專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于抑制細(xì)胞凋亡的化合物的制作方法用于抑制細(xì)胞凋亡的化合物本發(fā)明涉及起細(xì)胞凋亡抑制劑作用的化合物，以及它們的制備方法和含有它們的藥物組合物和其在醫(yī)學(xué)中的用途。
背景技術(shù)：
：因細(xì)胞凋亡在多種生物系統(tǒng)包括正常細(xì)胞更新、免疫系統(tǒng)和胚胎發(fā)育中的重^f乍用和其與不同疾病有聯(lián)系，其為令人感興趣的生物學(xué)過(guò)程。不適當(dāng)?shù)募?xì)月包凋亡涉及4艮多人類(lèi)病理學(xué)，包括神經(jīng)變性性疾病，例如阿爾茨海默病和亨廷頓舞蹈病、局部缺血、自身免疫性疾病和多種癌癥(ReedJ.C.,TrendsMol.Med.2001,7:314-319)。多種凋亡刺激物，包括細(xì)胞表面死亡受體的激活、抗癌藥物、輻射、缺乏存活因子和局部缺血(在StrasserA.等，Annu.Rev.Biochem.2000,69:217-245中綜述)，誘導(dǎo)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大，它們都激活被稱(chēng)作胱天蛋白酶的半胱氨酰天冬氨酸蛋白酶家族。這些蛋白酶執(zhí)行凋亡過(guò)程。某些凋亡信號(hào)激活用胱天蛋白酶-9作為其起始子的線粒體介導(dǎo)的途徑或固有的途徑。稱(chēng)作凋亡體的大分子復(fù)合物的形成是該途徑的關(guān)鍵事件。凋亡體是全酶多蛋白復(fù)合物，其由細(xì)胞色素c激活的Apaf-l(凋亡蛋白酶的激活因子)、dATP和胱天蛋白酶原-9(LiP.等，Celll997，91:479-489;AcehanD等，Mol.Cell2002,9:423-432;RodriguezJ.等，GenesDev.1999,13:3179-3184;SrinivasulaS.M.等，Mol.Cell1998,1:949-957)形成。在該大分子復(fù)合物中，與胱天蛋白酶-9相關(guān)的凋亡體被激活，然后繼而激活效應(yīng)物胱天蛋白酶。為了鑒別能改善與疾病相關(guān)的細(xì)胞凋亡的分子，藥物研發(fā)的最初目標(biāo)為胱天蛋白酶的活性，并由此尋找特異性酶激活劑或4卬制劑(ScottC.W.等，J.Pharmacol.Exp.Ther.2003,304:433-440;Garda-CalvoM,J.Biol.Chem.1998,273:32608-32613)，而不是上游激活級(jí)聯(lián)/途徑中的調(diào)節(jié)子。然而，胱天蛋白酶活化上游蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用也是干涉細(xì)胞凋亡途徑調(diào)節(jié)子發(fā)展的相關(guān)點(diǎn)。具體而言，最近的資料提議，將凋亡體的形成作為凋亡調(diào)節(jié)子進(jìn)展的感興趣的目標(biāo)。因此，存在發(fā)現(xiàn)抑制凋亡體介導(dǎo)的激活細(xì)胞凋亡的分子的重要性。發(fā)明說(shuō)明本發(fā)明的一方面涉及提供通式I的新化合物、其立體異構(gòu)體和其混合物、其多晶型和其混合物和其藥學(xué)上可接受的溶劑化物和加成鹽，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>其中Rl代表(d-Cs)烷基、(C2-Cs)烯基、-(CH^w-NHCO-Cd-C^^基、誦(CH2)w-CONRaRb、-(CH2)0—3-(3-6)Cy、-(CH2V3-(5-6)Hetey、-(CH^—3-苯基、國(guó)(CH2V3畫(huà)(1國(guó)萘基)、-(0^)^(2-萘基)、-(CH^.rp-KOHetar、-(CH2)2-CH(苯基)2、-(012)2國(guó)。映苯基)[(5畫(huà)6)Hetar]或-(CH2)2-CH[(5國(guó)6)Hetar]2;R2代表-(CH2V3-(3-6)Cy、-(CH2)。.3-(5-6)Hetcy、-(CH^.r苯基、-(CH^-Hl-萘基)、-(CH2:h.3-(2-萘基)、-(CH2)M-(5-10)Hetar、-(012)2-(:11(苯基)2、-((3壓)2-0^(苯基)[(5-6)1^31]或-(CH2)2-CH[(5隱6)Hetar]2;R3代表-(CH2)w-苯基、-(012)1.3-(1-萘基)、-(0112)1.3-(2-萘基)或-(CH2)w國(guó)(5畫(huà)6)Hetar;(C廣C5)烷基和-(C2-Cs)烯基可任選被一個(gè)或多個(gè)選自以下的取代基取代-0-((^-(^2)烷基、-3-((>(^2)烷基、-NH2、-麗-((31-(:2)烷基和-N[(d國(guó)C2)烷基]2;(C廣C3)烷基可任選被一個(gè)或多個(gè)卣素原子取代；Ra和Rb獨(dú)立代表-H或-(d-C3)烷基；(3-6)Cy代表3-6元的部分不飽和或飽和,灰環(huán)基團(tuán)；(5-6)Hetcy代表C-或N-基團(tuán)的5或6元環(huán)，其為含有一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立選自O(shè)、S和N的雜原子的部分不飽和或飽和碳環(huán)；Cy和Hetcy可任選被一個(gè)或多個(gè)選自卣素、-CF3和-OH的取代基取代；(5國(guó)6)Hetar和(5-10)Hetar分別代表C-或N-基團(tuán)的芳族5元或6元和5-10元環(huán)；其^sfl-4個(gè)獨(dú)立選自O(shè)、S和N的雜原子；苯基、l-萘基、2-萘基、(5-6)Hetar和(5-10)Hetar可任選被一個(gè)或多個(gè)選自以下的取代基取代鹵素、-CF3、-OH、-0-((^<:3)烷基、國(guó)CO-(C廣C3)烷基、隱(d國(guó)Cs)烷基-NRaRb、畫(huà)NRaRb和國(guó)S02NH2;附帶條件為R2不代表2-(4-氟苯基)乙基。本發(fā)明另一方面涉及一種化合物，所述化合物為包含與聚谷氨酸聚合物結(jié)合的式II基團(tuán)、其立體異構(gòu)體和其混合物和其藥學(xué)上可接受的溶劑化物和加成鹽的藥物結(jié)合物，II其中Rl、R2和R3具有如式I的化合物所定義的含義，但對(duì)R2沒(méi)有附帶條件；每一R4獨(dú)立代表得自20種天然存在的氨基酸的任一種的側(cè)鏈，n為0、1、2或3。因此，式II化合物包含不同部分與n個(gè)L-氨基酸的肽鏈形成酰胺鍵的式I基團(tuán)，和酰胺型L-賴(lài)氨酸衍生物，其中其側(cè)鏈上的N與聚谷氨酸聚合物連接。在前述定義中，術(shù)語(yǔ)(d-C3)烷基和(CrC5)烷基分別代表含有1-3個(gè)和1_5個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和烴鏈。(C廣C3)烷基的實(shí)例包括但不限于甲基、乙基、丙基、異丙基。(d-C5)烷基的實(shí)例另外包括但不限于丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、l-戊基、l-曱基丁基、2-曱基丁基、3-甲基丁基、1,1-二曱基丙基、1,2-二甲基丙基和2，2-二曱基丙基。術(shù)語(yǔ)(C2-C5)烯基代表含有2-5個(gè)碳原子和一個(gè)或多個(gè)雙4t的不飽和直鏈或支鏈烴鏈，例如乙烯基、l-丙烯基、2-丙烯基、l-丁烯基、2-丁烯基、3-丁烯基和1,3-丁二烯基、l-戊烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、4-戊烯基、l-曱基-2-丁歸基、2-甲基-3-丁烯基、3-曱基-l-丁烯基、1,l-二甲基-2-丙烯基和1,2-二甲基-1-丙烯基。按照本說(shuō)明書(shū)，只要從化學(xué)觀點(diǎn)看適合,基團(tuán)(C廣C3)烷基、(C-C5)烷基和(C2-Cs)烯基可任選被取代。術(shù)語(yǔ)(3-6)Cy代表3-6元的部分不飽和或飽和碳環(huán)基團(tuán)。如上所述，其可任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代，可將取代基置于該環(huán)的任何可用的位置。(3-6)Cy的實(shí)例包括但不限于如下基團(tuán)環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、環(huán)戊烷、環(huán)己烷、l-環(huán)丁烯、2-環(huán)丁烯、l-環(huán)戊烯、2-環(huán)戊烯、l-環(huán)己烯、2-環(huán)己烯和3-環(huán)己烯。術(shù)語(yǔ)(5-6)Hetcy代表含有1個(gè)或2個(gè)獨(dú)立選自O(shè)、S和N的雜原子的部分不飽和或飽和C-或N-基團(tuán)的5-6元碳環(huán)，其可按照本說(shuō)明書(shū)在環(huán)上任何可用的位置被取代。(5-6)Hetcy的實(shí)例包括但不限于以下基團(tuán)二氫呋喃、吡咯啉、吡唑啉、咪唑啉、異噻唑烷、異嗨唑烷、嗨唑烷、吡唑烷、p比p各烷、p塞唑烷、二螺烷、嗎啉、艱溱、哌咬、吡喃、四氫吡喃、嗯。秦、嗯哇淋、p比p各啉、p塞哇啉、p比哇，林、。米哇啉、異嗯唑啉和異噻唑啉。術(shù)語(yǔ)(5-6)Hetar和(5-10)Hetar分別代表C-或N-基團(tuán)的芳族5元或6元和5-10元環(huán)；其含有l(wèi)-4個(gè)獨(dú)立選自O(shè)、S和N的雜原子，其可按照本說(shuō)明書(shū)在環(huán)上任何可用的位置被取代。(5-6)Hetar的實(shí)例包括但不限于以下基團(tuán)吡咯、呋喃、p塞吩(tiophene)、咪唑、異瞎唑、異漆唑、喊唑、1，2，4-嗨二唑、1,2,4-噻二唑、1,3，4-嗨二唑、1,3,4-噻二唑、1,2,3-三唑、1,2,4-三唑、吡啶、嘧啶、p達(dá)喚和吡溱。(5-10)Hetar的實(shí)例還包括但不限于以下基團(tuán)苯并咪唑、苯并呋喃、苯并噻唑、苯并蓬吩、咪P坐并P比噢、咪哇并P達(dá)n泰、咪峻并P比咬、咪峻并嘧咬、P引峻、。引咮、異p引咪、異會(huì)啉、吡唑并吡,、吡唑并吡啶、p比哇并嘧咬、噪呤、壹哇p林、會(huì)啉和奮逢啉。表述"任選被一個(gè)或多個(gè)取代基取代"意即基團(tuán)可不被取代，或被一個(gè)或多個(gè)、優(yōu)選被l、2、3或4個(gè)取代基取代，附帶條件為該基團(tuán)具有l(wèi)、2、3或4個(gè)易于被取代的位置。在整個(gè)本說(shuō)明書(shū)和附加權(quán)利要求中的措辭"包含"和該措辭的變體例如"包括，，并非意欲排除其他添加劑、成分、元素或步驟。本文所用術(shù)語(yǔ)"治療"包括這樣的病癥的治療、預(yù)防和控制。本文所用術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的"，是指在合理醫(yī)療判斷范圍內(nèi)適于與人類(lèi)和動(dòng)物的組織接觸、沒(méi)有過(guò)多的毒性、刺激、變態(tài)反應(yīng)或其他問(wèn)題或并發(fā)癥、且具有相稱(chēng)的合理利益/風(fēng)險(xiǎn)比率的那些化合物、組合物和/或劑型。在本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案中，Rl代表(C廣Cs)烷基、-(CH2).3-CONRaRb、-(CH2)o_r(3-6)Cy;-(CH2)o-3-(5-6)Hetcy;誦(CH2)L3-(5-10)Hetar、《CH2:h.3-苯基、-(012)1.3畫(huà)(1-萘基)或-((:12)1_3-(2-萘基)，它們中的所有都任選4支取代。在本發(fā)明的一個(gè)特別的實(shí)施方案中，Rl代表-(CH2)o-3-(5-6)Hetcy、-(CH2)L3-(5-10)Hetar、-(CH^—3-苯基、國(guó)(CH2)L3-(l-萘基)或-(CH2)L3-(2誦萘基)，它們中的所有都任選凈皮取代。在另一實(shí)施方案中，R1代表任選被一個(gè)或多個(gè)選自卣素的取代基取代的-(CH2)2-苯基。在另一實(shí)施方案中，Rl代表2，4-二氯苯基。在另一實(shí)施方案中，R2代表任選被取代的-(CH2)w-芳基或任選被取代的-(CH2)2-CH(Ph)2，附帶條件為R2不代表2-(4-氟苯基)乙基-。在另一實(shí)施方案中，R2代表3,3-二苯基丙基，附帶條件為R2不代表2-(4-氟苯基)乙基-。在另一實(shí)施方案中，R3代表任選被取代的-(CH2)w-(5-6)Hetar或任選被取代的-(CH2)2-苯基。在另一實(shí)施方案中，R3代表任選被一個(gè)或多個(gè)選自囟素的取代基取代的-(CH2)2-苯基。在另一實(shí)施方案中，R3代表2，4-二氯苯基。在另一實(shí)施方案中，R2代表3,3-二苯基丙基，Rl和R3二者都代表2,4-二氯苯基。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及一種為藥物結(jié)合物的化合物，所述藥物結(jié)合物包含如前所述的與聚谷氨酸聚合物結(jié)合的式II化合物，其中所述聚合物具有20-60kDa的分子量。本發(fā)明另一實(shí)施方案涉及為聚合物-藥物結(jié)合物的式III化合物，m其中Rl、R2、R3和R4具有在通式II中所述含義，y與x的比例按重量算為25-30%到75-70%。在另一實(shí)施方案中，式ni化合物中的n代表0。在另一實(shí)施方案中，n代表2，R4代表甘氨酸側(cè)鏈。在另一實(shí)施方案中，n代表3，R4代表甘氨酸側(cè)鏈、精氨酸側(cè)鏈和苯丙氨酸側(cè)鏈。在另一實(shí)施方案中，n代表3，R4代表纈氨酸側(cè)鏈、精氨酸側(cè)鏈和苯丙氨酸側(cè)鏈。在所述藥物結(jié)合物聚合物中，聚谷氨酸可為聚(L-谷氨酸)、聚(D-谷氨酸)或聚(DL-谷氨酸)。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，聚谷氨酸為聚(L國(guó)谷氨酸)。此外，上述實(shí)施方案的所有可能組合也形成本發(fā)明的一部分。式I的化合物包含至少一個(gè)手性中心。本發(fā)明包括式I的化合物的外消旋化合物和對(duì)映體，對(duì)映體即其中連接到Rl的手性碳的構(gòu)象為(》的化合物和其中連接到Rl的手性碳的構(gòu)象為(i)的化合物，其如下所示。式II化合物包含至少兩個(gè)手性中心。本發(fā)明還包括式II的立體異構(gòu)體混合物和分離的立體異構(gòu)體二者。本發(fā)明化合物可含有一個(gè)或多個(gè)堿性氮原子，因此，它們可與酸形成鹽，這也構(gòu)成了本發(fā)明的一部分。其中藥學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例包括無(wú)機(jī)酸的加成鹽，無(wú)機(jī)酸例如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硝酸、高氯酸、硫酸和磷酸，以及有機(jī)酸的加成鹽，有機(jī)酸例如乙酸、甲^黃酸、三氟甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對(duì)甲苯磺酸、苯甲酸、樟腦磺酸、扁桃酸、草酸、琥珀酸、反丁烯二酸、酒石酸和馬來(lái)酸。同樣地，本發(fā)明化合物可含有一個(gè)或多個(gè)酸性質(zhì)子，因此，它們可與堿形成鹽，這也構(gòu)成本發(fā)明的一部分，這些鹽的實(shí)例包括與金屬陽(yáng)離子的鹽，金屬陽(yáng)離子例如堿金屬離子、堿土金屬離子或鋁離子；或者，其可與有機(jī)石威或無(wú)機(jī)堿配位。其中可接受的有機(jī)堿包括二乙胺和三乙胺?？山邮艿臒o(wú)機(jī)堿包括氬氧化鋁、氫氧化鈣、氫氧化鉀、碳酸鈉和氫氧化鈉。根據(jù)帶電荷的官能團(tuán)的數(shù)目和陽(yáng)離子和陰離子的化合價(jià)可有不止一個(gè)陽(yáng)離子或陰離子。源自藥學(xué)上可接受的有機(jī)無(wú)毒堿的鹽包括如下堿的鹽伯胺、仲胺和叔胺、包括天然存在的取代的胺在內(nèi)的取代的胺、環(huán)胺和堿性離子交換樹(shù)脂，例如精氨酸、甜菜堿、咖啡堿、膽堿、A^V-二千基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、AL乙基嗎啉、乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡糖、組氨酸、海巴明、異丙胺、賴(lài)氨酸、甲基葡糖胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、聚胺樹(shù)脂、普魯卡因、嘌呤、可可堿、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨基丁三醇等?？墒褂玫柠}的類(lèi)型沒(méi)有限制，只要當(dāng)將它們用于治療目的時(shí)是藥學(xué)上可接受的鹽即可。通過(guò)常規(guī)化學(xué)方法從含有堿性或酸性部分的母體化合物可合成鹽。一般而言，通過(guò)使這些化合物的游離酸或堿形式與存于水或有機(jī)溶劑(例如醚、乙酸乙酯、乙醇、異丙醇或乙腈或)或二者的混合物中的化學(xué)計(jì)量量的合適堿或酸反應(yīng)，可制備這樣的鹽。式I或式III化合物和他們的鹽在某些物理性質(zhì)上不同，但它們對(duì)于本發(fā)明目的是等價(jià)物。例如水合物存在。本發(fā)明包括具有藥物活性的所有上述這樣的形式。某些通式I的化合物可表現(xiàn)多晶現(xiàn)象，其包括本發(fā)明所有可能的多晶型和其混合物。通過(guò)在不同條件下結(jié)晶，或通過(guò)加熱或熔融化合物接著逐步或快速冷卻，可制備各種多晶型。通過(guò)固態(tài)NMR波譜學(xué)、IR光譜學(xué)、差示掃描量熱法、粉末X射線衍射或其他這樣的技術(shù)，可測(cè)定多晶型的存在。本發(fā)明式I的化合物包含至少一個(gè)手性中心。此外，它們可具有另外的手性中心。本發(fā)明包括可能立體異構(gòu)體中的每一個(gè)和其混合物，尤其是其外消旋混合物。通過(guò)任何常用方法，例如通過(guò)在固定手性相上色譜分離外消旋混合物，通過(guò)非對(duì)映異構(gòu)體鹽的分級(jí)結(jié)晶技術(shù)來(lái)拆分外消旋混合物、通過(guò)手性合成、通過(guò)酶拆分或通過(guò)生物轉(zhuǎn)化，可制備單個(gè)對(duì)映體?？蓪?duì)任何手性合成中間體或?qū)νㄊ絀產(chǎn)物實(shí)施該拆分?；蛘?，通過(guò)用旋光純?cè)g(shù)斗或已知構(gòu)象的試劑對(duì)映選擇性合成，可得到通式I的化合物的任何^于映體。式I或式III化合物可以多種非對(duì)映異構(gòu)體存在，可通過(guò)常規(guī)技術(shù)例如色譜或分級(jí)結(jié)晶來(lái)分離。某些本發(fā)明化合物可存在順式/反式異構(gòu)體。本發(fā)明包括各個(gè)幾何異構(gòu)體和其混合物。本發(fā)明包括所有異構(gòu)體和其混合物(例如外消旋混合物)，無(wú)論其是通過(guò)合成還是通過(guò)將其物理混合得到。本發(fā)明涉及用于制備上述新化合物、其衍生物、其類(lèi)似物、其互變體形式、其立體異構(gòu)體、其多晶型或其藥學(xué)上可接受的鹽和溶劑化物的方法。用下述方法以及通過(guò)有機(jī)合成領(lǐng)域已知的其他方法可合成本發(fā)明化合物。優(yōu)選的方法包括但不限于在所附流程中所示的通用方法。除非另外指出，否則基團(tuán)R1、R2、R3、R4、n、x和y具有通式I、II和III中所述的含義。用以下方法可得到式I的化合物方法A<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>根據(jù)方法A，在藥基曱氧羰基去保護(hù)后，用?；瘎￢酰化固體支持體胺IV,其中X代表離去基團(tuán)，例如面素，Y代表-OH或鹵素。當(dāng)Y代表卣素(例如為氯乙酰氯)時(shí)，可在叔石咸例如三乙胺存在下進(jìn)行反應(yīng)。當(dāng)Y代表-OH(例如為溴乙酸)時(shí)，可在合適的偶聯(lián)劑例如二異丙基碳二亞胺存在下進(jìn)行反應(yīng)。在這兩種情況中，反應(yīng)都可在能夠恰當(dāng)溶脹樹(shù)脂的惰性溶劑(例如iV,W'-二曱基甲酰胺或二氯曱烷)中和室溫下或用微波照射實(shí)施，這些條件可縮短反應(yīng)時(shí)間。然后，用叔胺作為^5成來(lái)偶聯(lián)胺VIa。通過(guò)加熱例如在60。C或通過(guò)微波照射可實(shí)施反應(yīng)。用偶聯(lián)劑例如W-二異丙基碳二亞胺和1-羥基苯并三唑組合，使羧酸viii(其中PG代表保護(hù)基團(tuán)例如烯丙基)與胺vn反應(yīng)以產(chǎn)生酰胺ix。接下來(lái)，用堿和溶劑例如iV,Ar-二甲基甲酰胺或二曱亞砜通過(guò)Michael反應(yīng)引入胺VIb,以得到中間體X。在用與中間體VII所述相同的方法重復(fù)酰化和胺化后，得到XI。用在作為溶劑的二氯甲烷中的PhSiH3和Pd(PPh3)4(TetrahedronLett1999,40:2505-2508;"酰胺偶合2)樹(shù)脂解離TetrahedronLett1997,38:7275-7278)或用在二嗯烷中的KOH水溶液實(shí)施去保護(hù)，得到xn。采用用于固相肽鍵合程序的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)試劑(例如六氟磷酸苯并三唑-i-基氧基-三-(吡咯烷-i-基)轔和i-羥基苯并三唑的組合)通過(guò)酰胺形成來(lái)促使環(huán)化，該反應(yīng)在叔石威例如A^iV-二異丙基乙胺存在下實(shí)施。可用三氟乙酸、二氯甲烷和水的混合物從樹(shù)脂釋放最終化合物i。得到式I的化合物的可供選擇的策略涉及分別用式XHIa和XIIIb的氨基酸使胺IV和X?；?方法B)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>VIIX<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>IXI方法B本領(lǐng)域技術(shù)人員將很明白，為得到式I的化合物，可能要將方法A的某些步驟和方法B的某些步驟結(jié)合。起始伯胺VIa、VIb和VIc可市購(gòu)，或可通過(guò)已知方法(March,AdvancedOrganicChemistry,1991,JohnWiley&Sons編)或用例如以下所示流程得到。流程1<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>在例如在作為溶劑的四氫呋喃中的偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)和三苯基膦存在下，通過(guò)首先由醇和鄰苯二曱酰亞胺鉀的Mitsunobu反應(yīng)并進(jìn)一步用水合肼解離，可得到胺(Mitsunobu,爿w.C/jew.Soc.1972,9《679-680)。通過(guò)以下所示的各種方法可合成A^取代的甘氨酸XHIa和XIIIb，所述方法或者通過(guò)用還原劑例如NaBH4、NaBH3CN或NaBH(AcO)3用合適的醛使相應(yīng)的甘氨酸還原胺化(流程2),或者通過(guò)用合適的胺E-NH2對(duì)酯進(jìn)行親核取代(流程3)來(lái)實(shí)施。流程2<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>流程3<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>用與上述類(lèi)似的反應(yīng)可得到式II化合物。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>,一-R3l)酰胺偶合2)樹(shù)脂解離因此，為了得到式I相應(yīng)的羧酸，也就是式Ia化合物，除了起始固體支持體(IVa)含有代替M的活性卣素原子外，采用與合成式I的化合物相同的次序(用方法A和/或B)。用合成肽的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)也得到待鍵合到化合物Ia的肽XVI。因此，首先使固體支持體胺IV與受保護(hù)的賴(lài)氨酸(XIVa)反應(yīng)，任選隨后與另一受保護(hù)的氨基酸(XIVb)反應(yīng)。偶聯(lián)后除去保護(hù)基團(tuán)。可重復(fù)該次序至多三次。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>1)偶合2)脫保護(hù)依次重復(fù)n次<formula>formulaseeoriginaldocumentpage18</formula>然后使羧酸Ia與胺XVI反應(yīng)，去保護(hù)后得到化合物IIa。IIa和聚谷氨酸XVIIa(從相應(yīng)的鹽XVII得到)之間的酰胺偶聯(lián)得到藥物結(jié)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>本發(fā)明化合物為apaf-l抑制劑。因此，它們用于治療或預(yù)防與細(xì)胞凋亡過(guò)度有關(guān)的病癥。在成年人中，有絲分裂期后細(xì)胞例如神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞很少更新。因此，其損傷可引起神經(jīng)疾病和心臟疾病。在多種急性和慢性退化性疾病中，這些細(xì)胞經(jīng)歷程序化細(xì)胞死亡。同樣地，在多種器官中，膿毒性休克、局部缺血和中毒可引起大量的細(xì)胞凋亡。感染可導(dǎo)致特定細(xì)胞類(lèi)型(例如AIDS中的淋巴細(xì)胞，或幽門(mén)螺桿菌(//6/;'<:0^(:^"/7少/04)感染中的胃黏膜細(xì)胞)的高凋亡性代謝。細(xì)胞凋亡事件在缺血和<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>器官移植中的保存-再灌注過(guò)程中也很重要。因此，這些疾病是治療性抑制細(xì)胞死亡的候選病種。與細(xì)胞凋亡有關(guān)的其他病癥或疾病包括但不限于中風(fēng)、創(chuàng)傷病、腦損傷、脊髓損傷、腦膜炎、阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、肯尼迪病、多發(fā)性石更化、朊病毒相關(guān)病(prion-relatedDiseases)以及其他急性或慢性心血管病、酒精相關(guān)病和禿頭(allopeda)治療。因此，本發(fā)明涉及這些化合物在制備用于治療或預(yù)防上述疾病或病癥的藥物中的用途。本發(fā)明另一方面涉及對(duì)R2沒(méi)有附帶條件的式I的化合物或?yàn)槿缜笆龆x的聚合物-藥物結(jié)合物的化合物在制備用于治療或預(yù)防與細(xì)胞凋亡相關(guān)的疾病或病癥的藥物中的用途。本發(fā)明另一方面涉及用于治療或預(yù)防與抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括給予對(duì)R2沒(méi)有附帶條件的式I的化合物或?yàn)槿缜笆龆x的聚合物-藥物結(jié)合物的化合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。本發(fā)明另一方面涉及用于治療或預(yù)防以下疾病的方法中風(fēng)、創(chuàng)傷病、腦損傷、脊髓損傷、腦膜炎、阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、肯尼迪病、多發(fā)性硬化、朊病毒相關(guān)病、心肌缺血以及其他急性或慢性心血管病、器官移植、酒精相關(guān)病和禿頭治療，所述方法包括給予對(duì)R2沒(méi)有附帶條件的式I的化合物或?yàn)槿缜笆龆x的聚合物-藥物結(jié)合物的化合物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。本發(fā)明進(jìn)一步提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含單劑量或多劑量的式I的化合物或?yàn)槿缜笆龆x的聚合物-藥物結(jié)合物的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。給出下述賦形劑實(shí)例僅為了闡明，不能解釋為限制本發(fā)明范圍?？梢匀魏嗡幬镏苿┬问浇o予本發(fā)明化合物。藥物制劑將視活性化合物特性和其給藥途徑而定。可使用任何給藥途徑，例如口服給藥、口腔含化給藥、經(jīng)肺給藥、局部給藥、胃腸外(包括皮下、肌肉內(nèi)和靜脈內(nèi))給藥、透皮給藥、經(jīng)眼給藥、吸入給藥、鼻內(nèi)給藥、經(jīng)耳給藥、透過(guò)粘膜給藥、植入給藥或直腸給藥。然而，優(yōu)選口服給藥、局部給藥或胃腸外給藥。其中用于口服給藥的固態(tài)組合物包括片劑、顆粒劑和硬膠嚢，既可調(diào)配為即釋制劑又可調(diào)配為鄉(xiāng)爰釋制劑。或者，可將本發(fā)明化合物摻入口服液態(tài)制劑中，例如乳劑、溶液劑、分散劑、混懸液、糖漿劑、酏劑或呈明膠膠嚢形式。它們可含有常用的惰性稀釋劑，例如純水、乙醇、山梨醇、丙三醇、聚乙二醇和丙二醇。輔助組分還可含有共輔料(coadjuvant)，例如濕潤(rùn)劑、助懸劑、甜味劑、矯味劑、防腐劑、緩沖劑、螯合劑和抗氧化劑。用于胃腸外給藥的注射劑包括在油性或水性溶媒中的無(wú)菌溶液劑、混懸液或乳劑，可含有共輔料，例如助懸劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑或分散劑。還可將所述化合物調(diào)配用于其局部施用。制劑包括霜?jiǎng)⑾磩?、凝膠劑、粉劑、溶液劑、洗發(fā)劑、口服糊劑、漱口劑和貼劑，其中該化合物分散于或溶解于合適的貝武形劑中。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物呈納米球、微米顆粒和納米顆粒的形式?；钚越M分的有效劑量可視給予的特定化合物、給藥途徑、待治療疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度以及患者年齡、一般健康狀況和體重等而變化。合適的劑量范圍的代表性實(shí)例為每天約0.001-約100mg/Kg體重，其可以單劑量或分次劑量給予。然而，給予的劑量通常將由醫(yī)生決定。通過(guò)MTT分析測(cè)定毒性和細(xì)胞恢復(fù)MTT分析測(cè)定細(xì)胞增殖以及當(dāng)代謝事件導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死時(shí)細(xì)胞生存力的還原。其也可用于評(píng)估當(dāng)特定細(xì)胞系在存在生物異源物質(zhì)時(shí)溫育時(shí)的存活率。公認(rèn)四氮唑鹽的還原為分析細(xì)胞增殖的可靠方法。用代謝活性細(xì)胞還原黃色四氮唑鹽MTT(溴化3-(4，5-二甲基噻唑基-2)-2,5-二苯基四氮唑)，結(jié)果在細(xì)胞內(nèi)形成紫色甲臢，該物質(zhì)用DMSO溶解后可采用分光光度測(cè)定。本發(fā)明中使用MTT分析評(píng)估不同濃度化合物的毒性。為了分析對(duì)細(xì)胞生存力可能的損害，將化合物以不同濃度加入到Saos-2和U937細(xì)胞系，溫育不同時(shí)間。結(jié)果以細(xì)胞生存力百分比來(lái)表示。%細(xì)胞生存力24h,,.10S110S1S的s-21.196100的100100100細(xì)胞系U091100761001001001.2的99100911001001.118298100749110OI.410O97100訴98100I.882的100667697I.310093;97100100100,J98卯9510010010O，.8的10010010010097訴371.19598100的97100細(xì)胞系U0的9996的9810O1.29710010083991001.11799510075的98I.487卯1009S94的1.988981005969931.3的85100981001001.7939599971001001.8的明1009998100時(shí)間(小時(shí)〕1.1的％細(xì)胞生存力IIa.2的％細(xì)胞生存力闊.>抑2S10S1S02S化51S抑s-2241963100100的102S77100助48"19979497ND11明9710072ND88088的NDNDNDNDND24275987的100NDNDNDNDNDU93748NDND8394100NDNDNDNDND72NDND678998。NONDNDNDND時(shí)間(小時(shí))m，i的％細(xì)胞生存力HM藥物-eq.5加坊O10O5020Saos-2244835ND75ND93959987989572NDND686386咖7244827ND50ND84ND明ND98ND72NDNDNDNDND通過(guò)將化合物加入到誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的細(xì)胞系中，也采用MTT測(cè)定來(lái)評(píng)估細(xì)胞恢復(fù)。對(duì)于Saos-2細(xì)胞系，通過(guò)加入2nM多西環(huán)素(doxycyclin)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；《對(duì)于U937、HeLa、U2-OS,分別通過(guò)0.25nM、1.5nM、2jiM多柔比星(doxorubicin)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)果以％細(xì)月包生存力來(lái)表示，認(rèn)為加入多西環(huán)素和多柔比星在Saos-2和HeLa、U2-OS或U937中分別誘導(dǎo)100%的細(xì)胞死亡和0%的細(xì)胞恢復(fù)率。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>ND:未測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>胱天蛋白酶抑制分析分析了由本發(fā)明所述化合物誘導(dǎo)的胱天蛋白酶抑制隨時(shí)間的變化。細(xì)胞系在存在或不存在化合物(50^iM)時(shí)生長(zhǎng)不同時(shí)間。用Saos-2或U937細(xì)胞抽提物和作為底物的Ac-DEVD-afc(N-乙?；?Asp-Glu-Val-Asp-afc(7-tt-4-三氟曱基香豆素))(20pM)測(cè)定胱天蛋白酶活性。用Cytofluor4000熒光計(jì)(激發(fā)波長(zhǎng)400nm;發(fā)射波長(zhǎng)508nm)通過(guò)釋放的熒光afc來(lái)連續(xù)1小時(shí)監(jiān)測(cè)胱天蛋白酶活性。該化合物對(duì)胱天蛋白酶活性的影響以處理細(xì)胞對(duì)未處理細(xì)胞(對(duì)照)的熒光信號(hào)的抑制百分比來(lái)表示。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>ND:未測(cè)定<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>Apaf-1-誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的抑制評(píng)估了所述化合物在凋亡f幾制中對(duì)于其特異性靶的活性。Apaf-l寡聚化為導(dǎo)致激發(fā)凋亡體形成的分子事件，其以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡結(jié)束。這些實(shí)驗(yàn)通過(guò)無(wú)細(xì)胞測(cè)定和細(xì)胞測(cè)定來(lái)進(jìn)行。對(duì)于無(wú)細(xì)胞測(cè)定，如前所述制備Hek-293細(xì)胞質(zhì)抽提物(Malet等，2005)，將全部細(xì)胞抽提物分成多份(partition)。同時(shí)按Malet等，2005純化重組Apaf-l。在不同濃度化合物存在下與重組Apaf-l—起溫育FT部分(含有胱天蛋白酶-3和-9但不含Apaf-l)(參見(jiàn)圖1)。通過(guò)胱天蛋白酶活性的抑制分析所述化合物活性(參見(jiàn)上文)。對(duì)于細(xì)胞測(cè)定，用凋亡體激活劑處理Saos-2和U937細(xì)胞(Nguyen和Wells,Proc.Natl.Acad.Sci.USA2003,100:7533-7538)，其特異性誘導(dǎo)Apaf-l寡聚化。然后，將化合物加入細(xì)胞中(50nM),溫育24或48小時(shí)。通過(guò)胱天蛋白酶活性的抑制分析所述化合物抑制Apaf-l誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的能力(參見(jiàn)上文)。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>IIa.l與Apaf-lCARD域的結(jié)合熒光偏振測(cè)定用Victor2V1420MultilabelHTSCounter進(jìn)行熒光偏振測(cè)定。用濃縮蛋白溶液滴定在緩沖液A中的60nM的5，-6，-熒光素標(biāo)記的IIa.l(稱(chēng)作CF-IIA.l;激發(fā)波長(zhǎng)=480nm;發(fā)射波長(zhǎng)=535nm)的溶液(總反應(yīng)體積為200|ul)。用Wallacl420工作站軟件記錄數(shù)據(jù)。用兩態(tài)模型計(jì)算Kd值(參見(jiàn)圖2)。為了初始表征擬肽和凋亡體的結(jié)合位點(diǎn)，我們合成了IIa.l的熒光類(lèi)似物(CF-IIa.l)。CF-IIa.l結(jié)合到Apaf-lCARD域而不是細(xì)胞色素e和其他控制蛋白(Malet等，2005)，且采用熒光偏振測(cè)定測(cè)定60nM下的解離常數(shù)(Kd)(圖2)。然而，結(jié)合常數(shù)值與在我們的測(cè)定中抑制50%胱天蛋白酶活性所需要的IIa.l濃度形成對(duì)照(IC50《30iuM,圖1)。使這些數(shù)據(jù)一致的假定解釋為用于體外翻譯胱天蛋白酶原-9的網(wǎng)狀細(xì)胞溶解產(chǎn)物含有降低IIa.l有效濃度的成分。實(shí)施例在實(shí)施例中使用以下縮寫(xiě)詞Boc:叔丁氧基羰基DCM:二氯曱烷DIC:W,F-二異丙基碳二亞胺DIPEA:二異丙基乙胺DMF:W,Ar-二甲基甲酰胺eq:摩爾當(dāng)量EtOAc:乙酸乙酯Fmoc:芴基甲氧羰基甘氨酸GHATU:六氟磷酸0-(7-氮雜苯并三唑-l-基)-W,AT，iV'-四曱基脲輸HOBT:1-羥基苯并三唑賴(lài)氨酸KPGA:聚(L-谷氨酸)苯丙氨酸FPyBOP:六氟磷酸苯并三唑-l-基tt-三-(吡咯烷-l-基)轔R:精氨酸rt:保留時(shí)間TFA:三氟乙酸纈氨酸V本發(fā)明將進(jìn)一步由以下實(shí)施例來(lái)闡明。給出實(shí)施例僅為了闡明，不能認(rèn)為對(duì)本發(fā)明范圍加以限制。聚苯乙烯AMRAM樹(shù)脂(0.75mmol/g)購(gòu)自RappPolymereGmbH(德國(guó))。2-氯三苯曱基氯樹(shù)脂(1.4mmol/g)購(gòu)自Novabiochem。在Waters(Milford,馬薩諸塞州，美國(guó))系統(tǒng)中用X-TerraC18(19x25cm,5拜)柱進(jìn)行半制備RP-HPLC;洗脫液A二0.1。/。TFA/水，B=0.1%TFA/乙腈，梯度0分鐘20。/oB-20分鐘0。/。B。高分辨率質(zhì)譜(HRMS-FAB)已登記在SantiagodeCompostela大學(xué)的質(zhì)譜中心(西班牙)。中間體VIIIVIII:(Z)-丁-:2-烯二酸單烯丙酯向2g馬來(lái)酐(20mmol)在氯仿中的溶液中加入1.8ml烯丙醇(26mmol,1.3eq.)。于60。C在微波照射下將反應(yīng)混合物攪拌50分鐘。用1NHC1處理得到的溶液，用氯仿萃取。用鹽水洗滌有機(jī)萃取物，然后經(jīng)無(wú)水硫酸鎂干燥并過(guò)濾。減壓下蒸發(fā)溶劑，通過(guò)色鐠柱純化得到的殘留物，得到油狀中間體VIII(純度為95%,產(chǎn)率85%)。式I的化合物1.1:1\-{氨基甲酰基甲基-[2-(2，4-二氯苯基)-乙基)-l-[2-(2，4-二氯苯基)乙基-4-(3，3-二苯基丙基)-3，7-二氧代1，41-二氮雜環(huán)庚烷-5-甲酰胺用3mL20y。哌咬/DMF處理Rink酰胺樹(shù)脂(500mg，0.4mmol),于60。C在微波反應(yīng)器中將該混合物攪拌2分鐘。過(guò)濾樹(shù)脂，用DMF(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DCM(3x3mL)洗滌。用溴乙酸(V，275mg,5叫.)和DIC(306^L,5eq.)的DMF(3mL)溶液處理樹(shù)脂。于60。C在微波反應(yīng)器中將該反應(yīng)混合物攪4半2分鐘。排出樹(shù)脂，用DCM(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DMF(3x3mL)洗滌。將2,4-二氯苯乙胺(VIa,300HL，5叫.)和三乙胺(2"^L,5eq.)的DMF(3mL)溶液加入到樹(shù)脂中，于9CTC在微波活化下將懸浮液攪拌2分鐘。除去上清液，排出殘留物，用DMF(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DCM(3x3mL)洗滌。然后，用(Z)-丁-2-烯二酸單烯丙酯(VIH,310mg,5eq.)、HOBT(267mg,5eq.)和DIC(306|LiL,5eq.)的DCM:DMF(2:1,3mL)溶液處理樹(shù)脂。于室溫將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，過(guò)濾，在同樣條件下重復(fù)該反應(yīng)。排出樹(shù)脂，用DCM(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DMF(3x3mL)洗滌。然后，將3,3-二苯基丙基胺(VIb,418mg,5eq.)和三乙胺(275jxL,5eq.)的DMF(3mL)溶液加入到樹(shù)脂中，于室溫將該懸浮液攪拌3小時(shí)。在同樣的溫度下重復(fù)該反應(yīng)過(guò)夜。除去上清液，排出殘留物，用DMF(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DCM(3x3mL)洗滌。然后，用溴乙酸(V,275mg,5eq.)和DIC(306^L，5eq.)的DMF(3mL)溶液處理樹(shù)脂。于6(TC在微波反應(yīng)器中將該反應(yīng)混合物攪拌2分鐘。排出樹(shù)脂，用DCM(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DMF(3x3mL)洗滌。將2,4-二氯苯乙胺(VIc,200^L,5eq.)和三乙胺(210^L,5eq.)的DMF(3mL)溶液加入到樹(shù)脂中，于9(TC在微波活化下^)尋懸浮液攪拌2分鐘。除去上清液，排出樹(shù)脂，用DMF(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DCM(3x3mL)洗滌。然后，于室溫下在氬氣中用在無(wú)水DCM中的四(三苯基膦)合鈀(0)(46mg，0.1eq.)和苯基硅烷(490iuL,10eq.)處理樹(shù)脂15分鐘。將該過(guò)程重復(fù)三次(bytriplicate)。除去上清液，排出樹(shù)脂，用DMF(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DCM(3x3mL)洗滌。通過(guò)用在DMF(3mL)中的PyBOP(308mg,1.5eq.)、HOBT(80mg,1.5eq.)和DLPEA(203|iiL,3eq.)處理來(lái)促進(jìn)環(huán)化。在室溫下將該反應(yīng)混合物攪拌16小時(shí)并過(guò)濾。排出樹(shù)脂，用DCM(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DMF(3x3mL)洗滌。最后，用60:40:2的TFA/DCM/水混合物處理樹(shù)脂，釋》丈含有標(biāo)題化合物I.l的粗反應(yīng)混合物，將其過(guò)濾。通過(guò)減壓蒸發(fā)、凍干除去濾液中的溶劑。通過(guò)半制備RP-HPLC用乙腈水溶淡梯度洗脫(42%乙腈—80%乙腈，35分鐘)來(lái)純化得到的殘留物，得到91mg所需產(chǎn)物(產(chǎn)率30%,純度^98%)。HRMS(M+H)+:C39H38CLtN404的計(jì)算值為767.1647;實(shí)測(cè)值為767.1720。按照實(shí)施例1.1所闡述的類(lèi)似程序但用不同的胺，得到以下產(chǎn)物<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>中間體laIa:{[2－(2,4－二氯苯基)乙基l－[l－2-(2，4－二氯苯基)乙基－4-(3，3－雙－苯基丙基)-3，7-二氧代l，4I二氮雜環(huán)庚烷-5-羰基I氨基)乙酸用氯乙酸(V,463mg,5eq.)和DIPEA(8405eq.)的DCM(4mL)溶液處理2-氯三苯曱基氯樹(shù)脂(IVa,700mg,0.98mmol)。在室溫下將該混合物攪拌l小時(shí)，用曱醇(550^iL)猝滅該反應(yīng)，再攪拌IO分鐘。除去上清液，排出樹(shù)脂，用DCM(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DMF(3x3mL)洗滌。將2,4-二氯苯乙胺(VIa,740^L,5eq.)和DIPEA(840^L,5叫.)的DMF(4mL)溶液加入到樹(shù)脂中，在室溫下將該懸浮液攪拌3小時(shí)。除去上清液，排出樹(shù)脂，用DMF(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DCM(3x3mL)洗滌。然后，用(Z)-丁-2-烯二酸單烯丙酯(VIH)(765mg,5叫)、HOBT(662mg,5eq.)和DIC(760^L,5eq.)的2:1的DCM:DMF(4mL)溶液處理樹(shù)脂。在室溫下將該反應(yīng)混合物攪拌30分鐘，過(guò)濾，在同樣條件下重復(fù)。然后，將3,3-二苯基丙基胺(VIb,1.0g,5eq.)和DIPEA(8405eq.)的DMF(4mL)溶液加入到樹(shù)脂中，室溫下將該懸浮液攪拌3小時(shí)。在同樣溫度下再重復(fù)攪拌該反應(yīng)物16小時(shí)。除去上清液，排出樹(shù)脂，用DMF(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DCM(3x3mL)洗滌。然后，用氯乙酸(V,463mg,5eq.)和DIC(760|uL,5eq.)的2:1的DCM:DMF(4mL)溶液處理樹(shù)脂。室溫下將反應(yīng)混合物攪拌30分鐘。排出樹(shù)脂，用DCM(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DMF(3x3mL)洗滌。將2,4-二氯苯乙胺(VIc，740^L，5eq.)和DIPEA(840pL，5eq.)的DMF(4mL)溶液加入到樹(shù)脂中，在室溫將該懸浮液攪拌3小時(shí)。除去上清液，排出樹(shù)脂，用DMF(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DCM(3x3mL)洗滌。然后，用在無(wú)水DCM中的四(三苯基膦)合鈀(0)(114mg,0.1eq.)和苯基硅烷(1.2mL,10eq.)于室溫下在氬氣中處理樹(shù)脂15分鐘。重復(fù)三次該合成步驟。除去上清液，排出樹(shù)脂，用DCM(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DMF(3x3mL)洗滌。用在DMF(4mL)中的PyBOP(765mg,1.5eq.)、HOBT(199mg,1.5eq.)和DIPEA(505(iL,3eq.)處理來(lái)促進(jìn)環(huán)化。在室溫下將該混合物攪拌48小時(shí)并過(guò)濾。排出樹(shù)脂，用DCM(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DMF(3x3mL)洗滌。最后，用5:95的TFA/DCM混合物處理樹(shù)脂，釋放粗反應(yīng)混合物，過(guò)濾。減壓除去濾液的溶劑、凍千，得到無(wú)色固體狀的化合物Ia(460mg,產(chǎn)率61%,純度^55%)。中間體IIa用3mL20。/。哌咬/DMF使Rink酰胺樹(shù)脂(IV，505mg,0.4mmol)去保護(hù)。在微波反應(yīng)器中于60。C將該混合物攪拌2分鐘。過(guò)濾樹(shù)脂，用DMF(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DCM(3x3mL)洗涂。用HOBT(108mg,2eq.)和DIC(125^L,2eq.)將Fmoc-L鍾Lys(Boc)-OH(XIVa,2eq)連接到樹(shù)脂。于室溫下將混合物攪拌l小時(shí)。排出樹(shù)脂，用DCM(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DMF(3x3mL)洗滌。一旦用3mL200/。哌^(guò)t/DMF除去Fmoc基團(tuán)(30分鐘)，用DMF(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DCM(3x3mL)洗涂樹(shù)脂。若需要，在如上所述同樣條件下偶聯(lián)另一個(gè)氨基酸(XIVb),得到中間體XVI。在HATU(228mg，1.5eq.)和DIPEA(205juL,3叫.)的DMF(3mL)溶液存在下，將酸Ia(460mg,1.5eq.)加入到溶脹在DMF中的中間體XVI中。于室溫下將該反應(yīng)混合物攪拌16小時(shí)并過(guò)濾。排出樹(shù)脂，用DCM(3x3mL)、異丙醇(3x3mL)和DMF(3x3mL)洗滌。用80:20:2.5:2.5的TFA/DCM/水/三異丙基硅烷混合物處理樹(shù)脂，釋放出含有化合物IIa的粗反應(yīng)混合物，過(guò)濾。減壓除去濾液的溶劑、凍干。通過(guò)半制備RP-HPLC用水-乙腈混合物梯度洗脫來(lái)純化得到的殘留物。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>式III化合物III.1:PGA-IIa.l向分子量(Mw)介于17000-43000Da的PGA鈉鹽(XVII,0.1g,0.5mmol)的水溶液中加入0.2MHCl，直到將該溶液的pH調(diào)整到2.0。收集沉淀物，用水滲析析并凍干。然后，將呈其質(zhì)子形式(protinicform)的PGA(XVHa)溶解于無(wú)水DMF(7.5mL)中，加入DIC(3eq)和HOBt(3eq)，攪拌15分鐘。然后，加入中間體IIa.1(0.052mmol(12mol%)leq)，用DIPEA(1.5mL)將pH調(diào)整到8。讓反應(yīng)在室溫繼續(xù)進(jìn)行36小時(shí)。薄層色譜(TLC,硅膠)顯示Ha.l(R尸O.5)完全轉(zhuǎn)化為聚合物結(jié)合物(R尸0,MeOH:H20:AcOH=85:10:5)。為了停止該反應(yīng)，將混合物倒入CHCl3中。收集得到的沉淀物并真空干燥。通過(guò)將該產(chǎn)物溶于l.OMNaHC03，得到PGA-擬肽結(jié)合物III.l的鈉鹽。用蒸餾水滲析該水溶液(MwCO6,000-8000Da)。凍干滲析液得到白色粉末產(chǎn)物。按照UV(入=282nm)所測(cè)定聚合物中總擬肽含量介于25-30%(w/w)(10-12mol。/。功能化(fonctionalization)),游離藥物含量<1%重量總藥物。通過(guò)尺寸排阻色語(yǔ)(SEC)和分析用超速離心機(jī)(AUC)分析了溶液中IIU和對(duì)照XVII的分子量(Mw)的平均值、多分散性(Mw/Mn)和特性。兩種技術(shù)都顯示in.l比XVII(III.l的tr=12.5分鐘，S=3.5±0.4秒，而XVII的tr-11.6分鐘，S二1.9土0.1秒)作為更緊湊的構(gòu)象結(jié)構(gòu)具有更小的流體力學(xué)體積和更大的沉降系數(shù)(S)。通過(guò)沉降平衡測(cè)得XVII的Mw為26700Da，III.l的Mw為58600Da,然而，通過(guò)GPC用PEG標(biāo)準(zhǔn)物測(cè)定XVII和III.l的Mw分別為36000Da(Mw/Mn=1.8)和38000Da(Mw/Mn=1.5)。通過(guò)UV光譜法測(cè)定總藥物含量制備IIa的MeOH儲(chǔ)液(lmg/mL)。為得到校準(zhǔn)曲線，用MeOH稀釋樣品，以得到O-lmg/mL的濃度范圍。通過(guò)測(cè)定在H20中于272nm和281nm處的光密度，來(lái)測(cè)定結(jié)合物中的藥物總負(fù)載。用在H20中與所分析的III結(jié)合物同樣濃度范圍(0-5mg/mL)的PGA作空白。發(fā)現(xiàn)在室溫下在MeOH中的Ha在281nm處的消光系數(shù)Hl=713Lmor1cm"。通過(guò)HPLC測(cè)定游離藥物含量制備IIU水溶液(lmg/mL),將等份試樣(100ML)加入到聚丙烯試管中，用水補(bǔ)足到lmL。用甲酸銨緩沖液(100yL，1M,pH8.5)將樣品pH調(diào)整到8，然后，加入CHCl3(5mL)。然后，通過(guò)漩渦振蕩(3xIO秒)充分萃取樣品。仔細(xì)除去上面水層，在N2下蒸發(fā)溶劑。將干殘留物溶解于200nLHPLC級(jí)乙腈中。平行對(duì)母體化合物IIa.l(用200yL1mg/mL含水儲(chǔ)液)實(shí)施同樣過(guò)程。加入lmL乙腈重新溶解產(chǎn)物，得到200jug/mL儲(chǔ)液，由此制備各種濃度范圍(2-100jug/mL)。通過(guò)HPLC用LichrospherC18(150x3.9mm)柱測(cè)定結(jié)合物中游離藥物的含量。用0.1%TFA水溶液/乙腈梯度洗脫(20分鐘內(nèi)20-100%乙腈)，流速lmL/分鐘。1Ia,l保留時(shí)間tr-14.3分鐘(入=220腿)。按照與nu的這些程序，得到以下實(shí)施例:<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>通過(guò)尺寸排阻色語(yǔ)(SEC)測(cè)定圖1:在不同濃度化合物Ha.l存在下，用Hek-293FT細(xì)胞質(zhì)部分與重組Apaf-l溫育，無(wú)細(xì)胞胱天蛋白酶的抑制測(cè)定。圖2:分析CARD/IIa.1的相互作用。用濃度依次升高的CARD-Apaf滴定240nM的CF-IIa.l/PBS緩沖液溶液，在3(TC測(cè)定熒光偏振。以毫偏振(mP)為單位記錄數(shù)據(jù)(平均s.d.;n=3)。權(quán)利要求1.一種通式I的化合物、其立體異構(gòu)體和其混合物、其多晶型和其混合物和其藥學(xué)上可接受的溶劑化物和加成鹽，其中R1代表(C1-C5)烷基、(C2-C5)烯基、-(CH2)1-3-NHCO-(C1-C3)烷基、-(CH2)1-3-COMRaRb、-(CH2)0-3-(3-6)Cy、-(CH2)0-3-(5-6)Hetcy、-(CH2)1-3-苯基、-(CH2)1-3-(1-萘基)、-(CH2)1-3-(2-萘基)、-(CH2)1-3-(5-10)Hetar、-(CH2)2-CH(苯基)2、-(CH2)2-CH(苯基)[(5-6)Hetar]或-(CH2)2-CH[(5-6)Hetar]2；R2代表-(CH2)0-3-(3-6)Cy、-(CH2)0-3-(5-6)Hetcy、-(CH2)1-3-苯基、-(CH2)1-3-(1-萘基)、-(CH2)1-3-(2-萘基)、-(CH2)1-3-(5-10)Hetar、-(CH2)2-CH(苯基)2、-(CH2)2-CH(苯基)[(5-6)Hetar]或-(CH2)2-CH[(5-6)Hetar]2；R3代表-(CH2)1-3-苯基、-(CH2)1-3-(1-萘基)、-(CH2)1-3-(2-萘基)或-(CH2)1-3-(5-6)Hetar；(C1-C5)烷基和-(C2-C5)烯基可任選被一個(gè)或多個(gè)選自以下的取代基取代-O-(C1-C2)烷基、-S-(C1-C2)烷基、-NH2、-NH-(C1-C2)烷基和-N[(C1-C2)烷基]2；(C1-C3)烷基可任選被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子取代；Ra和Rb獨(dú)立代表-H或-(C1-C3)烷基；(3-6)Cy代表3-6元的部分不飽和或飽和碳環(huán)基團(tuán)；(5-6)Hetcy代表C-或N-基團(tuán)的5或6元環(huán)，其為含有一個(gè)或兩個(gè)獨(dú)立選自O(shè)、S和N的雜原子的部分不飽和或飽和碳環(huán)；Cy和Hetcy可任選被一個(gè)或多個(gè)選自鹵素、-CF3和-OH的取代基取代；(5-6)Hetar和(5-10)Hetar分別代表C-或N-基團(tuán)的芳族5元或6元和5-10元環(huán)；其含有1-4個(gè)獨(dú)立選自O(shè)、S和N的雜原子；苯基、1-萘基、2-萘基、(5-6)Hetar和(5-10)Hetar可任選被一個(gè)或多個(gè)選自以下的取代基取代鹵素、-CF3、-OH、-O-(C1-C3)烷基、-CO-(C1-C3)烷基、-(C1-C5)烷基-NRaRb、-NRaRb和-SO2NH2；附帶條件為R2不代表2-(4-氟苯基)乙基。2.權(quán)利要求1的化合物，其中Rl代表-(CH2)。-3-(5-6)Hetcy、-(CH^.HS-lC^HetaL畫(huà)(CH2)L3-苯基、-(012)1.3-(1-萘基)或-((^2)1.3誦(2陽(yáng)萘基)，它們中的所有都任選^支取代。3.權(quán)利要求1或2的化合物，其中R2代表-(CH2)w-苯基、-((^2)1—3-(1-萘基)、-(0^2)1_3-(2-萘基)或-((^2)2-01(苯基)2，它們中的所有都任選被取代，附帶條件為R2不代表2-(4-氟苯基)乙基。4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的化合物，其中R3代表-(CH2;h-3-(5-6)Hetar或-((312)2-苯基，二者都任選被取代。5.—種化合物，所述化合物為包含與聚谷氨酸聚合物結(jié)合的式II基團(tuán)、其立體異構(gòu)體和其混合物和其藥學(xué)上可接受的溶劑化物和加成鹽的藥物結(jié)合物，，1其中Rl、R2和R3具有如權(quán)利要求1所定義的含義，但對(duì)R2沒(méi)有附帶條件；每一R4獨(dú)立代表得自20種天然存在的氨基酸的任一<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>種的側(cè)鏈，n為0、1、2或3。6.—種式III化合物，所述化合物為根據(jù)權(quán)利要求2的藥物結(jié)合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>其中y與x的比例按重量算為25-30%到75-70%。7.權(quán)利要求5或6的化合物，其中所述聚谷氨酸為聚(L-谷氨酸);n代表2，R4代表甘氨酸側(cè)鏈。8.對(duì)R2沒(méi)有附帶條件的權(quán)利要求1所定義的化合物或權(quán)利要求5所定義的化合物在制備用于治療或預(yù)防與抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)的病癥的藥物中的用途。9.權(quán)利要求8的用途，其中所述病癥選自中風(fēng)、創(chuàng)傷病、腦損傷、脊髓損傷、腦膜炎、阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、肯尼迪病、多發(fā)性硬化、朊病毒相關(guān)病、心肌缺血以及其他急性或慢性心血管病、器官移植、酒精相關(guān)病或禿頭治療。10.—種用于治療或預(yù)防與抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)的病癥的方法，所述方法包括給予對(duì)R2沒(méi)有附帶條件的權(quán)利要求1所定義的式I的化合物或權(quán)利要求5所定義的化合物和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述病癥選自中風(fēng)、創(chuàng)傷病、腦損傷、脊髓損傷、腦膜炎、阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病、肯尼迪病、多發(fā)性硬化、朊病毒相關(guān)病、心肌缺血以及其他急性或慢性心血管病、器官移植、酒精相關(guān)病或禿頭治療。12.—種藥物組合物，所述組合物包含有效量的權(quán)利要求1所定義的式I的化合物或權(quán)利要求5所定義的化合物、其藥學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。13.權(quán)利要求12的藥物組合物，所述組合物呈納米球、微米顆粒和納米顆粒形式。全文摘要本發(fā)明涉及起細(xì)胞凋亡抑制劑作用的式(I)化合物以及基于式(I)化合物的藥物結(jié)合物，以及它們的制備方法和含有它們的藥物組合物和其在醫(yī)學(xué)中的用途。文檔編號(hào)C07K5/097GK101370820SQ200680051639公開(kāi)日2009年2月18日申請(qǐng)日期2006年11月22日優(yōu)先權(quán)日2005年11月23日發(fā)明者A·梅塞古爾佩波克,A·莫爾弗南德茨,E·佩雷茨帕亞,G·?？死镩T(mén)斯佩雷茨德羅扎,G·馬萊特恩格拉,L·蒙德拉岡馬蒂尼茨,M·J·維森特多康,M·奧爾扎茨卡拉塔尤德申請(qǐng)人:薩爾瓦特實(shí)驗(yàn)室有限公司;康斯喬最高科學(xué)研究公司