專利名稱：作為制造鹵化蔗糖的中間體的蔗糖-6-酯的酶促生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶促生產(chǎn)蔗糖-6-酯，其是在制造包括1，-6，-二氯-1，-6，-二脫 氧-(3-呋喃果糖-4-氯-4-脫氧-卩比喃半乳糖苷(TGS)以及其前體(TGS-6-酯) 的鹵化(氯化)蔗糖時(shí)使用的中間體。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)方法生產(chǎn)4,1，，6，三氯半乳蔗糖(TGS)的策略主要包括通過(guò)使 用Vilsmeier-Haack試劑來(lái)氯化蔗糖-6-酯以形成6-乙酰基-4，l，,6，-三氯半乳蔗 糖，所述Vilsmeier-Haack試劑來(lái)源于諸如氯化氧磷、草酰氯、五氯化磷等的 不同氯化試劑和諸如二甲基甲酰胺(DMF)或二甲基乙酰胺的三級(jí)酰胺
(tertiary amide)。所述氯化反應(yīng)后，使用適宜的鈣、鈉等的堿性氫氧化物中 和反應(yīng)物料至pH 7.0 7.5，然后優(yōu)選地進(jìn)一步升高pH以使6-乙?；?4,1，,6，-三氯半乳蔗糖去酯化(deesterify) /去乙?；纬?,1，,6，三氯半乳蔗糖
(TGS)。
蔗糖-6-酯通常是利用酯化蔗糖而得到，是TGS的前體，TGS是用于食品 和其它應(yīng)用中的零熱量強(qiáng)力甜味劑或味覺改進(jìn)劑。然而，蔗糖的酯化必須單 獨(dú)在6位進(jìn)行，而這對(duì)于其制造是主要的挑戰(zhàn)，這是因?yàn)樵擋セ哪康奈恢?的反應(yīng)性比其它更高反應(yīng)性的競(jìng)爭(zhēng)位置(即，l'和6'位)更低。
為了實(shí)現(xiàn)區(qū)域選擇性的酯化，在制造蔗糖-6-酯的有機(jī)合成方式中已經(jīng)描 述了各種方法，其包括但不限于酯化后由錫介導(dǎo)的加合物生成和蔗糖在嘧啶 中的直接酯化。然而，通過(guò)有機(jī)合成的方法，即使是選擇性方法，也導(dǎo)致各 種副產(chǎn)物的生成并且需要涉及分離步驟以在氯化前純化蔗糖-6-酯。在實(shí)現(xiàn)對(duì) 位點(diǎn)特異酯化的更多控制上需要進(jìn)一步的改進(jìn)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開了酶促?；姆椒?，其中，當(dāng)蔗糖在新型脂酶或交聯(lián)脂酶存 在下與適宜的?；蚍蓟セ瘎?包括有機(jī)酸)反應(yīng)時(shí)，主要產(chǎn)物是6-?；?蔗糖，該脂酶是在三級(jí)酰胺存在或不存在下或游離或固定化的形式，或是在 任何其它適宜的溶劑(其中酶是穩(wěn)定的)中。根據(jù)酯化所用的反應(yīng)物，引入 到蔗糖分子6位上的酯基可以是烷基、芳基、取代垸基或取代芳基。因此獲 得的6-酰基-蔗糖可以用于制備鹵化蔗糖。 現(xiàn)有技術(shù)
Dordick等(1992)在美國(guó)專利no. 5128248中公開了在4，-和6-位中的至 少一個(gè)位置上對(duì)蔗糖或其衍生物進(jìn)行?；姆椒?，其中特別地，在存在微生 物脂肪酶時(shí)，供體?；ヅc蔗糖或其衍生物在非羥基溶劑中反應(yīng)。所述供體 酯是直鏈烷酸或苯甲酸的反應(yīng)性酯。
Bomemann等(1992)在美國(guó)專利no. 5141860中公開了制備部分去酰化 的蔗糖?；a(chǎn)物的方法，該蔗糖?；a(chǎn)物在每個(gè)環(huán)中具有至少在2-， 3-和3'-位處的乙?；约爸辽僖粋€(gè)游離羥基，其中蔗糖辛酰酯(sucrose octaacylate)用酶或酶的組合處理，該酶或酶的組合能在緩沖至pH 5-7的水 性介質(zhì)(包括水和高達(dá)50%的有機(jī)溶劑)中催化所述蔗糖辛酰酯的每個(gè)環(huán)上 的至少一個(gè)酰基的水解，并分離生成的部分去酰化的蔗糖?；a(chǎn)物，所述酶 選自由胰脂酶、酵母酯酶、真菌、a-淀粉酶、枯草桿菌蛋白酶、蜂蜜曲霉蛋 白酶和a-半乳糖苷酶組成的組中。
具體實(shí)施例方式
酶促路線對(duì)其終產(chǎn)物顯著特異。它們也是非常底物特異性的。 本發(fā)明描述了利用酶生產(chǎn)蔗糖-6-酯的新型方法。其描述了對(duì)蔗糖高效且 選擇性的酶促酯化。利用新型脂酶或交聯(lián)酯酶進(jìn)行區(qū)域選擇性反應(yīng)，該酶是 或者在三級(jí)酰胺存在或不存在時(shí)的游離或固定化形式或者在任何其它適宜的 溶劑(其中酶是穩(wěn)定的)中。根據(jù)酯化所用的反應(yīng)物，引入到蔗糖分子6位 上的酯基可以是垸基、芳基、取代垸基或取代芳基。因此獲得的6-?；?蔗糖 可以用于制備鹵化蔗糖，例如作為強(qiáng)力甜味劑的TGS。
所使用的酶可以是酯酶、脂酶等。這些酶可以固定在合成的聚合支撐物 之中或之上，該聚合支撐物為例如但不限于聚丙烯酸，或聚苯乙烯或聚丙烯 酰胺，基于尼龍的支撐物；或者像基于多糖的半合成的或天然的有機(jī)支撐
物，該多糖為例如但不限于纖維素、淀粉、葡聚糖、瓊脂糖、幾丁糖、幾丁
質(zhì)等；或者無(wú)機(jī)支撐物，例如基于碳、硅、氧化鋯、氧化鋁、磷酸鋯的那 扭，等等。
脂酶的來(lái)源可以是源于動(dòng)物、植物或微生物，更優(yōu)選源于微生物或細(xì)
菌，例如5"c/〃m f/2er附ocatow/(3ft^&、尸"W(icw7o"as1 aerwg/was^等，真菌，例
w/vews、 C(3"(i/(i(3 rwgosa、 i /7&o附wcor mz72ez7、 Cawcfe/a awf"W"/ca等或者等效 物。
這一策略在效果上提高了蔗糖-6-酯的產(chǎn)率和純度，該蔗糖-6-酯本身或在 除去溶劑后用于氯化步驟，以制備氯化蔗糖衍生物，這又提高所生產(chǎn)的氯化 蔗糖的純度和產(chǎn)率。
在本發(fā)明中，蔗糖的酶促轉(zhuǎn)化成蔗糖-6-乙酸酯基本上包括使用蔗糖和乙 酸或適宜的有機(jī)酸或適宜的?；蚍蓟セ囎鳛榉磻?yīng)物以直接生產(chǎn)作為主 要產(chǎn)物的蔗糖-6-酯。
下述發(fā)明方法是高效區(qū)域選擇性反應(yīng)，其中首次利用新型的分離脂酶專 門在6位進(jìn)行選擇性的蔗糖酯化。
在本發(fā)明方法中，通過(guò)將蔗糖溶解于干燥的DMF中并用脂酶處理來(lái)進(jìn) 行該反應(yīng)。DMF溶液中的蔗糖濃度從1: l到l: 10w/v變化。乙酸被用作酰 化劑并且被直接加入反應(yīng)混合物中。可以使用任何其它脂肪酸、取代的脂肪 酸、芳香酸或取代的芳香酸以生成各自的蔗糖-6-酯。反應(yīng)期間的溫度可以是 15。C 60。C中的任意值。酶促酯化反應(yīng)在1小時(shí) 16小時(shí)以上完成，并伴隨 可忽略量的副產(chǎn)物的產(chǎn)生(若有的話)。當(dāng)適當(dāng)保持反應(yīng)條件，蔗糖向蔗糖-6-酯的轉(zhuǎn)化相當(dāng)好且對(duì)6位特異。該酶可以以諸如粉末或液體的游離形式使 用，也可以是固定化形式。
酶以固定化形式使用時(shí)被回收。可以將固定化酶裝入柱中并且以設(shè)定流 速通過(guò)所述反應(yīng)物以進(jìn)行反應(yīng)?；蛘撸诜磻?yīng)器中用固定化酶進(jìn)行反應(yīng)并且 反應(yīng)后，可以通過(guò)從反應(yīng)物料中將酶過(guò)濾掉而回收酶。
因此獲得的蔗糖-6-酯基本上是純的并且易于分離和進(jìn)行氯化來(lái)生產(chǎn)鹵化 蔗糖。
下面描述的是實(shí)施例，其說(shuō)明了本發(fā)明的工作方式而不以任何方式限制 本發(fā)明的范圍。反應(yīng)物、所使用的反應(yīng)物的比例、描述的反應(yīng)條件的范圍僅 僅是說(shuō)明性的并且本發(fā)明的范圍延伸至其類似的反應(yīng)物、反應(yīng)條件和類似的 通性反應(yīng)。通常，對(duì)氯化蔗糖生產(chǎn)領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的任何等效替代包 括在本說(shuō)明書的范圍內(nèi)。除非文中不允許，所提及的單數(shù)被理解為包括其復(fù) 數(shù)形式，而且包括由該表述所包含的所有等效替代，即，使用"氯化蔗糖"包 括所有氯化蔗糖化合物中的每種以及其混合物或在相關(guān)內(nèi)容中可實(shí)現(xiàn)相同功 能的替代的氯化蔗糖化合物。提及用于溶液的"一種有機(jī)溶劑"包括一種或多 種有機(jī)溶劑連續(xù)使用，或其組合作為混合物使用，或能進(jìn)行與權(quán)利要求、說(shuō) 明書所述或?qū)嵤├f(shuō)明的相同功能的若干替代中的任何一種。在本說(shuō)明書 中，蔗糖-6-酯和6-?；?蔗糖為了所有功能性目的而作為等效物互換使用。
實(shí)施例l、蔗糖在DMF中的酶促乙酰化反應(yīng)
將來(lái)自A^en^〃w oo^"e的脂酶在聚苯乙烯珠上固定化并與戊二醛交聯(lián) 以得到固定化脂酶。將200g蔗糖于80。C溶解于800ml的DMF中并冷卻至室 溫，在反應(yīng)燒瓶中加入34g所述固定化脂酶并保持?jǐn)嚢?。保持溫度?0°C。 向反應(yīng)燒瓶中滴加13.5g乙酸并持續(xù)攪拌。繼續(xù)攪拌并且用TLC和HPLC監(jiān) 測(cè)乙?；磻?yīng)。
在3小時(shí)內(nèi)完成了 70%的乙?；^(guò)濾反應(yīng)內(nèi)含物(reaction content)并 用水沖洗酶且回收。
HPLC確認(rèn)生成70%的蔗糖-6-乙酸酯，且無(wú)副產(chǎn)物生成。
實(shí)施例2、蔗糖在異戊醇中的酶促乙酰化反應(yīng)
將20g蔗糖于80。C部分溶解于400ml異戊醇中并冷卻至室溫。在反應(yīng)燒 瓶中加入34g如實(shí)施例1所述方法制備的來(lái)自o^yzae的固定化脂 酶并保持?jǐn)嚢?。保持溫度?0。C。向反應(yīng)燒瓶中滴加3.5g乙酸并持續(xù)攪拌。 繼續(xù)攪拌并且用TLC和HPLC監(jiān)測(cè)乙?；磻?yīng)。
在3小時(shí)內(nèi)完成了 70%的乙?；⑶疫^(guò)濾反應(yīng)內(nèi)含物，用水沖洗酶并回 收。HPLC確認(rèn)生成70。/。的蔗糖-6-乙酸酯，且無(wú)副產(chǎn)物生成。
實(shí)施例3、利用苯酐將蔗糖在DMF中酶促?；?br> 將10g蔗糖于50°C部分溶解于100ml的DMF中并冷卻至25°C。加入 26g分離自Aw^ wo"a w.的脂酶并充分?jǐn)嚢?。溫度再次升?0°C。加入 0.59ml的苯酐并且持續(xù)反應(yīng)6.0h。用TLC和HPLC監(jiān)測(cè)酰化反應(yīng)。
在6小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)高達(dá)48%的苯甲酰化，且無(wú)副產(chǎn)物生成。
實(shí)施例4、利用月桂酸將蔗糖在DMSO中酶促酰化
將10g蔗糖于60°C溶解于100ml的DMSO (二甲亞砜)中并冷卻至 25°C。加入26g分離自Rhizopus w.的脂酶并充分?jǐn)嚢?。溫度再次升?50°C。加入11.69g月桂酸并且持續(xù)反應(yīng)8.0h。用TLC和HPLC監(jiān)測(cè)酰化反 應(yīng)。
HPLC確認(rèn)在8小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)高達(dá)42%的酰化，且無(wú)副產(chǎn)物生成。
實(shí)施例5、利用p-硝基苯甲酸將蔗糖在DMSO中酶促?；?br> 將10g蔗糖于60°C溶解于100ml的DMSO中并保持在35°C。加入26g 分離自戸e^fo附o"os w.的脂酶并充分?jǐn)嚢?。溫度再次升?0°C。加入4.89g 的p-硝基苯甲酸并且持續(xù)反應(yīng)8.0h。用TLC和HPLC監(jiān)測(cè)苯甲?；磻?yīng)。 HPLC確認(rèn)在8小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)高達(dá)32。/。的苯甲?；?，且無(wú)副產(chǎn)物生成。
實(shí)施例6、酶促乙酰化和氯化反應(yīng)以制備TGS
在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將200g蔗糖于80°C溶解于2000ml的DMF中并冷卻至 室溫。在反應(yīng)燒瓶中加入34g如實(shí)施例1所述方法制備的來(lái)自J^^h^7/w 00^"e的固定化脂酶并保持?jǐn)嚢?。保持溫度?0°C。向反應(yīng)燒瓶中滴加 13.8ml乙酸酐并持續(xù)攪拌。繼續(xù)攪拌并且用TLC和HPLC監(jiān)測(cè)乙?；磻?yīng)。
在6小時(shí)內(nèi)完成了高達(dá)68%的乙?；?，過(guò)濾反應(yīng)內(nèi)含物并用水沖洗酶且 回收。然后將DMF溶液用于氯化。
將432g的PCls于35°C加入至2L的DMF中并且允許形成Vilsmeier Haack試劑。由該反應(yīng)產(chǎn)生的POCl3與反應(yīng)物料中可用的DMF形成第二 Vilsmeier,并且充分?jǐn)嚢柙摲磻?yīng)物料60min。然后將該反應(yīng)物料冷卻至0°C 且在攪拌下緩慢加入由酶促反應(yīng)獲得的DMF中的6-?；崽?。加入6-?；?br> 蔗糖后，將該反應(yīng)物料加熱至35°C并保持?jǐn)嚢?0min。然后加熱反應(yīng)物料至 85°C，保持60min，再次加熱至100°C，保持6h，然后進(jìn)一步加熱至114°C 并保持1.5h，然后冷卻至65。C。
然后利用氫氧化鈣漿水中和反應(yīng)物料至pH7.0，然后過(guò)濾。然后，將過(guò) 濾物提取至l: 3倍v/v的乙酸乙酯中，并濃縮至其原始體積的50%。然后用 1: 0.1倍v/V的飽和氯化鈉溶液沖洗該提取物。重復(fù)該氯化鈉沖洗12次，并 且將乙酸乙酯提取物中的DMF含量減小至< 0.1%。然后，徹底除去乙酸乙 酯，并且將該漿液在硅化硅膠上進(jìn)行色譜分析。使用的流動(dòng)相是pH 10.5 ll.O的緩沖液。
收集由色譜純化獲得的純餾分，然后使用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9.0。 允許完成去乙酰化并由TLC確認(rèn)。
去乙酰化后，通過(guò)利用RO膜的分子分離濃縮該餾分。將RO濃縮后的 濃縮物提取入1: 3.5倍v/v的乙酸乙酯中并且分離各層。將乙酸乙酯提取物 濃縮至最大值，并且所獲得的晶體重新在甲醇中溶解。然后過(guò)濾甲醇溶液以 除去任何雜質(zhì)并將其濃縮和結(jié)晶。
HPLC測(cè)定，獲得的純度為98.5%，并且由6-?；崽禽斎氆@得的總產(chǎn) 率是35%。
實(shí)施例7、利用酯酶在t-丁醇中的酶促酞?；磻?yīng)
將25g蔗糖于60。C部分溶解于100ml的t-丁醇中并冷卻至25°C。加入 45g分離自c朋d油平的脂酶并充分?jǐn)嚢?。將溫度再次升?0。C。加入4.89g 苯二甲酸并且持續(xù)反應(yīng)16.0h。用TLC和HPLC監(jiān)測(cè)酞?；磻?yīng)。
HPLC確認(rèn)在16小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)高達(dá)26°/。的酞酰化，且無(wú)副產(chǎn)物生成。
實(shí)施例8、利用封裝于柱中的固定化脂酶的酶促?；磻?yīng)
將25g蔗糖于80°C部分溶解于100ml的DMF中并冷卻至25。C。將15g
在聚苯乙烯支撐物上的來(lái)自尸"M^W20"^ w.的固定化脂酶裝入玻璃柱。柱的
入口通過(guò)蠕動(dòng)泵連接到DMF中的蔗糖溶液。出口也連接到蔗糖溶液。在 25°C持續(xù)攪拌溶液。將4.0ml乙酸加入到蔗糖溶液中并且通過(guò)蠕動(dòng)泵以20ml/h的流速泵入玻璃柱。繼續(xù)再循環(huán)12h。用TLC周期性地監(jiān)測(cè)乙?；磻?yīng)。
HPLC確認(rèn)在12小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)高達(dá)59%的乙?；?，且無(wú)副產(chǎn)物生成。
權(quán)利要求
1、一種主要在6-位上酰化蔗糖以制備6-?；?蔗糖的方法，其中，使用酶，當(dāng)包括直鏈烷酸或芳基羧酸的有機(jī)酸，或?；瘎┡c蔗糖在溶劑中反應(yīng)時(shí)，該酶能在蔗糖分子的6位上催化選擇性?；凰鋈軇┦撬雒冈谄渲蟹€(wěn)定的溶劑。
2、 權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，a、 所述包括直鏈烷酸或芳基羧酸的有機(jī)酸進(jìn)一步包括乙酸、丙酸、丁 酸、六烯酸、苯甲酸、苯二甲酸等，b、 所述?；瘎┌ㄒ宜狒⒈狒?、月桂酸酐、丁酸酐、苯甲酸酐、苯 二甲酸酐等，c、 所述酶包括脂酶或酯酶，其為可溶或固定化形式，并且源于動(dòng)物、植 物或微生物，d、 所述酶在其中是穩(wěn)定的所述溶劑包括二甲基甲酰胺、異戊醇、辛醇、 己烷、環(huán)己烷、甲苯、t-丁醇、二甲基亞砜等。
3、 權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括下述步驟a、 將蔗糖溶解于溶劑中以產(chǎn)生溶液，優(yōu)選在無(wú)水溶劑中且所述溶劑是所 述酶在其中穩(wěn)定的溶劑，b、 向所述溶液中加入脂酶或酯酶，c、 向前述步驟中的反應(yīng)混合物中加入乙酸或另一種有機(jī)酸或?；瘎?，d、 允許反應(yīng)在促進(jìn)酶作用的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選15 6(TC，持續(xù)足以得 到蔗糖向6-乙?；?蔗糖的實(shí)際最大轉(zhuǎn)化的一段時(shí)間，優(yōu)選約1 16h。
4、 權(quán)利要求l或2所述的方法，其特征在于，蔗糖的酰化包括反應(yīng)器， 其中，在一定溫度下，在足以使大多數(shù)蔗糖酰化為6-?；?蔗糖的一段時(shí)間 內(nèi)，所述酶以固定化形式在反應(yīng)器中與含有蔗糖和有機(jī)酸或?；瘎┑难h(huán)溶 液相互接觸。
5、 權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，a、蔗糖在一定溫度，優(yōu)選約80。C下溶解于溶劑中，優(yōu)選部分溶解于 DMF，并冷卻至一溫度，優(yōu)選大約25。C， b、 將在優(yōu)選的聚苯乙烯支撐物上固定的提取自p"^/owoww ^的優(yōu)選的 脂酶封裝入玻璃柱，c、 將該柱的入口通過(guò)泵，優(yōu)選蠕動(dòng)泵連接到DMF中的蔗糖溶液，d、 將該柱的出口連接到本權(quán)利要求的a中所指的所述蔗糖溶液，e、 優(yōu)選在大約25。C持續(xù)攪拌該溶液，f、 將有機(jī)酸，優(yōu)選乙酸加入蔗糖溶液并通過(guò)蠕動(dòng)泵以一定流速，優(yōu)選約 20ml/h泵入玻璃柱中，持續(xù)進(jìn)行再循環(huán)一段時(shí)間，優(yōu)選大約12h，以使相當(dāng) 部分的蔗糖轉(zhuǎn)變成6-?；?蔗糖，以及g、 可選擇的使用因此獲得的6-?；?蔗糖，以制備氯化蔗糖。
6、權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，將所得到的含有6-酰基-蔗糖 的反應(yīng)液流進(jìn)行氯化和去乙?；磻?yīng)，以產(chǎn)生氯化蔗糖，包括強(qiáng)力甜味劑 4，1，，6，三氯半乳蔗糖(TGS)。
全文摘要
本發(fā)明描述了一種用于生產(chǎn)6-?；崽堑男路椒?，包括利用包括有機(jī)酸的酯化試劑將蔗糖在脂酶或酯酶的存在下在溶劑中(所用酶在其中是穩(wěn)定的)酶促?；?。通過(guò)對(duì)利用本發(fā)明的方法制備的6-?；崽锹然腿ヒ阴；梢灾苽渎然崽牵瑥?qiáng)力甜味劑三氯半乳蔗糖。
文檔編號(hào)C07H1/00GK101341165SQ200680046221
公開日2009年1月7日 申請(qǐng)日期2006年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者巴楚·強(qiáng)德拉塞卡, 彭巴巴斯·薩伯拉姆尼亞姆, 拉克什·拉南 申請(qǐng)人:V.B.醫(yī)療保險(xiǎn)私人有限公司