專利名稱：：選擇性萃取原花青素的方法選擇性萃取原花青素的方法相關申請的交叉引用本申請要求2005年10月3日遞交的美國申請No.11/242，473(現(xiàn)未決)的優(yōu)先權(quán)。發(fā)明背景發(fā)明領域本發(fā)明涉及使用特定順序的'容劑，依照其聚合度選擇性萃取可可原花青素的方法。特別地，本發(fā)明涉及使用乙酸正丁酯作為第一萃取溶劑，從可可原花青素的混合物中選擇性萃取單獨的低聚物或小組低聚物的方法。眾所周知，單獨的黃烷-3-醇，例如兒茶素、表兒茶素和可可原花青素低聚物，表現(xiàn)出獨特的性質(zhì)并且具有供人類和動物使用的獨特應用。基于聚合度選擇性萃取特定的單體或低聚物，使得其在藥理應用上以及食品級產(chǎn)品的應用中更具靶向性和有效性。相關技術(shù)的討論原花色素，即黃烷-3-醇的低聚物和聚合物，為繼木質(zhì)素之后含量第二豐富的天然植物酚。黃烷-3-醇亞單位主要通過一個亞單位4位與另一個亞單位8位間的碳碳4建(C4—C8)而連接在一起，少量通過C4—C6鍵而連4矣在一起。原花青素代表了最大一類的原花色素。Gu等人指出，在41種已發(fā)現(xiàn)含有原花色素的食物中，有27種含有原花青素。(J.Agric.andFoodChem.51(2003)7513)。原花青素通常由(-)-表兒茶素、(+)-表兒茶素、(-)-兒茶素和/或(+)-兒茶素亞單位組成。原花色素包括B-型和A-型原花色素。在B-型原花色素中，單體亞單位(表兒茶素、兒茶素)通過黃烷間C4—C6和/或黃烷間C4—C8鍵而連接在一起。只具有C4—C8鍵的低聚物為線性，而至少一個C4—C6鍵的存在將導致支化的低聚物。而A-型原花色素為包括鍵C2-0-C7以及C4—C6或C4—C8的雙重連4妄低聚物。原花色素的分子量通常用聚合度(DP)表示，單獨的低聚物通常被稱作二聚物、三聚物等。已知用于人體和動物時各種原花青素低聚物具有特異性質(zhì)和潛在作用。例如，Tempesta公開了聚合度(DP)為2-11的原花青素低聚物具有明顯的抗病毒活性，并用于治療^^皮副敘液病毒(paramyxovaridae)(例如呼吸道合月包病毒)、正|占液病毒(orthomyxovaridae)(例如流行性感冒病毒A、B和C)以及皰滲病毒(例如單純皰滲病毒)感染的包括人在內(nèi)的溫血動物(美國專利5,211,944)。RomanczykJr.等公開了包含DP為3-11的原花青素低聚物和合適載體的抗腫瘤組合物(美國專利5,554，645)。RomanczykJr.等還公開了DP為5-12的原花青素低聚物用作抗氧化劑(美國專利5,891,905)。Schmitz等公開了將DP為2-18的可可原花青素低聚物與乙酰水楊酸用于抗血小板療法(美國專利6,524,630)。在分離并分析原花青素低聚物方面，現(xiàn)已取得了顯著進步，(見Rigaud等人，Chromatogr.654(1993)179;Cheynier等人，MethodsinEnzymology299(1999);Natsume等人，Biosci.Biotechnol.Biochem.64(2000)2581)?，F(xiàn)已對原花青素低聚物分離到五聚物(DP=5)。Hammerstone等人公開了對本方法的修改，從而在未發(fā)酵可可種子的分析中取得了分離單體至九聚物的進展，(J.Agric.andFoodChem.47(1999)490)。Gu等人還公開了進一步的進展，導致聚合物峰(DP>10)的洗脫，也改善了整體的峰型和分離度，(J.Agric.andFoodChem.50(2002)4852)。希望能夠最大程度地增加可可原花青素在制備型HPLC系統(tǒng)上的負載容量，這樣可以洗脫更多量所需的特定單體和/或低聚物，以進一步研究或使用。理論上，制備型HPLC柱(300x55mm,100pm)的負載容量約為4克物質(zhì)。然而，可可原花青素提取物的溶解性問題限制其最大負載容量至約為400毫克，其中只有約41%為黃酮類。預期在進樣HPLC柱之前，通過從多酚混合物中選擇性萃取單獨或小組低聚物，可以顯著增加樣品負載(黃烷醇)量。因此，需要的是，花青素低聚物的方法。發(fā)明概述本發(fā)明提供了從可可多酚水性混合物中選擇性萃取可可原花青素的方法，該方法用乙酸正丁酯萃取水性混合物，分離水相和乙酸正丁酯相。所述水相富集原花青素二聚物及更高的低聚物，乙酸正丁酯相富集兒茶素和表兒茶素。在優(yōu)選的實施方式中，用能有效地選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物的有機溶劑(其是二乙醚或者乙酸曱酯和二乙醚的混合物)，萃取富集原花青素二聚物及更高低聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素三聚物及更高^^聚物，有機相富集原花青素二聚物。優(yōu)選地，乙酸甲酯和二乙醚的混合物約為25:75(v/v)。此外在本實施方式中，用乙酸乙酯萃取富集原花青素三聚物及更高低聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素五聚物及更高低聚物，乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物。此外在本實施方式中，用能有效地選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物的有機溶劑(其是乙酸曱酯和二乙醚的混合物)，萃取富集原花青素五聚物及更高低聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素六聚物及更高低聚物，有機相富集原花青素五聚物。優(yōu)選地，乙酸曱酯和二乙醚的混合物約為75:25(v/v)。此外在本實施方式中，用乙酸甲酯萃取富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素九聚物及更高低聚物，乙酸曱酯相富集原花青素六聚物、七聚物和八聚物。此外在本實施方式中，用乙酸曱酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相，并分離相。乙酸甲酯相富集原花青素九聚物及更高低聚物。在另一個實施方式中，用乙酸曱酯萃取富集原花青素三聚物及更高低聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素九聚物及更高低聚物，9乙酸甲酯相富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物和八聚物。此外在本實施方式中，除去乙酸曱酯相的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用乙酸乙酯萃取溶解的產(chǎn)物。分離相，水相富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物和八聚物，乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物。此外在本實施方式中，用能有效地選擇性萃取兒茶素、表兒茶素及原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物的有機溶劑(其是乙酸曱酯和二乙醚的混合物)，萃取富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物和八聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素六聚物、七聚物和八聚物，有機相富集原花青素五聚物。優(yōu)選地，乙酸曱酯和二乙醚的混合物約為75:25(v/v)。同樣在本實施方式中，用乙酸甲酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相，并分離相。乙酸甲酯相富集原花青素九聚物及更高低聚物。在另一個實施方式中，用乙酸乙酯萃取富集原花青素二聚物及更高低聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素五聚物及更高低聚物，乙酸乙酯相富集原花青素二聚物、三聚物和四聚物。在本實施方式中，用能有效地選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物的有機溶劑(其是乙酸曱酯和二乙醚的混合物)，萃取富集原花青素五聚物及更高低聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素六聚物及更高低聚物，有機相富集原花青素五聚物。優(yōu)選地，乙酸甲酯和二乙醚的混合物約為75:25(v/v)。此外在本實施方式中，用乙酸曱酯萃取富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素九聚物及更高低聚物，乙酸曱酯相富集原花青素六聚物、七聚物和八聚物。此外在本實施方式中，用乙酸曱酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相，并分離相。乙酸曱酯相富集原花青素九聚物及更高低聚物。同樣在本實施方式中，除去乙酸乙酯相的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用能有效地選擇萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物的有機溶劑(其是二乙醚或者乙酸甲酯和二乙醚的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。分離相。水相富集原花青素三聚物和四聚物，有機相富集原花青素二聚物。優(yōu)選地，乙酸曱酯和二乙醚的混合物約為25:75(v/v)?；蛘咴诒緦嵤┓绞街?，用乙酸曱酯萃取富集原花青素五聚物及更高低聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素九聚物及更高低聚物，乙酸曱酯相富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物和八聚物。同樣在此供選實施方式中，除去乙酸曱酯相的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用能有效地選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物的有機溶劑(其是乙酸曱酯和二乙醚的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。分離相。水相富集原花青素六聚物、七聚物和八聚物，有機相富集原花青素五聚物。優(yōu)選地，乙酸曱酯和二乙醚的混合物約為75:25(v/v)。在另一個實施方式中，用能有效地選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物的有機溶劑(其是乙酸甲酯和二乙醚的混合物)，萃取富集原花青素二聚物及更高低聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素六聚物及更高低聚物，有機相富集原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物。優(yōu)選地，乙酸甲酯和二乙醚的混合物約為75:25(v/v)。在本實施方式中，用乙酸甲酯萃取富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素九聚物及更高低聚物，乙酸甲酯相富集原花青素六聚物、七聚物和八聚物。此外在本實施方式中，用乙酸曱酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相，并分離相。乙酸甲酯相富集原花青素九聚物及更高低聚物。或者在本實施方式中，除去富集原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物的有機相的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用能有效地選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物的有機溶劑(其是二乙醚或乙酸甲酯和二乙醚的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。分離相。水相富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物，有機相富集原花青素二聚物。優(yōu)選地，乙酸曱酯和二乙醚的混合物約為25:75(v/v)。同樣在本替代實施方式中，用乙酸乙酯萃取富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素五聚物，乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物。在另一個實施方式中，用乙酸甲酯萃取富集原花青素二聚物及更高低聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素九聚物及更高低聚物，乙酸曱酯相富集原花青素二聚物、三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物和八聚物。在本實施方式中，除去乙酸曱酯相的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用能有效地選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物的有機溶劑(其是二乙醚或乙酸甲酯和二乙醚的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。分離相。水相富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物和八聚物，有機相富集原花青素二聚物。優(yōu)選地，乙酸甲酯和二乙醚的混合物約為25:75(v/v)。此外在本實施方式中，用乙酸乙酯萃取富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物和少量九聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物和少量原花青素九聚物，乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物。此外在本實施方式中，用能有效地選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物的有機溶劑(其是乙酸曱酯和二乙醚的混合物)，萃取富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物和少量原花青素九聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素六聚物、七聚物和八聚物，有機相富集原花青素五聚物。優(yōu)選地，乙酸甲酯和二乙醚的混合物約為75:25(v/v)?；蛘咴诒緦嵤┓绞街?，除去富集原花青素二聚物、三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物和八聚物的乙酸甲酯相的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用能有效地選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物的有機溶劑(其是乙酸曱酯和二乙醚的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。分離相。水相富集原花青素六聚物、七聚物和八聚物，有機相富集原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物。優(yōu)選地，乙酸曱酯和二乙醚的混合物約為75:25(v/v)。同樣在本替代實施方式中，除去富集原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物的有機相的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用能有效地選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物的有機溶劑(其是二乙醚或者乙酸甲酯和二乙醚的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。分離相。水相富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物，有機相富集原花青素二聚物。優(yōu)選地，乙酸曱酯和二乙醚的混合物約為25:75(v/v)。同樣在本替代實施方式中，用乙酸乙酯萃取富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物的水相，并分離相。水相富集原花青素五聚物，乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物。這些及其它目的和實施方式在此公開，或者依照以下詳述說明書是顯而易見的。附圖簡述圖1:可可多酚標準品的HPLC色譜圖。圖2:來自水性可可多酚提取物的乙酸甲酯有機萃取部分的HPLC/FLD色譜圖。圖3:來自水性可可多酚提取物的乙酸正丁酯有機萃取部分的HPLC/FLD色譜圖。圖4:來自水性可可多酚提取物的乙酸乙酯有機萃取部分的HPLC/FLD色譜圖。圖5:來自水性可可多酚提取物的二乙醚有機萃取部分的HPLC/FLD色譜圖。圖6:來自水性可可多酚提取物的有機萃取部分的HPLC/FLD色語圖，溶劑為乙酸曱酯和二乙醚的混合物(25:75v/v)。圖7:來自水性可可多酚提取物的有機萃取部分的HPLC/FLD色鐠圖，溶劑為乙酸甲酯和二乙醚的混合物(50:50v/v)。圖8:來自水性可可多酚提取物的有機萃取部分的HPLC/FLD色譜圖，溶劑為乙酸甲酯和二乙醚的混合物(75:25v/v)。圖9:選擇性萃取水性可可多酚提取物的選擇性萃取路徑流程圖；第一溶劑是乙酸正丁酯。圖10:選擇性萃取水性可可多酚提取物的選擇性萃取路徑流程圖；第一溶劑是乙酸乙酯。圖11:選擇性萃取水性可可多酚提取物的選擇性萃取路徑流程圖；第一溶劑是乙酸甲酯。圖12:選擇性萃取水性可可多酚提取物的選擇性萃取路徑流程圖；第一溶劑是二乙醚。圖13:選擇性萃取水性可可多酚提取物的選擇性萃取路徑流程圖；第一溶劑是乙酸甲酯和二乙醚的混合物(25:75v/v)。圖14:選擇性萃取水性可可多酚提取物的選擇性萃取路徑流程圖；第一溶劑是乙酸甲酯和二乙醚的混合物(75:25v/v)。發(fā)明詳述本發(fā)明公開了從可可多酚水性混合物中選擇性萃取單獨或小組可可原花青素單體和/或低聚物的方法。特別地，本發(fā)明涉及通過所選順序的基于乙酸酯和/或二乙醚的溶劑，選擇性萃取原花青素單體和/或低聚物，其中第一萃取溶劑為乙酸正丁酯?，F(xiàn)已表明，將可可多酚提取物溶于水并用乙酸乙酯萃取該水溶液，可選擇性萃取較少量的原花青素低聚物(兒茶素、表兒茶素、原花青素二聚物、三聚物和四聚物)?；谶@些結(jié)果，考察了其它的溶劑(其不能與水混溶，是極性的、"綠色的"、食品級的，且價格合理)和溶劑順序。特別地，考察了用乙酸正丁酯和乙酸甲酯選擇性萃取可可原花青素單體和/或低聚物，考察了兩種溶劑單獨使用和與乙酸乙酯順序使用的情況。所有三種基于乙酸酯的溶劑可以食品級質(zhì)量購買。這在所萃取的低聚物部分用于食品或藥品時具有益處。圖1描述了可可多酚標準品的高效液相色譜圖，顯示單獨的單體和寸氐聚物。圖2顯示乙酸甲酯的選擇性萃取特征。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)用乙酸甲酯首先萃取水相可可多酚提取物可選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物、三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物和少量原花青素九聚物。還發(fā)現(xiàn)(未描繪)在除去較低級的低聚物之后，用乙酸曱酯進一步萃取可選擇性萃取原花青素九聚物及更高低聚物。圖3顯示了乙酸正丁酯的選擇性萃取特征，這在以前不為人所知。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，用乙酸正丁酯首先萃取水性可可多酚提取物，可選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和少量原花青素二聚物。圖4顯示了乙酸乙酯的選擇性萃取特征，如前所示，用乙酸乙酯首先萃取水性可可多酚提取物，可選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物、三聚物和四聚物。除了三種基于乙酸酯的溶劑之外，乙酸甲酯和二乙醚的混合物溶聚物。這種基于二乙醚的溶劑中，乙酸甲酯:二乙醚之比可以為0至100:100至0(v/v)。如圖5所示，當溶劑中乙酸甲酯:二乙醚為0:100(v/v)，也就是說，當溶劑僅為二乙醚時，該溶劑從水性可可多酚提取物中選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物。如圖6所示，當溶劑中乙酸甲酯:二乙醚為25:75(v/v)時，該溶劑選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物，以及少量原花青素三聚物。如圖7所示，當混合溶劑中乙酸曱酯:二乙醚為50:50(v/v)時，該溶劑選擇性萃取兒茶素、表兒茶素以及原花青素二聚物、三聚物和四聚物。如圖8所示，當混合溶劑中乙酸曱酯:二乙醚為75:25(v/v)時，該溶劑選擇性萃取兒茶素、表兒茶素以及原花青素二聚物、三聚物、四聚物、五聚物和少量原花青素六聚物。下表總結(jié)了這里討論的基于乙酸酯和二乙醚的有機溶劑的選擇性萃取特征。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>預期其它基于二乙醚的溶剤(乙酸曱酯與二乙醚的其它配比)，可選擇性萃取其它組的原花青素低聚物。有兩個主要因素決定特定選擇性萃取順序中所用的溶劑。第一個因素是所用單獨溶劑的萃取特征。如指出的，乙酸酯溶劑(乙酸正丁酯、乙酸乙酯和乙酸曱S旨)分別限于選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和少量原花青素二聚物；兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物、三聚物和四聚物；和兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物、三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物和少量原花青素九聚物。相比而言，基于二乙醚的溶劑組對原花青素低聚物的選擇性要大一些，這取決于溶劑中二乙醚的比例。例如，單獨用二乙醚可選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物。乙酸曱酯和二乙醚的混合物(25:75v/v)選擇性萃取兒茶素、表兒茶素，以及原花青素二聚物和少量原花青素三聚物。乙酸甲酯和二乙醚的混合物(75:25v/v)選擇性萃取兒茶素、表兒茶素，以及原花青素二聚物、三聚物、四聚物、五聚物和少量原花青素六聚物。確定所用溶劑的第二個因素是目標原花青素低聚物部分在所選溶劑中的相對溶解性。與乙酸甲S旨:二乙醚混合溶劑相比，可可原花青素傾向于更易溶解在基于乙酸酯的溶劑中，產(chǎn)生類似萃取特征。例如，乙酸乙酯，以及乙酸曱酯與二乙醚的等量混合物(50:50v/v),都是從水性可可多酚提取物中選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物、三聚物和四聚物。然而，乙酸乙酯需要較少次萃取洗滌來累積目標多酚。已知沒有一種溶劑能在單次萃取洗滌中完全萃取盡其目標多酚。乙酸酯溶劑需要多次萃取洗滌(多至四次)。相比而言，已知二乙醚和基于二乙醚的溶劑需要更多次額外的萃取洗滌(多于10次)才能接近完全(exhaustion)，也可能達不到完全萃取(exhaustiveextraction)。因此，在可能的情況下，用具有相應萃取特征的基于乙酸酯的溶劑代替基于二乙醚的溶劑，以改善萃取效率。根據(jù)基于乙酸酯和二乙醚的溶劑的選擇性萃取特征，可使用多種選擇性萃取順序來選擇性萃取所需的原花青素單體和/或低聚物?？赏ㄟ^任何常規(guī)方法來制備水性可可多酚提取物。對于第一溶劑是乙酸正丁酯或乙酸甲酯的選擇性萃取，水性可可多酚提取物的制備樣品制備來自脫脂可可固體的可可多酚j是取物?？煽啥喾犹崛∥锝?jīng)由多步工藝制備，旨在將可可原花青素的損失降至最低。收集可可種子，洗去漿狀物，并干燥。在環(huán)境條件下以壓榨器按壓干燥的可可豆，以去除可可脂。然后用乙醇:水(70:30v/v)研磨和提取油餅。離心去除固體。減壓蒸發(fā)提取液去除乙醇，最后噴霧干燥。樣品制備來自脫脂可可種子的可可多酚提取物。將新鮮的未發(fā)酵的可可種子(30g)冷凍干燥(16.9g)。用己烷使冷凍干燥的可可種子(10.2g)脫脂，研磨脫脂可可豆小樣(6.3g)，用40mL丙酮:水:醋酸(70:29.5:0.5,v/v/v)超聲(10分鐘，50。C)提取三次。減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除合并提取液中的丙酮。冷凍干燥剩余液體得到紫紅色殘留物(l.13g)。將干燥的可可多酚提取物溶于水中，優(yōu)選將50克提取物溶于200毫升水中，得到供選擇性萃取用的水性可可多酚提取物，開始用乙酸正丁酯或乙酸甲酯萃取。選擇性提取的部分經(jīng)由HPLC分析，使用配備有自動進樣器、四元HPLC泵、柱溫箱、二極管陣列檢測器和熒光檢測器的AgilentllOOHPLC系統(tǒng)。所用柱子為DevelosilDiol(250x4.6mm內(nèi)徑，5^粒徑)，購自Phenomenex(Torrance,California)。兩元流動相由(A)乙腈:醋酸(98:2，v/v)和(B)甲醇:水:醋酸(95:3:2，v/v/v)組成。利用線性梯度(流動相)在35°〇以1.0mL/分鐘流速如下進行分離0-35分鐘，0%B;35-40分鐘，40%B等度；40-45分鐘，40-0%B，接著5分鐘再平4軒時間。通過UV檢測(280nm)和熒光檢測(FLD)(激發(fā)波長=276腦，發(fā)射波長=31611111)監(jiān)控洗脫液。利用MS法和自Hammerstone等，J.Agric.andFoodChem.47(1999)490修改的參數(shù)表征提取物和純化的流分，通過引用將其公開的內(nèi)容結(jié)合到本文。電離試劑通過正好在質(zhì)譜前的HPLC洗脫液液流中的T形物加入，并通過HPLC泵輸送。用于在正離子模式分析的條件包括以0.05mL/分鐘流速引入0.05MNaCl以有助于電離，3.5kV毛細管電壓，100V裂解器(fragmentor)電壓，25psig噴霧壓力和350。C干燥氣體溫度。用于在負離子模式分析的條件包括1.5MNH4OH作為緩沖劑，其流速為0.09mL/分鐘29分鐘，然后0.05mL/分鐘。毛細管電壓為3kV，裂解器電壓為75V，噴霧壓力為25psig，干燥氣體溫度為350°C。MS分析忽略氬氧化銨的使用。將樣品溶解在丙酮水醋酸(70:29.5:0.5,v/v/v)或流動相中，注入前濾過0.45pmPTFE注射過濾器。所有提取都在室溫下進行。4是取溶劑中沒有使用酸。鑒于這里所用萃取溶劑的非完全萃取(non-exhaustive)性質(zhì)，如下面實施例中所用的，當所述溶劑為乙酸正丁酯、乙酸乙酯或乙酸甲酯時，"萃取，，是指用所述溶劑萃取洗滌(extractionwashes)多至四次。當使用二乙醚或者使用二乙醚和乙酸甲酯的任何混合物時，"萃取"是指用所述溶劑萃取洗滌至少10次。應明白的是，將每次萃取的所有有機相合并，以供使用或根據(jù)需要作進一步萃取。還有這里所用的，"富集，，是指以下內(nèi)容當溶劑;1^于乙酸酯或基于二乙醚的有機溶劑時，"富集"是指所鑒定的相基本上由溶于指定溶劑的所鑒定的單體和/或低聚物，以及其它痕量物質(zhì)所組成。當溶劑是水時，即所述相是來自萃取步驟的水性相時，"富集"是指所述相基本上由溶于水的所鑒定的單體和/或低聚物，以及其它痕量物質(zhì)組成。本領域技術(shù)人員明白，可以用常規(guī)方法來分離由下面實施例中各次提取所得到的有機相和水相，分開的相可根據(jù)需要直接使用，進一步萃取或者丟棄。如果需要，可通過常規(guī)方法來除去有機相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中以得到水性混合物。進一步理解的是，如果在實施例中有機溶劑相(乙酸正丁酯相、乙酸乙酯相、乙酸曱酯相、二乙醚相或其它有機相W支萃取，則在萃取之前通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去有機相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中，得到產(chǎn)物的水溶液，然后可對其進行萃取。以下實施例參考圖9至14將更容易理解。在圖中，"CP,，指可可多酚的水性提取物，包含兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物及更高低聚物。"O，，指有機相，"A，，指水相，可以指萃取后的相以及正被萃取的相(水相或有機相)。對于溶劑，"nBA"指乙酸正丁酯；"0:100"指只含二乙醚的溶劑；"25:75"指基于二乙醚的溶劑，其中乙酸甲酯與二乙醚之比為25:75(v/v);"EtAc，，指乙酸乙酯；"75:25"指基于二乙醚的溶劑，其中乙酸曱酯與二乙醚之比為75:25(v/v);"MeAc"指乙酸甲酯，不含二乙醚。括號里的數(shù)字指包含在被萃取相中的低聚物的聚合度。在實施例1至1.5.23中，最先萃取溶劑是乙酸正丁酯。參考圖9中的流程圖可更好地理解實施例。實施例1:最先萃取乙酸正丁酯:可用乙酸正丁酯萃取可可多酚的水性混合物(兒茶素、表兒茶素和原花青素二聚物及更高低聚物)。所得乙酸正丁酯相富集兒茶素和表兒茶素，以及少量原花青素二聚物，所得水相富集原花青素二聚物及更高低聚物。比較圖l、3。實施例1.1:第二次萃取二乙醚:可用二乙醚萃取富集原花青素二聚物及更高低聚物的水相(實施例1)，得到富集原花青素二聚物的有機(二乙醚)相和富集原花青素三聚物及更高低聚物的水相。實施例l丄l:第三次萃取乙酸乙酯:可用乙酸乙酯萃取富集原花青素三聚物及更高低聚物的水相(實施例1.1)。所得乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物，而所得水相富集原花青素五聚物及更高低聚物。實施例l丄2:第四次萃取乙酸曱酯:二乙醚(75:25v/v):可用有機溶劑(其是乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素五聚物及更高低聚物的水相(實施例l丄l),得到富集原花青素五聚物的有機相和富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相。實施例l丄3:第五次萃取乙酸甲酯:可用乙酸甲酯萃取富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相(實施例l丄2),得到富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物和少量原花青素九聚物的乙酸甲酯相和富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相。實施例l丄4:第六次萃取乙酸甲酯:可用乙酸甲酯萃取富集原花青素九聚物的水相(實施例l丄3)，得到富集原花青素九聚物及更高低聚物的有機相。所得水相基本除盡原花青素。實施例1丄5:第四次萃取乙酸曱酯:對實施例1丄2的改變，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例l丄l有機相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中。可用乙酸甲酯萃取溶解的產(chǎn)物，得到富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的乙酸甲酯相和富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相。實施例U.6:第五次萃取乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v):通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例l丄5乙酸曱酯相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中?？捎糜袡C溶劑(其是乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃^l溶解的產(chǎn)物，得到富集原花青素五聚物和少量原花青素六聚物的有機相。水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物和少量原花青素九聚物。實施例l丄7:第五次萃取乙酸曱酯:可用乙酸曱酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相(實施例l丄5)，得到富集原花青素九聚物及更高低聚物的乙酸甲酯相。水相基本除盡原花青素。實施例1丄8:第三次萃取乙酸曱酯:二乙醚(75:25v/v):對實施例l丄l的改變，可用有機溶劑(包含乙酸甲酯和二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素三聚物及更高低聚物的水相(實施例1.1)。所得有機相將富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物，及少量原花青素六聚物。水相將富集原花青素六聚物及更高低聚物。實施例1.1.9:第四次萃取乙酸乙酯:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例l丄8有機相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中?？捎靡宜嵋阴ポ腿∪芙獾漠a(chǎn)物，得到富集原花青素三聚物和四聚物的乙酸乙酯相，所得水相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物。20實施例1丄10:第四次萃取乙酸曱酯:可用乙酸甲酯萃取富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相(實施例l丄8)，得到富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的乙酸甲酯相，和富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相。實施例l丄ll:第五次萃取乙酸曱酯:可用乙酸甲酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相(實施例I丄IO)，得到富集原花青素九聚物及更高低聚物的乙酸甲酯相。水相基本除盡原花青素。實施例1丄12:第三次萃取乙酸曱酯:對實施例l丄l的另一種改變，可用乙酸曱酯萃取富集原花青素三聚物及更高低聚物的水相(實施例l.l),得到富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的乙酸甲酯相，和富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相。實施例1丄13:第四次萃取乙酸乙酯:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1丄12乙酸曱酯相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中?？捎靡宜嵋阴ポ腿∪芙獾漠a(chǎn)物，得到富集原花青素三聚物和四聚物的乙酸乙酯相。水相富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物和少量原花青素九聚物。實施例1丄14:第五次萃取乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v):可用有機溶劑(其是乙酸曱S旨:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物和少量原花青素九聚物的水相(實施例1丄13)，得到富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物的有機相。水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物和少量原花青素九聚物。實施例1丄15:第四次萃取乙酸曱酯:二乙醚(75:25v/v):對實施例1丄13的改變，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1丄12乙酸曱酯相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中。可用有機溶劑(其是乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物，得到富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物及少量原花青素六聚物的有機相。水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.1.16:第五次萃取乙酸乙酯:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1丄15有機相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中?？捎靡宜嵋阴ポ腿∪芙獾漠a(chǎn)物，得到富集原花青素三聚物和四聚物的乙酸乙酯相，和富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物的水相。實施例1丄17:第四次萃取乙酸甲酯:可用乙酸曱酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相(實施例U.12)。所得乙酸甲酯相富集原花青素九聚物及更高低聚物。水相基本除盡原花青素。實施例1.2:第二次萃取乙酸甲酯:二乙醚(75:75v/V):對實施例1.1的改變，可用有機溶劑(其是乙酸甲酯:二乙醚(25:75v/v)的混合物)萃取富集原花青素二聚物及更高低聚物的水相(實施例1)，得到富集原花青素二聚物及少量原花青素三聚物的有機相，和富集原花青素三聚物及更高低聚物的水相。實施例1.2.1:第三次萃取乙酸乙酯:可用乙酸乙酯萃取富集原花青素三聚物及更高低聚物的水相(實施例1.2)。所得乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物，而水相富集原花青素五聚物及更高低聚物。實施例1.2.2:第四次萃取乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v):可用有機溶劑(其是乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素五聚物及更高低聚物的水相(實施例1.2.1)，得到富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物的有機相。水相富集原花青素六聚物及更高低聚物。實施例1.2.3:第五次萃取乙酸曱酯:可用乙酸甲酯萃取富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相(實施例1.2.2)，得到富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的乙酸甲酯相，和富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相。實施例1.2.4:第六次萃取乙酸甲酯:可用乙酸曱酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相(實施例1.2.3)。所得乙酸甲酯相富集原花青素九聚物及更高低聚物，而水相基本除盡原花青素。實施例1.2.5:第四次萃取乙酸曱酯:對實施例1.2.2的改變，可用乙酸甲酯萃取富集原花青素五聚物及更高低聚物的水相(實施例1.2.1)，得到富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的乙酸甲酯相，和富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相。實施例1.2.6:第五次萃取乙酸曱酯:二乙醚(75:25v/v):通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.2.5有機相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中?？捎糜袡C溶劑(包含乙酸曱酉旨:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。所得有機相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物。水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.2.7:第五次萃取乙酸曱酯:可用乙酸甲酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相(實施例1.2.5)，得到富集原花青素九聚物及更高低聚物的乙酸甲酯相。水相基本除盡原花青素。實施例1.2.8:第三次萃取乙酸曱酯:二乙醚(75:25v/v):對實施例1.2.1的改變，可用有機溶劑(包含乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素三聚物及更高低聚物的水相(實施例1.2)。所得有才/L相富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物，及少量原花青素六聚物。水相富集原花青素六聚物及更高低聚物。實施例1.2.9:第四次萃取乙酸曱酯:可用乙酸甲酯萃取富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相(實施例1.2.8)。所得乙酸甲酯相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物，水相富集原花青素九聚物及更高#^聚物。實施例1.2.10:第五次萃取乙酸曱酯:可用乙酸曱酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相(實施例1.2.9)。所得乙酸甲酯相富集原花青素九聚物及更高低聚物，而水相基本除盡原花青素。實施例1.2.11:第四次萃fl:乙酸乙酯:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.2.8有機相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中。可用乙酸乙酯萃取溶解的產(chǎn)物。所得乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物，而水相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物。實施例1.2.12:第三次萃取乙酸甲酯:對實施例1.2.1的另一種改變，可用乙酸甲酯萃取富集原花青素三聚物及更高低聚物的水相(實施例1.2)。所得乙酸曱酯相富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物，而水相富集原花青素九聚物及更高低聚物。實施例1.2.13:第四次萃取乙酸乙酯:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.2.12乙酸曱酯相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中?？捎靡宜嵋阴ポ腿∪芙獾漠a(chǎn)物。所得乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物，而水相富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.2.14:第五次萃取乙酸曱酯:二乙醚(75:25v/v):可用有機溶劑(包含乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的水相(實施例1.2.13)。所得有機相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物。水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.2.15:第四次萃取乙酸曱西旨:二乙醚(75:25v/v):對實施例1.2.13的改變，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.2.12乙酸甲酯相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中?？捎糜袡C溶劑(包含乙酸曱酉旨:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。所得有機相富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物，及少量原花青素六聚物。水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.2.16:第五次萃取乙酸乙酯:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.2.15有機相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中?？捎靡宜嵋阴ポ腿∪芙獾漠a(chǎn)物。所得乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物，而水相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物。實施例1.2.17:第四次萃取乙酸甲酯:可用乙酸甲酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相(實施例1.2.12)。所得乙酸曱酯相富集原花青素九聚物及更高低聚物。水相基本除盡原花青素。實施例1.3:第二次萃取乙酸乙酯:對實施例U的進一步改變，可用乙酸乙酯萃取富集原花青素二聚物及更高低聚物的水相(實施例1)，得到富集原花青素二聚物、三聚物和四聚物的乙酸乙酯相，和富集原花青素五聚物及更高低聚物的水相。實施例1.3.1:第三次萃取二乙醚:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.3乙酸乙酯相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中。可用二乙醚萃取溶解的產(chǎn)物，得到富集原花青素二聚物的二乙醚相和富集原花青素三聚物和四聚物的水相。實施例1.3.2:第三次萃取乙酸甲酯:二乙醚(25:75v/v):實施例1.3.1的替代方法，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.3乙酸乙酯相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中?？捎糜袡C溶劑(包含乙酸甲酯:二乙醚(25:75v/v)的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物，得到富集原花青素二聚物及少量原花青素三聚物的有機相，和富集原花青素三聚物及四聚物的水相。實施例1.3.3:第三次萃取乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v):可用有機溶劑(包含乙酸曱酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素五聚物及更高低聚物的水相(實施例1.3),得到富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物的有機相，所得水相富集原花青素六聚物及更高低聚物。實施例1.3.4:第四次萃取乙酸曱酯:可用乙酸曱酯萃取富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相(實施例1.3.3),得到富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的乙酸甲酯相，和富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相。實施例1.3.5:第五次萃取乙酸甲酯:可用乙酸曱酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相(實施例1.3.4)，得到富集原花青素九聚物及更高低聚物的乙酸甲酯相。水相基本除盡原花青素。實施例1.3.6:第三次萃取乙酸甲酯:對實施例1.3.3的改變，可用乙酸曱酯萃取富集原花青素五聚物及更高低聚物的水相(實施例1.3)，得到富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的乙酸甲酯相，和富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相。實施例1.3.7:第四次萃取乙酸曱酉旨:二乙醚(75:25v/v):通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.3.6乙酸甲酯相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中。可用有機溶劑(包舍乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。所得有機相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物。水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.3.8:第四次萃取乙酸甲酯:可用乙酸甲酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相(實施例1.3.6)，得到富集原花青素九聚物及更高低聚物的乙酸甲酯相。水相基本除盡原花青素。實施例1.4:第二次萃取乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v):還是對實施例1.1的進一步改變，可用有機溶劑(包含乙酸曱酉旨:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素二聚物及更高低聚物的水相(實施例1),得到富集原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物及少量原花青素六聚物的有機相，和富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相。實施例1.4.1:第三次萃取二乙醚:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.4有機相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中?？捎枚颐演腿∪芙獾漠a(chǎn)物。所得二乙醚相富集原花青素二聚物，所得水相富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物，及少量原花青素六聚物。實施例1.4.2:第四次萃取乙酸乙酯:可用乙酸乙酯萃取富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物，及少量原花青素六聚物的水相(實施例1.4.1),得到富集原花青素三聚物和四聚物的乙酸乙酯相，所得水相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物。實施例1.4.3:第三次萃取乙酸甲酉旨:二乙醚(25:75v/v):對實施例1.4.1的改變，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.4有機相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中。可用有機溶劑(包含乙酸甲酯:二乙醚(25:75v/v)的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。所得有機相富集原花青素二聚物及少量原花青素三聚物。水相富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物和少量原花青素六聚物。實施例1.4.4:第四次萃取乙酸乙酯:可用乙酸乙酯萃取富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物及少量原花青素六聚物的水相(實施例1.4.3)，得到富集原花青素三聚物和四聚物的乙酸乙酯相，和富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物的水相。實施例1.4.5:第三次萃取乙酸乙酯:對實施例1.4.1的另一改變，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.4有機相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中，用乙酸乙酯萃取溶解的產(chǎn)物。所得乙酸乙酯相富集原花青素二聚物、三聚物和四聚物，而水相富集原花青素五聚物和少量原花青素六聚物。實施例1.4.6:第四次萃取二乙醚:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.4.5乙酸乙酯相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中，用二乙醚萃取溶解的產(chǎn)物。所得二乙醚相富集原花青素二聚物，而水相富集原花青素三聚物和四聚物。實施例1.4.7:第四次萃取乙酸甲酯:二乙醚(25:75v/v):對實施例1.4.6的改變，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.4.5乙酸乙酯相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中，用有機溶劑(包含乙酸曱酯:二乙醚(25:75v/v)的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。所得有機相富集原花青素二聚物及少量原花青素三聚物。水相富集原花青素三聚物和四聚物。實施例1.4.8:第三次萃取乙酸甲酯:可用乙酸甲酯萃取富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相(實施例1.4)，得到富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的乙酸甲酯相，和富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相。實施例1.4.9:第四次萃取乙酸曱酯:可用乙酸甲酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相(實施例1.4.8)，得到富集原花青素九聚物及更高低聚物的乙酸曱酯相。水相基本除盡原花青素。27實施例1.5:第二次萃取乙酸甲酯:對實施例1.1的另一種改變，可用乙酸曱酯萃取富集原花青素二聚物及更高低聚物的水相(實施例l)，得到富集原花青素二聚物、三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的乙酸曱酯相，和富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相。實施例1.5.1:第三次萃取二乙醚:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.5乙酸曱酯相中的溶劑，并將所得產(chǎn)物溶于水中，用二乙醚萃取溶解的產(chǎn)物，得到富集原花青素二聚物的二乙醚相，和富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的水相。實施例1.5.2:第四次萃取乙酸乙酯:可用乙酸乙酯萃取富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的水相(實施例1.5.1)，得到富集原花青素三聚物和四聚物的乙酸乙酯相，和富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的水相。實施例1.5.3:第五次萃取乙酸甲酯:二乙醚(75'.25v/v):可用有機溶劑(包含乙酸曱酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的水相(實施例1.5.2)。所得有機相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物，而水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.5.4:第三次萃取乙酸乙酯:對實施例1.5.1的改變，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.5乙酸甲酯相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，并用乙酸乙酯萃取溶解的產(chǎn)物。所得乙酸乙酯相富集原花青素二聚物、三聚物和四聚物，而水相富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.5.5:笫四次萃取二乙醚:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.5.4乙酸乙酯相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，并用二乙醚萃取溶解的產(chǎn)物。所得二乙醚相富集原花青素二聚物，而水相富集原花青素三聚物和四聚物。實施例1.5.6:第四次萃取乙酸曱酉旨:二乙醚(75:25v/v):可用有機溶劑(包含乙酸曱S旨:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的水相(實施例1.5.4)。所得有機相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物，而水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.5.7:第四次萃取乙酸曱酯:二乙醚(75:25v/V):可用有機溶劑(包含乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的水相(實施例1.5.1)。所得有機相富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物，及少量原花青素六聚物，而水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.5.8:第五次萃取乙酸乙酯:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.5.7有機相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，并用乙酸乙酯萃取溶解的產(chǎn)物。所得乙酸乙酯相富集三聚物和四聚物，而水相富集原花青素五聚物及少量原;&青素六聚物。實施例1.5.9:第五次萃取乙酸曱酯:可用乙酸甲酯萃取富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的水相(實施例1.5.7)。所得乙酸曱酯相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。水相基本除盡原花青素。實施例1.5.10:第三次萃取乙酸曱酯:二乙醚(75:25v/v):對實施例1.5.1的另一種改變，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.5乙酸甲酯相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，并用有機溶劑(包含乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。所得有機相富集原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物及少量原花青素六聚物，而水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.5.11:第四次萃取二乙醚:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.5.10有機相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，并用二乙醚萃取溶解的產(chǎn)物。所得二乙醚相富集原花青素二聚物，而水相富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物及少量原花青素六聚物。實施例1.5.12:第五次萃取乙酸乙酯:可用乙酸乙酯萃取富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物及少量原花青素六聚物的水相(實施例1.5.11)。所得乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物，而水相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物。實施例1.5.13:第四次萃取乙酸乙酯:對實施例1.5.11的改變，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.5.10有機相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，并用乙酸乙酯萃取溶解的產(chǎn)物。所得乙酸乙酯相富集原花青素二聚物、三聚物和四聚物，而水相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物。實施例1.5.14:第五次萃取二乙醚:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.5.13乙酸乙酯相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，并用二乙醚萃取溶解的產(chǎn)物。所得二乙醚相富集原花青素二聚物，而水相富集原花青素三聚物和四聚物。實施例1.5.15:第五次萃取乙酸曱酯:二乙醚〖25:75v/v):對實施例1.5.14的改變，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.5.13乙酸乙酯相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，并用有機溶劑(包含乙酸甲酉旨:二乙醚(25:75v/v)的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。所得有機相富集二聚物及少量原花青素三聚物，水相富集原花青素三聚物和四聚物。實施例1.5.16:第四次萃取乙酸曱酯:二乙醚(25:75v/v):對實施例1.5.11的另一種改變，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.5.10有機相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，并用有機溶劑(包含乙酸甲酯:二乙醚(25:75v/v)的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。所得有機相富集原花青素二聚物及少量原花青素三聚物。水相富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物及少量原花青素六聚物。實施例1.5.17:第五次萃取乙酸乙酯:可用乙酸乙酯萃取富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物及少量原花青素六聚物的水相(實施例1.5.16)。所得乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物，而水相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物。實施例1.5.18:第三次萃取乙酸曱酯:二乙醚(25:75v/v):對實施例1.5.1的另一種改變，通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.5乙酸曱酯相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，并用有機溶劑(包含乙酸曱酯:二乙醚(25:75v/v)的混合物)萃取溶解的產(chǎn)物。所得有機相富集原花青素二聚物及少量原花青素三聚物，而水相富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.5.19:第四次萃取乙酸乙酯:可用乙酸乙酯萃取富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的水相(實施例1.5.18)。所得乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物，而水相富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.5.20:第五次萃取乙酸曱酯:二乙醚(75:25v/v):可用有機溶劑(包含乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的水相(實施例1.5.19)。所得有機相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物，而水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.5.21:第四次萃取乙酸甲酯:二乙醚(75:25v/v):對實施例1.5.19的改變，可用有機溶劑(包含乙酸曱酯:二乙醚(75:25v/v)的混合物)萃取富集原花青素三聚物。四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物的水相(實施例1.5.18)。所得有機相富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物及少量原花青素六聚物，而水相富集原花青素六聚物、七聚物、八聚物及少量原花青素九聚物。實施例1.5.22:第五次萃取乙酸乙酯:通過蒸發(fā)或其它常規(guī)方法除去實施例1.5.21有機相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，并用乙酸乙酯萃取溶解的產(chǎn)物。所得乙酸乙酯相富集原花青素三聚物和四聚物，而水相富集原花青素五聚物及少量原花青素六聚物。實施例1.5.23:第三次萃取乙酸曱酯可用乙酸曱酯萃取富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相(實施例1.5)，得到富集原花青素九聚物及更高低聚物的乙酸甲酯相。水相基本除盡原花青素。圖10至14描述了使用其它最先萃取溶劑的其它萃取順序的實施例。圖IO描繪了實施例2至2.5.2，其中最先萃取溶劑(實施例2)為乙酸乙酯。圖11描繪了實施例3至3.6，其中最先萃取溶劑(實施例3)為乙酸曱酯。圖12描繪了實施例4至4.4.5,其中最先萃取溶劑為二乙醚。圖13描繪了實施例5至5.4.5，其中最先萃取溶劑為乙酸曱酯和二乙醚(25:75v/v)的混合物。圖14描繪了實施例6至6.5.1,其中最先萃取溶劑為乙酸甲酯和二乙醚(75:25v/v)的混合物。本領域技術(shù)人員應理解，盡管以上實施例涉及水性可可多酚提取物的選擇性萃取，但是依照所提供的實施例，任何包含極性質(zhì)子低聚物的物質(zhì)都可以被選擇性萃取。適當?shù)臉O性質(zhì)子低聚物包括原花色素、可水解單寧、低聚糖、低聚核苷酸、多肽、丙烯酰胺、聚山梨醇酯、聚酮、泊洛沙姆、聚乙二醇、聚氧乙烯醇和聚乙烯醇。當極性質(zhì)子低聚物為原花色素時，它們可以是原芽菜定(proapigeninidins)、原木犀草定(proluteolinidins)、原五羥黃酮(protricetinidins)、原花葵素(propelargonidins)、原花翠素(prodelphinidins)、原桂金合歡定(proguibourtinidins)、原四輕黃酮(profisetinidins)、原刺槐定(prorobinetinidins)、proteracacinidins和/或原黑金合？欠素(promelacacinidins)。盡管參考某些具體實施方式對本發(fā)明進行了描述，但是可以理解，本領域技術(shù)人員可以進行多種修改和變更，而不脫離本發(fā)明。因此，希望通過附加的權(quán)利要求涵蓋可落入本發(fā)明真正精神和范圍內(nèi)的所有這些修改和變更。權(quán)利要求1.一種從可可多酚的水性混合物中選擇性萃取可可原花青素的方法，所述方法包括以下步驟用乙酸正丁酯萃取水性混合物，分離富集原花青素二聚物及更高低聚物的水相和富集兒茶素和表兒茶素的乙酸正丁酯相。2.權(quán)利要求1的方法，其還包括以下步驟用二乙醚或乙酸甲酯和二乙醚的混合物來萃取水相，分離富集原花青素三聚物及更高低聚物的水相和富集原花青素二聚物的乙酸甲酯或乙酸曱酯-二乙醚相。3.權(quán)利要求2的方法，其還包括以下步驟用乙酸乙酯萃取水相，分離富集原花青素五聚物及更高低聚物的水相和富集原花青素三聚物和四聚物的乙酸乙酯相。4.權(quán)利要求3的方法，其還包括以下步驟用乙酸甲酯和二乙醚的混合物萃取水相，分離富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相和富集原花青素五聚物的乙酸甲酯-二乙醚相。5.權(quán)利要求4的方法，其還包括以下步驟用乙酸曱酯萃取水相，分離富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相和富集原花青素六聚物、七聚物和八聚物的乙酸甲酯相。6.權(quán)利要求5的方法，其還包括以下步驟用乙酸曱酯萃取水相，分離水相和富集原花青素九聚物及更高低聚物的乙酸甲酯相。7.權(quán)利要求2的方法，其還包括以下步驟用乙酸曱酯萃取水相，分離富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相和富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物和八聚物的乙酸曱酯相。8.權(quán)利要求7的方法，其還包括以下步驟除去乙酸甲酯相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用乙酸乙酯萃取水溶液，分離富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物和八聚物的水相和富集原花青素三聚物和四聚物的乙酸乙酯相。9.權(quán)利要求8的方法，其還包括以下步驟用乙酸甲酯和二乙醚的混合物萃取水相，分離富集原花青素六聚物、七聚物和八聚物的水相和富集原花青素五聚物的乙酸曱酯-二乙醚相。10.權(quán)利要求7的方法，其還包括以下步驟用乙酸甲酯萃取水相，分離水相和富集原花青素九聚物及更高低聚物的乙酸曱酯相。11.權(quán)利要求l的方法，其還包括以下步驟用乙酸乙酯萃取水相，分離富集原花青素五聚物及更高低聚物的水相和富集原花青素二聚物、三聚物和四聚物的乙酸乙酯相。12.權(quán)利要求11的方法，其還包括以下步驟用乙酸曱酯和二乙醚的混合物萃取水相，分離富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相和富集原花青素五聚物的乙酸甲酯-二乙醚相。13.權(quán)利要求12的方法，其還包括以下步驟用乙酸甲酯萃取水相，分離富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相和富集原花青素六聚物、七聚物和八聚物的乙酸甲酯相。14.權(quán)利要求13的方法，其還包括以下步驟用乙酸曱酯萃取水相，分離水相和富集原花青素九聚物及更高低聚物的乙酸曱酯相。15.權(quán)利要求11的方法，其還包括以下步驟用乙酸甲酯萃取水相，分離富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相和富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物和八聚物的乙酸甲酯相。16.權(quán)利要求15的方法，其還包括以下步驟除去乙酸甲酯相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用乙酸曱酯和二乙醚的混合物萃取水溶液，分離富集原花青素六聚物、七聚物和八聚物的水相和富集原花青素五聚物的乙S交甲酯-二乙醚相。17.權(quán)利要求11的方法，其還包括以下步驟除去乙酸乙酯相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用二乙醚或乙酸曱酯和二乙醚的混合物萃取水溶液，分離富集原花青素三聚物及四聚物的水相和富集原花青素二聚物的二乙醚相或乙酸甲酯-二乙醚相。18.權(quán)利要求l的方法，其還包括以下步驟用乙酸曱酯和二乙醚的混合物萃取水相，分離富集原花青素六聚物及更高低聚物的水相和富集原花青素二聚物、三聚物、四聚物和五聚物的乙酸曱酯-二乙醚相。19.權(quán)利要求18的方法，其還包括以下步驟用乙酸甲酯萃取水相，分離富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相和富集原花青素六聚物、七聚物和八聚物的乙酸甲酯相。20.權(quán)利要求19的方法，其還包括以下步驟用乙酸曱酯萃取水相，分離水相和富集原花青素九聚物及更高低聚物的乙酸甲酯相。21.權(quán)利要求18的方法，其還包括以下步驟除去乙酸曱酯相-二乙醚相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用二乙醚或乙酸曱酯和二乙醚的混合物萃取水溶液，分離富集原花青素三聚物、四聚物和五聚物的水相和富集原花青素二聚物的二乙醚相或乙酸曱酯-二乙醚相。22.權(quán)利要求21的方法，其還包括以下步驟用乙酸乙酯萃取水相，分離富集原花青素五聚物的水相和富集原花青素三聚物和四聚物的乙酸乙酯相。23.權(quán)利要求l的方法，其還包括以下步驟用乙酸甲酯萃取水相，分離富集原花青素九聚物及更高低聚物的水相和富集原花青素二聚物、三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物和八聚物的乙酸曱酯相。24.權(quán)利要求23的方法，其還包括以下步驟除去乙酸曱酯相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用二乙醚或乙酸曱酯和二乙醚的混合物萃取水溶液，分離富集原花青素三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物和八聚物的水相和富集原花青素二聚物的二乙醚相或乙酸曱酉旨-二乙酸相。25.權(quán)利要求24的方法，其還包括以下步驟用乙酸乙酯萃取水相，分離富集原花青素五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量的九聚物的水相和富集原花青素三聚物和四聚物的乙酸乙酯相。26.權(quán)利要求25的方法，其還包括以下步驟用乙酸曱酯和二乙醚的混合物萃取水相，分離富集原花青素六聚物、七聚物及八聚物的水相和富集原花青素五聚物的乙酸甲酯-二乙醚相。27.權(quán)利要求23的方法，其還包括以下步驟除去乙酸曱酯相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用乙酸曱酯和二乙醚的混合物萃取水溶液，分離富集原花青素六聚物、七聚物及八聚物的水相和富集原花青素二聚物、三聚物、四聚物及五聚物的乙酸甲酯-二乙醚相。28.權(quán)利要求27的方法，其還包括以下步驟除去乙酸甲酯-二乙醚相中的溶劑，將所得產(chǎn)物溶于水中，用二乙醚或乙酸甲酯和二乙醚的混合物萃取水溶液，分離富集原花青素三聚物、四聚物及五聚物的水相和富集原花青素二聚物的二乙醚相或乙酸曱酯-二乙醚相。29.權(quán)利要求28的方法，其還包括以下步驟用乙酸乙酯萃取水相，分離富集原花青素五聚物的水相和富集原花青素三聚物和四聚物的乙酸乙酯相。30.權(quán)利要求2、17、21、24或28的方法，其中所述乙酸曱酯和二乙醚的混合物約為25:75(v/v)。31.權(quán)利要求4、9、12、16、18、26或27的方法，其中所述乙酸曱酯和二乙醚的混合物約為75:25(v/v)。32.—種從水性混合物中選擇性萃取特定組的兒茶素及表兒茶素單體和/或其原花青素低聚物的方法，所述水性混合物包含所述單體和/或低聚物，該方法包括以下步驟(a)用選自乙酸曱酯、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二乙醚及乙酸甲酯和二乙醚的混合物的有機溶劑萃取水性混合物；(b)分離水相和溶劑相；(c)用上述溶劑之一萃取水相，得到富集特定組的單體和/或低聚物的水相和有機相；和(d)任選重復萃取和分離步驟。33.權(quán)利要求32的方法，其中乙酸正丁酯用于步驟(a)，以選擇性萃取兒茶素、表兒茶素及少量二聚物；或者其中乙酸乙酯用于步驟(a)，以選擇性萃取兒茶素、表兒茶素及少量二聚物、三聚物和四聚物；或者其中乙酸曱酯用于步驟(a),以選擇性萃取兒茶素、表兒茶素、二聚物、三聚物、四聚物、五聚物、六聚物、七聚物、八聚物及少量的九聚物；或者其中二乙醚用于步驟(a)，以選擇性萃取兒茶素、表兒茶素和二聚物；或者其中乙酸曱酯和二乙醚的混合物(25:75v/v)用于步驟(a)，以選擇性萃取兒茶素、表兒茶素、二聚物及少量的三聚物；或者其中乙酸曱酯和二乙醚的混合物(75:25v/v)用于步驟(a),以選擇性萃取兒茶素、表兒茶素、二聚物、三聚物、四聚物、五聚物及少量的六聚物。全文摘要本發(fā)明描述了從可可多酚的水性混合物中選擇性萃取可可原花青素的方法，使用特定順序的溶劑來萃取選擇的原花青素單體和/或低聚物。所述溶劑為乙酸正丁酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、二乙醚或者乙酸甲酯和二乙醚的混合物。優(yōu)選地，首先用乙酸正丁酯萃取可可多酚的水性混合物。乙酸甲酯和二乙醚的混合物為25∶75至75∶25(v/v)。文檔編號C07D311/62GK101316831SQ200680044192公開日2008年12月3日申請日期2006年10月3日優(yōu)先權(quán)日2005年10月3日發(fā)明者J·P·穆納富,M·A·凱姆,R·J·羅賓斯申請人:瑪爾斯有限公司