專利名稱：：用于制備抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的殺蟲組合物和方法用于制備抗蟲轉(zhuǎn)基因植物的殺蟲組合物和方法發(fā)明背景本發(fā)明總的來講涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地講，本發(fā)明涉及新的多核苷Slf列和由這些序列編碼的蛋白，這些序列來源于蘇云金芽孢桿菌CBac/〃w^zwn'"g/e"";s)并且編碼ET29、TIC809、ET37、TIC810和TIC812蛋白，這些蛋白對鞘翅目和該總目內(nèi)^f皮稱為半翅目的昆蟲有毒性。鞘翅目毒性蛋白包括ET29、TIC809(ET29的氨基酸序列變體)和ET37(ET29的同源物)。本文還提供TIC810和TIC812以及編碼這些蛋白的核香酸序列。當(dāng)TIC810或TIC812與ET29、TIC809或ET37組合在一起時，提供殺蟲組合物，與僅單獨(dú)的ET29、TIC809或ET37的表現(xiàn)相比，該殺蟲組合物表現(xiàn)出針對鞘翅目令人驚奇的更高效力，這兩種蛋白的組合(TIC810與ET29、TIC809或ET37的組合，或者TIC812與ET29、TIC809或ET37的組合)令人驚奇地提供半翅目昆蟲毒性組合物，尤其是在例如豆莢盲蝽(westerntarnishedplantbug,WTPB)等物種的食物中提供時。還公開了在抵抗鞘翅目和半翅目昆蟲侵襲的轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞的開發(fā)中制備和使用編碼這些蛋白和相關(guān)蛋白的多核苷酸的方法。用于防治或根除昆蟲侵襲的環(huán)境敏感的方法和組合物在許多情況下是合乎需要的，因?yàn)樯虡I(yè)用途的作物經(jīng)常是昆蟲攻擊的目標(biāo)，尤其是來自鞘翅目和鱗翅目害蟲的攻擊的目標(biāo)。這對設(shè)法使用環(huán)境友好的方法和組合物防治昆蟲種群的農(nóng)民、園丁、栽培者以及商業(yè)區(qū)和居民區(qū)尤其如此。防治或根除半翅目昆蟲對作物的侵襲還具有商業(yè)上的重要性，且重要性逐漸增加，因?yàn)橛糜谇食崮亢枉[翅目害蟲防治方法的生物技術(shù)方法變得更廣泛可用，尤其是因?yàn)楹苌儆挟a(chǎn)生廣譜殺蟲活性的化學(xué)殺蟲應(yīng)用被利用。長期以來，人們就已認(rèn)識到細(xì)菌-蘇云金芽孢桿菌的殺蟲特性。眾所周知，蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生蛋白質(zhì)伴孢晶體，即5-內(nèi)毒素，對多種鱗翅目、鞘翅目和雙翅目幼蟲具有特異性毒性(English等，美國專利第6,063,597號)。含產(chǎn)生殺蟲蛋白的蘇云金芽孢桿菌菌抹的組合物已在商業(yè)上用作環(huán)境上可接受的殺蟲劑，因?yàn)樗鼈儗μ囟繕?biāo)昆蟲表現(xiàn)出毒性，而對植物、動物和其它非目標(biāo)生物沒有表現(xiàn)出毒性。業(yè)已分離和表征了250多種不同的5-內(nèi)毒素。這些S-內(nèi)毒素當(dāng)中某些的編碼序列已被用于構(gòu)建基因工程蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)品，其中表達(dá)一種或多種殺蟲蛋白，所述殺蟲蛋白表現(xiàn)出對目標(biāo)害蟲的特異性殺蟲活性，已被批準(zhǔn)作為局部應(yīng)用的殺蟲組合物用于農(nóng)業(yè)用途。表達(dá)一種或多種Bt殺蟲S-內(nèi)毒素蛋白并且這些蛋白能用于防治特定類別中的一種或多種昆蟲如鱗翅目或鞘翅目害蟲的轉(zhuǎn)基因植物已被批準(zhǔn)商業(yè)化并已獲得成功。然而，存在著以這些轉(zhuǎn)基因植物為食的目標(biāo)害蟲種群將對該植物產(chǎn)生的一種或多種毒素出現(xiàn)抗性的風(fēng)險(xiǎn)，所以仍有需其它蛋白一起使用的新的殺蟲蛋白。新的殺蟲組合物是產(chǎn)生表達(dá)一種或多種對相同昆蟲有毒性的蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因植物、提供管理抗性的方法以及延遲或消除任何特定敏感昆蟲對轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的一種或多種殺蟲物質(zhì)的任一種的抗性發(fā)展所需要的。大多數(shù)Bt毒素對鱗翅目有毒性。幾乎沒有表現(xiàn)出對鞘翅目有效，與未表現(xiàn)出宿主范圍特異性的溶細(xì)胞毒素不同，還沒有表明Bt毒素對鱗翅目或鞘翅目和半翅目害蟲表現(xiàn)出殺蟲活性。因此，有需要鑒定新的鞘翅目和/或半翅目特異性殺蟲組合物，以及防治鞘翅目和半翅目昆蟲科成員侵襲的方法，所述成員對于鞘翅目而言具體地為葉曱科(Chrysomelidae)成員，更具體地為葉曱科(Chrysomelidae)葉曱屬(D/a6ra"ca)，可包括來自葉曱屬CD/Wra"ca)的那些，包括西方玉米才艮蟲(Z^/a6raO'cavz>g7y^ra)(westerncornrootworm,WCR)、南方玉米才艮蟲(D勵raf/catmdecempwwctoto)(southerncornrootworm,SCR)、北方玉米才艮蟲(D/aZrah'caZ^Aen')(NorthernCornRootworm,NCR)、墨西哥玉米才艮蟲(Dz'a6radcaWrg(/^ra(MexicanCornRootworm,MCR)、巴西玉米才艮蟲(Z)z'a6ro"ca6"/to3ta)(BrazilianCornRootworm,BZR)以及由D/"6ra〃caW"'(iw/<3和南美葉曱(D/a6rc^/cas/ec/cwa)組成的巴西玉米才艮蟲復(fù)合群(BrazilianCornRootwormcomplex,BCR)，所述成員具體地為半翅總目成員，包括異翅亞目和同翅亞目中的任何害蟲，其中異翅亞目包括通常被稱為蝽象、草盲蝽(包括豆莢盲蝽(Aygw7/^^n^)、美國4文草盲棒(丄7gw/z'"eo/ww力和豆莢灰盲蝽(Lyguselisus))、獵棒、臭蟲和花蝽的昆蟲，同翅亞目包括通常被稱為蟬、蜂蟲、葉蟬、介殼蟲和粉虱的昆蟲。發(fā)明概述本發(fā)明提供從蘇云金芽孢桿菌分離的并且具有抗鞘翅目和半翅目害蟲的殺蟲活性的多肽組合物，并提供編碼這些多肽的核苷酸序列。本發(fā)明通過在植物中共表達(dá)至少兩種蘇云金芽孢桿菌蛋白(或?yàn)楠?dú)立蛋白或?yàn)閮煞N蛋白的融合蛋白)，產(chǎn)生令人驚奇的高水平的殺蟲蛋白累積，用于提供對目標(biāo)鞘翅目和半翅目害蟲的有效防治，提供對鞘翅目和半翅目昆蟲侵襲的防治，以及提供鞘翅目和半翅目昆蟲侵襲的抗蟲性管理的改善。另外，提供增加蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白或其變體在植物體中(/w;/a"to)的累積水平的方法，該方法還為表達(dá)這些蛋白的轉(zhuǎn)基因植物提供沒有異常植物形態(tài)的額外益處。在實(shí)現(xiàn)前述內(nèi)容時，提供如SEQIDNO:l所示的多核苷酸分子，該分子是從蘇云金芽孢桿菌菌抹EG5078分離出來的。該多核苷酸分子編碼如SEQIDNO:2所示的殺蟲蛋白，在本文凈支稱為ET37,具有鞘翅目害蟲抑制性生物活性。還提供如SEQIDNO:3所示的多核苷酸分子，該分子從蘇云金芽孢桿菌菌抹EG4096分離出來，并編碼如SEQIDNO:4所示的TIC810氨基酸序列。提供如SEQIDNO:5所示的又一個多核苦酸序列，其編碼如SEQIDNO:6所示的TIC812氨基酸序列，并從蘇云金芽孢桿菌菌林EG5078分離出來。TIC812與TIC810基本相同。本文具體地提出了編碼殺蟲蛋白或其殺蟲片段的分離多核苦酸分子，與示于SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的多肽序列具有至少約70%至約99%或以上的序列相似性，或其間的任何百分率。殺蟲蛋白或殺蟲片段由來源于蘇云金芽孢桿菌的分離多核苷酸分子編碼，并包含與選自SEQIDNO:3和SEQIDNO:5的多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列具有至少約70%、約80%、約90%或約99%或以上的序列同一性或其間的任何百分率的多核香@1^列。在又一個實(shí)施方案中，提供用于在植物中實(shí)現(xiàn)改良的殺蟲蛋白表達(dá)的多核苷酸分子。殺蟲蛋白優(yōu)選具有防治鞘翅目或半翅目害蟲或這二者的生物活性，但可對非鞘翅目或半翅目害蟲的害蟲有活性，并可由為在植物細(xì)胞中表達(dá)而改造的核普酸序列編碼，所述核香酸序列例如示于SEQIDNO:15(TIC810)或SEQIDNO:19(ET37)。為本文提供其它多核苷酸序列，用于獲得表達(dá)本發(fā)明的一種或多種蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞。這樣的核苷酸序列包括但不限于SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17、SEQIDNO:19、SEQIDNO:28、SEQIDNO:31、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40、SEQIDNO:43和SEQIDNO:46。提供寡核苷酸序列，用于鑒定其它細(xì)菌、尤其是其它芽孢桿菌細(xì)菌菌抹(包括蘇云金芽孢桿菌(5a"7/twAwnV2g/em!'s)和側(cè)孢芽孢桿菌(Ba".〃ws/aferasperaw力和殺蟲芽孑包桿菌(Sac〖〃usewtomoc/cW51))中的相關(guān)核苷酸序列。提供以SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8、SEQIDNO:14和SEQIDNO:47(TIC127)的氨基酸序列例舉的殺蟲蛋白。在具體的實(shí)施方案中，提供SEQIDNO:4(TIC8IO)和SEQIDNO:6(TIC812)，作為輔助蛋白、伴侶蛋白或另外穩(wěn)定和增強(qiáng)連同這些輔助蛋白一起同時表達(dá)的第二種蛋白的表達(dá)和累積的蛋白。TIC809、ET29和ET37在各自均連同TIC810或TIC812氨基酸序列一起同時表達(dá)時，全部是具有較高穩(wěn)定性水平并由此具有改善的累積水平的殺蟲蛋白。這些序列可在相同的亞細(xì)胞區(qū)室中一起表達(dá)，即二者均在胞質(zhì)中或二者均被靶向插入到植物細(xì)胞的葉綠體或質(zhì)體中并累積，或者同時表達(dá)，以在不同的亞細(xì)胞區(qū)室中累積，例如TIC810在胞質(zhì)中，ET29或TIC809被靶向插入到植物葉綠體或質(zhì)體中并累積。另外，TIC809、ET29或ET37蛋白中的任一種連同TIC810或TIC812蛋白中的任一種的組合產(chǎn)生組合物，該組合物令人驚奇地對兩種蛋白組分在植物細(xì)胞中的高水平表達(dá)和累積穩(wěn)定，并具有涉及防治鞘翅目和半翅目中的植物害蟲的殺蟲活性。所述蛋白組合還可以作為肽融合體表達(dá)，例如SEQIDNO:47。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及選自EG5078和EG4096的蘇云金芽孢桿菌野生型菌抹的生物學(xué)上純的培養(yǎng)物，由EG5078分離示于SEQIDNO:l的編碼ET37蛋白的多核苷酸序列和示于SEQIDNO:5的編碼TIC812蛋白的多核苦酸序列，由EG4096分離編碼TIC810蛋白的SEQIDNO:3和編碼ET29蛋白的SEQIDNO:7。EG4096和EG5078已依照國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約保藏于美國農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(AgriculturalResearchServiceCenterCollection,NRRL)的北方地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室(NorthernRegionalResearchLaboratory,USDA,1815NorthUniversityStreet,Peoria,IL61604),已登記的保藏號分別為NRRLB-21582和NRRLB-3084LEG4096的保藏日為1996年5月30日，EG5087的保藏日為2005年5月3曰。本發(fā)明還涉及用于在植物或植物細(xì)胞中表達(dá)的重組DNA構(gòu)建體，其包含同時表達(dá)第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列的雙基因表達(dá)盒，其中第一多核苷酸序列編碼的多肽序列選自ET29、TIC809和ET37或其殺蟲活性片段，其中第二多核苷酸序列編碼的多肽序列選自TIC810和TIC812及其殺蟲活性片段。第一多核苷酸序列選自SEQIDNO:13和SEQIDNO:17，第二多核香酸序列選自SEQIDNO:15和SEQIDNO:19，其中第二多核苷酸序列與第一多核苷酸序列共表達(dá)，以增強(qiáng)或改善第一多核苷酸序列的表達(dá)，促進(jìn)涉及防治鞘翅目和半翅目植物害蟲侵襲的殺蟲活性。本發(fā)明還涉及被轉(zhuǎn)化以包含本文公開的本發(fā)明表達(dá)載體或重組DNA構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞可選自細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞和植物細(xì)胞。在實(shí)施方案的一個方面，宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)月包，例如纟皮轉(zhuǎn)化以包含本發(fā)明表達(dá)載體的蘇云金芽孢桿菌。在實(shí)施方案的另一方面，宿主細(xì)胞為被轉(zhuǎn)化以包含本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。重組DNA構(gòu)建體可包含同時編碼4種蛋白中的2種的組合的多核苦酸序列，這4種蛋白的多肽序列見SEQIDNO:14(TIC809)、SEQIDNO:16(TIC810)、SEQIDNO:18(ET37)和SEQIDNO:20(TIC812)。優(yōu)選蛋白組合可包括TIC809和TIC810、TIC809和TIC812、ET37和TIC810以及ET37和TIC812，其中編碼TIC810或TIC812的多核苷酸序列和編碼TIC809(或ET29)或ET37的多核苷酸序列的共表達(dá)將(a)導(dǎo)致植物細(xì)胞中TIC809(或ET29)或ET37蛋白的累積增加，(b)產(chǎn)生正常的細(xì)胞生長，(c)產(chǎn)生由宿主植物細(xì)胞再生的轉(zhuǎn)基因植物，(d)產(chǎn)生正常表型，和(e)導(dǎo)致鞘翅目和半翅目昆蟲抗性水平增加。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞可包含玉米植物細(xì)胞、小麥植物細(xì)胞、黑麥植物細(xì)胞、大麥植物細(xì)胞、燕麥植物細(xì)胞、蕎麥植物細(xì)胞、高粱植物細(xì)胞、水稻植物細(xì)胞、甘蔗植物細(xì)胞、木豆植物細(xì)胞、花生植物細(xì)胞、洋蔥植物細(xì)胞、大蒜植物細(xì)胞、草植物細(xì)胞(包括剪股穎、牛毛草、雀麥草、梯牧草、鴨茅、百慕大草、結(jié)縷草等)、擬南芥植物細(xì)胞、椰菜植物細(xì)胞、向日葵植物細(xì)胞、油菜植物細(xì)胞、豌豆植物細(xì)胞、豇豆植物細(xì)胞、菜豆植物細(xì)胞、咖啡一直物細(xì)胞、大豆植物細(xì)胞、棉花植物細(xì)胞、亞麻子植物細(xì)胞、花椰菜植物細(xì)胞、蘆夢植物細(xì)胞、萵苣植物細(xì)胞、甘藍(lán)植物細(xì)胞、煙草植物細(xì)胞、香料植物細(xì)胞(包括咖哩、齊菜、鼠尾草、歐芹、胡椒、百里香、芫荽、月桂、孜然齊、姜黃、肉豆蔻、肉桂等)、糖甜菜植物細(xì)胞、馬鈴薯植物細(xì)胞、甘薯植物細(xì)胞、胡蘿卜植物細(xì)胞、蕪菁植物細(xì)胞、芽菜植物細(xì)胞、番茄植物細(xì)胞、茄子細(xì)胞、黃瓜植物細(xì)胞、南瓜或香瓜植物細(xì)胞等，果樹植物細(xì)胞(包括蘋果、杏、桃、梨、李、橘、檸檬、酸橙等)、堅(jiān)果樹植物細(xì)胞(包括橡樹、山核桃木、巴西木、美洲山核桃木、胡桃木、榛木等)、葡萄植物細(xì)胞、漿果植物細(xì)胞(包括黑莓、藍(lán)莓、草莓、酸果蔓等)和開花植物纟田月包。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及被轉(zhuǎn)化以包含本文公開的重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)基因植物可由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞子。轉(zhuǎn)基因植物選自單子葉植物和雙子葉植物，可包括諸如玉米、小麥、黑麥、大麥、燕麥、蕎麥、高粱、水稻、甘蔗、洋蔥、大蒜、草等單子葉植物，或諸如向日葵、油菜、豌豆、豇豆、木豆、菜豆、大豆、咖啡、椰菜、棉花、亞麻子、花椰菜、擬南芥、蘆筍、萵苣、煙草、香料植物(包括咖哩、芥茱、鼠尾草、歐芹、胡椒、百里香、芫荽、月桂、孜然齊、姜黃、肉豆蔻、肉桂等)、糖甜菜、馬鈴薯、甘薯、胡蘿卜、蕪菁、芽菜、番茄、茄子、黃瓜、南瓜或香瓜，果樹植物(包括蘋果、杏、桃、梨、李、橘、檸檬、酸橙等)、漿果植物(包括黑莓、藍(lán)莓、草莓、酸果蔓等)、堅(jiān)果樹植物(包括橡樹、山核桃木、巴西木、美洲山核桃木、胡桃木、榛木等)、葡萄植物和開花植物等雙子葉植物。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及來自被轉(zhuǎn)化以包含重組DNA構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子。轉(zhuǎn)基因種子可來自于由本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞再生的轉(zhuǎn)基因植物，或者可來自于再生的轉(zhuǎn)基因植物的子代，或者來自于由于轉(zhuǎn)基因植物與非轉(zhuǎn)基因植物雜交或育種而產(chǎn)生的雜種。在一個方面，轉(zhuǎn)基因種子可被覆種皮，其中種皮包括除草組合物、殺真菌種皮、殺細(xì)菌種皮、殺蟲種皮、植物激素種皮、營養(yǎng)物種皮、微生物接種物種皮、有色種皮、驅(qū)禽種皮、驅(qū)嚙齒動物種皮、殺蟲蛋白種皮、含殺蟲蛋白的細(xì)菌種皮、單鏈RNA種皮、雙鏈RNA種皮、小RNA種皮或小干擾RNA種皮。一種使種皮包含這些單鏈或雙鏈RNA組合物并穩(wěn)定化的方法是將這些RNA分子和互補(bǔ)RNA分子組合起來，使得穩(wěn)定的DNA-RNA分子雜種存在于種皮組合物中，該種皮組合物能將dsRNA或單鏈RNA提供給以種子為食的害蟲，或在包衣種子萌發(fā)時提供至發(fā)芽種子帶中的微環(huán)境或生出的發(fā)芽枝條的小根。按照本發(fā)明的一個實(shí)施方案，提供產(chǎn)生抗鞘翅目和/或半翅目昆蟲侵襲的植物的方法，該方法包括以下步驟a)將用于在植物中編碼第一種蛋白的第一種核酸分子和用于在植物中編碼第二種蛋白的第二種核酸分子插入到植物細(xì)胞的基因組中，所述第一種蛋白選自SEQIDNO:14(TIC809)和SEQIDNO:18(ET37)，所述第二種蛋白選自SEQIDNO:16(TIC810)和SEQIDNO:20(TIC812);b)獲得含步驟(a)的核酸分子的植物細(xì)胞；和c)由植物細(xì)胞產(chǎn)生表達(dá)兩種蛋白的轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物與沒有所述分子的植物相比具有鞘翅目和/或半翅目害蟲抗性。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供用于防治植物的鞘翅目和/或半翅目害蟲侵襲的方法，該方法包括在害蟲食物中提供表達(dá)TIC809、ET2或ET37蛋白連同TIC810或TIC812蛋白的植物、植物組織或4直物細(xì)月包。本文公開的多核苷酸和多肽組合物和方法在抗鞘翅目和半翅目害蟲使用時將獲得特別的益處，所述害蟲選自由葉曱科(Chrysomelidae)、扁甲科(Cucujidae)、金龜子科(Scarabaeidae)、谷盜科(Trogositidae)、擬步曱科(Tenebrionidae)、象蟲科(Curculionidae)、叩甲科(Elateridae)和豆象科(Bruchidae)組成的鞘翅目(Coleopteran),以及選自半翅目成員，具體包括異翅亞目和同翅亞目成員。在本發(fā)明的一個方面，鞘翅目昆蟲來自葉曱科。示例性的鞘翅目葉甲科昆蟲可包括葉曱屬(r>z'Wra"ca)的那些昆蟲，包括西方玉米根蟲(Z>Wrgz/era)(WCR)、南方玉米才艮蟲(￡).w"&cew/^"ctota)(SCR)、北方玉米才艮蟲(￡>k;^en')(NCR)、墨西哥玉米根蟲(D.Wrgz/erazeae)(MCR)、巴西玉米才艮蟲(Z).6a/^ato)(BZR)以及由D&6ro"cavzWcfw/a和南美葉曱(D.^ec/as力組成的巴西玉米根蟲復(fù)合群(BCR)。可構(gòu)建核酸序列分子，以摻入編碼第三種物質(zhì)(dsRNA或蛋白)的第三種結(jié)構(gòu)基因序列，作為手段用于在同一植物中提供具有涉及防治一種以上植物害蟲的活性(例如具有鞘翅目和/或半翅目昆蟲防治)的額外農(nóng)藝性狀以及抗鱗翅目昆蟲、抗細(xì)菌、抗病毒或抗真菌侵襲、抗線蟲的額外性狀，或用于提供諸如抗除草劑性狀、產(chǎn)量性狀、脅迫性狀、進(jìn)食增強(qiáng)或?qū)е逻M(jìn)食加工增強(qiáng)的性狀等的補(bǔ)充性狀。該方法可由以下步驟組成將編碼選自SEQIDNO:14(TIC809)和SEQIDNO:18(ET37)的蛋白的第一種核酸分子插入到植物細(xì)胞基因組中。將第一種核酸分子接上編碼選自SEQIDNO:16(TIC810)和SEQIDNO:20(TIC812)的蛋白的第二種核酸分子。導(dǎo)入到植物基因組中的第三種核酸分子編碼的物質(zhì)提供與第一種和第二種核酸分子提供的農(nóng)藝性狀不同的農(nóng)藝性狀，包括^f旦不限于抗鱗翅目昆蟲、抗細(xì)菌、抗病毒或抗真菌侵襲、抗線蟲，或提供補(bǔ)充性狀，例如抗除草劑性狀、產(chǎn)量性狀、脅迫性狀、進(jìn)食增強(qiáng)或?qū)е逻M(jìn)食加工增強(qiáng)的性狀等。除了在用于防治鞘翅目或半翅目害蟲侵襲的組合物中提供本發(fā)明的蛋白以外，還具體提出了轉(zhuǎn)錄核糖核苷酸(RNA)分子的多核苷酸序列，所述分子在被無脊推動物-害蟲攝入時通過抑制害蟲中的生物功能起到控制無脊椎動物-害蟲侵襲的作用，作為組合物的第二種作用模式或抗蟲性管理特征。RNA分子可包含dsRNA分子、siRNA分子、miRNA分子或ssRNA分子，并應(yīng)當(dāng)特異性抑制目標(biāo)害蟲的必需基因，所述目標(biāo)害蟲例如為本發(fā)明組合物所靶向的害蟲。本發(fā)明公開的組合物和方法提供了許多超越現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)勢，包括以上具體概述的那些。這些優(yōu)勢可包括獲得對敏感害蟲(不僅僅包括侵襲植物的那些害蟲)的改善的防治措施，獲得大量商業(yè)上可行的抗蟲植物系；獲得抗昆蟲病原體的季節(jié)性長期保護(hù)作用；以及增加形態(tài)學(xué)上正常的轉(zhuǎn)化植物的發(fā)生率。序列表描述SEQIDNO:l是編碼ET37殺蟲蛋白的蘇云金芽孢桿菌多核苷酸序列。SEQIDNO:2是由示于SEQIDNO:l的多核苷齡列編碼的ET37氨基酸序列。SEQIDNO:3是編碼TIC810殺蟲蛋白的多核苦酸序列。SEQIDNO:4是由示于SEQIDNO:3的多核苷酸序列編碼的TIC810氨基酸序列。SEQIDNO:5是編碼TIC812蛋白的蘇云金芽孢桿菌多核苷酸序列。SEQIDNO:6是由示于SEQIDNO:5的多核普酸序列編碼的TIC812氨基酸序列。SEQIDNO:7是編碼ET29蛋白的蘇云金芽孢桿菌多核苷酸序列。SEQIDNO:8是由示于SEQIDNO:7的多核苷酸序列編碼的ET29氨基酸序列。SEQIDNO:9是編碼TIC810的核苷酸1位至核苷酸657位并編碼ET29的核苷酸716-1411位的蘇云金芽孢桿菌多核苦酸序列。SEQIDNO:10是編碼TIC812的核苷酸1-657位并編碼ET37的核苦酸716-1411位的蘇云金芽孢桿菌多核苷酸序列。SEQIDNO:11是編碼TIC810的核苷酸1位至核苷酸657位并編碼ET37的核苦酸716-1411位的多核苷酸序列。SEQIDNO:12是編碼TIC812的核苦酸1-657位并編碼ET29的核苷酸716-1411位的多核香酸序列。SEQIDNO:13是構(gòu)建用于在植物細(xì)胞中表達(dá)的、編碼TIC809蛋白的多核苷酸序列。SEQIDNO:14是由示于SEQIDNO:13的多核苦酸序列編碼的TIC809氨基^列。SEQIDNO:15是構(gòu)建用于在植物細(xì)胞中表達(dá)的、編碼TIC810蛋白的多核苷酸序列。SEQIDNO:16是由示于SEQIDNO:15的多核苷酸序列編碼的TIC810氨基酸序列。SEQIDNO:17代表構(gòu)建用于在植物細(xì)胞中表達(dá)的、編碼ET37蛋白的多核苷酸序列。SEQIDNO:18是由示于SEQIDNO:19的多核苷酸序列編碼的ET37氨基酸序列。SEQIDNO:19是構(gòu)建用于在植物細(xì)胞中表達(dá)的、編碼TIC812蛋白的多核苷酸序列。SEQIDNO:20是由示于SEQIDNO:17的多核苷財(cái)列編碼的TIC812氨基酸序列。SEQIDNO:21是用于擴(kuò)增編碼TIC810氨基酸序列的核苷酸序列的熱擴(kuò)增引物，在本文#1稱為pr370。SEQIDNO:22是用于擴(kuò)增編碼TIC810氨基酸序列的核苷酸序列的熱擴(kuò)增引物，在本文被稱為pr371。SEQIDNO:23是用于擴(kuò)增編碼TIC810氨基S吏序列的核苷酸序列的熱擴(kuò)增引物，在本文^^皮稱為pr375。SEQIDNO:24是用于擴(kuò)增編碼TIC810氨基酸序列的核苷酸序列的熱擴(kuò)增引物，在本文被稱為pr376。SEQIDNO:25是用于擴(kuò)增編碼ET29氨基酸序列的核苷酸序列的熱擴(kuò)增引物，在本文被稱為pr365。SEQIDNO:26是用于擴(kuò)增編碼ET29氨基酸序列的核苦酸序列的熱擴(kuò)增引物，在本文^皮稱為pr372。SEQIDNO:27是用于擴(kuò)增編碼TIC810—ET29或TIC812—ET37操縱子序列的核苦酸序列的熱擴(kuò)增引物，在本文被稱為pr421。SEQIDNO:28是存在于轉(zhuǎn)化載體pMON64138中的合成核苦酸序列，由編碼TIC809蛋白的第一植物表達(dá)盒和編碼TIC810蛋白的第二植物表達(dá)盒組成。SEQIDNO:29是由示于SEQIDNO:28的第一植物表達(dá)盒編碼的TIC809氨基酸序列。SEQIDNO:30是由示于SEQIDNO:28的第二植物表達(dá)盒編碼的TIC810氨基酸序列。SEQIDN0:31是存在于pMON64139中的合成核香酸序列，由編碼耙向葉綠體的TIC809的第一植物表達(dá)盒和編碼靶向葉綠體的TIC810的第二植物表達(dá)盒組成。SEQIDNO:32是由示于SEQIDNO:31的第一植物表達(dá)盒編碼的TIC809氨基酸序列。SEQIDNO:33是由示于SEQIDNO:31的第二植物表達(dá)盒編碼的TIC810氨基酸序列。SEQIDNO:34是存在于pMON70513中的合成核苷酸序列，由編碼TIC809氨基酸序列的植物表達(dá)盒組成。SEQIDNO:35是由示于SEQIDNO:34的植物表達(dá)盒編碼的TIC809氨基酸序列。SEQIDNO:36是存在于pMON70514中的合成核苷酉^f列，由編碼靶向葉綠體的TIC809氨基酸序列的植物表達(dá)盒組成。SEQIDNO:37是由示于SEQIDNO:36的植物表達(dá)盒編碼的TIC809氨基酸序列。SEQIDNO:38是存在于pMON64144中的合成核苷酸序列，由編碼把向葉綠體的TIC809氨基酸序列的植物表達(dá)盒組成。SEQIDNO:39是由示于SEQIDNO:38的植物表達(dá)盒編碼的TIC809氨基酸序列。SEQIDNO:40是存在于pMON64150中的合成核苦Sl^列，由編碼靶向葉綠體的TIC809氨基酸序列的第一植物表達(dá)盒和編碼靶向葉綠體的TIC810氨基酸序列的第二植物表達(dá)盒組成。SEQIDNO:41是由示于SEQIDNO:40的第一植物表達(dá)盒編碼的TIC809氨基酸序列。SEQIDNO:42是由示于SEQIDNO:40的第二植物表達(dá)盒編碼的TIC810氨基酸序列。SEQIDNO:43是存在于pMON64151中的合成核苷^列，由編碼TIC809氨基酸序列的第一植物表達(dá)盒和編碼TIC810氨基酸序列的第二植物表達(dá)盒組成。SEQIDNO:44是由示于SEQIDNO:43的第一植物表達(dá)盒編碼的TIC809氨基SlL^列。SEQIDNO:45是由示于SEQIDNO:43的第二植物表達(dá)盒編碼的TIC810氨基酸序列。SEQIDNO:46是編碼TIC127肽的核苷酸序列，對應(yīng)于TIC809(由第1_696位核苦酸編碼)和丁1(:810(由第754_1407位核苷酸編碼)之間的融合體，其中已導(dǎo)入短連接序列(由第697-753位核苷酸編碼)，以允許兩種蛋白在植物細(xì)胞中表達(dá)后(或在攝入目標(biāo)害蟲的消化道時)通過蛋白水解被分離開。SEQIDNO:47是TIC127氨基酸序列。發(fā)明詳述本文提供得自蘇云金芽孢桿菌的多核苷酸序列，其編碼ET29、ET37、TIC809、TIC810和TIC812蛋白以及ET29衍生物TIC809和TIC810之間的融合體。還提供構(gòu)建用于在植物中表達(dá)的合成核苷酸序列，其編碼ET29、TIC809、ET37、TIC810和TIC812氨基酸序列以及TIC809和TIC810之間的TIC127蛋白融合體。還公開了在抗鞘翅目和半翅目昆蟲侵襲的轉(zhuǎn)基因植物和植物細(xì)胞的開發(fā)中制備和使用多核苷酸序列的方法。還提供在多種農(nóng)業(yè)或動物環(huán)境中的局部施用制劑中作為殺蟲組合物的蛋白，或作為由優(yōu)選宿主細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或酵母或真菌細(xì)胞生產(chǎn)的殺蟲組合物的蛋白。關(guān)于術(shù)語"得自"，其意指序列可直接從特定來源分離得到，或在從特定來源分離后，對要編碼蛋白的序列諸如核苷酸序列進(jìn)行修飾，所述序列與從特定來源分離的序列基本相同?；蛘撸被鵡列可與從特定來源分離的氨基酸序列基本相同，或由特定核苷酸序列編碼。氨基酸序列可為各自已獨(dú)立地從特定來源分離的眾多不同氨基酸序列的嵌合體，但這些不同氨基酸序列的多種區(qū)段已亂拼湊在一起，產(chǎn)生嵌合體。在此意義上，嵌合體得自多種不同氨基酸序列的每一個。核苷s吏序列可類似地得自其它核普酸序列。核苷酸序列可由于其參照一種或多種其它核苷酸序列產(chǎn)生或獲得而得自其它核苷酸序列。類似地，氨基酸序列可參照一種或多種其它氨基酸序列獲得或產(chǎn)生，因此以該方式獲得。本發(fā)明的合成多核苷酸序列優(yōu)選設(shè)計(jì)用于植物組織和植物細(xì)胞中在植物體中表達(dá)(!'"http://a"taexpression)殺蟲蛋白。具體地說，本發(fā)明的殺蟲蛋白被稱為ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812和TIC127蛋白。這些蛋白中任一種的氨基酉1^列只要其具有的殺蟲活性至少等同于其所來源的全長蛋白的殺蟲活性，就都落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含編碼本文公開的一種或多種蛋白的核苷酸序列的蘇云金芽孢桿菌細(xì)菌的生物學(xué)上純的培養(yǎng)物。具體地說，核苷酸序列為示于編碼ET37(SEQIDNO:2)的SEQIDNO:l、編碼TIC810(SEQIDNO:4)的SEQIDNO:3、編碼TIC812(SEQIDNO:6)的SEQIDNO:5以及編碼ET29(SEQIDNO:8)的SEQIDNO:7的那些序列。另外，本文提出并具體實(shí)施了融合體，例如TIC127(編碼SEQIDNO:47的SEQIDNO:46)。生物學(xué)上純的培養(yǎng)物還可包括用本發(fā)明的多核苷酸序列或兩種以上多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的那些培養(yǎng)物，至少第一種多核苷酸序列選自ET37編碼序列和ET29編碼序列，至少第二種多核普酸序列選自TIC810編碼序列和TIC812編碼序列。示例性細(xì)菌菌抹，即EG4096和EG5078,已依照國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏的布達(dá)佩斯條約保藏于美國農(nóng)業(yè)研究機(jī)構(gòu)保藏中心(AgriculturalResearchServiceCenterCollection,NRRL)的北方》也區(qū)研究實(shí)'瞼室(NorthernRegionalResearchLaboratory,USDA，1815NorthUniversityStreet,Peoria，IL61604),并已給出保藏號，見表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>編碼ET37的天然存在的(天然的)多核苷酸序列示于SEQIDNO:1。該序列與編碼在美國專利第6,093,695號中公開的ET29殺蟲蛋白并在本文以SEQIDNO:7公開的多核苷酸序列具有約99%的序列同一性。由SEQIDNO:l編碼的ET37氨基酸序列示于SEQIDNO:2。ET37蛋白的殺蟲活性在本文于使用鞘翅目葉曱屬昆蟲(包括WCR和SCR)和半翅目草盲蝽屬昆蟲的生物測定中被證實(shí)。在對ET37和ET29編碼序列在它們對應(yīng)菌抹中位于其上的染色體外質(zhì)粒進(jìn)行序列分析的過程中，鑒定ET37和ET29可讀框各自上游的單個可讀框，這些可讀框分別對應(yīng)于編碼蛋白TIC812和TIC810的序列。編碼TIC810蛋白(SEQIDNO:4)的天然多核苷酸分子(SEQIDNO:3)在蘇云金芽孢桿菌菌抹EG4096中緊鄰ET29編碼序列上游定位。編碼TIC812蛋白(SEQIDNO:6)的天然多核苷酸分子(SEQIDNO:5)在蘇云金芽孢桿菌菌林EG5078中緊鄰ET37編碼序列上游定位。ET29、ET37、TIC810和TIC812全都可以與Cyt殺蟲毒素家族遠(yuǎn)緣相關(guān)，但是，從系統(tǒng)發(fā)生的觀點(diǎn)看，ET29和37蛋白彼此比其它Cyt蛋白更接近，TIC810和812蛋白彼此也比其它Cyt蛋白更接近。ET37氨基酸序列與ET29的氨基酸序列共有約99%的序列相似性。TIC810和TIC812彼此具有約97%的氨基酸序列相似性。TIC810與ET29和ET37具有約33%的氨基@殳序列相似性。類似地，TIC812蛋白與ET29和ET37具有約32%的氨基酸序列相似性。相似性對比基于4吏用WisconsinPackage10.3版,AccelrysInc.,SanDiego,CA進(jìn)4亍的蛋白之間的成對比對。按照本發(fā)明，在宿主細(xì)胞中TIC810、TIC812、ET37和ET29蛋白表達(dá)的某些組合用于在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)期望的提高水平的殺蟲蛋白累積，產(chǎn)生涉及某些目標(biāo)鞘翅目和半翅目害蟲的改善的殺蟲活性。編碼ET29的多核苷酸序列可與編碼TIC810蛋白的多核普酸序列共表達(dá)，以在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)ET29殺蟲蛋白的增強(qiáng)的表達(dá)和或累積。類似地，編碼ET37的多核苦酸序列可與編碼TIC812的多核芬酸序列共表達(dá)，以在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)ET37殺蟲蛋白的增強(qiáng)的表達(dá)和或累積。預(yù)計(jì)TIC812與TIC810作為殺蟲劑以及作為ET37或ET29的穩(wěn)定、累積和改善的宿主范圍生物活性所需的伴侶蛋白或輔助蛋白可互換。TIC810或TIC812連同ET37或ET29的共表達(dá)產(chǎn)生改善的ET37或ET29表達(dá)和/或累積。這些組合在本文被稱為穩(wěn)定的殺蟲組合物。而且，至少就其針對鞘翅目和半翅目害蟲的殺蟲效力而言，穩(wěn)定的組合物比組合物中的任何個體組分都具有更大的宿主范圍。其中由ET37或ET29組成的第一種蛋白和由TIC810或TIC812組成的第二種蛋白具有增加水平的ET29/ET37累積的重組細(xì)胞提供了先前用殺蟲蛋白ET37和ET29未獲得的鞘翅目和半翅目昆蟲抗性水平，并導(dǎo)致整體與在沒有TIC810或TIC812的情況下表達(dá)ET29或ET37的細(xì)胞相比，細(xì)胞或由這些重組細(xì)胞組成的生物沒有異常的形態(tài)和/或表型。以上殺蟲組合還可連同至少一種不同于組合中包含的任一種蛋白的額外殺蟲蛋白一起在植物中表達(dá)，表現(xiàn)出不同于組合中包含的任一種蛋白的作用模式，以及和組合中的蛋白相同的昆蟲毒性。此包含額外的殺蟲蛋白的第二種組合提供了鞘翅目昆蟲抗性管理方法。所述額外的蛋白包括但不限于鞘翅目毒素Cry3Bb和變體、Cry22A、TIC901、TIC1201、TIC407、TIC417、CryET70，二元毒素PS149B1、ET33/34和ET80/76，以及多種已表現(xiàn)出鞘翅目殺蟲活性的其它蛋白，例如馬鈴薯塊莖蛋白(patatin)、Cry3Aa變體和可從細(xì)菌如致病桿菌(Xe"or/w^^ssp.)和發(fā)光桿菌(尸/zoto^aZ)ckssp.)分離的非特異性殺蟲組合物。ET29或ET37蛋白各自可與TIC810或TIC812組合，并在植物中與具有針對非鞘翅目害蟲的殺蟲活性的物質(zhì)共表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對一種以上的普通植物害蟲的預(yù)期防治，所述植物害蟲選自鱗翅目害蟲和半翅目害蟲。而且，這些組合可與另一些有效控制病毒害物、細(xì)菌害物、真菌害物等的物質(zhì)組合。在這些組合中提出的物質(zhì)可連同ET29/ET37和TIC810/TIC812組合一起表達(dá)，或通過在農(nóng)業(yè)上可接受的制劑中應(yīng)用殺蟲或殺蟲物質(zhì)提供，可能采用載體，例如軟化劑、膠體、噴霧劑、粉末劑、混合物或粉劑。在其中組合物應(yīng)對防治動物害蟲如蚤、蜱、虱、螨等有用的情況下，連同ET29/ET37和TIC810/TIC812組合一起包括有效防治與該組合針對的害蟲相同或不同的害蟲的物質(zhì)是有用的，所以這樣的應(yīng)用應(yīng)以藥學(xué)上可接受的制劑提供。本發(fā)明的特定殺蟲組合制劑可用于局部和/或系統(tǒng)應(yīng)用于大田作物、草、水果和蔬菜以及觀賞植物。在一個實(shí)施方案中，殺蟲組合物包含表達(dá)本文公開的一種或多種新的殺蟲蛋白的細(xì)菌細(xì)胞的油性可流動懸液。示例性的細(xì)胞可為蘇云金芽孢桿菌菌林EG4096、EG5078、sIC8134或sIC8135，但是，任何這樣的表達(dá)殺蟲組合物的細(xì)菌宿主細(xì)胞，例如巨大芽孢桿菌(及megarer^w)、枯草芽孢桿菌(及ra^'fe)、大腸桿菌(￡.coZ/)或假單月包菌(尸sew(icwo"asspp.)，■啫卩應(yīng)當(dāng)是有用的。本發(fā)明的殺蟲組合物可與其它生物技術(shù)方法如雙鏈RNA介導(dǎo)的基因抑制技術(shù)組合，以實(shí)現(xiàn)對一種或多種特定植物害蟲的預(yù)期防治。以導(dǎo)致形成雙鏈RNA乃至穩(wěn)定的雙鏈RNA的方式，在植物細(xì)胞中表達(dá)選自參與必需生物途徑的特定害蟲細(xì)胞的天然序列的特定核苷酸序列。以此方式，在害蟲攝取殺蟲有效量的RNA(即一種或多種表達(dá)得自這些害蟲的細(xì)胞的雙鏈RNA的植物細(xì)胞)時，害蟲的一種或多種必需生物途徑被抑制。連同dsRNA—起害蟲還攝入殺蟲有效量的本文所述殺蟲組合物，導(dǎo)致提供有效的昆蟲或害蟲抗性管理系統(tǒng)，該系統(tǒng)由于兩種殺蟲劑通過不同作用模式起作用而避免了出現(xiàn)抗性的可能性。表達(dá)對應(yīng)于本發(fā)明的鞘翅目和半翅目殺蟲蛋白的組合物的特定重組;逸物細(xì)胞，也可以表達(dá)作為dsRNA分子的一種或多種得自目標(biāo)鞘翅目害蟲的基因組的序列和一種或多種得自目標(biāo)半翅目害蟲的基因組的序列，導(dǎo)致提供多種殺蟲有效量的本發(fā)明蛋白和設(shè)計(jì)用于抑制目標(biāo)鞘翅目和/或半翅目害蟲中的一種或多種必需基因的dsRNA。由編碼一種或多種本發(fā)明蛋白的基因單獨(dú)地或與額外的防蟲劑(例如dsRNA)組合地組成的植物，相比于沒有這些殺蟲劑的植物，表現(xiàn)出改善的產(chǎn)量和耐旱性狀。這可能是因?yàn)橄啾扔跊]有這些物質(zhì)的根群，這些性狀產(chǎn)生更均一、強(qiáng)壯和健康的穩(wěn)定化根群，提供更多的營養(yǎng)物和集水能力。嵌合蛋白可#1合成，其中編碼ET29或ET37的序列和編碼TIC810或TIC812的序列融合在一起，供作為一種蛋白的穩(wěn)定殺蟲組合物表達(dá)用。預(yù)期嵌合蛋白可能不穩(wěn)定或不具有殺蟲生物活性，除非兩個融合肽未連接在一起。此物理分離可通過在蛋白之間包含作為間隔物的獨(dú)特肽序列實(shí)現(xiàn)，所述肽序列是本領(lǐng)域已知的眾多蛋白酶的靶。嵌合蛋白還可以與影響嵌合體穩(wěn)定性的其它序列連接，導(dǎo)致形成基本由嵌合-融合肽組成的晶體形式或包涵體，把雜質(zhì)組合物、肽或分子排除在外。這樣的嵌合體或融合體在本文的實(shí)施例11中以TIC127(通過短肽連接的TIC809和TIC810的順序融合體)和TIC128(TIC810和TIC809的順序融合體)舉例說明，已表明具有鞘翅目和半翅目殺蟲生物活性。還提供在宿主細(xì)胞中使用的表達(dá)載體。在示例實(shí)施方案中提供了包含導(dǎo)致本文公開的至少兩種多核苦酸序列組合表達(dá)的序列的表達(dá)載體。在一個實(shí)施方案中，表達(dá)載體是分離純化的多核苷酸分子，包含兩種不同多核普酸序列的組合，每個序列均包含在期望的宿主細(xì)胞中有功能的啟動子，所述啟動子與編碼TIC809、TIC810、TIC812、ET29或ET37的核苷酸區(qū)段有效連接。在某些實(shí)施方案中，編碼這些蛋白之一的核苷酸區(qū)段的3'可包含轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。提供用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的表達(dá)載體，例如用于大腸桿菌(五.CO//)細(xì)胞或芽孢桿菌細(xì)胞，包括來自蘇云金芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌或相關(guān)芽孢桿菌的細(xì)胞。細(xì)菌宿主細(xì)胞表達(dá)載體可包含串聯(lián)表達(dá)本發(fā)明的一種或多種蛋白的一種核苷酸序列，以大體上相同的方式，蛋白可在大部分細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)，即在多順反子表達(dá)盒中表達(dá)?；蛘?，細(xì)菌表達(dá)載體可由僅編碼其中一種本發(fā)明蛋白的核苷酸序列組成o在細(xì)菌中有功能的啟動子在本領(lǐng)域眾所周知。示例性的芽孢桿菌晶體蛋白啟動子可包括任一種已知的晶體蛋白基因啟動子，包括ET29基因啟動子(美國專利第6,093,695號)和蘇云金芽孢桿菌cj因子特異性啟動子(Baum和Malvar，Mo/ec.M/cr。Wo/.，18(1):1-12,1995)?；蛘?，編碼誘變或重組晶體蛋白的基因啟動子可由本領(lǐng)域技術(shù)人員工程化，并用于啟動本文^Hf的新的多核苷酸序列的表達(dá)。對于本發(fā)明而言，本文用于多核苷酸序列表達(dá)的啟動子為crylA啟動子。提供用于在植物細(xì)胞中表達(dá)的重組DNA構(gòu)建體。這樣的構(gòu)建體通常包含兩種或多種植物功能性表達(dá)盒，所述表達(dá)盒能將兩種或多種表達(dá)盒同時導(dǎo)入到植物基因組中的相同基因座的方式連接在一起，或者可包含兩種或多種植物功能性表達(dá)盒，所述表達(dá)盒連接在構(gòu)建體或載體中，但能夠被獨(dú)立地導(dǎo)入到植物基因組中的不同基因座內(nèi)。這些表達(dá)盒可被稱為第一表達(dá)盒和第二表達(dá)盒，分別表達(dá)編碼第一種蛋白的第一種多核苷酸序列和編碼第二種蛋白的第二種多核苷酸序列。預(yù)期第一種蛋白可為本文公開的任何蛋白，第二種蛋白可為非第一種蛋白的任何本文公開的其它蛋白。提供示于SEQIDNO:13、SEQIDNO:15、SEQIDNO:17和SEQIDNO:19的示例性多核苷酸序列。用于本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的啟動子在導(dǎo)入到植物細(xì)胞中時應(yīng)具有驅(qū)動編碼殺蟲物質(zhì)的多核苷酸序列表達(dá)的能力?？捎糜谠谥参镏斜磉_(dá)多肽序列的啟動子可為用于單子葉或雙子葉植物的誘導(dǎo)型、組成型、組織特異性或發(fā)育特異性啟動子。在一個實(shí)施方案中，選擇使用的啟動子可為組成型啟動子，對本發(fā)明而言，啟動子可特別地包括增強(qiáng)型花椰菜花葉病毒(CaMV35S)啟動子。在另一個實(shí)施方案中，選定的啟動子可為組織特異性啟動子，對本發(fā)明而言，啟動子可特別地包括從水稻分離的根特異性啟動子Rcc3(美國專利申請序號11\075,113)。除了一個或多個啟動子以外，載體或構(gòu)建體還可包含用于調(diào)節(jié)它們所連接的目標(biāo)基因的表達(dá)水平和時間的元件。例如，所述構(gòu)建體可包含內(nèi)含子序列。用于本發(fā)明的內(nèi)含子序列可包括水稻肌動蛋白內(nèi)含子(美國專利第5,641,876號)。重組DNA構(gòu)建體還可在啟動子和編碼序列之間具有翻譯前導(dǎo)序列。載體或構(gòu)建體還可在目標(biāo)編碼區(qū)中包含完全或部分地起終止該區(qū)轉(zhuǎn)錄作用的核酸序列。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的多腺苷酸化序列可來自小麥熱激蛋白基因(tahspl7)的3'非翻譯區(qū)。重組DNA構(gòu)建體也可包含其它元件。例如，構(gòu)建體可包含提供復(fù)制功能的DNA區(qū)段和一種或多種用于細(xì)菌細(xì)胞的選擇標(biāo)記。構(gòu)建體還可包含篩選標(biāo)記、選擇標(biāo)記和適合于選擇具有本發(fā)明的重組DNA構(gòu)建體的植物或細(xì)菌細(xì)胞的其它元件。重組DNA構(gòu)建體設(shè)計(jì)得具有可賦予細(xì)胞抗生素或除草劑耐受性的適宜選擇標(biāo)記。耐抗生素的多核苦酸序列包括但不限于編碼涉及耐卡那霉素、耐新霉素、耐潮霉素和耐本領(lǐng)域已知的其它抗生素的蛋白的多核苦酸序列。在此載體中的耐抗生素基因可被編碼5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS，參見美國專利第5，627，061和5,633,435號；Padgette等，HerbicideResistantCrops,LewisPublishers,53_85,1996)的耐除草劑基因或其它選擇標(biāo)記基因和它們的等同物(例如草銨膦(basta)耐受性、bar耐受性、氨曱喋p令抗性、草甘膦氧化還原酶、草甘膦乙酰轉(zhuǎn)移酶、磷酸乙?；?ph"O和得自腸桿菌科(五Wera6ac&Waceae)的等位基因)和耐麥草畏基因等)替代。表達(dá)與一種或多種這樣的選擇標(biāo)記關(guān)聯(lián)的本發(fā)明耐蟲性的植物對商業(yè)用途特別有用。本發(fā)明的多核苷酸序列可用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞可被再生為轉(zhuǎn)基因植物，該轉(zhuǎn)基因植物與獲得轉(zhuǎn)基因植物的植物或植物細(xì)胞相比具有改善的抗蟲性。本發(fā)明的多核苷酸序列可被修飾，以改善它們在植物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。本發(fā)明的多核普酸序列在植物細(xì)胞中的表達(dá)可實(shí)現(xiàn)殺蟲蛋白在胞質(zhì)中的累積，或者可以導(dǎo)致殺蟲蛋白在諸如葉綠體、質(zhì)體或線粒體的亞細(xì)胞器中累積。在實(shí)施前述內(nèi)容時，已改善了編碼示于SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18和SEQIDNO:20以及SEQIDNO:47的本發(fā)明蛋白的多核苷酸序列在植物中的表達(dá)。本文例舉的這些多核苷酸序列示于SEQIDNO:13(TIC809)、SEQIDNO:15(TIC810)、SEQIDNO:17(ET37)、SEQIDNO:19(TIC812)和SEQIDNO:46(TIC127)，而且在示于SEQIDNO:28、SEQIDNO:31、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40和SEQIDNO:43的表達(dá)盒序列中。TIC810或TIC812蛋白中的至少一種連同ET29、TIC809或ET37殺蟲蛋白中的一種或多種的共表達(dá)改善(或幫助、作為伴侶蛋白用于、穩(wěn)定或可作為輔助蛋白另外與殺蟲蛋白相互作用)殺蟲蛋白的表達(dá)和/或累積。在轉(zhuǎn)基因植物中的共表達(dá)導(dǎo)致沒有低水平表達(dá)和/或累計(jì)以及沒有在僅殺蟲蛋白(例如ET29、ET37或TIC809)單獨(dú)表達(dá)時觀察到的植物毒性作用。有許多將含多核苷酸序列組合的重組DNA構(gòu)建體導(dǎo)入細(xì)胞中的方法，一般認(rèn)為適宜的方法實(shí)際上包括可將DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞中的任何方法，例如通過土壤桿菌感染，例如通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(Omirulleh等，PlantMol.Biol.,21:415-428，1993)、通過干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝取、通過電穿孔或通過微粒轟擊等直接傳送DNA。在考慮抗蟲性管理(IRM)時，本發(fā)明的組合物和方法可用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，其表達(dá)兩種以上對相同昆蟲有毒的蘇云金芽孢桿菌蛋白，并提供一定水平的抗性管理，用于延遲任何特定敏感昆蟲對轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)的一種或多種殺蟲物質(zhì)的抗性的出現(xiàn)。或者，期望表達(dá)對特定目標(biāo)害蟲有毒的蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白連同對相同害蟲有毒但通過與蘇云金芽孢桿菌毒素具有的途徑不同的途徑賦予毒性的不同蛋白類物質(zhì)。這些其它的不同蛋白類物質(zhì)可包含任何Cry殺蟲蛋白、Cyt殺蟲蛋白、來自致病桿菌(Jfe"or/zak/RSsp.)或發(fā)光桿菌(尸/20tor/zaMwsp.)的殺蟲蛋白、蘇云金芽孢桿菌植物性殺蟲蛋白等。一種獲得此結(jié)果的方法會產(chǎn)生兩種不同的轉(zhuǎn)基因事件，一個事件表達(dá)本發(fā)明的兩種殺蟲蛋白的組合，對鞘翅目和半翅目昆蟲有活性，另一個事件表達(dá)第三種殺蟲蛋白，將兩種性狀一起選育到雜種植物中。第三種殺蟲蛋白可能是具有鞘翅目殺蟲活性的蛋白、具有半翅目殺蟲活性的蛋白、具有針對鞘翅目和半翅目這二者(可能還對其它昆蟲目有毒性)的殺蟲活性的蛋白或者具有針對非鞘翅目和半翅目害蟲的一種或多種其它目昆蟲(包括但不限于鱗翅目、直翅目、雙翅目等)的殺蟲活性的蛋白。殺蟲量的本發(fā)明殺蟲蛋白可在害蟲食物中提供。典型地，所述食物由一般為昆蟲食用的植物部分組成，例如植物組織或植物細(xì)胞，但也可包括其它組合物，例如配制用于增強(qiáng)特定害蟲的發(fā)育和存活的人工食物。殺蟲蛋白可在應(yīng)用于食物表面的組合物中提供，或者更優(yōu)選地可通過細(xì)胞的蛋白合成機(jī)器產(chǎn)生，并如上所述在植物細(xì)胞中累積或分泌到植物細(xì)胞外部，只要提供的蛋白毒素量是足以抑制害蟲進(jìn)一步進(jìn)食或抑制害蟲的進(jìn)一步生長和發(fā)育或引起害蟲死亡的殺蟲量。轉(zhuǎn)基因植物可自交(自花授粉)，以產(chǎn)生具有對編碼殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因?yàn)榧兒系幕蛐偷姆N子。這些種子產(chǎn)生僅對編碼殺蟲蛋白的轉(zhuǎn)基因?yàn)榧兒系闹参锖头N子。產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物經(jīng)常在不能表現(xiàn)出最期望的農(nóng)藝品質(zhì)的品系中產(chǎn)生。因此，純合的重組植物可與具有特定農(nóng)藝學(xué)主要品質(zhì)的近交系雜交。本發(fā)明尤其可用于產(chǎn)生商業(yè)用途的轉(zhuǎn)基因植物，包括多種草坪草、小麥、玉米、水稻、大麥、燕麥、各種觀賞植物和蔬菜，以及眾多結(jié)堅(jiān)果和水果的樹和植物。具體地說，這些植物可包括玉米、小麥、黑麥、大麥、燕麥、蕎麥、高粱、水稻、洋蔥、草、向曰葵、油菜、豌豆、菜豆、大豆、棉花、亞麻子、花椰菜、蘆夢、萵苣、煙草、芥菜、糖甜茱、馬鈴薯、甘薯、胡蘿卜、蕪菁、芹菜、番茄、茄子、黃瓜、南瓜、蘋果、杏、桃、梨、李、橘、黑莓、藍(lán)莓、草莓、酸果蔓和檸檬。一般來說，本發(fā)明在單子葉和雙子葉植物品系中有用。轉(zhuǎn)基因植物選自單子葉和雙子葉植物，可包括諸如玉米、小麥、黑麥、大麥、燕麥、蕎麥、高粱、水稻、甘蔗、洋蔥、大蒜、草等單子葉植物，或諸如向日葵、油菜、豌豆、豇豆、木豆、菜豆、大豆、咖啡、椰菜、棉花、亞麻子、花椰菜、擬南芥、蘆筍、萵苣、煙草、香料植物(包括咖哩、芥菜、鼠尾草、歐芹、胡椒、百里香、芫荽、月桂、孜然芽、姜黃、肉豆蔻、肉桂等)、糖甜菜、馬鈴薯、甘薯、胡蘿卜、蕪菁、芹菜、番茄、茄子、黃瓜、南瓜或香瓜，果樹植物(包括蘋果、杏、桃、梨、李、橘、檸檬、酸橙等)、漿果植物(包括黑莓、藍(lán)莓、草莓、酸果蔓等)、堅(jiān)果樹植物(包括橡樹、山核桃木、巴西木、美洲山核桃木、胡桃木、榛木等)、葡萄植物和開花植物。本文提供的DNA序列信息允許制備具有與本文公開的核苷酸序列或編碼TIC810、TIC812、ET37和ET29相關(guān)蛋白的同源序列特異性雜交能力的核苷酸序列或探針和/或引物。這些核酸探針與相關(guān)毒素或輔助/伴倡素樣蛋白編碼序列特異性雜交的能力在多個實(shí)施方案中提供了特別用途。更重要的是，探針可用于檢測給定樣品中的互補(bǔ)序列存在情況的多種測定。含本發(fā)明基因的轉(zhuǎn)基因植物在其下商品化的法規(guī)環(huán)境的性質(zhì)提供了能夠檢測生物樣品中的蛋白編碼序列以及本發(fā)明蛋白的存在情況的特定用途，并提供了在關(guān)于其授權(quán)的任何專利期當(dāng)中發(fā)現(xiàn)某些要求保護(hù)的實(shí)施方案的侵權(quán)行為的方法。在某些實(shí)施方案中，使用單獨(dú)的或成對的或其它引物組的寡核苷酸引物是有利的。這些引物的序列使用本發(fā)明的多核苦酸設(shè)計(jì)，用于使用熱擴(kuò)增法檢測、擴(kuò)增或突變來自蘇云金芽孢桿菌或其它來源的毒素或輔助/伴侶素樣蛋白編碼序列的限定區(qū)段。還可以擴(kuò)增來自其它種的相關(guān)毒素或輔助/伴侶素樣蛋白編碼序列的區(qū)段。還提出了用于檢測生物樣品中的本發(fā)明多核苷酸或氨基酸序列的試劑盒。這些試劑盒包含一個或多個多核苷酸序列，所述多核苦酸序列各自均用作檢測編碼本發(fā)明的殺蟲蛋白或其片段的多核苷酸序列存在情況的探針。這些試劑盒可另外或可選地包含特異性結(jié)合本發(fā)明蛋白的一種或多種多肽的抗體，以及與探針或抗體一起使用的試劑，試劑盒應(yīng)當(dāng)還含有對照樣品，用于確保按照生產(chǎn)商的說明實(shí)施用探針和或抗體和試劑鑒定核苷酸或肽。實(shí)施核苦酸序列或肽鑒定方法必需的所有試劑都應(yīng)和使用說明書一起包裝在試劑盒中。示例性的試劑盒可包含TIC810或編碼殺蟲蛋白的相關(guān)多核苷S^列，連同示于SEQIDNO:23和SEQIDNO:24的示例性核苷酸序列擴(kuò)增引物pr375和pr376的樣品，加上實(shí)施擴(kuò)增反應(yīng)必需的必需試劑，所有這些都一起包裝在試劑盒中。特異性結(jié)合僅由ET37、TIC810和TIC812蛋白中的任一種或其同源物提供的表位的抗體也可用于鑒定ET37、TIC810和TIC812蛋白中的任一種或其同源物的存在情況，用于純化蛋白或同源物，用于鑒定由其表達(dá)ET37、TIC810或TIC812蛋白或同源物的核苷酸序列，用于設(shè)計(jì)得可檢測ET37、TIC810和TIC812蛋白或同源物或檢測表達(dá)所述蛋白或其同源物的核苷酸序列的試劑盒。技術(shù)人員容易認(rèn)識到，這些抗體還提供對這些蛋白的融合體(例如TIC127等)的鑒定。預(yù)期農(nóng)業(yè)上和商業(yè)上重要的產(chǎn)品和/或組合物(包括但不限于動物祠料、商品和棉花或大豆或玉米產(chǎn)品以及擬用作動物飼料或用作人食用食品或用于預(yù)計(jì)人食用的組合物的副產(chǎn)品，包括但不限于棉籽、棉籽油、棉籽餅粉等，大豆餅、大豆油、大豆粉等，玉米面、玉米粉、玉米漿、玉米油、玉米淀粉、爆米花、玉米餅、含有玉米或大豆的谷物以及玉米副產(chǎn)品等)都落入本發(fā)明的范圍內(nèi)，前提條件是這些產(chǎn)品和組合物含有可4全測量的、如本文所示的、用于診斷編碼ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127的序列或其組合等的存在情況的核苦酸序列。還提出了為農(nóng)業(yè)上和商業(yè)上重要產(chǎn)品的蒸餾谷物固體(distillersdrygoods),尤其是在其包含可^r測量的編碼本發(fā)明的一種或多種蛋白的核苷酸序列或者可檢測量的一種或多種本發(fā)明蛋白的情況下。含編碼這些蛋白的可檢測量的核香S臾序列的種子，或可被加工成含可檢測量的這些核苷酸序列或蛋白的產(chǎn)品的種子或植物部分，都落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。按照這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可在不偏離所公開的本發(fā)明精神和范圍的情況下，對前述公開內(nèi)容實(shí)施多種改變。業(yè)已闡釋和描述了本發(fā)明的原則，對本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)顯而易見的是，可在不偏離這些原則的情況下，在排列和細(xì)節(jié)方面修改本發(fā)明我們要求保護(hù)在隨附權(quán)利要求書的精神和范圍內(nèi)的所有修改。為參考，其程度如同每個單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾埦唧w地和單獨(dú)地指明被引入作為參考。實(shí)施例實(shí)施例1本實(shí)施例說明了用于在玉米植物細(xì)月包中實(shí)現(xiàn)ET29蛋白表達(dá)的核苦酸序列的構(gòu)建。ET29是得自蘇云金芽孢桿菌的蛋白，先前已表明在食物中提供給玉米根蟲幼蟲時具有玉米根蟲殺蟲生物活性(美國專利第6，093，695、6,537,756、6,686,452號)。業(yè)已表明，天然Bt編碼序列在植物細(xì)胞中表達(dá)時表現(xiàn)出無法接受的蛋白合成水平(美國專利第5,500,365號)。ET29蛋白在玉米植物細(xì)胞中的表達(dá)，特別是在玉米根細(xì)胞中的表達(dá)，可提供給玉米植物抗玉米根蟲進(jìn)食損傷的保護(hù)作用。因此，構(gòu)建編碼蘇云金芽孢桿菌ET29殺蟲蛋白的核苷酸序列，預(yù)期其在植物中更高地表達(dá)，避免了先前已表明有問題的某些不利核苷ll^列，同時保持除一個以外編碼天然殺蟲蛋白的核苷酸序列；將在編碼序列(SEQIDNO:13)2位的補(bǔ)加丙氨酸密碼子納入合成序列中，以利于克隆的簡易性。示于SEQIDNO:14的ALA2變體ET29氨基酸序列被稱為TIC809,在生物測定中具有不低于天然ET29的生物活性。將示于SEQIDNO:13的TIC809編碼區(qū)亞克隆入二元植物轉(zhuǎn)化載體。TIC809編碼區(qū)上游的元件包括增強(qiáng)的CaMV35S啟動子、小麥主要葉綠素a/b-結(jié)合蛋白5'非翻譯前導(dǎo)序列、水稻肌動蛋白l基因第一內(nèi)含子和側(cè)翼非翻譯前導(dǎo)區(qū)(UTL)夕卜顯子序列，以及任選地包括玉米核酮糖1，5-二磷酸羧化酶小亞基葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽編碼序列。由與TIC809蛋白N端連接的葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(ctp)組成的融合蛋白在植物體中的表達(dá)能夠?qū)IC809蛋白靶入質(zhì)體中。將小麥hspl73'非翻譯區(qū)(UTR)摻入TIC809下游，以實(shí)現(xiàn)mRNA轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化。植物轉(zhuǎn)化載體包含耐草甘膦選擇標(biāo)記。植物轉(zhuǎn)化載體pMON70513供胞質(zhì)可溶性TIC809蛋白表達(dá)用，而pMON70514供靶向質(zhì)體的TIC809蛋白表達(dá)用。實(shí)施例2本實(shí)施例說明了在瞬時玉米原生質(zhì)體測定中靶向質(zhì)體的和非靶向的TIC809表達(dá)的對比，以及隨后對纟皮轉(zhuǎn)化以表達(dá)靶向玉米質(zhì)體的TIC809蛋白的轉(zhuǎn)基因植物的分析。將^f吏用用pMON70513或pMON70514轉(zhuǎn)化的玉米原生質(zhì)體的瞬時表達(dá)測定彼此對比和與空載體對照對比。結(jié)果表明，非靶向的TIC809蛋白表達(dá)水平比耙向的TIC809蛋白低。因此，僅進(jìn)一步分析pMON70514。在土壤桿菌介導(dǎo)的玉米原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化后產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因玉米事件。篩選再生的玉米植株("RO植抹，，)的草甘膦耐受性和小麥hspl7(tahspl7)3'UTR的拷貝數(shù)。使用ELISA法篩選各個轉(zhuǎn)基因玉米事件的6葉期(V6)根和葉樣品的ET29蛋白的存在情況和存在量。通過ELISA分析的87個轉(zhuǎn)基因事件中有19個表現(xiàn)出以褪綠莖稈為特征的獨(dú)特異常表型，這些事件中的8個具有纓或穗異常。表現(xiàn)出異常表型的植抹的葉和根組織中的TIC809平均表達(dá)水平分別為2.2ppm和2.0ppm。表型正常植抹的葉和根中的TIC809平均水平分別為1.4ppm和1.1ppm。這些結(jié)果提示，較高水平的TIC809蛋白可能與觀察到的異常表型相關(guān)。實(shí)施例3本實(shí)施例說明了TIC810編碼基因的克隆以及TIC810的表達(dá)不具有玉米根蟲殺蟲生物活性的鑒定結(jié)果，TIC810是由蘇云金芽孢桿菌的操縱子中表達(dá)的蛋白，在該操縱子中還存在ET29(&809)基因。"29最初克隆在得自蘇云金芽孢桿菌菌抹EG4096的DNA的7.1kb五coRI片段上(美國專利第6,686,452號)，并保留在質(zhì)粒pEG1303中，質(zhì)粒pEG1303是能夠在蘇云金芽孢桿菌和大腸桿菌中復(fù)制的穿梭載體。含pEG1303的重組蘇云金芽孢桿菌菌抹EG11502在C2培養(yǎng)基中生長時產(chǎn)生低水平的ET29晶體蛋白(Donovan等，Mo/.214:365-372，1988)。將ET29編碼序列作為約1.5kb的尺;wI-C/"I片段由pEG1303中的大7.1五coRI片段亞克隆入高拷貝數(shù)的穿梭載體pEG854.9(Baum等,(1996)Appl.Env.Microbiol.62:4367-4373)中，例外之處是會由較小片段觀察到ET29表達(dá)水平的增加。產(chǎn)生的質(zhì)粒pMON78402—般被認(rèn)為包含ET29編碼區(qū)的足夠天然的DNA5，和3，，以摻入任何必需的表達(dá)元件，例如孢子形成依賴性啟動子。令人驚奇的是，當(dāng)將pMON78402導(dǎo)入到無晶體蘇云金芽孢桿菌宿主菌株EG10650中時未沖企測到蛋白晶體形成，提示存在于pMON78402上的5'區(qū)可能不包含天然ET29啟動子，pEG1303中克隆的ET29轉(zhuǎn)錄由偶然性的蟲媒啟動子驅(qū)動。而且，pEG1303中的完整7.1kb五coRI片萃殳的測序揭示，緊鄰ET29編碼區(qū)上游存在中斷的可讀框。中斷的編碼區(qū)含有用于在pEG1303中克隆7.1kb&oRI片段的其中一個末端五coRI位點(diǎn)?，F(xiàn)有的非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫以及蘇云金芽孢桿菌晶體蛋白序列數(shù)據(jù)庫的FASTX檢索提示，該部分編碼區(qū)編碼的氨基酸序列與ET29蛋白的氨基酸序列具有約36%的序列同一性。此相關(guān)蛋白稱為TIC810。這提示，ET29基因存在于包含至少上游TIC810基因的非特征性操縱子中，并因?yàn)門IC810可能與ET29共表達(dá)，所以其非?？赡芤簿哂杏衩赘x殺蟲活性。天然ET29編碼序列示于SEQIDNO:9的716-1408位。在該編碼序列中存在單個iV&I位點(diǎn)(示于SEQIDNO:9的核苦酸820-825)。pEG1303中的部分TIC810編碼序列示于SEQIDNO:9的核苷酸369-654位。分開TIC810編碼序列的五coRI位點(diǎn)示于SEQIDNO:9的核苷酸369-374。AT^I消化EG4096DNA或用和適合的限制酶消化結(jié)合連接和反向PCR使得可以鑒定TIC810編碼區(qū)的5'末端的核苦酸序列。用相適的多種組合的限制酶以50pL體積消化EG4096基因組DNA(5jig)，所述組合包4舌Mzel、A7zel+5/"I、A%el+5^1和A^el+Wal。將10|al完全消化物與80(iL無菌水、1010X連接酶緩沖液(NewEnglandBioLabs，Beverly,MA)和2]uLT4連接酶混合，并于4°C保溫過夜。連接產(chǎn)物用作熱擴(kuò)增模板，使用Invitrogen(Carlsbad,CA)的Elongase⑧試劑盒以及異向引物pr370和pr371(分別示于SEQIDNO:21和SEQIDNO.22)。SEQIDNO:21對應(yīng)于示于SEQIDNO:9的核苷酸650-671的反向互補(bǔ)序列，SEQIDNO:22對應(yīng)于示于SEQIDNO:9的核苦酸744-764。用于各個反應(yīng)的限制酶產(chǎn)生匹配末端。蘇云金芽孢桿菌DNA為富含AT的，所以預(yù)期與祝"I和Mzel限制酶相比限制酶和會產(chǎn)生較小的PCR產(chǎn)物。只有S;el-A^el和Wal-M2el組合產(chǎn)生擴(kuò)增的DNA片段。對擴(kuò)增的DNA片段克隆和測序，并與示于SEQIDNO:9的核芬酸369-825組成的五coRJWW^1區(qū)革殳組裝。鑒定出如SEQIDNO:3200680040460.0說明書第29/43頁所示的預(yù)計(jì)編碼TIC810的組裝序列。隨后使用高保真度熱穩(wěn)定性聚合酶直接由EG4096基因組DNA擴(kuò)增TIC810基因。使用多個克隆證實(shí)該序列。預(yù)計(jì)TIC810基因編碼如SEQIDN0:4所示的約25,000道爾頓的蛋白。推斷的TIC810氨基酸序列與ET29氨基酸序列具有約33%的氨基酸序列同一性，提示TIC810也可能具有殺蟲生物活性。檢驗(yàn)蘇云金芽孢桿菌無晶體菌抹中的TIC810表達(dá)。TIC810基因使用引物pr375和pr376(分別示于SEQIDNO:23和SEQIDNO:24)擴(kuò)增，產(chǎn)生編碼TIC810氨基酸序列變體的擴(kuò)增子，其包含取代天然GTG密碼子的ATG翻譯起始密碼子。引物pr375還將S;el位點(diǎn)5，摻入到TIC810編碼區(qū)，而引物pr376將Wol位點(diǎn)3'摻入到TIC810編碼區(qū)擴(kuò)增子，允許將該擴(kuò)增子亞克隆到蘇云金芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體pMON47407中。將編碼TIC810的擴(kuò)增子緊鄰載體內(nèi)源性啟動子下游插入到該載體中。位于c^ylA啟動子下游的序列在蘇云金芽孢桿菌中具有孢子形成依賴性表達(dá)。將獲得的含TIC810蛋白編碼序列的重組質(zhì)粒pMON78409通過電穿孔導(dǎo)入到無晶體蘇云金芽孢桿菌宿主菌抹EG10650中，以產(chǎn)生重組蘇云金芽孢桿菌菌林SIC8116。菌抹SIC8116在C2孢子形成培養(yǎng)基中生長時產(chǎn)生含TIC810蛋白的伴孢包涵體。當(dāng)玉米根蟲幼蟲接觸覆蓋已形成孢子的SIC8116培養(yǎng)物的人工培養(yǎng)基時，未觀察到殺蟲生物活性，提示TIC810蛋白不具有針對CRW的殺蟲生物活性。實(shí)施例4本實(shí)施例說明了處于ctj1A孢子形成依賴性啟動子控制下的ET29表達(dá)產(chǎn)生較差的表達(dá)水平和異常的生理性宿主細(xì)胞行為。含質(zhì)粒pEG1303的重組蘇云金芽孢桿菌菌抹EG11502產(chǎn)生少量的ET29晶體蛋白。在嘗試增加蘇云金芽孢桿菌中的ET29表達(dá)時，將ET29編碼序列插入到蘇云金芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體pMON47407中。ET29編碼序列使用引物pr365和pr372(分別為SEQIDNO:25和SEQIDNO:26)由pEG1303DNA擴(kuò)增。在驗(yàn)證序列后，的方向插入到pMON47407載體骨架中。為評價ET29蛋白生產(chǎn)，將獲得的重組質(zhì)粒pIC17507導(dǎo)入到蘇云金芽孢桿菌菌抹EG10650中，以產(chǎn)生重組菌林SIC8114。菌抹SIC8114產(chǎn)生的ET29蛋白量低于原始ET29重組菌抹EG11502產(chǎn)生的ET29蛋白量，在C2孢子形成培養(yǎng)基中表現(xiàn)出較差的孢子形成。該結(jié)果提示，ET29的過表達(dá)可能對宿主細(xì)胞有害，或者天然菌抹EG4096中存在的或重組菌林中不存在的某些其它因素是ET29的有效表達(dá)和/累積所需要的。實(shí)施例5本實(shí)施例說明了與TIC810/ET29操縱子具有同源性的操縱子的鑒定。通過對EG4096中TIC810/ET29操縱子相關(guān)序列的存在情況進(jìn)行DNA印跡分析檢驗(yàn)其它價菌抹。發(fā)現(xiàn)Bt菌林EG5078總DNA的5.4kbC/d限制性片段與ET29特異性雜交探針雜交。將該5.4kbC7d片段克隆入蘇云金芽孢桿菌-大腸桿菌穿梭載體pEG854中(Baum等，(1990)Appl.Env.Microbiol.56:3420-3428)，并還克隆到大腸桿菌載體pBluescriptIISK中，以分別產(chǎn)生重組質(zhì)粒pEG1325和pEG1323。5,4kb插入片段的序列分析揭示了在蘇云金芽孢桿菌菌林EG4096中類似于ET29和TIC810基因的兩個緊密連接的基因。5'鄰近編碼序列被稱為"c812(示于SEQIDNO:5),預(yù)計(jì)其編碼TIC812多肽(示于SEQIDNO:6)。TIC812與TIC810蛋白具有約97%的氨基醋列同一性。3，鄰近編碼序列^f皮稱為e。7(SEQIDNO:l)，預(yù)計(jì)其編碼示于SEQIDNO:2的ET37氨基酸序列。ET37與ET29蛋白具有超過約99%的氨基酸序列同一性，差別僅在于一個氨基酸位置。使用電穿孔法將包含TIC812和ET37基因這二者的穿梭載體pEG1325導(dǎo)入到無晶體蘇云金芽孢桿菌宿主菌抹EG10650中。獲得的重組菌林EG11541在C2孢子形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)時產(chǎn)生高水平的ET37蛋白。然而，存在于孢子中的TIC812蛋白量大約僅為ET37蛋白量的25%。已發(fā)現(xiàn)菌林EG5078產(chǎn)生的ET37/TIC812蛋白混合物在生物測定中測試時對玉米根蟲幼蟲有毒。因?yàn)門IC810/ET29和TIC812/ET37操縱子之間的相似性，以及因?yàn)镋T37和ET29差異僅在于一個氨基酸位置，所以不可能兩種蛋白都表現(xiàn)出明顯不同的殺蟲或細(xì)胞毒性特性。單獨(dú)表達(dá)時低水平的ET29相比于由其天然操縱子表達(dá)時較高的ET37蛋白水平，連同TIC810和TIC812蛋白之間的大致同一性，提示TIC810和TIC812蛋白可在為它們對應(yīng)的ET29或ET37蛋白增加水平或提供一定穩(wěn)定作用方面起作用。TIC812連同ET37蛋白的共表達(dá)可為在菌抹EG11541中觀察到的ET37過表達(dá)的原因。另外，TIC810和ET29的共表達(dá)同樣可導(dǎo)致ET29過表達(dá)。為測試該假說，擴(kuò)增單個ET29、ET37、TIC810和TIC812編碼序列，并克隆入上述蘇云金芽孢桿菌表達(dá)載體pMON47407中，佳_得每個的表達(dá)都處于載體內(nèi)源性￡T_ylA啟動子控制之下。將TIC812編碼序列位置1的天然GTG密碼子改變?yōu)锳TG密碼子。TIC810-ET29串聯(lián)編碼序列(SEQIDNO:9)和TIC812-ET37串聯(lián)編碼序列(SEQIDNO:10)各自由基因組DNA擴(kuò)增，并克隆入TOPO克隆載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad,CA)中，i正實(shí)它們的序列。然后將擴(kuò)增的DNA片段克隆入載體pMON47407中，使得串聯(lián)編碼序列處于載體內(nèi)源性crylA啟動子控制之下。因此，將各個插入片段以相同方向克隆入pMON47407中，并使用相同的啟動子。無晶體蘇云金芽孢桿菌菌抹EG10650用作所有表達(dá)研究的宿主菌抹。質(zhì)粒構(gòu)建體和包含這些質(zhì)粒的重組蘇云金芽孢桿菌見表2。表2.構(gòu)建用于TIC810/ET29和TIC812/ET37的表達(dá)分析的質(zhì)粒<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>-用于擴(kuò)增插入到pMON47407中的編碼序列的引物對重組菌株和EG10650各自在250ml擋板瓶中的30mlC2培養(yǎng)基于28。C在劇烈攪拌下培養(yǎng)3天。通過低速離心收集孢子和晶體，用30ml洗滌緩沖液(IOmMTris-HCl,0.1mMEDTA，0.005%TritonX-100,pH6.8)洗滌1次，以3ml終體積重懸浮在洗滌緩沖液中。然后通過SDS-PAGE分析這些10XC2濃縮物。蛋白濃度通過使用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)品的光密度分析法測定。SDS-PAGE分析表明，1)ET29和ET37在單獨(dú)表達(dá)時均表現(xiàn)出較差的產(chǎn)量；2)TIC810和TIC812在單獨(dú)表達(dá)時累積至高水平；和3)ET29和ET37在分別連同TIC810或TIC812共表達(dá)時表現(xiàn)出急劇提高的表達(dá)水平。存在TIC810時的ET29蛋白產(chǎn)量是不存在TIC810時的約4.6倍高，存在TIC812時的ET37產(chǎn)量是不存在TIC812時的約6.6倍高。而且，含TIC810—ET29串聯(lián)編碼序列的菌林SIC8134和含TIC812—ET37串聯(lián)編碼序列的SIC8135具有正常的孢子形成和裂解。這些結(jié)果表明，TIC810和TIC812分別是在蘇云金芽孢桿菌中高水平生產(chǎn)ET29和ET37所需要的，可能起輔助蛋白或伴侶蛋白的作用。10XTIC812/ET37孢子-晶體懸液直接用于針對WCR的生物測定。懸液中的晶體蛋白通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和使用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品的光密度分析法定量。以類似于Pleau等(五"towo/.4p//.105:l-ll,2002)所述的方式制備200mLWCR食物。每孔施加20^L測試樣品，并使其千燥，然后用細(xì)硬毛刷涂抹于每孔一個新生昆蟲幼蟲。板用聚酯薄膜密封，并使用昆蟲針通風(fēng)。每個樣品濃度測試24只幼蟲。生物測定板于27。C、60%RH在完全黑暗中溫育5-7天。根據(jù)實(shí)驗(yàn)在5-7天結(jié)束時記錄每個處理的存活幼蟲數(shù)。存活幼蟲在微量天平(CahnC-33)上稱重。數(shù)據(jù)使用JMP4統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件(SASInstitute,Cary,N.C.,USA)分析。生物測定數(shù)據(jù)見表3。結(jié)果提示，發(fā)現(xiàn)含ET37和TIC812混合物的野生型蘇云金芽孢桿菌菌抹EG5078的已形成孢子的培養(yǎng)物對西方玉米根蟲幼蟲有毒，與對照相比引起顯著的幼蟲量減少。相對照的c，蘇云金芽孢桿菌宿主菌抹EG10650的IOX孢子懸液在生物測定中未表現(xiàn)出抗WCR幼蟲的活性。納入含500mgCry3Bb根蟲殺蟲蛋白的樣品作為陽性對照。表3.西方玉米根蟲生物測定對ET37/TIC812<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>'-mg/ml;2-標(biāo)準(zhǔn)偏差；3-未處理的檢驗(yàn)；變異數(shù)不相等，Levene法，P>F0.0053;存在由于處理產(chǎn)生的作用，SLS,P>F0.0002;和P值0.05的平均值與UTC、對比計(jì)劃(PlannedContrast)顯著不同。實(shí)施例6本實(shí)施例說明了TIC810和TIC809蛋白在玉米原生質(zhì)體中的共表達(dá)。構(gòu)建編碼蘇云金芽孢桿菌TIC810和ET29(TIC809)蛋白的合成核苷酸序列，用于在植物中表達(dá)。編碼TIC809的合成序列示于SEQIDNO:13，氨基Sg序列翻譯示于SEQIDNO:14。編碼T1C810的合成序列示于SEQIDNO:15，氨基酸序列翻譯示于SEQIDNO:16。將TIC809和TIC810的合成編碼序列克隆入表達(dá)載體中，用于采用玉米原生質(zhì)體的瞬時表達(dá)研究。TIC809和TIC810編碼序列的編碼區(qū)周圍的遺傳元件是相同的，只是加入葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(ctp),如實(shí)施例1所述。質(zhì)粒構(gòu)建體的部分描述見下表4。表4.用于TIC810/TIC809表達(dá)的瞬時測定的質(zhì)粒構(gòu)建體<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>原生質(zhì)體如下制備在0.6M甘露醇、10mMMESpH5.7、2%纖維素酶RS和0.3%混合酶R10中消化12日玉米葉組織達(dá)2小時。所有轉(zhuǎn)化都使用50iagDNA和1.3xl()S個細(xì)胞進(jìn)行。原生質(zhì)體中的TIC809表達(dá)使用ELISA檢測，該ELISA采用針對ET29蛋白產(chǎn)生的多克隆抗體。結(jié)果見表5，代表3個重復(fù)樣品的平均值。表5.TIC809在玉米原生質(zhì)體中的瞬時表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>'-使用Tukey-KramerHSD比較所有對，a=0.05。具有相同字母的處理彼此之間沒有顯著不同。2-(ngET29/mg總蛋白)結(jié)果表明，靶向葉綠體的TIC809蛋白導(dǎo)致瞬時系統(tǒng)中的TIC809表達(dá)相比于非靶向的TIC809表達(dá)增力o。通過比較pMON84203的表達(dá)和pMON84202的表達(dá)，觀察到靶向的TIC809蛋白表達(dá)約為非靶向的TIC809蛋白表達(dá)的約20倍高。但是，非靶向的TIC810蛋白與非靶向的TIC809共表達(dá)也導(dǎo)致TIC809蛋白的表達(dá)顯著增加(比較pMON64134和pMON84202)。在6個實(shí)驗(yàn)中的5個當(dāng)中，將TIC810和TIC809這二者靶向質(zhì)體導(dǎo)致TIC809的表達(dá)和累積水平等同于或高于TIC809被單獨(dú)地靶向質(zhì)體時累積的量。無論如何，TIC809和TIC810一起在任何共同細(xì)胞部位的共表達(dá)都導(dǎo)致TIC809累積水平相比于沒有TIC810的情況下在該區(qū)室中表達(dá)時的TIC809累積水平增加。構(gòu)建pMON64136和pMON64137，以測試TIC809在定位于與TIC810不同的亞細(xì)胞區(qū)室時的表達(dá)作用。TIC810靶向質(zhì)體對非靶向的TIC809的表達(dá)沒有顯著影響(比較pMON64136和pMON84202)。類似地，非靶向的TIC810對靶向的TIC809的累積沒有顯著影響(比較pMON64137和pMON84203)。但是，非耙向的TIC810增加或穩(wěn)定非靶向的TIC809的累積。這些結(jié)果提示，兩種蛋白定位于細(xì)胞中的相同空間導(dǎo)致根蟲殺蟲蛋白TIC809的累積更大，這可能是由于蛋白之間的某些相互作用造成的，這些相互作用穩(wěn)定TIC809蛋白的累積。這些結(jié)果與TIC810和ET29共表達(dá)或TIC812和ET37共表達(dá)分別在蘇云金芽孢桿菌產(chǎn)生高水平的ET29或ET37表達(dá)的觀察結(jié)果相一致。在瞬時原生質(zhì)體表達(dá)測定中納入含螢光素酶(LUX)基因的質(zhì)粒作為對照。盡管營光素酶一般被納入瞬時測定中作為轉(zhuǎn)化功效的指示劑，但觀察到螢光素酶表達(dá)水平隨測試的質(zhì)粒構(gòu)建體而廣泛變化，推測是由于累積的Bt蛋白的植物毒性作用造成的。TIC809的低累積與低螢光素酶水平相關(guān)。在所有情況下，除了TIC809定位于葉綠體時以夕卜，非靶向的TIC810在相同區(qū)室中與TIC809共表達(dá)導(dǎo)致螢光素酶和TIC809表達(dá)水平均急劇增加(對比pMON64134和pMON84202)。螢光素酶數(shù)據(jù)見表6。表6.瞬時測定實(shí)驗(yàn)中的安光素酶水平<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>1所有對的對比都使用Tukey-KramerHSD,a=0.05。具有相同字母的處J里;波it匕之間沒有顯著不同。實(shí)施例7本實(shí)施例說明了TIC810和TIC809在轉(zhuǎn)基因玉米中共表達(dá)的結(jié)果。將TIC809、ctp-TIC809、TIC809-TIC810和ctpTIC809-ctpTIC810表達(dá)盒導(dǎo)入到適用于玉米轉(zhuǎn)化的二元植物轉(zhuǎn)化載體中。與編碼Bt蛋白的序列不同，構(gòu)建體彼此差異僅在于有或沒有靶向葉綠體的肽編碼序列。賦予草甘膦耐受性的基因作為選擇標(biāo)記用于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。pMON64138包含用于在植物體中表達(dá)TIC809和TIC810的表達(dá)盒。pMON64139包含用于在植物體中表達(dá)靶向葉綠體的TIC809和輩巴向葉綠體的TIC810的表達(dá)盒。pMON70513包含用于在才直物體中表達(dá)TIC809的表達(dá)盒。pMON70514包含用于在植物體中表達(dá)耙向葉綠體的TIC809的表達(dá)盒。使用這4種質(zhì)粒轉(zhuǎn)化和草甘膦選擇后獲得再生轉(zhuǎn)基因玉米植林，使用TaqMan⑧測定篩選這些植抹的草甘膦選擇標(biāo)記基因存在情況和tahspl73'序列存在情況。對于每個事件在相關(guān)的情況下都使用終點(diǎn)PCR測定證實(shí)TIC809和/或TIC810編碼序列的存在情況。預(yù)期用含TIC809和TIC810這二者的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的事件具有2個拷貝的tahspl73'序歹']，因?yàn)槊總€編碼序列在其3'末端都以tahspl73，元件為界。使用ET29ELISA測定含6片葉(V6期)和根的轉(zhuǎn)基因和對照植抹的TIC809累積水平。在用僅含靶向胞質(zhì)的TIC809編碼序列的pMON70513轉(zhuǎn)化后再生的植林表現(xiàn)如以上實(shí)施例1和2所述。具有顯著異常的表型和特征的植林在視覺上通常以褪綠莖稈連同其它異常性為特征。根組織中的TIC809表達(dá)和/或累積水平平均不超過約2.0ppm。測定用pMON64138轉(zhuǎn)化的15林RO植株的草甘膦標(biāo)記的存在情況以及tahspl73'元件的存在情況和拷貝數(shù)，以及用于檢測任何載體骨架的OriV的存在情況，和編碼靶向胞質(zhì)的TIC809和TIC810蛋白的基因的存在情況和完整性。一個事件不包含全長TIC809編碼序列，還^C測定出具有不可^r測水平的TIC809蛋白。余下的14個事件在葉組織或根組織中表現(xiàn)出平均約12ppm的TIC809(鮮重)。根組織中的TIC809水平由1個植林中的約0.2ppm至表現(xiàn)出最高表達(dá)和/或累積水平的植抹中的約45ppm。該結(jié)果提示，TIC810連同TIC809在植物組織中的共表達(dá)提供了改善的TIC809蛋白表達(dá)和/或累積水平。更顯著地，在胞質(zhì)中表達(dá)TIC809和TIC810這二者的植物中未觀察到異常表型。TIC809的表達(dá)水平在根組織中比在葉組織中更均一，大部分檔^朱在根中具有的TIC809表達(dá)水平高于葉中的表達(dá)水平。使用含靶向葉綠體的TIC809和TIC810編碼序列的pMON64139由轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生15抹R0植林。在篩選分析中鑒定出1個事件，該事件不含全長TIC809表達(dá)盒，也不具有可檢測的TIC809蛋白水平。余下的14個事件在根和葉組織中的TIC809蛋白分別為平均約4.4ppm和約8.6ppm。根中的TIC809水平在約0.2ppm至約45ppm的范圍內(nèi)。用pMON70514轉(zhuǎn)化的、含ctpTIC809基因的玉米植抹在葉組織中平均僅為約1.7ppmTIC809蛋白，在根組織中平均為約6.3ppmTIC809蛋白。因此，非耙向的TIC810連同靶向的TIC809的共表達(dá)產(chǎn)生的TIC809表達(dá)和/或累積水平高于用耙向葉綠體的TIC809蛋白達(dá)到的水平。而且，產(chǎn)生提高水平的TIC809蛋白的R0植林沒有表現(xiàn)出莖稈褪綠或與在植物體中表達(dá)單獨(dú)的TIC809蛋白相關(guān)的其它植物毒性表現(xiàn)。在與沒有TIC810的情況下表達(dá)的靶向葉綠體的TIC809蛋白水平相比時，耙向葉綠體的TIC810連同靶向葉綠體的TIC809的共表達(dá)也導(dǎo)致TIC809累積水平增加。轉(zhuǎn)化18抹R0植抹，以共表達(dá)靶向的TIC809和靶向的TIC810蛋白，測定這些植抹的耐草甘膦選擇標(biāo)記基因、tahspl73'拷貝數(shù)、OriV(骨架)的存在情況以及完整的TIC809和TIC810編碼序列。一個事件不包含完整的TIC809編碼序列，不能表現(xiàn)出可檢測水平的TIC809蛋白。余下的17林植林在葉和根中的TIC809蛋白分別為平均8.6和4.4ppm。TICS09蛋白的根表達(dá)在約lppm至約9ppm的范圍內(nèi)。具有靶向葉綠體的TIC809和TIC810蛋白表達(dá)的事件沒有表現(xiàn)出莖稈褪綠或與在植物體中表達(dá)單獨(dú)的TIC809蛋白相關(guān)的其它植物毒性表現(xiàn)。實(shí)施例8本實(shí)施例說明了靶向質(zhì)體的TIC809在玉米根中的增強(qiáng)的表達(dá)。構(gòu)建pMON64144，以包含靶向葉綠體的TIC809，其處于RCc3根啟動子的有效控制之下(美國專利申請序號11\075,113),CTP編碼序列的5'側(cè)接玉米熱激蛋白HSP70內(nèi)含子，TIC809編碼序列的3，側(cè)接小麥hspl73，轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列。表達(dá)盒的序列示于SEQIDNO:38。在用載體pMON64144進(jìn)行土Jt裏桿菌介導(dǎo)的玉米組織轉(zhuǎn)化后再生玉米植抹。使用TaqMan㊣測定篩選再生的玉米植抹的草甘膦選擇標(biāo)記和小麥3，側(cè)翼序列的存在情況。完整的TIC809編碼序列的存在情況使用終點(diǎn)PCR測定證實(shí)。在6葉期的23抹R0玉米植抹的根和葉樣品使用ET29ELISA篩選。在#^且織中累積的TIC809平均水平為0.4ppm。在葉中未^r測到TIC809蛋白，提示RCc3啟動子活性在根細(xì)胞中被增強(qiáng)。23林R0植林中有8林表現(xiàn)出的TIC809蛋白濃度低于根中的檢測水平。測試的植林沒有一個表現(xiàn)出高于約1ppmTIC809的水平。相反，處于e35S啟動子控制下的類似構(gòu)建體在根組織中表現(xiàn)出平均約1.4ppm的TIC809蛋白,在葉組織中約1.7ppm(n=87)。實(shí)施例9本實(shí)施例說明了各自處于不同啟動子控制下的TIC809和TIC810在植物體中的共表達(dá)。在實(shí)施例7中，TIC809和TIC810基因各自由獨(dú)立表達(dá)盒在^f直物體中表達(dá)，各個編碼序列的表達(dá)由獨(dú)立但相同的e35S啟動子驅(qū)動。在本實(shí)施例中，設(shè)計(jì)表達(dá)盒，使得使用RCc3啟動子將TIC809的表達(dá)基本上定位于根組織，而TIC810的表達(dá)處于e35S啟動子控制之下。pMON64150含有兩個表達(dá)盒。一個表達(dá)盒(SEQIDNO:40)包含耙向葉綠體的TIC809編碼序列，該編碼序列在其5'末端與水稻RCc3啟動子和玉米熱激蛋白HSP70內(nèi)含子有效連接，在其3'末端與小麥hspl73'轉(zhuǎn)錄終止和聚腺苷酸化序列有效連接。另一個表達(dá)盒(SEQIDNO:40)含有靶向葉綠體的TIC810編碼序列，該編碼序列在其5'末端與e35S啟動子和水稻肌動蛋白內(nèi)含子序列有效連接，在其3'末端與小麥hsp173，轉(zhuǎn)錄終止和聚腺香酸化序列有效連接。pMON64151與pMON64150相同，只是在兩個表達(dá)盒中的編碼序列沒有靶向葉綠體的肽編碼序列(分別為SEQIDNO:43和SEQIDNO:40)。測試由用pMON64150或pMON64151轉(zhuǎn)化的玉米組織再生的植抹，以檢驗(yàn)TIC809和TIC810編碼序列的存在情況和完整性。在6葉期使用ET29ELISA測試這些事件的葉和根，以測定TIC809蛋白累積水平。用pMON64150轉(zhuǎn)化的植株具有平均約1.5ppmTIC809/株，而用pMON64151轉(zhuǎn)化的植物具有平均約0.4pmTIC809/株。pMON64150植株具有約0.4ppm至約6ppm的TIC809根累積水平，2/3以上的事件具有至少約1ppm的TIC809水平。葉組織始終具有低于測定檢出限的TIC809累積水平。pMON64151事件中的TIC809根平均累積高于使用靶向葉綠體的pMON64150表達(dá)盒產(chǎn)生的事件(pMON64151，6.6ppm對pMON64150，1,4ppm)。這些結(jié)果與使用其中TIC809由e35S啟動子表達(dá)的構(gòu)建體獲得的結(jié)果一致(pMON64138和pMON64139)。由RCc3對e35S啟動子表達(dá)TIC809的植物之間的最大差異在于，當(dāng)表達(dá)受控于RCc3啟動子時，在葉中沒有TIC809累積。pMON64150和pMON64151事件均具有正常表型。實(shí)施例10本實(shí)施例說明了含TIC809和TIC810及其如本文公開的同源物的組合物的半翅目昆蟲殺蟲生物活性。本文業(yè)已公開，含ET29和/或TIC809或ET37的組合物對鞘翅目害蟲有殺蟲性。TIC810和TIC812還沒有表現(xiàn)出對鞘翅目昆蟲的殺蟲生物活性，<旦正如本文所7>開的，其可用于促進(jìn)ET29和或TIC809和ET37的高水平表達(dá)和穩(wěn)定性。ET29先前還沒有表現(xiàn)出針對祁頭蚤(C^wcep/za/WMsp.)的殺蟲生物活性，預(yù)期ET37對該類昆蟲也會表現(xiàn)出活性。推測TIC810和/或TIC812也具有殺蟲生物活性，所以在抗其它植物害蟲的生物測定中測試這些蛋白，所述其它植物害蟲例如為半翅目害蟲，例如豆莢盲椿(Lygw/^pems)(西方牧草盲蝽(WesternTarnishedPlantBug;WTPB))。WTPB是攻擊眾多雜草和作物的食植物的刺吸式昆蟲。WTPB通過直接進(jìn)食損傷來損害農(nóng)作物，包括棉花。使用該類昆蟲測試殺蟲組合物的測定必須允許昆蟲的天然進(jìn)食行為。使用的進(jìn)食測定基于使用藥粉包系統(tǒng)(sachetsystem)的96孔微量滴定板模式，參見Habibi等，C^c/z/va。//"化"5!,oc/zem.a"c/尸/z^.50:62-74(2002》。WTPB人工食物由Bio-Serv(Bio-ServDietF9644B，F(xiàn)renchtown,NJ)提供。使580ml高壓蒸汽滅菌的煮沸水和156.3gBio-ServDietF9644B在表面消毒的混合器中混合。加入4個表面消毒的雞蛋的內(nèi)容物，將混合物混勻，直至平滑，然后調(diào)整至1L總體積，并^f吏其冷卻。通過將需要濃度的20|il樣品和200^混合食物混合(1:10)制備毒素樣品。根據(jù)測試需要的單個樣品數(shù)目，該量可;^文大或縮小。將一片Parafilm(PechineyPlasticPacking,Chicago,IL)放置在設(shè)計(jì)用于96孔斧反才莫式(AnalyticalResearchSystems,Gainesville,FL)的真空歧管上，應(yīng)用約-20mm汞柱的真空度，該真空度足以使Parafilm擠入到孔中。向Parafilm⑧孔加入40pi測試樣品。然后將一片Mylar月莫(ClearLamPackaging,Inc.,ElkGroveVillage,IL)方欠置在Parafilm上，并用電爽斗(BienfangSealectorII，HuntCorporation,Philadelphia,PA)輕輕密封。然后將Pamfilm⑧藥粉包放置在含懸浮在瓊脂糖中的WTPB卵的平底96孔板上。在孵化時，WTPB蛹將刺穿存在于它們之上的藥粉包進(jìn)食。由于將WTPB口分泌物擠入到藥粉包中而引起的口外消化可導(dǎo)致食物內(nèi)容物在昆蟲攝入前蛋白水解和降解。為確保完整蛋白在昆蟲食物中被提供給昆蟲，每兩天更換一次食物藥粉包。這種強(qiáng)化允許在進(jìn)食測定過程中更長時間地提供完整食物內(nèi)容物。昆蟲食物藥粉包在第2、4和6天更換。在第8天確定萎縮和死亡得分，并與未處理的檢查結(jié)果(UTC)對比。單獨(dú)地和組合例如TIC809加TIC810測試蛋白ET29(或TIC809)、TIC810、ET37和TIC812(美國專利申請?zhí)?0V713，lll)對WTPB的毒性。晶體蛋白在無晶體蘇云金芽孢桿菌菌抹EG10650中表達(dá)，并經(jīng)蔗糖分級梯度純化，以除去孢子和細(xì)胞碎片。蔗糖分級梯度(IOmL各55%、70%和79%蔗糖在10mMTris-HCl、0.1mMEDTA、0.005%TritonX-100中的溶液，pH7.5)在25x89mmUltra-Clear離心管(BeckmanInstruments,Inc.,PaloAlto，CA)中制備。孢子-晶體懸液處于梯度頂部，以18,000rpm(4'C)在配備SW28轉(zhuǎn)子的超速離心機(jī)中離心4-18小時。蛋白晶體由55-70%或70-79%蔗糖界面回收，并懸浮在25mMTris-HClpH7.5中。初始生物測定包含終濃度為200ppm的純化的Bt殺蟲蛋白。在進(jìn)食測定中各包含鞘翅目特異性毒素Cry3Bbl(Donovan等，Appl.Environ.Microbiol.58:3921-3927(1992》、鱗翅目特異性毒素CrylAc(Baum等，Appl.Environ.Microbiol.56:3420-3428(1990)和鱗翅目特異性毒素CrylBbl(美國專利第5，322，687號)作為陰性對照。令人驚奇的是，WTPB蛹在接觸TIC810加ET29蛋白組合時表現(xiàn)出萎縮和死亡，并如所預(yù)期的，在僅接觸ET29或任何其它BT蛋白Cry3Bbl、CrylAc或CrylBbl時都沒有觀察到萎縮和死亡，在與未處理對照相比時它們?nèi)紱]有表現(xiàn)出明顯差異。擴(kuò)展草盲蝽生物測定，以包含TIC810、TIC812的單個晶體制備物以及TIC812和ET37的混合物。與上述結(jié)果類似，只有兩種蛋白的組合才表現(xiàn)出顯著的殺蟲活性。在與未處理的對照或僅使用單個蛋白的生物測定相比時，TIC810加ET29以及TIC812加ET37表現(xiàn)出顯著的死亡率和數(shù)量下降。但是，TIC810力口ET29(或TIC809)組合比TIC812加ET37組合表現(xiàn)出更大的死亡率和數(shù)量下降。這些生物測定的結(jié)果表明，單獨(dú)的TIC810或TIC812對WTPB均無毒，TIC810和ET29的混合物或者TIC812和ET37的混合物對WTPB有毒，這類似于針對玉米根蟲幼蟲測試時觀察到的結(jié)果。實(shí)施例11本實(shí)施例說明了用于表達(dá)TIC809和/或TIC810及其同源物的表達(dá)盒的構(gòu)建。構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化載體，以在植物中獲得高水平的根蟲毒性TIC809和/或ET37蛋白表達(dá)。含TIC812和ET37編碼序列的載體可用于共表達(dá)TIC812和ET37蛋白，由此獲得抗蟲植物，該植物具有高水平的在植物體中的ET37蛋白生產(chǎn)。TIC810連同ET37的共表達(dá)足以在宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)ET37的穩(wěn)定高水平累積。類似地，TIC812連同ET29乃至TIC809的共表達(dá)足以在宿主細(xì)胞中獲得穩(wěn)定的高水平的ET29或TIC809累積。如上文所述，預(yù)期與ET29和/或ET37具有約15%至約100%的氨基酸序列相似性的Cytl和Cyt2類蛋白在宿主細(xì)胞中連同TIC810、TIC812或具有的氨基酸序列與TIC810或TIC812具有約50%至約100%的氨基酸序列相似性的直系同源或同源蛋白一起表達(dá)時，將具有改善的表達(dá)和/或累積，由這些Cyt蛋白表達(dá)引起任何負(fù)面表型作用都將被這些Cyt蛋白與TIC810、TIC812或其變體的共表達(dá)改善。以上說明書描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解，在不偏離本發(fā)明的范圍和精神以及無需過多實(shí)驗(yàn)的情況下，本發(fā)明可采用廣泛的等價參數(shù)實(shí)施。盡管已結(jié)合其具體實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但要理解的是，本發(fā)明能夠進(jìn)一步修改。本發(fā)明用于按照本發(fā)明一般原則覆蓋本發(fā)明的任何用途、變化或修改。在隨附的所有權(quán)利要求中提供的各項(xiàng)內(nèi)容的多種排列和組合是可能的，都落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本說明書中提及的所有出版物、專利和公布的專利申請都在此1入作為參考，如同每個單獨(dú)的出版物或?qū)＠唧w地和單獨(dú)地指明被引入作為參考一樣。權(quán)利要求1.一種編碼殺蟲蛋白的分離純化的核苷酸序列，所述蛋白選自SEQIDNO2、SEQIDNO4、SEQIDNO6、SEQIDNO8、SEQIDNO10、SEQIDNO12和SEQIDNO47。2.權(quán)利要求1的分離純化的核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQIDNO:l、SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9、SEQIDNO:l1和SEQIDNO:46。3.—種分離純化的殺蟲蛋白，所述殺蟲蛋白選自ET29、ET37、TIC810、TIC812、TIC809和TIC127。4.一種用編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞，所述殺蟲蛋白選自ET29、ET37、TIC810、TIC812、TIC809和TIC127。5.權(quán)利要求4的植物的子代或種子，其中所述子代或種子包含所述核苦酸序列。6.—種載體，所述載體包含的核苷酸序列編碼的蛋白選自ET29、ET37、TIC810、TIC812、TIC809和TIC127。7.—種在宿主細(xì)胞中增強(qiáng)第一種殺蟲蛋白累積的方法，所述方法包括同時表達(dá)選自ET29、TIC809和ET37的所述第一種蛋白和選自TIC810和TIC812的第二種殺蟲蛋白，其中，相比于在沒有所述第二種蛋白時表達(dá)的所述第一種蛋白的累積，所述同時表達(dá)增強(qiáng)第一種蛋白的累積。8.—種表現(xiàn)出殺蟲活性的組合物，所述組合物包含選自ET29、ET37和TIC809的第一種蛋白以及選自TIC810和TIC812的第二種蛋白。9.權(quán)利要求8的組合物，其中所述第一種蛋白是TIC809,所述第二種蛋白是TIC810。10.權(quán)利要求8的組合物，其中所述第一種蛋白與所述第二種蛋白的比率為約1:1至約2:1。11.權(quán)利要求8的組合物，所述組合物以農(nóng)學(xué)上可接受的制劑在鞘翅目或半翅目植物害蟲的食物中提供。12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述制劑由在植物細(xì)胞中表達(dá)的兩種蛋白組成。13.權(quán)利要求11的組合物，其中所述鞘翅目害蟲為玉米根蟲，所述半翅目害蟲為草盲蝽。14.一種商品，所述商品包括可才企測量的選自ET29、ET37和TIC809的第一種蛋白，以及可4企測量的選自TIC810和TIC812的第二種蛋白。15.—種商品，所述商品包括可檢測量的(l)第一種核苷酸序列和第二種核苷酸序列，所述第一種核苷酸序列編碼選自ET29、ET37和TIC809的第一種蛋白，所述第二種核苷酸序列編碼選自TIC810和TIC812的第二種蛋白；(2)選自ET29、ET37和TIC809的第一種蛋白,和選自TIC810和TIC812的第二種蛋白；(3)(1)和(2)這二者；或(4)(1)和(2)的任何組合。16.權(quán)利要求14-15中任一項(xiàng)的商品，所述商品選自棉籽、棉籽油、棉籽餅、大豆種子、大豆油、大豆餅、大豆粉、蒸餾干谷物固體、玉米種子、玉米粉、玉米餅、玉米漿、玉米油、玉米淀粉、動物飼料以及全部或部分生產(chǎn)以含有大豆和/玉米副產(chǎn)物的谷物產(chǎn)品。17.—種制備抗害蟲的植物細(xì)胞的方法，所述方法包括轉(zhuǎn)化所述植物細(xì)胞，以表達(dá)殺蟲有效量的毒素組合物，所述毒素組合物包含選自ET29、ET37和TIC809的第一種蛋白以及選自TIC810和TIC812的第二種蛋白。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述植物細(xì)胞再生為能育轉(zhuǎn)基因植物。19.權(quán)利要求17的方法，其中所述植物細(xì)胞選自單子葉植物細(xì)胞和雙子葉4直物細(xì)胞。20.權(quán)利要求19的方法，其中(l)所述單子葉植物細(xì)胞選自玉米、小麥、燕麥、水稻、高粱、蜀黍、蕎麥、黑麥、草(牛毛草、梯牧草、雀麥草、鴨茅、圣奧古斯丁草、百慕大草、翦股穎)和大麥植物細(xì)胞，(2)所述雙子葉植物細(xì)胞選自苜蓿、蘋果、杏、蘆筍、菜豆、漿果、黑莓、藍(lán)莓、油菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、櫻桃、鷹嘴豆、柑橘樹、棉花、虹豆、酸果蔓、黃瓜、葫蘆、茄子、果樹、葡萄、檸檬、萵苣、亞麻子、香瓜、芥菜、結(jié)堅(jiān)果的樹、秋葵、橘、豌豆、桃、花生、梨、李、馬鈴薯、大豆、南瓜、草莓、糖甜菜、向日葵、甘薯、煙草、番茄、蕪菁和蔬菜植物細(xì)胞。21.權(quán)利要求18的方法，其中子代植物和種子由所述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生，其中所述子代植物和種子包含所述第一種和第二種蛋白。22.—種包含編碼cyt蛋白的核苷酸序列的宿主細(xì)胞，所述蛋白選自TIC809、ET37、TIC810、TIC812和TIC127。23.權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞選自植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。24.權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞選自單子葉植物細(xì)胞和雙子葉植物細(xì)胞。25.權(quán)利要求24的宿主細(xì)胞，其中(l)所述單子葉植物細(xì)胞選自玉米、小麥、燕麥、水稻、高粱、蜀黍、蕎麥、黑麥、草(牛毛草、梯牧草、雀麥草、鴨茅、圣奧古斯丁草、百幕大草、翦股穎)和大麥植物細(xì)胞，(2)所述雙子葉植物細(xì)胞選自苜蓿、蘋果、杏、蘆筍、菜豆、漿果、黑莓、藍(lán)莓、油菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、櫻桃、鷹嘴豆、柑橘樹、棉花、豇豆、酸果蔓、黃瓜、葫蘆、茄子、果樹、葡萄、檸檬、萵苣、亞麻子、香瓜、芥菜、結(jié)堅(jiān)果的樹、秋葵、橘、豌豆、桃、花生、梨、李、馬鈴薯、大豆、南瓜、草莓、糖甜菜、向日葵、甘薯、煙草、番茄、蕪菁和蔬菜植物細(xì)胞。26.—種用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)殺蟲蛋白的表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒包含可操作連接的、在所述宿主細(xì)胞中有功能的啟動子序列以及編碼所述蛋白的核苷酸序列，所述蛋白選自TIC809、TIC810、TIC812、ET37和TIC127。27.權(quán)利要求26的表達(dá)盒，其中所述宿主細(xì)胞選自細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞和一直物細(xì)胞。28.權(quán)利要求27的表達(dá)盒，其中a)所述細(xì)菌細(xì)胞選自芽孢桿菌細(xì)胞、腸桿菌細(xì)胞、假單胞菌細(xì)胞、梭菌細(xì)胞和根瘤菌細(xì)胞，以及土壤桿菌細(xì)胞；和b)所述植物細(xì)胞選自由雙子葉植物和單子葉植物組成的植物，所述雙子葉植物又選自苜蓿、蘋果、杏、蘆夢、菜豆、漿果、黑莓、藍(lán)莓、油菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、櫻桃、鷹嘴豆、柑橘樹、棉花、豇豆、酸果蔓、黃瓜、葫蘆、茄子、果樹、葡萄、檸檬、萵苣、亞麻子、香瓜、芥菜、結(jié)堅(jiān)果的樹、秋葵、橘、豌豆、桃、花生、梨、李、馬鈴薯、大豆、南瓜、草莓、糖甜菜、向日葵、甘薯、煙草、番茄、蕪菁和蔬菜，而所述單子葉植物又選自玉米、小麥、燕麥、水稻、高粱、蜀黍、蕎麥、黑麥、草(牛毛草、梯牧草、雀麥草、鴨茅、圣奧古斯丁草、百慕大草、蓊股穎)和大麥。29.權(quán)利要求26的表達(dá)盒，其中所述宿主細(xì)胞為植物細(xì)胞，所述表達(dá)盒還包含可操作連接的序列，所述序列選自表達(dá)增強(qiáng)子序列、非翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子序列、靶向葉綠體的肽編碼序列以及轉(zhuǎn)錄終止和聚腺普酸化序列。30.—種載體，所述載體包含權(quán)利要求26-29中任一項(xiàng)的表達(dá)盒。31.—種抗昆蟲侵襲的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞包含編碼第一種cyt毒素和第二種cyt毒素的核苷酸序列，所述第一種cyt毒素選自ET29、TIC809和ET37,所述第二種cyt毒素選自TIC810和TIC812。32.權(quán)利要求31的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，其中所述轉(zhuǎn)基因植物選自雙子葉植物或雙子葉植物細(xì)胞和單子葉植物或單子葉植物細(xì)胞，所述雙子葉植物或雙子葉植物細(xì)胞又選自苜蓿、蘋果、杏、，夢、菜豆、漿果、黑莓、藍(lán)莓、油菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、櫻桃、鷹嘴豆、柑橘樹、棉花、豇豆、酸果蔓、黃瓜、葫聲、茄子、果樹、葡萄、檸檬、萵苣、亞麻子、香瓜、芥菜、結(jié)堅(jiān)果的樹、秋葵、橘、豌豆、桃、花生、梨、李、馬鈴薯、大豆、南瓜、草莓、糖甜菜、向曰葵、甘薯、煙草、番茄、蕪菁和蔬菜，而所述單子葉植物又選自玉米、小麥、燕麥、水稻、高粱、蜀黍、蕎麥、黑麥、草(牛毛草、梯牧草、雀麥草、鴨茅、圣奧古斯丁草、百慕大草、剪股穎)和大麥。33.權(quán)利要求32的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，所述轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞能抵抗(l)鞘翅目昆蟲侵襲和(2)半翅目昆蟲侵襲，其中所述鞘翅目昆蟲選自葉曱科、扁曱科、金龜子科、谷盜科、擬步曱科、象蟲科、叩曱科和豆象科，所述半翅目選自異翅亞目和同翅亞目。34.權(quán)利要求33的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞，其中所述葉曱科為選自以下的葉甲蟲西方玉米才艮蟲(Z)/"6ra"cav^g!/era)、南方玉米沖艮蟲(D/"6ra/7'caw(iece/7/7Mwctoto)、北方玉米才艮蟲(D/fl6ra"ca6ar6en〕、墨西哥玉米才艮蟲(Dia6ro"cavz>g7/erazeae)、巴西玉米才艮蟲(DZ"6ra〃c"以及巴西玉米根蟲復(fù)合群(BCR)，所述巴西玉米根蟲復(fù)合群還包才舌Z)/<3Z)ra//cav/n'c/w/a和南美葉曱(D/aZra/z'cas/ecz.osa)。35.權(quán)利要求33的轉(zhuǎn)基因植物或植物細(xì)胞的子代或種子，其中所述子代或種子包含所述核苷酸序列。36.—種防治鞘翅目或半翅目昆蟲侵襲植物的方法，所述方法通過在昆蟲食物中提供一種或多種用核酸序列轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，所述核酸序列包含有效連接的植物功能性啟動子和編碼融合蛋白的核苷酸序列，其中所述融合蛋白包含選自SEQIDNO:2、SEQIDNO:8和SEQIDNO:14的第一種氨基酸序列以及選自SEQIDNO:4和SEQIDNO:6的第二種氛基i^列。37.—種保護(hù)大田中作物免受昆蟲侵襲的方法，所述方法包括培育含殺蟲有效量的第一種蛋白和第二種蛋白的轉(zhuǎn)基因作物，所述第一種蛋白選自ET37、ET29和TIC809,所述第二種蛋白選自TIC810和TIC812，并在昆蟲食物中一起提供所迷蛋白，以抑制昆蟲在所述轉(zhuǎn)基因作物上存活。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述昆蟲選自鞘翅目昆蟲和半翅目昆蟲。39.權(quán)利要求37的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因作物還包含與所述第一種和第二種蛋白具有相同昆蟲毒性的額外殺蟲劑，其中所述額外殺蟲劑選自芽孢桿菌毒素、致病桿菌毒素、發(fā)光桿菌毒素和特異性抑制所述昆蟲中的一種或多種必需基因的dsRNA。40.權(quán)利要求37-39中任一項(xiàng)的方法，其中所述作物的產(chǎn)量相比于沒有所述殺蟲蛋白的等基因作物的產(chǎn)量被提高。全文摘要本發(fā)明提供編碼蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)的ET37、TIC810和TIC812蛋白的分離的多核苷酸序列，以及用于在植物中表達(dá)TIC809、ET37、TIC810和TIC812以及這些蛋白的多種殺蟲有效組合的融合體如TIC127的核苷酸序列。公開了在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物的開發(fā)中制備和使用所述多核苷酸序列和蛋白的方法，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物針對以下害蟲具有改善的抗蟲性(1)鞘翅目昆蟲，包括西方玉米根蟲(Diabroticavirgifera)、南方玉米根蟲(Diabroticaundecempunctata)、北方玉米根蟲(Diabroticabarbed)、墨西哥玉米根蟲(Diabroticavirgiferazeae)、巴西玉米根蟲(Diabroticabalteata)和巴西玉米根蟲復(fù)合群(Diabroticaviridula和南美葉甲(Diabroticaspeciosa))，和(2)半翅目昆蟲，例如草盲蝽。文檔編號C07K14/195GK101300353SQ200680040460公開日2008年11月5日申請日期2006年8月30日優(yōu)先權(quán)日2005年8月31日發(fā)明者C·A·查伊,H·M·安德森,J·A·鮑姆,J·K·羅伯茨,蓓張申請人:孟山都技術(shù)有限公司