專利名稱：：基于慢病毒載體的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及慢病毒載體、使用慢病毒載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移、免疫和疫苗接種的方法、用于生產(chǎn)重組多肽、針對(duì)這些多肽的抗體的方法以及這些分子在診斷方法、試劑盒、免疫原性組合物、疫苗和抗病毒療法中的用途。
背景技術(shù)：
：在過去幾年中，慢病毒載體在基因治療領(lǐng)域中引起了相當(dāng)濃厚的興趣。這一無可匹敵的聲譽(yù)是因?yàn)椋鼈兡軌蚋咝Р⒎€(wěn)定地將治療基因或報(bào)告基因轉(zhuǎn)移至對(duì)治療介入而言至關(guān)重要的多種細(xì)胞和組織，如造血干細(xì)胞、腦、肝和視網(wǎng)膜(參閱[l-4等)。無論靶細(xì)胞的增殖狀態(tài)如何，慢病毒載體均可實(shí)現(xiàn)高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，從而避開了源自腫瘤病毒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要限制之一，這些病毒載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)僅限于正在分裂的細(xì)胞中。這一優(yōu)點(diǎn)已在多種人類疾病動(dòng)物模型中大量的成功臨床前試驗(yàn)中得到反映(參閱[5-ll等)，并且亳無疑問將轉(zhuǎn)化成其在不斷增多的臨床試驗(yàn)中的應(yīng)用。最近，已經(jīng)證明慢病毒載體是一種有前途的疫苗接種載體。迄今為止，多數(shù)研究著眼于在抗腫瘤免疫治療領(lǐng)域中誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答[12-18，一些研究還著眼于誘導(dǎo)針對(duì)病毒的保護(hù)性細(xì)胞免疫[19-211。它們?cè)陔x體[12、14、15、19和體內(nèi)[13、18、22情況下高效轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂的樹突細(xì)胞(dendriticcell,DC)的能力解釋了其引發(fā)強(qiáng)CTL應(yīng)答的能力。事實(shí)上，使用慢病毒載體刺激抗腫瘤免疫的報(bào)道顯示了非常有前途的結(jié)果。通過表達(dá)肺瘤抗原的慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)的人DC在體外刺激特異性CTL應(yīng)答[12、14、15、18。在小鼠中，注射慢病毒載體顆粒或經(jīng)慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC可誘導(dǎo)強(qiáng)烈且特異性的抗腫瘤細(xì)胞免疫應(yīng)答[13、15、18，并針對(duì)肺瘤攻擊提供保護(hù)[12、17。無論是離體[20還是在體內(nèi)[16、21進(jìn)行測(cè)定，這些應(yīng)答均強(qiáng)于通過用肽加佐劑[13或者甚至用肽脈沖處理(peptide-pulsed)抗原呈遞細(xì)胞(antigenpresentingcell,APC)進(jìn)行經(jīng)典免疫時(shí)所獲得的應(yīng)答。與APC的肽脈沖處理所產(chǎn)生的瞬時(shí)抗原呈遞相比較[16，20，所觀察到的優(yōu)點(diǎn)可能是由于已轉(zhuǎn)導(dǎo)載體的APC持續(xù)呈遞抗原。迄今為止，對(duì)慢病毒載體刺激基于抗體的保護(hù)性免疫的能力尚知之甚少。盡管如此，其高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也可賦予其誘導(dǎo)體液免疫的良好能力。此外，它們?cè)谧⑸涞襟w內(nèi)時(shí)似乎對(duì)DC有偏好趨向性[13、18、22，這可能進(jìn)一步增強(qiáng)其引發(fā)基于抗體的保護(hù)性免疫的能力，因?yàn)镈C是CD4T細(xì)胞的強(qiáng)刺激劑，而CD4T細(xì)胞是正確產(chǎn)生基于B細(xì)胞的免疫應(yīng)答所必需的。此外，在免疫接種的情況下，由轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)抗原可以排除對(duì)進(jìn)行數(shù)次接種的需要。事實(shí)上，公認(rèn)體液免疫應(yīng)答是針對(duì)西尼羅病毒(WestNileVirus,WNV)的保護(hù)性免疫的必要組分[23-25。作為重組抗原注射[27或通過棵DNA[28或復(fù)制性麻瘆載體[29進(jìn)行i達(dá)時(shí)，來自WNV的包膜E-糖蛋白(其具有中和表位[26)引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。針對(duì)WNV毒林IS-98-ST1包膜E糖蛋白(sE)可溶形式的中和抗體的被動(dòng)轉(zhuǎn)移為小鼠提供了針對(duì)WNV腦炎的保護(hù)，這一事實(shí)進(jìn)一步證明了體液免疫足以提供針對(duì)WNV攻擊的保護(hù)[29。WNV是黃病毒科日本腦炎血清復(fù)合體(serocomplex)中的蚊媒黃病毒。它在鳥類與蚊子的天然循環(huán)中傳播，但可感染許多哺乳動(dòng)物物種[30。由于毒力更強(qiáng)的毒林1998年在以色列出現(xiàn)，其后1999年在紐約出現(xiàn)(Isr98/NY99)，因此動(dòng)物源性WNV最近在北美、中東和歐洲成為了重要的健康問題。WNV感染的重度臨床表現(xiàn)主要涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并且在人和大量動(dòng)物物種(特別是馬和鳥類(綜述參閱[30))中可導(dǎo)致顯著的死亡率。因此，迫切需要開發(fā)出能提供迅速、強(qiáng)力且長(zhǎng)期免疫的高效疫苗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明幫助實(shí)現(xiàn)本領(lǐng)域中的這些需要。本發(fā)明涉及慢病毒載體引發(fā)體液免疫應(yīng)答的潛力。發(fā)明人研究了用基于慢病毒的疫苗進(jìn)行免疫接種是否能提供針對(duì)西尼羅病毒(WNV)感染的保護(hù)。意想不到的發(fā)現(xiàn)是，慢病毒載體能引發(fā)基于抗體的保護(hù)性免疫。在本發(fā)明中，對(duì)基于慢病毒載體的疫苗引發(fā)針對(duì)西尼羅病毒(WNV，在人、鳥類和馬中引起腦炎的蚊媒黃病毒)的體液免疫的潛力進(jìn)行了評(píng)估。值得注意的是，在WNV腦炎的小鼠模型中，使用小劑量TRIP/sEWNV的單次免疫接種誘導(dǎo)了特異性體液應(yīng)答以及針對(duì)WNV感染的保護(hù)，其中所述TRIP/sEwNv是表達(dá)來自WNV高毒力毒林IS-98-ST1的包膜E-糖蛋白(sEWNV)分泌性可溶形式的慢病毒載體。這種單次免疫接種在引發(fā)后僅一周即引發(fā)長(zhǎng)期保護(hù)性和殺滅性(sterilizing)體液免疫。這些結(jié)果證明了慢病毒載體作為針對(duì)病原體的高效非復(fù)制疫苗的適用性，針對(duì)所述病原體的保護(hù)性免疫積極地需要中和性體液應(yīng)答。TRIP/sEWNV慢病毒載體看來可作為一種有前途的工具用于針對(duì)動(dòng)物源性WNV進(jìn)行獸醫(yī)免疫接種。因此，本發(fā)明提供在體內(nèi)生產(chǎn)抗體的方法，包括對(duì)動(dòng)物施用慢病毒栽體，其中所述慢病毒包含編碼抗原的異源核酸，并且其中所述抗原在該動(dòng)物中引發(fā)體液應(yīng)答。本發(fā)明包括對(duì)有此需要的動(dòng)物誘導(dǎo)保護(hù)性免疫(包括例如長(zhǎng)期保護(hù)性免疫和殺滅性免疫)的慢病毒栽體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述有此需要的動(dòng)物選自人、馬、鳥類、家禽、豬、家畜(包括牛、綿羊、山羊)、嚙齒動(dòng)物(包括倉(cāng)鼠、大鼠和小鼠)、寵物和爬行動(dòng)物。本發(fā)明還提供在體內(nèi)產(chǎn)生抗體的方法，包括對(duì)動(dòng)物施用慢病毒載體，其中所述慢病毒包含編碼抗原的異源核酸，并且其中所述抗原在該動(dòng)物中引發(fā)體液應(yīng)答，其中該慢病毒載體誘導(dǎo)針對(duì)感染微生物的保護(hù)性免疫。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述感染微生物為西尼羅病毒。在另一實(shí)施方案中，所述慢病毒載體包含編碼肽或多肽的核酸，所述肽或多肽至少帶有B表位。該至少帶有B表位的多肽可以是例如微生物膜蛋白或其片段，特別是來自西尼羅病毒的包膜E-糖蛋白或其片段。所述慢病毒載體可包含缺乏跨膜錨著區(qū)的羧基端截短的西尼羅病毒E糖蛋白，例如包含西尼羅病毒IS-98-ST1毒林包膜E-糖蛋白中1-441位殘基的羧基端截短的E糖蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述異源核酸編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白的變體。本發(fā)明包括在下文所述嚴(yán)謹(jǐn)條件下與西尼羅病毒IS-98-ST1毒林中編碼包膜E-糖蛋白的核酸雜交的變體異源核酸。本發(fā)明還提供用于針對(duì)西尼羅病毒感染對(duì)動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種的方法，包括對(duì)有此需要的動(dòng)物一次或多次施用慢病毒載體，所述載體包含編碼至少帶有B表位的肽的核酸。所述至少帶有B表位的核酸可以是例如微生物膜蛋白或其片段，特別是西尼羅病毒的包膜E-糖蛋白或其片段，其還帶有可接受的生理載體和/或佐劑。合適的體內(nèi)給藥途徑包括例如腹膜內(nèi)途徑、靜脈內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑、經(jīng)口途徑、粘膜途徑、舌下途徑、鼻內(nèi)途徑、皮下途徑或皮內(nèi)途徑。合適的離體途徑包括施用已轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒載體的自體細(xì)胞(即抗原呈遞細(xì)胞(APC)如樹突細(xì)胞(DC)或B細(xì)胞)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源核酸編碼至少帶有B表位的肽或多肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，該多肽編碼膜蛋白或其片段。在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述異源核酸編碼缺乏跨膜錨著區(qū)的羧基端截短的西尼羅病毒E糖蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述羧基端截短的E糖蛋白包含西尼羅病毒IS-98-ST1毒林包膜E-糖蛋白的1-441位殘基。本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案包括以有限的劑量數(shù)(如單劑量或者兩次劑量或三次劑量)施用所述慢病毒載體。在另一實(shí)施方案中，該劑量包括例如相當(dāng)于0.5ng至5000ngp24抗原的載體顆粒。在小鼠中，優(yōu)選劑量可為0.5ng至50ng，而在馬中優(yōu)選劑量可為50ng至500ng。本發(fā)明包括治療這些動(dòng)物，例如人、馬、鳥類、家禽、豬、家畜(包括牛、綿羊和山羊)、嚙齒動(dòng)物(包括倉(cāng)鼠、大鼠和小鼠)、寵物和爬行動(dòng)物。本發(fā)明還提供針對(duì)微生物感染而對(duì)動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種的方法，包括對(duì)有此需要的動(dòng)物一次或多次施用包含異源核酸的慢病毒載體，所述異源核酸編碼這些微生物的免疫原性膜蛋白或其片段。本文使用的術(shù)語微生物包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了針對(duì)病毒感染(例如黃病毒感染)而對(duì)有此需要的動(dòng)物進(jìn)行疫苗接種的方法，特別是針對(duì)西尼羅病毒感染而對(duì)有此需要的動(dòng)物進(jìn)行免疫接種的方法，這通過施用慢病毒載體以及可接受生理載體和/或佐劑來實(shí)現(xiàn)，所述慢病毒栽體中包含西尼羅病毒包膜E-糖蛋白的變體或其片段。本發(fā)明包括這樣的免疫接種方法其中所述異源核酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與來自西尼羅病毒IS-98-ST1毒林的編碼包膜E-糖蛋白的核酸雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述慢病毒載體施用一次，例如以相當(dāng)于0.5ng至5000ngp24抗原的載體顆粒劑量施用。有此需要的動(dòng)物可包括例如人、馬、鳥類、家禽、豬、家畜(包括牛、綿羊和山羊)、嚙齒動(dòng)物(包括倉(cāng)鼠、大鼠和小鼠)、寵物(包括貓和狗)和爬行動(dòng)物。本發(fā)明還提供包含慢病毒載體以及可藥用載體的免疫原性組合物，其中所述慢病毒載體包含編碼抗原的異源核酸，該抗原的量足以在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫原性或保護(hù)性應(yīng)答。本發(fā)明包括這樣的免疫原性組合物其中異源核酸編碼至少帶有B表位的肽。至少帶有B表位的肽可以是例如微生物膜蛋白或其片段，特別是西尼羅病毒包膜E-糖蛋白或其片段或者缺乏跨膜錨著區(qū)的羧基端截短的西尼羅病毒E-糖蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述羧基端截短的E糖蛋白包含西尼羅病毒IS-98-ST1毒林包膜E-糖蛋白的1-441位殘基。本發(fā)明還提供包含慢病毒載體和可藥用載體的免疫原性組合物，其中所述慢病毒載體包含編碼抗原的異源核酸，該抗原的量足以在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫原性或保護(hù)性應(yīng)答，并且其中所述異源核酸編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白的變體。在一個(gè)實(shí)施例中，所述異源核酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與來自西尼羅病毒IS-98-ST1毒林的編碼包膜E-糖蛋白的核酸雜交。本發(fā)明包括指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的慢病毒載體，其中所述載體包含巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子，并且其中所述異源核酸編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白或其片段。所述異源核酸可編碼如缺乏跨膜錨著區(qū)的羧基端截短的西尼羅病毒E-糖蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述羧基端截短的E-糖蛋白包含西尼羅病毒IS-98-ST1毒林包膜E-糖蛋白的1-441位殘基。本發(fā)明還提供已轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了這種慢病毒載體的基本純化的宿主細(xì)胞，還提供用于生產(chǎn)西尼羅病毒包膜E-糖蛋白多肽或其片段的方法，包括在促進(jìn)表達(dá)的條件下培養(yǎng)已轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)這種慢病毒載體的宿主細(xì)胞；以及從該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所述多肽。本發(fā)明還提供指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的慢病毒栽體，其中所述載體包含巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子，并且其中所述異源核酸編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述異源核酸在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與來自西尼羅病毒IS-98-STl毒林的編碼包膜E-糖蛋白的核酸雜交。本發(fā)明包括已轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了這種慢病毒栽體的基本純化的宿主細(xì)胞，還包括用于生產(chǎn)西尼羅病毒包膜E-糖蛋白變體的方法，該方法包括在促進(jìn)表達(dá)的條件下培養(yǎng)已轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)這種慢病毒載體的宿主細(xì)胞；以及從該宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收所述多肽。本發(fā)明還提供指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的慢病毒載體，其中所述載體包含巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子，并且其中所述異源核酸包含綠色熒光蛋白。本發(fā)明還包括已轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了這種慢病毒載體的基本純化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明包括針對(duì)病原體進(jìn)行疫苗接種的方法，包括對(duì)有此需要的動(dòng)物施用慢病毒載體，其中所述慢病毒載體包含編碼抗原的異源核酸，并且其中所述抗原引發(fā)針對(duì)該病原體的抗體。本發(fā)明包括例如以下的免疫接種法其中慢病毒載體的施用引發(fā)長(zhǎng)期持續(xù)性體液免疫。本發(fā)明還包括例如以下的免疫接種法其中慢病毒載體的施用引發(fā)針對(duì)該病原體的中和抗體。所述有此需要的動(dòng)物可包括例如人、馬、鳥類、家禽、豬、家畜(包括牛、綿羊和山羊)、嚙齒動(dòng)物(包括倉(cāng)鼠、大鼠和小鼠)、寵物(如貓和狗)以及爬行動(dòng)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述慢病毒載體包含編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白的核酸或其片段，并且所述病原體為西尼羅病毒。在另一實(shí)施方案中，所述西尼羅病毒包膜E-糖蛋白缺乏跨膜錨著區(qū)。在另一實(shí)施方案中，所述慢病毒載體的施用包括至少一個(gè)劑量相當(dāng)于0.5ng至5000ngp24抗原的載體顆粒。本發(fā)明還提供遞送DNA以在體內(nèi)產(chǎn)生抗體的方法，包括對(duì)動(dòng)物施用慢病毒載體，其中所述慢病毒載體包含編碼抗原的異源核酸，并且其中該抗原在該動(dòng)物中引發(fā)體液免疫。本發(fā)明包括對(duì)有此需要的動(dòng)物誘導(dǎo)保護(hù)性體液免疫的慢病毒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述有此需要的動(dòng)物可包括例如人、馬、鳥類、家禽、豬、家畜(包括牛、綿羊和山羊)、嚙齒動(dòng)物(包括倉(cāng)鼠、大鼠和小鼠)、寵物以及爬行動(dòng)物。本發(fā)明還提供遞送DNA以在體內(nèi)產(chǎn)生抗體的方法，包括對(duì)動(dòng)物施用慢病毒載體，其中所述慢病毒載體包含編碼抗原的異源核酸，并且其中該抗原在該動(dòng)物中引發(fā)體液免疫，其中所述慢病毒載體誘導(dǎo)針對(duì)西尼羅病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述慢病毒載體可包含編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白的核酸或其片段。所述慢病毒載體可包含編碼以下蛋白的核酸缺乏跨膜錨著區(qū)的羧基端截短的西尼羅病毒E糖蛋白，例如包含西尼羅病毒IS-98-ST1毒林包膜E-糖蛋白中1-441位殘基的羧基端截短的E糖蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述異源核酸編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白的變體。本發(fā)明包括在下文所述嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與來自西尼羅病毒IS-98-ST1毒林的編碼包膜E-糖蛋白的核酸雜交的變體異源核酸。本發(fā)明還包括對(duì)動(dòng)物施用慢病毒載體的方法，其中所述慢病毒載體包含編碼抗原的異源核酸，并且其中該抗原在該動(dòng)物中引發(fā)體液應(yīng)答。本發(fā)明包括在有此需要的動(dòng)物中誘導(dǎo)保護(hù)性體液免疫的慢病毒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述有此需要的動(dòng)物可包括例如人、馬、鳥類、家禽、豬、家畜(包括牛、綿羊和山羊)、嚙齒動(dòng)物(包括倉(cāng)鼠、大鼠和小鼠)、寵物以及爬行動(dòng)物。本發(fā)明還提供包括對(duì)動(dòng)物施用慢病毒載體的方法，其中所述慢病毒載體包含編碼抗原的異源核酸，其中該抗原在該動(dòng)物中引發(fā)體液應(yīng)答，并且其中以該慢病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)后在該動(dòng)物中表達(dá)的抗原誘導(dǎo)針對(duì)感染微生物(如西尼羅病毒)的保護(hù)性免疫。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述慢病毒載體包含編碼感染性微生物膜蛋白(特別是編碼包膜蛋白，更優(yōu)選地編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白)或其片段的核酸。所述慢病毒載體可包含編碼以下蛋白的核酸缺乏跨膜錨著區(qū)的羧基端截短的西尼羅病毒E糖蛋白，例如包含西尼羅病毒IS-98-ST1毒祙包膜E-糖蛋白中1-441位殘基的羧基端截短的E糖蛋白。在另一實(shí)施方案中，所述異源核酸編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白的變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與下述核酸、例如來自西尼羅病毒IS-98-STl毒林的編碼包膜E-糖蛋白的核酸雜交的異源核酸。本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)一部分將在以下描述中公開，一部分將從以下描述中顯而易見，或者可以通過本發(fā)明的實(shí)踐來獲知。本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)將通過附帶的權(quán)利要求書中具體指出的要素和組合來實(shí)現(xiàn)和獲得。圖1顯示已轉(zhuǎn)導(dǎo)TRIP/sEwnv的293T細(xì)胞中sEwjw的表達(dá)。(A)TRIP/sEWNV載體的示意圖。將編碼sEWNV的IS-98-ST1cDNA從TOPO/sEwNv質(zhì)粒[29亞克隆到TRIP慢病毒栽體的BsiWl與BssHII克隆位點(diǎn)之間，并在人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子(cytomegalovirusimmediateearlypromoter,CMVie)的控制下。LTR=長(zhǎng)末端重復(fù)。(B)檢測(cè)已轉(zhuǎn)導(dǎo)TRIP/sEWNVW293T細(xì)胞中的sEwnv蛋白。用相當(dāng)于100ng/mlp24抗原(左)的TRIP/sEWNV載體顆粒量轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞，或者不進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)(右)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)，用抗WNVHMAF(HyperimmuneMouseAsciticFluid,超免疫的小鼠腹水)對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。圖2顯示在來自已接種TRIP/sEwNv的小鼠的血清中檢測(cè)抗E體。用WNV毒林IS-98-ST1(WNV)感染Vero細(xì)胞，或者進(jìn)行模擬感染(無病毒)。用合并的免疫血清(稀釋度1:100)對(duì)放射性標(biāo)記的細(xì)胞裂解液進(jìn)行免疫沉淀。通過非還原條件下的SDS-15%PAGE來分析樣品。(A)在免疫后(p.i)第6、13、20和27天收集的來自TRIP/sEWNV免疫小鼠的血清。(B)來自已接種WNV的抗性同類系BALB/c-MBT小鼠的血清(抗WNV的血清)。使用淋巴脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphochoriomeningitisvirus,LCMV)抗血清作為陰性對(duì)照。顯示了WNV結(jié)構(gòu)糖蛋白C、prM和E以及非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和NS2A。(C)WNV攻擊后21天收集的來自TRIP/sEwnv免疫小鼠的血清，攻擊在免疫后7天或14天進(jìn)行。作為陽性對(duì)照，用抗WNVHMAF對(duì)病毒抗原進(jìn)行免疫沉淀。圖3顯示TRIP/sEWNV載體顆粒的熱失活消除了轉(zhuǎn)導(dǎo)。用熱失活(70"C10分鐘)或未熱失活的TRIP/GFP載體(66ngp24抗原/ml)轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)，通過FACS檢測(cè)GFPi達(dá)。圖4顯示來自IS-98-STl毒林的西尼羅病毒E-糖蛋白之分泌形式的核酸序列(SEQIDNO:9)，在該序列的末端添加了起始密碼子和終止密碼子。圖5顯示來自IS-98-STl毒林的西尼羅病毒E-糖蛋白之分泌形式的核酸序列(SEQIDNO:IO)。圖6顯示來自IS-98-ST1毒林的西尼羅病毒E-糖蛋白之分泌形式的氨基酸序列(SEQIDNO:ll)。N端的信號(hào)序列加有下劃線。圖7顯示來自IS-98-ST1毒林的西尼羅病毒E-糖蛋白結(jié)構(gòu)域III的氨基酸序列(SEQIDNO:12)。圖8顯示帶有異源序列的慢病毒載體pTRIPsEwNv的完整核酸序列(SEQIDNO:13),所述異源序列為來自西尼羅病毒IS-98-ST1毒林的截短的西尼羅病毒E-糖蛋白。發(fā)明詳述已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用于誘導(dǎo)保護(hù)性體液應(yīng)答的慢病毒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述慢病毒載體為復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其包含逆轉(zhuǎn)錄(PPT3，、PBS和LTR的R區(qū))、入核(cPPT-CTS)和整合(psi)所需的順式作用序列以及編碼抗原的異源核酸。在這一實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白以"反式"提供。慢病毒載體可包含LTR的整合重復(fù)(integrationrepeat,IR)序列和Tip以及轉(zhuǎn)錄序列作為ORF和啟動(dòng)子。所述'匱病毒顆?？捎扇魏尾《净蚍遣《景みM(jìn)行假型包裝，以便于其進(jìn)入靶細(xì)胞。慢病毒載體中用于插入異源核酸的一個(gè)優(yōu)選位點(diǎn)是兩個(gè)LTR之間，如下文所述?；蛘撸蓪愒春怂岵迦肜鏛TR的U3或U5區(qū)，或者以替換LTR的U3或U5區(qū)的方式提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述慢病毒栽體包含編碼肽的異源核酸，所述肽帶有至少一個(gè)B表位。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述異源核酸編碼來自感染微生物的膜蛋白，例如包膜蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述異源核酸編碼西尼羅病毒的包膜E-糖蛋白或其片段。術(shù)語"慢病毒栽體"指該載體含有滿足以下條件的多核苷酸(1)與在自然界中與其關(guān)聯(lián)的多核苷酸的全部或一部分不相關(guān)聯(lián)，(2)與自然界中不與其相連的多核苷酸相連，或者(3)在自然界中不存在。本發(fā)明的慢病毒載體包括來自以下的栽體，例如HIV-1、HIV-2、SIV(猴免疫缺陷病毒)、EIAV(馬傳染性貧血病毒)、FIV(貓免疫缺陷病毒)、CAEV(羊關(guān)節(jié)炎腦炎病毒)和VMV(綿羊髓鞘脫落病毒(visna/maedivirus)。慢病毒還包括來自至少兩種不同慢病毒的嵌合慢病毒。術(shù)語"多肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用，指任何長(zhǎng)度的氨基酸的聚合形式，并可包括經(jīng)化學(xué)或生物化學(xué)修飾或衍生的氨基酸以及具有修飾肽主鏈的多肽。該術(shù)語包括融合蛋白，如GST融合蛋白和PEG化蛋白、含有異源氨基酸序列的融合蛋白、含有異源或同源前導(dǎo)序列的融合體(帶有或不帶有N端曱硫氨酸殘基)；免疫標(biāo)記的蛋白等。多肽序列的"片段"指短于參照序列、但保留被認(rèn)為與參照多肽相同的生物功能或活性的多肽序列。這樣的活性可包括例如刺激免疫應(yīng)答的能力。片段保留該參照多肽的至少一個(gè)表位。本文使用的術(shù)語"純化的"指基本不與其他蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合的多肽，例如作為重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物的純化產(chǎn)物或來自非重組來源的純化產(chǎn)物。本文使用的術(shù)語"基本純化的"指含有多肽并且基本不與其他蛋白質(zhì)或多肽結(jié)合的混合物，其中存在的已知蛋白質(zhì)可使用特異性抗體除去，并且所述基本純化的多肽可用作抗原。本文使用的術(shù)語"抗原"指能刺激免疫應(yīng)答的物質(zhì)。優(yōu)選的抗原包括至少一個(gè)B表位，其中B表位能夠引發(fā)體液免疫應(yīng)答。這樣優(yōu)選的抗原包括例如表面抗原、例如包膜或其他膜蛋白以及其片段。本文使用的術(shù)語"病原體"指疾病的特異性致病因子，可包括例如任何細(xì)菌、病毒或寄生蟲。本文使用的術(shù)語"疾病"指身體機(jī)能、系統(tǒng)或器官的中斷、停止或紊亂。優(yōu)選的疾病包括傳染病。本文使用的術(shù)語"體液免疫"指由抗原引發(fā)的抗體及其伴隨的所有輔助過程。本文使用的術(shù)語"保護(hù)性體液免疫"指賦予針對(duì)病原體的必要保護(hù)成分的體液免疫應(yīng)答。本文使用的術(shù)語"殺滅性體液免疫"指防止病原體建立任何可檢測(cè)感染的體液免疫。本文使用的術(shù)語"長(zhǎng)期持續(xù)性體液免疫"指在抗原施用三個(gè)月后仍可檢測(cè)到的體液免疫的一些方面，例如由該抗原引發(fā)的抗體。合適的抗體檢測(cè)方法包括但不僅限于以下方法，如ELISA、免疫熒光(immunofluorescence,IFA)、空斑減少中和試驗(yàn)(focusreductionneutralizationtest,FRNT)、免疫沉淀和Western印跡。本文使用的術(shù)語"中和性體液應(yīng)答"指在體液免疫過程中引發(fā)的抗體直接阻斷病原體感染細(xì)胞的能力。本文使用的術(shù)語"快速應(yīng)答"指在抗原施用后三周內(nèi)賦予保護(hù)性體液免疫。本文使用的術(shù)語"極快速應(yīng)答"指在抗原施用后一周內(nèi)賦予保護(hù)性體液免疫。雜交反應(yīng)可以在不同"嚴(yán)謹(jǐn)度"條件下進(jìn)行。提高雜交反應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)度的條件是本領(lǐng)域已知的。例如，DNA/DNA和DNA/RNA雜交的嚴(yán)謹(jǐn)條件均描述于Sambrook和Russell,MolecularCloning,ALaboratoryManual,第三版,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，2001。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)了解如何根據(jù)特定雜交所需嚴(yán)謹(jǐn)程度的需要而改變條件。相關(guān)條件的實(shí)例包括(按嚴(yán)謹(jǐn)度提高的順序)孵育溫度為25t:、37"c、sor:和68X:;緩沖液濃度為10xSSC、6xSSC、lxSSC、0.1xSSC(其中1xSSC為0.15MNaCl和15mM檸檬酸鹽緩沖液)以及使用其他緩沖體系的其等價(jià)物；甲酰胺濃度為0°/。、25%、50%和75%、孵育時(shí)間為5分鐘至24小時(shí)；1、2或更多次洗滌步驟；洗滌孵育時(shí)間為1、2或15分鐘；洗滌溶液為6xSSC、lxsSC、O.lxSSC或去離子水。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的實(shí)例為在50X:和0.1xSSC(15mM氯化鈉/1.5mM檸檬酸鈉)中進(jìn)行雜交。嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件的另一實(shí)例為42n下在含有50%甲酰胺、1xSSC(150mMNaCl、15mM檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5xDenhardt液、10%石克酸葡聚糖、20ng/ml變性斷裂鮭精DNA的溶液中孵育過夜，其后在約65C下用0.1xSSC洗滌濾膜。高嚴(yán)謹(jǐn)條件的另一實(shí)例包括在65"C下6xSSC(其中20xSSC含有3.0MNaCl和0.3M檸檬酸鈉)、1%十二烷基;P危酸鈉(SDS)中水性雜交(如不含甲酰胺)約8小時(shí)(或更長(zhǎng)時(shí)間)，其后在65"C下用0.2xSSC、0.1%SDS洗滌一次或更多次。本文使用的術(shù)語"變體"多肽指與參照多肽基本同源的多肽，但其氨基酸序列由于一個(gè)或多個(gè)缺失、插入或替換而與該參照多肽不同。變體氨基酸序列優(yōu)選與參照多肽具有至少卯％的一致性，更優(yōu)選至少95%的一致性。百分比一致性可通過如使用GAP計(jì)算機(jī)程序6.0版比較序列信息來測(cè)定，該程序描述于Devereux等(Nucl.AcidsRes.12:387，1984)，并可得自威斯康辛大學(xué)遺傳計(jì)算組(UniversityofWisconsinGeneticsComputerGroup,UWGCG)。GAP程序利用由Smith和Waterman(Adv.Appl.Math2:482,1981)修正的Needleman和W畫ch(J.Mol.Biol.48:443，1970)比對(duì)法。GAP程序的優(yōu)選默認(rèn)參數(shù)包括(1)核苷酸一元比較矩陣(所包含的一致性值為1，非一致性值為0)，以及Gribskov和Burgess,Nucl.AcidsRes.14:6745,1986的權(quán)重比較矩陣,如Schwartz和Dayhoff編輯,AtlasofProteinSequenceandStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,353-358頁，1979所述；(2)每個(gè)缺口罰分為3.0，每個(gè)缺口中的每個(gè)字符(symbol)額外罰分0.1;以及(3)末端缺口無罰分。變體可包含保守性替換序列，指給定的氨基酸被具有相似生理化學(xué)特征的殘基取代。保守性替換的實(shí)例包括脂肪族殘基彼此替換，如Ile、Val、Leu或Ala彼此替換；或者極性殘基彼此替換，如Lys與Arg、Glu與Asp或Gin與Asn之間進(jìn)行替換。其他這樣的保守性替換(如替換具有相似疏水性特征的完整區(qū)域)是公知的。天然存在的多肽變體也包括在本發(fā)明中。這些變體的實(shí)例為由于選擇性mRNA剪接事件或由于多肽的蛋白水解切割而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。可歸因于蛋白水解的變異包括例如在不同宿主細(xì)胞類型中表達(dá)時(shí)，由于通過蛋白水解從該多肽中去除一個(gè)或多個(gè)末端氨基酸而造成的末端差異?？蓺w因于移碼的變異包括例如在不同宿主類型中表達(dá)時(shí)，由于不同的氨基酸而造成的末端差異。在抗體結(jié)合的語境中，術(shù)語"特異性結(jié)合"指抗體與特定多肽(或者更準(zhǔn)確地，與特定多肽的特定表位)的高親合力(avidity)和/或高親和力(affinity)結(jié)合。抗體與這些表位的結(jié)合通常強(qiáng)于同一抗體與任何其他表位或不包含該表位的任何其他多肽的結(jié)合。一般通過將特定多肽注射進(jìn)動(dòng)物中以引發(fā)抗體產(chǎn)生來生產(chǎn)這樣的抗體。這樣的抗體可能能與其他多肽以弱但可檢測(cè)的水平結(jié)合(所示針對(duì)目的多肽的結(jié)合的10%或更低)。這樣的弱結(jié)合或背景結(jié)合易于與特異性抗體結(jié)合區(qū)分，例如使用適當(dāng)?shù)膶?duì)照。一般而言，本發(fā)明的抗體以10^M或更高、優(yōu)選10-8]\1或更高(如1(^M、10"°、10-u等)的結(jié)合親和力與特異性多肽結(jié)合。"可藥用載體"指無毒的固體、半固體或液體填充劑、稀釋劑、包裹材料或任何常規(guī)類型的制劑輔助物。"可藥用載體"在所使用的劑量和濃度下對(duì)受者無毒，并與該制劑中的其他成分相容。例如，用于含有多肽的制劑的栽體優(yōu)選不包括氧化劑和其他已知對(duì)多肽有害的化合物。合適的載體包括但不僅限于水、葡萄糖、甘油、鹽水、乙醇及其組合。所述載體可含有其他試劑如濕潤(rùn)劑或乳化劑、pH緩沖劑或增強(qiáng)制劑效力的佐劑。局部載體包括液體石蠟、棕櫚酸異丙酯、聚乙二醇、乙醇(95%)、水中的聚氧乙烯單月桂酸酯(5%)或水中的月桂硫酸鈉(5%)。其他材料如抗氧化劑、保濕劑、粘度穩(wěn)定劑和類似試劑可根據(jù)需要添加。還可包括經(jīng)皮滲透增強(qiáng)劑如月桂氮卓酮(Azone)。西尼羅病毒IS-98-ST1(或STD)毒林的完整基因組序列可以從GenBank登錄號(hào)AF481864獲得(GI:19387527，2002年5月21日版)。本發(fā)明提供重組和非重組的、分離和純化的或同質(zhì)的西尼羅病毒包膜E-糖蛋白多肽?？捎米骺乖奶烊话-糖蛋白多肽的變體和衍生物可通過突變編碼天然包膜E-糖蛋白多肽的核苷酸序列而獲得。天然氨基酸序列的改變可通過多種常規(guī)技術(shù)中的任一種實(shí)現(xiàn)?？赏ㄟ^合成含有突變體序列的寡核苷酸來在特定基因座引入突變，所述突變體序列的側(cè)翼為實(shí)現(xiàn)連接天然序列片段的限制性位點(diǎn)。連接后，得到的重建序列編碼具有期望氨基酸插入、替換或缺失的類似物。或者，可以利用寡核苷酸指導(dǎo)的位點(diǎn)特異性誘變操作來提供改變的基因，其中可通過替換、缺失或插入來改變預(yù)定的密碼子。產(chǎn)生上文所述改變的示例性方法公開于Walder等(Gene42:133，1986);Bauer等(Gene37:73,1985);Craik(BioTechniques，January1985,12-19);Smith等(GeneticEngineering:PrinciplesandMethods,PlenumPress,1981);Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA82:488，1985);Kunkel等(MethodsinEnzymol.154:367，1987)和美國(guó)專利號(hào)4,518,584和4,737,462，所述文獻(xiàn)均以參考方式并入本文。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，慢病毒載體可用于制備與多肽特異性結(jié)合的抗體。術(shù)語"抗體，，旨在包括多克隆抗體、單克隆抗體、其片段如F(ab，)2和Fab片段以及任何重組產(chǎn)生的結(jié)合伴侶。如果抗體與包膜E-糖蛋白多肽結(jié)合的Ka大于或等于約KTm",則將其定義為特異性結(jié)合。結(jié)合伴侶或抗體的親和力可便利地使用常規(guī)技術(shù)測(cè)定，例如Scatchard等，Ann.N.YAcad.Sci.，51:660(1949)中所述。多克隆抗體可4吏用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)便利地從多種來源中產(chǎn)生，例如馬、牛、山樣、綿羊、狗、雞、兔、小鼠或大鼠。含有的重組表達(dá)載體可使用熟知的方法制備。分子生物學(xué)的綜述參閱Sambrook和Russell,MolecularCloning:ALaboratoryManual,CSHLPress2001，第三版。表達(dá)載體可包含與適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)核苷酸序列(如來自哺乳動(dòng)物、微生物、病毒或昆蟲基因的序列)可操作性連接的插入序列，如西尼羅病毒包膜E-糖蛋白序列。調(diào)節(jié)序列的實(shí)例包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操作子(叩erator)或增強(qiáng)子、mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)、以及控制轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止的適當(dāng)序列。當(dāng)調(diào)節(jié)序列在功能上與插入序列相關(guān)時(shí)，核苷酸序列就是"可操作性連接"的。因此，如果啟動(dòng)子核苷酸序列控制包膜E-糖蛋白DNA序列的轉(zhuǎn)錄，則該啟動(dòng)子核苷酸序列與包膜E-糖蛋白序列可操作性連接。還可在表達(dá)載體中額外加入在期望宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力(通常由復(fù)制起點(diǎn)提供)以及用于鑒定轉(zhuǎn)化體的選擇基因。此外，在表達(dá)載體中還可加入編碼不與插入序列天然結(jié)合的適當(dāng)信號(hào)肽的序列。用于表達(dá)的合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。與細(xì)菌、真菌、酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主一起使用的適當(dāng)?shù)目寺『捅磉_(dá)載體例如描述于Pouwels等CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,NewYork,(1985)。獲得了本發(fā)明的慢病毒載體之后，它們可用于產(chǎn)生多克隆抗體和單克隆抗體。因此，通過慢病毒載體體內(nèi)或離體表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽可通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)用于免疫動(dòng)物宿主。這些技術(shù)通常包括免疫接種，但其也可能涉及其他給藥模式。施用足量的慢病毒載體以在動(dòng)物宿主中產(chǎn)生免疫原性應(yīng)答。任何慢病毒能感染的宿主均可使用。免疫動(dòng)物并經(jīng)過足以使其開始產(chǎn)生針對(duì)該抗原的抗體的足夠時(shí)間之后，就可以回收多克隆抗體。一般的方法包括從該動(dòng)物中取血和從血中分離血清。含有針對(duì)該抗原的抗體的血清可用作針對(duì)該抗原的抗血清。或者，可以從該血清中回收抗體。親和純化是用于從血清中回收針對(duì)該抗原的純化多克隆抗體的優(yōu)選技術(shù)。還可以制備針對(duì)本發(fā)明抗原的單克隆抗體。產(chǎn)生對(duì)所述抗原具有反應(yīng)性的單克隆抗體的一種方法包括以下步驟用慢病毒載體感染宿主；從宿主的脾中回收抗體產(chǎn)生細(xì)胞；將所述抗體產(chǎn)生細(xì)胞與次黃噤呤-鳥噤呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶缺陷型骨髓瘤細(xì)胞融合以形成雜交瘤；通過在包含次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)來選擇至少一個(gè)雜交瘤；鑒定產(chǎn)生針對(duì)該抗原的抗體的至少一個(gè)雜交瘤；培養(yǎng)所鑒定的雜交瘤，從而以可回收的量產(chǎn)生抗體；以及從培養(yǎng)的雜交瘤回收所產(chǎn)生的抗體。這些多克隆抗體和單克隆抗體可用于多種應(yīng)用。其中包括中和相應(yīng)的蛋白質(zhì)。它們還可用于檢測(cè)生物制劑中的病毒抗原或用于純化相應(yīng)蛋白質(zhì)、糖蛋白或其混合物，例如用于親和層析柱。所述包膜E-糖蛋白多肽可作為抗原用于鑒定材料中針對(duì)西尼羅病毒的抗體和用于測(cè)定這些材料中抗體的濃度。因此，所述抗原可用于定性或定量測(cè)定材料中的病毒。這些材料包括動(dòng)物組織和動(dòng)物細(xì)胞以及生物流體，如動(dòng)物體液，包括動(dòng)物血清。當(dāng)在用于測(cè)定針對(duì)西尼羅病毒的抗體的存在情況或濃度的免疫測(cè)定中作為試劑使用時(shí)，該抗原提供便利、快捷、靈敏且特異的測(cè)定。更具體地，該抗原可檢測(cè)微生物病原體感染(特別是西尼羅病毒)，所述檢測(cè)通過爿〉知可用于檢測(cè)或定量流體中體液組分的免疫測(cè)定法來實(shí)現(xiàn)。因此，抗原-抗體相互作用可以直接觀察，或者通過次級(jí)反應(yīng)(如沉淀或聚集)來測(cè)定。此外，還可以使用免疫電泳技術(shù)。例如，可以使用瓊脂糖電泳之后與抗血清反應(yīng)的經(jīng)典組合，以及二維電泳、火箭電泳以及聚丙烯酰胺凝膠模式的免疫標(biāo)記(Western印跡或免疫印跡)。其他可使用本發(fā)明抗原的免疫沉淀包括但不僅限于放射性免疫測(cè)定、竟?fàn)幮悦庖叱恋頊y(cè)定、酶免疫測(cè)定和免疫熒光測(cè)定。應(yīng)該理解，可以使用比濁技術(shù)、比色技術(shù)和濁度技術(shù)。優(yōu)選基于Western印跡技術(shù)的免疫測(cè)定。免疫沉淀可通過將免疫試劑之一固定在載體表面上而保持該試劑的免疫反應(yīng)性來進(jìn)行。交互的免疫試劑可以不標(biāo)記，或者以仍保留免疫反應(yīng)性的方式標(biāo)記。這些技術(shù)特別適用于酶免疫測(cè)定中，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)和竟?fàn)幮砸种泼该庖邷y(cè)定(CIEIA)。當(dāng)任一免疫試劑附著在固體支持物上時(shí)，該支持物通常為玻璃或塑料材料。優(yōu)選模制成板、管、珠或盤形式的塑料材料。合適的塑料材料的實(shí)例為聚苯乙烯和聚氯乙烯。如果免疫試劑不易與固體支持物結(jié)合，則可使用置于試劑和支持物之間的載體材料。合適的載體材料的實(shí)例為蛋白質(zhì)如牛血清白蛋白，或者化學(xué)試劑如戊二醛或尿素。固相的包被可使用常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。本發(fā)明提供免疫原性慢病毒載體，更具體地，提供用于引發(fā)針對(duì)西尼羅病毒的保護(hù)性應(yīng)答的保護(hù)性慢病毒載體。因此，可通過對(duì)易感病原微生物(細(xì)菌、病毒、寄生蟲)的動(dòng)物施用該慢病毒載體而將這些慢病毒載體用作病毒疫苗并用于預(yù)防感染。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的慢病毒載體包含編碼黃病毒(如西尼羅病毒)膜蛋白的異源核酸，并可用于預(yù)防感染，例如預(yù)防西尼羅病毒感染?？梢岳贸Ｒ?guī)給藥方式。例如，可通過經(jīng)口、呼吸道、胃腸外途徑、舌下途徑、鼻內(nèi)途徑、皮下途徑或皮內(nèi)途徑給藥。本發(fā)明的疫苗組合物以具有療效和免疫原性的量并以與劑型相容的方式給藥。待施用的量取決于待治療對(duì)象，包括個(gè)體免疫系統(tǒng)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。免疫方案將取決于若干因素，例如宿主對(duì)感染的易感性、宿主的體重和宿主的年齡?？梢詫?duì)宿主施用單劑量的本發(fā)明疫苗，或者可以遵循以一定時(shí)間間隔施用數(shù)次劑量的初次免疫時(shí)程?？梢栽诔醮螘r(shí)程之后根據(jù)需要施用作為加強(qiáng)免疫的后續(xù)劑量?？赏ㄟ^以約10至約500ng抗原/千克體重、優(yōu)選約50至約100ng抗原/千克體重的量對(duì)宿主施用本發(fā)明的慢病毒載體來獲得免疫應(yīng)答。本發(fā)明的蛋白質(zhì)和疫苗可以與生理可接受的載體一起施用。例如可以使用稀釋劑如水或鹽溶液。為了進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)目標(biāo)，并且根據(jù)本發(fā)明的目的，描述了能診斷西尼羅病毒感染的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，此試劑盒含有能與西尼羅病毒包膜E-糖蛋白結(jié)合的本發(fā)明抗體。在另一實(shí)施方案中，此試劑盒含有能檢測(cè)與包膜E-糖蛋白多肽結(jié)合的抗體存在與否的本發(fā)明多肽。本發(fā)明將在以下實(shí)施例中更為詳盡地進(jìn)行描述。實(shí)施例1:材料和方法細(xì)胞培養(yǎng)和病毒制備。在分別補(bǔ)充了10%或5%熱滅活胎牛血清(FCS)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco，smodifiedEaglemedium,DMEM)Glutamax(GIBCO)中培養(yǎng)人293T細(xì)胞和非洲綠猴腎Vero細(xì)胞。在假鱗斑伊蚊(J^/esiwe"^si&//flWs)AP61細(xì)胞單層中擴(kuò)增與NY99毒林[32-34密切il關(guān)的WNV毒林IS-98-ST1(GenBank登錄號(hào)AF481864)[31。如前述[29、31、35，在蔗糖梯度中純化并使用抗WNV超免疫小鼠腹水(HyperimmuneMouseAsciticFluid,HMAF)通過空斑免疫檢測(cè)測(cè)定(focusimmunodetectionassay,FIA)在AP61細(xì)胞中進(jìn)行病毒滴定。感染性效價(jià)表示為空斑形成單位(FocusFormingUnit,FFU)。慢病毒載體的構(gòu)建和生產(chǎn)。編碼來自WNV毒林IS-98-ST1的缺乏跨膜錨著區(qū)的羧基端截短E糖蛋白(殘基E-l至E-441,稱為sEWNV)的1.4kbcDNA已有描述[29。已經(jīng)通過PCR將sEwNv編碼cDNA修飾成在開放讀碼框末端的側(cè)翼為BsiWI和BssHII限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。用BsiWI和BssHII消化該cDNA,接著克隆進(jìn)pTRIPAU3CMV質(zhì)粒中的單一BsiWI和BssHII位點(diǎn)中。得到的質(zhì)粒pTRIP.AU3.CMV.sEWNV(下文稱為pTRIP/sEWNV)含有巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子(CMVie)控制下的IS-98-ST1sE糖蛋白序列?？梢匀缜笆鯷38通過用載體質(zhì)粒pTRIP/sEWNV、包衣殼質(zhì)粒(p8.7，[36)和VSV-G包膜表達(dá)質(zhì)粒(pHCMV-G;[37])對(duì)293T細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)磷酸鉀共轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生載體顆粒。用商品HIV-1p24ELISA試劑盒(PerkinElmerLifeSciences)定量濃縮載體顆津立的p24抗原含量。定量PCR。為了檢測(cè)該慢病毒載體的U5-R序列，使用以下引物和探針探針LTR-FL5，-CACAACAGACGGGCACACACTACTTGA-螢光素-3，(SEQIDNO:l)、LTR-LC5,畫RED640誦CACTCAAGGCAAGCTTTATTGAGGC-磷酸化-3，(SEQIDNO:2),引物AA55M5'-GCTAGAGATTTTCCACACTGACTAA一3，(SEQIDNO:3)、M6675，-GGCTAACTAGGGAACCCACTG-隱3，(SEQIDNO:4)[39。為了檢測(cè)CD3，引物和探針的序列如下探針CD3-P15，-GGCTGAAGGTTAGGGATACCAATATTCCTGTCTC-安光素-3，(SEQIDNO:5)、CD3-P25，-RED705-CTAGTGATGGGCTCTTCCCTTGAGCCCTTC國(guó)磷酸化-3，(SEQIDNO:6)和引物CD3-in-F5，-GGCTATCATTCTTCTTCAA(3GTA_3，(SEQIDNO:7)和CD3-in-R5，-CCTCTCTTCAGCCATTTAAGTA-3,(SEQIDNO:8)。引物和探針由Proligo(France)合成。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)使用QIAampDNABlood小量試劑盒(QIAGEN，GmbH,Hilden)從約3x106個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒載體的293T細(xì)胞中分離基因組DNA。對(duì)于實(shí)時(shí)PCR分析，將5nLDNA與15pLPCRmaster混合物混合，所述混合物由1xIXJumpstartTaqReadyMix(Sigma)、1.9mMMgCl2、1.5fiM正向和反向引物(AA55M/M667或CD3-in-F/CD3-in-R)、200nM探針(LTR-FL/LTR-LC或CD3-P1/CD3-P2)和1.5單位TaqDNA聚合酶(Invitrogen)組成。使用3分鐘的一個(gè)循環(huán)以及95t:5s、55"C15s和10s的40個(gè)循環(huán)在LightCycler2.0(RocheAppliedScience)上進(jìn)行擴(kuò)增。為了將載體原液中可能的質(zhì)粒污染考慮在內(nèi)，總是平行測(cè)試來自轉(zhuǎn)導(dǎo)了熱滅活(70XM0分鐘)載體的293T細(xì)胞的DNA。使用5HL來自未轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的基因組DNA作為陰性對(duì)照。每個(gè)DNA樣品均一式二份進(jìn)行測(cè)試，才艮告平均值。與DNA樣品平行擴(kuò)增十倍連續(xù)稀釋的已知濃度質(zhì)粒pTripCD3(含有相關(guān)序列U5-R和CD3),以產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過以下步驟計(jì)算每個(gè)細(xì)胞中的載體總拷貝數(shù)將U5-R拷貝數(shù)對(duì)通過同一基因組DNA樣品中CD3分子拷貝數(shù)定量的293T細(xì)胞數(shù)進(jìn)行歸一化，接著減去從轉(zhuǎn)導(dǎo)了熱滅活載體的細(xì)胞中獲得的拷貝數(shù)。小鼠抗WNV抗血清。通過用WNV毒林IS-98-ST1重復(fù)免疫成年小鼠其后接種肉瘤180來獲得抗WNV超免疫小鼠腹水(HMAF)。通過如前述[31用103FFUIS-98-ST1免疫成年WNV抗性BALB/c-MBT同系小鼠來獲得抗WNV的血清。在接種后1個(gè)月收集小鼠多克隆抗WNV抗體。小鼠免疫和WNV攻擊。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)巴斯德研究所根據(jù)動(dòng)物護(hù)理官方實(shí)驗(yàn)室的指導(dǎo)原則進(jìn)行。對(duì)六至八周齡129小鼠腹膜內(nèi)(i.p.)接種不同劑量的TRIP/sEwNv栽體顆粒，所述載體顆粒處于0.1ml補(bǔ)充了0.2%牛血清白蛋白緩沖液的Dulbecco，sPBS(DPBS;pH7.5)(DPBS/0.2%BSA,Sigma)中。WNV攻擊通過如前述[29、31]腹膜內(nèi)接種神經(jīng)毒性WNV毒林IS-98-ST1(腹膜內(nèi)LD5Q=10FFU)來進(jìn)行。對(duì)攻擊后小鼠每日監(jiān)測(cè)發(fā)病或死亡的體征多至21天。測(cè)量血清抗體應(yīng)答。通過眶周途徑對(duì)小鼠取血，將血清在56t:下熱滅活30分鐘。4吏用蔗糖純化的WNVIS-98-ST1作為病毒抗原，通過ELISA檢測(cè)抗WNV抗體[29、31。使用1:4000稀釋度的綴合過氧化物酶的抗小鼠免疫球蛋白(H+L)(JacksonImmunoResearch)以及1:20000稀釋度的綴合過氧化物酶的抗小鼠IgM(n-鏈特異性)或IgG(Y-鏈特異性)(Sigma)作為第二抗體。終點(diǎn)效價(jià)計(jì)算為引發(fā)兩倍于作為陰性對(duì)照的TRIP/GFP接種小鼠吸光度(opticaldensity,OD)的最后一個(gè)稀釋度的倒數(shù)。如前述[29通過在Vero細(xì)胞上進(jìn)行空斑減少中和測(cè)試(FRNT)檢測(cè)抗WNV中和抗體。終點(diǎn)效價(jià)計(jì)算為減少％%FFU數(shù)的最高血清稀釋度的倒數(shù)(FRNT90)。放射性免疫沉淀測(cè)定。以高感染復(fù)數(shù)用WNV毒林IS-98-STl感染2225112瓶中培養(yǎng)的Vero細(xì)胞。感染后20小時(shí)，使細(xì)胞在除去曱硫氨酸的DMEM(ICNBiomedicals)中饑餓1小時(shí)，并用100^Ci/mlTrans35S-LabelTM/ml(ICNBiomedicals)放射性標(biāo)記3小時(shí)。用冷PBS洗滌三次后，在4t:下用補(bǔ)充了25pg/ml抑肽酶(aprotinin)(Sigma)的RIPA裂解緩沖液(50mMTris隱HCl,150mMNaCl，10mMEDTA，1%TritonX-IOO，0.5%脫氧膽酸鹽，0.1%SDS，pH8.0)裂解細(xì)胞10分鐘。接著通過在4X:下以10000rpm離心5分鐘來使細(xì)胞裂解液澄清。如前述[29、40進(jìn)行放射性免疫沉淀(Radioimmunoprecipitation，RIP)測(cè)定。用小鼠抗WNV抗體免疫沉淀病毒抗原。在非還原條件下通過SDS-15%PAGE分析樣品。間接免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。對(duì)于間接免疫熒光(indirectimmunofluorescence,IF)分析，用TRIP/sEWNV載體顆粒轉(zhuǎn)導(dǎo)8室Glass-Labteks(Nunc)上培養(yǎng)的人293T細(xì)胞。48小時(shí)后，將細(xì)胞用PBS中的3%多聚甲搭(paraformaldehyde,PFA)固定20分鐘，并用PBS中的0.1%TritonX-100透化4分鐘。將細(xì)胞與PBS中1:100稀釋度的抗WNVHMAF孵育1小時(shí)。用DPBS/0.2。/。BSA封閉后，再將細(xì)胞與DPBS/0.2%BSA中1:500稀釋度的綴合Cy3的抗小鼠IgG抗體(AmershamPharamcia)—起孵育。用DAPI使細(xì)胞核顯影。使用帶有ApoTome系統(tǒng)的蔡司Axioplan顯微鏡檢查玻片。對(duì)于流式細(xì)胞術(shù)分析，用經(jīng)過或未經(jīng)熱滅活(70T10分鐘)的TRIP/GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)25cm2瓶中培養(yǎng)的293T細(xì)胞。48小時(shí)后，使細(xì)胞脫壁，洗滌并用2%PFA固定。通過FACS測(cè)量GFP熒光強(qiáng)度并用CellQuest軟件分析。實(shí)施例2:通過重組TRIP慢病毒載體表達(dá)分泌形式的WNVE糖蛋白.為了評(píng)價(jià)使用基于慢病毒載體的疫苗進(jìn)行的免疫是否能提供對(duì)WNV腦炎的保護(hù)，產(chǎn)生了慢病毒載體TRIP/sEwNv，其在CMV立即早期啟動(dòng)子(CMVi.e.)控制下表達(dá)來自WNV毒林IS-98-ST1的E糖蛋白可溶形式(sEWNV)(圖1A)。我們先前證明了在通過重組麻疹載體感染的細(xì)胞的培養(yǎng)基中sEwnv的高效分泌[29。轉(zhuǎn)導(dǎo)了慢病毒的293T細(xì)胞中sEwNv的表達(dá)通過免疫熒光進(jìn)行檢查(圖1B)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后48小時(shí)，很大一部分細(xì)胞被免疫染色，其模式提示SEwNV通過分泌途徑遷移。本研究所使用載體原液中物理顆粒的量通過針對(duì)p24HIV-1衣殼蛋白的市售ELISA測(cè)定(PerkinElmerLifescience)A測(cè)定。4吏用定量PCR測(cè)定,基于栽體DNA向靶細(xì)胞的轉(zhuǎn)移來計(jì)算載體原液的實(shí)際效價(jià)。對(duì)載體特異性序列(U5)和細(xì)胞基因座(CD3)均進(jìn)行定量，給出每個(gè)細(xì)胞中的平均載體DNA拷貝數(shù)。這使得可以對(duì)載體制劑進(jìn)行精確定量。本研究中使用的TRIP/sEwnv栽體原液在人293T細(xì)胞中以5.2x107轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(transductionunit,TU)/ml(對(duì)應(yīng)于人293T細(xì)胞中約卯OTU/ng的p24)滴定。出于筒化原因，我們?cè)谝韵抡鹿?jié)中將載體顆粒的量表示為p24抗原的ng數(shù)。實(shí)施例3:用TRIP/sEww進(jìn)行的單次免疫誘導(dǎo)強(qiáng)抗體應(yīng)答為了評(píng)估表達(dá)sEWNV的慢病毒載體所誘導(dǎo)的體液免疫，用相當(dāng)于500ngp24抗原的載體顆粒腹膜內(nèi)接種成年129小鼠組。編碼sEwnv或GFP蛋白的載體作為對(duì)照。在免疫后6、13、20或27天對(duì)小鼠眶周取血，并使用已描述的同種型特異性ELISA對(duì)單個(gè)或合并的血清測(cè)試抗WNV總抗體、IgG和IgM[29。通過空斑減少中和測(cè)試(FNRT)測(cè)定血清的體外中和活性[29]。在用TRIP/GFP免疫的對(duì)照小鼠中未檢測(cè)到抗WNV抗體。首先單個(gè)測(cè)試了來自TRIP/sEwnv免疫小鼠的血清，動(dòng)物之間觀察到的差異非常小(第6天的平均值士SD二0.5士0.3;第13天=1.3士0.05;第21天=1.3土0.15;第27天=1.4±0.15)，因此在其后的實(shí)驗(yàn)中使用合并血清。在TRIP/sEwnv免疫小鼠中，早在免疫后第6天即可檢測(cè)到針對(duì)WNV的總抗體，盡管存在的濃度;f艮低。與預(yù)計(jì)一致，在此時(shí)間點(diǎn)，免疫血清中僅檢測(cè)到抗WNVIgM抗體。總抗體應(yīng)答在第13天提高IO倍到達(dá)平臺(tái)，接著隨時(shí)間維持。在這些較晚的時(shí)間點(diǎn)(第13、20、27天)中，IgM抗體消失，被IgG取代(表1)。RIP測(cè)定證明，這些血清與來自用IS-98-ST1感染細(xì)胞裂解液的WNVE-糖蛋白具有反應(yīng)性(圖2A)?？瞻邷p少中和測(cè)試(FRNT)顯示，來自TRIP/sEwnv免疫小鼠的血清早在免疫后第6天即含有可檢測(cè)水平的中和性抗WNV抗體(表1)?？傊?，這些數(shù)據(jù)顯示，在接種了單劑量TRIP/sEwNv載體顆粒的小鼠中引發(fā)了早且特異性的抗WNV抗體免疫應(yīng)答。免疫WNV抗體WNVIgMWNVIgG抗德V載體a，效價(jià)b抗體效價(jià)b抗體效價(jià)b取血天數(shù)TRIP/GFP第27天NDNDND<10TRIP/sE瞎第06天3,000300ND10第13天30"00ND1,00010第20天30,000ND1,00010第27天30,000ND1,00020a.用對(duì)應(yīng)于500ngp24抗原的慢病毒載體顆粒的量腹膜內(nèi)接種6只成年129小鼠組。實(shí)施例4:用TRIP/sEw^進(jìn)行免疫賦予小鼠針對(duì)WNV腦炎的早期保為了確定TRIP/sEWNV免疫接種后小鼠中引發(fā)的體液應(yīng)答是否是保護(hù)性的，利用了WNV攻擊的小鼠模型。事實(shí)上，一些小鼠品系對(duì)WNV攻擊極端敏感[31、41]，它們?cè)诮臃N后數(shù)天內(nèi)發(fā)生與人中所見相似的神經(jīng)侵襲性致死疾病[32、42并死亡。對(duì)接受500ngp24單劑量TRIP/sEwjw或TRIP/GFP載體顆粒的129大鼠組在引發(fā)后一周或兩周以1000倍腹膜內(nèi)LD50的WNV毒林IS-98-ST1進(jìn)行腹膜內(nèi)攻擊。值得注意的是，所有用TRIP/sE，v免疫的小鼠均早在引發(fā)后7天即產(chǎn)生針對(duì)高病毒攻擊(1000倍腹膜內(nèi)LD5Q)的保護(hù)。所有用載體TRIP/GFP或DPBS免疫的小鼠均在攻擊后11天內(nèi)死亡(表2)。有意思的是，針對(duì)WNV的總抗體在攻擊后提高為IO倍，提示TRIP/sEwnv免疫小鼠中引發(fā)了有效的二次應(yīng)答(表2)。在BALB/c小鼠中得到了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果(結(jié)果未顯示)。這些結(jié)果表明，TRIP/sEwNv疫苗接種賦予針對(duì)高WNV攻擊的非常迅速的完全保護(hù)性免疫應(yīng)答。表2.TRIP/sEwNv針對(duì)WNV感染提供迅速的保護(hù)免<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>a.用對(duì)應(yīng)于500ngp24抗原的單劑量的慢病毒栽體顆?；蛴肈PBS腹膜內(nèi)接種成年129小鼠組。實(shí)施例5:用TRIP/sEWNV免疫接種引發(fā)殺滅性抗病毒免疫。為了說明在經(jīng)疫苗接種的動(dòng)物中攻擊后是否發(fā)生WNV原發(fā)性感染(primo-infection)，對(duì)WNV攻擊前和攻擊后21天收集的來自免疫小鼠的合并血清進(jìn)行RIP測(cè)定。使用來自TRIP/sEwnv免疫小鼠的合并血清，首先在免疫后第13天通過RIP測(cè)定可檢測(cè)到E蛋白(圖2A)。在一周免疫血清中未檢測(cè)到抗E抗體可歸因于在我們的RIP測(cè)定中蛋白A對(duì)IgM的親和力低。來自TRIP/GFP對(duì)照免疫小鼠的血清不與WNVE蛋白反應(yīng)。重要的是，來自TRIP/sEwNv疫苗接種小鼠的攻擊后血清不沉淀除E以外的任何病毒蛋白(圖2C)。這種對(duì)除E以外的任何WNV蛋白(如preM和非結(jié)構(gòu)蛋白NS2a、NS2b和NS3)反應(yīng)性的缺乏清楚地表明，在疫苗接種動(dòng)物中攻擊后不存在體內(nèi)WNV復(fù)制。在對(duì)WNV腦炎具有抗性的BALB/c-MBT小鼠品系中，血清易于與所有病毒蛋白反應(yīng)(圖2B)。因此，TRIP/sEw!w疫苗接種賦予小鼠完整的殺滅性免疫。實(shí)施例6:通過單次注射TRIP/sEWNV所提供的保護(hù)是長(zhǎng)期的。我們接著確定了用基于慢病毒載體的單次免疫是否具有引發(fā)針對(duì)WNV感染的長(zhǎng)期保護(hù)性免疫的潛力。用相當(dāng)于500ngp24抗原的TRIP/sEWNV載體顆粒對(duì)129小鼠組進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫，或者使用相同量的TRIP/GFP載體作為對(duì)照。3個(gè)月后，對(duì)小鼠眶周取血，并通過ELISA和FRNT測(cè)試來自每個(gè)組的合并血清。TRIP/sEwnv免疫小鼠中的抗體水平在單次載體注射(1:30000)后3個(gè)月仍非常高，并且中和抗體持續(xù)(表3)。接著用1000倍LDs()劑量的IS-98-ST1WNV腹膜內(nèi)攻擊小鼠。在用TRIP/sEw!w免疫的小鼠中發(fā)病或死亡均未觀察到，而所有對(duì)照小鼠均在10天內(nèi)死亡(表3)?？偪贵w效價(jià)以及中和性抗WNV抗體在攻擊后提高，提示在3個(gè)月前用TRIP/sEwNv免疫的小鼠中引發(fā)了有效的二次應(yīng)答(表3)。因此，單劑量的SEwNv編碼慢病毒載體足以在小鼠中提供長(zhǎng)期保護(hù)性免疫。表3:TRIP/sEWNV針對(duì)WNV感染提供長(zhǎng)期保護(hù)免疫WNV抗體抗-WNVFRNT"9oe保護(hù)aWNV抗體抗-WNV載體a效價(jià)b(攻擊前)存活數(shù)/效價(jià)bFRNTS0C(攻擊前)感染數(shù)(攻擊后)(攻擊后)TWP/GFPND《100/3NANATR、PJsE賄30,0002013/13500,000400a.用對(duì)應(yīng)于500ngp24抗原的慢病毒載體顆粒腹膜內(nèi)接種成年129小鼠組。b.用合并的熱滅活血清經(jīng)ELISA測(cè)定。c.FRNT:空斑減少中和試驗(yàn)使WNV的FFU減少至少90。/。的最高血清稀釋度。d.免疫接種后3個(gè)月用1000倍LD50的WNV毒林IS-98-ST1腹膜內(nèi)接種小鼠。記錄21天的存活。ND:未檢測(cè)到(<100)NA:不適用實(shí)施例7:單次小劑量TRIP/sEw!w賦予完全且迅速的保護(hù)。為了確定保護(hù)性疫苗的最小劑量，用1.5ng至500ngp24抗原的寬劑量范圍的TRIP/sEwNv疫苗接種129小鼠組。引發(fā)后一周，用1000倍LDs。的IS-98-ST1WNV腹膜內(nèi)攻擊免疫小鼠。與預(yù)計(jì)一致，所有接受500ngp24的對(duì)照TRIP/GFP載體的小鼠均在攻擊后11-13天內(nèi)死亡。在注射低至50ngp24的單次TRIP/sEwNv載體劑量后獲得了100%保護(hù)。更低的劑量?jī)H賦予部分保護(hù)，從而使我們計(jì)算出成年小鼠中50%保護(hù)性劑量為6.2ngp24抗原(表4)。應(yīng)該注意，這些劑量-保護(hù)實(shí)驗(yàn)在最嚴(yán)格攻擊條件下進(jìn)行，在免疫接種后第7天進(jìn)行早期攻擊，并使用高量的致死性病毒攻擊接種物(1000倍LDs。)。由于總抗體濃度在第7天與第14天之間提高10倍(表1)，因此如果在僅一周后進(jìn)行測(cè)定，則50%保護(hù)性劑量可能甚至低于6.2ng。這些結(jié)果證明，小劑量的載體顆粒在小鼠中實(shí)現(xiàn)迅速且完全的保護(hù)性免疫。這種100%保護(hù)是載體顆粒實(shí)際體內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果。消除慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的熱處理(701C10分鐘)(圖3)也消除了保護(hù)作用(表4)，排除了質(zhì)粒DNA或污染載體原液的殘余sEwNv蛋白賦予保護(hù)的可能性。表4.TRIP/sEWNV針對(duì)WNV感染的劑量依賴性保護(hù)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>a.用單劑量的慢病毒載體顆粒腹膜內(nèi)接種成年129小鼠組。b.引發(fā)后1周用1000倍LD50的WNV毒林IS-98-STl腹膜內(nèi)接種小鼠。記錄21天的存活。c.用合并的熱滅活血清經(jīng)ELISA測(cè)定。d.慢病毒載體顆粒在70°C熱滅活10分鐘。NA:不適用本發(fā)明提供了慢病毒栽體是引發(fā)針對(duì)病原體的保護(hù)性體液免疫應(yīng)答之有效工具的第一個(gè)證據(jù)。除了現(xiàn)已充分描述的其誘導(dǎo)強(qiáng)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力[12-15、17、18、21以外，這一工作拓寬了慢病毒栽體作為針對(duì)病原體的疫苗接種工具的適用性，就此工具而言，中和性體液應(yīng)答是免疫系統(tǒng)的一個(gè)活躍分支。TRIP/sEwNv還能誘導(dǎo)針對(duì)WNV的極早期、長(zhǎng)期持續(xù)的、完全保護(hù)性免疫應(yīng)答，這與小鼠中使用的致死劑量無關(guān)。重要的是，這一免疫是使用小劑量的載體顆粒通過單次免疫實(shí)現(xiàn)的。這些特征使TRIP/sEwNv成為很有前途的針對(duì)WNV的候選疫苗。特別地，對(duì)在WNV爆發(fā)事件中可用于易感動(dòng)物群體的高效獸用疫苗的迫切需求證明動(dòng)物(特別是馬和鳥類)中涉及慢病毒TRIP/sEwnv栽體的試驗(yàn)是有意義的。此外，用基于慢病毒載體的疫苗對(duì)動(dòng)物大群體進(jìn)行預(yù)防性免疫還可作為強(qiáng)有力的毒性和安全性概念證據(jù)，提供了必要的事后認(rèn)識(shí)，并最終為慢病毒載體作為人類預(yù)防性疫苗接種工具的可能用途鋪平道路。一些因素使TRIP/sEWNV慢病毒載體成為用于獸醫(yī)用途的強(qiáng)有力的候選疫苗。首先，所提供的保護(hù)在免疫后很短時(shí)間內(nèi)發(fā)生。這在敏感動(dòng)物的迅速保護(hù)至關(guān)重要的WNV爆發(fā)情況中可能非常重要。這種早期保護(hù)性免疫應(yīng)答的確切性質(zhì)尚未完全闡明。免疫后一周時(shí)IgG抗體還檢測(cè)不到，IgM可能負(fù)責(zé)所觀察到的免疫。已經(jīng)顯示多克隆抗WNV抗體IgM的被動(dòng)轉(zhuǎn)移為小鼠提供針對(duì)WNV攻擊的保護(hù)作用，證明這一同種型在控制早期WNV感染中的關(guān)鍵作用[43。盡管如此，我們不能排除針對(duì)WNV抗原的先天或適應(yīng)性細(xì)胞應(yīng)答對(duì)所觀察保護(hù)作用的貢獻(xiàn)[44。其次，TRIP/sEwNv慢病毒載體以單次小劑量即完全有效。這使得這一候選疫苗很有意義地具有成本效益，并可能允許開發(fā)出大規(guī)模免疫接種的方案，對(duì)家禽保護(hù)特別有意義。很重要的是，需要指出，完全保護(hù)性免疫所需的劑量在我們的小鼠實(shí)驗(yàn)方案中甚至可能被高估。事實(shí)上，已經(jīng)顯示，小鼠細(xì)胞對(duì)慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的允許性低于其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人細(xì)胞(數(shù)據(jù)未顯示和[4、451)。鳥類細(xì)胞顯示高于小鼠細(xì)胞的允許性(數(shù)據(jù)未顯示)，使得可以預(yù)計(jì)少量慢病毒載體疫苗劑量將在家禽中有效。此外，6.2ngp24抗原的TRIP/sEwnv的50%保護(hù)性劑量是在最嚴(yán)格的攻擊條件下計(jì)算的(在免疫接種后第7天早期攻擊，1000倍LDs。的致死劑量)。由于總抗體濃度在第7和14天之間提高10倍，因此如果在僅一周后計(jì)算，則50。/。保護(hù)性劑量將可能甚至低于6.2ng。第三，由于用于假型包裝載體顆粒的VSV-G包膜的廣泛趨向性[37，因此所述慢病毒載體疫苗在理論上可無需改變地用于任何有風(fēng)險(xiǎn)的脊推動(dòng)物物種馬、家禽和動(dòng)物園哺乳動(dòng)物。最后一個(gè)因素是該載體賦予的保護(hù)性免疫是殺滅性的，在WNV攻擊后未發(fā)生病毒復(fù)制。如果該疫苗用于鳥類免疫，則這可能代表一個(gè)重要優(yōu)點(diǎn)。事實(shí)上，盡管相信馬、人和其他哺乳動(dòng)物是WNV感染的終宿主，但已知鳥類是擴(kuò)增宿主，并參與流行的維持[30。此外，最近的文獻(xiàn)顯示，從急性疾病中存活的實(shí)驗(yàn)性WNV感染的倉(cāng)鼠繼續(xù)在尿中散發(fā)傳染性WNV多達(dá)52天[46。如果這可以推而廣之到其他WNV敏感哺乳動(dòng)物中，則殺滅性疫苗對(duì)于控制WNV流行將是決定性的。已經(jīng)提出了用于獸醫(yī)用途的若干WNV疫苗。2003年在美國(guó)得到批準(zhǔn)的一種用于馬的疫苗是滅活并添加佐劑的病毒(FortDodge網(wǎng)址www.equinewestnile.com)。這種滅活制劑在馬中引發(fā)低強(qiáng)度體液應(yīng)答，從而需要數(shù)次注射，其后每年進(jìn)行加強(qiáng)。這種滅活病毒疫苗在智利火烈鳥和紅尾鷹中不引發(fā)中和抗體[47。編碼WNVpreM/E蛋白的重組金絲雀痘也在2004年得到了批準(zhǔn)[48。然而，這一候選也需要5周間隔的兩次注射。這兩種疫苗均不對(duì)經(jīng)免疫接種的馬提供絕對(duì)保護(hù)。還設(shè)想了其他策略如編碼WNVpreM和E蛋白的棵DNA[28。開發(fā)針對(duì)WNV的候選疫苗最主要的是用于人用途。已經(jīng)顯示，表達(dá)WNVE-糖蛋白分泌形式的活麻滲疫苗為小鼠提供針對(duì)WNV腦炎的高效保護(hù)[29。測(cè)試了兩種重組減毒活疫苗嵌合體WNV/黃熱病毒和WNV/4型登革熱病毒(Dengue4)，所述疫苗含有克隆進(jìn)黃熱病毒17D疫苗林或4型登革熱病毒之骨架中的WNVpreM和E基因。小鼠和獼猴中的臨床前研究顯示，兩種疫苗對(duì)WNV攻擊均有保護(hù)性[49-51。然而，使用嵌合體減毒活病毒可能產(chǎn)生安全性問題天然存在的重組黃病毒已經(jīng)證明，不同黃病毒物種之間有可能重組[52、53?；诼《据d體的疫苗用于人或獸用的潛在用途將需要仔細(xì)設(shè)計(jì)栽體以及嚴(yán)格的臨床前安全性研究。關(guān)于使用整合性載體的安全線考慮在最近SCID.X1試驗(yàn)中白血病病例的報(bào)告中得到了證明。這些嚴(yán)重的不良作用與來源于Moloney的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在造血干細(xì)胞中LM02原癌基因附近整合直接相關(guān)[54。然而，慢病毒載體的疫苗接種應(yīng)用具有較低風(fēng)險(xiǎn)。與基于干細(xì)胞的基因治療(其涉及轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的廣泛增殖并在患者一生中維持該基因修飾)相反，疫苗接種情況中的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)相關(guān)抗原，因而是所引發(fā)免疫應(yīng)答的靶標(biāo)。認(rèn)為表達(dá)該抗原的細(xì)胞(無論是不是APC)在數(shù)周或數(shù)月內(nèi)從接種疫苗的生物中被清除。此外，在通過皮下或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行疫苗接種的特定情況下，已經(jīng)顯示VSV-G假型包裝的慢病毒載體顆粒主要耙向DC[13、18，DC是不分裂的專職APC，活化后體內(nèi)半衰期很短。盡管如此，載體細(xì)胞趨向性和免疫接種載體序列缺乏持續(xù)性均需根據(jù)注射途徑和載體劑量而對(duì)每種疫苗接種方案仔細(xì)闡明。慢病毒載體看來是針對(duì)西尼羅病毒(以及可能的其他動(dòng)物傳染病或新出現(xiàn)病原體)進(jìn)行疫苗接種的有前途的工具。在考慮本說明書并實(shí)施本發(fā)明之后，本發(fā)明的其他實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。說明書和實(shí)施例應(yīng)認(rèn)為僅用于示例，本發(fā)明的實(shí)際范圍和構(gòu)思由以下權(quán)利要求表明。參考文獻(xiàn)1.SirvenA,PflumioF,ZennouV,efa/.Thehumanimmunodeficiencyvirustype-1centralDNAflapisacrucialdeterminantfortenfvirafvectornuctearimportandgenetransducttonofhumanhematopoieticstemcells.S/ooof2000:96:4103~4110.2-ZennouV，SergueraC,Sarkisefa/.TheH1V-1DNAflapstimulatesHIVvector-mediatedcelltransductioninthebrain.A/afS/otec/no/2001;19:446-450.3.TakahashiM,MiyoshiH,VermaIM，a/.Rescuefromphotoreceptordege鵬ationirvthemousebyhumanimmiinocl&fici的Gy由smediatedgenetransfer.JWra/1999;73:7812-7816.4.GianniniC,MorosanS，TralhaoJG,s/.Ahighlyefficient,stable,andrapidapproachfor欲vivohuman"VergenetherapyviaaFLAPlentiviralvector.Hepato/ogy2003:38:114-122.5.KootstraNA，MatsumuraR,andVermaiM.EfficientproductionofhumanFVIllinhemophilicmiceusinglentiviralvectors./Wo/7T7er2003;7:623^631.6.KordowerJH,EmborgME'BlochJ,a/,NeurodegenerationpreventedbylentiviralvectordeliveryofGDNFinprimatemodelsofParicinson'sdisease.Sc/ence2000;290:767-773.7.BenhamidaS,PflumioF,Dubart-Kupperschm汰tA,a/.TransducedCD34+cellsfromadrenoleukodystrophypatientswithHIV-derivedvectormediatelong-termengraftmentofNOD/SCIDmice.Mo/The/"2003:7:317-324,8.BiffiA，DePalmaM,QuattriniA,a/.Correctionofmetachromaticleukodystrophyinthemousemodelbytransplantationofgeneticallymodifiedhematopoieticstemcells.JC〃n/nvesf2004;113:1118-1129.9.PawliukR,WestermanKA,FabryME,Correctionofsickleceildiseaseintransgenicmousemodetsbygenetherapy.Science2001;294:2368-2371,10.PuthenveetilG,ScholesJ,CarbonellD,efa/.Successfulcorrectionofthehumanbeta-thalassemiamajorphenotypeusingalentiviralvector.Stood2004;104:3445-3453.11.RalphGS，RaddiffePA,DayDM,a/.SilencingmutantSOD1usingRNAiprotectsagainstneurodegenerationandextendssurvivalinanALSmodel.WafMed2005;11:429-433,12.Bre鄉(xiāng)otDullaersM,BonehillA,a/.Len驗(yàn)allytransducecJdendriticcellsasatoolforcancerimmunotherapy.JMec/2003;5:654-667.13.EsslingerC,ChapatteL,FinkeD,a/.InvivoadministrationofalentiviralvaccinetargetsDCsandinducesefficientCD8(+)Tcellresponses.JC//7/nvesf2003;111:1673-1681.14.EsslingerC,RomeroP,andMacDonaWHR.EfficienttransductionofdendriticcellsandinductionofaT-cellresponsebythird-generationtentivectors.他mGene7T7e/"2002;13:1091-1100.15.FiratH,ZennouV，Garcia—PonsF,efa/.UseofalentiviralflapvectorforinductionofCTLimmunityagainstmelanoma.Perspectivesforimmunotherapy.JG朋eMecf2002;4:38-45.16.HeY，ZhangJ,MiZ,a/.Immunizationwithlentiviralvector-transduceddendriticcelfsinducesstrongandtong-lastingTcellresponsesandtherapeuticimmunity.J//77mw"0/2005:174:3808-3817.17.MetharomP,曰lemKA，SchmidtC,a/.Lentiviralvector-mediatedtyrosinase-relatedprotein2genetransfertodendriticcellsforthetherapyofmelano亂M/m(3,TTer2001;12:2203-2213.18.PalmowskiMJ，LopesL,lkedaY'a/,lnf:ravenousinjectionofalentiviralvectorencodingNY-ESO-1inducesaneffectiveCTLresponse.J//nmt/no/2004;172:1582-1587.19.DyallJ，LatoucheJB,SchnellS,ef3/.Len齢us-transducedhumanmonocyte-deriveddendriticcellsefficientlystimulateantigen-specificcytotoxicTlymphocytes.Stood2001;97:11小121.20.RohrlichPS,GardinauciS,LuleJ'a/.UseofalentMralvectorencodingaHCMV-ctiimericI￡1-pp65proteinfor鄰汰opeide順cationinHUVTransgenicmiceandforexwVostimufationandexpansionofCD8(+)cytotoxicTcellsfromhumanperipheralbJoodcells.M/m/mmw/o/2004:65:514~522,21.ZareiS,AbrahamS'ArrighiJF,af.Le倉(cāng)iraltransductionofdendriticcellsconfersprotectiveantiviralimmunityinvivo.J旨o(jì)/2004;78:7843-7845,22.Vand印DriesscheT，ThorrezL，NalcHnia/,Lentiviralvectorscontainingthehumanimmunodeficiencyvirustype-1centralpolypur'metractcanefficientlytransducenondivjdingh鄰atocytesandantigen-presentingcellsinvivo.8/oocf2002;100:813-822.23.EngteIVU，andDfamondMS.AntibodyprophylaxisandtherapyagainstWestNilevirusinfectioninwild-typeandimmunodeficientmice.JV7ro/2003:77:12941-12949.24.DiamondMS,ShresthaB,MarriA,a/,BcellsandantibodyplaycriticalrolesintheimmediatedefenseofdisseminatedinfectionbyWestNileenc印ha〗ftisvirus.J麵2003;77:2578-2586.25.Ben-NathanD,LustigS,TamG,a/.ProphylacticandtherapeuticefficacyofhumanintravenousimmunoglobulinintreatingWestNilevirusinfectioninmice.J/nfecfO/s2003;188:5-12.26.Beas)eyDW，andBarrettAD.IdentificationofneutralizingepitopeswithinstructuraldomainII!oftheWestNilevirusenvelopeprotein.JV7rof2002;76:13097-13100.27'Wang丁，AndersonJF,Magnare川LA,a/,lmmunfeatfonofmiceagainstV/estNileviruswithrecombinantenvelopeprotein.J//nmy/io/2001;167:5273-5277,28.DavisBS，ChangGJ,CroppB,a/.WestMilevirusrecombinantDNAvaccineprotectsmouseandhorsefromviruschallengeandexpressesinvitroanoninfectiousrecombinantantigenthatcanbeusedinenzyme-linkedimmunosorbentassays.Jl//ro/2001;75:4040-4047,29.DespresP，CombredetC，F(xiàn)renkielMP,a/.LivemeaslesvaccineexpressingthesecretedformoftheWestNilevirusenvelopeglycoproteinprotectsagainstVVestNilevirusencephalitis.J/nfecfD/s2005;191:207-214.30.DauphinG，ZfentaraS,ZellerH,efa/.WestNile:worldwidecurrentsituationinanimalsandhumans.Co/np//77mi//70/AffcroWo//nfecfD/s2004;27:343-355.31.MashimoT,LucasM，Simcm-ChazottesD，a/.Anonsensemutationinthegeneencoding2'-5'-oligoadenylatesyntlietase/L1isoformisassociatedwithWestNilevirussusc鄰tibi附y(tǒng)inlaboratorymice.PracA/af//\cacfSc/USA2002;夢(mèng)9:11311-11316.32.LucasM,Frenkie，MP,MashimoT,a/.TheIsraelistrainIS-98-StlofWestNilevirusasviralmodelforWestNileencephalitisintheOWWorld.33.LanciottiRS，EbelGD,DeubelV'a/.CompletegenomesequencesandphylogeneticanalysisofWestNilevimsstrainsisolatedfromtheUnitedStates,Europe,andtheMiddleEast.V7m/ogy2002;298:96-105.34.CharrelRN，BraultAC,GallianP,甜a/.EvolutionaryrelationshipbetweenOldWorldWestNilevirusstrains,B/idenceforviralgeneflowbetweenAfrica,theMiddleEast,andEurope.ogy2003;315:381-388.35.DespresP,FrenkielMP，andDeubelV.Differencesbetweencellmembranefusionac歸tesoftwodenguetype-1isolatesreflectmodificationsofviralstructure.Wro/ogy1993;196:209-219.36.ZuffereyR,NagyD,MsmddRJ,a/.Multiplyattenuatedienth/iraivectorachievesefficientgenedeliveryinvivo.WafS/otec/7/o/1997;15:871-875.37.YeeJK,MiyanoharaA,LaPorteP,a/.Ageneralmethodforthegenerationofhigh-Hter,pantropicretroviralvectors:highlyeffidentinfectionofprimaryhepatocytes.P/tcA/a//i4catfSc/L/S41994;91:9564-9568.38.ZennouV,PetitC,GuetardD,efa/.HIV-1genomenuclearimportismediatedbyacentralDNAflap.Ce//2000;101:173-185.39.BrusselA，andSonigoP.Analysisofearlyhumanimmunodeficiencyvirustype1DNAsynthesisbyuseofanewsensitiveassayforquantifyingintegratedprovirus.JW/t>/2003:77:10119-10124.40.DespresP，Gr怖nJW,andGriffinDE.Effectsofanti-monoctonalantibodyonsindbisvirusreplicationinAT3cellsexpressingbcl-2.Jl///t)/1995;69:7006-7014.41.DeubelV，F(xiàn)ietteL,GounonP,a/.Variati'onsinbiologicalfeaturesofWestMiteviruses.AmWy>AcadSd2001;訴1:195-206.42.CeccaWiPE，LucasM,andDespresP.Newins^/WsontheneuropathologyofWestNilevirus.F￡/WSM/c廠ob/ofLe汁2004;233:1-6.43.DiamondMS,SitatiEM,FriendLD,a/.Acriticalroleforinducedlg!VIintheprotectionagainstWestNilevirusinfection.JBcp/Wecf2003;198:1853-1862,44.ShresthaB,andDiamondMS.RoleofCD8+TcellsincontrolofWestNilevirusinfection.JWra/2004;78:8312-8321.45.Nguyen丁H,Oberho!zer丄BirrauxJ'efa/.Highlyefficienttentiviralvector-mediatedtransductionofnoncfivi'dfng,fullyreimplanfableprimaryh鄰atocytes.Mo/Tfter2002;6:199-209.46.TonryJH，XiaoSY'SiirinM,a/.PersistentsheddingofWestNilevirusinurineofexperimentailyinfectedhamsters.AmJ77*qpMedHyg2005;72:320-324.47.NusbaumKE,WrightJC，JohnstonWB,a/.Absenceofhumoralresponseinflamingosandred-taitedhawkstoexperimentalvaccinationwithakilledWestNilevirusvaccine.>Av7anD/s2003;47:750-752.48.MitikeJM,Sigerl_,KaracaK,a/.RecombinantcanarypoxvirusvaccinecarryingtheprM/EgenesofWestNilevirusprotectshorsesagainstaWestNilevirus-mosquitochallenge./Arc/Wra/S卿/2004:221-230.49.ArroyoJ,WlHlerC，CatalanJ,efa/.CWmeriVax-WestNileviruslive-attenuatedvaccine:preclinicalevaluationofsafety,immunogenicity,andefficacy.JWro/2004;78:12497-12507.50.PtetnevAG,PutnakR，SpefcherJ,a/.WestNitevfrus/cfenguetype4viruschimerasthatarereducedinneurovirulenceandperipheralvirulencewithoutlossofimmunogenic汰yorprotecth/eefficacy.Proe/Vaf//4caofSc/1/S/\2002;99:3036-3041.51.PletnevAG,ClaireMS,ElkinsR,efa/,Molecularlyengineeredfive-attenuatedchimericWestNile/denguevirusvaccinesprotectrhesusmonkeysfromWestNilevirus.V7m/ogy2003;314:190-195.52.SeligmanSJ,andGouldEA,Liveflavivirusvaccines:reasonsforcaution.La"c甜2004;363:2073-2075.53.GouldEA,MossSR,andTurnerSL.Evolutionanddispersalofencephaliticflaviviruses.Arc/V/V"o/St/pp/2004:65-84.54.Hacein-Bey-AbinaS,VonKalleC,SchmidtM,efa/.LWI02-associatedclonalTcellpro附erationintwopatientsaftergenetherapyforSCID-X1,Sc/e/7ce2003;302:415419.權(quán)利要求1.慢病毒載體用于制備在施用于動(dòng)物時(shí)能產(chǎn)生抗體的藥物的用途，所述慢病毒載體包含編碼抗原的異源核酸，并且其中該抗原在所述動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)在所述動(dòng)物中引發(fā)體液應(yīng)答。2.權(quán)利要求l的用途，其中所述抗原選自表面抗原和膜抗原。3.權(quán)利要求1或2的用途，其中所述體液應(yīng)答在有此需要的動(dòng)物中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫，所述保護(hù)性免疫是長(zhǎng)期持續(xù)的保護(hù)性免疫或殺滅性免疫。4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的用途，其中所述抗原的表達(dá)誘導(dǎo)針對(duì)病原微生物的保護(hù)性免疫。5.權(quán)利要求4的用途，其中所述病原微生物為黃病毒。6.權(quán)利要求5的用途，其中所述病原微生物為西尼羅病毒。7.權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的用途，其中所述異源核酸編碼來自西尼羅病毒的包膜E-糖蛋白、其片段或者來自西尼羅病毒之所述包膜E-糖蛋白的變體。8.權(quán)利要求7的用途，其中所述片段選自缺乏跨膜錨著區(qū)的羧基端截短的西尼羅病毒E糖蛋白和包含西尼羅病毒IS-98-ST1毒林包膜E-糖蛋白中1-441位殘基的羧基端截短的E糖蛋白。9.慢病毒載體以及可接受的生理載體和/或佐劑用于制備針對(duì)微生物感染的疫苗的用途，所述慢病毒載體含有選自以下的異源核酸編碼微生物表面蛋白或其片段以及表面膜蛋白之變體或其片段的異源核酸，所述疫苗可一次或多次對(duì)有此需要的動(dòng)物施用。10.權(quán)利要求9的用途，其中所述微生物為西尼羅病毒，并且其中所述異源核酸編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白、其變體或其片段，并帶有可接受的生理載體和/或佐劑。11.權(quán)利要求9或10的用途，其中所述慢病毒栽體通過腹膜內(nèi)途徑、靜脈內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑、經(jīng)口途徑、粘膜途徑、舌下途徑、皮下途徑、鼻內(nèi)途徑或皮內(nèi)途徑施用。12.權(quán)利要求ll的用途，其中所述慢病毒載體通過肌內(nèi)途徑施用，并且其中所述有此需要的動(dòng)物為馬。13.權(quán)利要求ll的用途，其中所述慢病毒載體通過鼻內(nèi)途徑或皮內(nèi)途徑施用，并且其中所述有此需要的動(dòng)物為人。14.權(quán)利要求9至13中任一項(xiàng)的用途，其中所述異源核酸編碼選自以下的西尼羅病毒包膜E-糖蛋白片段缺乏跨膜錨著區(qū)的羧基端截短的西尼羅病毒E糖蛋白和包含西尼羅病毒IS-98-ST1毒林包膜E-糖蛋白中1-441位殘基的羧基端截短的E糖蛋白。15.權(quán)利要求9至14中任一項(xiàng)的用途，其中所述慢病毒載體施用一次，并包含相當(dāng)于0.5ng至5000ngp24抗原的載體顆粒劑量，優(yōu)選相當(dāng)于0.5ng至50ngp24抗原的載體顆粒劑量，更優(yōu)選相當(dāng)于50ng至500ngp24抗原的載體顆粒劑量。16.包含慢病毒載體及其可藥用載體的免疫原性組合物，其中所述慢病毒載體包含編碼抗原的異源核酸，其量足以在體內(nèi)誘導(dǎo)免疫原性或保護(hù)性應(yīng)答。17.權(quán)利要求16的免疫原性組合物，其中所述異源核酸編碼來自微生物的表面蛋白或其片段。18.權(quán)利要求16的免疫原性組合物，其中所述異源核酸編碼來自黃病毒的包膜E-糖蛋白或其片段。19.權(quán)利要求18的免疫原性組合物，其中所述異源核酸編碼來自西尼羅病毒的包膜E-糖蛋白或其片段。20.權(quán)利要求19的免疫原性組合物，其中所述異源核酸選自編碼缺乏跨膜錨著區(qū)的羧基端截短的西尼羅病毒E糖蛋白的異源核酸、編碼包含西尼羅病毒IS-98-ST1毒林包膜E-糖蛋白中1-441位殘基的羧基端截短的E糖蛋白的異源核酸以及編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白變體的異源核酸。21.指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的慢病毒載體，其中所述異源核酸編碼來自西尼羅病毒的包膜E-糖蛋白、其變體或其片段，并且其中所述栽體包含選自巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、EFla啟動(dòng)子、PGK啟動(dòng)子、SVero啟動(dòng)子和MND啟動(dòng)子的啟動(dòng)子。22.權(quán)利要求21的慢病毒載體，其中所述異源核酸選自編碼缺乏跨膜錨著區(qū)的羧基端截短的西尼羅病毒E糖蛋白的異源核酸以及編碼包含西尼羅病毒IS-98-STl毒林包膜E-糖蛋白中1-441位殘基的羧基端截短的E糖蛋白的異源核酸。23.權(quán)利要求22的慢病毒載體，其中所述載體包含pTRIP/sEwNv。24.基本純化的宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)的慢病毒載體。25.生產(chǎn)西尼羅病毒包膜E-糖蛋白多肽、其變體或其片段的方法，包括在促進(jìn)表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞以及從所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收該多肽。26.指導(dǎo)異源核酸表達(dá)的慢病毒載體，其中所述載體包含巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子，并且其中所述異源核酸包含綠色熒光蛋白。27.基本純化的宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)了權(quán)利要求26的慢病毒載體。28.慢病毒載體用于制備針對(duì)病原體的疫苗的用途，所述'艮病毒載體包含編碼抗原的異源核酸，并且其中該抗原引發(fā)針對(duì)該病原體的抗體，所述疫苗可施用于有此需要的動(dòng)物。29.權(quán)利要求28的用途，其中所述慢病毒載體的施用引發(fā)針對(duì)該病原體的長(zhǎng)期持續(xù)性體液免疫或中和抗體。30.權(quán)利要求28和29中任一項(xiàng)的用途，其中所述慢病毒載體包含編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白或其片段的核酸，并且其中所述病原體為西尼羅病毒。31.權(quán)利要求30的用途，其中所述西尼羅病毒包膜E-糖蛋白缺乏跨膜錨著區(qū)。32.權(quán)利要求28至31中任一項(xiàng)的用途，其中所述慢病毒載體的施用包括至少一個(gè)劑量的相當(dāng)于0.5ng至5000ngp24抗原的載體顆粒。33.權(quán)利要求3、9或28的用途，其中所述有此需要的動(dòng)物選自人、馬、鳥類、家禽、豬、家畜、嚙齒動(dòng)物、寵物和爬行動(dòng)物。34.權(quán)利要求7、9、20或21的用途或者權(quán)利要求25的方法，其中所述異源核酸編碼西尼羅病毒包膜E-糖蛋白的變體，并在嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件下與編碼包膜E-糖蛋白的西尼羅病毒IS-98-ST1毒林之核酸的任一鏈雜交。全文摘要本發(fā)明公開了利用慢病毒載體進(jìn)行引發(fā)體液應(yīng)答的方法、免疫的方法以及疫苗接種的方法。此外，還公開了用于西尼羅病毒的免疫原性組合物和疫苗。文檔編號(hào)C07K14/18GK101291688SQ200680038618公開日2008年10月22日申請(qǐng)日期2006年10月17日優(yōu)先權(quán)日2005年10月17日發(fā)明者皮埃爾·沙爾諾,菲利普·德普雷斯申請(qǐng)人:巴斯德研究所