專利名稱：免疫原性組合物及其使用方法
免疫原性組合物及其使用方法 相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2005年10月25日提交的、申請?zhí)枮?0/729,828的美國臨 時申請的優(yōu)先權(quán)，其全文通過引用合并于此。技術(shù)領(lǐng)域[1]本發(fā)明涉及免疫原性組合物和使用該免疫原性組合物誘導脊椎動 物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法。
背景技術(shù)：
[2]人們發(fā)現(xiàn)，對于某些疾病，機體先與免疫性感染制劑接觸后，可抵 抗以后的感染，自此之后疫苗一直在醫(yī)學領(lǐng)域占據(jù)重要地位。多年來人們 一直使用疫苗使個體產(chǎn)生抗病毒、細菌、真菌和寄生蟲等特定病原體感染 的免疫性，而且還使用疫苗刺激機體產(chǎn)生抗癌細胞上抗原或抗病理原纖維 形成的免疫應(yīng)答的能力。疫苗可以通過口服、靜脈內(nèi)、皮下、透皮、舌下、 肌內(nèi)和鼻內(nèi)等各種給藥方式使用。[3]早期疫苗制備依賴于仍然保留免疫原性的"活"或"死"的病原體。 隨著對特定病原體結(jié)構(gòu)和功能及適應(yīng)性免疫機制的深入了解，設(shè)計更安全 可靠、靶向性更強的疫苗已成為可能。例如，目前使用的抗B型肝炎病毒 疫苗僅僅只使用一部分病毒表面抗原接種，而不必使用整個病原體。使用 這類疫苗不僅能降低副作用，而且能避免產(chǎn)生針對抗原的無益免疫應(yīng)答， 這種應(yīng)答是非保護性應(yīng)答，也就是說，不產(chǎn)生長期免疫力。另外，使用重 組DNA技術(shù)和基因療法，還研制出DNA疫苗，在有利情況下使機體產(chǎn)生 保護性免疫應(yīng)答。[4]使用蛋白質(zhì)抗原(如病毒蛋白或腫瘤特異性抗原)或來源于蛋白質(zhì) 抗原的免疫原性多肽制備疫苗，是一種新型策略，因其毒性低、應(yīng)用廣泛 而有巨大的臨床潛力。但是，使用蛋白質(zhì)疫苗獲得成功的臨床病例極為有 限，部分原因在于該疫苗給藥困難。所以，有必要開發(fā)制備工程多肽抗原 的更有效方法。[5]目前正在評估合成肽疫苗抗細菌、寄生蟲和病毒感染的保護功效。 細菌表位疫苗包括抗霍亂和志賀氏菌感染的疫苗。瘧疾合成疫苗已經(jīng)通過I期和n期臨床試驗。流感和B型肝炎代表兩類病毒系統(tǒng)，合成肽疫苗在這兩類系統(tǒng)中的前景尤其看好，而且最近抗人免疫缺陷病毒-1 (HIV-1)的合 成疫苗的開發(fā)也備受關(guān)注。[6]疫苗中蛋白質(zhì)或肽抗原刺激產(chǎn)生的有利的免疫應(yīng)答包括體液介導 的和細胞介導的免疫。體液部分涉及經(jīng)刺激產(chǎn)生抗體的B細胞，而細胞介 導的部分包括T淋巴細胞。細胞毒性T-淋巴細胞(CTLs)在細胞介導的免 疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，可以使被病毒或細菌感染的細胞裂解。尤其是 CTLs具有細胞表面受體，能識別與MHC-I類或II類分子有關(guān)的外來肽。[7]所以，需要開發(fā)適于將多肽等復合抗原釋放到脊椎動物內(nèi)的方法和 專用釋放平臺。免疫原性多肽的工程技術(shù)和由免疫原性多肽制成的結(jié)構(gòu)體 有望滿足這一需求。最好是，所得免疫原性決定簇的提呈將活化適應(yīng)性免 疫系統(tǒng)的至少某些組成，也就是說，抗原提呈將誘導產(chǎn)生足以抗擊特定抗 原的免疫應(yīng)答，而無論該免疫應(yīng)答是由抗體、細胞毒性T細胞、輔助性T 細胞、天然殺傷細胞或巨噬體，還是由它們的某些組合介導。發(fā)明內(nèi)容[8]在一實施例中，免疫原性組合物包括含兩層或兩層以上聚電解質(zhì)的 多層膜，其中，相鄰層含有相反電荷的聚電解質(zhì)，第一層聚電解質(zhì)包括抗 原性多肽，該抗原性多肽含有與一個或多個抗原決定區(qū)共價連接的一個或 多個表面吸附區(qū)。所述抗原性多肽和一個或多個表面吸附區(qū)具有相同的極 性。所述一個或多個表面吸附區(qū)含有一個或多個氨基酸序列基元(motif)，該基元由5-15個氨基酸構(gòu)成，每個殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4。所述一個或多個抗原決定區(qū)含有3到約250個氨基酸殘基。所述抗原性多肽不 是均聚體，有至少15個氨基酸長，pH4-10時水溶解度大于50pg/mL。另 外，第二層聚電解質(zhì)包括分子量大于1,000、每分子至少5個電荷且電荷與 第一層多肽相反的聚陽離子材料或聚陰離子材料。[9]在另一實施例中，誘導脊椎動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法包含給所述脊 椎動物給用上述免疫原性組合物。


[10]圖1是帶相反電荷多肽的組裝體示意圖。[11]圖2是包含一個抗原決定區(qū)(3)和兩個表面吸附區(qū)(1、 2)的抗 原性多肽， 一個表面吸附區(qū)(1)與所述抗原決定區(qū)(3)的N-端連接，另 一個表面吸附區(qū)(2)與所述抗原決定區(qū)(3)的C-端連接。[12]圖3是利用水相合成法、固相合成法或多肽重組法獨立制備的LBL 抗原性多肽的三個不同區(qū)。[13]圖4是將抗原性多肽(4)的三個區(qū)連在一起的過程。[14]圖5是一個含兩個表面吸附區(qū)(120和130)和一個抗原決定區(qū) (110)的抗原性多肽例。
具體實施方式
[15]本文中，"層"是指厚度增加體，例如用吸附步驟使模板上方厚度 增加以形成膜。"多層"是指多個厚度增加體。"聚電解質(zhì)多層膜"是指包 含一個或多個由聚電解質(zhì)構(gòu)成的厚度增加體的膜。多層膜的各層在沉積后 可能不是離散的層。事實上，尤其是厚度增加體界面間的物質(zhì)可能會有明 顯混合。[16]"聚電解質(zhì)"包括分子量大于1,000、每分子含至少5個電荷的聚陽離子或聚陰離子材料。合適的聚陽離子材料例如包括聚胺。聚胺例如包 括多肽、聚乙烯胺、聚(氨基苯乙烯)、聚(氨基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)、聚(N,N-二甲基氨基丙烯酸 酯)、聚(N,N-二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N-甲基氨基-甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N,N-二甲 基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N,N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(乙烯亞 胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化銨)、聚(N,N,N-三甲基氨基丙烯酸酯氯化 物)、聚(甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化銨)、幾丁質(zhì)和包含前述至少一種 或幾種聚陽離子材料的組合。合適的聚陰離子材料例如包括多肽、核酸、 海藻酸、卡拉膠、帚叉藻膠、果膠、黃原膠、透明質(zhì)酸、肝素、硫酸肝素、 硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸葡聚糖、聚(甲基)丙烯酸、氧化纖維素、 羧甲基纖維素、酸性多糖和交聯(lián)羧甲基纖維素、含有側(cè)鏈羧基的合成聚合 物和共聚物，以及包含前述至少一種聚陰離子材料的組合。[17]"氨基酸"是指多肽的結(jié)構(gòu)單位。本文中，"氨基酸"包括20種 常見的天然存在的L-氨基酸、其它所有天然氨基酸、所有非天然氨基酸和 所有類氨基酸，如類肽(peptoid)。[18]"天然存在的氨基酸"是指20種常見的天然L-氨基酸，即甘氨酸、 丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫 氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、賴氨酸、組氨 酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和脯氨酸。[19]"非天然氨基酸"是指除20種常見天然L-氨基酸之外的氨基酸。 非天然氨基酸可以是L-型或D-型。[20]"類肽"或N-取代的甘氨酸是指相應(yīng)氨基酸單體的類似物，與相 應(yīng)氨基酸的側(cè)鏈相同，但側(cè)鏈是與氨基的氮原子相連，而不是與該殘基的a 碳原子相連。所以，聚類肽單體間的化學鍵不是肽鍵，可用來限制蛋白質(zhì) 水解。[21]"氨基酸序列"和"序列"是指至少兩個氨基酸長的多肽鏈的連續(xù)長度。"殘基"是指多聚體或寡聚體中的氨基酸；它是可形成多聚體的 氨基酸單體的殘基。多肽合成涉及脫水反應(yīng)，也就是說，肽鏈上每增加一 個氨基酸會失去一個水分子。"氨基酸序列基元"是指含有n個殘基的連續(xù)氨基酸序列，n是 5-15。在一實施例中，氨基酸序列基元中每個殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于 0.4。在另一實施例中，氨基酸序列基元中每個殘基的凈電荷數(shù)量大于或等 于0.5。本文中，凈電荷數(shù)量是指凈電荷的絕對值，也就是說，所述凈電荷 可以是正電荷，也可以是負電荷。本文中，"肽"和"多肽"均指通過相鄰氨基酸的oi-氨基和a-羧基 之間形成的肽鍵而相互連接的一系列氨基酸，它們可以含或不含糖基化、 側(cè)鏈氧化或磷酸化等修飾，不過前提是含有這些修飾或缺少這些修飾不會 其破壞免疫原性。本文中"肽"是指肽和多肽或蛋白質(zhì)。"設(shè)計出的多肽"(以下簡稱"設(shè)計多肽")是指含有一個或多個 氨基酸序列基元的多肽，該多肽有至少15個氨基酸長，pH7.0時，相同極 性的帶電殘基和與其極性相反的殘基的數(shù)量差與多肽中殘基總數(shù)的比值大 于或等于0.4。換句話說，多肽中每個殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4。
在一實施例中，pH7.0時，相同極性的帶電殘基和與其極性相反的殘基的數(shù) 量差與多肽中殘基總數(shù)的比值大于或等于0.5。換句話說，多肽中每個殘基 的凈電荷數(shù)量大于或等于0.5。雖然多肽長度沒有絕對上限，但總的來說， 適于ELBL沉積的設(shè)計多肽的實際長度上限為1,000個殘基。"—級結(jié)構(gòu)"是指多肽鏈中連續(xù)的線性氨基酸序列，"二級結(jié)構(gòu)" 是指多肽鏈中基本上規(guī)則的結(jié)構(gòu)類型，通過非共價相互作用(通常為氫鍵) 保持穩(wěn)定。二級結(jié)構(gòu)例如包括a-螺旋、(3-折疊和(3-轉(zhuǎn)角。"多肽多層膜"是指含有上述一條或多條設(shè)計多肽的膜。例如， 多肽多層膜包括含設(shè)計多肽的第一層和含帶有極性與該設(shè)計多肽相反的凈 電荷的聚電解質(zhì)的第二層。例如，如果第一層的凈電荷為負電荷，則第二層的凈電荷為正電荷。第二層含有另一種設(shè)計多肽或另一種聚電解質(zhì)。"基底"是指一種固體材料，具有適于吸附水溶液中聚電解質(zhì)的 表面?；妆砻婊旧峡梢允瞧矫?、球形、棒狀等任何形狀?；妆砻婵?以是規(guī)則或不規(guī)則的面?；卓梢允蔷w，可以是生物活性分子，其尺寸 從納米級到宏觀級大小不等。另外，基底中也可以含一些微小的亞粒子。 基底可以由有機材料、無機材料、生物活性材料或這些材料的組合制成。
基底例如包括但不限于硅晶片；CaC03微?；蛉矍璋芳兹┪⒘５葞щ娔z 體粒子；紅細胞、肝細胞、細菌細胞或酵母細胞等生物細胞；聚苯乙烯或 苯乙烯共聚物等有機聚合物點陣結(jié)構(gòu)體(polymer lattice);脂質(zhì)體；細胞器 和病毒。在一實施例中，基底是人工起搏器、人工耳蝸或支架等醫(yī)療器械。如果在膜形成期間或形成之后，將基底分離，或用其它方式去除， 這時候?qū)⒒追Q為"模板"(用于膜的形成)。模板粒子可以用合適的溶劑 溶解或加熱去除。舉例來說，如果使用部分交聯(lián)的三聚氰胺甲醛模板粒子， 可以用較為溫和的化學方法，如使用DMSO或改變pH值來溶解模板。模 板粒子溶解后，留下由聚電解質(zhì)層交替構(gòu)成的中空多層外殼。"微膠囊"是指中空外殼形式或包覆核心的涂層形式的聚電解質(zhì) 膜。所述核心含有各種不同的膠囊填充劑，如蛋白質(zhì)、藥物或其組合。"生物活性分子"是指有生物學效應(yīng)的分子、大分子或大分子組 裝體。利用合適的試驗，并經(jīng)每單位重量或每分子標準化后，可以測出生 物活性分子的特定生物學效應(yīng)?？梢詫⑸锘钚苑肿友b入膠囊、固定在后 面或者置于聚電解質(zhì)膜內(nèi)。生物活性分子例如包括但不限于藥物、藥物晶 體、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)功能片段、復合蛋白、脂蛋白、寡肽、寡核苷酸、核 酸、核糖體、活性治療劑、磷脂、多糖、脂多糖。本文中，"生物活性分子" 進一步包括有生物活性的結(jié)構(gòu)組成，如功能性膜碎片、膜結(jié)構(gòu)組成、病毒、 病原體、細胞、細胞團和細胞器。能被封裝在膠囊內(nèi)或固定在多肽膜后面 的蛋白質(zhì)例如有血紅球蛋白；葡萄糖氧化酶、脲酶和溶菌酶等酶；纖維連 接蛋白、層粘蛋白、玻連蛋白和膠原蛋白等胞外基質(zhì)蛋白；以及抗體。能 被封裝在膠囊內(nèi)或固定在多肽膜后面的細胞例如包括移植胰島細胞、真核細胞、細菌細胞、植物細胞和酵母細胞。"生物相容性"是指經(jīng)口服、局部給藥、透皮給藥、皮下注射、 肌內(nèi)注射、吸入、植入或靜脈內(nèi)注射后不會對健康產(chǎn)生實質(zhì)性的不良影響。 例如，生物相容性膜包括那些與免疫系統(tǒng)(如人的免疫系統(tǒng))接觸后不會 引起實質(zhì)性免疫應(yīng)答的膜。"免疫應(yīng)答"是指細胞或體液免疫系統(tǒng)對體內(nèi)任何部位出現(xiàn)的物
質(zhì)所產(chǎn)生的反應(yīng)。免疫應(yīng)答可以表現(xiàn)為很多方式，如血流中識別某種抗原
的抗體數(shù)量增加?？贵w是由B細胞分泌的蛋白質(zhì)，而抗原是誘導產(chǎn)生免疫 應(yīng)答的物體。人體通過增加血流或其它部位的抗體數(shù)量來抵抗感染和抑制 再感染。"抗原"是指進入易受感染的脊椎動物組織內(nèi)，誘導機體產(chǎn)生免 疫應(yīng)答(如產(chǎn)生特異性抗體分子)的外來物質(zhì)，含有一個或多個表位?？?原可以是單純的一種物質(zhì)或者是不同物質(zhì)的混合物(包括細胞或細胞片 段)?？乖ê线m的抗原決定簇、自身抗原(auto-antigen)、自體抗原 (self-antigen)、交叉反應(yīng)抗原、變應(yīng)原、耐受原、半抗原、免疫原或它們 的一部分及其組合，這些術(shù)語可以互換使用。抗原一般具有高分子量，通 常為多肽。 一般把能誘導機體產(chǎn)生強免疫應(yīng)答的抗原稱為強免疫原性抗原。 抗原上可與互補抗體特異性結(jié)合的位點稱為表位或抗原決定簇。"抗原性"是指一種組合物產(chǎn)生特異性抗體或產(chǎn)生細胞介導的免 疫應(yīng)答的能力。本文中，"表位"和"抗原決定簇"可互換使用，是指被抗體識別 的抗原(如蛋白質(zhì)或設(shè)計肽)的結(jié)構(gòu)或序列。表位通常位于蛋白質(zhì)表面。"連 續(xù)表位"是指表位中包括的若干氨基酸殘基相互連接、而不是在折疊蛋白 中碰巧接觸或處于有限的空間區(qū)域內(nèi)。"構(gòu)象表位"所含的氨基酸殘基來源 于蛋白質(zhì)線性序列的不同部分，它們在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中相互接觸?？乖?和抗體間要發(fā)生有效的相互作用，必須要有容易結(jié)合的表位。所以，表位 或抗原決定簇存在于抗原的天然細胞環(huán)境中，或者僅在變性時暴露出來，其天然形式可以是細胞質(zhì)型(可溶)、膜相關(guān)型或分泌型。表位的數(shù)量、位 置和大小取決于抗體制備過程中的抗原數(shù)量。本文中，"疫苗組合物"是指向哺乳動物給用該組合物后能誘導機 體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，并能保護被免疫生物，抵抗以后由免疫劑或免疫性交叉 反應(yīng)劑引發(fā)的挑戰(zhàn)。與未經(jīng)疫苗接種的生物體相比，這種保護作用可表現(xiàn) 為完全或部分減輕癥狀或感染。免疫性交叉反應(yīng)劑例如可以是，其亞肽已 被用作免疫原的整個蛋白質(zhì)(如葡糖基轉(zhuǎn)移酶)?；蛘撸庖咝越徊娣磻?yīng)劑 可以是能被免疫劑誘導產(chǎn)生的抗體全部或部分識別的不同蛋白質(zhì)。本文中，"免疫原性組合物"是要包括那些經(jīng)給用生物體后誘導機
體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的組合物，這些組合物可以或者不可以保護被免疫哺乳動 物抵抗以后由免疫劑引起的挑戰(zhàn)。在一實施例中，免疫原性組合物是疫苗 組合物。本發(fā)明包括含聚電解質(zhì)多層膜的疫苗組合物和免疫原性組合物， 該多層膜含有帶電荷的抗原性多肽，其具有一個或多個抗原決定簇。聚電解質(zhì)多層膜是由帶相反電荷的聚電解質(zhì)交替層構(gòu)成的薄膜 (如幾納米到幾毫米厚)。在合適的基底上進行層疊組裝，可以形成這類膜。 靜電層疊自組裝工藝(ELBL)中，靜電是聚電解質(zhì)結(jié)合的物理基礎(chǔ)。由于 連續(xù)層層積時膜表面電荷密度符號逆轉(zhuǎn)，所以可能形成積層膜。帶相反電 荷聚離子的ELBL沉積的一般原理如圖1所示。鑒于ELBL膜工藝的一般 原理和相對簡單的特點，可以將許多不同類型的聚電解質(zhì)沉積到許多不同 類型的表面上。多肽多層膜屬于聚電解質(zhì)多層膜，包含至少一個含帶電多 肽的層。多肽多層膜的主要優(yōu)點是環(huán)保。ELBL膜還可以用于膠囊制備工藝。 多肽膜和微膠囊的應(yīng)用例如包括納米反應(yīng)器、生物感應(yīng)器、人工細胞和藥 物釋放載體。美國專利(公開號2005/0069950)中闡述了適用靜電層疊沉積的 多肽的設(shè)計原理，這里通過引用將其并入本文。簡單地說，設(shè)計中主要考 慮的因素是多肽長度和電荷。靜電是設(shè)計所要考慮的最重要因素，這是因為它是ELBL的基礎(chǔ)。多肽如果沒有合適的電荷特性，則基本上不溶于 pH4-10的水溶液，而且在用ELBL制造多層膜時，使用起來較為費勁。其 它考慮因素包括多肽的物理結(jié)構(gòu)、多肽所形成的膜的物理穩(wěn)定性，以及膜 與構(gòu)成膜的多肽的生物相容性和生物活性。如上所述，設(shè)計多肽是指包含一個或多個氨基酸序列基元的多肽， 其中，所述多肽有至少15個氨基酸長，pH7.0時，每個殘基的凈電荷數(shù)量 大于或等于0.4。"氨基酸序列基元"是指含n個殘基的連續(xù)氨基酸序列， 其中n是5-15。 pH7.0時，天然的正電荷氨基酸(堿性)是Arg、 His禾n Lys， 天然的負電荷氨基酸(酸性)是Glu和Asp。可以使用含相反電荷氨基酸殘 基的氨基酸基元，只要整個電荷比例滿足以上規(guī)定的標準即可。在一實施 例中，設(shè)計多肽不是均聚體。在一典型實施例中，氨基酸序列基元含7個氨基酸。長7個氨基 酸的基元中含4個帶電氨基酸是比較合適的最小值，因為少個4個電荷， 肽的可溶性和ELBL的可控性會降低。而且，關(guān)于生物相容性，基因組數(shù) 據(jù)中述及的各氨基酸序列基元都比7個氨基酸長，足以構(gòu)成連續(xù)表位，但 并沒有長到基本上與蛋白質(zhì)表面和其內(nèi)部的殘基相對應(yīng)。所以，氮基酸序 列基元的電荷和長度有助于確?；蚪M數(shù)據(jù)中提到的序列基元有可能出現(xiàn) 在該序列基元所來源的折疊蛋白表面上。相反，非常短的序列基元在機體 看來有可能是隨機序列，或者是非特定"自體"的隨機序列，從而會誘導 免疫應(yīng)答。某些情況下，關(guān)于氨基酸序列基元和設(shè)計多肽的設(shè)計考慮因素是 其形成二級結(jié)構(gòu)尤其是a-螺旋或(3-折疊的傾向。某些實施例中，最好能控 制水介質(zhì)中設(shè)計多肽形成二級結(jié)構(gòu)的可能性，如最大程度降低這種可能性， 以便盡可能地控制薄膜層形成工藝。首先，最好是序列基元較短，約5-15 個氨基酸，因為長基元在溶液中更有可能形成穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)。第二，設(shè) 計多肽中共價連接連續(xù)氨基酸序列基元的接頭，如甘氨酸或脯氨酸殘基會 降低多肽在水溶液中形成二級結(jié)構(gòu)的傾向。例如，甘氨酸的a-螺旋和(3-折 疊傾向性非常低，這非常不利于甘氨酸和其相鄰氨基酸在水溶液中形成規(guī)則二級結(jié)構(gòu)。第三，選擇(X-螺旋總體傾向性小于7.5、 |3-折疊總體傾向性小
于8的氨基酸序列基元，將設(shè)計多肽本身的(x-螺旋和(3-折疊傾向性降到最 低。"總體"傾向性是指基元中所有氨基酸的a-螺旋或P-折疊的傾向性總和。 ci-螺旋和/或P-折疊的總體傾向性稍高的氨基酸序列基元適用于ELBL，尤 其是由Gly或Pro等接頭連接時更是如此。某些應(yīng)用中，如果作為薄膜制造 中特定設(shè)計特征，多肽形成二級結(jié)構(gòu)的傾向可以較高。用Chou和Fasman 法(參見P. Chou and G. Fasman Biochemistry 13:211 (1974)，全文通過引用 合并于此)可以計算出所有20種天然存在的氨基酸的二級結(jié)構(gòu)傾向性。多肽ELBL膜的穩(wěn)定性控制是要考慮的另一設(shè)計因素。離子鍵、 氫鍵、范德華力和憎水作用都有助于多層膜的穩(wěn)定性。另外，同一層內(nèi)或 相鄰層中多肽的含巰基氨基酸之間形成的共價二硫鍵可以增加結(jié)構(gòu)強度。 含巰基的氨基酸包括半胱氨酸和同型半胱氨酸。另外，可以往P-氨基酸中 加入巰基，如D,L-P-氨基-(3-環(huán)己基丙酸、D，L-3-氨基丁酸或5-(甲基硫代)-3-氨基戊酸。使用含巰基的氨基酸，通過改變氧化電位，可以將多肽多層膜 各層"鎖住"(結(jié)合在一起)和"脫離"。另外，設(shè)計多肽中序列基元中加 入含巰基的氨基酸后，由于分子內(nèi)形成二硫鍵，所以薄膜制造中可以使用 較短的肽?？梢允褂孟旅鏀⑹龅姆椒◤幕膸熘羞x取包括含巰基氨基酸 的氨基酸序列基元，或者可以從頭設(shè)計。在一實施例中，將無論是化學合成還是宿主體內(nèi)產(chǎn)生的含巰基的 設(shè)計多肽，在用于防止二硫鍵過早形成的還原劑存在條件下，采用ELBL 法進行組裝。然后除去還原劑，再加入氧化劑。氧化劑使巰基之間形成二 硫鍵，從而將層內(nèi)多肽"鎖"在一起，而且存在硫醇基團時還會將各層之 間的多肽"鎖"在一起。合適的還原劑包括二硫蘇糖醇("DTT")、 2-巰基 乙醇(2-ME)、還原谷胱甘肽、三(2-甲酰乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)和前 述一種以上化學物質(zhì)的組合。適合的氧化劑包括氧化谷胱甘肽、叔丁基過 氧化氫(t-BHP)、硫柳汞、肼、5,5'-二硫代-雙-(2-硝基-安息香酸)(DTNB)、 4，4'-二硫代二吡啶、溴酸鈉、過氧化氫、連四硫酸鈉、porphyrindin、鄰碘 苯甲酸鈉，及前述一種以上化學物質(zhì)的組合。[47]生物相容性是生物藥學應(yīng)用中所考慮的一個因素。這類應(yīng)用中， 首先利用作為多聚體設(shè)計基礎(chǔ)的基因組或蛋白質(zhì)信息，得到我們需要的"免 疫惰性"多肽。如果制造產(chǎn)物或包有涂層的物體會與循環(huán)血接觸，則這一 方法特別有用。由于氨基酸序列基元的極性較高，所以它們通常位于其來 源蛋白質(zhì)天然折疊結(jié)構(gòu)的表面。"表面"是指折疊蛋白質(zhì)中與溶劑接觸或因 水的微粒性而難以單獨靠近溶劑的那一部分。已鑒定出的血液蛋白氨基酸 序列基元在血液中總是能與細胞有效接觸。所以，來源于血液折疊蛋白質(zhì) 的多肽有免疫原性的可能性低于隨機選擇的序列。設(shè)計多肽一般都有生物 相容性，但免疫應(yīng)答或其它任何類型的生物應(yīng)答所達到的程度可能完全取 決于序列基元的特定細節(jié)?？梢杂煤芏喾椒ㄊ鼓?、涂層或微膠囊具備生物活性。例如，膜所
含的設(shè)計多肽可以含有功能域?；蛘?，具有多肽薄膜涂層或裝在多肽薄膜 膠囊內(nèi)的其它生物活性分子也可能有生物活性。在一實施例中，所述模板 包含蛋白晶體等生物活性分子。這里提到的功能域是指蛋白質(zhì)中一段有特定生物功能(如結(jié)合磷 酸化酪氨酸)的獨立耐熱區(qū)域。多結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)中可能存在多功能域，例 如，張力蛋白中就包含磷酸酪氨酸結(jié)合域和蛋白酪氨酸磷酸酶域。多層膜 內(nèi)加入的設(shè)計多肽中包含功能域，可以使該膜具備與特異性配體結(jié)合、體 內(nèi)靶定、生物感應(yīng)和生物催化等所需功能。生物活性分子可以是蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)功能片段，非設(shè)計多肽構(gòu)成 部分的蛋白質(zhì)功能片段、復合蛋白、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖體、活 性治療劑、磷脂、多糖、脂多糖、功能性膜碎片、膜結(jié)構(gòu)組成、病毒、病 原體、細胞、細胞團、細胞器、脂、碳水化合物、藥物或抗菌劑。生物活 性分子可以是規(guī)則排列的結(jié)晶型或無定形。所述蛋白質(zhì)可以是酶或抗體。 所述基底可以包含這類生物活性分子。在一實施例中，在相反電荷的多肽 層沉積前，基底表面含有生物活性分子。在另一實施例中，基底是含生物 活性分子的晶體。在一實施例中，氨基酸序列基元采用從頭設(shè)計。在另一實施例中，氨基酸序列基元選自特定生物的基因組或蛋白質(zhì)組信息，如人的基因組。
例如，可以利用補體C3 (gi|68766)或乳轉(zhuǎn)鐵蛋白(gi|4505043)的一級結(jié) 構(gòu)，從人血液蛋白中檢索氨基酸序列基元。鑒定多肽內(nèi)第一個氨基酸序列基元的方法包含選擇多肽的起始 氨基酸殘基；檢查多肽內(nèi)含該起始氨基酸殘基和后面n-l個(即n減O 氨基酸殘基的氨基酸序列中存在的正電荷和負電荷，其中n是5-15;如果 pH7.0時，這5-15個氨基酸殘基側(cè)鏈的凈電荷大于或等于0.4xn，則將這些
氨基酸殘基確定為氨基酸序列基元；或者，如果pH7.0時，這5-15個氨基 酸殘基側(cè)鏈的凈電荷小于0.4xn，則舍棄該序列。下面敘述在一實施例中從氨基酸序列數(shù)據(jù)中檢索含n個氨基酸、 僅包含中性或負電荷氨基酸的負電荷氨基酸序列基元的方法。第一步，從 蛋白質(zhì)序列中選擇起始氨基酸殘基。第二步，檢査起始氨基酸殘基和后面n
-l個氨基酸殘基中是否含有精氨酸、組氨酸或賴氨酸(中性pH時，這三 種天然存在的氨基酸可能帶有正電荷)，其中n是5-15。第三步，如果發(fā)現(xiàn) 這n個氨基酸殘基中有一個或多個精氨酸、組氨酸或賴氨酸，則從第二個 氨基酸殘基重新開始上述步驟。但如果這n個氨基酸中不含精氨酸、組氨 酸或賴氨酸，則檢查并確定n個氨基酸殘基中谷氨酸(Glu)和/或天冬氨酸
(Asp)(中性pH時這兩個氨基酸帶負電荷)出現(xiàn)的數(shù)量。第四步，如果這 n個殘基中有至少0.4xn個Glu和/或Asp，則將該序列歸類為負電荷氨基酸 序列基元。但如果發(fā)現(xiàn)負電荷氨基酸數(shù)量少于0.4xn個，則舍棄從第一個氨 基酸殘基開始的序列，然后再重新開始以上步驟，例如，立即從與第一個 氨基酸殘基相鄰的第二個氨基酸殘基開始以上步驟。將基元歸好類后，再 從第二個氨基酸殘基開始，重復以上步驟。鑒定正電荷序列基元的方法大致是從蛋白序列數(shù)據(jù)中檢索僅含中 性或正電荷氨基酸、n個氨基酸長而且中性pH時這些氨基酸殘基側(cè)鏈的凈 電荷數(shù)量大于或等于0.4xn的氨基酸序列。鑒定含n個氨基酸、允許同時存在正電荷和負電荷氨基酸殘基的 負電荷氨基酸序列基元或正電荷氨基酸序列基元的方法也差不多類似。例如，鑒定含n個氨基酸的正電荷氨基酸序列基元的步驟也是從多肽中選擇
起始氨基酸殘基。然后，檢査該氨基酸殘基和后面n-l個氨基酸殘基中是 否有pH7時帶正電荷或負電荷的殘基。確定這n個氨基酸殘基側(cè)鏈的凈電 荷數(shù)。如果凈電荷的絕對值小于0.4xn，則舍棄該序列，從另一個氨基酸重 新開始檢索。但如果凈電荷的絕對值大于或等于0.4xn，則該序列為一個氨 基酸序列基元。若凈電荷大于O，該基元為正電荷基元，若小于O，該基元 為負電荷基元。本文述及的氨基酸序列基元的從頭設(shè)計方法與上面的原理大體相
同，不同在于所設(shè)計的序列并不限于天然發(fā)現(xiàn)的序列。首先，選擇基元
長度n和所需的凈電荷符號和數(shù)量。然后，選定n個能作為氨基酸序列基 元而得到所需電荷符號和數(shù)量的氨基酸，這n個氨基酸的凈電荷絕對值大 于或等于0.4xn。從頭設(shè)計氨基酸序列基元的潛在優(yōu)點是，操作者可以從所 有氨基酸(20種天然存在的和所有非天然的氨基酸)中挑選以獲取所需的 凈電荷，而不僅限于特定已知氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)的那些氨基酸。與從基因 組序列中鑒定氨基酸基元相比，大型氨基酸池擴大了基元序列設(shè)計時可供 選擇的物理、化學和/或生物學特征的潛在范圍。本文所述的設(shè)計多肽包含一個或多個氨基酸序列基元。設(shè)計用于 ELBL的多肽時，可以重復同一基元，或者將不同基元連在一起。在一實施 例中，氨基酸序列基元之間共價連接，無插入序列。在另一實施例中，設(shè) 計多肽包含兩個或兩個以上由接頭共價連接的氨基酸序列基元。該接頭可 以是氨基酸型接頭，如一個或多個氨基酸殘基，如賴氨酸或脯氨酸，或者 可以是適于共價連接兩個氨基酸序列基元的其它任何化合物。在一實施例 中，接頭包含l-4個氨基酸，如1-4個賴氨酸和/或脯氨酸殘基。該接頭包 含合適的長度或組成，使設(shè)計多肽中每個殘基的凈電荷大于或等于0.4。在一實施例中，設(shè)計多肽的長度大于或等于15個氨基酸殘基。在 其它實施例中，設(shè)計多肽的長度大于18、 20、 25、 30、 32或35個氨基酸。 聚合物長度的實際上限為1,000個殘基。氨基酸序列基元被選出或從頭設(shè)計后，即可利用本領(lǐng)域熟知的方法，如固相合成和F-moc化學合成法，或者通過基因克隆、轉(zhuǎn)化及細菌異
源表達的方法，合成帶有氨基酸型接頭的設(shè)計多肽。可以委托肽合成公司
如SynPep公司(Dublin, California),在實驗室內(nèi)用肽合成器合成，或者采 用重組DNA的方法合成。任何新型開發(fā)的肽合成法可能會增加肽的產(chǎn)量， 但對本文所述的肽設(shè)計程序應(yīng)該不會有實質(zhì)性改變。制作設(shè)計多肽多層膜的方法包含將多層帶相反電荷的化學物質(zhì) 沉積到基底上，其中至少一個層含有設(shè)計多肽。依次沉積的聚電解質(zhì)的凈 電荷相反。圖1是ELBL沉積的示意圖。在一實施例中，設(shè)計多肽(或其 它聚電解質(zhì))的沉積過程包括將基底暴露在含設(shè)計多肽(或其它聚電解質(zhì))、 pH值使設(shè)計多肽凈電荷適于ELBL的水溶液中。在另一實施例中，將設(shè)計 多肽或其它聚電解質(zhì)沉積到基底上的方法是將帶有相反電荷的多肽溶液先 后噴涂到基底上。在其它實施例中，沉積到基底上的方法是將帶有相反電 荷的多肽溶液同時噴涂到基底上。形成多層膜的ELBL法中，相鄰層的相反電荷能驅(qū)動組裝發(fā)生。 關(guān)鍵因素不是相對層中聚電解質(zhì)的凈線性電荷密度相同，而是相對層帶有 相反電荷。 一種通過沉積進行的標準膜組裝程序包括形成聚離子水溶液， pH為使聚離子以離子形式存在的值(即pH4-10)，選用帶有表面電荷的基 底，將基底交替浸入帶電荷的聚電解質(zhì)溶液內(nèi)。視情況可以在交替層沉積 步驟之間洗漆基底。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易確定適于聚離子沉積的聚離子濃 度。典型的濃度為0.1-10mg/mL。制出的層厚通常與沉積時所述聚離子溶液 濃度范圍基本上無關(guān)。對于典型的非多肽聚電解質(zhì)如聚(丙烯酸)和聚(烯 丙胺鹽酸鹽)，層厚通常約3-5A，具體視溶液離子強度而定。較短電解質(zhì)通 常比較長電解質(zhì)形成的層薄。聚電解質(zhì)膜的厚度與濕度、層數(shù)和構(gòu)成膜的 組合物有關(guān)。例如，50nm厚的PLL/PLGA經(jīng)氮氣干燥后收縮到1.6nm。通 常可以形成l-100nm或更厚的膜，具體取決于膜的水合狀態(tài)和組裝體中聚 電解質(zhì)的分子量。另夕卜，形成穩(wěn)定聚電解質(zhì)多層膜所需的層數(shù)與膜內(nèi)聚電解質(zhì)相關(guān)。對僅含有低分子量多肽層的膜來說，通常要有4個或4個以上相反電荷多
肽雙層。而對于含高分子量聚電解質(zhì)如聚(丙烯酸)和聚(烯丙胺鹽酸鹽) 的膜來說，僅含一個帶相反電荷聚電解質(zhì)的雙層是比較穩(wěn)定的。本發(fā)明還涉及通過提呈任何能誘導免疫應(yīng)答的蛋白或肽，來誘導 機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在一實施例中，抗原是對特定感染疾病物質(zhì)產(chǎn)生強免 疫應(yīng)答的關(guān)鍵表位，即免疫優(yōu)勢表位。需要的話，為了提高免疫應(yīng)答的可 能性，免疫原性組合物中可以包括一個以上的抗原或表位。在一實施例中，多層膜包括含有與一個或多個抗原決定區(qū)共價結(jié) 合的一個或多個表面吸附區(qū)的第一抗原性多肽層，其中，所述第一抗原性 多肽層和一個或多個表面吸附區(qū)的凈極性相同。所述表面吸附區(qū)包含一個 或多個氨基酸序列基元。第一抗原性多肽層的多肽長度至少為15個氨基酸， pH4-10時在水溶液中的溶解度大于50)Lig/mL。在一實施例中，所述一個或 多個表面吸附區(qū)和一個或多個抗原決定區(qū)的凈極性相同。在另一實施例中， 第一層的抗原性多肽在pH4-10時的溶解度大于或等于約lmg/mL。溶解度 是對促進水溶液中多肽沉積的實際限制因素。抗原性多肽聚合程度的實際 上限是約1000個殘基。但是，采用合適的合成法合成更長的合成多肽也不 是沒有可能。在一實施例中，抗原性多肽包含一個抗原決定區(qū)(3)，被兩側(cè)的 N-端表面吸附區(qū)(1)和C-端表面吸附區(qū)(2)夾在中間(圖2)?？乖远嚯牡母鳘毩^(qū)(如抗原決定區(qū)(1)和表面吸附區(qū)(2、 3)) 可以采用液相合成法、固相合成法，或合適宿主的基因工程法單獨合成(圖 3)。液相合成法是目前市場上大多數(shù)批準使用的肽類藥物所用的制備方法。 這一方法可用來合成較長的肽和甚至較小的蛋白質(zhì)。降鈣素是用液相合成 法合成的最長肽G2mers)。使用該方法制備較小或幾百公里中等長度的肽 更為普通。制造工藝優(yōu)良的設(shè)備中有可能制出像這樣大量的所需肽。或者，可以使用溶液合成法、固相合成法，或合適宿主的基因工 程法將各個不同獨立區(qū)作為一條多肽鏈來一起合成。特定情況下選用何種方法將視簡便性或經(jīng)濟成本而定。如果要單獨合成各抗原決定區(qū)和表面吸附區(qū)(圖3)，則例如先后 用離子交換色譜、高效液相色譜法純化各部分，然后用肽鍵合成法將它們
連在一起(圖4)。 B卩，N-端表面吸附區(qū)(1)、抗原決定區(qū)(3)和C-端抗 原決定區(qū)(2)共價連接成抗原性多肽(4)。其方法類似于所謂的雜合法 (hybrid synthesis),這一方法中，先用固相技術(shù)合成側(cè)鏈被完全保護的肽 段，然后在液相或固相程序中通過肽鍵將其連接。這一雜合法已用于T2( — 段含36個氨基酸殘基的肽)的合成，但尚未普及。圖5是含兩個表面吸附區(qū)(120和130)和一個抗原決定區(qū)(110) 的抗原性多肽實施例。120是N-端表面吸附區(qū)。130是C-端吸附區(qū)。各表 面吸附區(qū)包含一個或多個氨基酸序列基元?？乖远嚯氖且粭l多肽鏈中表 面吸附區(qū)與抗原決定區(qū)之間的獨特組合。接頭的肽序列(140)可用于在一 條多肽鏈中產(chǎn)生含抗原決定區(qū)的復合多肽。在一實施例中，抗原決定區(qū) (110)是約含50-130個氨基酸殘基的小功能區(qū)，直徑約2nm。在另一實施 例中，抗原決定區(qū)(110)是約含250個氨基酸殘基的大功能區(qū)，直徑約4證。 在伸展結(jié)構(gòu)中16個氨基酸殘基的長度約5.5nm。在一實施例中，抗原性多肽包含一個抗原決定區(qū)和一個表面吸附 區(qū)，其中，表面吸附區(qū)包含兩個氨基酸序列基元。在另一實施例中，抗原 性多肽包含一個抗原決定區(qū)和兩個表面吸附區(qū)， 一個表面吸附區(qū)與抗原決 定區(qū)的N端連接，另一個表面吸附區(qū)與抗原決定區(qū)的C端連接，其中，各 表面吸附區(qū)包含一個或多個氨基酸序列基元，所述兩個表面吸附區(qū)相同或 不同，有相同極性(圖2)。表面吸附區(qū)的作用是在構(gòu)建多層膜時，使多肽 能吸附到帶相反電荷的表面上?？乖远嚯闹校砻嫖絽^(qū)的數(shù)量與抗原決定區(qū)的數(shù)量和/或長度 的比值與溶解度需求相關(guān)。例如，如果抗原決定區(qū)是一個例如含3個氨基 酸殘基的短氨基酸序列，則僅需要一個含至少12個氨基酸殘基的氨基酸序 列基元，將抗原性多肽吸附到帶合適電荷的表面上。反之，如果抗原決定 區(qū)是蛋白質(zhì)的水溶性折疊結(jié)構(gòu)域，例如含有120個氨基酸殘基，則一般兩個氨基酸序列基元就足以使抗原性多肽帶有充足電荷而具有水溶性并能夠 吸附。兩個基元可能相互挨著，位于結(jié)構(gòu)域的N端，或者相互挨著，位于 結(jié)構(gòu)域的C端，或者不挨著， 一個在N端，另一個在C端。與抗原性多肽中抗原決定區(qū)的氨基酸殘基數(shù)相比，表面吸附區(qū)的
總長度更受熱能耗散的影響，而對于同時進行的抗原性多肽吸附來說，必
須克服這種影響。所以，將抗原決定區(qū)的聚合程度增加2倍，對抗原性多 肽的表面吸附區(qū)的有效連接來說，并不一定需要將表面吸附區(qū)加長2倍。
抗原性多肽與一表面吸附的物理基礎(chǔ)是靜電引力(和向本體溶液釋放相反 電荷離子)，對納米級長度來說結(jié)構(gòu)域的精確質(zhì)量是第二重要因素，并且， 熱能是抵消抗原性多肽吸附的主要"作用力"。鑒于此，本領(lǐng)域的技術(shù)人員 可以很容易地設(shè)計適于與特定目標抗原決定區(qū)的表面發(fā)生物理吸附的表面 吸附區(qū)。抗原決定區(qū)包含3到約250個氨基酸殘基?？乖瓫Q定區(qū)同時包括 抗原性基元和抗原性結(jié)構(gòu)域?？乖曰^短，所以一般不存在緊密的三 維折疊結(jié)構(gòu)；但它們能表現(xiàn)出特定抗原性。雖然抗原性基元一般沒有緊密 的三維折疊結(jié)構(gòu)，但它們可以含有二級結(jié)構(gòu)特征，如cx-螺旋和卩-折疊?？?原決定區(qū)若是抗原性基元時，通常包含3到約50個氨基酸殘基；若是抗原 性結(jié)構(gòu)域時，通常含約50-250個氨基酸殘基。本文中，抗原性結(jié)構(gòu)域是指至少一部分多肽，該多肽在折疊時會 產(chǎn)生自己的憎水核。例如，天然蛋白質(zhì)可以含有多個結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域 都是獨立的結(jié)構(gòu)和功能單位。 一個域的生物功能與另一個域的功能完全獨 立，就像同一個多肽鏈中含有催化域和結(jié)合域一樣，這兩個域彼此間完全 不發(fā)生相互作用。天然蛋白中，域之間的結(jié)構(gòu)相互作用不僅有可能，而且 相對普遍；這種情況下， 一個結(jié)構(gòu)域與另一個結(jié)構(gòu)域之間的相互作用可看 作是一種四級結(jié)構(gòu)。本文中，抗原性域通常最少約含50個，最多約含250個氨基酸殘 基。原則上，只要本文所述抗原性多肽的水溶性適于ELBL沉積，則抗原 性肽中可以使用任何抗原性域。在一實施例中，pH4-10時，抗原性域的水溶性大于50iug/mL。在另一實施例中，pH4-10時，抗原性域的水溶性大于 或等于1 mg/mL。再在另一實施例中，抗原決定區(qū)包含抗原性域時，第一 層抗原性多肽至少包含兩個氨基酸序列基元。當抗原性多肽含抗原性基元而不含功能域時，通常每個殘基的凈 電荷數(shù)量大于或等于0.4。但如果抗原性基元中每個殘基的凈電荷數(shù)量小于 0.4，則通常一個或多個表面吸附區(qū)中每個殘基的凈電荷數(shù)量大于0.4，以彌 補并給抗原性多肽提供合適的電荷特性，以確保其水溶性和物理吸附性。多肽或抗原可以含有一個或多個截然不同的抗原決定簇?？乖瓫Q 定簇可以是含多條鏈的多肽的免疫原性部分。本文所述抗原性多肽包含抗原決定區(qū)。合適的抗原決定區(qū)包括病 毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生蟲抗原、腫瘤抗原、參與自身免疫的 抗原，以及包含前述一種或多種抗原決定區(qū)的組合。在一實施例中，抗原決定區(qū)包含病毒抗原。合適的病毒抗原包括 但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原，如fflV-l抗原，其包括基因gag、 pol和env的 基因產(chǎn)物、Nef蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV抗原其它部分；肝炎病毒抗原，如B 型肝炎病毒的S、 M和L蛋白，B型肝炎病毒的pre-S抗原，及A型、B型 和C型等肝炎病毒其它部分；流感病毒抗原，如血凝素、神經(jīng)氨酸酶和流 感病毒其它部分；麻疹病毒抗原，如麻疹融合蛋白和麻疹病毒其它部分； 風疹病毒抗原，如蛋白質(zhì)E1和E2及風疹病毒其它部分；輪狀病毒抗原， 如VP7sc和輪狀病毒其它部分；巨細胞病毒抗原，如外殼糖蛋白B和其它 巨細胞病毒抗原；呼吸道合胞病毒抗原，如M2蛋白和其它呼吸道合胞病毒 抗原；單純皰疹病毒抗原，如即刻早期蛋白、糖蛋白D和其它單純皰疹病 毒抗原；水痘帶狀皰疹病毒抗原，如gpl、 gpll和其它水痘帶狀皰疹病毒抗 原；日本腦炎病毒抗原，如蛋白E、 M-E、 M-E-NS1、 NS 1、 NS l-NS2A、 80ME和其它日本腦炎病毒抗原；狂犬病毒抗原，如狂犬病糖蛋白、狂犬病 核蛋白和其它狂犬病毒抗原；以及包含前述一種或多種抗原決定區(qū)的組合。在另一實施例中，抗原決定區(qū)包含細菌抗原。合適的細菌抗原包括但不限于百日咳細菌抗原，如百日咳毒素、絲狀血凝素、百日咳桿菌黏
附素(pertactin)、 FIM2、 FIM3、腺苷酸環(huán)化酶和其它百日咳細菌抗原；白 喉細菌抗原，如白喉毒素或類毒素和其它白喉細菌抗原；破傷風細菌抗原， 如破傷風毒素或類毒素和其它破傷風細菌抗原；鏈球菌抗原，如M蛋白和 其它鏈球菌抗原；革蘭氏陰性桿菌抗原；結(jié)核分枝桿菌抗原，如熱休克蛋 白65 (HSP65)、 30 kDa主要分泌蛋白、抗原85A和其它分枝桿菌抗原； 幽門螺旋桿菌抗原；肺炎球菌抗原，如肺炎球菌溶血素和其它肺炎球菌抗 原；流感嗜血桿菌抗原；炭疽菌抗原，如炭疽保護抗原和其它炭疽菌抗原； 立克次體細菌抗原，如romps和其它立克次體細菌抗原；以及包含前述一 種或多種抗原決定區(qū)的組合。在另一實施例中，抗原決定區(qū)包含真菌抗原。合適的真菌抗原包 括但不限于念珠菌真菌抗原；組織漿真菌抗原，如熱休克蛋白60 (HSP60) 和其它組織漿真菌抗原；隱球菌抗原，如莢膜多糖和其它隱球菌抗原；球 孢子菌抗原，如小球體抗原和其它球孢子菌抗原，以及包含前述一種或多 種抗原決定區(qū)的組合。在另一實施例中，抗原決定區(qū)包含寄生蟲抗原。合適的原生動物 和其它寄生蟲抗原包括但不限于惡性瘧原蟲抗原，如裂殖子表面抗原、子 孢子表面抗原、環(huán)子孢子抗原、配子細胞/配子表面抗原、血相抗原pf 1 55/RESA和其它原生質(zhì)抗原；弓形蟲抗原，如SAG-1、 p30和其它弓形蟲 抗原；血吸蟲抗原，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、副肌球蛋白和其它血吸蟲抗原； 碩大利什曼原蟲和其它利什曼原蟲抗原，如gp63、脂磷酸多糖及其相關(guān)蛋 白和利什曼原蟲抗原其它部分；克氏錐蟲(trypanosoma cmzi)抗原，如75-77 kDa抗原，56 kDa抗原和錐蟲抗原其它部分；以及包含前述一種或多種寄 生蟲抗原的組合。在一實施例中，抗原決定區(qū)包腫瘤抗原。合適的腫瘤抗原包括但 不限于前列腺特異性抗原(PSA)、端粒酶；多藥物耐藥蛋白，如P-糖蛋白； MAGE-1、 (x-胎甲球蛋白、癌胚抗原抗原、突變p53、乳頭瘤病毒抗原、神 經(jīng)節(jié)苷脂或其它黑色素瘤含糖組分，或其它腫瘤細胞；以及包含前述至少一種或多種腫瘤抗原的組合。本文所述組合物和方法中可以考慮使用來源 于任意類型腫瘤細胞的抗原。在另一實施例中，抗原決定區(qū)包含參與自身免疫的抗原。研究顯 示，參與自身免疫的合適抗原包括但不限于髓磷脂基蛋白、髓磷脂少突膠 質(zhì)細胞糖蛋白和多發(fā)性硬化癥的蛋白脂質(zhì)蛋白質(zhì)和風濕性關(guān)節(jié)炎的CII膠 原蛋白；以及包含前述一種或多種抗原決定區(qū)的組合。 了解引發(fā)目標疾病的病原體抗原的抗原決定簇或表位，可能是開 發(fā)合成肽疫苗的良好開端。對病原體及其作用機制、免疫系統(tǒng)對感染的應(yīng) 答情況了解得越多，疫苗制備的成功率越高。全面探究病原體基因組結(jié)構(gòu)， 是幫助確定病原體抗原決定簇位點的快速、常規(guī)程序。査明特異性抗體靶向抗原決定簇或表位的位置和組成的方法和技 術(shù)都是本領(lǐng)域很熟悉的。這些技術(shù)可用于鑒定用作抗原決定區(qū)的表位，并 且/或者對該表位進行特征分析。在一實施例中，對抗原性蛋白中暴露在外 的氨基/羧基進行化學修飾，通過表位"足跡"法，來確定對應(yīng)抗原特異性 抗體的表位的圖譜/特征分析。在一個實施例中，足跡技術(shù)涉及HXMS (用 質(zhì)譜法檢測氫-氖交換)的使用，其中受體和配體蛋白酰胺質(zhì)子之間發(fā)生氫/ 氘交換、結(jié)合和后交換，參與蛋白結(jié)合的骨架酰胺基團被后交換所保護， 所以仍然被氘化。這樣用胃蛋白酶蛋白水解法、快速微孔高效液相色譜分 離法和/或電噴霧離子化質(zhì)譜法就可以鑒定出相關(guān)區(qū)域。在另一實施例中，合適的表位鑒定技術(shù)是核磁共振表位圖譜法 (NMR)，該方法中，通常比較游離抗原和與抗原結(jié)合肽如抗體結(jié)合的抗原 在二維NMR光譜中的信號位置。 一般有選擇性地對抗原進行同位素15N 標記，這樣可以在NMR-光譜中觀察到抗原信號，而看不到抗原結(jié)合肽信號。 與抗原結(jié)合肽發(fā)生相互作用的氨基酸產(chǎn)生的抗原信號通常在結(jié)合體光譜中 的位置相對于游離抗原有所改變，并且參與結(jié)合的氨基酸通過這種方式也 被鑒定出來。在另一實施例中，可以用肽掃描法進行表位圖譜/特征分析。這一方法中，先制出覆蓋抗原性多肽鏈全長的一系列相互重疊的肽，然后測定 各個肽的免疫原性。再用標準方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗，確定相應(yīng)肽抗 原的抗體滴定度。最后根據(jù)免疫原性對各肽分類，作為選擇用于疫苗開發(fā) 的設(shè)計肽的經(jīng)驗基礎(chǔ)。在另一實施例中，在制作表位圖譜及鑒定過程中還可以使用蛋白 酶水解技術(shù)?？乖瓫Q定簇相關(guān)區(qū)/序列可通過蛋白酶水解方法確定，如使用
與抗原性蛋白用量比約1: 50的胰蛋白酶在37°C、 pH7-8對抗原性蛋白進 行過夜水解，然后進行質(zhì)譜(MS)分析用于肽鑒定。隨后比較胰蛋白酶水 解樣品和先與CD38BP溫育然后用例如胰蛋白酶水解得到的樣品，可以鑒 定出受抗原性蛋白保護而未被胰蛋白酶切割的肽。其它酶如糜蛋白酶和胃 蛋白酶等也可以或選擇性地在類似表位特征分析法中使用。另外，利用已 知抗體，通過蛋白酶水解可以快速確定已知抗原性蛋白內(nèi)潛在抗原決定簇 序列的位置。本發(fā)明進一步涉及免疫原性組合物，該組合物包括含有兩層或兩 層以上聚電解質(zhì)的多層膜，其中，相鄰層所含的聚電解質(zhì)電荷相反，第一 層聚電解質(zhì)含有抗原性多肽。免疫原性組合物可視情況進一步包括一個或 多個含其它抗原性多肽的層。在一實施例中，免疫原性組合物含有位于相同或不同抗原性多肽 上的多個抗原決定區(qū)。該多個抗原決定區(qū)可以來源于相同或不同的感染性 物質(zhì)。在一實施例中，免疫原性組合物包含多個各不相同的抗原性多肽。 在另一實施例中，免疫原性組合物包含多個免疫原性肽，各肽內(nèi)含多個抗 原決定區(qū)。在另一實施例中，多肽是含與脂部分或者與載體蛋白部分結(jié)合 的抗原性肽混合物的結(jié)合肽。這些免疫原性組合物的優(yōu)點是，多個抗原決 定簇或單個線性抗原決定簇的多種構(gòu)象可以存在于一個合成疫苗粒子中。 這類具有多個抗原決定簇的組合物有可能產(chǎn)生抗多個表位的抗體，增加機 體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的至少某些抗體中和抗原或靶向例如癌細胞上特定抗原的 機率。在一實施例中，免疫原性組合物包含多個抗原性多肽，其中，各抗原性多肽是相同病原體的免疫原。或者，免疫原性組合物還可以包括多 個針對相同病原體不同表位的抗原性多肽。不同表位另外也可以存在于病 原體表面上緊挨著的區(qū)域內(nèi)。所以，在一實施例中，第一層聚電解質(zhì)包含 兩個或兩個以上的抗原決定簇。在另一實施例中，多層膜包括含一個或多 個與一個或多個第二抗原決定區(qū)共價連接的第二表面吸附區(qū)的第二抗原性 多肽，其中，第二抗原性多肽和一個或多個第二表面吸附區(qū)的極性相同， 其中， 一個或多個第二表面吸附區(qū)含有一個或多個第二氨基酸序列基元，
該基元由5-15個氨基酸構(gòu)成，各殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4， 一個或 多個第二抗原決定區(qū)含有3到約250個氨基酸殘基，第二抗原性多肽不是 均聚體，至少有15個氨基酸長，pH4-10時水溶解度大于50pg/ml。免疫原性組合物的免疫原性可通過多種方式增強。在一實施例中， 多層膜視情況可以包含一個或多個其它免疫原性生物活性分子。雖然不是 一定，但一個或多個其它免疫原性生物活性分子通常包含一個或多個另外 的抗原決定簇。其它合適的免疫原性生物活性分子包括但不限于藥物、蛋 白質(zhì)、寡核苷酸、核酸、脂、磷脂、碳水化合物、多糖、脂多糖，或者包 含前述一種或多種生物活性分子的組合。其它類型的另外的免疫增強因子 包括功能性膜碎片、膜結(jié)構(gòu)組成、病毒、病原體、細胞、細胞團、細胞器， 或者包含前述生物活性結(jié)構(gòu)組成的組合。在一實施例中，多層膜視情況可以包含一種或多種另外的生物活 性分子。所述一種或多種另外的生物活性分子可以是藥物?；蛘?，免疫原 性組合物是中空外殼或包覆核心的涂層形式。所述核心包含各種不同的填 充體，例如， 一種或多種另外的生物活性分子，如包括藥物。所以，按本 文所述設(shè)計的免疫原性組合物還可能用于聯(lián)合治療，如誘導機體產(chǎn)生免疫 應(yīng)答，并釋放目標藥物。用作核心的合適的微米級晶型治療材料可以通過 含抗原性多肽的免疫原性組合物被膠囊化，所得的微膠囊有可能用于藥物 釋放。某些條件如高pH或低溫下核心可以是不溶的，而在發(fā)生控釋的條件 下是可溶性的。晶體上的表面電荷可通過；-電勢測量法(用于確定液態(tài)介 質(zhì)中膠體粒子上單位凈電荷)測定。微膠囊內(nèi)容物從膠囊內(nèi)向周圍環(huán)境釋放的速度取決于眾多因素，包括膠囊外殼的厚度、外殼中使用的抗原性多 肽、是否存在二硫鍵、肽的交聯(lián)程度、溫度、離子強度和肽的組裝方法。 通常，膠囊越厚，釋放時間越長。在另一實施例中，另外的免疫原性生物活性分子是能控制目標宿 主免疫原合成或干擾病原體遺傳信息表達的核酸序列。前一情況下，例如 通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法將這類核酸序列插入合適的表達載體 內(nèi)。適于向體內(nèi)高效轉(zhuǎn)移基因的表達載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和牛痘 病毒載體。這類表達載體的調(diào)控因子包括至少一個啟動子、至少一個操縱 子、至少一個先導序列、至少一個終止密碼子和對載體核酸的合適轉(zhuǎn)錄和
后續(xù)翻譯有益或其必需的其它任何DNA序列。尤其是，這類載體應(yīng)該含有
至少一個宿主識別的復制起點和至少一個選擇性標記和至少一個能啟動核 酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。后一情況下，這一核酸序列的多拷貝例如通過 裝入多肽多層膜膠囊內(nèi)用于靜脈給藥。構(gòu)建重組表達載體時，另外應(yīng)當注意，可以將目標核酸序列(El 或核心)的多拷貝及其跟隨的調(diào)控因子插入每一個載體內(nèi)。在這樣一個實 施例中，宿主內(nèi)每個載體會產(chǎn)生更多的目標E1或核心蛋白質(zhì)?？刹迦胼d體 的核酸序列拷貝數(shù)受所用載體向合適宿主內(nèi)轉(zhuǎn)移、復制和轉(zhuǎn)錄能力(和載 體大小有關(guān))的限制。在進一步的實施例中，免疫原性組合物含有抗原性肽/免疫原性生 物活性分子混合物。它們可以來源于相同抗原，可以是來源于相同感染性 物質(zhì)或疾病的不同抗原，或者可以是來源于不同感染性物質(zhì)或疾病。所以 該復合物或混合物會產(chǎn)生免疫應(yīng)答，抵抗大量由釋放系統(tǒng)抗原性肽/蛋白組 分限定的抗原或者可能是感染性物質(zhì)或疾病。在一實施例中，免疫原性組合物引起免疫系統(tǒng)對病原體產(chǎn)生應(yīng)答。 在一實施例中，疫苗組合物包含免疫原性組合物和藥用載體的組合。所以， 接種疫苗抵抗病原體疾病的方法包含向被接種對象給用有效量的免疫原性 組合物。
28[100]藥用載體包括但不限于較大的、代謝緩慢的大分子，如蛋白質(zhì)、 多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物、失活病毒粒子等。 組合物中也可以使用藥用鹽，例如，鹽酸鹽、溴酸鹽、磷酸鹽或硫酸鹽等 無機鹽以及醋酸鹽、丙酸鹽、丙二酸鹽或安息香酸鹽等有機酸鹽。組合物 還可以含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇，以及潤濕劑、乳化劑或pH緩 沖劑等物質(zhì)。還可以使用脂質(zhì)體作為載體。誘導脊椎動物產(chǎn)生抗疾病或病原體的免疫應(yīng)答的方法包含給用
包括含抗原性多肽的多層膜的免疫原性組合物。在一實施例中，抗原性多 肽在多層膜的最外層或溶劑接觸層。免疫原性組合物可以口服、鼻內(nèi)、靜 脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、腹腔內(nèi)、舌下或透皮方式給藥，助劑可用可不用。通 常，所述組合物按與劑型相符的給藥方式，以預防和/或治療有效量給藥。 免疫原性組合物的精確用量由醫(yī)師定奪，每個受治對象可以有各自特定用 量。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然知道，免疫原性組合物的治療有效量取決于給藥 方案、所用抗原的單位劑量，組合物是否與其它治療劑聯(lián)合使用，及受治 者的免疫狀態(tài)和健康狀況。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)患者特點(年齡、重 量、性別、狀況、并發(fā)癥、其它疾病等)可以確定治療有效劑量，這是本 領(lǐng)域熟知的技術(shù)。另外，隨著進一步的常規(guī)研究，會逐漸獲得有關(guān)不同患 者所患各種疾病治療所需的合適劑量水平等更為具體的信息，普通技術(shù)人 員結(jié)合受治對象的治療現(xiàn)狀、年齡和一般健康狀況考慮，能夠確定合適的免疫原性組合物可視情況含有佐劑。通常佐劑包含增強宿主非特 異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)。佐劑的選用視被接種對象而定。最好是使用藥用佐 劑。例如，人用疫苗應(yīng)當避免使用油類或烴類乳液佐劑，包括完全或不完 全氟氏佐劑。適于人使用的佐劑例如是明礬(鋁凝膠)。但是，動物用的疫 苗可以含有不適于人用的佐劑。下面用非限制性實施例對本發(fā)明做進一步闡述。實施例
實施例l:具有單個抗原決定簇的HIV-1疫苗組合物本例中，抗原性多肽僅包含一個抗原決定區(qū)，其中，抗原決定區(qū) 是來源于病原體的多肽序列，表面吸附區(qū)位于抗原決定區(qū)的N-端。在一實 施例中，抗原決定區(qū)是已知病原體如HIV-1的抗原決定簇，如肽ARP7022 或DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNC (SEQ ID NO: 1)。合適的抗原性多肽
包含
ID NO: 2)抗原性肽的表面吸附區(qū)包含KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 3)。含24個殘基的APR7022序列(SEQ ID NO. 1)表示HIV-1糖蛋白 41 (第593-616個殘基)的保守免疫優(yōu)勢區(qū)，可被大多數(shù)歐洲和非洲1 丫+ 血清識別(Langeetal. (1993)AIDS7,461)。用本領(lǐng)域已知的任何一種方法 合成對應(yīng)SEQIDN0.2全長的肽。用這個肽以多種方式制備人造病毒，如 將包括5個分別含多聚(L-賴氨酸)和多聚(L-谷氨酸)的雙層和最后一個 對應(yīng)SEQ ID NO. 2的肽層的LBL免疫原性組合物沉積到直徑3pm的碳酸 鈣微粒上。用這一方法制備的人造病毒的露在外面的外層或外表面層，由 SEQ ID NO. 2所表示的免疫原性肽的多拷貝形成。各層吸附用的多肽水溶 液濃度是2mg/mL(pH7)。各層的吸附時間是20分鐘。在各肽吸附步驟之間 用離心方式"漂洗"微粒。某些情況下，用EDTA處理，將最后得到的人 造病毒構(gòu)建體的碳酸鈣模板粒子溶解掉。如此制備出的結(jié)構(gòu)體可以稱之為 人造病毒或合成疫苗本例中，它們"展現(xiàn)"出它們的表面抗原決定簇， 即多個已知抗原決定簇拷貝來誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生識別完整 HIV-1的抗體。這一技術(shù)有望用來制備預防藥物，進行HIV-1治療。
實施例2:具有多個抗原決定簇的HIV-1疫苗組合物主要有兩類具有多個抗原決定簇的免疫原性組合物1)被同時吸附的各個抗原性多肽均包含多個抗原決定區(qū)，且數(shù)量相同，其中，多個 抗原決定區(qū)之間相同或不同，基于相同或不同的病原體；2)被同時吸附的 多個抗原性肽中，每個抗原性肽含有多個功能單位中的一個單位，其中功 能區(qū)是基于或并非基于相同的病原體。這里需要重點提一下，兩類肽的混 合溶液原則上在用于制備人造病毒的表面層時不遜于其中任一類肽的溶 液。任一類中表面吸附區(qū)的肽肽之間通常相同，但并非必要。而且，表面
吸附區(qū)可以位于合成抗原性肽的N-端或C-端，或者在同一合成肽的功能區(qū)
之間，或者這些可能性的某種組合。具有多個抗原決定簇的1型免疫原性組合物。本例中，抗原決定 區(qū)中抗原性多肽包含兩個位于抗原決定區(qū)中的抗原序列，其中，兩個抗原 序列均來源于同一病原體，并且含有位于抗原決定區(qū)N-端、抗原決定區(qū)C-端和介于抗原序列之間的表面吸附區(qū)。在一例中，抗原決定簇來源于已知 病原體如HIV-1 ，例如，肽ARP7022或DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNC (SEQ ID NO: l)和LQARILAVERYLKDQQL (SEQ ID NO:4)。合適的抗原性
多肽包含
AKKKGKKKAKKKGLQARILAVERYLKD⑨LKKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 5)合成抗原性肽的表面吸附區(qū)包含KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 3)。 SEQ ID NO. 4對應(yīng)HIV-1糖蛋白41中第67-83個殘基。 如前述方法，先用本領(lǐng)域已知的任何一種方法合成對應(yīng)SEQ ID NO. 5全長 的肽。用這個肽以多種方式制備人造病毒，如將包括5個分別含多聚(L-賴氨酸)和多聚(L-谷氨酸)的雙層和最后一個對應(yīng)SEQIDNO. 5的肽層 的LBL免疫原性組合物沉積到直徑3pm的碳酸鈣微粒上。用這一方法制備 的人造病毒的露在外面的外層或外表面層，由SEQ ID NO. 5所表示的多個 免疫原性肽拷貝形成。各層吸附用的多肽水溶液濃度是2mg/mL(pH7)。各 層的吸附時間是20分鐘。在各肽吸附步驟之間采用離心方式"漂洗"微粒。 某些情況下，用EDTA處理，將最后得到的人造病毒構(gòu)建體的碳酸鈣模板粒子溶解掉。如此制備出的結(jié)構(gòu)體可以稱之為人造病毒或合成疫苗本例 中，它們"展現(xiàn)"出它們的表面抗原決定簇，即已知抗原決定簇的多拷貝 來誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生識別完整HIV-1的抗體。這一技術(shù)不 僅有望用來制備預防藥物，進行HIV-1治療，而且有望用于癌癥治療(當 抗原序列代表癌癥細胞表面標志物時)。
實施例3:用于HIV-1和SARS的免疫原性組合物本例中，抗原性多肽包含兩個抗原決定區(qū)和兩個表面吸附區(qū)，其
中，抗原決定區(qū)是來源于單個病原體的多肽序列，表面吸附區(qū)位于抗原性
多肽的N-端和C-端，第一抗原決定區(qū)與中央的表面吸附區(qū)之間被短接頭隔 開。在一例中， 一個抗原決定區(qū)是病原體如HIV-1中已知的抗原決定簇， 例如肽ARP7022或DQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNC (SEQ ID NO: 1)， 其它抗原決定區(qū)，即YSRVKNLNSSEG(SEQIDNO:6)，來源于嚴重急性呼 吸道綜合癥(SARS)的推定外殼蛋白，短接頭是單個賴氨酸殘基G:
AKKKGKKKAKKKGYSRVKNLNSSEGKKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 7)
像前面 一 樣，合成抗原性肽的表面吸附區(qū)均包含 KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 3)。
實施例4:具有單個抗原決定簇的真菌疫苗組合物本例中，抗原性多肽包含單個抗原決定區(qū)，其中，該抗原決定區(qū)
是來源于病原體的多肽序列，表面吸附區(qū)位于抗原決定區(qū)的c-端。在一例
中，抗原決定區(qū)是病原體(如粗球孢子菌(CoccWw'cfes /mw/泡))蛋白質(zhì) (如Ag2/PRA)內(nèi)的信號序列，如MQFSHALIALVAAGLASA(SEQIDNO:
8)。合適的抗原性多肽包含
MQFSHALIALVAAGLASAKKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 9)[111]抗原性肽的表面吸附區(qū)包含KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 3)。這一來源于Ag2/PRA (SEQ ID NO. 8)的含18個殘基的序列表示 CoccWio/tfey Zwmz'to的結(jié)構(gòu)域，它是導致呼吸疾病球孢子菌病(圣華金河熱) (San Joaquin Valley fever)的病因。本例中，先用本領(lǐng)域已知的任何一種 方法合成對應(yīng)SEQ ID NO. 9全長的整個肽。用這個肽以多種方式制備人造 病毒，如將包括5個分別含多聚(L-賴氨酸)和多聚(L-谷氨酸)的雙層和 最后一個對應(yīng)SEQ ID NO. 9的肽層的LBL免疫原性組合物沉積到直徑3pm 的碳酸鈣微粒上。用這一方法制備的人造病毒的露在外面的外層或外表面 層，由SEQIDN0.9所表示的多個免疫原性肽拷貝形成。各層吸附用的多 肽水溶液濃度是2 mg/mL(pH7)。各層的吸附時間是20分鐘。在各肽吸附步 驟之間采用離心方式"漂洗"微粒。某些情況下，用EDTA處理，將最后 得到的人造病毒構(gòu)建體的碳酸鈣模板粒子溶解掉。如此制備出的結(jié)構(gòu)體可 以稱之為人造病毒或合成疫苗本例中，它們"展現(xiàn)"出它們的表面抗原 決定簇，即己知抗原決定簇的多拷貝來誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生 識別完整CoccW/oWm 的抗體。這一技術(shù)有望用來制備預防藥物，
進行CoccWc^Wey /w/mto治療。
實施例5:具有多個抗原決定簇的細菌疫苗組合物本例中，抗原性多肽包含單個抗原決定區(qū)，其中抗原決定區(qū)包含 兩個來源于病原細菌的多肽序列，表面吸附區(qū)位于抗原決定區(qū)的C-端、N-端和病原細菌的兩個序列之間。在一例中，抗原決定簇來源于蛋白質(zhì)，如 來源于變形鏈球菌(&reptococc^ mwtora) MT8148的表面蛋白抗原Pac， 如 NAKATYEAALKQYEADLAAVKKANAA (SEQ ID NO: 10)和 AALTAENTAIKQRNENAKA (SEQ ID NO: 11)。合適的抗原性多肽包含
12)抗原性肽的表面吸附區(qū)包含KKKAKKKGKKKAKKKG (SEQ ID NO: 3)。來源于PAc基因產(chǎn)物的序列(SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 11)表示表面蛋白抗原中的一部分富含丙氨酸的重復區(qū)，在用作抗牙齲疫苗的 抗原組成方面己備受關(guān)注。本例中，先用本領(lǐng)域已知的任何一種方法合成
對應(yīng)SEQIDNO. 12全長的肽。用這個肽以多種方式制備人造病毒，如將包 括5個分別含多聚(L-賴氨酸)和多聚(L-谷氨酸)的雙層和最后一個對應(yīng) SEQ ID NO. 12的肽層的LBL免疫原性組合物沉積到直徑3pm的碳酸鈣微 粒上。用這一方法制備的人造病毒的露在外面的外層或外表面層，由SEQ ID NO. 12所表示的免疫原性肽多拷貝形成。各層吸附用的多肽水溶液濃度是 2mg/mL(pH7)。各層的吸附時間是20分鐘。在各肽吸附步驟之間采用離心 方式漂洗微粒。某些情況下，用EDTA處理，將最后得到的人造病毒構(gòu)建 體的碳酸鈣模板粒子溶解掉。如此制備出的結(jié)構(gòu)體可以稱之為人造病毒或 合成疫苗本例中，它們"展現(xiàn)"出它們的表面抗原決定簇，即抗原決定 簇多拷貝來誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而產(chǎn)生識別完整S. m"to^的抗體。 這一技術(shù)有望用來制備預防藥物，進行S. 治療。總之，用ELBL法和免疫原性肽制出的人造病毒具有如下優(yōu)點 合成肽疫苗不需要進行某些疫苗安全性試驗，降低了疫苗生產(chǎn)中的成本和 風險。例如，進行特定毒性試驗，檢測含有毒性被減弱或被殺死的病毒粒 子的疫苗中病毒粒子的不完全失活(例如用細胞培養(yǎng)分析法檢測)，既耗費 時間，又浪費資源。而未使用病毒或其它類型病原體作免疫原的疫苗構(gòu)建 體不需要進行這類安全性試驗。另外，由于不需要進行哺乳動物細胞培養(yǎng) 來繁殖本發(fā)明用的病毒，所以本發(fā)明所得疫苗被來源于病毒、微生物或真 核生物的有害物污染的風險會大大降低，尤其是按照GMP條件制備合成肽 和人造病毒時，更是如此。本文要求保護的發(fā)明的其它優(yōu)點包括利用"盒式"(cassette) 法合成適于LBL的肽不僅制備簡單而且反應(yīng)快速。而且，該方法能使單個線性抗原決定簇的多種構(gòu)象同時"展現(xiàn)" 在單個合成疫苗粒子表面上，產(chǎn)生抗多種序列構(gòu)象的抗體，從而使至少一 些由機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的抗體中和病原體或靶向癌細胞上特定抗原的幾率 增加。如上所述，可以想到，有可能將含不同功能區(qū)的肽加到單個合成疫苗構(gòu)建體內(nèi)，增加保護范圍本文要求保護的合成疫苗可以提呈針對多個 病原體的多個抗原決定簇， 一次疫苗接種后，可提供抗許多不同病原體的 保護功效。本合成疫苗平臺極其普遍，原則上可適用于任何病原體。所以， 不像其它已知的疫苗接種法那樣，需要用基因工程，將基因轉(zhuǎn)到合適表達 宿主內(nèi)，表達基因，純化重組蛋白或病毒粒子等，本文公開的合成疫苗可 以縮短應(yīng)對病原體威脅的應(yīng)答時間。本文中"第一"和"第二"等詞不表示任何特定順序，而僅便于 表示例如多個層。除非另外說明，"包含"、"具有"、"包括"和"含有"等 詞均應(yīng)理解為開放式用語(即意指"包括但不限于")。文中表示數(shù)值范圍 的方式僅僅是作為單獨談及落在該范圍內(nèi)的每個分散數(shù)值的簡略表示法， 除非本文另外指明，而且每個分散值就好比文中以一一敘述的方式被引入 本說明書。所有范圍的端點包含在該范圍內(nèi)，而且可獨立組合。文中所述 所有方法均按合適的順序操作，除非文中另外指明或上下文清楚地出現(xiàn)不 同說法。任一和所有實施例或典型用語(如"例如/如")僅僅是為了更好地 闡述本發(fā)明，而非對本發(fā)明范圍予以限制，除非另外要求。說明書中任何 語言均不應(yīng)解釋為將任何未要求權(quán)利保護的特征作為實施本文所述發(fā)明的 必要特征。雖然參照典型實施例對本發(fā)明進行了描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 當明白，在本發(fā)明范圍內(nèi)可以進行各種改動而且可以將本發(fā)明的特征用等 同特征替代。另外，根據(jù)本發(fā)明的教導有可能在本發(fā)明的范圍內(nèi)進行多種 改進以適應(yīng)特定情況或材料，所以，本發(fā)明并非要局限于本文公開的作為 實施本發(fā)明最佳基元的特定實施例，而是要包括權(quán)利要求范圍內(nèi)的所有實 施例。本發(fā)明涵蓋上述特征所有可能變化形式的任一組合，除非本文另外 指明或有清楚的相反敘述。
權(quán)利要求
1.一種免疫原性組合物，其包括含兩層或兩層以上聚電解質(zhì)的多層膜，其中，相鄰層含有相反電荷的聚電解質(zhì)，其中，第一層聚電解質(zhì)含有第一抗原性多肽，該抗原性多肽含有與一個或多個抗原決定區(qū)共價連接的一個或多個表面吸附區(qū)，所述抗原性多肽和一個或多個表面吸附區(qū)具有相同的極性，所述一個或多個表面吸附區(qū)含有一個或多個氨基酸序列基元，該基元由5-15個氨基酸構(gòu)成，每個殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4，及所述一個或多個抗原決定區(qū)含有3到約250個氨基酸殘基，其中，所述第一抗原性多肽不是均聚體，有至少15個氨基酸長，pH4-10時水溶解度大于50μg/mL；其中，第二層含有第二層聚電解質(zhì)，該聚電解質(zhì)含有分子量大于1,000、每分子至少5個電荷且電荷與第一層多肽相反的聚陽離子材料或聚陰離子材料。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述抗原性多肽位 于所述多層膜的外層內(nèi)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述抗原決定區(qū)包 含病毒抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生蟲抗原、腫瘤抗原、參與自身免 疫的抗原，或者前述一種或多種抗原決定區(qū)的組合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述第一層聚電解 質(zhì)含有兩個或兩個以上抗原決定簇。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的免疫原性組合物，其中，所述兩個或兩個以 上抗原決定簇來源于相同或不同的病原體或靶疾病。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其進一步含有第二抗原性 多肽，該抗原性多肽含有與一個或多個第二抗原決定區(qū)共價連接的一個或多個第二表面吸附區(qū)，所述第二抗原性多肽和一個或多個第二表面吸附區(qū) 具有相同的極性，所述一個或多個第二表面吸附區(qū)含有一個或多個第二氨基酸序列基元，該基元由5-15個氨基酸構(gòu)成，每個殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4， 及所述一個或多個第二抗原決定區(qū)含有3到約250個氨基酸殘基，其中，所述第二抗原性多肽不是均聚體，有至少15個氨基酸長，pH4-10 時水溶解度大于50 |Lig/mL。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的免疫原性組合物，其中，所述第一抗原決定 區(qū)和第二抗原決定區(qū)來源于相同或不同的病原體或靶疾病。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述多層膜進一步 含有另外的免疫原性生物活性分子。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的免疫原性組合物，其中，所述另外的免疫原 性生物活性分子包括藥物、寡核苷酸、核酸、脂、磷脂、碳水化合物、多 糖、脂多糖，或者包含前述一種或多種生物活性分子的組合。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述抗原性多肽的 水溶解度約大于或等于lmg/mL。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述抗原決定區(qū)包 括含3到約50個氨基酸殘基的抗原性基元，中性pH時所述抗原性多肽中 每個殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述抗原決定區(qū)是 含有約50-250個氨基酸殘基的抗原性域。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的免疫原性組合物，其中，所述抗原性域在 pH4-10時的水溶解度大于50叱/mL。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述多層膜形成膠 囊，將一種或多種非肽生物活性分子封裝在內(nèi)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫原性組合物，其中，所述多層膜是微膠 囊形式。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的免疫原性組合物，其中，所述微膠囊含有 核心，該核心含有另外的生物活性分子。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的免疫原性組合物，其中，所述另外的生物 活性分子包括藥物、蛋白質(zhì)、寡核苷酸、核酸、脂、磷脂、碳水化合物、 多糖、脂多糖，或者包含前述一種或多種生物活性分子的組合。
18. —種誘導脊椎動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，其包含將該脊椎動物給用 一種免疫原性組合物的步驟，所述免疫原性組合物包括含有兩層或兩層以上聚電解質(zhì)的多層膜，其中，相鄰層含有相反電荷 的聚電解質(zhì)，其中，第一層聚電解質(zhì)含有抗原性多肽，該抗原性多肽含有與一個或 多個抗原決定區(qū)共價連接的一個或多個表面吸附區(qū)，所述抗原性多肽和一 個或多個表面吸附區(qū)具有相同的極性，所述一個或多個表面吸附區(qū)含有一個或多個氨基酸序列基元，該基元 由5-15個氨基酸構(gòu)成，每個殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4，及所述一個或多個抗原決定區(qū)含有3到約250個氨基酸殘基，其中，所述抗原性多肽不是均聚體，有至少15個氨基酸長，pH 4-10 時水溶解度大于50 |ag/mL;其中，第二層含有第二層聚電解質(zhì)，該聚電解質(zhì)含有分子量大于1,000、 每分子至少5個電荷且電荷與第一層多肽相反的聚陽離子材料或聚陰離子 材料。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述免疫原性組合物以肌內(nèi) 或皮下方式給用。
20. —種制備免疫原性組合物的方法，該方法包括 在基底表面上沉積第一層聚電解質(zhì)，形成第一層；其中，第一層聚電解質(zhì)含有第一抗原性多肽，該抗原性多肽含有與一個或多個抗原決定區(qū)共 價連接的一個或多個表面吸附區(qū)，所述抗原性多肽和一個或多個表面吸附 區(qū)具有相同的極性，所述一個或多個表面吸附區(qū)含有一個或多個氨基酸序列基元，該基元由5-15個氨基酸構(gòu)成，每個殘基的凈電荷數(shù)量大于或等于0.4，及所述一個或多個抗原決定區(qū)含有3到約250個氨基酸殘基，其中，所述第一抗原性多肽不是均聚體，有至少15個氨基酸長，pH4-10 時水溶解度大于50嗎/mL;在所述第一層聚電解質(zhì)上沉積第二層聚電解質(zhì)，形成第二層；其中， 第二層含有第二層聚電解質(zhì)，該聚電解質(zhì)含有分子量大于l，OOO、每分子至 少5個電荷且電荷與第一層多肽相反的聚陽離子材料或聚陰離子材料。
全文摘要
本文公開了包括含兩層或兩層以上聚電解質(zhì)的多層膜的免疫原性組合物，其中，相鄰層含有相反電荷的聚電解質(zhì)。第一層聚電解質(zhì)含有抗原性多肽，該抗原性多肽含有與一個或多個抗原決定區(qū)共價連接的一個或多個表面吸附區(qū)，所述抗原性多肽和一個或多個表面吸附區(qū)具有相同的極性。免疫原性組合物可在誘導脊椎動物產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法中使用。
文檔編號C07K17/00GK101296945SQ200680039703
公開日2008年10月29日 申請日期2006年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月25日
發(fā)明者唐納德·坦普爾頓·海尼 申請人:人工細胞技術(shù)公司