專利名稱：：丙型肝炎病毒變種的制作方法丙型肝炎病毒變種發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及丙型肝炎病毒(HCV)變種。發(fā)明背景丙型肝炎病毒(HCV)感染全世界超過1.7億人并且是慢性肝炎的主因，所述慢性肝炎最終可以導(dǎo)致末期肝硬化和肝細(xì)胞癌。關(guān)于HCV感染的標(biāo)準(zhǔn)治療目前是與病毒唑(RBV)組合的聚乙二醇化干擾素ot(Peg-IFN)。HCV治療的目標(biāo)是通過獲得持久的病毒應(yīng)答(SVR)來清除病毒感染，如通過在抗病毒治療6個月后血液中具有檢測不到的HCV-RNA。不幸的是，目前治療在約50%具有基因型1的受試者中無效，并且副作用顯著。因此需要新的抗病毒靶和改善的治療策略(Pawlotsky，J.M.和J.G.McHutchison，2004,HepatitisC，Developmentofnewdrugsandclinicaltrials:promisesandpitfalls.SummaryofanAASLDhepatitissingletopicconference,Chicago,IL，F(xiàn)ebruary27—March1，2003，Hepatology39:554-67;Strader等人，2004,Diagnosis,management,andtreatmentofhepatitisC.Hepatology39:1147-71)。非結(jié)構(gòu)(NS)3-4A蛋白酶是HCV復(fù)制所需的并且是關(guān)于新型抗HCV治療的有希望的靶。VX-950,有效和特異性NS3-4A蛋白酶抑制劑在受HCV基因型l感染的受試者的lb期試驗中證實基本抗病毒活性(研究VX(M-950-101)。觀察到的受試者對治療應(yīng)答的程度和病毒反彈的速率可能部分是由于對蛋白酶抑制劑的敏感性的基因型差異。HCV的快速復(fù)制速率連同其聚合酶的弱保真度引起遍及其基因組的突變的積聚(Simmonds，P,,2004，GeneticdiversityandevolutionofhepatitisCvirus-15yearson.J.Gen.Virol.85:3173-88)。蛋白酶區(qū)域中的序列變異性影響酶的催化效率或抑制劑的結(jié)合的程度未知。另外，具有顯著序列變異的眾多病毒基因組的產(chǎn)生提出了在用抗病毒療法治療的受試者中顯現(xiàn)的抗藥病毒的潛在性問題。事實上，針對抗病毒藥物例如HIV蛋白酶抑制劑的抗藥性已得到充分證明(Johnson等人，2004，Top.HIVMed.12:119-24)?？顾幫蛔儤I(yè)已顯示在HCV蛋白酶抑制劑的存在下在體外發(fā)展(Lin等人，2005,Invitrostudiesofcross-resistancemutationsagainsttwohepatitisCvirusserineproteaseinhibitors,VX—950andBILN2061.J.Biol.Chem.280:36784-36791;Lin等人，2004，InvitroresistancestudiesofhepatitisCvirusserineproteaseinhibitors,VX-950andBILN2061Structuralanalysisindicatesdifferentresistancemechanisms.LBiol.Chem.279:17508-17514;U等人，2004,Antimicrob.AgentsChemother.48:2260-6;Trozzi等人，2003，InvitroselectionandcharacterizationofhepatitisCvirusserineproteasevariantsresistanttoanactive-sitepeptideinhibitor.J.Virol.77:3669-79)。對蛋白酶抑制劑BILN2061有抵抗力的突變已在NS3基因的位置R155Q、A156T和D168V/A/Y上發(fā)現(xiàn)，但仍未在NS4區(qū)域或蛋白酶切割位點中觀察到突變。VX-950抗性突變也已在體外位置A156S上發(fā)現(xiàn)。針對VX-950和BILN2061的交叉抗性突變也已顯示在體外位置156(A156V/T)上發(fā)展(Lin等人，2005，同上)。因此，存在鑒定顯示出對于藥物或其他療法抗性的突變HCVs或其他病毒和開發(fā)有效針對這些突變病毒的新型病毒療法的需要。發(fā)明概述因此，本發(fā)明提供了HCV變種以及相關(guān)方法和組合物。特別地，提供了對一種或多種蛋白酶抑制劑例如VX-950具有減少的敏感性的HCV變種和變體HCV蛋白酶。在一個方面，本發(fā)明提供了編碼HCVNS3蛋白酶的分離的HCV多核苷酸、其生物活性類似物、或其生物活性片段的。分離的HCV多核苷酸具有突變的對應(yīng)野生型HCV多核苷酸的密碼子36、41、43、54、148、155或156的至少一個密碼子，使得它編碼與由野生型HCV多核苷酸的相應(yīng)密碼子編碼的氨基酸不同的氨基酸。野生型HCV多核苷酸可以包含SEQIDNO:1的核苷酸序列或其部分例如SEQIDNO:l的前543個核苷酸。備選地，野生型HCV多核苷酸可以包含與SEQIDNO:1的序列或其部分至少60%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或更多等同的核苷酸序列。在某些實施方案中，分離的HCV多核苷酸包含對應(yīng)野生型HCV多核普酸的密碼子36的密碼子，和該密碼子不編碼V。在某些實施方案中，該密碼子編碼M、L、A或G。在某些實施方案中，分離的HCV多核苷酸包含對應(yīng)野生型HCV多核苷酸的密碼子41的密碼子，和該密碼子不編碼Q。在某些實施方案中，該密碼子編碼H。在某些實施方案中，分離的HCV多核苷酸包含對應(yīng)野生型HCV多核苷酸的密碼子43的密碼子，和該密碼子不編碼F。在某些實施方案中，該密碼子編碼S。在某些實施方案中，分離的HCV多核苷酸包含對應(yīng)野生型HCV多核苷酸的密碼子54的密碼子，和該密碼子不編碼T。在某些實施方象中，該密碼子編碼S或A。在某些實施方案中，分離的HCV多核苷酸包含對應(yīng)野生型HCV多核苷酸的密碼子148的密碼子，和該密碼子不編碼G。在某些實施方案中，該密碼子編碼E。在某些實施方案中，分離的HCV多核苷酸包含對應(yīng)野生型HCV多核苷酸的密碼子155的密碼子，和該密碼子不編碼R。在某些實施方案中，該密碼子編碼K、M、S、T、G、I或L。在某些實施方案中，分離的HCV多核苷酸包含對應(yīng)野生型HCV多核苷酸的密碼子156的密碼子，和該密碼子不編碼A。在某些實施方案中，該密碼子編碼S、T、V或I。在某些實施方案中，分離的HCV多核苷酸包含對應(yīng)選自下述的任何2個密碼子的2個密碼子野生型HCV多核苷酸的密碼子36、41、43、54、148、155和156，和所述2個密碼子是突變的，使得任一密碼子編碼與由野生型HCV多核苷酸的相應(yīng)密碼子編碼的氨基酸不同的氨基酸。例如，分離的HCV多核苷酸包含對應(yīng)野生型HCV多核苷酸的密碼子36的密碼子，和該密碼子編碼A或M;分離的HCV多核苷酸進(jìn)一步包含對應(yīng)野生型多核苷酸的密碼子155的密碼子，和該密碼子編碼K或T;備選地，分離的HCV多核苷酸進(jìn)一步包含對應(yīng)野生型多核苷酸的密碼子156的密碼子，和該密碼子編碼T。在某些實施方案中，分離的HCV多核苷酸包含對應(yīng)選自下述的任何3個密碼子的3個密碼子野生型HCV多核苷酸的密碼子36、41、43、54、148、155和156,和所述3個密碼子是突變的，4吏得3個密碼子各自編碼與由野生型HCV多核苷酸的相應(yīng)密碼子編碼的氨基酸不同的氨基酸。在某些實施方案中，分離的HCV多核苷酸包含對應(yīng)野生型HCV多核苷酸的密碼子36、41、43、54、148、155和156的4個密碼子，和所述4個密碼子是突變的，使得4個密碼子各自編碼與由野生型HCV多核苷酸的相應(yīng)密碼子編碼的氨基酸不同的氨基酸。在進(jìn)一步的實施方案中，本發(fā)明提供了涉及本發(fā)明的HCV多核苷酸的方法和組合物。例如，提供了包含HCV多核苷酸的表達(dá)系統(tǒng)，且此類表達(dá)系統(tǒng)可以包括包含與啟動子可操作地連接的HCV多核苷酸的載體；還提供了用該載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。備選地，本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)基于mRNA展示技術(shù)，例如如美國專利號6,258,558中描述的RNA-蛋白質(zhì)融合技術(shù)，或如美國專利號6，361，943中描述的體外"病毒"技術(shù)。在另一個方面，本發(fā)明提供了分離的HCV變種。分離的HCV變種可以包含編碼HCVNS3蛋白酶的多核苷酸，其中對應(yīng)選自下述的密碼子的多核苷酸的至少一個密碼子是突變的野生型HCV多核苷酸的密碼子36、41、43、54、148、155和156,使得它編碼與由野生型HCV多核苷酸的相應(yīng)密碼子編碼的氨基酸不同的氨基酸。本發(fā)明的進(jìn)一步的實施方案提供了涉及HCV變種的方法和組合物。例如，提供了鑒定可以抑制本發(fā)明的HCV變種復(fù)制的化合物的方法；提供了被本發(fā)明的HCV變種感染的細(xì)胞。在另一個方面，本發(fā)明提供了分離的HCV蛋白酶，特別是HCVNS3蛋白酶。分離的HCVNS3蛋白酶可以包含這樣的氨基酸序列，其中在選自下述的至少一個位置上的氨基酸不同于野生型HCVNS3蛋白酶的每個相應(yīng)位置上的氨基酸野生型HCVNS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156。野生型HCVNS3蛋白酶可以包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其部分，例如SEQIDNO:2的前181個氨基酸。分離的HCVNS3蛋白酶可以包含HCVNS3蛋白酶的生物活性類似物或片段，例如分離的HCVNS3蛋白酶可以不具有SEQIDNO:2的N末端的5、10、15、20、30、35、40、45或48個氨基酸。分離的HCVNS3蛋白酶還可以包括NS4A輔因子，例如，如由SEQIDNO:2的后54個氨基酸表示的NS4A蛋白質(zhì)。分離的HCVNS3蛋白合物，例如如美國專利號6，653，127和6，211，338中描述的。在一個進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了對本發(fā)明的HCV蛋白酶特異的抗體。該抗體可以識別包含這樣的氨基酸序列的HCVNS3蛋白酶，其中在選自下述的至少一個位置上的氨基酸不同于野生型HCVNS3蛋白酶的每個相應(yīng)位置上的氨基酸野生型HCVNS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156。本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案提供了涉及本發(fā)明的抗HCV蛋白酶抗體的方法和組合物。例如，提供了包含本發(fā)明的抗體的診斷試劑盒、以及包含本發(fā)明的抗體和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。在另一個方面，本發(fā)明提供了能夠在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的HCV多核苷酸的核酸序列雜交的核苷酸探針或引物。本發(fā)明的進(jìn)一步的實施方案提供了涉及該探針或引物的方法和組合物。例如，提供了包含本發(fā)明的探針或引物的診斷或檢測試劑盒，和該試劑盒在例如測定本發(fā)明的HCV變種或HCVNS3蛋白酶是否存在于樣品中有用。在一個進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供了用于評估患者中對HCV感染的蛋白酶抑制劑的抗藥性或敏感性的方法。此類方法可以包括收集來自HCV感染的患者的生物樣品，和評估或測定樣品是否包含編碼HCVNS3蛋白酶的核酸，所述HCVNS3蛋白酶包含這樣的氨基酸序列，其中在選自下述的至少一個位置上的氨基酸不同于野生型HCVNS3蛋白酶的每個相應(yīng)位置上的氨基酸野生型HCVNS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156。蛋白酶抑制劑可以是VX-950或另一種蛋白酶抑制劑。還提供了用于指導(dǎo)治療或設(shè)計關(guān)于患者中的HCV感染的治療方案的方法。該方法可以包括評估患者對蛋白酶抑制劑的抗藥性或敏感性，和基于抗藥性或敏感性確定關(guān)于患者的方案。例如，如果預(yù)測或檢測到抗藥性(例如，對蛋白酶抑制劑例如VX-950減少的敏感性)，可以在患者的治療計劃或治療方案中包括一種或多種其他化合物或試劑。該方法可以包括下述的任何組合測定患者中的HCVNS3蛋白酶的序列(例如，基因分型)、測定患者中對HCVNS3蛋白酶的蛋白酶抑制劑的敏感性(例如，表型分型)、或測定患者的HCVs的病毒適合度水平。表型分型可以在無細(xì)胞系統(tǒng)(例如，體外蛋白酶測定法)以及基于細(xì)胞的系統(tǒng)(例如，復(fù)制子測定法或病毒感染或復(fù)制測定法)中進(jìn)行。在另一個方面，本發(fā)明提供了用于鑒定用于治療患者中的HCV感染的候選化合物的方法。此類方法可以包括提供由本發(fā)明的HCV變種感染的樣品，和測定候選化合物抑制樣品中的HCV變種的活性的能力。由HCV變種感染的樣品可以得自患者，例如細(xì)胞或血漿樣品。由HCV變種感染的樣品也可以是培養(yǎng)細(xì)胞。HCV變種的活性可以通過其感染、復(fù)制和/或變得被釋放的能力測定。備選地，此類方法可以包括提供包含本發(fā)明的HCV多核苷酸的復(fù)制子RNA，和在合適的測定法中測定候選化合物是否抑制復(fù)制子RNA的復(fù)制。另一種備選方法可以包括提供本發(fā)明的分離的HCVNS3蛋白酶和蛋白酶底物，和測定HCVNS3蛋白酶活性在候選化合物的存在下是否減少；HCVNS3蛋白酶和/或蛋白酶底物可以在基于細(xì)胞的系統(tǒng)中，例如在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)，或HCVNS3蛋白酶和/或蛋白酶底物可以在無細(xì)胞系統(tǒng)中，例如包括HCVNS3蛋白酶和肽底物的反應(yīng)混合物。HCVNS3蛋白酶可以是如美國專利號6,258,558中描述的RNA-蛋白質(zhì)融合分子，和此類融合分子可以包括在評估蛋白酶活性的無細(xì)胞測定法中。用于評估用于治療患者中的HCV感染的候選化合物的進(jìn)一步備選方法可以包括將包含本發(fā)明的HCV多核苷酸的載體和編碼指示物的指示基因引入宿主細(xì)胞內(nèi)，和在候選化合物的存在和不存在下測量指示物。本發(fā)明的另一個方面提供了用于鑒定能夠援救VX-950針對HCVNS3蛋白酶的活性的化合物的方法，所述HCVNS3蛋白酶例如已變得對VX-950有抵抗力的HCVNS3蛋白酶。此類化合物也稱為"次級化合物"。該方法可以包括使本發(fā)明的HCVNS3蛋白酶與候選化合物接觸，和測定VX-950抑制HCVNS3蛋白酶的活性的能力。該方法還可以包括下述步驟在計算機上模擬對VX-950具有減少的敏感性(例如如通過測量ICs。和/或Ki測定的)的變體HCVNS3蛋白酶，和設(shè)計和/或選擇可以援救VX-950的活性的化合物。還提供了用于治療患者中的HCV感染的方法，和該方法包括給患者施用藥學(xué)有效量的次級化合物，所述次級化合物可以援救VX-950的活性。次級化合物可以單獨或與VX-950組合施用于患者。次級化合物可以在患者的治療方案中暫時或永久地代替VX-950。例如，在暫時代替治療方案中，在化合物施用于患者并且已援救VX-950的活性后，將VX-950施用于患者。進(jìn)一步提供了用于鑒定在減少HCVNS3蛋白酶活性中有效的化合物的方法。該方法可以包括獲得本發(fā)明的HCVNS3蛋白酶的三維模型，和設(shè)計或選擇化合物。該方法可以進(jìn)一步包括在計算機上、體外和/或體內(nèi)評估化合物與蛋白酶結(jié)合或相互作用的能力。該方法還可以涉及測定設(shè)計或選擇的化合物在無細(xì)胞或基于細(xì)胞的測定法中是否可以抑制HCVNS3蛋白酶活性的能力，所述HCVNS3蛋白酶特別是對蛋白酶抑制劑例如VX-950具有減少的敏感性的變體HCVNS3蛋白酶。該方法可以進(jìn)一步或備選包括測定設(shè)計或選擇的化合物抑制細(xì)胞或樣品中的HCV復(fù)制的能力。HCV復(fù)制可以通過測量本發(fā)明的HCV變種或本發(fā)明的HCV復(fù)制子的復(fù)制來測定。本發(fā)明的另一個方面提供了用于消除或減少生物樣品、或者醫(yī)學(xué)或?qū)嶒炇以O(shè)備的HCV污染的方法。該方法可以包括使生物樣品、或者醫(yī)學(xué)或?qū)嶒炇以O(shè)備與本發(fā)明的化合物，例如通過本文描述的方法鑒定的化合物接觸的步驟。本發(fā)明的一個進(jìn)一步的方面提供了用于治療患者中的HCV感染的方法。該方法可以包括給患者單獨或與另一種抗病毒劑組合施用藥學(xué)或治療有效量的通過本發(fā)明方法鑒定的化合物。本發(fā)明的另一個方面涉及計算機工具，其提供了包含用機器可讀數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)存儲材料的機器可讀數(shù)據(jù)存儲媒體，其中機器可讀數(shù)據(jù)包含關(guān)于與HCV變種或生物樣品相關(guān)的至少2個特征的指數(shù)值。該特征選自a)顯示對蛋白酶抑制劑減少的敏感性的抗性的能力；b)HCV蛋白酶包含這樣的氨基酸序列，其中在選自下述的至少一個位置上的氨基酸不同于野生型HCVNS3蛋白酶的每個相應(yīng)位置上的氨基酸野生型HCVNS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156;c)患者的發(fā)病或恢復(fù)潛力；和d)HCV變種改變的復(fù)制能力(增加或減少)。本發(fā)明的一個進(jìn)一步的方面提供了獲得受HCV感染患者中的HCV變種鐠的方法。該方法可以包括獲得來自患者的樣品(例如，血漿樣品)，和基因分型和/或表型分型來自樣品的至少2、20、50、100、200、500個或更多HCV病毒粒子的HCV蛋白酶。例如，此類基因分型可以包括測定來自血漿樣品的至少2、20、50、100、200、500個或更多HCV病毒粒子的HCV蛋白酶的核苷酸序列。在某些實施方案中，實施此類分鐠的患者可以已用或選擇將用蛋白酶抑制劑例如VX-950進(jìn)行治療。在某些實施方案中，在2個或更多不同時間點上獲得來自實施此類分鐠的患者的血漿樣品。附圖簡述圖1舉例說明來自未處理的受基因型1HCV感染的受試者中NS3蛋白質(zhì)N末端543個核苷酸的基線序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析。圖2顯示對于基因型la和lb蛋白酶變體的Telaprevir(VX-950)的基線IC5。s。圖3舉例說明基于對VX-950的病毒應(yīng)答的受試者分組。圖4(彩色)概括了對應(yīng)突變模式的病毒應(yīng)答。圖5顯示來自針對VX-950的蛋白酶單重抗性突變體的HCV-H參照基因型la毒林的酶促IC5。s和倍數(shù)變化。圖6顯示來自4f對VX-950的蛋白酶雙重抗性突變體的HCV-H參照基因型la毒林的酶促IC5Qs和倍數(shù)變化。圖7顯示對于VX-950的抗性和適合度之間的反相關(guān)。圖8舉例說明2種HCV蛋白酶抑制劑的結(jié)構(gòu)VX-950和BILN2061。圖9舉例說明^^據(jù)結(jié)構(gòu)研究在HCV蛋白酶中的變異的位置。圖IO概述用于HCV病毒變種的表型分析的方法。圖11顯示V36置換給予針對VX-950的低水平的抗性。圖12顯示V36M變體蛋白酶的X射線結(jié)構(gòu)。圖13顯示V36與VX-950不進(jìn)行直接接觸。圖14顯示V36M變體在Gla中具有低水平的抗性和更好的適合度。圖15顯示V36A變體在Gla/b中具有低水平的抗性和更差的適合度。圖16顯示V36G變體在Glb中具有低水平的抗性和更差的適合度。圖17顯示V36L變體沒有抗性，這在G1中也是罕見的。圖18也概述用于HCV病毒變種的表型分析的方法。圖19顯示R155置換給予針對VX-950的低水平的抗性。圖20顯示R155K變體蛋白酶的X射線結(jié)構(gòu)。圖21顯示與R155K變體蛋白酶結(jié)合的VX-950的計算機模型。圖22顯示V36或T54置換給予針對VX-950的低水平的抗性。圖23顯示與V36M變體蛋白酶結(jié)合的VX-950的計算機模型。圖24顯示V36M和R155K置換在給予針對VX-950的抗性方面是累加的。圖25顯示結(jié)構(gòu)研究的結(jié)果(A)與NS4A輔因子復(fù)合的Lys"變體和Arg"s野生型NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的X射線結(jié)構(gòu)的重疊。野生型(藍(lán)色)和R155K變體(紅色)蛋白酶的Ca原子蹤跡顯示為線。殘基155用球棍模型(Arg155)或Liquorice模型(Lys155)突出顯示，其中氮為藍(lán)色和氧為紅色。(B)野生型NS3-4A的Arg155、Asp"8和Arg^的側(cè)鏈與R155K變體中相應(yīng)的Lys"、Asp"8和Arg^的側(cè)鏈的重疊。R155K變體蛋白酶的3個殘基(Arg123、Asp"8和Lys155)顯示于Liquorice模型中，野生型蛋白酶的Arg"也是如此。野生型蛋白酶的Argm和Asp168殘基顯示為細(xì)線。所有氮都是藍(lán)色的和氧是紅色的。圖26顯示了特拉匹韋(telaprevir)與HCVNS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的共同復(fù)合物(co-complex)的計算模型，所述HCVNS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域與NS4A輔因子復(fù)合。在所有三維模型中，包括野生型(A)、R155K(B)或R155T(C)變體蛋白酶，特拉匹韋在棍圖中以淺藍(lán)色顯示，而氮為藍(lán)色和氧為紅色?；钚晕稽c殘基(His57、Asp"和Ser139)顯示為灰色棍。AiV"和Asp"s殘基為紫色，而殘基155側(cè)鏈為黃色。Lys155或Thr"5側(cè)鏈保持伸展構(gòu)象，使得與特拉匹韋的P2基團最低限度的接觸。圖27顯示VX-950抗性復(fù)制子變體保持對IFN-oc非常敏感。圖28顯示VX-950抗性復(fù)制子變體保持對病毒唑非常敏感。圖"顯示VX-"0組合療法在給藥期間抑制病毒抗性的出現(xiàn)并阻止病毒突;皮。圖30提供關(guān)于HCV序列多樣性和抗性突變的概括點。圖31概括針對HCV蛋白酶抑制劑的病毒變種抗性的機制，包括先前研究。圖32概括關(guān)于針對HCV蛋白酶抑制劑的病毒變種抗性的機制的結(jié)論，包括先前的研究和本研究。圖33概括基于本研究的某些結(jié)論。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及HCV變種。特別地，提供了顯示對蛋白酶抑制劑的抗性的HCV變種。還提供了涉及HCV變種的方法和組合物。該方法和組合物在下述方面有用，鑒定病毒變種，包括HCV和其他病毒變種，評估并鑒定抗病毒化合物，和發(fā)展并優(yōu)化針對病毒感染的療法。本發(fā)明基于下述研究首先表征在用VX-950給藥前從34個受試者中分離的HCVNS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)的序列多樣性的程度，所述受試者參與臨床試驗，研究VX04-950-101。隨后通過在用VX-950給藥14天后受試者中的蛋白酶NS3-4A區(qū)域的序列分析監(jiān)控在體內(nèi)針對VX-950的抗性的出現(xiàn)。在給藥結(jié)束后7-10天進(jìn)一步收集隨訪樣品，以察看在給藥期間發(fā)展的任何抗藥突變在VX-950去除后是否維持在血漿中。發(fā)現(xiàn)在群體中已增加超過基線的任何突變視為潛在抗藥突變。因為抗藥性突變可能需要一定時間積聚至可測量的水平，所以該研究包括檢測變種的較小群體(而不是野生型病毒和病毒變種群體中的占優(yōu)勢種類)的新方法，所述方法涉及獲得來自許多(例如，80-85)單個病毒克隆/受試者/時間點的序列，使得可以檢測并鑒定在用VX-950給藥14天中可能出現(xiàn)的病毒變種，其敏感性下至約5%的群體。此類80/85單個病毒克隆可以代表高達(dá)80/85個不同的病毒粒子。茇神以及;^^,核奪^和f^凝本發(fā)明提供了HCV變種。在具體實施方案中，HCV變種包括編碼對蛋白酶抑制劑例如VX-950具有減少的敏感性的HCV蛋白酶(也稱為"變體HCV蛋白酶")的多核苷酸序列。如本文所使用的，野生型HCV指包含編碼對蛋白酶抑制劑具有正?；蛩杳舾行缘腍CV蛋白酶的多核苷酸(也稱為"野生型多核苷酸")的HCV，并且在具體實施方案中，蛋白酶抑制劑是VX-950。類似地，野生型HCV蛋白酶指對蛋白酶抑制劑具有正?；蛩杳舾行缘腍CV蛋白酶，并且在具體實施方案中，蛋白酶抑制劑是VX-950。如本文所使用的，HCV可以是任何基因型或亞型的HCV，例如基因型1-6。如本文所使用的，"NS3蛋白酶"或"HCVNS3蛋白酶"指HCVNS蛋白質(zhì)3或其具有絲氨酸蛋白酶活性的部分。例如，NS3蛋白酶可以是如SEQIDNO:2(685個氨基酸)的前631個氨基酸序列表示的NS3蛋白質(zhì)；備選地，NS3蛋白酶可以是如SEQIDNO:2的前181個氨基酸表示的蛋白質(zhì)；181-氨基酸片段在本領(lǐng)域中也稱為NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域。NS3蛋白酶也可以是NS3-NS4A蛋白質(zhì)復(fù)合物，例如美國專利號6,653,127;6,211,338中描述的復(fù)合物。"NS3蛋白酶活性"指在NS4A的蛋白酶活性。NS4A蛋白質(zhì)，例如如由SEQIDNO:2的后54氨基酸序列表示的，通常充當(dāng)NS3蛋白酶的輔因子，并且可以形成NS3-NS4A絲氨酸蛋白酶復(fù)合物；NS4A蛋白質(zhì)的生物活性部分指NS4A蛋白質(zhì)的片段，其保留NS4A蛋白質(zhì)作為NS3蛋白酶的輔因子的功能。本發(fā)明還提供了分離的HCV變種，分離的變種HCVNS3蛋白酶，和編碼變種HCVNS3蛋白酶的分離的多核苷酸。術(shù)語"分離的"一般指從受試病毒、蛋白酶或多核苷酸的天然環(huán)境的組分中分離的和/或回收的。在某些實施方案中，變體HCV蛋白酶可以是包含這樣的氨基酸序列的變體HCVNS3蛋白酶，其中在來自野生型HCVNS3蛋白酶的位置36、41、43、54、148、155和156的一個或多個位置上的一個或多個氨基酸不同于野生型HCVNS3蛋白酶的每個相應(yīng)位置上的氨基酸。野生型HCVNS3蛋白酶可以包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其部分，例如SEQIDNO:2的前181個氨基酸。分離的HCVNS3蛋白酶可以包含HCVNS3蛋白酶的生物活性類似物或片段，例如分離的HCVNS3蛋白酶可以不具有SEQIDNO:2的N末端的5、10、15、20、30、35、40、45或48個氨基酸。在變體HCVNS3蛋白酶的各個位置上的氨基酸置換或突變的例子顯示于表l-4中。本文的表、圖和實施例也提供了與野生型HCVNS3蛋白酶或野生型HCVs比較，用變體HCVNS3蛋白酶或HCV病毒變種獲得的各種數(shù)據(jù)。還提供了本發(fā)明的變體HCVNS3蛋白酶的生物活性片段或類似物。Bartenschlager等人(1994，LVirology68:5045-55)描述了HCVNS3蛋白質(zhì)的各種片段，例如，N末端7或23個殘基的刪除取消在NS4B/5A位點上的切割，但對實施NS3蛋白酶活性的其他切割位點沒有影響；和N末端39個殘基的刪除取消在NS4B/5A和NS5A/5B位點上的切割，并減少在NS4A/4B位點上的NS3蛋白酶活性。Failla等人(1995，J.Virology69:1769-77)描述了野生型NS3蛋白質(zhì)的N末端IO個殘基的刪除對NS3蛋白酶活性沒有影響，N末端15或28個殘基的刪除導(dǎo)致NS3蛋白質(zhì)具有部分蛋白酶活性的NS3蛋白質(zhì)(在NS5A/5B位點上正常切割，但在NS4A/4B和NS4B/5A位點上較低)，N末端49個殘基的刪除導(dǎo)致完全失活的NS3蛋白酶，和NS3蛋白質(zhì)中NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的C末端IO個殘基的刪除也導(dǎo)致完全失活的NS3蛋白醉。提供了例如制備本發(fā)明的變體HCV蛋白酶的表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)系統(tǒng)還可以包括包含本發(fā)明的HCV多核苷酸的表達(dá)栽體。包含本發(fā)明的HCV多核苷酸(或"核酸"，在本文中可互換使用)的合適原核或真核載體(例如，表達(dá)栽體)可以通過合適的方法(例如，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、感染)引入合適的宿主細(xì)胞內(nèi)，使得多核苷酸與一種或多種表達(dá)控制元件可操作地連接(例如，在栽體中或整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi))。對于生產(chǎn)，宿主細(xì)胞可以維持在適合于表達(dá)的條件下(例如，在誘導(dǎo)物，補充有合適的鹽、生長因子、抗生素、營養(yǎng)補充物等的合適培養(yǎng)基的存在下)，由此生產(chǎn)編碼的多核苷酸。需要時，可以回收和/或分離(例如，從宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中)編碼的蛋白質(zhì)。應(yīng)當(dāng)理解生產(chǎn)方法包括在轉(zhuǎn)基因動物的宿主細(xì)胞中表達(dá)(參見例如，W092/03918)。表達(dá)系統(tǒng)可以基于無細(xì)胞系統(tǒng)例如美國專利號6，258，558中描述的RNA-蛋白質(zhì)融合技術(shù)，或美國專利號6，361，943中描述的體外"病毒"。也可以使用核糖體展示法，例如美國專利號5,843,701中描述的方法。提供了各種測定法，例如適合于HCVs表型分型的測定法。該測定法可以指向測量病毒活性(例如，感染、復(fù)制和/或病毒顆粒的釋放)或酶促活性(例如，蛋白酶活性)。病毒活性測定法可以使用由待測活性的病毒或病毒變種感染的細(xì)胞或樣品。細(xì)胞或樣品可以得自患者例如人患者。備選地，細(xì)胞或樣品可以進(jìn)行培養(yǎng)并在體外用病毒或病毒變種進(jìn)行感染。病毒活性測定法可以使用基于復(fù)制子的系統(tǒng)，例如Trozzi等人(13)和美國專利申請公開號20050136400中描述的基于復(fù)制子的系統(tǒng)。酶促活性可以在無細(xì)胞或基于細(xì)胞的系統(tǒng)中進(jìn)行測定，其一般包括目的酶或其生物活性片段或類似物和目的酶的底物。例如，美國專利申請公開號20030162169描述了用于測定HCVNS3蛋白酶的活性的基于替代細(xì)胞的系統(tǒng)和方法。Trozzi等人(13)描述了使用肽底物和HPLC系統(tǒng)的體外、無細(xì)胞蛋白酶測定法。本發(fā)明利用NS3/4A蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)已得到解決(參見例如，W098/11134)的事實。可以獲得本發(fā)明的變體蛋白酶的三維模型；例如基于其與變體蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)相互作用的能力設(shè)計或選擇化合物，并且與蛋白酶結(jié)合或相互作用的能力通過在計算機上模擬進(jìn)行評估，并可以通過體外或體內(nèi)測定法中進(jìn)一步進(jìn)行評估?；衔锟梢允菑慕M合化學(xué)文庫中鑒定或通過合理藥物設(shè)計制備的化合物。在示例性實施方案中，該化合物是通過合理藥物設(shè)計制備的化合物并且衍生自已知蛋白酶抑制劑例如VX-950的結(jié)構(gòu)。合理藥物設(shè)計也可以與大規(guī)模篩選實驗的系統(tǒng)方法組合，在所述大規(guī)模篩選實驗中潛在的蛋白酶抑制劑藥物靶用來自組合文庫的化合物進(jìn)行測試。合理藥物設(shè)計是集中方法，其使用關(guān)于藥物受體的結(jié)構(gòu)或其天然配體的結(jié)構(gòu)的2以鑒定或制備候選藥物。蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)可以使用X射線晶體學(xué)或核磁共振波i普學(xué)方法進(jìn)行測定。在本發(fā)明中，包含殘基36、41、43、54、148、155或156中的一個或多個突變的變體HCVNS3蛋白酶的三維結(jié)構(gòu)現(xiàn)在可以使用常規(guī)X射線晶體學(xué)和/或NMR波i普學(xué)技術(shù)容易地進(jìn)行測定。合理藥物設(shè)計也可以與大規(guī)模篩選實驗的系統(tǒng)方法組合，在所述大規(guī)模篩選實驗中潛在的蛋白酶抑制劑藥物靶用來自組合文庫的化合物進(jìn)行測試?？梢栽O(shè)計計算機程序以搜索包含許多不同化學(xué)化合物的結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫。該計算機可以逸擇最可能與變體HCVNS3蛋白酶相互作用的那些化合物，和此類鑒定的化合物可以在適合于評估蛋白酶抑制劑的測定法(例如，病毒或酶促測定法)中進(jìn)行測試。在某些實施方案中，將鑒定的化合物配制到包含該化合物和藥學(xué)上可接受的栽體、佐劑或媒介物的組合物內(nèi)。優(yōu)選地，該組合物包含有效減少HCVNS3絲氨酸蛋白酶的活性的量的化合物。更加優(yōu)選地，該組合物配制用于給患者施用。該組合物還可以包含選自下述的另外試劑免疫調(diào)節(jié)劑；抗病毒劑；HCV蛋白酶的第二種抑制劑；和HCV生命周期中的另一種靶的抑制劑；細(xì)胞色素P-450抑制劑；或其組合。各種組合物在下文更詳細(xì)地進(jìn)行描述。在另一個方面，本發(fā)明提供了對HCV蛋白酶特異的抗體，所述HCV蛋白酶特別是與野生型HCVNS3蛋白酶比較，具有改變的一個或多個氨基酸的HCVNS3蛋白酶。術(shù)語"抗體"以其最廣泛的含義使用，并且具體包含但不限于，完整的單克隆抗體、多克隆抗體、嵌合抗體、由至少2種完整抗體形成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)、和抗體片段，只要它們顯示所需生物活性。術(shù)語"免疫球蛋白"包括不一定是抗體的各種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)。"抗體片段"包含完整抗體的部分，優(yōu)選地完整抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab'、F(aV)2和Fv片段；雙抗體；線性抗體(Zapata等人，ProteinEng.，8(10):1057-1062(1995))單鏈抗體分子；和由抗體片段形成的多特異性抗體。"單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中這些結(jié)構(gòu)域存在于單條多肽鏈中。優(yōu)選地，F(xiàn)v多肽進(jìn)一步包含在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接體，其使得scFv能夠形成用于抗原結(jié)合的所需結(jié)構(gòu)。關(guān)于scFv的綜述，參見PluckthuninThePharmacologyofMonoclonalAntibodies,第113巻，Rosenburg和Moore,編輯(Springer-Verlag:NewYork,1994)，第269-315頁。術(shù)語"雙抗體"指具有2個抗原結(jié)合位點的小抗體片段，所述片段包含在同一多肽鏈(VH-VL)中與輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(VL)連接的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)。通過使用太短而不允許同一條鏈上的2個結(jié)構(gòu)域配對的連接體，結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對并產(chǎn)生2個抗原結(jié)合位點。雙抗體在例如EP404，097;W093/11161;和Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993)中更充分地描述。由針對HCVNS3蛋白質(zhì)的已知抗體可以開發(fā)針對變體HCV蛋白酶的抗體，例如通過分子進(jìn)化。美國專利申請公開號20040214994描述了針對HCVNS3蛋白質(zhì)的人重組抗體。通過將合適的核苷酸變化引入已知抗體的DM內(nèi)或通過肽合成制備氨基酸序列變體。此類變體包括例如，從已知抗體的氨基酸序列的殘基的刪除，或在已知抗體的氨基酸序列內(nèi)的殘基插入和/或殘基的置換。制備刪除、插入和置換的任何組合以取得最終構(gòu)建體，條件是最終構(gòu)建體具有所需特征。氨基酸變化也可以改變抗體的翻譯后加工，例如改變糖基化位點的數(shù)目或位置。本發(fā)明的抗體可以具有診斷以及治療應(yīng)用。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體是標(biāo)記的。本公開內(nèi)容的各種抗體可以用于檢測或測量變體HCVNS3蛋白酶的表達(dá)，且因此，它們也在下述應(yīng)用例如細(xì)胞分選和成像(例如流式細(xì)胞計量術(shù)和熒光活化細(xì)胞分選)中有用，以用于診斷或研究目的。如本文所使用的，術(shù)語"標(biāo)記"或"標(biāo)記的"指抗體中另一種分子的摻入。在一個實施方案中，標(biāo)記是可檢測標(biāo)記，例如放射性標(biāo)記的氨基酸的摻入或與生物素基部分的多肽附著，所述生物素基部分可以通過標(biāo)記的抗生物素蛋白(例如包含可以通過光學(xué)或比色法進(jìn)行檢測的熒光標(biāo)記或酶促活性的鏈霉親和素)進(jìn)行檢測。在另一個實施方案中，標(biāo)記或標(biāo)記物可以是治療劑，例如藥物綴合物或毒素。標(biāo)記多肽和糖蛋白的各種方法是本領(lǐng)域已知的并且可以使用。用于多肽的標(biāo)記的例子包括但不限于下述放射性同位素或放射性核素(例如，3H、"C、15N、35S、'。Y、"Tc、mIn、1251、1311)，熒光標(biāo)記(例如，F(xiàn)ITC、羅丹明、鑭系元素磷光體)，酶促標(biāo)記(例如，辣根過氧化物酶、p-半乳糖苷酶、螢光素酶、堿性磷酸酶)，化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，生物素基，由次級報道分子(例如，亮氨酸拉鏈對序列、二級抗體的結(jié)合位點、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、附加表位)識別的預(yù)定多肽表位，磁性試劑例如釓螯合物，毒素例如百日咳毒素，紫杉醇，細(xì)胞松弛素B,短桿菌肽D，溴化乙啶，依米丁，絲裂霉素，依托泊苷，替尼泊苷，長春新堿，長春堿，秋水仙堿，多柔比星，道諾紅霉素，二羥基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，光輝霉素，放線菌素D，l-去氫睪酮，糖皮質(zhì)激素，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛爾和嘌呤霉素，及其類似物或同系物。在某些實施方案中，標(biāo)記通過各種長度的間隔臂進(jìn)行附著以減少潛在的空間位阻。在某些方面，也可以制備用于檢測生物樣品中的HCV病毒、變體HCVNS3多核苷酸、或變體HCV蛋白酶的存在的試劑盒。此類試劑盒可以包括識別本發(fā)明的變體HCVNS3蛋白酶的抗體，以及適合于檢測抗體和變體蛋白酶或其部分之間的復(fù)合物存在的一種或多種輔助試劑。備選地，此類試劑盒可以包括本發(fā)明的探針或引物，此類探針或引物可以在嚴(yán)格條件下與本發(fā)明的變體HCVNS3多核苷酸雜交。本發(fā)明的探針或引物可以適合于可以用于檢測目的受試者的PCR或RT-PCR。備選地，此類試劑盒可以商購可得的基于PCR或非基于PCR的HCVi貪斷試劑盒，例d(口，RocheCobasAmplicor系統(tǒng)和BayerVersant系統(tǒng)，包括RNA3.0測定法(bDNA)和RNAQualitativeAssay(TMA)。AMPLICORHCVMONITORTest,v2.0是用于定量人血清或血漿中的HCVRNA的體外核酸擴增測試。VERSANTHCVRNA3.0Assay(bDNA)是已證明可靠檢測21ogl0滴的病毒栽量測定法。VERSANTHCVRNAQualitativeAssay是基于技術(shù)發(fā)展水平的Transcription-MediatedAmplification(TMA)技術(shù)。秀#遂合#希辦浙本發(fā)明的另一個方面提供了包括本發(fā)明的化合物的藥物組合物或制劑，例如鑒定為能夠援救VX-950活性的次級化合物，或鑒定為有效針對HCV變種(例如，能夠減少病毒變種的復(fù)制)和/或變體HCVNS3蛋白酶(例如，能夠減少變體蛋白酶的酶促活性)的化合物。本發(fā)明的另一個方面提供了本發(fā)明的化合物在藥物制備中的用途，例如用于治療患者中的HCV感染的藥物。本發(fā)明的另一個方面提供了用于治療患者中的HCV感染的方法。此類方法一般包括給患者單獨或與另一種抗病毒劑組合(順次或同時)施用藥學(xué)或治療有效量的本發(fā)明的化合物?；衔锘蛟噭┑?有效量，，一般指與在不存在此類化合物或試劑的情況下這些參數(shù)的水平比較，有效地重現(xiàn)性減少HCVNS3蛋白酶表達(dá)或活性、HCV產(chǎn)生、復(fù)制或毒力、或HCV感染，或產(chǎn)生HCV感染的一種或多種癥狀改善或減輕的那些量。在另一個方面，本發(fā)明的方法和組合物包括蛋白酶抑制劑(例如，VX-950)和另一種抗病毒劑，優(yōu)選地抗HCV試劑。靼向HCV的組合療法也在美國專利號6，924，270;6,849,254中得到描述。另一種抗病毒試劑也可以是蛋白酶抑制劑，特別是HCV蛋白酶抑制劑。本領(lǐng)域已知的HCV蛋白酶抑制劑包括VX-950(圖8)，BILN2061(圖8,也參見PCT公開號WO00/59929;美國專利號6，608,027)，化合物1(13)，抑制劑A、B和C(PCT公開號WO04/039970)。潛在的HCV蛋白酶抑制劑也已在下述參考文獻(xiàn)中得到描述PCT和美國專利申請乂^開號WO97/43310，US20020016294，WO01/81325，WO02/08198，WO01/77113，WO02/08187，WO02/08256，WO02/08244，WO03/006490，WO01/74768，WO99/50230，WO98/17679，WO02/48157，US20020177725，WO02/060926，US20030008828，WO02/48116，WO01/64678，WO01/07407，WO98/46630，WO00/59929，WO99/07733，WO00/09588,US20020016442,WO00/09543，WO99/07734，US20020032175，US20050080017，WO98/22496，WO02/079234，WO00/31129，WO99/38888,WO99/64442，WO2004072243和WO02/18369，以及美國專利號6，018，020;6,265,380;6，608，027;5,866,684;M.Llinas-Br薦t等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,8，第1713-18頁(1998);W.Han等人，Bioorg.Med.Chem.Lett,10，711-13(2000);R.D畫don等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，10，第1571-79頁(2000);M.Llinas-Brunet等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.，10，第2267—70頁(2000);和S.LaPlante等人，Bioorg.Med.Chem.Lett.,10，第2271-74頁(2000)。許多NS3蛋白酶抑制劑已也由ScheringCorp.、ScheringA.G.和其他公司開發(fā)，并且它們在下述專利中得到描述美國專利申請/^開號20050249702;20050153900;20050245458200502220472005016492120030207861200501073042004007760020030207861200502091642005011916820020147139200500904502004001898620050197301200500854252005014343920040147483200302362422005017664820050059606200500596062004014287620030216325美國專利號6,962,932;6,914,122;6，911，4286,846,802;6,838,475。抗病毒劑也可以包括但不限于，免疫調(diào)節(jié)劑，例如oc-、p-和y-干擾素，聚乙二醇化衍生的干擾素-a化合物，和胸腺素；其他抗病毒劑，例如病毒唑，金剛烷胺和telbivudine;丙型肝炎蛋白酶的其他抑制劑(例如NS2-NS3抑制劑和NS3-NS4A抑制劑)；HCV生命周期中的其他耙的抑制劑，包括解旋酶和聚合酶抑制劑；內(nèi)部核糖體進(jìn)入抑制劑；廣譜病毒抑制劑，例如IMPDH抑制劑(例如，美國專利號5,807,876、6,498,178、6,344,465、6,054,472、WO97/40028、WO98/40381、WO00/56331的化合物，以及霉酚酸及其衍生物，并且包括但不限于，VX-497、VX-148、和/或VX-944);或上述的任何一種的組合。還參見W.Markland等人，Antimicrobial&AntiviralChemotherapy,44,第859頁(2000)和美國專利號6，541，496。下述定義在本文中使用"Peg-Int頭，，意指PEG-Intron,可從ScheringCorporation,Kenilworth，N.J.獲得的peginteferonoc-2b;"Intron"意指Intron-A，可從ScheringCorporation,Kenilworth,N.J.獲得的干擾素oc-2b'，"病毒喳，，意指可從ICNPharmaceuticals,Inc.，CostaMesa，Calif.獲得的病毒唑(1-P-D呋喃核糖基-lH-l，2，4-三唑-3-曱酰胺)；在MerckIndex,條目8365,第12版中得到描述；也可作為Rebetol⑧從ScheringCorporation,Kenilworth，N.J.獲得,或作為Copegus⑧從Hoffmann-LaRoche,Nutely,N.J.獲得；"Pagasys"意指Pegasys,可從Hoffmann-LaRoche,Nutely，N.J.獲得的peg-干擾素ct-2a;"Roferon"意指Roferon,可從Hoffmann-LaRoche,Nutley，NJ.獲得的重組干擾素a-2a;"Berofor"意指Berofor,可從BoehringerIngelheimPharmceutical，Inc.，Ridgefield，Conn,獲得的干擾素ct-2;Sumiferon,可從例如Sumitomo,曰本獲得的天然ct干擾素的純化摻合物，例如Sumiferon;Wellferon,可從GlaxoWellcomeLtd.,英國獲得的干擾素otnl;Alferon,由InterferonSciences制備，并可從PurdueFrederickCo.，CT獲得的天然ot干擾素的混合物。如本文所使用的，術(shù)語"干擾素"意指高度同源的物種特異性蛋白質(zhì)的家族成員，其抑制病毒復(fù)制和細(xì)胞增殖，并調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，例如干擾素ot、千擾素P、或干擾素v。MerckIndex,條目5015，第12版。根據(jù)本發(fā)明一個實施方案，干擾素是ot-干擾素。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明的治療組合利用天然a千擾素2a。備選地，本發(fā)明的治療組合利用天然ot干擾素2b。在另一個實施方案中，本發(fā)明的治療組合利用重組cx干擾素2a或2b。在另外一個實施方案中，干擾素是聚乙二醇化的cc干擾素2a或2b。適合于本發(fā)明的干擾素包括(a)Intron(干擾素-a2B，ScheringPlough),和(b)Peg-Intron，(c)Pegasys，(d)Roferon，(e)Berofor，(f)S頭ife醒，(g)WeiIferon，(h)可從Amgen，Inc.，NewburyPark,Calif.獲得的復(fù)合oc干擾素，(i)Alferon;(j)Viraferon;(k)Infergen。蛋白酶抑制劑可以口部施用，而干擾素一般不口部施用。然而，本文沒有任何事物將本發(fā)明的方法或組合限制于任何具體劑型或方案。因此，根據(jù)本發(fā)明的組合的每種組分可以分開、一起、順次或同時或以其任何組合施用。在一個實施方案中，蛋白酶抑制劑和干擾素在分開的劑型中施用。在一個實施方案中，任何另外的試劑與蛋白酶抑制劑一起作為單一劑型的部分施用或作為分開的劑型施用。因為本發(fā)明涉及化合物和/或試劑的組合，所以每種化合物或試劑的具體量可以依賴組合中的每種其他化合物的具體量。干擾素的劑量一般以IU(例如，約4百萬IU/約12百萬IU)測量。因此，可以與本發(fā)明的化合物組合使用的試劑(無論充當(dāng)免疫調(diào)節(jié)劑或其他方面)包括但不限于，干擾素-ot2B(IntronA，ScheringPlough);Rebat旭(ScheringPlough,干擾素-oc2B+病毒哇)；聚乙二醇化干擾素ct(Reddy,K.R.等人"EfficacyandSafetyofPegylated(40-kd)interferonalpha-2acomparedwithinterferonalpha—2ainnoncirrhoticpatientswithchronichepatitisC，"Hepatology，33，第433-438頁(2001));復(fù)合干擾素(Kao，J.H.等人,"EfficacyofConsensusInterferonintheTreatmentofChronicHepatitis,"J.Gastroenterol.Hepatol.15,第1418-1423頁(2000))，干擾素-ot2A(RoferonA;Roche),成'淋巴細(xì)胞樣或"天然"干擾素；干擾素T(Clayette,P.等人，"IFN-tau，ANewInterferonTypeIwithAntiretroviralactivity,"Pathol.Biol.(Paris)47，第553-559頁(1999));白介素2(Davis,G.L.等人，"FutureOptionsfortheManagementofHepatitisC，"SeminarsinLiverDisease,19，第103-112頁(1999));白介素6(Davis,G.L.等人，同上)；白介素12(Davis,G.L.等人，同上)；病毒唑；和增強1型輔助T細(xì)胞應(yīng)答發(fā)展的化合物(Davis,G.L.等人，同上)。來改善病毒感染。干擾素的抗病毒效應(yīng)通常通過抑制病毒穿入或脫殼、病毒RM合成、病毒蛋白質(zhì)翻譯和/或病毒裝配和釋放來介導(dǎo)。刺激細(xì)胞中的干擾素合成的化合物(Tazulakhova，E.B.等人，"RussianExperienceinScreening，analysis，andClinicalApplicationofNovelInterferonInducers,"J.InterferonCytokineRes.，21第65-73頁)包括但不限于，雙鏈RM、單獨或與托普霉素組合、和咪奮莫特(3MPharmaceuticals;Sauder，D.N.，"ImmunomodulatoryandPharmacologicPropertiesofImiquimod，"J.Am.Acad.Dermatol.，43第S6-11頁(2000))。用，包括^旦不限于，W002/18369中詳細(xì)說明的那些，所述專利通過引用合并入本文(參見例如，第273頁第9-22行，和第274頁第4行至第276頁第11行，所述專利整體通過引用合并入本文)。刺激細(xì)胞中的干擾素合成的化合物(Tazulakhova等人，J.InterferonCytokineRes.21，65-73))包括但不限于，雙鏈RNA、單獨或與托普霉素組合、和咪會莫特(3MPharmaceuticals)(Sauder，J.Am.Arad.Dermatol.43,S6-11(2000))。已知具有或可能具有HCV抗病毒活性的其他化合物包括但不限于，病毒唑(ICNPharmaceuticals);肌苷5'-單磷酸脫氫酶抑制劑(本文提供的VX-497制劑)；金剛烷胺和金剛烷乙胺(Younossi等人，InSeminarsinLiverDisease19，95-102(1999));LY217896(美國專利號4，835，168)(Colacino等人，AntimicrobialAgents&Chemotherapy34,2156-2163(1990));和9-將基-6-甲氧基-1，4a-二甲基1，2，3，4，4a，9，10，10a-八氫-菲-l羧酸曱酯；6-甲氧基-l，4a二甲基-9-(4-甲基-哌嗪-1-基亞氨基)-1，2，3，4，4a，9，10，10a-八氫-菲-l羧酸甲酯-鹽酸鹽；1-(2-氯-苯)-3-(2，2-聯(lián)苯-乙基)-尿素(美國專利號6,127,422)。關(guān)于前述分子的制劑、劑量和施用途徑在下文引用的參考文獻(xiàn)中教導(dǎo)，或是本領(lǐng)域眾所周知的，如例如F.G.Hayden，inGoodman&Gilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,NinthEdition,Hard畫等人，編輯，McGraw-Hill，NewYork(1996)，第50章，第1191-1223頁中公開的，以及其中引用的參考文獻(xiàn)。備選地，一旦顯示出HCV抗病毒活性，特別是針對HCV抗藥性毒林的抗病毒活性的化合物已得到鑒定，那種化合物的藥學(xué)有效量就可以使用技術(shù)人員眾所周知的4支術(shù)進(jìn)行測定。注意例如Benet等人，inGoodman&Gilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics,NinthEdition,Hardman等人，編輯，McGraw-Hill,NewYork(1996)，第1章，第3-27頁，和其中引用的參考文獻(xiàn)。因此，此類化合物的合適制劑、劑量范圍和給藥方案可以通過常規(guī)方法容易地測定。涉及本發(fā)明的組合療法的組合物可以提供給一種或多種細(xì)胞、或人患者，在同時或順次施用的分開的藥學(xué)上可接受的制劑中，包含超過一種治療劑的制劑中，或通過各式各樣的單一試劑和多重試劑制劑。與施用途徑無關(guān)，這些藥物組合形成抗HCV有效量的藥學(xué)上可接受的制劑的組分?？梢栽诒景l(fā)明的方法中使用的大量其他免疫調(diào)節(jié)劑和免疫刺激劑是目前可獲得的并包括AA-2G;金剛烷酰胺二肽；腺苷脫氨酶，Enzon佐劑，Al1iance;佐劑，Ribi;佐劑，Vaxcel;Adjuvax;agelasphin—ll;AIDS療法,Chiron',海藻葡聚糖,SRI;algammulin,Anutech;Anginlyc;抗細(xì)胞因子，Yeda;Anticort;抗胃泌素-17免疫原，Ap;抗原遞送系統(tǒng)，Vac;抗原制劑，IDBC;抗GnRH免疫原，Aphton;Antiherpin;Arbidol;氮雙他咯；Bay-q-8939;Bay-r-1005;BCH-1393;Betafectin;Biostim;BL-001;BL-009;Broncostat;Cantastim;CDRI-84-246;頭孢地噢；趨化因子抑制劑，IC0S;CMV肽，CityofHope;CN-5888;細(xì)胞因子釋訪文試劑，St;DHEAS,Paradigm;DISCTA-HSV;J07B;I01A;I01Z;二硫卡鈉；ECA-10-142;ELS-1;內(nèi)毒素，Novartis;FCE-20696;FCE-24089;FCE-24578;FLT-3配體，Immunex;FR-900483;FR-900494;FR-901235;FTS-Zn;G-蛋白質(zhì)，Cadus;gludapcin;珙乙谷酰胺；glycophosphopeptical;GM-2;GM-53;GMDP;生長因子疫苗，EntreM;H-BIG，NABI;H-CIG，NABI;HAB-439;幽門螺桿菌(#e//co^c^rpj^or/)疫苗；皰滲特異性免疫因子；HIV療法，UnitedBiomed;HyperGAM+CF;ImmuMax;ImmunBCG;免疫療法，Connective;免疫調(diào)節(jié)劑，Evans;免疫調(diào)節(jié)劑，Novacell;伊姆雷-l;伊姆雷-2;Indomune;肌酐普拉諾貝'，干擾素，Dong-A(oc2);干擾素，Genentech(Y);干擾素，Novartis(a);白介素-12，GeneticsIns;白介素-15，Immunex;白介素-16，ResearchCor;ISCAR-1;J005X;L-644257;licomarasminicacid;LipoTher;LK-409,LK-410;LP-2307;LT(R1926);LW-50020;MAF，Shionogi;MDP衍生物，Merck;曱硫啡肽，TNI;甲基呋喃基丁內(nèi)酯；MIMP;米立司亭；混合細(xì)菌疫苗，Tem,MM-1;moniliastat;MPLA，Ribi;MS-705;莫拉丁酉旨；marabutide，Vacsyn;胞壁酰二肽個汙生物；胞壁酰肽衍生物myelopid;-563;NAC0S-6;NH-765;NISV，Proteus;NPT-16416;NT-002;PA-485;PEFA-814;肽，Scios;肽聚糖，Pliva;Perthon,AdvancedPlant;PGM衍生物，Pliva;藥物開發(fā)號1099;No.1426;No.1549;No.1585;No.1607;No.mo;No.1779;No.2002;No.2060;No.2795;No.3088;No.3111;No.3345;No.3467;No.3668;No.3998;No.3999;No.4089;No,4188;No.4451;No.4500;No.4689;No.4833;No.494;No.5217;No.530;匹多莫德；匹美勞肽；吡萘非特；PMD-589;鬼臼毒素，Conpharm;POL-509;多-ICLC;多-ICLC，YamasaShoyu;PolyA-PolyU;多糖A;蛋白質(zhì)A,BerluxBioscience;PS34W0;假單胞菌(尸"油/z7歸s)MAbs,Teijin;Psomaglobin;PIX-78419;Pyrexol;pyriferone;Retrogen;Retropep;RG-003;Rhinostat;rifamaxil;RM-06;Rollin;羅莫肽；RU-40555;RU-41821;風(fēng)滲抗體，ResCo;S-27649;SB-73;SDZ-280-636;SDZ-MRL953;SK&F-107647;SL04;SL05;SM-4333;Solutein;SRI-62-834;SRL-172;ST-570;ST-789;葡萄球菌噬菌體溶解物；SUmulon;抑制素；T-150R1;T-LCEF;他比勞肽；替莫肽；Theradigm-HBV;Theradigm-HBV;Theradigm-HSV;THF，Pharm&Upjohn;THF，Yeda;胸腺法新；胸腺激素組分；胸腺卡??；thymolymphotropin;胸腺噴丁；胸腺噴丁類似物；胸腺噴丁，Peptech;胸腺素組分5，oc;胸腺刺激素；胸腺曲南；TMD-232;T0-115;轉(zhuǎn)移因子，Viragen;促吞噬肽，Selavo;烏苯美司；Ulsastat;ANGG-;CD-4+;Collag+;C0LSF+;C0M+;DA-A+;GAST-;GF-TH+;GP-120-;IF+;IF-A+;IF-A-2+;IF-B+;IF-G+;IF-G-1B+;IL-2+;IL-12+;IL-15+;IM+;LHRH-;LIPCOR+LLYM-B+;LYM-NK+;LYM-T+;OPI+;PEP+;PHG-MA+;RNA-SYN-;SY-CW-;TH-A-I+;TH-5+;TNF+;UN。在本發(fā)明中有用的代表性核苷和核苷酸化合物包括但不限于(+)-順-5-氟-l-[2-(羥曱基)-[1，3-氧硫烷-5基]胞嘧啶；(-)-2'-脫氧-3'-巰基胞苷-5'-三磷酸鹽(3TC);(-)-順-5-氟-1-[2(羥甲基)-[l，3-氧硫烷-5-基]胞嘧啶(FTC);(-)2'，3'，二脫氧-3'-硫代胞苷[(-)-SddC];1-(2'-脫氧-2'-氟-P-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘胞嘧啶(FIAC);1-(2'-脫氧-2'-氟-p-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘胞嘧啶三磷酸鹽(FIACTP);1-(2'-脫氧-2'-氟-p-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-間-乙基尿嘧啶(FMAU);1-P-D-呋喃核糖基-1，2,4-三唑-3-甲酰胺；2'，3'-二脫氧-3'-氟-5-曱基-脫氧胞苷(FddMeCyt);2'，3'-二脫氧-3'-氯-5-曱基-脫氧胞苷(ClddMeCyt);2、3'-二脫氧-3'-氨基-5-曱基-脫氧胞苷(AddMeCyt);，3'-二脫氧-3'-氟-5-曱基胞苷(FddMeCyt);2\3'-二脫氧-3'-氯-5-甲基胞香(Cl謹(jǐn)eCyt);2'，3'-二脫氧-3'-氨基-5-曱基胞苷(AddMeCyt);2',-二脫氧-3'-氟胸苷(FddThd);2'，3'-二脫氧-p-L-5-氟-胞苷(P-L-FddC);2'，3'-二脫氧-0-L-5-疏代胞苷；2'，3'-二脫氧-p-L-5-胞苷(P-L-ddC);9-(1，3-二羥基-2-丙氧基間乙基)鳥嘌呤；2'-脫氧-3'-硫代-5-氟胞嘧啶；3'-氨基_5-曱基-脫氧胞苷(AddMeCyt);2-氨基-l，9-[(2-羥曱基-1-(羥甲基)乙氧基]甲基]-6H-嘌呤-6-酮(丙氧鳥苷)；2-[2-(2-氨基-9H-嘌呤-9基)乙基)-1，3-丙二醇二乙酯(泛昔洛韋)；2-氨基-l，9-二氫-9-[(2-羥基-乙氧基)甲基]6H-嘌呤-6-酮(阿昔洛韋)；9-(4_羥基-3-羥甲基-丁基)鳥嘌呤(噴昔洛韋)；9-(4-羥基-3-羥曱基-丁基)-6—脫氧-鳥嗓呤二乙酯(泛昔洛韋)；3'-疊氮-3'-脫氧胸苷(AZT);-氯-5-甲基-脫氧胞苷(Cl謹(jǐn)eCyt);9-(2-膦酰甲氧乙基-)-2、6'-二氨基嘌呤-2'，3'-二脫氧核苷；9-(2-膦酰甲氧乙基)-腺嘌呤(PMEA);阿昔洛韋三磷酸鹽(ACVTP);D-碳環(huán)-2'-脫氧鳥苷(CdG);二脫氧-胞普；二脫氧-胞嘧啶(ddC);二脫氧-鳥嘌呤(ddG);二脫氧-肌苷(ddl);E-5-(2-溴乙烯基)-2'-脫氧尿苷三磷酸；氟-阿拉伯呋喃糖基-碘尿嘧啶；l"(2'-脫氧-2'-氟-l--p-D-阿拉伯^^喃糖基)-5-碘尿嘧啶(FIAU);司他夫定；9-P-D-阿拉伯呔喃糖基-9H-噤呤-6-胺一水合物(Ara-A);9-P-D-阿拉伯呋喃糖基-9H-嘌呤-6-胺-5'-單磷酸一水合物(Ara-AMP);2-脫氧-3'-硫代-5-氟胞苦；2'，3'-二脫氧-鳥嘌呤；和2\3'-二脫氧-鳥苷。用于制備在本發(fā)明中有用的核苷和核苷酸的合成方法是本領(lǐng)域眾所周知的，如下述參考文獻(xiàn)中公開的ActaBiochimPol，43，25-36(1996);Swed.NucleosidesNucleotides15，361-378(1996);Synthesis12，1465-1479(1995);Carbohyd.Chem.27，242-276(1995);ChenaNucleosidesNucleotides3,421-535(1994);Ann.ReportsinMed.Chena，AcademicPress;和Exp.Opin.Invest.Drugs4,95-115(1995)。上文引用的參考文獻(xiàn)中描述的化學(xué)反應(yīng)一般依據(jù)其最廣泛的應(yīng)用公開以制備本發(fā)明的化合物。偶爾地，反應(yīng)可以不與所述的一樣應(yīng)用于本文公開的化合物的范圍內(nèi)包括的每種化合物。發(fā)生此類情況的化合物將由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地識別。在所有此類情況下，反應(yīng)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)修飾成功地進(jìn)行，例如通過干擾基團的合適保護(hù)，通過改變成備選的常規(guī)試劑，通過反應(yīng)條件的常規(guī)修改相應(yīng);匕合物的制備。i所有制備方法，所有原二料i已知的或可容易地由已知原材料制備。盡管核苷類似物一般用作抗病毒劑，但核苷酸(核苷磷酸鹽)有時必須轉(zhuǎn)變成核苷以便促進(jìn)其跨越細(xì)胞膜的運輸。能夠進(jìn)入細(xì)胞的化學(xué)修飾的核苷酸的例子是S-l-3-羥基-2-膦酰甲氧丙基胞嘧啶(HPMPC，GileadSciences)。本發(fā)明中使用的酸類的核苷和核苷酸化合物可以形成鹽。例子包括與堿金屬或堿土金屬例如鈉、鐘、鉀或鎂的鹽，或與有機堿的鹽或堿性季胺鹽。技術(shù)人員還可以選擇施用細(xì)胞色素P450單加氧酶抑制劑。此類抑制劑可以在增加肝濃度和/或增加受細(xì)胞色素P450抑制的化合物的血液水平方面有用。對于涉及CYP抑制劑的本發(fā)明的實施方案，改善相關(guān)NS3/4A蛋白酶的藥代動力學(xué)的任何CYP抑制劑可以包括在本發(fā)明的組合物中和/或可以在本發(fā)明的方法中使用。這些CYP抑制劑包括但不限于，利托那韋(WO94/14436)、酮康唑、醋竹桃霉素、4-曱基吡唑、環(huán)孢素、氯美噻唑、西咪替丁、伊曲康唑、氟康唑、咪康唑、氟伏沙明、氟西汀、奈法唑酮、舍曲林、茚地那韋、奈非那韋、氨普那韋、呋山那韋、沙奎那韋、洛匹那韋、地拉韋定、紅霉素VX-944和VX-497。優(yōu)選的CYP抑制劑包括利托那韋、酮康唑、醋竹桃霉素、4-甲基吡唑、環(huán)孢素和氯美瘞唑。關(guān)于利托那韋的優(yōu)選劑型，參見美國專利號6,037,157，和其中引用的文件美國專利號5，484，801，美國申請序列號08/402，690，以及國際申請WO95/07696和WO95/09614)。用于測量化合物抑制細(xì)胞色素P50單加氧酶活性的能力的方法是已知的(參見美國專利號6，037，157和Yun等人，DrugMetabolism&Disposition,第21巻，第403-407頁(1993))。在本發(fā)明的組合治療方法中有用的免疫調(diào)節(jié)劑、免疫刺激劑和其他試劑可以以低于本領(lǐng)域常規(guī)的那些的量施用。例如，干擾素ot—般以約lxl(T單位/人每周3次-約10xl(T單位/人每周3次的量施用于人用于治療HCV感染(Simon等人，Hepatology25:445-448(1997))。在本發(fā)明的方法和組合物中，這個劑量可以為約0.lxl(T單位/人每周3次-約7.5xl(T單位/人每周3次；更優(yōu)選地約0.5xl(T單位/人每周3次-約5xl()6單位/人每周3次；最優(yōu)選地約lxl(T單位/人每周3次-約3乂106單位/人每周3次。由于在本發(fā)明的HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑的存在下，免疫調(diào)節(jié)劑、免疫刺激劑或其他抗HCV試劑增強的丙型肝炎病毒抗病毒有效性，可以在本文預(yù)期的治療方法和組合物中使用減少量的這些免疫調(diào)節(jié)劑/免疫刺激劑。類似地，由于在免疫調(diào)節(jié)劑和免疫刺激劑的存在下，HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑增強的丙型肝炎病毒抗病毒有效性，可以在本文預(yù)期的方法和組合物中使用減少量的這些HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑。此類減少的量可以通過常規(guī)監(jiān)控經(jīng)歷治療的受感染患者中的丙型肝炎病毒滴度來測定。這可以通過下述來進(jìn)行，例如通過槽印跡、斑點印跡或RT-PCR技術(shù)監(jiān)控患者的血清中的HCVRNA，或通過測量HCV表面或其他抗原?；颊呖梢栽诮M合治療期間類似地進(jìn)行監(jiān)控，所述組合治療使用本文公開的HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑和具有抗HCV活性的其他化合物，例如核苷和/或核苷酸抗病毒劑，以測定組合使用時各自的最低有效劑量。在本文公開的組合治療的方法中，核苷或核苷酸抗病毒化合物、或其混合物可以以約O.1mg/人/天-約500mg/人/天的量施用于人；優(yōu)選地約10mg/人/天-約300mg/人/天；更優(yōu)選地約25fflg/人/天-約200mg/人/天；更加優(yōu)選地約50mg/人/天-約150mg/人/天；和最優(yōu)選地約1mg/人/天-約50mg/人/天?；衔锏膭┝靠梢砸詥未蝿┝炕虺杀壤膭┝渴┯糜诨颊摺Ｔ诤竺嬉环N情況下，劑量單位組合物可以包含其約數(shù)的此類量以補足日劑量。多重劑量/天也可以增加日總劑量，如果這是開藥物處方的人希望的。用于由本發(fā)明的化合物和/或組合物治療患有HCV感染的患者的方案依照各種因素進(jìn)行選擇，包括患者的年齡、重量、性別、飲食和醫(yī)療條件，感染的嚴(yán)重度，施用途徑，藥理學(xué)考慮如使用的具體化合物的活性、功效、藥代動力學(xué)和毒物學(xué)特征，以及是否使用藥物遞送系統(tǒng)。本文公開的藥物組合的施用一般應(yīng)持續(xù)數(shù)周至數(shù)月或年的時間段，直至病毒滴度達(dá)到可接受的水平，顯示感染已受到控制或被消除。經(jīng)歷用本文公開的藥物組合的治療的患者可以下述進(jìn)行常規(guī)監(jiān)控，通過槽印跡、斑點印跡或RT-PCR技術(shù)測量患者的血清中的肝炎病毒RNA,或通過測量血清中的丙型肝炎病毒抗原如表面抗原，以測定治療的有效性。通過這些方法獲得的數(shù)據(jù)的連續(xù)分析允許在治療期間修改治療方案，使得施用組合中的每種組分的最佳量，和使得同樣可以測定治療的持續(xù)時間。因此，治療方案/給藥時間表可以在治療過程中進(jìn)行理性修改，使得施用共同顯示出滿意的抗丙型肝炎病毒有效性的組合中使用的抗病毒化合物各自的最低量，和使得組合中的此類抗病毒化合物的施用繼續(xù)，只要是成功治療感染所需的。本發(fā)明包含本文公開的HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑與具有抗HCV活性的前述和相似類型化合物的各種組合的使用，以治療或預(yù)防患者中的HCV感染，特別是具有已發(fā)展出針對經(jīng)由VX-950和其他標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶抑制劑治療的抗性的HCV感染的那些患者。例如，一種或多種HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑可以與下述組合使用具有抗HCV活性的一種或多種干擾素或干擾素衍生物；具有抗HCV活性的一種或多種非干擾素化合物；或具有抗HCV活性的一種或多種干擾素或干擾素衍生物和具有抗HCV活性的一種或多種非干擾素化合物。當(dāng)在組合中用于治療或預(yù)防人患者中的HCV感染時，目前公開的HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑和具有抗HCV活性的前述化合物中的任何一種可以以藥學(xué)或抗HCV有效量存在。由于其累加或協(xié)同效應(yīng)，當(dāng)在上文描述的組合中使用時，各自還可以以亞臨床藥學(xué)有效或抗HCV有效量存在，即，與此類HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑和具有抗HCV活性的化合物以藥學(xué)有效量使用時比較，單獨使用時在完全抑制或減少HCV病毒粒子的積聚和/或減少或改善與患者中的HCV感染或發(fā)病機理相關(guān)的病狀或癥狀方面提供減少的藥學(xué)有效性的量。此外，本發(fā)明包含HCV絲氨酸蛋白酶抑制劑和如上所述具有抗HCV活性的化合物的組合治療或預(yù)防HCV感染的用途，由于其累加或協(xié)同效應(yīng)，其中一種或多種這些抑制劑或化合物以藥學(xué)有效量存在，和另一種或多種以亞臨床藥學(xué)有效或抗HCV有效量使用。如本文所使用的，術(shù)語"累加效應(yīng)"描述2種(或多種)藥學(xué)活性劑的組合效應(yīng)，其等于單獨給予的每種試劑的效應(yīng)總和。"協(xié)同效應(yīng)"是其中2種(或多種)藥學(xué)活性劑的組合效應(yīng)大于單獨給予的每種試劑的效應(yīng)總和?；颊叩牟罡纳坪螅匾獣r可以施用本發(fā)明的化合物、組合物或組合的維持劑量。隨后，根據(jù)癥狀可以減少施用劑量或頻率或兩者至在其上保持改善的病狀的水平，當(dāng)癥狀已減輕至所需水平，治療應(yīng)停止。然而，在疾病癥狀的任何復(fù)發(fā)后在長期基礎(chǔ)上患者可能需要間歇療法。用于任何特定患者的具體劑量和治療方案將依賴各種因素，包括使用的具體化合物的活性、年齡、體重、一般健康、性別、飲食、施用時間、排泄率、藥物組合、以及治療醫(yī)師的判斷和待治療的具體疾病的嚴(yán)重度?；钚猿煞值牧窟€將依賴具體描述的化合物以及組合物中的另外抗病毒劑的存在或不存在和性質(zhì)。因此，對于治療處理有用的本申請的試劑可以單獨、在具有合適的藥學(xué)載體的組合物中、或與其他治療劑組合施用。待施用的試劑的有效量可以基于具體情況來確定?？紤]因素通常包括年齡、體重、病狀階段、其他疾病狀況、治療持續(xù)時間和對初始治療的應(yīng)答。一般地，試劑制備為注射劑，作為液體溶液或懸浮液。然而，也可以制備適合于在注射前溶解于或懸浮于液體媒介物中的固體形式。試劑還可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法配制成腸溶片或凝膠膠嚢。本申請的試劑可以以醫(yī)學(xué)上可接受的任何方式施用，所述方式可以依賴試劑特性和/或待治療的疾病狀況或損害?？赡艿氖┯猛緩桨ㄗ⑸?，通過腸胃外途徑例如血管內(nèi)、靜脈內(nèi)、硬膜內(nèi)(intraepidural)或其他，以及口部、鼻、眼、直腸、局部或肺，例如通過吸入、煙霧化或噴霧法。試劑可以直接應(yīng)用于組織表面例如在手術(shù)期間。持續(xù)釋放施用也特別包括在本申請中，通過此類方式如積存注射，經(jīng)皮貼劑或易蝕埋植劑。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明提供了通過給所述患者施用本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的組合物用于治療被病毒感染的患者，或預(yù)防由病毒的感染的方法，所述病毒的特征在于病毒編碼的絲氨酸蛋白酶是該病毒的生命周期所需的。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法用于治療患有HCV感染的患者。此類治療可以完全消除病毒感染或減少其嚴(yán)重性。更優(yōu)選地，患者是人類。術(shù)語"治療"包括預(yù)防性(例如，防止)和/或治療性處理。術(shù)語"預(yù)防性或治療性"處理是領(lǐng)域公認(rèn)的并包括給宿主施用一種或多種主題組合物。如果它在不希望的病狀(例如，宿主動物的疾病或其他不希望的狀態(tài))的臨床表現(xiàn)前施用，那么治療是預(yù)防性的，(即，它使宿主免于發(fā)展不希望的病狀)，而如果它在不希望的病狀表現(xiàn)后施用，那么治療是治療性的，(即，它預(yù)期減少、改善或穩(wěn)定現(xiàn)有的不希望的病狀或其副作用)。在一個備選的實施方案中，本發(fā)明的方法另外包括給所述患者施用抗病毒劑優(yōu)選抗HCV試劑的步驟。此類抗病毒劑包括但不限于，免疫調(diào)節(jié)劑，例如ct-、和y-干擾素，聚乙二醇化衍生的干擾素-oc化合物，和胸腺素；其他抗病毒劑，例如病毒唑和金剛烷胺；丙型肝炎蛋白酶的其他抑制劑(NS2-NS3抑制劑和NS3-NS4A抑制劑)；HCV生命周期中的其他靶的抑制劑，包括解旋酶和聚合酶抑制劑；內(nèi)部核糖體進(jìn)入抑制劑；廣i瞽病毒抑制劑，例如IMPDH抑制劑(例如，美國專利號5，807，876中公開的VX-497和其他IMPDH抑制劑，霉酚酸及其衍生物)；或上述的任何一種的組合。此類另外的試劑可以作為單一劑型的部分施用于所述患者，所述單一劑型包含本發(fā)明的化合物和另外的抗病毒劑。備選地另外的試劑可以作為多重劑型的部分與本發(fā)明的化合物分開施用，其中所述另外的試劑在包含本發(fā)明的化合物的組合物施用之前、一起或之后施用。在另外一個實施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)處理預(yù)期用于給患者施用的生物物質(zhì)的方法，所述方法包括使所述生物物質(zhì)與包含本發(fā)明的化合物的藥學(xué)上可接受的組合物接觸。此類生物物質(zhì)包括但不限于，血液及其組分如血漿、血小板、血細(xì)胞亞群等；器官如腎、肝、心臟、肺等；精子和卵子；骨髓及其組分，以及被輸注到患者內(nèi)的其他流體如鹽水、葡聚糖等。根據(jù)另一個實施方案，本發(fā)明提供了處理可能潛在與病毒接觸的材料的方法，所述病毒的特征在于病毒編碼的絲氨酸蛋白酶是其生命周期所需的。這種方法包括使所述材料與根據(jù)本發(fā)明的化合物接觸的步驟。此類材料包括但不限于，外科器械和衣服；實驗室器械和衣服；采血裝置和材料；和侵入裝置如分流器、支架等。在另一個實施方案中，本發(fā)明的化合物可以用作實驗室工具以幫助分離病毒編碼的絲氨酸蛋白酶。這種方法包括下述步驟提供與固體栽體附著的本發(fā)明的化合物；在引起所述蛋白酶與所述固體栽體結(jié)合的條件下，使所述固體載體與包含病毒絲氨酸蛋白酶的樣品接觸；和從所述固體栽體中洗脫所述絲氨酸蛋白酶。優(yōu)選地，通過這種方法分離的病毒絲氨酸蛋白酶是HCVNS3蛋白酶。更優(yōu)選地，它是如本文所描述的對經(jīng)由VX-905和/或BILN2061的治療有抵抗力的突變型HCVNS3蛋白酶。示例性的此類蛋白質(zhì)包括本文描述的那些，如在SEQIDNO:2的蛋白質(zhì)的位置36、41、43、54、148、155和/或156上具有突變型(即，非野生型)殘基。實施例盡管公開內(nèi)容目前已得到一般描述，但它通過參考下述實施例將更容易理解，所述實施例僅為了舉例說明本公開內(nèi)容的某些方面和實施方案的目的而包括，并且不希望限制公開內(nèi)容?！蹲瘫?患者斧傳和研^:沒^參與關(guān)于VX-950的lb期隨機化、不知情、劑量逐步增加的臨床試驗(研究VX04-950-101)且被基因型1HCV感染的34個患者是本研究的受試者。所有患者為18-65歲，具有至少105IU/mL的基線HCVRNA水平，并且是乙型肝炎病毒(HBV)和HIV陰性的。將患者分成連續(xù)14天接受450(q8h)、750(q8h)或1250(ql2h)mgVX-950的3個組，在每個給藥組中具有2個安慰劑患者。在3個肘間點上從研究患者中收集4毫升(mL)血液樣品給藥前一天(基線樣品)，給藥第14天或治療結(jié)束時(ETR樣品)，和研究藥物的最后一次劑量后7-10天(隨訪樣品)。血液通過前臂靜脈的靜脈穿刺收集到包含EDTA(K2)抗凝劑的管內(nèi)。血漿通過10分鐘離心進(jìn)行分離，冷凍并貯藏于-80。C少于6個月。從這種血漿中分離病毒粒子用于序列分析。其滋辨2^^患者^^的〃CF)V^蛋冷錄^^增和浙^HCV的序列分析通過半巢式逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴增HCVRNA片段來完成，所述HCVRNA片段包含來自血漿病毒的全部534堿基對(bp)NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域。病毒粒子在變性條件下進(jìn)行裂解，并且HCVRNA使用標(biāo)準(zhǔn)的商業(yè)硅膠膜結(jié)合法(QIAampViralRNAMinikit;QUgen，Valencia,CA)進(jìn)行分離。包含NS3絲氨酸蛋白酶區(qū)域的互補DNA(cDNA)片段由病毒RNA進(jìn)行合成，并使用商業(yè)1步逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(SuperscriptIIIRNaseH-ReverseTranscriptasewithHighFidelityPlatinumTaqDNAPolymerase;InvitrogenCorp，Carlsbad,CA)進(jìn)行擴增。NS3的912bp編碼區(qū)使用NS3區(qū)域側(cè)翼的引物(NS3-lb-ls:GGCGTGTGGGGACATCATC;和NS3-lb-3a:GGTGGAGTACGTGATGGGGC)進(jìn)行擴增。對于每種樣品以在lx所有權(quán)的(proprietary)反應(yīng)緩沖液中0.5pM引物(InvitrogenCustomPrimers)、0.2mMdNTPs(InvitrogenCorp)、1.2mMMgS04和34.8單位RNAguard(PorcineRNaseInhibitor,AmershamBiosciences)的終濃度進(jìn)行2輪巢式PCR。對于逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將反應(yīng)混合物于47。C最初溫育30分鐘，隨后為于3分鐘的變性步驟，以及隨后94。C30秒、51°C30秒和68。C45秒的30個循環(huán)。將第一種PCR產(chǎn)物以1:10稀釋并在另一個半巢式反應(yīng)中使用，所述另一個半巢式反應(yīng)4吏用1.25單位AccuPrime尸/iDNA聚合酶、0.5pM引物(NS3-lb-ls和NS3-lb-4a;CATATACGCTCCAAAGCCCA)、0.3mMdNTPs、1mMMgS04和lx反應(yīng)緩沖液。來自外部PCR的DNA產(chǎn)物于94。C變性3分鐘，并且使用30秒、53X:30秒和68"C30秒的30個循環(huán)進(jìn)行擴增。來自這個PCR的DNA隨后在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分離，并且合適大小的產(chǎn)物(830bpM吏用QIAquickGelExtractionKit(Qiagen)進(jìn)行純化。分離的DNA隨后使用ZeroBluntT0P0PCRCloningKit(InvitrogenCorp)進(jìn)行克隆。將克隆平板送至擴增并測序96個克隆/患者/時間點的SeqWright(Houston,TX)。^滋^#/#^^和屑鍵迷^》浙使用軟件MutationalSurveyor(SoftGenetics,StateCollege,PA)就突變比對并分析序列。分析NS3蛋白酶的N末端543個核苷酸U81個氨基酸)。關(guān)于每個患者的共有序列從平均84個基線序列發(fā)展，并且在第14天和隨訪(研究藥物的最后一次劑量后7-10天)時對于每個患者獲得平均81個序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹使用PHYLIP(Felsenstein，J.1993.PHYLIP(PhylogenyInferencePackage)版本3.5c。由作者分布。DepartmentofGenetics,UniversityofWashington,Seattle,WA)Dnadist和QuickTree(http〃www.hcv.lanl.gov/content/hcv-db，2005年6月存取)來制備。#邀#5^蛋冷^蛋^{種衷這和磁^使用對每個HCV變種特異的寡核苷酸由患者分離物的所選質(zhì)?？寺U增編碼HCVNS3蛋白酶的Met'-Ser181的DNA片段。將DNA片段克隆到大腸埃希桿菌(^c力er/c力/flco7/)表達(dá)質(zhì)粒pBEVll內(nèi)，產(chǎn)生181-殘基HCVNS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域，隨后為C末端六組氨酸標(biāo)記。重組6X-His-標(biāo)記的NS3蛋白酶隨后^f吏用如先前公開的(4)遺漏(leaky)表達(dá)法在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。用NS3蛋白酶表達(dá)質(zhì)粒新轉(zhuǎn)化的大腸桿菌BL21(DE3)的5-7個分離的菌落用于接種含有100jag/mL羧爺西林的5mLLB培養(yǎng)基。這些種子培養(yǎng)物于37'C伴隨震蕩(250rpm)進(jìn)行溫育直至達(dá)到OD62Q0.3-1，隨后以~0.010的起始0062。用于接種在250mL埃倫邁爾(Erlenraeyer)燒瓶中包含100jug/niL羧爺西林的50mL4xTY肉湯(32g/L胰蛋白胨，20g/L酵母提取物，5g/LNaCl)。表達(dá)培養(yǎng)物于環(huán)境溫度(~25匸)伴隨在250rpm下的震蕩溫育24小時。細(xì)胞通過在3000xg下離心30分鐘進(jìn)行收集，將團塊快速冷凍于-80。C乙醇浴中并貯藏于-80"C直至蛋白酶被純化。重組蛋白酶使用公開方法(7)的修改從大腸桿菌中進(jìn)行純化。將冷凍的細(xì)胞團塊解凍并重懸浮于6.8mL冷緩沖液A(50mM薩2-羥乙基哌。秦-^-乙磺酸[HEPES,pH8,0];1MNaCl;10%[體積/體積]甘油；5mM咪唑；5mM卩-巰基乙醇；0.1%辛基P-D-吡喃葡萄糖苷[Sigma,SaintLouis,MO];2jig/mL亮抑酶肽[Sigma,SaintLouis,MO];1|ug/mLE-64[Sigma，SaintLouis,MO];2pg/mL胃酶抑素A[Sigma,SaintLouis，MO])中。細(xì)胞通過添加0.8mL10XBugBuster試劑(Novogen/EMDBiosciences,Madison,WI)和8yL1000XBenzonuclease(Novogen/EMDBiosciences,Madison,WI)進(jìn)行裂解，隨后于4C輕微搖動30分鐘。細(xì)胞裂解物在16，00oxg下離心以去除不溶性材料。將每種上清液施加于在一次性聚丙烯柱(Biorad，Hercules,CA)中平衡至緩沖液A的O,"mL柱床體積的TALON金屬親和力樹脂(BDBiosciences,PaloAlto,CA)。裂解物/樹脂漿于4"C搖動30分鐘。將裂解物從柱中排出并且用3-5mL體積的緩沖液A洗滌樹脂。2個等分試樣(各O.25mL)的緩沖液B(50mMHEPES[pH8.0];1MNaCl;25%[體積/體積]甘油；300mM咪唑；5mM巰基乙醇；0.1%辛基0-D-吡喃葡萄糖苷；2jag/mL亮抑酶肽；1iag/mLE-64;2jag/mL胃酶抑素A])用于洗脫與柱結(jié)合的蛋白質(zhì)，合并2個部分，分成小等分試樣并貯藏于-80t:。洗脫蛋白質(zhì)的濃度使用考馬斯蛋白質(zhì)測定法(Biorad，Hercules,CA)根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行測定，使用牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)。蛋白酶的純度使用IDImageAnalysisSoftware(Kodak,Rochester,NY)根據(jù)在變性丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上分開的用Biosafe考馬斯藍(lán)(Biorad,Hercules,CA)染色的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行估計。-施辨JyV57纟減^蛋^雜潛種試^雜炎溯/;t法體外蛋白酶活性如公開的(7)在96孔微量滴定板(CorningNBS3990)中用VX-950和BILN2061蛋白酶抑制劑進(jìn)4亍測定。BILN2061是由BoehringherIngelheim,Laval,Quebec,Canada開發(fā)的HCVNS3.4A蛋白酶抑制劑。簡言之，蛋白酶與5juM輔因子KK4A—起于25。C溫育10分鐘并于30X:溫育10分鐘。添加在DMSO中系列稀釋的蛋白酶抑制劑(VX-950或BILN2061)并于30。C另外溫育15分鐘。反應(yīng)通過添力口5pMRET-S1(AnaspecInc.SanJose，CA)-內(nèi)部猝滅的熒光酯肽底物來起始，并且于30X:進(jìn)行溫育。產(chǎn)物釋放在TecanSpectraFluorPlus平板閱讀儀中監(jiān)控20分鐘(在360nm處激發(fā)和在500nm處發(fā)射)。數(shù)據(jù)用簡單的ICs。等式Y(jié)=V。/(1+(X/IC5。))進(jìn)行擬合。^施辦6WFA5^^^^蛋冷^潛^試蛋^^W1底物動力學(xué)參數(shù)用內(nèi)部猝滅的熒光酯肽底物RET-S1(Ac-DED(EDANS)EEaAbucjJ[COO]ASK(DABCYL)-NH2)(Taliani等人(1996)Anal.Biochem.240(1)，60-67)來測定。蛋白酶在50mM匿ES(pH7.8)、100niMNaCl、20%甘油、5mM二硫蘇糖醇中與5"M輔因子肽KK4A(KKGSVVIVGRIVLSGKXLandro等人(1997)Biochemistry36(31)，9340-9348)—起于25。C預(yù)溫育10分鐘并于30匸預(yù)溫育10分鐘。反應(yīng)通過添力口RET-S1底物(AnaspecIncorporated,SanJose，CA)來起始，并且于30匸溫育IO分鐘。測定總體積為100jliL。反應(yīng)通過添加25juL10%三氟乙酸(TFA)進(jìn)行猝滅。反應(yīng)產(chǎn)物在反相微孔高效液相層析柱(PenomenexJupiter5pC18300A柱，150x2.0mm)上進(jìn)行分離，所述柱加熱至40'C。流速為0.2ml/分鐘，使用H20/0.1%TFA(溶劑A)和乙腈/0.1%TFA(溶劑B)。如下使用線性梯度5%-30%溶劑B經(jīng)過l分鐘，30%-40%溶劑B經(jīng)過15分鐘，隨后40%-100%溶劑B經(jīng)過1分鐘，3分鐘等度，隨后為100%-5%B1分鐘，并且在5%B時平衡10分鐘。DABCYL-肽產(chǎn)物在500nm處進(jìn)行檢測并且一般洗脫約17分鐘。l通過用GraphPrism軟件使數(shù)據(jù)與米-曼氏(Michaelis-Menten)等式擬合來測定。豸滋辨7"6T^,^f^躇潛種誠f謬^掙拉壓一f7W,e"rfKT-，,(一w種艦NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域變體對特拉匹韋的敏感性如先前公開的(Un等人(2004)J.Biol.Chem.279(17),17508-17514)在96孔微量滴定板(CorningNBS3990;Corning,NY)中進(jìn)行測定。簡言之，NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域在50idMHEPES(pH7.8)、100mMNaCl、20%甘油、5mM二硫蘇糖醇中與5|iMKK4A肽一起于25X3預(yù)溫育10分鐘并于30。C預(yù)溫育10分鐘。向蛋白酶混合物中添加在DMSO中系列稀釋的特拉匹韋，并且于30。C另外溫育60分鐘。反應(yīng)通過添加5jaMRET-S1底物來起始，并且于30X:進(jìn)行溫育。產(chǎn)物釋放在TecanSpectraFl雨P(guān)lus平板閱讀儀(TecanUS,Durham,NC)中監(jiān)控20分鐘(在360nm處激發(fā)和在500nm處發(fā)射)。測定總體積為100juL。選擇蛋白酶濃度使得10-20%的底物在測定過程期間周轉(zhuǎn)。為了計算表觀抑制常數(shù)KiUpp,no值，使用GraphPrism軟件使數(shù)據(jù)與用于緊密結(jié)合抑制(38)的莫里森氏(Morrison's)等式的整合形式擬合。穩(wěn)態(tài)測定法顯示野生型酶和所有R155K/T/I/S變體對于RET-S1具有高于檢測極限(IOOyM)的Km。因此，Kj殳定為100juM用于計算Ki(app,^值。抑制劑研究在明顯低于L的底物濃度(5jiM)下進(jìn)行。因此，真實的L和在計算中使用的L之間的偏差在Ki(app,no計算中應(yīng)具有可忽略的影響。關(guān)于每個患者的HCV群體的共有序列衍生自包含HCVcDNA的平均84個獨立的質(zhì)粒克隆。共有序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析指出序列是患者特異性的(圖1)。平均的患者內(nèi)氨基酸準(zhǔn)種復(fù)雜性(香農(nóng)(Shannon)熵)和多樣性(哈明(Hamming)距離)很低(分別為0.332±0.109和0.421±0.195),并且沒有觀察到準(zhǔn)種異質(zhì)性與基線時的HCVRNA血漿濃度的關(guān)聯(lián)?；颊唛g氨基酸多樣性(在這個試驗中與患者的基因型la或lb共有序列比較的個別共有區(qū))對于基因型la是1.3。/。和對于基因型11)是2%。結(jié)構(gòu)模擬分析預(yù)測在亞型內(nèi)的所有患者的共有序列之間觀察到的氨基酸差異將對VX-950結(jié)合具有很少的影響或無影響?；颊咛禺愋缘鞍酌缚寺‰S后進(jìn)行表達(dá)并就經(jīng)由VX-950的抑制進(jìn)行測試。與模擬觀察一致，在衍生自特定亞型內(nèi)的不同患者分離物的這些蛋白酶的酶促ICs。值中沒有顯著差異。然而，關(guān)于基因型lb患者的平均ICs。略微高于關(guān)于基因型la患者(圖2)。這個發(fā)現(xiàn)與先前測量關(guān)于HCV-H(la)和HCVConl(lb)的Ki值(7)的體外結(jié)果一致。la對lb基因型的模擬分析暗示可能影響抑制劑/底物結(jié)合的關(guān)鍵差異在殘基位置132上，而其他差異位于結(jié)合袋外部?；蛐蚻b蛋白酶的Val^側(cè)鏈與VX-950的P3叔丁基-甘氨酸基團僅進(jìn)行1個范德華(vanderWaals)接觸，而基因型la蛋白酶的116132側(cè)鏈進(jìn)行2個接觸。相互作用中的這個結(jié)構(gòu)差異與實驗數(shù)據(jù)一致，所述實驗數(shù)據(jù)顯示與基因型lb蛋白酶比較，VX-950與基因型la蛋白酶的較低酶ICs。。盡管在亞型之間存在輕微差異，但2種亞型仍明顯對VX-950敏感。總之，盡管在HCVNS3絲氨酸蛋白酶中觀察到序列多樣性，基因型1患者預(yù)期對使用蛋白酶抑制劑VX-950的治療響應(yīng)。臨床數(shù)據(jù)支持到這個發(fā)現(xiàn)，因為沒有觀察到對VX-950的病毒應(yīng)答中的顯著差異。《滋辨夕差西型炎^,^^和經(jīng)訪摔品^y^/y為Vi在治療結(jié)束(ETR)時對于每個患者將HCVNS3蛋白酶序列與基線時的共有序列比較，以鑒定潛在的抗性突變。對于每個ETR樣品獲得平均80個序列，并計算在ETR樣品181個位置的每一個上的變異百分比。最初，與基線比較，在任何單個氨基酸位置上5%或更大的頻率的增加視為潛在的抗性突變。使用5%的截斷值是因為基于分析的克隆數(shù)目和PCR的錯誤率，這是我們的測序方案的敏感性的較低水平。在基線的多態(tài)的位點上的改變不視為抗性突變。僅在給藥結(jié)束時存在和在多個患者中觀察到的位點上的改變視為潛在的抗性突變，并且這些隨后在所有患者中進(jìn)行分析。為了分析，基于對VX-950應(yīng)答的病毒載量(血漿HCVRNA水平)將患者分組。在病毒動態(tài)分析中將患者分組成"初始應(yīng)答者"或"持續(xù)應(yīng)答者，，。在病毒序列分析中，基于最初下降后血漿HCVRNA中的增加，將"初始應(yīng)答者"進(jìn)一步分成2個組。從測量的最低HCVRNA水平到給藥結(jié)束時(第14天)具有小于O,75logu增加的患者分類為具有HCVRNA"穩(wěn)定水平，，的患者。在血漿HCVRNA中具有大于0.75logl。增加的那些分類為具有HCVRNA"反彈"的患者。在未處理患者中HCVRNA的正常波動為約0.5log1Q，且這些分組基于抗病毒應(yīng)答以及病毒突變模式。存在關(guān)于其這些分類在2類分析之間不一致的2個患者。對于序列分析患者12308從最低值到給藥結(jié)束時(第14天)具有0.05logn的增加并且分類為"穩(wěn)定水平"，而對于病毒動態(tài)分析U308置于"持續(xù)應(yīng)答者，，組中。患者3112在第11天時具有無法檢測的血漿HCVMA(<10IU/ml)，但在給藥結(jié)束時(第14天)具有35IV/ml可檢測的血漿HCVRNA。對于病毒動態(tài)分析HCVRNA的增加使得該患者置于"初始應(yīng)答者"組中；然而，在序列分析中，HCVRNA水平通過測序測定法仍無法檢測并且該患者因此分到"持續(xù)應(yīng)答者，，組內(nèi)。序列分析將患者分組為無應(yīng)答(安慰劑)；在給藥期間下降隨后反彈(反彈)；在給藥期間下降隨后穩(wěn)定水平(穩(wěn)定水平)；和給藥自始至終持續(xù)下降(持續(xù)應(yīng)答者)(圖3)。此外，在這些組內(nèi)，患者通過劑量組和基因型亞組(la或lb)進(jìn)行分析。最后，在VX-950撤藥后7-10天收集的隨訪樣品中分析突變，以監(jiān)控任何突變的持久性以及從基線變種的任何轉(zhuǎn)變。對于每個隨訪樣品分析平均81個克隆。全序列分析對于28個患者可獲得，和其余6個患者的分析目前在進(jìn)行中。分析對于具有反彈的2個患者，具有穩(wěn)定水平的3個和具有持續(xù)下降的1個正在進(jìn)行的。在安慰劑患者(n=6)的第一個組中，在任何患者的任何位置上沒有從基線的顯著改變?！蹲剔k"在發(fā)^歡所具才^cryw^:詳?shù)?悉者存在最初對VX-950應(yīng)答在HCVRNA中具有大于21og!。下降，但在仍用VX-950給藥的時候最后開始反彈的13個患者。在這13個患者中，6個在450mgq8h劑量組中，1個在750mgq8h劑量組中，和6個在1250mgql2h劑量組中。全序列分析對于這些患者中的11個在第14天時可獲得(表1)。所有這些患者具有在位置36上的突變中的顯著增加。在位置36上，野生型纈氨酸在基因型lb患者中突變成丙氨酸(V36A)(平均值60%，范圍31%-86%)，和在基因型la患者中突變成丙氨酸或曱硫氨酸(V36M)(平均值62%，范圍18%-90%)。V36M在亞型lb中的不存在可能是由于亞型lb中的2核苷酸置換對亞型la中的僅僅單個變化的需要。V36A突變需要亞型la或lb中的單個核苷酸變化。位置36上突變成甘氨酸(V36G)在基因型lb患者中也可見，并且在la患者中突變成亮氨酸(V36L)，但頻率低得多。3個患者還具有在位置54上從蘇氨酸到丙氨酸的突變(T54A)(平均值35%，范圍8%-67%)，和較不頻繁地至絲氨酸(T54S)。有趣的是，在位置36和54上的突變似乎是互相排斥的。此外，這個組中是基因型la的所有患者包含在位置155上從精氨酸到賴氨酸(R155K)或蘇氨酸U155T)的突變(平均值60%，范圍22%-99%),和較不頻繁地至異亮氨酸(R155I)、絲氨酸(R155S)、甲硫氨酸(R155M)或甘氨酸(R155G)。在R155上的這些突變限制于亞型la患者的觀察再次可能是由于lb患者中來自基線的2核苷酸變化對la患者中的單個核苷酸變化的需要。在來自這個組的隨訪樣品中，野生型病毒開始再度出現(xiàn)，但在ETR時可見的所有突變?nèi)源嬖?，盡管處于不同的頻率，可能是由于病毒適合度中的差異。關(guān)于在其上對于每個患者首次觀察到反彈的時間點沒有可用的測序樣品，因此其他突變是否更早出現(xiàn)仍不明了。-滋辦77^發(fā)秀癡河^^Vl定水"fW〃(TiW^Mt^,悉l在下一個組(n-8)中，患者最初對VX-950應(yīng)答，但他們的HCVRNA應(yīng)答穩(wěn)定并且不繼續(xù)下降，盡管沒有看到HCVRNA中的增加。這些患者中的2個在450mgq8h劑量組中，2個在750mgq8h劑量組中，和4個在1250mgql2h劑量組中。分析對于這些患者中的5個在第14天時完成(表1)。所有患者在位置156上發(fā)展出從丙氨酸到纈氨酸(A156V)或蘇氨酸(A156T)的突變，和非常罕見地至絲氨酸(A156S)或異亮氨酸(A156I)。A156V/T突變在這個組的3個患者中以非常高的頻率(100%)看到，并且在這些患者中沒有看到其他突變。其他2個患者(02104和12308)僅分別具有8%的A156T和30%的A156V突變型病毒，但這些患者也具有在其他位置上的突變(關(guān)于患者0210447%的V36A/M和36%的R155K/T;關(guān)于患者1230868。/。的T54A)。來自反彈組的1個患者02102在位置156上也具有類似頻率的突變(11%)。在隨訪時間點上，位置156上的突變幾乎被野生型病毒或在位置36、54和/或155上具有突變的病毒完全替換。在位置156上至絲氨酸的改變(A156S)是VX-950的體外抗性研究(7)期間可見的顯性突變。A156V/T突變在體外研究(7)中也鑒定為對VX-950和BILN2061的交叉抗性。在^秀歡河^才持錄^M^^悉者其余7個患者對VX-950應(yīng)答，在14天給藥期自始至終具有HCVRNA水平的持續(xù)下降。這些患者中的5個在750mgq8h劑量組中，和2個在450mgq8h劑量組中。這些患者在第H天時具有非常低水平的HCVRNA(64IU/mL至無法檢測(<10IU/mL))，和測序數(shù)據(jù)在這個時間點上無法獲得。然而，從關(guān)于這些患者的隨訪樣品中成功擴增HCVcDNA，并且分析對于這7個患者中的6個完成(表l)。到第H天時已達(dá)到無法檢測水平的基因型la患者(03205)在隨訪時間點上具有3個突變V36A/M(67%)、T54A(11%)和R155K/T(26%)。2個基因型lb患者具有V36A(21%和25%)和T54A突變(54%和20%)，和另2個lb患者在隨訪時僅具有低水平的V36A(3%和9%)和T54A(6%和1%)突變。在第14天時具有無法檢測的HCVRNA水平(<10IU/mL)的最后l個lb患者中，在隨訪時沒有檢測到突變。同樣分析了在患者中發(fā)現(xiàn)的雙重突變的頻率。在位置36上的突變與在位置155(36/155雙重突變)和156(36/156雙重突變)上的突變組合發(fā)現(xiàn)。只有基因型la患者具有36/155雙重突變，這在第14天ETR時在反彈組中分析的所有8個la患者(平均值27.6%,范圍10%-77%)和穩(wěn)定水平組中的2個la患者之一(9%)中可見。36/156雙重突變的頻率少得多，并且在第14天ETR時在反彈組的3個患者(3%，范圍1%-5%)和穩(wěn)定水平組的2個患者(1%和4%)中發(fā)現(xiàn)。與ETR樣品比較，雙重突變也在隨訪樣品中對于36/155以類似頻率發(fā)現(xiàn)但對于36/156以較低頻率發(fā)現(xiàn)。對于持續(xù)下降的患者組，只有1個患者具有36/155雙重突變，其以5%出現(xiàn)。單獨或組合發(fā)現(xiàn)的突變頻率顯示于圖4中?？剐阅Ｊ降母爬@示于圖5中，其描述了關(guān)于每個患者組的突變氨基酸的平均百分比。《滋辦〃^型炎^;^^^^^雜炎/G。為、浙因為對平均82個獨立測序克隆實施基因型分析，所以如表1中所示，在每個患者中存在病毒粒子的混合物。在上文序列分析中可見的所有突變林(V36A/M/G、T54A/S、R155K/T/M/G/S和A156T/V/S)的酶ICs。以及在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的這些突變的任何觀察到的組合在至少2個不同的患者特異性遺傳背景中進(jìn)行測定。如實施例6中報告的，關(guān)于基因型內(nèi)的所有患者的基線ICs。類似?？剐缘鞍酌傅拿窱Cs。值報告為與基因型laHCV-H參照林比較的倍數(shù)變化。這種參照林的ICs。在這種酶測定法中發(fā)現(xiàn)為64nM。圖5顯示關(guān)于單重突變林的酶ICs。值和超過參照抹的倍數(shù)變化。在給定位置上對于任何氨基酸變化類似的值在這個圖中集合在方框中。在位置36上的單重突變給予對VX-950的低水平的抗性。V36A/M/L突變顯示出酶ICs。中約1.5-IO倍的增加，與具體的氨基酸變化無關(guān)。在位置54上從蘇氨酸到絲氨酸的置換(T54S)不顯著增加IC5。。然而，T54A突變產(chǎn)生酶ICs。中約10倍的增加。對于從精氨酸到蘇氨酸(R155T)、賴氨酸(R155K)、甲硫氨酸U155M)或絲氨酸(R155S)的變化中的任何一種，在位置155上的置換也給予相當(dāng)?shù)退降目剐?IC5。中約5-15倍的增加)。在位置156上從丙氨酸到纈氨酸(A156V)、蘇氨酸(A156T)或異亮氨酸(A156I)的突變給予高水平的抗性(酶ICso中約400-500倍的增加)。有趣的是，A156S突變對VX-950的抵抗力比在這個位置上的其他氨基酸變化小得多UC5。中僅22倍的增加)，這與體外抗性研究(6，7)—致。圖6顯示關(guān)于雙重突變林的實際酶IC5。值和超過參照抹的倍數(shù)變化。在這些位置上的雙重突變產(chǎn)生比任何單重突變更高水平的抗性。與在位置155或156上的突變組合的在位置36上的突變產(chǎn)生在抗性方面超過分別的單重突變林的另外IO倍的增加。表2列出了關(guān)于針對VX-950以及另一種HCV蛋白酶抑制劑BILN2061測試的所有突變抹的實際ICs。值。在位置36和54上的突變對VX-950的敏感性的影響比BILN2061多得多，而在殘基155上的突變給予對BILN2061高得多水平的抗性。在位置156上的突變以及雙重突變都給予針對2種抑制劑的高水平的抗性。然而，A156S突變林對VX-950更有抵抗力，這已先前在體外(7)顯示。表3顯示了在給定位置上所有突變的酶IC5。的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差值以及超過參照林的倍數(shù)變化?！蹲剔k"^f凈倉悉者W"f坊或^本文進(jìn)行的基因型分析允許詳細(xì)檢查每個患者內(nèi)的不同抗性突變林的相對比例。為了更好地了解由這些病毒混合物給予的表型抗性的水平，進(jìn)行探索性分析以獲得關(guān)于每個患者的平均表型。具有給定單重或雙重突變的病毒粒子的百分比乘以關(guān)于那種給定突變林的酶IC5。中的平均倍數(shù)變化(表3)，隨后將關(guān)于每個患者的所有值相加。相對數(shù)目(值除以100)顯示于表1的最后1列中。關(guān)于反彈組患者的平均值在第14天時為27(范圍6-70)和在隨訪時為15(范圍3-29)。關(guān)于穩(wěn)定水平組患者的平均值在第14天時為272(范圍26-466)和在隨訪時為32(范圍1-126)。持續(xù)下降的最后一組患者在隨訪時具有4的平均值(范圍0-10)。根據(jù)這些非常初步的計算，看起來在所有患者組中的抗性水平在最后一次劑量后(從第14天到隨訪)下降，這并非未預(yù)料到的，因為對于抗性病毒粒子選擇的藥物壓力不再存在。還似乎反彈組患者具有比穩(wěn)定水平的患者更低水平的抗性。使藥4戈動力學(xué)數(shù)據(jù)與抗性模式關(guān)聯(lián)的分析目前在進(jìn)行中?！蹲棠?我遂^^^適合,為、浙除其抗性特征外這些病毒變種的另一個重要方面是適合度水平。計算單重和雙重突變的病毒適合度(表4)。測定在給定時間點上單個患者中的每個HCV變種的感染單位(IU/mL)的絕對數(shù)。例如，在第14天時在患者03201中具有A156V/T突變的變種的感染單位的絕對數(shù)計算為VLd14(A156V/T，3201)(整體，3201)x%A156V/Tdl4(32o"。在給藥結(jié)束(第H天，VLdH(整體，3201))或隨訪(第21天，VLd21(整體，3201))時的總HCVRM取自血漿HCVRNA水平的分析，如通過RocheC0BASTaqmanHCV測定法測定的。HCVRNA無法檢測的水平視為5IU/mL。在給藥結(jié)束(第14天，。/oA156V/TV"3朗)或隨訪(第21天，0/oA156V/Td"(則)時每個單個變種組(例如，A156V/T)的百分比取自上述序列分析(表1)。接下來，測定關(guān)于每個HCV變種的血漿HCV病毒栽量(NVL)的凈增加倍數(shù)和給藥后(第14天-第21天)單個患者的血漿中的HCV的整個群體。例如NVL(A156V/T,3201)(A156V/T，3201)/VLdl"A156V/T，3201)NVL(整體，(整體，3201)(整體，3201)每個HCV變種的NVL對每個患者中的整個血漿HCV群體的那種進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化％NVL(A156V/T，3201)-NVL(A156V/T,3201)/NVL(整體，3201)o隨后將單個患者中每個HCV變種的病毒載量的凈增加的標(biāo)準(zhǔn)化倍數(shù)轉(zhuǎn)化成logu轉(zhuǎn)化值Log10[%NVLU156V/T'3201)]，和測定來自所有患者的關(guān)于變種的平均值。隨后計算HCV突變株的適合度關(guān)于A156V/T突變的適合度=10Log(適合度，A156V/T)o這種相對適合度得分與每個突變林的抗性水平一起進(jìn)行分析。如圖7中所示，與野生型比較，所有突變林較不適合，并且一般而言，使用這種分析，單重突變林的適合度和抗性之間存在反相關(guān)。然而，雙重突變林36/155在抗性中具有顯著增加而對適合度的影響較少。這可能是由于補償適合度喪失的突變的相互作用，同時仍給予抗性。實滋辨〃w"ix^r沐蛋冷雜wx射4'潛^以8.Omg/ml的濃度與NS4A肽輔因子(Kim等人(1996)Cell87(2),343-355)復(fù)合的HCV-H林蛋白酶結(jié)構(gòu)域的純化的R155K變體用于結(jié)晶試驗。蛋白質(zhì)晶體在0.1MMES(pH6.2)、1.4MNaCl、0.3MKH2P04和10mMP-巰基乙醇的儲庫液體上生長。單晶經(jīng)過2天平衡后在懸滴中獲得。將具有O.15x0.l5x0.35mm尺度的單晶轉(zhuǎn)移到含25%甘油的母液的冷凍保護(hù)劑溶液內(nèi)，在氮氣流中沖洗冷卻(flush-cooled)至100K前不久加入。衍射圖傳使用安裝在ALS束線5，01上的CCD4圖像板器械進(jìn)行收集。在2.5-A分辨率時的數(shù)據(jù)使用HKL(2000，HKLIncorporated,Charlottesville,VA)和CCP4軟件編入索引并整合。該晶體屬于空間群R32，具有a-225.31A，b=225.31A,c=75.66A，cx=90.00°，P-90，00°和y=120.00。的晶胞尺度。存在在隨后的精煉中指定用于測試游離R因子的5%數(shù)據(jù)。本文研究的R155K變體的晶體具有與先前公開的野生型蛋白酶NS3-4A的那種(Kim等人，同上)相同的晶體學(xué)晶格。公開的NS3-4A蛋白酶結(jié)構(gòu)域(PDB編碼1A1R)用于進(jìn)行模擬的最初剛體和位置精煉。殘基155的側(cè)鏈中的差異在電子密度圖中證實為Lys而不是Arg。使用QUANTA程序針對電子密度圖視覺檢查蛋白質(zhì)分子。精煉中溶劑分子的進(jìn)一步包括和在20.0-2.5A分辨率范圍處的個別B因子精煉分別使R因子和游離R因子減少至22.0%和24.7%。對于晶體學(xué)獨立分子和2個Zn金屬離子，包括在精煉模擬中的殘基為NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的氨基酸1-181和NS4A輔因子的殘基21-39。根據(jù)先前描述的操作(Lin等人，同上)，使用與NS4A輔因子肽復(fù)合的R155K變體脫輔基酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)，將特拉匹韋模擬到R155K變體NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的活性位點內(nèi)。^t擬特拉匹韋的酮酰胺基以用si面附著與Ser^側(cè)鏈形成共價加合物。對于類似的酮酰胺抑制劑(Perni等人(2004)Bioorg.Med.Chem.Lett.14(6)，1441-1446)和酮酸抑制劑(DiMarco等人(2000)J.Biol.Chem,275(10)，7152-7157.)觀察到這種結(jié)合模式。抑制劑的主鏈與這些酮酰胺和酮酸抑制劑的類似主鏈重疊，使得特拉匹韋主鏈構(gòu)成所有下述主鏈氫鍵PlNH與Lys"5羰基，P3羰基與Ala157NH，P3NH與Ala"'羰基，和P4帽羰基與Cys"9的NH。在這個結(jié)合模型中，特拉匹韋的P2基團置于S2袋中，而沒有去除Lys^側(cè)鏈的任何需要。特拉匹韋的叔丁基和環(huán)己基分別置于S3和S4袋中。該抑制劑在2個階段中使能量最小化。在第一個階段中，對于1000個步驟只允許抑制劑和蛋白酶的Argm、Lys"5和Asp副的側(cè)鏈原子在能量最小化期間移動。在第二個階段中，對于另外1000個步驟允許蛋白酶的所有側(cè)鏈原子連同抑制劑一起移動。這種模擬結(jié)構(gòu)緊密地模仿先前描述的(Lin等人，同上)野生型NS3蛋白酶的活性位點中的特拉匹韋模擬。沒有觀察到Lys"側(cè)鏈或其他活性殘基側(cè)鏈位置的顯著移動。重復(fù)相同操作用于將特拉匹韋對接到NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的R155T變體的活性位點內(nèi)。然而，這種情況下的酶結(jié)構(gòu)不是X射線晶體結(jié)構(gòu)，而是使用R155K變體晶體結(jié)構(gòu)的模型建造。Lys^殘基用Thr側(cè)鏈替換，并且通過使除了Th"側(cè)鏈外的酶的所有原子固定最小化。在這個模型中，Thr"側(cè)鏈的羥基與Asp"的側(cè)鏈形成氫鍵。所有模擬和最小化操作使用QUANTA分子模擬軟件(AccelrysIncorporated,SanDiego,CA)來進(jìn)行。^滋辦"^^:潛果除了關(guān)于本發(fā)明的某些變體的上文討論外，此處呈現(xiàn)來自酶促測定法和結(jié)構(gòu)研究的結(jié)果。1)在NS3蛋白酶的Arg"5上的置換在HCV復(fù)制子細(xì)胞中給予針對特拉匹韋的低水平的抗性為了測定觀察到的HCVNS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的Arg^置換是否足以給予針對特拉匹韋(VX-950)的抗性，將在NS3殘基155(R155K、R155T、R155S、R155I、R155M或R155G)上的幾種置換引入高效率亞基因組復(fù)制子質(zhì)粒(Conl-mADE)內(nèi)。對于這些變種中的每一種產(chǎn)生穩(wěn)定的HCV復(fù)制子細(xì)胞，指出用不同殘基置換NS3Arg"s不取消細(xì)胞中的HCVRNA復(fù)制。野生型HCV復(fù)制子Conl-mADE細(xì)胞中的特拉匹韋的平均48小時I"值為0.485±0.108iuM,這略微高于在基于Conl的HCV復(fù)制子細(xì)胞中使用不同的適應(yīng)性突變組(24-2)(25,41)先前已測定的那種(0.354jaM)。在單獨的特拉匹韋的lb期試驗中觀察到的2種主要的Arg"s變體R155K和R155T對于R155K具有3.59±0.28pM的平均48小時特拉匹韋ICs。值，和對于R155T為9.60±0.87jjM。這分別對應(yīng)7.4或20倍增加，與野生型Conl-mADE復(fù)制子比較(表I)。在包含在Arg"s上的其他4種次要變體的HCV復(fù)制子細(xì)胞中觀察到針對特拉匹韋的敏感性中的類似增加R155S、R155I、R155M或R155G;表1。在特拉匹韋lb期試驗中這4種變體以比R1S5K/T低得多的頻率發(fā)現(xiàn)。關(guān)于這4種變體的復(fù)制子48小時ICs。值為1.97±0.21pM(R155S)、11.7土2.5|uM(R155I)、2.68±0.21pM(R155M)和3.58±0.24juM(R155G)，這分別對應(yīng)4.1、24、5.5和7.4倍增加，喪失對特拉匹韋的敏感性(表I)。這些結(jié)果指出NS3Arg155的置換導(dǎo)致HCV復(fù)制子細(xì)胞中針對特拉匹韋的低水平(<25倍)的抗性，不依賴置換殘基的物理性質(zhì)，這包括正電荷殘基(Lys)、親水性殘基(Thr或Ser)、疏水性殘基(lie或Met)或缺乏側(cè)鏈的殘基(Gly)。表I.HCV復(fù)制子細(xì)胞測定法中抗性的證實<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>穩(wěn)定的野生型(mADE)和變體HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞系使用T7RNA失控(runoff)轉(zhuǎn)錄物由相應(yīng)的高效率Conl復(fù)制子質(zhì)粒產(chǎn)生。在3次獨立實驗中在48小時測定法中測定關(guān)于HCV復(fù)制子細(xì)胞系的特拉匹韋的平均ICs。值和SD。倍數(shù)變化通過將給定變體的ICs。除以野生型HCV復(fù)制子的那種進(jìn)行測定。2)HCVNS3蛋白酶在Arg"上的置換導(dǎo)致酶測定法中針對特拉匹韋減少的敏感性為了證實HCVNS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域中在Arg^上的置換是否足以在酶水平上引起針對特拉匹韋的敏感性的喪失，在NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域(基因組la)中將Arg"替換為Lys、Thr、Ser或Ile，關(guān)于其序列衍生自用特拉匹韋給藥前的患者中的HCV樣品。包含R155K、R155T、R155S或R155I突變的NS3絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并且在測定針對特拉匹韋的酶敏感性前進(jìn)行純化。針對特拉匹韋的抗性通過Ki(app,lh)中的倍數(shù)變化來限定，所述Ki(app,w是在與特拉匹韋一起1小時預(yù)溫育后測量的表觀Ki。關(guān)于與KK4A輔因子肽共復(fù)合的野生型HCV蛋白酶結(jié)構(gòu)域的特拉匹韋敏感性對在Arg"5上具有置換的變體的比較顯示于表n中。針對與KK4A肽復(fù)合的野生型基因型la患者NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的特拉匹韋的平均KiUpp,^值為0.044±0.033pM(表II)。相比之下，特拉匹韋的平均Ki(app,^值對于R155K蛋白酶高約11倍，和對于R155T蛋白酶高9倍(表I1)，在單獨的特拉匹韋lb期試驗中觀察到的2種主要變體。與野生型蛋白酶的那種比較，在特拉匹韋lb期試驗中觀察到的2種次要Argw變體R155S和R155I分別顯示出在K！Upp,110值中22倍和16倍的增加(表II)。這些數(shù)據(jù)指出用不同氨基酸置換Arg155，包括另一種正電荷殘基(Lys)的保守置換，導(dǎo)致針對特拉匹韋減少的敏感性。表II.HCVNS3蛋白酶酶測定法中抗性的證實<table>tableseeoriginaldocumentpage55</column></row><table>在3-5次獨立實驗中使用KK4A輔因子肽和FRET底物測定關(guān)于純化的野生型和關(guān)于4種變體HCVNS3絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的特拉匹韋的平均Ki(app,w值和SD。倍數(shù)變化通過將給定變體的KiUPP,w除以野生型蛋白酶的那種進(jìn)行測定。3)R155KHCVNS3蛋白酶的X射線結(jié)構(gòu)為了了解用另一種殘基包括正電荷氨基酸(Lys)置換Arg"為何導(dǎo)致針對特拉匹韋的敏感性喪失，測定R15SKNS3蛋白酶的X射線晶體結(jié)構(gòu)。將R155K突變改造成T7標(biāo)記融合的HCV-H蛋白酶構(gòu)建體，其先前已用于確定與NS4A輔因子肽共復(fù)合的野生型蛋白酶的結(jié)構(gòu)。分辨率為2.5A的與NS4A輔因子肽共復(fù)合的R155K蛋白酶結(jié)構(gòu)域的總體結(jié)構(gòu)，非常類似于先前描述的野生型HCV-H林蛋白酶復(fù)合物的那種(Kim等人，同上)。筒言之，NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域的l個分子(殘基1-181)和輔因子NS4A的1個分子(殘基21-39)形成球形實體，這依次與不對稱單位中的另一個球形實體形成同二聚體。與NS4A輔因子復(fù)合的Lys'"變體蛋白酶的1個球形單位與野生型Arg"s共復(fù)合物重疊。因為Ccc原子的rms偏差僅為0.314A,所以在這2種蛋白酶的結(jié)構(gòu)中存在很少差異。S2和S4袋中的NS3蛋白酶殘基123、168和155的側(cè)鏈的局部放大圖顯示于圖25(B)中。殘基155側(cè)鏈(Lys"對Arg155)的總體移動很小，如通過殘基155的C5和Asp"的CP之間的距離證明的，催化三聯(lián)殘基之一對于Lys155的4.26A和對于Arg155的4.24A。在R155K蛋白酶中，Lys"s的末端胺(Nz)和Asp"的CP之間的距離為3.5A，和Lys155的C5和Asp81的C0之間的距離為3.6A。在野生型蛋白酶中，Arg"5的NH1和Nz分別遠(yuǎn)離其Asp"的CP5.6A和5.3A。因此，R155K蛋白酶中Lys"s的末端胺基比Argw的相當(dāng)末端疊氮基更接近于Asp81的羧基。相比之下，在R155K蛋白酶中Lys^的Nz和Asp"s的羧基原子0e2之間的距離為5.8A,與野生型蛋白酶中Arg"5的末端NH2和Asp"s的0s2的相應(yīng)對之間的3.2A比較。因此，在R155K蛋白酶中Lys"s的末端胺基比Arg"的相當(dāng)末端疊氮基更進(jìn)一步遠(yuǎn)離Asp"8的羧基。因此，在殘基155上用Lys替換Arg改變S2結(jié)合袋的形狀，使得Lys"的Nz原子上的正電荷不能被Asp"s的鄰近側(cè)鏈中和，如在野生型Argw和Asp"s對的情況下。4)R155K或R155T變體對特拉匹韋的抗性4幾制特拉匹韋和NS3蛋白酶之間的相互作用的結(jié)構(gòu)模型先前已得到描述(例如，Lin等人，同上)。在特拉匹韋與R1WK酶的共復(fù)合物的模型中，相同的相互作用得到維持，除了殘基l55的側(cè)鏈上的差異。在野生型蛋白酶結(jié)構(gòu)中，Arg"側(cè)鏈屈向特拉匹韋的二環(huán)P2基團以進(jìn)行幾個直接的范德華接觸，并提供關(guān)于特拉匹韋的P2基團的疏水環(huán)境(圖26(A))。然而，R1^K的Lys"側(cè)鏈具有擴展的構(gòu)象并且只與P2基團進(jìn)行1個或2個直接接觸，從而使得特拉匹韋的P2基團更暴露于溶劑(圖26(B))。這個觀察與R155K酶對特拉匹韋較不敏感一致，如用體外酶測定法顯示的。假定R155M變體將具有Met"側(cè)鏈的擴展構(gòu)象，并因此類似地與特拉匹韋的P2基團具有較少的相互作用，這是合理的，與在抑制劑的結(jié)合中觀察到的減少一致。為了了解特拉匹韋與在位置155上具有較短側(cè)鏈的殘基的變體的結(jié)合機制，使用與特拉匹韋復(fù)合的R155T變體酶的模型。根據(jù)模型顯而易見的是Thr"5側(cè)鏈太短而不能提供關(guān)于抑制劑的P2基團的疏水性覆蓋(圖26(C))。其他較短的側(cè)鏈如Ile、Ser和Gly是在尺寸方面類似的或甚至更短，并且預(yù)期喪失與P2基團的相互作用并對特拉匹韋具有減少的結(jié)合親和力。5)在NS3蛋白酶的Arg"s上具有置換的HCV變種復(fù)制子保持對IFN-cc非常敏感同樣測定在NS3殘基155上具有置換的特拉匹韋抗性變體復(fù)制子細(xì)胞是否保持對IFN-a或病毒唑的敏感性。如表III中所示，與野生型復(fù)制子細(xì)胞比較，對于包含R155K、R155T或R155M突變的HCV復(fù)制子細(xì)胞，IFN-a或病毒唑的IC5。保持基本上相同。這些結(jié)果暗示與IFN-a包括或不包括病毒唑的組合可以是潛在的治療策略，以抑制在NS3蛋白酶殘基155上具有置換的HCV變種的出現(xiàn)。表III.在HCV復(fù)制子細(xì)胞中缺乏對其他抗HCV試劑的抗性<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>穩(wěn)定的野生型和變體HCV亞基因組復(fù)制子細(xì)胞系使用T7RNA失控轉(zhuǎn)錄物由相應(yīng)的高效率Conl復(fù)制子質(zhì)粒產(chǎn)生。在3次獨立實驗中在48小時測定法中測定關(guān)于HCV復(fù)制子細(xì)胞系的IFN-ct和病毒唑的平均IC5。值和SD。倍數(shù)變化通過將給定變體的ICs。除以野生型HCV復(fù)制子的那種進(jìn)行測定。iT滋,/20^^《潛^婉括一項研究是通過具有基因型1丙型肝炎的受試者中HCV蛋白酶NS3-4A區(qū)域的序列分析，監(jiān)控針對VX-950單一療法的抗藥性突變的可能出現(xiàn)，所述受試者用VX-950給藥14天。通常地，抗性基因分型已通過基于群體的測序來進(jìn)行，這檢測血漿病毒中占優(yōu)勢的序列。構(gòu)成少于20%的病毒群體的任何序列不能通過這種方法進(jìn)行檢測。因為抗藥性突變可能需要超過14天積聚至這種可測量的水平，所以開發(fā)了新方法以檢測變種的較小群體。從約80-85個單個病毒克隆/受試者/時間點獲得序列，使得可以鑒定在用VX-950給藥的14天中可能出現(xiàn)的抗性突變，而敏感性下至約5%的群體。在通過對VX-950的病毒應(yīng)答分組的受試者中，觀察到不同的突變模式。在其HCVRM在給藥期間反彈的第一組受試者中，在ETR和隨訪時野生型病毒幾乎完全由包含在位置36、54或155上的突變的3個病毒變種之一替換。V36A突變在基因型lb受試者中發(fā)現(xiàn)，而V36A/M或R155K/T在基因型la受試者中可見。某些變種還包含在la受試者中的位置36和155上的雙重突變。T54A突變在la和lb亞型中可見。在位置36和54上的突變看起來是互相排斥的，因為它們很少在同一基因組中一起發(fā)現(xiàn)。第二組受試者具有初始的HCVRNA下降，這在14天給藥期結(jié)束時恢復(fù)水平。這些受試者具有包含在位置156上從丙氨酸到纈氨酸(A156V)或蘇氨酸(A156T)的突變的病毒。在位置156上的這種突變先前已顯示在體外在VX-950的存在下發(fā)展(6，7)。某些受試者具有也包含在位置36和156上的雙重突變的少數(shù)變種。受試者特異性蛋白酶克隆進(jìn)行表達(dá)并就經(jīng)由VX-950的抑制進(jìn)行測試。在衍生自亞型內(nèi)的不同患者分離物的基線蛋白酶的酶ICs。值中沒有顯著差異。然而，突變型蛋白酶的IC^值指出對VX-950不同程度減少的敏感性。最后一組受試者中的HCVRNA在給藥期自始至終持續(xù)下降，并且某些達(dá)到低于目前測定法的檢測極限(10IU/mL)的水平。由于我們的測序測定法的敏感性極限(>100IU/mL),在給藥第14天時關(guān)于這些受試者沒有可用的病毒序列數(shù)據(jù)。然而，對于所有患者在VX-950的最后一次劑量后7-10天獲取的樣品成功地進(jìn)行測序。在來自前2個應(yīng)答組的隨訪樣品中，發(fā)現(xiàn)抗性突變在所有受試者的血漿中持續(xù)。然而，在許多情況下，在位置156上的突變頻率明顯減少，因為野生型以及在位置36或54上的突變開始成比例增加。在位置155上具有突變的病毒粒子的比例保持相對不變。突變模型中的這些變化可能是由于在不存在藥物選擇壓力的情況下變種之間的適合度差異?？雌饋碓谖恢?6、54或155上具有突變的病毒，盡管與野生型比較較不適合，但仍適度地適合，而殘基156突變林在不存在藥物的情況下相當(dāng)不適合。根據(jù)這些數(shù)據(jù)，看起來對于不同的單重突變林在抗性水平和適合度之間存在反相關(guān)。衍生自在血漿HCVRNA中具有穩(wěn)定水平的受試者組的數(shù)據(jù)指出病毒抗性和適合度在產(chǎn)生給定臨床應(yīng)答中的影響。因此，臨床應(yīng)答其自身不能指示潛在的病毒學(xué)。在給藥期間具有持續(xù)的HCVRM下降并達(dá)到低水平的HCVRM的最后一組受試者的分析揭示在隨訪時存在的病毒由大部分低水平的在位置36和54上的抗性突變組成，并且3個受試者具有少數(shù)突變但大部分或完全是野生型的。盡管何種變種(若有的話)在第14天時存在是未知的，但這個結(jié)果暗示關(guān)于對VX-950的最佳應(yīng)答，可以避免使用單一療法的臨床抗性或通過添加其他抗病毒化合物如Peg-IFN。優(yōu)化的給藥方案可以使這種應(yīng)答擴展至更多數(shù)目的患者?？傊?，這些結(jié)果指出在這項研究中VX-950的給藥方案可以導(dǎo)致具有不同水平的抗藥性的NS3蛋白酶中不同突變的選擇。增加的VX-950濃度預(yù)期阻止具有低水平抗性的病毒(在位置36、54和1H上)的出現(xiàn)。其余的高水平抗性病毒(在位置156上)可能通過不同治療選擇，包括組合療法被克服。較高的藥物濃度可以更完全地抑制病毒復(fù)制，引起初始下降的較陡的斜度；因此減少了抗性突變將被選擇并引起臨床抗性的機會。向VX-950治療中添加Peg-IFN可以增強病毒的免疫介導(dǎo)的清除，并且免疫介導(dǎo)的清除的有效性應(yīng)不受抗性變種存在的影響。盡管在位置156上的突變給予高水平的抗性，但看起來伴隨顯著的適合度成本發(fā)生，如通過在不存在VX-950的情況下其相對的復(fù)制速率測量的。存在越來越多的證據(jù)，抗病毒抗藥性與受損的病毒適合度相關(guān)，這可以轉(zhuǎn)化為臨床利益(1-3，9)。以如此低水平復(fù)制的抗性病毒可能不立即積聚補償性的適合度突變，允許宿主免疫系統(tǒng)或其他藥物如Peg-IFN清除剩余病毒。參考文獻(xiàn)1.Bre薩r，B.G.，D.Turner,andM.A.Wainberg.2002.HIV-ldrugresistance:canweovercomeExpertOpin.Biol.Ther.2:751-61.2.Buckheit,R.W.，Jr.2004.UnderstandingHIVresistance,fitness,replicationcapacityandcompensation:targetingviralfitnessasatherapeuticstrategy.ExpertOpin.Investig.Drugs13:933-58.3.Gilbert,C,J.Bestman-Smith，andG.Boivin.2002.Resistanceofherpesvirusestoantiviraldrugs:clinicalimpactsandmolecularmechanisms.DrugResist.Updat.5:88—114.4.Grossman,T.H.,E.S.Kawasaki,S.R.Punreddy，andM.S.Osburne.1998.SpontaneouscAMP-dependentderepressionofgeneexpressioninstationaryphaseplaysaroleinrecombinantexpressioninstability.Gene209:95-103.5.Johnson,V.A.，F(xiàn).Brun-Vezinet，B.Clotet，B.Conway，R.T，D'Aquila，L.M.Demeter，D.R.Kuritzkes，D.Pillay，J.M.Schapiro,A.Telenti,andD.D.Richman.2004.UpdateofthedrugresistancemutationsinHIV-l:2004.Top.HIVMed.12:119-24.6.Lin,C,C.A.Gates,B.G.Rao,D.Bre廳n,J.R.Fulghum,Y.-P.L廳g,J.D.Frantz，K.Lin，S.Ma，Y.-Y.Wei,R.B.Perni,andA.D.Kwong.2005.Invitrostudiesofcross-resistancemutationsagainsttwohepatitisCvirusserineproteaseinhibitors,VX-950andBILN2061.J.Biol.Chem.280:Lin,Y.P.Uong，B.Rao,Y.Y.Wei，D.Fulghum,H.M.Hsiao,S.Ma，J.P.Maxwell,B.Perni,C.A.Gates,andA.D.Kwong.2004.36784-36791.7.Lin，C，K.L.Brennan，J.R.K.M.Cottrell，R.InvitroresistancestudiesofhepatitisCvirusserineproteaseinhibitors,VX-950andBILN2061:Structuralanalysisindicatesdifferentresistancemechanisms.J.Biol.Chem.279:17508-17514.8.U，L,，T.J.Pilot-MatUs,K.D.Stewart,J.T.Randolph,R.Pithawalla,W.He,P.P，H畫g，L.L.Klein,H.Mo，andA.Molla.2004.MutationsconferringresistancetoapotenthepatitisCvirusserineproteaseinhibitorinvitro.Antimicrob.AgentsChemother.48:2260-6.9.Maisnier-Patin，S.，andD.I.Andersson.2004.Adaptationtothedeleteriouseffectsofantimicrobialdrugresistancemutationsbycompensatoryevolution.Res.Microbiol.155:360-9.10.Pawlotsky,J.M.，andJ.G.McHutchison.2004.HepatitisC.Developmentofnewdrugsandclinicaltrials:promisesandpitfalls.SummaryofanAASLDhepatitissingletopicconference,Chicago,IL，F(xiàn)ebruary27-March1，2003.Hepatology39:554-67.11.Simmonds，P.2004.GeneticdiversityandevolutionofhepatitisCvirus—15yearson.J.Gen.Virol.85:3173-88.12.Strader，D.B.，T.Wright,D.L.Thomas，andL.B.Seeff.2004.Diagnosis,management,andtreatmentofhepatitisC.Hepatology39:1147-71，13.Trozzi，C，L.Bartholomew,A.Ceccacci，G.Biasiol,L.Pacini,S.Altamura，F(xiàn).Narjes，E.Muraglia，G.Paonessa，U.Koch，R.DeFrancesco,C.Steinkuhler，andG.Migliaccio.2003.InvitroselectionandcharacterizationofhepatitisCvirusserineproteasevariantsresistanttoanactive-sitepeptideinhibitor.J.Virol.77:3669-79.表1.在用VX-MO給藥后發(fā)現(xiàn)的單獨或組合的HCV蛋白酶中的突變<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table>aHCVRNA從最低值到第14天(給藥結(jié)束)的對數(shù)變化?；颊逪O8沒有第l4天的HCVRNA值，并因此使用第11天和第17天的值推斷。bVX-950的第一次劑量后的天數(shù)e基于平均82個克隆的百分比d(在氨基酸位置上的突變％)總和x(關(guān)于所有單重和雙重突變林的氨基酸位置的ICs。中的平均倍數(shù)變化)/100eETR=治療結(jié)束(第14天)fFU=隨訪(ETR后7-10禾)gn/a=未獲得(進(jìn)行中)hnd=無法檢測表2.使用VX-"0和BILN2061的單重和雙重突變體的<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>表3.關(guān)于在相同位置上的不同氨基酸突變的VX-950的平均I"值<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表4.病毒突變抹的適合度<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表5.突變型HCV蛋白酶的抗性概括<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>通過引用合并本文提及的所有出版物和專利通過引用在此整體合并，如同每個單個出版物或?qū)＠貏e并個別指出通過引用合并。盡管本公開內(nèi)容的具體實施方案已得到討論，但上文說明書是舉例說明性的而非限制性的。在檢查本說明書和下文的權(quán)利要求后，公開內(nèi)容的許多變化對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。本公開內(nèi)容的全部范圍應(yīng)通過參考權(quán)利要求連同其等價物的全部范圍，以及說明書連同此類變化來確定。權(quán)利要求1.編碼HCVNS3蛋白酶、其生物活性類似物、或其生物活性片段的分離的HCV多核苷酸，其中對應(yīng)選自下述的密碼子的至少一個密碼子是突變的野生型HCV多核苷酸的密碼子36、41、43、54、148、155和156，使得它編碼與由所述野生型HCV多核苷酸的所述相應(yīng)密碼子編碼的所述氨基酸不同的氨基酸。2.權(quán)利要求1的分離的HCV多核苷酸，其中所述野生型HCV多核苷酸包含SEQIDNO:1的核酸序列或其部分。3.權(quán)利要求1的分離的HCV多核苷酸，其中對應(yīng)所述野生型HCV多核苷酸的密碼子36的所述密碼子不編碼V。4.權(quán)利要求1的分離的HCV多核苷酸，其中對應(yīng)所述野生型HCV多核普酸的密碼子54的所述密碼子不編碼T。5.權(quán)利要求1的分離的HCV多核苷酸，其中對應(yīng)所述野生型HCV多核苷酸的密碼子155的所述密碼子不編碼R。6.權(quán)利要求1的分離的HCV多核苷酸，其中對應(yīng)所述野生型HCV多核苷酸的密碼子156的所述密碼子不編碼A。7.權(quán)利要求1的分離的HCV多核苷酸，其中對應(yīng)選自下述的任何2個密碼子的2個密碼子是突變的野生型HCV多核苷酸的密碼子36、41、43、54、148、155和156，使得任一密碼子編碼與由所述野生型HCV多核苷酸的所述相應(yīng)密碼子編碼的所述氨基酸不同的氨基酸。8.權(quán)利要求1的分離的HCV多核苷酸，其中對應(yīng)選自下述的任何3個密碼子的3個密碼子是突變的野生型HCV多核苷酸的密碼子36、41、43、54、148、155和156，使得3個密碼子各自編碼與由所述野生型HCV多核苷酸的所述相應(yīng)密碼子編碼的所述氨基酸不同的氨基酸。9.權(quán)利要求1的分離的HCV多核苷酸，其中對應(yīng)野生型HCV多核普酸的密碼子36、41、43、54、148、155和156的所述密碼子是突變的，使得所述4個密碼子各自編碼與由所述野生型HCV多核苷酸的所述相應(yīng)密碼子編碼的所述氨基酸不同的氨基酸。10.包含編碼HCVNS3蛋白酶的多核苷酸的分離的HCV變種，其中對應(yīng)選自下述的密碼子的所述多核苷酸的至少一個密碼子是突變的野生型HCV多核苷酸的密碼子36、41、43、54、148、155和156，使得它編碼與由所述野生型HCV多核苷酸的所述相應(yīng)密碼子編碼的所述氨基酸不同的氨基酸。11.分離的HCV蛋白酶，其包含這樣的氨基酸序列，其中在選自下述的至少一個位置上的所述氨基酸不同于所述野生型HCVNS3蛋白酶的每個相應(yīng)位置上的所述氨基酸野生型HCVNS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156。12.權(quán)利要求11的HCV蛋白酶，其中所述野生型HCVNS3蛋白酶包含SEQIDNO:2的氨基酸序列或其部分。13.權(quán)利要求11的HCV蛋白酶，其包含HCVNS3蛋白酶的生物活性類似物。14.權(quán)利要求11的HCV蛋白酶，其包含HCVNS3蛋白酶的生物活性片段。15.權(quán)利要求11的HCV蛋白酶，其包含NS4A輔因子。16.識別HCVNS3蛋白酶的抗HCV蛋白酶抗體，所述HCVNS3蛋白酶包含這樣的氨基酸序列，其中在選自下述的至少一個位置上的所述氨基酸不同于所述野生型HCVNS3蛋白酶的每個相應(yīng)位置上的所述氨基酸野生型HCVNS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156。17.核香酸探針或引物，其能夠在嚴(yán)格條件下與權(quán)利要求1的HCV多核苷酸的核酸序列雜交。18.表達(dá)系統(tǒng)，其包含權(quán)利要求1的HCV多核苷酸。19.權(quán)利要求18的表達(dá)系統(tǒng)，其包含載體，其中所述栽體包含與啟動子可操作地連接的權(quán)利要求1的HCV多核苷酸。20.宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求19的載體轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)。21.權(quán)利要求18的表達(dá)系統(tǒng)，其是mRM展示系統(tǒng)。22.用于評估患者中對HCV感染的蛋白酶抑制劑的抗藥性或敏感性的方法，其包括a)收集來自所述HCV感染的患者的生物樣品；和b)評估所述樣品是否包含編碼HCVNS3蛋白酶的核酸，所述HCVNS3蛋白酶包含這樣的氨基酸序列，其中在選自下述的至少一個位置上的所述氨基酸不同于所述野生型HCVNS3蛋白酶的每個相應(yīng)位置上的所述氨基酸野生型HCVNS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156。23.用于指導(dǎo)關(guān)于患者中的HCV感染治療的方法，其包括a)根據(jù)權(quán)利要求22的方法評估所述患者對蛋白酶抑制劑的抗藥性或敏感性；b)基于a)中評估的所述抗藥性或敏感性優(yōu)化關(guān)于所述患者的所述治療方案。24.用于鑒定用于治療患者中的HCV感染的候選化合物的方法，其包括a)提供由權(quán)利要求10的HCV變種感染的樣品；b)測定所述候選化合物抑制所述樣品中的所述HCV變種的活性的能力。25.權(quán)利要求24的方法，其中所述HCV變種的所述活性是復(fù)制。26.用于鑒定用于治療或預(yù)防患者中的HCV感染的候選化合物的方法，其包括a)提供包含權(quán)利要求1的多核苷酸的復(fù)制子RNA;b)測定所述候選化合物是否抑制a)的所述復(fù)制子RM的復(fù)制。27.用于鑒定用于治療患者中的HCV感染的候選化合物的方法，其包括a)提供權(quán)利要求11的分離的HCVNS3蛋白酶和蛋白酶底物，其中所述蛋白酶和所述底物在基于細(xì)胞的系統(tǒng)或無細(xì)胞系統(tǒng)中；b)使所述HCVNS3蛋白酶與所迷候選化合物在所述底物的存在下c)測定所述HCVNS3蛋白酶活性是否減少。28.用于評估用于治療患者中的HCV感染的候選化合物的方法，其包括a)將包含根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸的栽體和編碼指示物的指示基因引入宿主細(xì)胞內(nèi)；b)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；和c)在所述候選化合物的存在和不存在下測量所迷指示物。29.用于消除或減少生物樣品、或者醫(yī)學(xué)或?qū)嶒炇以O(shè)備的HCV污染的方法，其包括使所述生物樣品、或者所述醫(yī)學(xué)或?qū)嶒炇以O(shè)備與根據(jù)權(quán)利要求24-28中任一項鑒定的化合物接觸的步驟。30.治療患者中的HCV感染的方法，其包括給所述患者施用藥學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求24-28中任一項鑒定的化合物。31.用于鑒定能夠援救VX-950針對HCVNS3蛋白酶的活性的化合物的方法，所述HCVNS3蛋白酶已變得對VX-950有抵抗力，所述方法包括a)使權(quán)利要求1的HCVNS3蛋白酶與候選化合物接觸；b)測定VX-950抑制a)的所述蛋白酶的所述活性的能力。32.治療患者中的HCV感染的方法，其包括給所述患者施用藥學(xué)有效量的根據(jù)權(quán)利要求31鑒定的化合物。33.權(quán)利要求32的方法，其中所述化合物與VX-950組合施用于所述患者。34.權(quán)利要求32的方法，其中所述化合物在所述患者治療中代替VX-950。35.權(quán)利要求34的方法，其中在所述化合物施用于所述患者并且已援救VX-950的所述活性后，將VX-950施用于所述患者。36.用于鑒定在減少HCVNS3蛋白酶活性中有效的化合物的方法，其包括a)獲得權(quán)利要求1的HCVNS3蛋白酶的三維模型；b)設(shè)計或選擇化合物；c)評估所述化合物與a)的所迷蛋白酶結(jié)合或相互作用的能力。37.權(quán)利要求36的方法，其進(jìn)一步包括評估設(shè)計或選擇的化合物在無細(xì)胞或基于細(xì)胞的測定法中抑制HCVNS3蛋白酶活性的能力。38.權(quán)利要求36的方法，其進(jìn)一步包括測定設(shè)計或選擇的化合物抑制受感染細(xì)胞或樣品中的HCV復(fù)制的能力。39.包含用機器可讀數(shù)據(jù)編碼的數(shù)據(jù)存儲材料的機器可讀數(shù)據(jù)存儲媒體，其中所述機器可讀數(shù)據(jù)包含關(guān)于與HCV變種或生物樣品相關(guān)的至少2個特征的指數(shù)值；其中所述特征選自a)顯示對蛋白酶抑制劑減少的敏感性的抗性的能力；b)HCV蛋白酶包含這樣的氨基酸序列，其中在選自下述的至少一個位置上的所述氨基酸不同于所述野生型HCVNS3蛋白酶的每個相應(yīng)位置上的所述氨基酸野生型HCVNS3蛋白酶的36、41、43、54、148、155和156;c)患者的發(fā)病或恢復(fù)潛力；和d)所述HCV變種改變的復(fù)制能力(增加或減少)。40.獲得受HCV感染患者中的HCV變種譜的方法，其包括a)荻得來自所述患者的血漿樣品；b)測定來自所述血漿樣品的至少2個HCV病毒粒子的HCV蛋白酶的所述核苷酸序列。41.權(quán)利要求40的方法，其中鑒定至少20個HCV病毒粒子。42.權(quán)利要求40的方法，其中鑒定至少50個HCV病毒粒子。43.權(quán)利要求40的方法，其中鑒定至少IOO個HCV病毒粒子。44.權(quán)利要求40的方法，其中鑒定至少200個HCV病毒粒子。45.權(quán)利要求40的方法，其中鑒定至少500個HCV病毒粒子。46.權(quán)利要求40的方法，其中HCV蛋白酶的所述核苷酸序列包含權(quán)利要求1的多核苷酸的序列。47.權(quán)利要求40的方法，其中所述患者已用蛋白酶抑制劑進(jìn)行治療。48.權(quán)利要求40的方法，其中在至少2個不同時間點上獲得來自所迷患者的至少2個血漿樣品。49.用于檢測生物樣品中的HCV變種存在的方法，其包括檢測所述生物樣品中根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸的存在。50.診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求16的抗體。51.診斷試劑盒，其包含權(quán)利要求17的核苷酸探針或引物。全文摘要本發(fā)明涉及HCV變種，特別是對蛋白酶抑制劑例如VX-950有抵抗力的變種。還提供了涉及HCV變種的方法和組合物。進(jìn)一步提供了分離、鑒定和表征來自患者的多重病毒變種的方法。文檔編號C07K14/18GK101405295SQ200680050843公開日2009年4月8日申請日期2006年11月13日優(yōu)先權(quán)日2005年11月11日發(fā)明者A·夸恩格,C·薩拉茲恩,T·凱菲爾,超林申請人:沃泰克斯藥物股份有限公司