一種或多種突變)和/或可操作地與一種或多種抗體結(jié)構(gòu)域(例如另一種單一可變域)，抗體Fc結(jié)構(gòu)域，標(biāo)記或效應(yīng)基團(tuán)連接，此后從表達(dá)載體中表達(dá)。優(yōu)選步驟a)中使用的群體包含camelid輕鏈單一可變域。優(yōu)選步驟a)中使用的群體包含人輕鏈單一可變域(VL)。本發(fā)明還提供了方法，包含(i)使用靶抗原對(duì)抗體多肽類的起始抗體多肽類群體；和(ii)使用選擇的群體作為用于本發(fā)明方法步驟、a)中的抗體多肽類群體。在本發(fā)明的方法中，在步驟b)中，優(yōu)選使選擇的抗體輕鏈可變域中的至少一種與蛋白質(zhì)部分融合或與之綴合。優(yōu)選蛋白質(zhì)部分選自噬菌體外被蛋白、一種或多種抗體結(jié)構(gòu)域、抗體Fc結(jié)構(gòu)域、酶、毒素、標(biāo)記和-丈應(yīng)基團(tuán)。優(yōu)選在步驟b)中，選擇的抗體輕鏈可變域中的至少一種為抗體部分或抗體片l殳，其選自IgG、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv和二硫鍵鍵合的Fv。本發(fā)明還提供了包含抗體輕鏈可變域或由其組成的分離的抗體多肽，其中多肽可通過包含步驟a)和b)的方法獲得，其中該方法中的重鏈可變域?yàn)槿酥劓溈勺冇蚯抑劓溈勺冇騺碜苑侨说牟溉閯?dòng)物，例如Camelid。優(yōu)選輕鏈可變域來源于Camelid。優(yōu)選將輕鏈可變域作為CamelidIgG或來源于Camelid的IgG組成部分提供。優(yōu)選將輕鏈可變域作為人IgG或來源于人的IgG的組成部分提供，且其中使輕鏈可變域在IgG中與不同于該方法步驟a)中使用的重鏈可變域的重鏈可變域配對(duì)。本發(fā)明還提供了這類抗體多肽作為藥物的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了這類抗體多肽在人疾病或疾患的治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了這類抗體多肽在人疾病或疾患治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用?？蛇m合的疾患和疾病4皮露在WO04003019A2,WO05044858A1,WO04062551A2，WO04041867A2，WO04041865A2,WO04041863A2和WO04041862A2中，如遞送，給藥和制劑途徑。將所有這些具體的披露內(nèi)容明確地引入本說明書作為應(yīng)用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)膶?shí)例參考。在一個(gè)實(shí)施方案中，按照I部分中所列的方法選擇抗體重鏈可變域群體，并且按照II部分中所列的方法選擇抗體輕鏈可變域，且然后合并由此獲得的群體。III.使用T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域的選擇本發(fā)明提供了從多肽類的所有組成成分中選擇結(jié)合靶配體和一般配體的功能性T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域群體的方法，所述一般配體能夠結(jié)合所有組成成分中的功能性成員，而與靶配體的特異性無關(guān)，該方法包括下列步驟a)使所有組成成分接觸所述一般配體并且選擇與之結(jié)合的功能性T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域；和b)使選擇的功能性T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域接觸耙配體并且選擇結(jié)合靶配體的T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域群體；其中a)T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域?yàn)閂a結(jié)構(gòu)域且一般配體為T-細(xì)胞受體Vp結(jié)構(gòu)域；或b)T-細(xì)胞結(jié)構(gòu)域?yàn)門-細(xì)胞受體Vp結(jié)構(gòu)域且一般配體為T-細(xì)胞受體Va結(jié)構(gòu)域。任選在a)中，T-細(xì)胞受體Va結(jié)構(gòu)域?yàn)閬碓从贑amelid的Camelid結(jié)構(gòu)域；或任選在a)和b)中，T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域各自為人結(jié)構(gòu)域或來源于人。優(yōu)選按照該方法選擇T-細(xì)胞受體Va結(jié)構(gòu)域群體并且按照該方法選擇T-細(xì)胞受體Vp結(jié)構(gòu)域，且然后合并由此獲得的群體。其它實(shí)施例,滋辨」/;4丙個(gè)^參淘^磁豕^雙^;^凝#^^;_^游#詐為、岸戎^-掙#^重遂^傳^^^:鍵在第0,7,14,21,28,35，42，49和54天時(shí)給1只成年美洲駝羊注射1mg人破傷風(fēng)類毒素(TT)。在每次注射前采集血清，隨后發(fā)生對(duì)免疫原的免疫應(yīng)答。從免疫接種動(dòng)物中采集抗凝血(150ml)并且使用Unisep(WAKChemie,Germany)制備外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)。使用蛋白質(zhì)G包被無菌ELISA平板(在4°C下10(xg/ml過夜)，然后用無菌PBS洗滌，用無菌PBS-10%IgG-耗盡的FCS(胎牛血清)封閉且然后再用PBS洗滌。使用TT包被無菌ELISA平板(在4°C下10pg/ml過夜)，然后用無菌PBS洗滌，用無菌PBS-10%IgG-耗盡的FCS(胎牛血清)封閉且然后再用PBS洗滌。首先將純化的PBLs(在PBS中)加入到蛋白質(zhì)G-包被的孔中并且使其在37。C下結(jié)合至少1小時(shí)。從蛋白質(zhì)G-包被的各孔中謹(jǐn)慎取出上清液中未結(jié)合的細(xì)胞(主要展示重鏈抗體或無抗體)并且合并。將表達(dá)重鏈的B-細(xì)胞中富集的細(xì)胞群加入到TT-包被的孔(以300個(gè)細(xì)胞/孔和1,500個(gè)細(xì)胞/孔的密度)中并且使其在37°C下結(jié)合至少1小時(shí)。通過用培養(yǎng)基洗滌10次除去上清液中未結(jié)合的細(xì)胞。在有包被抗原，T細(xì)胞條件培養(yǎng)基(3%)和EL-4細(xì)胞(5xIOV孔)存在下將表達(dá)抗原-特異性重鏈抗體的細(xì)胞培養(yǎng)7天。通過使用蛋白質(zhì)A-辣才艮過氧化物酶綴合物和TMB底物的ELISA分析新鮮TT-包被的孔中小體積的培養(yǎng)物上清液中的抗體結(jié)合鑒定分泌抗原-特異性抗體的陽性孔。選擇陽性B-細(xì)胞孔用于進(jìn)一步處理使B-細(xì)胞沉淀，除去上清液并且將細(xì)胞沉淀重新懸浮于10pl新鮮培養(yǎng)基(含有1-6%丁-細(xì)胞條件培養(yǎng)基的DMEM或RPMI)。取等分部分(各2pl)用于使用MJResearchRobusRT-PCR試劑盒(CatalogueNo.F-580L)的PCR，其中使用下列混合物/管來分離重鏈可變域35.55^11W2.5|tilDEPC水lOx緩沖液dNTPS10%NP-40RNAsinRT聚合酶2pl引物混合物(*)lpl(各IO^iM)MgC121.5PCR程序在50°C下30分鐘，隨后在94°C下2分鐘且然后是[94°C/1分鐘，55。C/1分鐘，72°C/1分鐘]的40個(gè)循環(huán)。組織伸展72。C/5分鐘。*:該混合物包含下列兩種引物寡-dT引物和單一變性的FR1引物5，誦GAGGTBCARCTGCAGGASTCYGG國3，，其編碼尸Wl限制位點(diǎn)。用尸Wl和5wEII切割1,300bp片段。后一種酶通常在編碼重鏈抗體的構(gòu)架4的DNA片段中切割。在電泳和UV照射后從瓊脂糖凝膠中分離消化產(chǎn)物并且連入克隆載體的相應(yīng)位點(diǎn)，所述克隆載體可以在用于生長的選擇性抗生素條件下在大腸桿菌中增殖。連接載體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞并且對(duì)尸W7/SWMI插入片段測序以^f更揭示出重鏈可變域的DNA序列。#滋辨S;遞《^游淘這和^4勿/^##^^^瘦凝#^^^厶敘#f#鏈拔沐的Tf械在第0,7,14,21，28，35,42,49和54天時(shí)給1只成年美洲駝羊注射1mg人破傷風(fēng)類毒素(TT)。在每次注射前采集血清，隨后發(fā)生對(duì)免疫原的免疫應(yīng)答。從免疫接種動(dòng)物中采集抗凝血(150ml)并且使用Unisep(WAKChemie,Germany)制備外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)。使用VL結(jié)構(gòu)域VL結(jié)構(gòu)域(例如Conrath等(2005)丄A/o/350，112-25所述VL結(jié)構(gòu)域)包被無菌ELISA平板(在4°C下10pg/ml過夜)，然后用無菌PBS洗涂，用無菌PBS-10%IgG-耗盡的FCS(胎牛血清)封閉且然后再用PBS洗滌。使用應(yīng)用對(duì)暴露的賴氨酸殘基具有特異性的N-羥基琥珀酰亞胺基(NHS)的德克薩斯紅或異疏氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記破傷風(fēng)類毒素。通過使標(biāo)記的TT通過PD10柱(AmershamBiosciences)除去過量的熒光標(biāo)記。通過質(zhì)譜(MALDI-TOF)評(píng)價(jià)使用德克薩斯紅或FITC標(biāo)記的程度。首先在室溫下將純化的PBLs與標(biāo)記的TT一起孵育30分鐘(就106個(gè)細(xì)胞而言使用1ug標(biāo)記的TT)。遞^"岸心5為、#產(chǎn)沉淀勿^敏#^重新,者孕于(Um/尸SS哞。然后用安裝了自動(dòng)細(xì)胞存放部件的流式細(xì)胞儀(例如來自Coulter,Florida,USA的CoulterEpicsElite流式細(xì)胞儀)分選細(xì)胞中的TT-陽性細(xì)胞。將所有TT-結(jié)合的陽性細(xì)胞收集在單一儲(chǔ)器中。在該階段，抗原-特異性B-細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面上的常規(guī)抗體或重鏈抗體。如下進(jìn)行對(duì)表達(dá)抗原-特異性重鏈抗體的B-細(xì)胞亞群的進(jìn)一步分離。將合并的B-細(xì)胞中富集的細(xì)胞群加入到蛋白質(zhì)L-包被的孔中并且使其在37°C下結(jié)合至少1小時(shí)。通過用培養(yǎng)基洗滌10次除去上清液中未結(jié)合的細(xì)胞(主要展示常用抗體或無抗體)。取出結(jié)合的細(xì)胞(表達(dá)抗原-特異性重鏈抗體)，計(jì)數(shù)并且用于在有T細(xì)胞條件培養(yǎng)基(3%)存在下以0.3細(xì)胞/孔的接種比例接種新鮮的EL4-B5T-細(xì)胞包被的孔(5x104/孔)。將細(xì)胞培養(yǎng)7天，此后通過使用蛋白質(zhì)A-辣根過氧化物酶綴合物和TMB底物的ELISA分析新鮮TT-包被的孔中小體積的培養(yǎng)物上清液中的抗體結(jié)合鑒定分泌抗原-特異性重鏈抗體的陽性孔。選擇陽性B-細(xì)胞孔用于進(jìn)一步處理使B-細(xì)胞沉淀，除去上清液并且將細(xì)胞沉淀重新懸浮于10pl新鮮培養(yǎng)基(含有1-6%丁-細(xì)胞條件培養(yǎng)基的DMEM或RPMI)。取等分部分(各2pl)用于使用MJResearchRobusRT-PCR試劑盒(CatalogueNo.F-580L)的PCR,其中使用下列混合物/管來分離重鏈可變域DEPC水35.5pl10x緩沖液dNTPS1W10%NP-402.5(li1RNAsin0.5(^1RTlpl聚合酶2pl引物混合物("lpl(各10|iiM)MgC121.5PCR程序在50°C下30分鐘，隨后在94°C下2分鐘且然后是[94。C/1分鐘，55。C/1分鐘，72°C/1分鐘]的40個(gè)循環(huán)。組織伸展72。C/5分鐘。*:該混合物包含下列兩種引物寡-dT引物和單一變性的FR1引物5，-GAGGTBCARCTGCAGGASTCYGG-3，，其編碼尸Wl限制位點(diǎn)。用尸WI和切割1,300bp片段。后一種酶通常在編碼重鏈抗體的構(gòu)架4的DNA片段中切割。在電泳和UV照射后從瓊脂糖凝膠中分離消化產(chǎn)物并且連入克隆載體的相應(yīng)位點(diǎn)，所述克隆載體可以在用于生長的選擇性抗生素條件下在大腸桿菌中增殖。連接載體用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞并且對(duì)尸W//^^11插入片段測序以^f更揭示出重鏈可變域的DNA序列。附錄1a)細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體，酶等，包括細(xì)胞因子，細(xì)胞因子受體，酶，酶輔因子或DNA結(jié)合蛋白。合適的細(xì)胞因子和生長因子包括，但不限于ApoE,Apo-SAA,BDNF,心臟營養(yǎng)素-1，EGF,EGF受體，ENA-78,嗜酸細(xì)胞活化趨化因子，嗜酸細(xì)胞活化趨化因子-2，Exodus-2，F(xiàn)GF-酸性，F(xiàn)GF-石咸性，成纖維細(xì)胞生長因子-10,FLT3配體，趨化骨分子(CX3C)，GDNF,G陽CSF，GM-CSF，GF國卩1,胰島素，IFN畫y，IGF-I,IGF-II,IL畫la,IL隱1卩，IL-2,IL畫3，IL國4，IL-5,IL國6，IL國7，IL-8(72a.a.)，IL畫8(77a.a.)，IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13,IL-15,IL-16,IL-17,IL-18(IGIF),抑制素a,抑制素p,IP-10,角質(zhì)化細(xì)胞生長因子-2(KGF-2),KGF，瘦蛋白，LIF,淋巴細(xì)胞趨化蛋白，穆勒抑制物，單核細(xì)胞集落抑制因子，單核細(xì)胞引誘蛋白，M-CSF,MDC(67a.a.),MDC(69a.a.)，MCP國1(MCAF),MCP-2,MCP畫3，MCP-4,MDC(67a.a.),MDC(69a.a.)，MIG,MIP-la,MIP-1卩，MlP陽3a,MIP-3卩，MIP國4，骨髓先祖細(xì)胞抑制因子-l(MPIF-l),NAP-2,Neurturin,神經(jīng)生長因子，|3-NGF,NT國3，NT-4,制癌蛋白M,PDGF畫AA,PDGF-AB，PDGF國BB，PF-4,RANTES,SDFla,SDF1卩，SCF，SCGF，干細(xì)胞因子(SCF),TARC,TACE識(shí)別位點(diǎn)，TGF-a,TGF-卩，TGF國卩2，TGF畫卩3，腫瘤壞死因子(TNF),TNF-a,TNF陽卩，TNF受體I(p55)，TNF受體II,TNIL畫l,TPO,VEGF,VEGF受體l,VEGF受體2，VEGF受體3，GCP-2,GRO/MGSA,GRO-|3,GRO誦y,HCC1,1-309,HER1,HER2,HER3和HER4。細(xì)胞因子受體包括上述細(xì)胞因子各自的受體，例如IL-1R,IL-6R,IL-10R，IL陽18R等?？梢岳斫庠撉鍐谓^非窮盡。本發(fā)明優(yōu)選的抗原單一可變域多肽類的耙標(biāo)披露在WO04/041867中(將該文獻(xiàn)的內(nèi)容完整地引入本文作為參考)，并且包括，但不限于TNFa,IgE,IFNy,MMP-12,EGFR,CEA,幽門螺桿菌(H.pylori),TB,流感，PDK-1,GSK1,Bad，胱天蛋白酶，F(xiàn)orkhead和馮維勒布蘭德因子(vWF)。靶標(biāo)還可以為上述靶標(biāo)的片段。因此，靶標(biāo)還為能夠引起免疫應(yīng)道的上述靶標(biāo)的片段。靶標(biāo)還為能夠結(jié)合對(duì)全長靶標(biāo)增加的抗體單一可變域多肽的上述靶標(biāo)的片段。b)能夠增加部分半衰期的抗原(后面的部分為，例如治療或成像蛋白質(zhì)部分，例如抗體或抗體片段，例如抗體可變域，諸如人VH或VL結(jié)構(gòu)域或CamelidVHH)。a-1糖蛋白(血清類粘蛋白)(AAG)a-l抗月夷凝乳蛋白酶(Antichyromotrypsin)(ACT)a-l抗胰蛋白酶(AAT)a-l微球蛋白(蛋白質(zhì)HC)(AIM)a-2巨3求蛋白(A2M)抗凝血酶m(ATIII)載脂蛋白A-l(ApoA-l)載脂蛋白B(ApoB)(3-2-微球蛋白(B2M)血漿銅藍(lán)蛋白(Cp)補(bǔ)體成分(C3)補(bǔ)體成分(C4)Cl酯酶抑制劑(C1腿)C-反應(yīng)蛋白(CRP)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C(CysC)鐵蛋白(FER)血纖蛋白原(FIB)纖連蛋白(FN)結(jié)合球蛋白(Hp)血液結(jié)合素(HPX)免疫球蛋白A(IgA)免疫球蛋白D(IgD)免疫球蛋白E(IgE)免疫球蛋白G(IgG)免疫球蛋白M(IgM)免疫球蛋白輕鏈(K/入)脂蛋白)[Lpa]]甘露糖-結(jié)合蛋白(MBP)月幾J求蛋白(Myo)纖溶酶原(PSM)前白蛋白(轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白)(PAL)視黃醇-結(jié)合蛋白(RBP)Rheomatoid因子(RF)血清淀粉樣蛋白A(SAA)可溶性運(yùn)4失蛋白(Tranferrin)受體(sTfR)運(yùn)鐵蛋白(Tf)G:能夠增加配體半衰期的抗原來自胞外基質(zhì)的蛋白質(zhì)，例如膠原蛋白，層粘連蛋白，整聯(lián)蛋白和纖連蛋白。膠原蛋白為胞外基質(zhì)中的主要蛋白質(zhì)。目前已知在身體的不同部位中發(fā)現(xiàn)的約15個(gè)類型的膠原蛋白分子，例如在骨、皮膚、腱、韌帶、角膜、內(nèi)臟器官中發(fā)現(xiàn)的I型膠原蛋白(占身體膠原蛋白的90%)或在軟骨、推間盤、脊索、眼的玻璃體液中發(fā)現(xiàn)的II型膠原蛋白。在血液中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)包括血漿蛋白，諸如血纖蛋白，a-2巨球蛋白，血清清蛋白，血纖蛋白原A,血纖蛋白原B,血清淀粉樣蛋白蛋白質(zhì)A,heptaglobulin,蛋白質(zhì)，遍在蛋白，子宮球蛋白和p-2-微球蛋白；酶和抑制劑，諸如纖溶酶原，溶菌酶，胱蛋白酶抑制劑C,a-l-抗胰蛋白酶和胰kypsin抑制劑。纖溶酶原為胰蛋白酶-樣2s絲氨酸蛋白酶纖維蛋白溶酶的無活性前體。一般發(fā)現(xiàn)它通過血流循環(huán)。當(dāng)纖溶酶原變活化并且轉(zhuǎn)化成纖維蛋白溶酶時(shí)，它不折疊有效酶結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域溶解摻入血塊中血細(xì)胞的血纖蛋白原纖維。這稱作纖維蛋白溶解；免疫系統(tǒng)蛋白，諸如IgE,IgG，IgM;轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，諸如視黃醇結(jié)合蛋白，o-l微球蛋白；防御素，諸如P-防御素l,嗜中性粒細(xì)胞防御素l,2和3;在血腦屏障或神經(jīng)組織上發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)，諸如黑皮質(zhì)素受體，髓磷脂，抗壞血酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；運(yùn)鐵蛋白受體特異性配體-神經(jīng)藥物活性劑融合蛋白(參見US5977307);腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受體，運(yùn)鐵蛋白受體，胰島素，胰島素-樣生長因子l(IGFl)受體，胰島素-樣生長因子2(IGF2)受體，胰島素受體；位于腎的蛋白質(zhì)，諸如多嚢蛋白，IV類膠原蛋白，有機(jī)陰離子運(yùn)4失蛋白Kl,Heymann抗原。位于肝的蛋白質(zhì)，例如醇脫氬酶，G250;凝血因子X;al抗胰蛋白酶；HNFla;位于肺的蛋白質(zhì)，諸如分泌成分(結(jié)合IgA);位于心臟的蛋白質(zhì)，例如HSP27,它與擴(kuò)張型心肌病相關(guān)；位于皮膚的蛋白質(zhì)，例如角蛋白；骨特異性蛋白，諸如骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs),其為顯示成骨活性的轉(zhuǎn)化生長因子卩超家族亞組，實(shí)例包括BMP-2、-4、-5、-6、-7(也稱作成骨蛋白(OP-1)和-8(OP-2);胂瘤特異性蛋白，包括人滋養(yǎng)層抗原，赫賽汀受體，雌二醇受體，組織蛋白酶，例如組織蛋白酶B(在肝和脾中發(fā)現(xiàn))；疾病-特異性蛋白，諸如僅在活化的T-細(xì)胞上表達(dá)的抗原包括LAG-3(淋巴細(xì)胞活化基因)，骨保護(hù)素配體(OPGL),參見A^w^402，304-309;1999,OX40(TNF受體家族成員，在活化的T細(xì)胞上表達(dá)且已知僅共刺激T細(xì)胞分子在產(chǎn)生人T細(xì)胞白血病病毒I型(HTLV-I)的細(xì)胞中特異性增量調(diào)節(jié))，參見J/mmw"o/.2卯0JW/，/65(7」,2<53-70;金屬蛋白酶(與關(guān)節(jié)炎/癌癥相關(guān))，包括CG6512果蠅屬(Drosophila)，人截癱蛋白，人FtsH,人AFG3L2,鼠ftsH;生成血管的生長因子，包括酸性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-1),堿性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)，血管內(nèi)皮生長因子/血管滲透因子(VEGF/VPF),轉(zhuǎn)化生長因子-a(TGFa),腫瘤壞死因子-a(TNF-a),血管生成素，白細(xì)胞介素-3(IL-3),白細(xì)胞介素-8(IL-8),血小板衍生內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(PD-ECGF),胎盤生長因子(P1GF)，中期因子血小板衍生生長因子-BB(PDGF),CXXXX趨化分子；應(yīng)激蛋白(熱激蛋白)；HSPs—般在胞內(nèi)分析。當(dāng)發(fā)現(xiàn)它們?cè)诎鈺r(shí)，其為細(xì)胞死亡和發(fā)散出其內(nèi)含物的指示劑。這種非程序性細(xì)胞死亡(壞死)僅在作為創(chuàng)傷，疾病或損傷結(jié)果是發(fā)生，且由此在體內(nèi)胞外HSPs引起來自抗感染和疾病的免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。結(jié)合胞外HSP的雙重特異性可以局限于疾病部位；涉及Fc轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)；Brambell受體(也稱作FcRB);這種Fc受體具有兩種功能，這兩者均能夠用于遞送；這些功能為1)IgG通過胎盤從母體轉(zhuǎn)運(yùn)給兒童；2)防止IgG降解，由此延長其IgG的血清半衰期。認(rèn)為受體使來自內(nèi)體的IgG再循環(huán)。參見Holliger等，NatBiotechno11997Jul;15(7):632-6。c)耙抗原還可以為下表中的任意一種，而與該抗原是否如表中所示配對(duì)無關(guān)-<table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>TNFa/IL-11細(xì)胞因子以協(xié)同作用方式誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化由無限增殖化或正常顱蓋細(xì)胞支持。Jm/尸/z，Zo/Ce〃尸/^wo/.2002Sep;283(3):C679-87。(骨丟失)TNFa/IL-12TNFa/IL-13TNF-a與IL-4或IL-13組合通過增加的mRNA穩(wěn)定性實(shí)現(xiàn)VCAM-1在培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中的持續(xù)升高水平。AmJPathol.1999Apr;154(4):1149-58。白細(xì)胞介素-13和胂瘤壞死因子-a以協(xié)同作用方式誘導(dǎo)人鼻成纖維細(xì)胞中的嗜酸細(xì)胞活化趨化因子產(chǎn)生。ClinExpAllergy.2000Mar;30(3):348-55。白細(xì)胞介素-13和肺瘤壞死因子-a以協(xié)同作用方式誘導(dǎo)人鼻成纖維細(xì)胞中嗜酸細(xì)胞活化趨化因子產(chǎn)生。C/,"Ex/j〃ergy.2000Mar;30(3):348-55(過敏性炎癥)血清TNF-P和IL-13涉及治療兒童期腎病綜合征反應(yīng)。Cyoh"e.2003Feb7;21(3):155-9。TNFa/IL-14吸入的肺瘤壞死因子a在具有輕度哮喘的受試者中的作用。T7zora;c.2002Sep;57(9):774-8。TNFa/IL-15吸入的腫瘤壞死因子a在具有輕度。孝喘的受試者中的作用。T72畫jc.2002Sep;57(9):774-8。TNFa/IL-16胂瘤壞死因子-a-誘導(dǎo)的白細(xì)胞介素-16在氣道上皮細(xì)胞的合成引發(fā)5-羥色胺刺激。爿mJAm/^Ce〃Mo/說o/.2003Mar;28(3):354-62.(氣道炎癥)患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的循環(huán)白細(xì)胞介素16與促炎細(xì)胞因子相關(guān)。臉w應(yīng)fo/，(Oxford).2001Apr;40(4):474-5。無可利用的摘要。白細(xì)胞介素16在克羅恩病中增量調(diào)節(jié)并且參94<table>tableseeoriginaldocumentpage95</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage102</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage103</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage104</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage105</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage106</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage107</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage108</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage109</column></row><table>a)公布的單一可變域披露在WO030020609,WO2004101790,WO2005035572,WO2004081026,WO2004003019和WO2004058821中的任意的可變域，將披露的這些可變域，其序列和生產(chǎn)和選擇方法明確地引入本文作為參考，以便為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供用于本發(fā)明的一般配體的實(shí)例。才皮露在WO9404678,WO9748905,W09933221,W09937681,WO0024884,WO0043507,WO0065057,WO0140310,WO03035694,WO03053531,WO03054015,WO0305527,WO2004015425，WO2004041862,WO2004041863,WO20040401865,WO2004062551，WO2005044858和EP1134231中的任意VHH結(jié)構(gòu)域或任意其它可變域，將4皮露的這些可變域，其序列和生產(chǎn)和選擇方法明確地引入本文作為參考，以便為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供用于本發(fā)明的一般配體的實(shí)例。b)(i)來源于圖7a)中的3-23位基因座或任意其它基因座的種系VH片段的人VH。(ii)具有FW1氨基酸序列的人VH,所述FW1氨基酸序列與來自圖7a)中的3-23位基因座或任意其它基因座的種系VH片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(iii)具有FW2氨基酸序列的人VH，所述FW2氨基酸序列與來自圖7a)中的3-23位基因座或任意其它基因座的種系VH片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(iv)具有FW3氨基酸序列的人VH,所述FW3氨基酸序列與來自圖7a)中的3-23位基因座或任意其它基因座的種系VH片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(v)具有FW4氨基酸序列的人VH,所述FW4氨基酸序列與來自圖7a)中的3-23位基因座或任意其它基因座的種系VH片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(vi)具有FW1，2,3和4氨基酸序列的人VH,所述FWl,2,3和4氨基酸序列與來自圖7a)中的3-23位基因座或任意其它基因座的種系VH片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或其中FW1,2，3和4氨基酸序列共同具有達(dá)IO種來自所述相應(yīng)FWs的氨基酸差異。(vii)來源于圖7b)中的DPK9基因座或任意基因組的的人Vk。(viii)具有FW1氨基酸序列的人Vk,所述FW1氨基酸序列與來自圖7b)中的DPK9基因座或任意基因座的種系Vk片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(ix)具有FW2氨基酸序列的人Vk,所述FW2氨基酸序列與來自圖7b)中的DPK9基因座或任意基因座的種系Vk片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(x)具有FW3氨基酸序列的人Vk,所述FW3氨基酸序列與來自圖7b)中的DPK9基因座或任意基因座的種系Vk片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(xi)具有FW4氨基酸序列的人Vk,所述FW1氨基酸序列與來自圖7b)中的DPK9基因座或任意基因座的種系Vk片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(xii)具有FWl,2,3和4氨基酸序列的人Vk,所述FW1，2,3和4氨基酸序列與來自圖7b)中的DPK9基因座或任意基因座的種系Vk片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或其中FW1,2,3和4氨基酸序列共同具有達(dá)IO種來自所述相應(yīng)FWs的氨基酸差異。(xiii)來源于圖7c)中的任意種系V人片段的人V人。(xiv)具有FW1氨基酸序列的人所述FW1氨基酸序列與來自圖7c)中的任意種系VX的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(xv)具有FW2氨基酸序列的人V入，所述FW2氨基酸序列與來自圖7c)中的任意種系VX的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(xvi)具有FW3氨基酸序列的人所述FW3氨基酸序列與來自圖7c)中的任意種系VX的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(xvii)具有FW4氨基酸序列的人VX,所述FW4氨基酸序列與來自圖7c)中的任意種系V入的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(xviii)具有FWl,2,3和4氨基酸序列的人所述FW1氨基酸序列與來自圖7c)中的任意種系VX的相應(yīng)FWs的氨基酸序列相同或其中FW1，2，3和4氨基酸序列共同具有達(dá)10種來自所述相應(yīng)FWs的氨基酸差異。(xix)來源于圖7d)或披露在Nguyen等，EMBOJ,2000,Vol19,No.5,pp921-930的圖2(924頁)(將特別披露VHH種系序列的該文獻(xiàn)引入作為參考)中的任意種系片段的CamelidVHH或Nanobody;(xx)具有FW1氨基酸序列的CamelidVHH或Nanobody,所迷FW1氨基酸序列與披露在來自Nguyen等，EMBOJ,2000,Vol19,No.5,pp921-930的圖2(924頁)中的任意種系VHH片l殳的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(xxi)具有FW2氨基酸序列的CamelidVHH或Nanobody,所m述FW2氨基酸序列與披露在來自Nguyen等，EMBOJ,2000,Vol19,No.5,pp921-930的圖2(924頁)中的任意種系VHH片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(xxii)具有FW3氨基酸序列的CamelidVHH或Nanobody,所述FW3氨基酸序列與披露在來自Nguyen等，EMBOJ,2000,Vol19,No.5,pp921-930的圖2(924頁)中的任意種系VHH片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(xxiii)具有FW4氨基酸序列的CamelidVHH或Nanobody,所述FW4氨基酸序列與披露在來自Nguyen等，EMBOJ,2000,Vol19,No.5,pp921-930的圖2(924頁)中的任意種系VHH片l殳的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或具有達(dá)5種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。(xxiv)具有FWl,2,3和4氨基酸序列的CamelidVHH或Nanobody,所述FWl,2,3和4氨基酸序列與披露在來自Nguyen等，EMBOJ,2000，Vol19,No.5,pp921-930的圖2(924頁)中的任意種系VHH片段的相應(yīng)FW的氨基酸序列相同或其中FWl，2,3和4氨基酸序列共同具有達(dá)10種來自所述相應(yīng)FW的氨基酸差異。c)(D來自下列抗體產(chǎn)品中的任意種的VH或VL:靶標(biāo)a口廣口口Ab類疾患EpCAMPanorex鼠結(jié)腸癌CD20Rituxin嵌合IgGl非霍奇金淋巴瘤(NHL)CD20澤娃靈鼠90Y人源化IgG4NHLCD33麥羅塔毒素藥物綴AML(急性髓性白血病)CD52Campath-IH人源化IgGlB-C1XHer-2/neu赫賽汀人源化IgGl乳腺癌GPIIb/IIIa阿昔單抗嵌合Fab絞痛RSVSynagis人源化IgGl呼吸道合胞病毒(RSV)IgEXolair人源化IgGl哮喘，過敏性鼻炎TNF國a類克嵌合IgGl類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA),CD25CD3CD25TNF-aCD20CDllaa4B3EGFRVEGF舒萊OKT3,Orthoclonc賽尼哌HumiraBexxarRaptivaAntcgrsn愛必妥阿伐他汀嵌合IgGl鼠IgG2a人源化IgGl人IgGl克羅恩病，銀屑病，強(qiáng)直性脊推炎，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，潰瘍性結(jié)腸炎移植物排斥移植物排斥腎移植RA，克羅恩病，銀屑病，強(qiáng)直性脊柱炎，牛皮癬性關(guān)節(jié)炎，潰瘍性結(jié)腸炎NHL銀屑病多發(fā)性硬化結(jié)腸直腸癌結(jié)腸直腸癌，腎癌(ii)4皮露在US6090382,US20030235585A1,US20040166111A1,EP1500329A2，US20040131613A1,US20030144484A1,US5698195,EP1159003A1,US20020119152A1,EP0871641A4,EP0710121B1,US5702705,EP0487610B1中的抗-TNF抗體或抗體片段的可變域(VH或VL),特別將其中披露的內(nèi)容(特別是其中披露的抗體和片段的生成，序列和應(yīng)用)引入作為參考，以便為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供用于本發(fā)明的這類信息。(iii)以通過表面等離振子共振測定的lxi(T8M或lxlCT8M以下的Kd從靶配體中解離的抗體重或輕鏈可變域(例如VH,VL或VHH)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶配體為附錄1中所述靶配體。為了指導(dǎo)表面等離振子共振，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照US6090382或WO04003019A2。(iv)以通過表面等離振子共振測定的lxl(T3s"或bio-3s"以下的K。ff速度常數(shù)從靶配體中解離的抗體重或輕鏈可變域(例如VH,VL或VHH)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，耙配體為附錄1中所述靶配體。為了指導(dǎo)表面等離振子共振，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照US6090382或WO04003019A2。(v)以通過表面等離振子共振測定的lxl(T8M或lxlO-8M以下的Kd和lxl(T3s"或lxl(T3s"以下的K。ff速度常數(shù)從耙配體中解離的抗體重或輕鏈可變域(例如VH,VL或VHH)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶配體為附錄1中所述耙配體。為了指導(dǎo)表面等離振子共振，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照US6090382或WO04003019A2。(vi)以均通過表面等離振子共振測定的lxl(T8M或lxl(T8M以下的Kd和1x10-3s"或1x1(T3s"以下的K。ff速度常數(shù)從耙配體中解離的抗體重或輕鏈可變域(例如VH，VL或VHH)，并且它們?cè)跇?biāo)準(zhǔn)測定中以lxl(T7M或lxl(T7M以下的IC5o中和耙配體細(xì)胞毒性。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶配體為附錄1中所述靶配體。為了指導(dǎo)表面等離振子共振，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照US6090382或WO04003019A2。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶配體為TNFa且標(biāo)準(zhǔn)測定為如US6090382中所述L929測定。在上述實(shí)施方案中，優(yōu)選一般配體以lxlO"M或lxl(T9M以下，lxl(T9M或1x10-9M以下，lx10-11M或lxl(T11M以下，lxlO"M或lxl(T12M以下的BQ結(jié)合。優(yōu)選K。ff速度常數(shù)為lxl(T4s"或lxl(T4s"以下，lxl(T5s"或lxl。-5S"以下，lxl(T6S"或lxlO-6S"以下，lxlO-7S"或lxl(T7S"以下，lxlO-8S"或lxl(T8S"以下。優(yōu)選ICso為lxlO-SM或1x10-Sm以下，1x10^M或1x10力M以下，5xl(T10M或5xl(T1。M以下，lxl(T10M或lxl(T10M以下，5xl(T"M或5xl(T11M以下。d)具有與附錄2(a)中的序列至少90%同源性的序列的抗體可變域。具有與附錄2(c)中的序列至少90%同源性的序列的抗體可變域。權(quán)利要求1.從抗體多肽類的所有組成成分中選擇功能性可變域群體的方法，所述功能性可變域結(jié)合靶配體和一般配體，該一般配體能夠結(jié)合所有組成成分中的功能性成員，但與靶配體的特異性無關(guān)，該方法包括下列步驟a)使所有組成成分與所述一般配體接觸并且選擇與之結(jié)合的功能性可變域；和b)使選擇的功能性可變域接觸靶配體并且選擇結(jié)合靶配體的可變域群體；其中(i)可變域?yàn)橹劓溈勺冇蚯乙话闩潴w為抗體輕鏈可變域；或(ii)可變域?yàn)檩p鏈可變域且一般配體為抗體重鏈可變域；且其中任選在(i)中，重鏈可變域?yàn)镃amelid可變域(VHH)或來源于Camelid重鏈抗體(H2抗體)；或任選在(i)和(ii)中，可變域各自為人可變域或來源于人。2.權(quán)利要求1的方法，其中首先使抗體多肽類的所有組成成分接觸靶配體，且然后接觸一般配體。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中一般配體結(jié)合可變域所有組成成分的亞組。4.權(quán)利要求3的方法，其中兩個(gè)或多個(gè)亞組選自多肽類的所有組成成分。5.權(quán)利要求4的方法，其中使用兩種或多種一般配體，任選兩種或多種輕鏈可變域(就任選的(i)而言)或兩種或多種重鏈可變域(就任選的(ii)而言)進(jìn)行選擇。6.權(quán)利要求4或5的方法，其中在選擇后合并兩個(gè)或多個(gè)亞組以便產(chǎn)生多肽類的其它所有組成成分。7.任意上述權(quán)利要求的方法，其中使多肽類的兩種或多種所有組成成分接觸一般配體且然后合并由此獲得的多肽類亞組。8.從多肽類的所有組成成分中選擇功能性T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域群體的方法，所述功能性T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域結(jié)合耙配體和一般配體，該一般配體能夠結(jié)合所有組成成分中的功能性成員，但與靶配體的特異性無關(guān)，該方法包括下列步驟a)使所有組成成分與所述一般配體接觸并且選擇與之結(jié)合的功能性T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域；和b)使選擇的功能性T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域接觸靶配體并且選擇結(jié)合耙配體的T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域群體；其中(i)T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域?yàn)閂a結(jié)構(gòu)域且一般配體為T-細(xì)胞受體V(3結(jié)構(gòu)域；或(ii)T-細(xì)胞結(jié)構(gòu)域?yàn)門-細(xì)胞受體Vp結(jié)構(gòu)域且一般配體為T-細(xì)胞受體Va結(jié)構(gòu)域；且任選在(i)中，T-細(xì)胞受體Va結(jié)構(gòu)域?yàn)閬碓从贑amelid的Camelid結(jié)構(gòu)域；或任選在(i)和(ii)中，T-細(xì)胞受體結(jié)構(gòu)域各自為人結(jié)構(gòu)域或來源于人。9.一種方法，其中按照權(quán)利要求1選擇抗體重鏈可變域群體，并且按照權(quán)利要求1選擇抗體輕鏈可變域群體，且然后合并由此獲得的群體。10.—種方法，其中按照權(quán)利要求8選擇T-細(xì)胞受體Va結(jié)構(gòu)域群體，并且按照權(quán)利要求8選擇T-細(xì)胞受體Vp結(jié)構(gòu)域群體，且然后合并由此獲得的群體。11.從抗體多肽類群體中選擇至少一種抗體重鏈可變域的方法，該方法包括a)使所述群體接觸抗體輕鏈可變域；和b)選擇至少一種結(jié)合輕鏈可變域的抗體重鏈可變域。12.權(quán)利要求11所述方法，所述方法包括在步驟a)前，使抗體多肽類接觸靶配體并且選擇結(jié)合靶配體的抗體多肽類的步驟，由此提供用于步驟a)的所述抗體多肽類的群體。13.權(quán)利要求11所述方法，所述方法包括在步驟b)后，使在步驟b)中選擇的抗體重鏈可變域接觸靶配體并且選擇結(jié)合靶配體的重鏈可變域的步驟。14.權(quán)利要求11-13中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟b)中選擇的重鏈結(jié)構(gòu)域各自來自下組來源于Camelid的重鏈可變域；VHH結(jié)構(gòu)域；Nanobody;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH。15.權(quán)利要求11-13中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟b)中選擇的重鏈結(jié)構(gòu)域各自為人源化Camelid或鼠重鏈可變域或人源化NanobodyTM。16.權(quán)利要求11-13中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟b)中選擇的重鏈結(jié)構(gòu)域各自為人重鏈可變域。17.權(quán)利要求11-16中任意一項(xiàng)所述方法，其中輕鏈可變域?yàn)槿溯p鏈可變域或來源于人或具有FW2序列的輕鏈可變域，所述FW2序列與種系基因序列DPK9編碼的FW2相同。18.權(quán)利要求11-16中任意一項(xiàng)所述方法，其中輕鏈可變域?yàn)镃amelid輕鏈可變域或來源于Camelid。19.權(quán)利要求11-18中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟a)中的群體由B-細(xì)胞群提供。20.權(quán)利要求19所述方法，其中B-細(xì)胞為外周血淋巴細(xì)胞。21.權(quán)利要求19或20所述方法，其中從使用靶抗原免疫接種的動(dòng)物中分離B-細(xì)月包。22.權(quán)利要求19或20所述方法，其中從未使用靶抗原免疫接種的動(dòng)物中分離B-細(xì)胞。23.權(quán)利要求11-16中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟a)中使用的群體由以合成方式重排的抗體基因編碼的抗體多肽類的所有組成成分提供。24.權(quán)利要求11-16中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟a)中使用的群體由包含展示所述抗體多肽類的噬菌體的噬菌體展示文庫提供。25.權(quán)利要求11-24中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟a)中使用的群體包含(i)各自包含至少一種不與輕鏈可變域配對(duì)的重鏈可變域的抗體多肽類；和(ii)各自包含與輕鏈可變域配對(duì)的重鏈可變域的抗體多肽類。26.權(quán)利要求11-25中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟a)中使用的群體包含camelid重鏈單一可變域(VHH)或NanobodiesTM。27.權(quán)利要求11-25中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟a)中使用的群體包含人重鏈單一可變域(VH)。28.從Camelid抗體多肽類群體中選擇至少一種Camelid抗體VHH結(jié)構(gòu)域的方法，所述Camelid抗體多肽類群體由分離自已經(jīng)免疫接種把抗原的Camelid的B-細(xì)胞提供，該方法包括a)使所述群體接觸抗體輕鏈可變域；和b)選擇至少一種結(jié)合輕鏈可變域的VHH結(jié)構(gòu)域。29.權(quán)利要求28所述方法，其中輕鏈可變域?yàn)槿溯p鏈可變域。30.權(quán)利要求28或29所述方法，其中在多個(gè)孔或塞孔內(nèi)提供B-細(xì)胞，其中各孔或塞孔包含平均一種B-細(xì)胞類型。31.—種方法，所述方法包括a)對(duì)抗體多肽類的起始群體使用靶抗原進(jìn)行SLAM(選擇的淋巴細(xì)胞抗體方法)以便選擇結(jié)合耙抗原的抗體多肽類群體；和b)使用選擇的群體作為用于權(quán)利要求11-30中任意一項(xiàng)所述方法的抗體多肽類群體。32.權(quán)利要求11-31中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟b)中，使選擇的抗體重鏈可變域中的至少一種與蛋白質(zhì)部分融合或與之綴合。33.權(quán)利要求32所述方法，其中蛋白質(zhì)部分選自噬菌體外被蛋白、一種或多種抗體結(jié)構(gòu)域、抗體Fc結(jié)構(gòu)域、酶、毒素、標(biāo)記和效應(yīng)基團(tuán)。34.權(quán)利要求11-31中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟b)中，選擇的抗體重鏈可變域中的至少一種為選自IgG、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab')2、scFv、Fv和二石危鍵鍵合的Fv的抗體部分或抗體片段。35.分離的抗體多肽，其包含抗體重鏈可變域或由其組成，其中該多肽可通過權(quán)利要求11所述方法獲得，其中該方法中的輕鏈可變域?yàn)槿溯p鏈可變域且重鏈可變域來自非-人的哺乳動(dòng)物。36.權(quán)利要求35所述抗體多肽，其中重鏈可變域來自來源于Camelid的重鏈可變域；VHH結(jié)構(gòu)域；NanobodyTM;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH。37.權(quán)利要求36所述抗體多肽，其中重鏈可變域作為CamelidIgG或來源于Camelid的IgG的組成部分提供。38.權(quán)利要求36所述抗體多肽，其中重鏈可變域作為人IgG或來源于人的IgG的組成部分提供，并且其中重鏈可變域在IgG中與不同于權(quán)利要求11中所述輕鏈可變域的輕鏈可變域配對(duì)。39.權(quán)利要求35-38中任意一項(xiàng)的抗體多肽作為藥物的應(yīng)用。40.權(quán)利要求35-38中任意一項(xiàng)的抗體多肽在人疾病或疾患的治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用。41.權(quán)利要求11-34中任意一項(xiàng)所述方法或權(quán)利要求35-38中任意一項(xiàng)所述抗體或權(quán)利要求39或40中所述應(yīng)用，其中重鏈可變域結(jié)合選自TNFa、血清清蛋白、馮維勒布蘭德因子(vWF)、IgE、干擾素Y、EGFR、IgE、MMP12、PDK1和淀粉樣蛋白(3(A-(3)的耙配體或附錄1中所列的耙標(biāo)中的任意一種。42.從抗體多肽類群體中選擇至少一種抗體輕鏈可變域的方法，該方法包括a)使所述群體接觸抗體重鏈可變域；和b)選擇至少一種結(jié)合重鏈可變域的抗體輕鏈可變域。43.權(quán)利要求42所述方法，所述方法包含在步驟a)前，使抗體多肽類接觸靶配體并且選擇結(jié)合靶配體的抗體多肽類的步驟，由此提供用于步驟a)的抗體多肽類的所述群體。44.權(quán)利要求42所述方法，所述方法包含在步驟b)后，使步驟b)中選擇的抗體輕鏈可變域接觸靶配體并且選擇結(jié)合靶配體的輕鏈可變域的步驟。45.權(quán)利要求42-44中任意一項(xiàng)所述方法，其中步驟b)中選擇的輕鏈結(jié)構(gòu)域各自來源于Camelid。46.權(quán)利要求42-44中任意一項(xiàng)所述方法，其中步驟b)中選擇的輕鏈結(jié)構(gòu)域各自為人輕鏈可變域。47.權(quán)利要求42-44中任意一項(xiàng)所述方法，其中重鏈可變域?yàn)槿酥劓溈勺冇颍粊碓从谌?；具有FW2序列的重鏈可變域，所述FW2序列與種系基因序列DP47編碼的FW2相同；或具有與種系基因序列DP47編碼的44、45和47位相同的44、45和47位的重鏈可變i或。48.權(quán)利要求42-44中任意一項(xiàng)所述方法，其中重鏈可變域?yàn)镃amelid重鏈可變域(VHH或VH)或來源于Camelid。49.權(quán)利要求42-48中任意一項(xiàng)所述方法，其中步驟a)中的群體由B-細(xì)胞群提供。50.權(quán)利要求49所述方法，其中B-細(xì)胞為外周血淋巴細(xì)胞。51.權(quán)利要求49或50所述方法，其中B-細(xì)胞分離自已經(jīng)免疫接種耙抗原的動(dòng)物。52.權(quán)利要求49或50所述方法，其中B-細(xì)胞分離自未免疫接種革巴抗原的動(dòng)物。53.權(quán)利要求42-48中任意一項(xiàng)所述方法，其中步驟a)中使用的群體由以合成方式重排的抗體基因編碼的抗體多肽類的所有組成成分提供。54.權(quán)利要求42-48中任意一項(xiàng)所述方法，其中步驟a)中的群體由包含展示所述抗體多肽類的噬菌體的噬菌體展示文庫提供。55.權(quán)利要求42-54中任意一項(xiàng)所述方法，其中步驟a)中使用的群體包含(i)各自包含至少一種不與重鏈可變域配對(duì)的輕鏈可變域的抗體多肽類；和(ii)各自包含與重鏈可變域配對(duì)的輕鏈可變域的抗體多肽類。56.權(quán)利要求42-54中任意一項(xiàng)所述方法，其中步驟a)中使用的群體包含人輕鏈單一可變域(VL)。57.—種方法，所述方法包括a)對(duì)抗體多肽類的起始群體使用耙抗原進(jìn)行SLAM(選擇的淋巴細(xì)胞抗體方法)以便選擇結(jié)合耙抗原的抗體多肽類群體；和b)使用選擇的群體作為用于權(quán)利要求42-56中任意一項(xiàng)所述方法的抗體多肽類群體。58.權(quán)利要求42-57中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟b)中，選擇的抗體輕鏈可變域中的至少一種與蛋白質(zhì)部分融合或與之綴合。59.權(quán)利要求58所述方法，其中所述蛋白質(zhì)部分選自噬菌體外被蛋白、一種或多種抗體結(jié)構(gòu)域、抗體Fc結(jié)構(gòu)域、酶、毒素、標(biāo)記和效應(yīng)基團(tuán)。60.權(quán)利要求42-59中任意一項(xiàng)所述方法，其中在步驟b)中，選擇的抗體重鏈可變域中的至少一種為選自IgG、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv和二硫鍵鍵合的Fv的抗體或抗體片段。61.分離的抗體多肽，其包含抗體輕鏈可變域或由其組成，其中該多肽可通過權(quán)利要求42所述方法獲得，其中該方法中的重鏈可變域?yàn)槿酥劓溈勺冇蚯逸p鏈可變域來自非-人的哺乳動(dòng)物。62.權(quán)利要求61所述抗體多肽，其中輕鏈可變域來自Camelid。63.權(quán)利要求61所述抗體多肽，其中輕鏈可變域作為CamelidlgG或來源于Camelid的IgG的組成部分提供。64.權(quán)利要求61所述抗體多肽，其中輕鏈可變域作為人IgG或來源于人的IgG的組成部分提供，并且其中輕鏈可變域在IgG中與不同于權(quán)利要求42中所述重鏈可變域的重鏈可變域配對(duì)。65.權(quán)利要求35-38和61-64中任意一項(xiàng)的抗體多肽衍生物，其中該衍生物具有與權(quán)利要求35-38和61-64中任意一項(xiàng)所述多肽的可變域CDR3相比的CDR3突變。66.通過權(quán)利要求35-38和61-64中任意一項(xiàng)的抗體多肽的親和力成熟產(chǎn)生的抗體多肽衍生物。67.多肽，其包含與權(quán)利要求35-38和61-64中任意一項(xiàng)的抗體多肽或權(quán)利要求65或67的衍生物連接的半衰期延長部分，其中該部分選自PEG;抗體恒定域；抗體Fc區(qū)；清蛋白或其片段；結(jié)合清蛋白的肽或抗體片段；清蛋白片段；新生兒Fc受體；轉(zhuǎn)移；或轉(zhuǎn)移受體。68.權(quán)利要求61-67中任意一項(xiàng)的抗體多肽作為藥物的應(yīng)用。69.權(quán)利要求61-67中任意一項(xiàng)的抗體多肽在人疾病或疾患的治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用。70.權(quán)利要求42-66中任意一項(xiàng)所述方法或權(quán)利要求61-67中任意一項(xiàng)所述抗體或權(quán)利要求68或69所述應(yīng)用，其中輕鏈可變域或抗體多肽的可變域結(jié)合選自TNFot、血清清蛋白、馮維勒布蘭德因子(vWF)、IgE、干擾素丫、EGFR、IgE、MMP12、PDK1和淀粉樣蛋白(3(A-(3)的耙配體或附錄l中所列的耙標(biāo)中的任意一種。71.權(quán)利要求l、11或42所述方法，所述方法包括產(chǎn)生選擇的可變域的突變體或衍生物的步驟。72.權(quán)利要求19-22和49-52中任意一項(xiàng)所述方法，其中將B-細(xì)胞群提供在多個(gè)孔或塞孔中，其中各孔或塞孔包含單一B-細(xì)胞類型。73.權(quán)利要求19-22和49-52中任意一項(xiàng)所述方法，其中將B-細(xì)胞群提供在多個(gè)孔或塞孔中，其中各孔或塞孔包含平均一種B-細(xì)胞類型。74.從包含單一可變域和IgG的抗體多肽類群體中的抗體單一可變域中分離IgG的方法，該方法包括a)使所述群體接觸一般配體；和b)選擇結(jié)合一般配體的亞群，由此從單一可變域中分離IgG;其中一般配體對(duì)抗體CH1結(jié)構(gòu)域、輕鏈恒定域(CL)、IgG絞鏈或抗體輕鏈可變域具有結(jié)合特異性。75.權(quán)利要求74所述方法，其中一般配體選自蛋白質(zhì)L、蛋白質(zhì)L結(jié)構(gòu)域或結(jié)合輕鏈可變域的蛋白質(zhì)L的衍生物；蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)G的結(jié)構(gòu)域或結(jié)合CH1的蛋白質(zhì)G的衍生物；抗體和抗體片段、affibody、LDL受體結(jié)構(gòu)域和EGF結(jié)構(gòu)域。76.權(quán)利要求75所述方法，其中一般配體選自dAb、NanobodyTM、scFv、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv或二石危4建4建合的Fv。77.權(quán)利要求74-76中任意一項(xiàng)所述方法，可變域?yàn)槿藛我豢勺冇?，且IgG為人IgG。78.權(quán)利要求74-77中任意一項(xiàng)所述方法，其中一般配體以lmM或lmM以下的親和力結(jié)合抗體CH1結(jié)構(gòu)域、輕鏈恒定域(CL)、IgG絞鏈或抗體輕鏈可變域。79.權(quán)利要求74-77中任意一項(xiàng)所述方法，其中一般配體以1微摩爾或1微摩爾以下的親和力結(jié)合抗體CH1結(jié)構(gòu)域、輕鏈恒定域(CL)、IgG絞鏈或抗體輕鏈可變域。80.權(quán)利要求74-77中任意一項(xiàng)所述方法，其中一般配體以100nM或低于100nM的親和力結(jié)合抗體CH1結(jié)構(gòu)域、輕鏈恒定域(CL)、IgG絞鏈或抗體輕鏈可變域。81.從包含CamelidVHH結(jié)構(gòu)域和IgG的抗體多肽類群體中的IgG中分離CamelidVHH單一可變域的方法，該方法包括a)使所述群體接觸一般配體；和b)選擇結(jié)合一般配體的亞群，由此從IgG中分離單一可變域；其中一般配體對(duì)(i)VHH而非對(duì)VH;或(ii)重鏈抗體(H2)絞鏈具有結(jié)合特異性。82.權(quán)利要求81所述方法，其中一般配體選自抗體輕鏈可變域、抗體和抗體片段。83.權(quán)利要求82所述方法，其中一般配體選自dAb、Nanobody1M、scFv、Fab、Fab，、F(ab)2、F(ab，)2、scFv、Fv或二碌u鍵4建合的Fv。84.權(quán)利要求81-83中任意一項(xiàng)所述方法，其中一^:配體以lmM或lmM以下的親和力結(jié)合VHH或重鏈抗體(H2)絞鏈。85.權(quán)利要求81-33中任意一項(xiàng)所述方法，其中一般配體以1微摩爾或1微摩爾以下的親和力結(jié)合VHH或重鏈抗體(H2)絞鏈。86.權(quán)利要求81-83中任意一項(xiàng)所述方法，其中一般配體以100nM或100nM以下的親和力結(jié)合VHH或重鏈抗體(H2)絞鏈。87.權(quán)利要求74-86中任意一項(xiàng)所述方法，其中抗體多肽群體由B細(xì)胞提供。88.權(quán)利要求74-87中任意一項(xiàng)所述方法，其中可變域?yàn)镃amelidVHH,且IgG為CamelidIgG。89.權(quán)利要求74-88中任意一項(xiàng)所述方法，其中可變域由Camelid重鏈(H2)抗體提供。90.權(quán)利要求74-89中任意一項(xiàng)所述方法，其中標(biāo)記一般配體或纟會(huì)^力口才示i己。91.權(quán)利要求1-7和11-90中任意一項(xiàng)所述方法、抗體多肽、衍生物或應(yīng)用，其中一般配體為選自附錄2a)、c)、d)或e)的抗體可變域。92.從抗體多肽類的所有組成成分中選擇結(jié)合耙配體和一般配體的單一可變域的方法，所述方法包括下列步驟a)使所有組成成分接觸靶配體并且選擇與之結(jié)合的單一可變域；和b)使選擇的可變域接觸一般配體并且選擇結(jié)合一般配體的可變域；其中一般配體為選自附錄2c)或e)的抗體可變域；且其中，(O當(dāng)選擇的可變域?yàn)橹劓溈勺冇驎r(shí)，一般配體為輕鏈可變域；或(ii)當(dāng)選擇的可變域?yàn)檩p鏈可變域時(shí)，一般配體為重鏈可變域。93.權(quán)利要求92所述方法，其中抗體多肽類的所有組成成分為重鏈可變域的所有組成成分，一般配體為輕鏈可變域。94.權(quán)利要求92所述方法，其中抗體多肽類的所有組成成分為輕鏈可變域的所有組成成分，一般配體為重鏈可變域。95.權(quán)利要求92-94中任意一項(xiàng)所述方法，所述方法包括產(chǎn)生選擇的可變域的突變體或衍生物的步驟。96.權(quán)利要求92-94中任意一項(xiàng)所述方法，其中一般配體結(jié)合與選擇的可變域相同的耙配體種類。97.權(quán)利要求92-94中任意一項(xiàng)所述方法，其中一般配體結(jié)合與選擇的可變域不同的靶配體種類。98.權(quán)利要求92-97中任意一項(xiàng)所述方法，所述方法包括將選擇的可變域與和一般配體或其衍生物相同的抗體可變域合并，以便產(chǎn)生具有耙配體結(jié)合特異性的產(chǎn)物。99.生產(chǎn)結(jié)合耙配體的附錄2c)(i)-(iv)中任意項(xiàng)的抗體或抗體片段的衍生物的方法，該方法包括a)使用所述抗體或片段的重鏈可變域或與權(quán)利要求94所述方法中的一般配體相同的可變域，并且其中步驟a)中使用的靶配體為所述抗體或片段結(jié)合的耙配體，由此選擇結(jié)合耙配體和重鏈可變域的輕鏈單一可變域；和b)用選擇的輕鏈可變域；相同的輕鏈可變域或其衍生物取代所述抗體或片段的輕鏈可變域中的至少一種。100.生產(chǎn)附錄2c)(i)-(iv)中任意項(xiàng)中的抗體或抗體片段的多特異性4汙生物的方法，該方法包括a)使用所述抗體或片段的重鏈可變域或與權(quán)利要求94所述方法中的一般配體相同的可變域，并且其中步驟a)中使用的耙配體是不同于所述抗體或片段結(jié)合的耙配體的耙配體，由此選擇結(jié)合不同靶配體和重鏈的可變域的輕鏈單一可變域；和b)用選擇的輕鏈可變域；相同的輕鏈可變域或其衍生物取代所述抗體或片段輕鏈可變域中的至少一種，由此產(chǎn)生的多特異性產(chǎn)物。101.生產(chǎn)附錄2c)(i)-(iv)中任意項(xiàng)中的抗體或抗體片段的衍生物的方法，該方法包4舌a)使用所述抗體或片段的輕鏈可變域或與權(quán)利要求94所述方法中的一般配體相同的可變域，并且其中步驟a)中使用的靶配體為所述抗體或片段結(jié)合的耙配體，由此選擇結(jié)合耙配體和輕鏈可變域的重鏈單一可變域；和b)用選擇的重鏈可變域；相同的重鏈可變域或其衍生物取代所述抗體或片段的重鏈可變域中的至少一種。102.生產(chǎn)附錄2c)(i)-(iv)中任意項(xiàng)中的抗體或抗體片段的多特異性衍生物的方法，該方法包括a)使用所述抗體或片段的輕鏈可變域或與權(quán)利要求94所述方法中的一般配體相同的可變域，并且其中步驟a)中使用的靶配體是不同于所述抗體或片段結(jié)合的靶配體的靶配體，由此選擇結(jié)合不同靶配體和輕鏈可變域的重鏈單一可變域；和b)用選擇的重鏈可變域；相同的重鏈可變域或其衍生物取代所述抗體或片段的重鏈可變域中的至少一種，由此產(chǎn)生多特異性產(chǎn)物。103.權(quán)利要求100至102所述方法，其中重鏈可變域選自來源于Camelid的重鏈可變域；VHH結(jié)構(gòu)域；Nanobody;在44位上具有甘氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸的VHH;在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在45位上具有亮氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VHH;在44位上具有甘氨酸，在45位上具有亮氨酸并且在47位上具有色氨酸的VH;在103位上具有色氨酸或精氨酸的VHH;人源化Camelid或鼠重鏈可變域；人源化NanobodyTM;人重鏈可變域；來源于人的重鏈可變域；具有FW2序列的重鏈可變域，所述FW2序列與種系基因序列DP47編碼的FW2相同；或具有與種系基因序列DP47編碼的44、45和47位相同的44、45和47位的重鏈可變域。104.權(quán)利要求99或101所述方法，其中輕鏈可變域選自人輕鏈可變域；來源于人的輕鏈可變域；具有FW2序列的輕鏈可變域，所述FW2序列與種系基因序列DPK9編碼的FW2相同；Camelid輕鏈可變域；來源于Camelid的輕鏈可變域；和人源化Camelid或鼠輕鏈可變域。105.權(quán)利要求99-104中任意一項(xiàng)所述方法，其中a)選擇的可變域?yàn)橹劓溈勺冇?，且抗體或片段的重鏈可變域各自被選擇的重鏈可變域；相同的重鏈可變域或其衍生物取代；或b)選擇的可變域?yàn)檩p鏈可變域，且抗體或片段的輕鏈可變域各自被選擇的輕鏈可變域；相同的輕鏈可變域或其衍生物取代。106.可通過權(quán)利要求99-105中任意一項(xiàng)所述方法獲得的書t生物。107.抗體或抗體片段衍生物，其選自Panorex;Rituxin;Zevalin;Mylotarg;Campath;Herceptin;ReoPro;Synagis;Xolair;Remicade;Simulect;OKT3TM;Orthoclone;Zenapax;HumiraTM;BexxarTM;Raptiva;Antegren;Erbitux;和AvastinTM,其中該衍生物可通過權(quán)利要求99-105中任意一項(xiàng)所述方法獲得。108.權(quán)利要求100所述方法，其中一關(guān)殳配體為來自抗體或抗體片段的抗體可變域，所述抗體或抗體片段選自Panorex、RituxinTM、ZevalinTM、MylotargTM、Campath、HerceptinTM、ReoProTM、SynagisTM、Xolair、Remicade、Simulect、OKT3TM、Orthoclone、Zenapax、HumiraTM、BexxarTM、RaptivaTM、AntegrenTM、ErbituxTM和AvastinTM109.具有靶配體結(jié)合特異性的產(chǎn)物，其中該產(chǎn)物可通過權(quán)利要求108所述方法獲得。110.權(quán)利要求106-107和109中任意一項(xiàng)所述衍生物或產(chǎn)物作為藥物的應(yīng)用。111.權(quán)利要求106-107和109中任意一項(xiàng)所述衍生物或產(chǎn)物在人疾病或疾患的治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用。112.權(quán)利要求106或109中任意一項(xiàng)所述衍生物或產(chǎn)物在人疾病或疾患的治療和/或預(yù)防中的應(yīng)用，其中所述疾患為附錄2c)(i)中對(duì)抗體或抗體片段所列的疾患。全文摘要本發(fā)明提供了在抗體多肽文庫篩選征的進(jìn)一步動(dòng)態(tài)。本發(fā)明還提供了可通過本發(fā)明方法獲得的新分離的抗體多肽類。文檔編號(hào)C07K16/00GK101312988SQ200680037900公開日2008年11月26日申請(qǐng)日期2006年10月11日優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日發(fā)明者J·克拉布,L·耶斯佩斯申請(qǐng)人:杜門蒂斯有限公司