專利名稱：：抗原和佐劑的多聚體復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：此項(xiàng)發(fā)明涉及包含佐劑和抗原的大分子裝配物(macromolecularassembly),比如融合蛋白，與單獨(dú)的抗原相比，這類裝配物能夠引起增強(qiáng)的對抗原的免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
：改善現(xiàn)有的疫苗和創(chuàng)造新的疫苗都需要改進(jìn)的免疫接種方法。同時(shí)，也需要最小化或避免佐劑的使用，因?yàn)橹挥泻苡邢迶?shù)量的佐劑被準(zhǔn)許在人身上使用，為了減少動物的痛苦，也廣泛期望將動物中佐劑的使用降至最低。近期的專利申請描述了使用哺乳動物C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域來提高哺乳動物中抗原的免疫原性。這些申請包括PCT/IB2004/002717和PCT/EP03/08926。一個更早些的專利W091/11461討論了C4bp蛋白融合物用于免疫接種的應(yīng)用，但是沒有證明成功的免疫接種。PCT/EP03/08928描述了生產(chǎn)哺乳動物C4bp融合蛋白的方法。但是到目前為止，尚未知曉用于非哺乳動物物種的CMbp寡聚化結(jié)構(gòu)域。由于對非哺乳動物的疫苗接種有相當(dāng)?shù)呐d趣，比如為鳥類接種疫苗以對抗禽流感，源自這些物種的C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域?qū)邢喈?dāng)可觀的實(shí)用性。Oshiumi等人(2005J.Immunol.175，1724-1734)已經(jīng)表征了雞中補(bǔ)體活化位點(diǎn)(complementactivationlocus)的調(diào)節(jié)物，并鑒定了三個蛋白質(zhì)，他們將這三個蛋白質(zhì)稱為CREM、CREG和CRES。每個基因的轉(zhuǎn)錄物的表征，促使了整個蛋白質(zhì)序列的推導(dǎo)。其中的一個蛋白質(zhì)，CRES,被描述為雞C4bp基因。發(fā)明概述我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一個同樣在雞RCA位點(diǎn)中找到的DNA序列編碼的新蛋白質(zhì)序列，但是與Oshiumi等人描述過的任何序列都截然不同。這種189個核苷酸的DNA序列及其編碼的62個氨基酸的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域示于表1。我們把這一結(jié)構(gòu)域稱為雞C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明因此提供一種產(chǎn)物，其包含作為第一組分的SEQIDNO:l的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體；和作為第二組分的抗原。我們也鑒定了SEQIDNO:l的禽類同源序列，其氨基酸序列示于SEQIDNO:23。因此，在本發(fā)明的另一個方面中提供一種產(chǎn)物，其包含作為第一組分的SEQIDNO:23的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體；和作為第二組分的抗原。我們也發(fā)現(xiàn)了CRES(雞的補(bǔ)體調(diào)節(jié)性分泌蛋白(complementregulatorysecretoryprotein))結(jié)構(gòu)域具有增加抗原免疫原性的能力。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種產(chǎn)物，其包含作為第一組分的C4bp結(jié)構(gòu)域，和作為第二組分的抗原，其中所述C4bp結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO:37中所示的CRES結(jié)構(gòu)域或其變體。第一組分和第二組分可能是以融合蛋白的形式。在一種可供選擇的情況下，它們也可能是化學(xué)偶聯(lián)的，通過任一第一組分的氨基酸側(cè)鏈，或者通過為了能夠與第二組分進(jìn)行化學(xué)偶聯(lián)而特別添加到第一組分上的氨基酸側(cè)鏈。第一組分和第二組分也可以非共價(jià)地與彼此結(jié)合。比如，對第一組分的氨基酸的側(cè)鏈進(jìn)行修飾以使其具有額外的生物素基團(tuán)，而這種生物素可以用來和鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)結(jié)合(當(dāng)鏈霉抗生物素蛋白是第二組分的情況)，或者和鏈霉抗生物素蛋白融合的抗原能夠通過這種生物素與第一組分結(jié)合。另一種可能性是，通過加入鏈霉抗生物素蛋白并且純化產(chǎn)生的復(fù)合物，能夠?qū)⑸锼鼗目乖蜕锼鼗牡谝唤M分牢固而非共價(jià)地結(jié)合。這些非共價(jià)結(jié)合的實(shí)例只是說明性的，本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員將理解可以釆用其他類型的非共價(jià)結(jié)合，理想的是導(dǎo)致兩組分緊密非共價(jià)結(jié)合的類型。為了避免疑問，"第一"和"第二"組分的指定并不暗示或者明示兩種組份在產(chǎn)物中的特定線性順序。兩種組分可以按照任何順序結(jié)合。雖然在優(yōu)選的方面，產(chǎn)物將包含1:1比率的第一組分和第二組分，但是同樣在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的是，可以將多于一個的第一組分和一個第二組分結(jié)合，或者反之亦然。比如，第一和第二組份的比率可以是1:4,1:3,1:2,1:1,2:1，3:1或者4:1。當(dāng)比例不是1:1時(shí)，更優(yōu)選第二組分過量。因此，當(dāng)兩種組分都是多肽并且將產(chǎn)物制備為融合蛋白時(shí)，兩種組分的N末端至C末端的順序可以按任意排列。本發(fā)明進(jìn)一步提供編碼所述第一和第二組分的融合蛋白的核酸。本發(fā)明還提供包含所述核酸的載體和攜帶所述載體的宿主細(xì)胞。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制備包含下列組分的產(chǎn)物的方法作為第一組分的SEQIDNO:1、23或37的C4bp結(jié)構(gòu)域，或其變體；和作為第二組分的多肽抗原，所述方法包含以融合蛋的形式表達(dá)編碼所述兩種組分的核酸，和回收產(chǎn)物。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制備包含下列組分的產(chǎn)物的方法作為第一組分的SEQIDNO:1、23或37的C4bp結(jié)構(gòu)域，或其變體；和作為第二組分的多肽或非多肽抗原，所述方法包含表達(dá)編碼第一組分的核酸，連接所述第一組分和抗原，和回收產(chǎn)物。制備產(chǎn)物的方法可以在真核和原核細(xì)胞中進(jìn)行。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)對抗原的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含對受試者施用有效量的本發(fā)明的產(chǎn)物。本發(fā)明還提供本發(fā)明的產(chǎn)物在治療人體和動物體的方法中的用途，特別是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明進(jìn)一步提供藥物組合物，其包含本發(fā)明的產(chǎn)物，所述產(chǎn)物和可藥用的載體或稀釋劑結(jié)合。本發(fā)明進(jìn)一步提供在針對傳染劑的被動免疫接種中使用的保護(hù)性免疫血清的制備方法，所述方法包含用本發(fā)明的產(chǎn)物接種包括人在內(nèi)的動物受試者，從所述動物包括人回收抗血清。其后這種抗血清可以使用在對受試者的被動免疫接種方法中。所述受試者可以是受到該傳染劑傳染或面臨該傳染劑傳染的風(fēng)險(xiǎn)的受試者。動物受試者尤其可以是哺乳動物受試者，包括人。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是盡管本發(fā)明的產(chǎn)物在哺乳動物(比如小鼠和兔)中誘導(dǎo)對抗第一組分的抗體，但是這些抗體卻不會和內(nèi)源的哺乳動物C4bp蛋白交叉反應(yīng)。因此本發(fā)明的產(chǎn)品可以不僅用在人類應(yīng)用中，也可以用在脊推動物應(yīng)用中，例如用于治療家養(yǎng)的哺乳動物，包括家畜(如牛，綿羊，豬，山羊，馬)和寵物(如貓，狗，嚙齒動物)，或者用于治療野生的哺乳動物，如動物園中圈養(yǎng)的那些哺乳動物。在另一方面中，本發(fā)明的產(chǎn)物可以用來治療非哺乳動物受試者，包括家禽，如雞，火雞，鴨，鵝等。在這個方面中，第二組分可能包括傳染性細(xì)菌或病毒生物的抗原，如沙門氏菌屬(Sa/wo"e〃a)菌種、埃希氏菌屬(Esc/2en'c/2/a)菌種類(特別是大腸桿菌)、彎曲桿菌屬(Cflw/^/oZ)ac^O菌種、流感病毒等的抗原。其他抗原的實(shí)例在下面討論。附圖描述圖1顯示本發(fā)明中C4bp結(jié)構(gòu)域的DNA和蛋白質(zhì)序列。圖2顯示本發(fā)明的C4bp結(jié)構(gòu)域、CRES的推定C4bp結(jié)構(gòu)域和人C4bp的比對。圖3是顯示本發(fā)明的純化蛋白(AVD259)的凝膠。圖4顯示AVD262蛋白在存在或缺失還原劑P-巰基乙醇時(shí)在SDS-PAGE膠上的特性。發(fā)明詳述SEQIDNO:l的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體。SEQIDNO:l的C4bp結(jié)構(gòu)域包含62個氨基酸。這種蛋白質(zhì)的變體有形成多聚體的能力。所述變體應(yīng)與SEQIDNO:l的62個氨基酸的序列具有至少45%序列同一性，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，甚至更優(yōu)選至少90%，比如至少95%或最優(yōu)選至少98%序列同一性。SEQIDNO:l的變體包括具有一個或多個氨基酸取代、缺失或插入的蛋白質(zhì)。取代是特別期望的，同樣期望的是N末端缺失和C末端缺失。因此，變體優(yōu)選應(yīng)包含下列中的一個或多個N末端缺失l-8，例如l-4個氨基酸殘基；C末端缺失1-8,例如1-4個氨基酸殘基；1-8個，如2,3，4，5,6或7個氨基酸的取代。SEQIDNO:23的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體。SEQIDNO:23的C4bp結(jié)構(gòu)域包含50個氨基酸。這種蛋白質(zhì)的變體有形成多聚體的能力。所述變體應(yīng)與SEQIDNO:23的50個氨基酸的序列具有至少45%序列同一性，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少90%,比如至少95%或最優(yōu)選至少98%序列同一性。SEQIDNO:23的變體包括具有一個或多個氨基酸取代、缺失或插入的蛋白質(zhì)。取代是特別期望的，同樣期望的是N末端缺失和C末端缺失。因此，變體優(yōu)選包含下列中的一個或多個N末端缺失1-8，例如1-4個氨基酸殘基；C末端缺失1-8，例如1-4個氨基酸殘基；1-8個，如2，3，4，5,6或7個氨基酸的取代。SEQIDNO:37的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體。SEQIDNO:37的C4bp結(jié)構(gòu)域包含58個氨基酸。這個序列代表CRES(雞的補(bǔ)體調(diào)節(jié)性分泌蛋白)蛋白的結(jié)構(gòu)域。CRES已經(jīng)由Oshiumi等人(2005J.Immunol.175,1724-1734)描述，并被描述為雞C4bp基因。SEQIDNO:37的蛋白質(zhì)的變體有形成多聚體的能力。所述變體應(yīng)與SEQIDNO:37的58個氨基酸的序列具有至少45%序列同一性，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%,甚至更優(yōu)選至少90%，比如至少95%或最優(yōu)選至少98%序列同一性。SEQIDNO:37的變體包括具有一個或多個氨基酸取代、缺失或插入的蛋白質(zhì)。取代是特別期望的，同樣期望的是N末端缺失和C末端缺失。因此，變體優(yōu)選包含下列中的一個或多個N末端缺失1-8,例如1-4個氨基酸殘基；C末端缺失1-8，例如1-4個氨基酸殘基；1-8個，如2,3,4，5,6或7個氨基酸的取代。M酸取代SEQIDNO:l,23或37的變體中的取代包括保守取代。保守取代的實(shí)例包括涉及相似氨基酸組的那些，這些組通常稱為JDayhoff組。這些組如下第l組D,E，N，Q第2組I,L，V，M第3組F，Y，W<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>一方面來說，SEQIDNO:1的變體保留了一些SEQIDNO:1的氨基酸殘基，例如至少3個，例如至少6個，或者下面全部的SEQIDNO:l的氨基酸殘基Cys22,Leu33,Glu34，Lys37，Leu38,Leu40，Glu41,11e42和Leu45。理想的是，當(dāng)一些或者全部這些殘基出現(xiàn)的時(shí)候，此變體將會保持這些殘基之間的相對間距。變體和SEQIDNO:l，23或37之間的序列同一性程度可以用算法GAP來決定，算法GAP是本領(lǐng)域廣泛使用的算法"Wisconsin程序包，，的一部分，可以從Accelrys(先前為基因計(jì)算機(jī)研究組(GeneticsComputerGroup),Madison，WI)得到。GAP使用Needleman和Wunsch算法來排列兩個完整序列，使相匹配的殘基數(shù)最大而缺口數(shù)最小。GAP對相似長度的緊密相關(guān)的短序列比對有用，因而對于決定序列是否符合以上提到的同一性水平適用。GAP可以使用缺省參數(shù)?？梢灾苽洳y試它們形成多聚體的能力的C4bp結(jié)構(gòu)域變體的實(shí)例包括SEQIDNO:5-14和SEQIDNO42和43，示于下面的表1:表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>A=SEQIDNO，B二序列，C-參照SEQIDNO:1計(jì)算的％同一性(最近似的整數(shù))。當(dāng)序列的缺失產(chǎn)生時(shí)，除N末端或C末端的截短(truncation)之外，優(yōu)選將它們限制在不超過一個，兩個或三個連續(xù)或者不連續(xù)的缺失。當(dāng)序列的插入產(chǎn)生時(shí)，也期望對插入數(shù)目進(jìn)行限制以使蛋白質(zhì)的大小不超過野生型序列長度多于20個氨基酸，特別是不多于15個，更優(yōu)選不多于10個氨基酸。因此，就SEQIDNO:1來說，當(dāng)通過插入修飾蛋白時(shí)，期望所述蛋白在長度上將不超過82個氨基酸。SEQIDNO:1，23或37的變體形成多聚體的能力可以如下測試通過在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)變體(如所附實(shí)施例中闡述的)，回收變體，和決定變體是否形成多聚體，例如用凝膠過濾。在另一個方面，SEQIDNO:1,23或37的C4bp結(jié)構(gòu)域的變體包括這類序列的其他非哺乳動物同源物，特別是鳥類和爬蟲類同源物。以上提到過，使用非哺乳動物蛋白的好處是避免針對宿主的天然C4bp蛋白的抗體。將同源物定義為有共同祖先證據(jù)的蛋白質(zhì)，即很有可能是源于進(jìn)化趨異的結(jié)果。鳥類同源物通常與SEQIDNO:l,23或37具有高度的序列同一性，并且這類同源物和它們能夠形成多聚體的變體同樣也可以用在本發(fā)明中。這些4支術(shù)包括用編碼本發(fā)明中SEQIDNO:1，23或37的核酸或其片段作為探針來回收和確定其他物種內(nèi)的C4bp同源物的序列。多種技術(shù)可以為此使用，如用合適來源的mRNA(如從胚胎或者活躍分裂的已分化細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和同源物的克隆，或者用包含以下步驟的方法從動物得到cDNA文庫，比如從以上提到的來源得到的cDNA文庫，用編碼SEQIDNO:1,23或37的核酸在嚴(yán)緊條件下探測(probe)所述文庫，和回收編碼全部或部分這種動物的SEQIDNO:1,23或37同源物的cDNA。當(dāng)獲得部分cDNA時(shí)，全長的編碼序列可以用引物延伸技術(shù)來確定?；蛘?，當(dāng)可以獲得所述動物的全部或部分基因組序列時(shí)，用SEQIDNO:l，23或37進(jìn)^f亍的同源性搜索可以用來確定合適的同源物。例如，通過使用SEQIDNO:l的數(shù)據(jù)庫同源搜索已在斑胸草雀(zebrafinch)(拉丁名為rae"/o;7_yg/o中鑒定出同源物，如實(shí)施例8中所列。同源氨基酸序列示于SEQIDNO:23。SEQIDNO:1和SEQIDNO:23的序列比對顯示了48%的同一性。在另一方面中，本發(fā)明涉及SEQIDNO:l，23或37和同樣能夠形成多聚體的它們的變體，所述變體具有至少45%,更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%，更優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少95%,最優(yōu)選至少98%序列同一性。本發(fā)明還涉及SEQIDNO:l,23或37和異源蛋白的融合蛋白，所述異源蛋白與其N末端或C末端中的任一融合。異源蛋白可以是哺乳動物蛋白。SEQIDNO:1，23或37的蛋白及其變體，以及本發(fā)明的產(chǎn)物可以以基本上分離的形式提供，不含或基本不含與其天然結(jié)合(naturallyassociated)的物質(zhì)，比如細(xì)胞中存在的其他多肽。當(dāng)然，本發(fā)明的蛋白、其變體以及產(chǎn)物可以是用稀釋劑(diluents)或佐劑(adjuvants)配制的，并且更因?qū)嶋H用途而可以是分離的，比如如果用來涂覆(coat)在免疫測定(immunoassays)中使用的孩i量滴定平板，則通常將多肽與明膠或其他載體混合。本發(fā)明的蛋白質(zhì)、其變體以及產(chǎn)物可以是天然糖基化的，或者可以是通過異源真核細(xì)胞的系統(tǒng)糖基化的，或者它們也可以(比如當(dāng)通過在原核細(xì)胞中表達(dá)來產(chǎn)生時(shí))是未糖基化的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)、其變體以及產(chǎn)物可以任選地是磷酸化和/或乙?；摹Ｋ龅鞍踪|(zhì)、其變體和產(chǎn)物還可以是基本上純化的形式，這種情況下蛋白質(zhì)、變體或產(chǎn)物將通常包含在制備物中，在所述制備物中大于90%，如95%，98%或99%的所述蛋白質(zhì)、變體或產(chǎn)物是本發(fā)明的多肽。產(chǎn)物的更多特性本發(fā)明的產(chǎn)物可以包含，并且期望其應(yīng)包含柔性接頭，所述接頭在第一組分和第二組分之間。通常這類接頭有幾個氨基酸長，比如1到20個，例如2-10個氨基酸長。這類接頭在本領(lǐng)域中是公知的，通常由主要選自甘氨酸、絲氨酸和丙氨酸的殘基組成。一個這類接頭是(Glym-Ser)n接頭，其中m和n各自獨(dú)立地是從1到4。這些接頭在本領(lǐng)域中用來使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域彼此附接。因此可以通過這樣的接頭將第一組分連接到第二組分。當(dāng)?shù)谝唤M分是C4bp結(jié)構(gòu)域而產(chǎn)物是融合蛋白的形式時(shí)，第一組分優(yōu)選在產(chǎn)物的C末端。當(dāng)C4bp結(jié)構(gòu)域在產(chǎn)物的N末端時(shí)(或者抗原沒有和C4bp以融合蛋白的形式表達(dá))，有必要為了蛋白質(zhì)的表達(dá)而并入合適的氨基酸序列。這將至少包含一個N末端的甲硫氨酸。在細(xì)菌中表達(dá)時(shí)，第二個氨基酸(在曱硫氨酸之后)期望是丙氨酸。N末端序列可以包含用于化學(xué)去除或酶促去除所述序列的全部或部分的切割位點(diǎn)。當(dāng)本發(fā)明的產(chǎn)物中抗原位于第一組分的C末端方向時(shí)，這樣的N末端區(qū)域期望不超過20個氨基酸，例如不超過10個氨基酸。抗原抗原是任何可以被抗體或T細(xì)胞受體識別的分子。然而，并非所有的抗原都是免疫原(immunogens)。免疫原是任何可以引起免疫應(yīng)答的物質(zhì)。在一個方面中，本發(fā)明可以使不是免疫原的抗原成為免疫原，使原本為弱免疫原的抗原成為更好的免疫原。本發(fā)明的一個重要特點(diǎn)是，當(dāng)抗原是通過與C4bp遺傳融合而產(chǎn)生時(shí)，非常優(yōu)選單體抗原，因?yàn)閱误w抗原不會妨礙C4bp結(jié)構(gòu)域裝配成寡聚的、因而有功能的形式。不過另一方面，抗原也可以是非單體抗原。可能特別是當(dāng)將它們化學(xué)地或非共價(jià)地偶聯(lián)到C4bp結(jié)構(gòu)域的時(shí)候。因此單體抗原可以分為兩個主要的組1)抗原是親本蛋白的片斷或者變體，所述親本蛋白在其天然狀態(tài)是多聚體(即二聚體或更高次的多聚體)，但是抗原本身在親本蛋白確實(shí)形成多聚體的條件下卻不形成多聚體。2)抗原在其天然狀態(tài)下是單體。這兩種類型抗原的實(shí)例都會在下面進(jìn)一步討論。單體抗原的共同點(diǎn)是它們都可以編碼在單獨(dú)一條DNA上，當(dāng)這個DNA融合到編碼C4bp結(jié)構(gòu)域的DNA上并且繼而翻譯成為蛋白時(shí)，抗原通過其上的獨(dú)特(unique)位點(diǎn)連接到單個C4bp結(jié)構(gòu)域鏈。這種抗原的一個筒單例子就是雞蛋白中的溶菌酶(lysozyme)。可以將編碼全長溶菌酶開放閱讀框架(叩enreadingframe)的cDNA以這樣一種方式融合到C4bp開放閱讀框架，所述融合方式不阻礙得到的融合蛋白中C4bp部分的裝配。生物合成之后，可以對融合到C4bp的單一多肽鏈進(jìn)行加工，比如使用蛋白酶，從而在多肽鏈中產(chǎn)生新的N末端和C末端。如果由蛋白水解切割產(chǎn)生的兩條或更多條鏈通過如二碌^t波此保持附4妄在一起，則在加工之后C4bp融合蛋白將有通常認(rèn)為不是單體的蛋白與之附接。但是，就本發(fā)明而言，將這類蛋白質(zhì)認(rèn)為是單體，因?yàn)樗鼈冊趩蝹€開放閱讀框架中編碼為單個融合蛋白。此類的一個例子是胰島素原，生物合成后經(jīng)加工而有兩條稱為A和B的鏈，它們通過二硫鍵相連。在對前體融合蛋白進(jìn)行蛋白水解加工后，將胰島素原的一個稱為C肽的片斷去除。單體抗原可以源自在其天然狀態(tài)不一定是單體的蛋白質(zhì)。因此可以對很多自然界中以多聚體狀態(tài)存在的抗原進(jìn)行修飾，比如通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)，從而使其成為單體。存在三個實(shí)例。這種抗原的例子是一種源自流感病毒血凝素蛋白的抗原。在其自然狀態(tài)下，公知它會形成復(fù)雜的三聚體結(jié)構(gòu)(Wilsonetal.Nature289，366-373，1981)。但是，通過除去造成分子聚合成三聚體的巻曲螺旋結(jié)構(gòu)，有可能得到單體片斷。特別的例子是由Joen和Amon的工作提供的(ViralImmunology15，165-176，2002)。這些作者僅用了血凝素的殘基96-261來得到只包含了血凝素球形區(qū)的片斷。另一個例子是癡原蟲屬裂歹直子表面蛋白1(Plasmodiummerozoitesurfaceprotein1;MSP1)。這個巨大(大約200kDa)的蛋白質(zhì)裝飾在裂殖子的表面，所述裂殖子是導(dǎo)致瘧疾感染的血液階段的因素。通常它通過C末端GPI錨著點(diǎn)固定在裂殖子的表面(GPI是糖基磷脂酰肌醇)。這種GPI錨著點(diǎn)前面是一段疏水性的氨基酸序列。由于這個錨著點(diǎn)的存在，無論全長的MSP1,還是被稱為MSP1.19的C末端片斷(在裂殖子侵入紅血球時(shí)它仍然與膜結(jié)合)在自然界都不以單體狀態(tài)存在。同樣的情況也發(fā)生在很多具有單個疏水性跨膜區(qū)(singlehydrophobictransmembraneregion)的月莫蛋白上。本發(fā)明在除去jt匕類疏7jc性序列段以后實(shí)施最佳。請參看下面對融合MSPU9蛋白和C4bp結(jié)構(gòu)域的描述。因此在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，發(fā)明的產(chǎn)物是癡原蟲(Plasmodium)MSP1抗原片斷和C4bp結(jié)構(gòu)域融合的融合物。癡原蟲屬M(fèi)SP1可能包含大約50到大約200個氨基酸，優(yōu)選大約50到大約150個氨基酸。抗原片斷可以來自任何癡原蟲屬的種，比如惡性癥原蟲(Plasmodiumfalciparum)或間日痗原蟲(Plasmodiumvivax)或卵開j癥原、蟲(Plasmodiumovale)或三日癥原蟲(Plasmodiummalariae)(以上都能夠引起人類疾病)或約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii)。雖然缺失是使本身的聚合體成為單體的最簡單的方法，但是在某些情況下，突變一個或多個氨基酸也可實(shí)現(xiàn)。這樣的例子是CpnlO蛋白質(zhì)，天然狀態(tài)下它是七聚體蛋白，就像處于其主要亞型(principalisoforms)的C4bp。CpnlO中的單氨基酸突變將其轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w突變體，從而使其適用于和C4bp結(jié)構(gòu)域的融合(Guidryetal.BMCBiochemistry4,14-26,2003)。單體化這種蛋白的一個替代方法是缺失N末端或C末端氨基酸(Llorcaetal.Biochem.BiophysicaActa1337,47-56，1997;SealeandHorowitz,J.Biol.Chem.270，30268-30270，1995)由此使負(fù)責(zé)亞基間相互作用的區(qū)域缺失。通常情況下，對于有強(qiáng)烈傾向裝配為多聚體結(jié)構(gòu)，從而破壞與其融合的C4bp結(jié)構(gòu)域裝配的蛋白質(zhì)(如病毒殼體蛋白)，缺失負(fù)責(zé)蛋白-蛋白相互作用的區(qū)域或突變界面上的殘基的原則可以用來得到單體蛋白。抗原可以分為兩類，兩類抗原均適用于本發(fā)明。第一類是外源抗原(exogenousantigens),包括感染性有機(jī)體中存在的所有分子。細(xì)菌免疫原，寄生性免疫原和病毒性免疫原可以用作多肽部分(moieties)來制造用作疫苗的多聚或異源多聚C4bp融合蛋白。這些免疫原的細(xì)菌來源包括引起細(xì)菌性肺炎，腦膜炎，霍亂，白喉，百日咳，破傷風(fēng)，結(jié)核病和麻風(fēng)病的那些細(xì)菌來源。寄生性來源的免疫原包括疾原蟲(malarialparasites),如疾原蟲屬(Plasmodium),以及4偉蟲類(trypanosomal)和矛H十曼原蟲類(leishmaniaspecies)。病毒來源包4舌痘病毒，如天花病毒，牛痘病毒和口掩病毒；皰滲病毒，如單純皰滲病毒1和2,B-病毒，水痘帶狀皰滲病毒，巨細(xì)胞病毒和EB病毒；A泉病毒,如乳腺腺病毒(mastadenovirus);乳多S病毒(papovaviruses)，如乳頭瘤病毒，例如HPV16，和多瘤病毒，例如BK和JC病毒；細(xì)小病毒，如腺病毒相關(guān)病毒；呼腸病毒(reovirus)，如呼腸病毒1、2和3;環(huán)狀病毒，如科羅拉多壁虱熱(Coloradotickfever);輪狀病毒，如人輪狀病毒；曱病毒，如東方腦炎病毒(Easternencephalitisvirus)和委內(nèi)瑞才立腦炎病毒；風(fēng)滲病毒(mbivirus),如風(fēng)滲；黃病毒，如黃熱病病毒，登革熱病毒，日本腦炎病毒，蜱傳腦炎病毒和丙型肝炎病毒；冠狀病毒，如人冠狀病毒；副粘病毒，如副流感病毒l、2、3和4，以及流行性腮腺炎；麻滲病毒(morbillivirus),如麻滲病毒(measlesvirus);肺病毒，如呼吸道合胞病毒；水泡性病毒，如水泡性口膜炎病毒；狂犬病病毒(lyssavirus)，^口狂犬病毒(rabiesvirus);正粘病毒,^口A型流感和B型流感；布尼病毒，如LaCrosse病毒；白蟲務(wù)病毒，如立夫特山谷熱病毒；納伊羅病毒(nairovirus)，如剛果出血熱病毒；嗜肝DNA病毒(hepadnaviridae),i口乙型肝炎；沙、并立病毒，長口lcm病毒,^立沙、病毒(Lassovirus)和胡寧病毒(Juninvirus);反轉(zhuǎn)錄病毒，如HTLVI,HTLVII，HIV-1和HIV-2;腸道病毒，如脊髓灰質(zhì)炎病毒l、-2和3，柯薩奇病毒，艾柯病毒，人腸道病毒，曱型肝炎病毒，戊型肝炎病毒和諾沃克病毒；鼻病毒，如人鼻病毒；以及絲狀病毒(filoviridae),如馬爾堡(病)病毒和依波拉病毒(Ebolavirus)。這些來自細(xì)菌性，病毒性和寄生性來源的抗原可以用來生產(chǎn)用作疫苗的多聚蛋白。所述多聚體可能包含帶有不同抗原的單體的混合物。可以將這些來自細(xì)菌性，病毒性和寄生性來源的抗原視為外源抗原，因?yàn)橥ǔＫ鼈儾辉谒拗黧w內(nèi)出現(xiàn)，也不由宿主基因組編碼。相反地，內(nèi)源抗原通常在宿主體內(nèi)存在或者在宿主基因組中編碼，或者既在宿主體內(nèi)出現(xiàn)又在宿主基因組中編碼。對內(nèi)源抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的能力對治療具有這一抗原的肺瘤或中和腫瘤的生長因子有用。第一類內(nèi)源抗原的例子是HER2，其是稱為赫賽汀(Herceptin)的單克隆抗體的耙。第二類，也就是生長因子類的內(nèi)源抗原的例子是促性腺激素釋放激素(稱為GnRH),它對前列腺的某些癌有營養(yǎng)作用。因此本發(fā)明的產(chǎn)物可以單獨(dú)使用或與其他抗腫瘤的治療一起使用，所述其他抗腫瘤治療如治療或預(yù)防癌癥的化療。例如，治療可以引起肺瘤在生長速率或生長量上的降低。治療還包括減少或改善不期望的癌癥癥狀?，F(xiàn)有的抗腫瘤治療包括例如化療(CT)、；故射療法(RT)和手術(shù)，以及它們的組合，還有專門化的療法，如使用血管發(fā)生抑制劑，生物療法，包括增強(qiáng)(boost)患者免疫系統(tǒng)的佐劑療法，抗體療法，疫苗療法和光動力療法?；?CT)是指使用抗癌藥物的治療方法。這個術(shù)語涵蓋了數(shù)量眾多的藥劑類型，這些藥劑類型包括基于鉑的藥物，烷化劑，抗代謝藥，抗減數(shù)分裂齊寸(anti-mioticagent)，抗微管劑，植物堿，和抗腫瘤抗生素，激酶抑制劑，蛋白酶體抑制劑，EGFR抑制劑，HER二聚體化抑制劑，VEGF抑制劑，和反義分子，并且包括抗體。這些藥物包括但不限于阿霉素(adriamycin)，苯丙氨酸氮芥(melphalan)，阿糖胞香，BiCNU，白消安(busulfan),CCNU，噴司他丁，基于鉑的藥物碳鉑(carboplatin)、順鉑(cisplatin)和奧沙利鉑(oxaliplatin)，環(huán)磷酰胺，柔紅霉素(daunorubicin)，表柔比星(epirubicin)，達(dá)卡巴噪(dacarbazine)，5-氟尿嗜啶(5-FU)，氟達(dá)拉濱(fludarabine),羥基脲(hydroxyurea),伊達(dá)比星(idarubicin)，異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)，氨曱喋呤，六曱密胺(altretamine)，光神霉素(mithramycin),絲裂霉素(mitomycin),博來霉素(bleomycin),苯丁酸氮齊(chlorambucil)，米托,蒽酉昆(mitoxantrone)，氮界，統(tǒng)u嘌呤(mercaptopurine),米托蒽醌(mitozantrone)，紫杉醇(Taxo1⑧)，長春化石威(vinblastine),長春4bl斤石威(vincristine),脫乙酰長春花石威(vindesine)，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(etoposide),雙氟去氧胞苷(gemcitabine),單克隆抗體例如Herceptin(赫賽、汀)、Rituxan、Campath⑧、Zevelin⑧和Bexxar,伊立替康(irinotecan),克^立立平(leustatin)，長春瑞濱(vinorelbine)，STI-571(Gleevac)，三苯氧胺(tamoxifen),多西紫杉醇(docetaxel)，托泊替康(topotecan),卡培他濱(capecetabine)(Xeloda),雷替曲塞(raltitrexed)，鏈脲菌素(streptozodn),替加氟聯(lián)用尿嘧啶(tegafiirwithuracil),替莫唑胺(temozolomide)，硫鳥嘌呤(thioguanine)，塞替派(thiotepa)，鬼臼毒素(podophyllotoxin)，filgristim,p卜吟姆鈉(profimersodium),來曲哇(letrozole)，氨磷汀(amifostine),阿那曲唾(anastrozole)，替莫p坐胺(temozolomide)，三氧4匕二石申(arsenictrioxide)，epithalonesA和B維生素A酸(epithalonesAandBtretinioin),白細(xì)胞介素(interleukin)(例如2和12)和干擾素，例如a和y干擾素，硼替佐米(bortezomib)，huBr-E3，Genasense，硝酸鎵(Ganite),FIT-3配體，MLN491RL，MLN2704,MLN576和MLN518?？寡苌蓜┌ǖ幌抻贐MS-275291,達(dá)肝素(Dalt印arin)(Fragmin⑧(法安明))，2-曱氧基雌二醇(2-ME)，thalodmide，CC-5013(沙利度胺(thalidomide)類似物)，maspin,考布他汀A4磷酸酯(combretastatinA4phosphate),LY317615,大豆異黃酮(染料木黃酮(genistein);大豆蛋白分離物)，AE-941(Neovastat(新伐司他)；GW786034),抗-VEGF抗體(Bevacizumab(貝伐單抗)；AvastinTM)，PTK787/ZK222584，VEGF-trap，ZD6474,EMD121974，抗-anb3整聯(lián)蛋白抗體(Medi-522;VitaxinTM),羧基酰胺三唑(carboxyamido,CAI),塞來考昔(Celebrex(西樂葆))，氫溴酸卣夫酮(halofbginonehydrobromide)(TempostatinTM),和羅非考昔(VIOXX⑧)。"化療"這個術(shù)語也包括使用例如干擾素和白細(xì)胞介素等作用劑的基因療法，即施用編碼干擾素或白細(xì)胞介素基因的載體。參見例如Helleretal.,TechnolCancerResTreat.2002;1(3):205-9。使用本發(fā)明制備的免疫原可以供研究和治療的目的使用。例如，研究用途包括對基因組序列數(shù)據(jù)中預(yù)測的基因產(chǎn)物產(chǎn)生抗血清。這項(xiàng)要求(requirement)適用于原核生物，如細(xì)菌的和包括真菌和哺乳動物在內(nèi)的真核生物的基因產(chǎn)物。抗原可以是在本領(lǐng)域中常規(guī)用于疫苗的任何大小，范圍從較短的肽到非常大的蛋白質(zhì)不等。非多肽免疫原可以是例如碳水化合物(carbohydrates)或核酸。奈瑟氏菌屬(7Ve^en'a)菌種或肺炎鏈3求菌(5Vre;tococcz^/wewwom'ae)菌種的多糖夕卜殼(coat)就是可以用作本發(fā)明目的的碳水化合物的例子。當(dāng)非多肽免疫原是本發(fā)明產(chǎn)物的一個部分時(shí)，此免疫原可以用常規(guī)的合成方法共價(jià)地附接到產(chǎn)物的第一組分上。通常免疫原可以附接到包含第一組分的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體的N末端或C末端，或者附接到氨基酸的側(cè)鏈基團(tuán)(如賴氨酸的s-氨基，或半胱氨酸的巰基)，或者它們的組合。每個融合蛋白可以添加多于一個免疫原。為了促進(jìn)偶聯(lián)，半胱氨酸殘基可以添加到C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體，例如作為N末端或C末端。本發(fā)明在產(chǎn)生免疫應(yīng)答方面有很多優(yōu)點(diǎn)。例如，多聚體的使用能夠讓多個抗原同時(shí)呈遞至免疫系統(tǒng)成為可能。這將允許制備可以對多個表位(epitope)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的多價(jià)疫苗，它可以使用在單個生物體中或多個不同的生物體中。因此，在進(jìn)一步的方面單體抗原可以是包含兩個不同表位的合成抗原，這兩個表位可以來自兩種不同的生物體或來自同一生物體的兩種不同的蛋白。后者的一個例子是子孢子抗原序列的融合物，如與MSP1序列結(jié)合的來自環(huán)子孢子蛋白的兩個或多個NANP重復(fù)序列。后者的另一個例子是Neirynck等人描述過的M2e序列和單體流感血凝素片段融合的融合物。因此，根據(jù)本發(fā)明形成的疫苗可以用于同時(shí)針對多于一種疾病的接種，或者同時(shí)耙向給定病原體上的多個表位。這些表位可以出現(xiàn)在同一單體單位上，或者出現(xiàn)在結(jié)合成異源多聚體(heteromultimer)的不同單體單位上。核酸本發(fā)明的C4bp結(jié)構(gòu)域和包含這類結(jié)構(gòu)域的產(chǎn)物(這兩種情況都包括它們的變體)可以如下產(chǎn)生在原核或真核宿主細(xì)胞中，使用編碼融合蛋白的核酸構(gòu)建體來表達(dá)該融合蛋白。當(dāng)抗原是多肽時(shí)，可以通過>^人核酸序列表達(dá)融合蛋白來生產(chǎn)本發(fā)明的產(chǎn)物。因此本發(fā)明提供編碼本發(fā)明的蛋白的核酸構(gòu)建體，通常是DNA或RNA。通常構(gòu)建體以可復(fù)制載體的形式存在，其中將編碼蛋白的序列與適合用于在宿主細(xì)胞中表達(dá)該蛋白的啟動子可操作地連接。提供的載體可以具有復(fù)制原點(diǎn)，并且任選地具有啟動子的調(diào)控子(regulator)。載體可能攜帶一個或多個可選擇的標(biāo)記基因。有許多本領(lǐng)域公知的這樣的原核和真核表達(dá)載體，而本發(fā)明可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的個人偏好(individualpreference)使用任何載體。大量原核宿主細(xì)胞可以在本發(fā)明的方法中使用。這些宿主可包括以下的菌抹埃希氏菌屬(Escherichia),假單胞菌屬(Pseudomonas)，芽孢桿菌屬(Bacillus),乳桿菌屬(Lactobacillus),嗜熱菌屬(Thermophilus)，沙門氏菌屬(Salmonella),腸桿菌科(Enterobacteriacae)或鏈霉菌屬(Streptomyces)的菌抹。例如，如果將埃希氏菌屬(generaEscherichia)的大腸桿菌在本發(fā)明的方法中使用，那么優(yōu)選使用的這種細(xì)菌的菌抹應(yīng)當(dāng)包括BL21(DE3)的衍生菌抹，包括C41(DE3)、C43(DE3)或C0214(DE3)，如W098/02559中描述和可以提供的那樣。甚至更優(yōu)選的是，當(dāng)啟動子不是T7啟動子時(shí)，可以使用這些菌抹缺少原噬菌體DE3的衍生菌抹。原核載體包括載體細(xì)菌質(zhì)粒，如源自大腸桿菌的質(zhì)粒，包括ColEI、pCRl、pBR322、pMB9和它們的衍生物；更廣范圍宿主質(zhì)粒，如RP4;噬菌體DNA，如噬菌體X的數(shù)種衍生物，例如，NM989;和其他DNA噬菌體，如M13和絲狀真菌單鏈DNA噬菌體。對這些載體和其他載體可以使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA的方法進(jìn)行操作，以將本發(fā)明的核酸引入，使其與啟動子可操作地連接。啟動子可以是可誘導(dǎo)的啟動子。適合的啟動子包括T7啟動子，tac啟動子，trp啟動子，、啟動子PL或PR以及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的啟動子。許多真核宿主細(xì)胞也可以^使用，包括例如酵母，昆蟲和哺乳動物細(xì)胞。哺乳動物細(xì)胞包括CHO和小鼠細(xì)胞，非洲綠《美(Africangreenmonkey)細(xì)胞，如COS-l,和人細(xì)胞。有許多公知的適合表達(dá)蛋白質(zhì)的真核載體?？梢詫⑦@些載體設(shè)計(jì)為以染色體插入的方式進(jìn)入真核細(xì)胞基因組，或保持在染色體外，或者僅僅是暫時(shí)保持在真核細(xì)胞中。可以將核酸可操作地連接到合適的啟動子，比如強(qiáng)力的病毒啟動子，包含CMV啟動子，和SV40T-抗原啟動子或反轉(zhuǎn)錄病毒LTR。為了得到本發(fā)明的產(chǎn)物，可以在適合表達(dá)蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)攜帶本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞，并且將所得的蛋白質(zhì)從培養(yǎng)基中的細(xì)胞中回收。細(xì)胞培養(yǎng)編碼根據(jù)本發(fā)明的融合蛋白的質(zhì)?？梢杂贸Ｒ?guī)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，并且在促進(jìn)所述融合蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞。當(dāng)使用可誘導(dǎo)的啟動子時(shí)，細(xì)胞可以先在無誘導(dǎo)物的情況下培養(yǎng)，然后一旦其生長到較高密度時(shí)，加入誘導(dǎo)物以便使蛋白質(zhì)的回收最大化。細(xì)胞培養(yǎng)條件是本領(lǐng)域公知的，并且可以參照同樣也是本領(lǐng)域公知的方法來使用這些條件。雖然W091/11461建議原核宿主細(xì)胞可以在生產(chǎn)基于C4bp的蛋白質(zhì)時(shí)使用，但是并沒有對這種生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)證明。近來，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在原核表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)的與C4bp融合的蛋白質(zhì)保持了它們的功能活性。這點(diǎn)公開在WO2004/020639中，將其內(nèi)容作為參考并入本文。這些方法可以用來生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白。從培養(yǎng)液中回收蛋白質(zhì)當(dāng)細(xì)胞生長到允許蛋白質(zhì)的產(chǎn)生時(shí)，就可以從細(xì)胞中回收蛋白質(zhì)。因?yàn)槲覀凅@奇地發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)保持水溶性，所以通?？梢岳鐚⒓?xì)胞離心(spindown)和超聲裂解，而保持蛋白質(zhì)級分可溶，并且允許該級分在進(jìn)一步的更高速離心(例如15,000rpm持續(xù)1小時(shí))之后存在于上清。我們還驚奇地發(fā)現(xiàn)C4bp結(jié)構(gòu)域的截短和/或變異可能會影響融合蛋白的溶解性。截短可以在C末端或N末端。特別是C端截短可改進(jìn)融合蛋白的溶解性。例如，實(shí)施例11顯示缺失如SEQIDNO:l所示的C4bp結(jié)構(gòu)域的最后七個C末端氨基酸可改進(jìn)融合蛋白的水溶性。在上清蛋白質(zhì)級分里的融合蛋白可以用任何適合的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)層析技術(shù)的組合來進(jìn)一步純化。我們使用了離子交換層析，凝膠過濾層析和親和層析。根據(jù)蛋白質(zhì)計(jì)劃的用途(intendeduses)，蛋白質(zhì)可以進(jìn)行進(jìn)一步的純化步驟，如透析或濃縮步驟，例如凍干，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)如融合蛋白的純化。特別是發(fā)現(xiàn)C末端可以促進(jìn)融合蛋白與純化基質(zhì)如純化柱(如鎳親和層析柱)的結(jié)合。例如，在實(shí)施例11中所示，SEQIDNO:l中C4bp結(jié)構(gòu)域的最后7個C末端氨基酸(FLEHILH)促進(jìn)融合蛋白和鎳親和柱的結(jié)合。最后7個C末端氨基酸只包含2個組氨酸。而公知的廣泛應(yīng)用的六組氨酸標(biāo)記(也叫多組氨酸標(biāo)記)包含6個連續(xù)的組氨酸，其顯示出對鎳柱的高親和性，我們顯示(并且相信是首次顯示)兩個組氨酸就足以使結(jié)合成為可能。這兩個組氨酸還可以被一些插入的氨基酸分開。插入氨基酸可以有一個，兩個或更多個。因此能夠想像SEQIDNO:l的C末端或其變體可以用作純化標(biāo)記。它可以通過如融合的方式附接到另一個蛋白質(zhì)來幫助這個蛋白質(zhì)的純化。它可以附接到蛋白質(zhì)的任何部位?？梢愿浇拥絅末端或C末端。特別地，序列FLEHILH(SEQIDNO:44)或其變體可以用作其它蛋白質(zhì)的純化標(biāo)記。FLEHILH的變體包括有一個或多個氨基酸取代、缺失或插入的多肽。變體能夠結(jié)合到鎳親和層析柱。變體的兩個組氨酸之間可以由一個，兩個，三個，四個或更多個插入氨基酸間隔開來。組合物及其用途可將本發(fā)明的蛋白質(zhì)和產(chǎn)物制備為藥物組合物的形式。產(chǎn)物會和一種或多種可藥用的載體或稀釋劑一起存在。組合物將會根據(jù)設(shè)定的產(chǎn)物的用途和給藥途徑來制備。因此本發(fā)明提供包含多聚體形式的本發(fā)明的產(chǎn)物和一種或多種可藥用的載體或稀釋劑的組合物，同時(shí)也提供這種組合物用在治療或預(yù)防人或動物受試者的免疫療法中的用途。些，所述施用方式包括口服，直腸，鼻，局部(topical)(包括口腔(buccal)和舌下)，陰道或胃腸外(包括皮下，肌內(nèi)，靜脈內(nèi)，真皮內(nèi)，鞘內(nèi)和硬膜外)。制劑可以方便地制備為單位劑型(unitdosageform)，可以用制藥學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法進(jìn)行制備。例如，制藥學(xué)上可以施用的液體組合物可以如下制備將本發(fā)明的融合蛋白和任選的藥劑學(xué)佐劑在載體中進(jìn)行溶解、分散等，所述載體例如水、鹽水、葡萄糖水溶液、甘油、乙醇等，由此形成溶液或懸液。如果需要，待施用的組合物可以輔以pH緩沖劑等物質(zhì)。實(shí)際制備這些劑型的方法在本領(lǐng)域技術(shù)人員中是公知的，或者應(yīng)該是顯而易見的；例如，參見Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton，Pennsylvania,19thEdition,1995。本發(fā)明的組合物可能額外包含一種或多種佐劑，如礦物鹽，如氫氧化鋁或磷酸鉤，或者細(xì)胞因子(cytokines)如IL-12或GM-CSF。SinghandO，Hagan,NatureBiotechnology,17,1075-1081，1999中的表1給出了更全面的合適佐劑的列表，將其公開的內(nèi)容并入本文作為參考。依據(jù)本發(fā)明的產(chǎn)物，期望的是以組合物或制劑形式的產(chǎn)物，可以通過對人或動物受試者施用所述產(chǎn)物或其組合物，而將其使用在本文描述的治療方法中。醫(yī)師將根據(jù)病人和治療情況來決定可有效緩解待治療受試者的癥狀的劑量。劑型或組合物含有的有效成分在2.5-95%之間，剩余部分再輔以無毒載體，由此進(jìn)行制備。胃腸外施用的特征通常在于注射，為皮下注射、肌肉內(nèi)注射或靜脈內(nèi)注射。注射劑(injectables)可以方便地制備為常規(guī)形式，如溶液或懸液；制備為固體形式，其適合于在注射之前溶解或懸浮在液體中；或制備為乳劑(emulsions)。適合的賦形劑有例如水，鹽水，葡萄糖(dextrose),甘油，乙醇等。一項(xiàng)最新發(fā)明的胃腸外施用方法應(yīng)用了緩釋或持續(xù)釋放(sustained-release)系統(tǒng)的植入，因此可以保持恒定水平的劑量。參見實(shí)例美國專利3，710，795。產(chǎn)物的劑量決定于抗原的性質(zhì)，也會參照目前施用在常規(guī)疫苗劑型中的該抗原的實(shí)踐來決定。坤皮動免疫在進(jìn)一步的方面，本發(fā)明提供用含有抗體的免疫血清來被動免疫受試者的方法，所述抗體是通過對宿主受試者接種本發(fā)明的產(chǎn)物的方式得到的。宿主受試者可以是人或非人哺乳動物。因此，在進(jìn)一步的方面中，本發(fā)明提供通過此方法得到的免疫血清，以及這種免疫血清在治療人體或動物體的方法中的用途。DNA疫苗在另一個方面，本發(fā)明提供真核表達(dá)載體，所述載體包含編碼用來治療人體或動物體的本發(fā)明融合蛋白產(chǎn)物的核酸序列。效果。核酸的遞送可以使用質(zhì)粒載體("棵露的(naked)"形式或配方的(formulated)形式)或重組表達(dá)載體來實(shí)現(xiàn)。對于DNA疫苗接種綜述，參見AdaG.andRamshawI，inExpertOpinioninEmergingDrugs8,27-35，2003?？梢杂迷诨蜻f送中的多種病毒載體包括腺病毒，皰滲病毒，痘苗病毒或RNA病毒如反轉(zhuǎn)錄病毒。反轉(zhuǎn)錄載體可以是鼠科動物(murine)或鳥類反轉(zhuǎn)錄病毒。單個外來基因可以插入的反轉(zhuǎn)錄病毒載體的實(shí)例包括但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurineleukaemiavirus)(MoMuLV)、。合維鼠肉瘤病毒(Harveymurinesarcomavirus)(HaMuSV)、鼠乳腺癌病毒(murinemammarytumourvirus)(MuMTV)和勞斯肉瘤病毒(RousSarcomaVirus)(RSV)。當(dāng)受試者是人時(shí)，可以使用如長臂猿白血病病毒(gibbonapeleukaemiavirus)(GaLV)等作為載體。載體將包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列，特別是足以指導(dǎo)RNA合成起始的啟動子區(qū)域。適用的真核啟動子包括小鼠金屬>5克蛋白I基因的啟動子(HamerWfl/.,1982,J.Molec.Appl.Genet.1:273)，皰滲病毒的TK啟動子(McKnight,1982，Cell31:355),SV40早期啟動子(Benoist"a/.,1981，Nature290:304)，勞斯肉瘤病毒啟動子(Gorman"a/.，1982,Proc.Natl.Acad,Sci.USA79:6777)，和巨細(xì)胞病毒啟動子(Foecking"a/.，1980,Gene45:101)。論是將載體作為質(zhì)粒載體還是作為病毒載體的一部分來施用。對于直接或間接施用，質(zhì)粒DNA可以是"棵露的"，或配以陽離子和中性的脂質(zhì)(脂質(zhì)體(liposomes)),或是微膠嚢化的(microencapsulated)。DNA序列也可以包含在病毒(如腺病毒，反轉(zhuǎn)錄病毒，皰滲病毒和痘病毒)載體中用于直接或間接遞送。遞送途徑包括但不限于口服、肌肉內(nèi)、真皮內(nèi)(Sato,Y.Wa/.，1996,Science273:352-354)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、吸入、陰道內(nèi)滴注(Bagarazzida/.,1997，JMed.Primatol.26:27)、直腸內(nèi)、月中瘤內(nèi)(intratumour)或腹膜內(nèi)。因此本發(fā)明包括此處描述的作為藥物組合物的載體，所述藥物組合物用于允許用DNA載體轉(zhuǎn)染某些細(xì)胞，從而將使治療多肽得到表達(dá)，具有治療效果，即誘導(dǎo)對抗原的免疫應(yīng)答。本發(fā)明的藥物組合物是通過使用溶劑、載體(carrier),遞送體系、賦形劑，以及添加劑或輔助劑，將本發(fā)明的構(gòu)建體(construct)制備為適合對受試者施用的形式來制備。經(jīng)常使用的溶劑包括無菌水和鹽水(緩沖的或無緩沖的)。一種載體包括金顆粒，其通過生物射彈遞送(即在一定氣壓下)。其他經(jīng)常使用的載體或遞送系統(tǒng)包括陽離子脂質(zhì)體，蝸形劑(cochleates)和微膠嚢(microcapsules),其可以作為液體溶液給予，可以包埋在遞送膠嚢中，或者可以并入食物中。用于施用基因遞送載體的一種可供選擇的形式包括脂質(zhì)體。脂質(zhì)體的膠嚢化提供用于施用多核苷酸和表達(dá)載體的一種可供選擇的劑型。脂質(zhì)體是由脂質(zhì)雙層包圍的一個或多個含水小室組成的微小嚢泡。概括而言，參見Bakker-Woudenbergefa/,1993，Eur,J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl.1):S61，andKim，1993，Drugs46:618。在組成上，脂質(zhì)體類似于細(xì)胞膜，因此脂質(zhì)體可以安全地施用，并且是生物可降解的。根據(jù)制備方法，脂質(zhì)體可以是單層或多層的，而且脂質(zhì)體直徑大小從0.02[iM到超過10pM不等。請參見例如Machya/.,1987，LIPOSOMESINCELLBIOLOGYANDPHARMACOLOGY(JohnLibbey),andOstroWa/,，1989,AmericanJ.Hosp.Pharm.4G:15了&通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，可以將表達(dá)載體包裹在脂質(zhì)體里。多種不同的脂質(zhì)體組合物與合成方法已經(jīng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。參見例如美國專利4,844,904、美國專利5,000,959、美國專利4,863,740、美國專利5,589,466、美國專利5,580，859，和美國專利4,975,282，將它們在此處并入作為參考。通常情況下，施用的脂質(zhì)體包裹的載體的劑量根據(jù)如下因素的不同而不同如患者的年齡，體重，身高，性別，綜合醫(yī)療狀況(generalmedicalcondition)和先前醫(yī)療史。特定劑型的劑量范圍可以經(jīng)由合適的模式動物來決定。本發(fā)明將通過以下實(shí)施例進(jìn)行闡述。實(shí)施例1雞C4bp寡聚化(oligomerisation)結(jié)構(gòu)域的克隆和表達(dá)編碼雞C4bp寡聚化(oligomerisation)結(jié)構(gòu)域的DNA片段是利用如下的寡聚核苷酸引物從雞基因組DNA中擴(kuò)增的(內(nèi)切酶位點(diǎn)用下劃線標(biāo)出)oAVD469:5，GGGGGGATCCAAGAAGCAAGGTGATGCTGATGTGTGCGG3,(SEQIDNO:15)和oAVD470:5，GGGGGAATTCTTATTAGTGCAGAATGTGCTCCAGGAACTC3，(SEQIDNO:16)并且將它作為質(zhì)粒載體上位于翻譯增強(qiáng)子序列和T7啟動子下游的BamHI/EcoRI片4史克隆，由此制備質(zhì)粒pAVD259。SEQIDNO:17為該質(zhì)粒表達(dá)的蛋白AVD259的序列，而SEQIDNO:18為編碼該蛋白的核苦酸序列SEQIDNO:17:AVD259蛋白MALKKHHENEISHHGSKKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTEDVKTLLEIRKLFLE耶LKVELQGLSKEFLEHILHSEQIDNO:18:編碼AVD259蛋白的DNA序列ACTGAGCAAGGAGTTCCTGGAGCACATTCTGCACTAA實(shí)施例2AVD259蛋白的純化和表征表達(dá)將編碼雞C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒pAVD259在大腸桿菌菌株C41(DE3)中表達(dá)。將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在LB培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)至OD600大約為0.6，然后用終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將培養(yǎng)物繼續(xù)在37。C培養(yǎng)4個小時(shí)后，用離心的方式收獲培養(yǎng)物。AVD259蛋白質(zhì)的純化從1升C41(DE3)細(xì)胞中純化蛋白AVD259。將細(xì)胞在含有20mMTrispH8.0的緩沖液中超聲裂解后，全部蛋白質(zhì)都存在于可溶級分中。將離心后的上清加樣至^^親和柱。親和柱純化將柱子用20mMTrispH8.0平衡(緩沖液A)。將蛋白質(zhì)用緩沖液B(緩沖液A加上300mMNaCl和300mM。米峻)洗出。凝膠過濾柱(Superdex20026/60制備等級(prepgrade))用20mM，pH8.0的Tris緩沖溶液來平衡Superdex20026/60柱，將來自親和柱的濃縮AVD259蛋白加到Superdex20026/60柱上。以200ml的體積洗脫蛋白質(zhì)。確定生物物理特征可以通過在存在和缺失還原劑p-巰基乙醇(BME)的條件下比較蛋白質(zhì)在SDS-PAGE凝膠上的特性，來檢查C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域融合蛋白的寡聚狀態(tài)。圖3顯示了新鮮純化的AVD259蛋白質(zhì)的特性，此蛋白經(jīng)快速純化(少于48小時(shí))，因此暴露在空氣中時(shí)自動發(fā)生的二碌^鍵的形成還不完全。(二碌b鍵在細(xì)菌細(xì)胞溶膠的還原性環(huán)境中不會形成)。每條膠道(lane)l含有3|ig,每條膠道2含有5昭，每條膠道3含有8pg。在P-巰基乙醇(標(biāo)為+Pme)的存在下，蛋白質(zhì)全部作為單體存在，表觀大小約為8kDa。沒有(3-巰基乙醇(標(biāo)為-pme)存在時(shí)，單體、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體和七聚體的條帶都清晰可見。實(shí)施例3約氏疾原蟲(Plasmodiumvoelii)MSP1.19-雞C4bp融合蛋白(AVD262)的表達(dá)為了測試把雞C4bp寡聚體結(jié)構(gòu)域和抗原融合的效果，將來自約氏疾原蟲的MSP1.19抗原與雞C4bp寡聚體結(jié)構(gòu)域融合。這一實(shí)驗(yàn)是用來自pAVD259的BamHI-EcoRI片段(在實(shí)施例1中描述)來代替質(zhì)粒pAVD108中編碼鼠C4bp蛋白的BamHI-EcoRI片段而實(shí)現(xiàn)的，由此構(gòu)建了質(zhì)粒pAVD262。質(zhì)粒pAVD108在先前的PCT/IB2004/002717的實(shí)施例4中已經(jīng)描述。被稱為AVD262的融合蛋白在細(xì)菌菌抹C41(DE3)中表達(dá)，并且從中純化。將純化過的融合蛋白在不添加任何佐劑的情況下用來免疫小鼠、兔和雞。編碼AVD262融合蛋白的核香酸序列為如下的SEQIDNO:19:CTGCACTAA由這個構(gòu)建體編碼的融合蛋白AVD262的氨基酸序列為如下的SEQIDNO:20:MRSHIAS工AL麗LNKSGLVGEGESKKILAKML麗DGMDLLGVDPKHVCVDTRD工PKNAGCFRDDNGTEEWRCLLGYKKGEGNTCVEN麗PTCDI麗GGCDPTASC，AESTENSKKIICTCKEPTPNAYYEGVFCSSSGSKKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTEDVKTLLEIRKLFLEIQKLKVELQGLSKEFLEH工此序列的殘基4-138對應(yīng)于約氏疾原蟲MSP1的殘基1619-1753，此序列的殘基141-202對應(yīng)于雞C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域的62個殘基。兩個部分之間是一個GS接頭序列。表達(dá)將編碼約氏癡原蟲-雞C4bp寡聚體結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒在大腸桿菌菌抹C41(DE3)中表達(dá)。將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在LB培養(yǎng)基中在37。C培養(yǎng)至OD600約為0.6，然后用終濃度0.5mM的IPTG來誘導(dǎo)表達(dá)，將培養(yǎng)物在37。C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后通過離心收獲。AVD262融合蛋白的純化從一升C41(DE3)細(xì)胞中純化蛋白AVD262。在含有20mMMESpH6.5、5mMEDTA和蛋白酶抑制劑混合物(acocktailofproteaseinhibitors)(Roche)的緩沖液中，全部融合蛋白均出現(xiàn)在細(xì)胞超聲裂解后的可溶性級分里。將離心后的上清加樣至HitrapS柱。陽離子柱(HiTrapS)將柱子用20mMMESpH6.5、5mMEDTA緩沖液(緩沖液A)來平衡。將蛋白質(zhì)用從緩沖液A到B(緩沖液A加1MNaCl)的10倍于柱體積的梯度洗出。將含有AVD262的HiTrapS級分用Millipore濃縮器(截留值30K)濃縮，其后上樣至凝膠過濾柱，之前在終體積為10ml的含有50mMTrispH8和8M尿素的緩沖液中過夜變性。存在尿素的第一凝皎過濾柱(Superdex20026/60制備等級)將Superdex20026/60柱用20mMTris緩沖液8.0、150mMNaCl和8M尿素來平衡，將來自HiTrapS級分的濃縮AVD262蛋白隨后上樣至Superdex20026/60柱。洗出蛋白的體積為186毫升，將其上樣至在PBS中平衡的第二Superdex20026/60柱。第二凝膠過濾柱(S叩erdex20026/60制備等級)將來自第一Superdex20026/60柱的濃縮AVD262蛋白上柱。將蛋白(不再為變性的)以164毫升的體積洗出，對AVD108蛋白進(jìn)行一樣的處理。確定生物物理特征可以通過在存在和缺失還原劑p-巰基乙醇(BME)的條件下比較AVD262蛋白在SDS-PAGE凝膠上的特性，來檢查AVD262蛋白的寡聚狀態(tài)。如圖4所示，在無BME時(shí)(亞基內(nèi)二硫鍵在暴露到空氣中子后已經(jīng)形成)，AVD262蛋白的表觀大小約為140kDa;而當(dāng)有BME存在時(shí)，將AVD262蛋白還原，該蛋白質(zhì)運(yùn)行出的表觀大小僅比20kDa稍大(因?yàn)槎蜴I在細(xì)菌溶膠的還原性環(huán)境中無法形成)。在圖4中，每個膠道l含有2.5jag純化的蛋白，每個膠道2含有5jug。可以清楚地看到在BME的存在下(標(biāo)有+(3me的膠道)蛋白質(zhì)以稍大于20kDa表觀大小的單體運(yùn)行。無(3-巰基乙醇存在時(shí)(標(biāo)記為-卩me)蛋白質(zhì)以大約140kDa的七聚體運(yùn)行。實(shí)施例4小鼠的免疫將純化的AVD262蛋白用來免疫三只BALB/c小鼠。未使用佐劑，并且蛋白質(zhì)存'在于緩沖的等滲的鹽水溶液中。每次注射使用40微克(2納摩爾)蛋白質(zhì)。每只小鼠皮下注射兩次，之間間隔4周(也就是在第O和第29天)。將三只BALB/c小鼠用40微克(也是2納摩爾)AVD108蛋白進(jìn)行免疫，AVD108蛋白與AVD262相同，但是具有鼠C4bpC-末端54個氨基酸。每只小鼠在第O和第29天皮下注射兩次。最后，將三只小鼠接受在弗氏佐劑中的40微克AVD108(對于第0天的第一次注射使用完全弗氏佐劑，對于第29天的第二次注射使用不完全弗氏佐劑)。在第43天，取所有小鼠的血液，并且針對重組約氏癡原蟲抗原測量它們的抗體效價(jià)。僅注射了AVD108的小鼠抗體效價(jià)為25，600或51,200。接受弗氏佐劑中的AVD108蛋白的小鼠抗體效價(jià)為102,400，與接受了無佐劑的AVD262蛋白的小鼠相同。實(shí)施例5兔的免疫將純化的AVD262蛋白用來免疫三只新西蘭白(NZW)兔。免疫時(shí)間表如下每只兔子接受三次注射，每次間隔兩周(換句話說，在第0，14和28天注射)。每次皮下注射100微克(或4.5納摩爾)蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)在緩沖的等滲鹽水溶液中，且不添加任何已知的佐劑。作為平行對照，將三只NZW兔根據(jù)同樣的時(shí)間表用20納摩爾AVD263蛋白免疫。AVD263蛋白和AVD262蛋白除C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域不同外其余都相同，即用兔的C4bp代替了雞的C4bp寡聚化。它的氨基酸序列SEQIDNO:21^口下戶斤示KMALEVYKLSLEIEIAEiLQRDKARKSSVLRQL在第35天，從每只動物都抽取血液，并用ELISA測量針對重組約氏疾原蟲抗原的抗體效價(jià)。結(jié)果如下接種了AVD262蛋白的兔的抗體效價(jià)為25,600,而接種了AVD263蛋白的抗體效價(jià)為6,400。這一結(jié)果是驚人的，因?yàn)锳VD262蛋白的用量比注射的AVD263蛋白要少。實(shí)施例6雞的免疫將純化的AVD262蛋白用來免疫三只雞。免疫時(shí)間表如下每只雞接受三次注射，每次間隔十天(換句話說，在第0，10和20天)。每次皮下注射含有132微克(或6納摩爾)的蛋白，蛋白在緩沖的等滲鹽水溶液中，不添加任何已知的佐劑。作為平行對照，根據(jù)相同的時(shí)間表，對三只雞用6納摩爾AVD108蛋白來進(jìn)行免疫。在第35天，/人每只動物抽取血液，并用ELISA測量針對重組約氏癥原蟲抗原的抗體效價(jià)。結(jié)果如下接種了AVD262蛋白的雞具有400的抗體效價(jià)，而接種了AVD108的雞的抗體效價(jià)為1,600。實(shí)施例7針對C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域的抗體效價(jià)對用AVD108和AVD262蛋白免疫過的小鼠和雞，都進(jìn)行抗鼠和雞C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域的抗體效價(jià)測試。用AVD108蛋白免疫過的小鼠通過ELISA測量的抗重組小鼠C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域的抗體效價(jià)為1600,但是卻不能檢測到抗重組AVD259蛋白的抗體效價(jià)(在免疫前和第43天的效價(jià)之間無差異)。AVD262蛋白免疫過的小鼠在第43天時(shí)抗鼠C4bp結(jié)構(gòu)域的效價(jià)為O(即免疫前和第43天的血清之間無差異)，但這些小鼠在第43天時(shí)抗AVD259蛋白的效價(jià)為12,800。這說明用非哺乳動物C4bp結(jié)構(gòu)域融合蛋白免疫的小鼠不產(chǎn)生抗內(nèi)源鼠C4bp結(jié)構(gòu)域的抗體，而用鼠C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域來免疫小鼠的確會誘導(dǎo)抗內(nèi)源結(jié)構(gòu)域的抗體。用同樣的兩種蛋白(AVD108和AVD262)免疫的雞顯示了互補(bǔ)的結(jié)果。即用AVD262蛋白免疫的雞具有102,000的抗AVD259蛋白的抗體效價(jià)，但抗鼠C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域的效價(jià)卻為0。不過用AVD108蛋白免疫的雞沒有可檢測到的抗AVD259蛋白的抗體，而抗鼠C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域的抗體效價(jià)為800。在免疫前血清中無法檢測到抗鼠結(jié)構(gòu)域的抗體。實(shí)施例8另一個非哺乳動物C4bp序列的分離利用NCBI^是供的非連續(xù)性兆級blast(discontinuousmegablast)程序(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/tracemb.shtml)，使用編碼雞C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列(圖1所示)來搜索斑胸草雀(Taeniopygiaguttata)的不完全基因組DNA序列。找到了幾個編碼斑胸草雀C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域的痕跡序列(tracesequence),所述痕跡序列包含完全相同的153個核苷酸的序列。斑胸草雀C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域的核酸序列SEQIDNO:22如下所示斑胸草雀C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列SEQIDNO:23如下所示:斑胸草雀C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域和雞C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域的比對(alignment)顯示只有48%的比對氨基酸殘基是相同的(以粗體強(qiáng)調(diào))。因此，即使在不成熟的(raw)DNA序列數(shù)據(jù)庫中，用雞的DNA序列來鑒定同源的C4bp寡聚化結(jié)構(gòu)域是可行的。變體〇DKKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTEDVKTLLEIRKLFLEI斑胸草雀MKEGDGDVCQEVHY工KSTFECGVPVEEVK工LLEIQKLLLEI變體ODQKIiKVEIiQGLSKEFLEHILH*斑胸草雀NKIiEMEIiEN*實(shí)施例9雞C4bp結(jié)構(gòu)域的截短突變體的活性證明實(shí)施例3中描述的AVD262蛋白是通過缺失最后7個C末端氨基酸得到的。使用以下寡核苷酸引物通過PCR來擴(kuò)增編碼C4bp結(jié)構(gòu)域截短版本的基因(SEQIDN〇24)T7F:TAATACGACTCACTATAGGG(SEQIDNO:25)PCR產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI消化，并重新克隆到pAVD262載體上的相同位點(diǎn)之間，由此形成質(zhì)粒pAVD317。此構(gòu)建體編碼的蛋白AVD317的氨基酸序列是SEQIDNO:26，如下MRSHIASIAL麗LNKSGLVGEGESKKILAKMLNMDGMDLLGVDPKHVCVDTRDIPKNAGCFRDDNGTEEWRCLLGYKKGEGNTCVEN麗PTCDI麗GGCDPTASCQNAESTENSKKIICTCKEPTPNAYYEGVFCSSSGSKKQGDADVCGEVAY工QSVVSDCHVPTEDVKTLLEIRKLFLE工QKLKVELQGLSKE使用用于蛋白AVD262的純化流程來純化AVD317蛋白。使用與實(shí)施例4中相同的免疫時(shí)間表來免疫小鼠，即對三只BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，且不添加任何佐劑。純化的蛋白在緩沖的等滲鹽水溶液中。每次注射使用2納摩爾蛋白質(zhì)，每只小鼠皮下注射兩次，每次間隔4周(換句話說即在第0天和第29天)。在第43天從所有小鼠抽取血液，并用ELISA測量它們抗重組約氏癡原蟲抗原的抗體效價(jià)。注射了不含任何佐劑的AVD317的小鼠抗體效價(jià)為104,000，表明截短并沒有減弱雞C4bp結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性。實(shí)施例10實(shí)施例9的截短突變體使不溶性融合蛋白變?yōu)榭扇苄缘鞍譇VD290和AVD291是通過將GnRH(促性腺激素釋》文激素)分別和所述結(jié)構(gòu)域的長形式或短形式進(jìn)行融合而得到的。AVD290是通過下列2個寡核苦酸的退火來制備oAVD607:5fTATGGAACATTGGAGCTATGGCCTGCGTCCGGGCG3'(SEQIDN〇27)oAVD608:5'GATCCGCCCGGACGCAGGCCATAGCTCCAATGTTCCA3'(SEQIDNO:28〉將退火的寡核苷酸克隆到pAVD262質(zhì)粒的Ndel和BamHI位點(diǎn)之間。將同樣的2個寡核苷酸克隆到pAVD317質(zhì)粒的NdeI和BamHI位點(diǎn)之間，形成pAVD291質(zhì)粒。編碼AVD2卯融合蛋白的核香酸序列SEQIDNO:29所示如下TGCACTAA由此構(gòu)建體編碼的AVD290融合蛋白的氨基酸序列SEQIDNO:30所示如下ME麗SYGLRPGGSKKQGDADVCGEVAYIQSVVSDCHVPTEDVKTLLEIRKLFLEIQKLKVELQGLSKEFLEHILH編碼AVD291融合蛋白的核苷酸序列SEQIDNO:31所示如下CAAAAACTGAAGGTGGAATTGCAAGGACTGAGCAAGGAGTAA由此構(gòu)建體編碼的AVD291融合蛋白的氨基酸序列SEQIDNO:32所示如下MEHWSYGLRPGGSKKQGDADVCGEVAY工QSVVSDCHVPTEDVKTLLEIRKLFLEIQKLKVELQGLSKE當(dāng)AVD290蛋白的表達(dá)在菌林C41(DE3)中誘導(dǎo)時(shí)，發(fā)現(xiàn)大于90%的表達(dá)產(chǎn)物不溶，使用的誘導(dǎo)條件如下當(dāng)OD600達(dá)到0.5時(shí)，加入0.5mMIPTG,繼續(xù)溫育3小時(shí)后收獲細(xì)菌。將細(xì)菌通過用Emulsiflex儀器破壞來裂解。在相同的誘導(dǎo)條件下，AVD291蛋白是可溶的。甚至在將裂解細(xì)菌的提取物在75。C加熱15分鐘后，AVD291蛋白仍然保持可溶，而此條件導(dǎo)致大部分細(xì)菌蛋白質(zhì)不溶。這些結(jié)果說明缺失雞結(jié)構(gòu)域的最后7個氨基酸會劇烈地改變?nèi)诤系鞍椎娜芙庑浴Ｒ虼?，純化被大大簡化了。純化中的最后步驟是通過在20mMTrisHCl、pH7.0緩沖液中的DEAE上的離子交換層析(洗脫時(shí)使用鹽濃度梯度，10倍柱體積的含有1MNaCl的相同緩沖溶液)和在SuperdexS7526/60柱上的大小排阻凝膠層析來進(jìn)行的。實(shí)施例11未截短的雞C4bp結(jié)構(gòu)域的C末端促進(jìn)蛋白質(zhì)純化如前面實(shí)施例所討i侖的，AVD262和AVD317蛋白的不同之處僅在于有無C末端處的7個氨基酸。將AVD262蛋白用它所結(jié)合的鎳親和層析柱(來自GE的Ni-NTA)來純化，并且能夠通過在結(jié)合用的緩沖液中加入咪唑來將AVD262蛋白從該柱洗脫。AVD317在相同條件下不與柱子結(jié)合。表達(dá)AVD262蛋白的細(xì)菌在僅含有10mMTrisHClpH7.0的緩沖液中裂解，并且通過在SorvallS34轉(zhuǎn)子中以10,000rpm離心將不溶性材料除去。向新的上清中加入NaCl至終濃度為300mM,將溶液與Ni-NTA在4。C溫育1小時(shí)。然后將全部溶液倒入柱子，先用含有50mMNaP04、300mMNaCl和0.1%TritonX-100,pH7.5的溶液洗滌，然后用不含Triton-XlOO的同樣的緩沖溶液來洗滌。將AVD262蛋白用含有200mM咪唑，150mMNaClpH8.0的溶液洗脫。實(shí)施例12與雞C4bp結(jié)構(gòu)域的融合使內(nèi)源抗原具有高免疫原性當(dāng)GnRH與截短的結(jié)構(gòu)域融合后(AVD291),通過用AVD291蛋白免疫小鼠來測試GnRH的免疫原性。將三只BALB/c小鼠用2納摩爾的AVD291蛋白來免疫。每只小鼠在第0天和第29天皮下注射兩次。所有小鼠在第43天抽血，并測定它們抗重組蛋白的抗體效價(jià)，此融合蛋白是通過把GnRH抗原融合到谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)蛋白的C末端而得到的。兩只小鼠的抗體效價(jià)為5,120，而第三只的抗體效價(jià)為10,240。另外的三只小鼠根據(jù)相同的免疫方案接種了AVD291蛋白，但第一次注射的AVD291蛋白包含在完全弗氏佐劑中，而第二次注射的AVD291蛋白包含在不完全弗氏佐劑中，這三只小鼠的抗體效價(jià)分別是5，120，10,240和20,480。此結(jié)果說明與截短的雞C4bp結(jié)構(gòu)域的融合使GnRH非常有免疫原性，而且可通過添加佐劑進(jìn)一步增加免疫原性。實(shí)施例13連續(xù)4個氨基酸的突變不會削弱雞C4bp結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性將pAVD317質(zhì)粒用Stratagene的含有PfbUltra的定點(diǎn)誘變試劑盒和以下的兩個寡核苷酸來突變CGAAAACTC(SEQIDNO:33)GGCAATCGG(SEQIDNO:34)。編碼AVD313融合蛋白的核香酸序列SEQIDNO:35所示如下此構(gòu)建體編碼的融合蛋白AVD313的氨基酸序列SEQIDNO:36所示如下MRSHIAS工AL麗LNKSGLVGEGESKKILAKML腿DGMDLLGVDPKHVCVDTRDIPKNAGCFRDDNGTEEWRCELGYKKGEGNTCVEN麗PTCDI麗GGCDPTASCQNAESTENSKKIICTCKEPTPNAYYEGVFCSSSGSKKQGDADVCGEVAYIQSWSDCHVPTAELRTLLEIRKLFLEIQKLKVELQGLSKE使用與AVD262蛋白所用的相同緩沖液和柱子來純化AVD313蛋白。將六只BALB/c小鼠用2納摩爾的AVD313蛋白進(jìn)行免疫。每只小鼠在第0天和第29天皮下注射兩次。將所有小鼠在第43天取血，并且測量它們抗重組約氏疾原蟲抗原的抗體效l介。所有僅注射了AVD313的小鼠的抗體效價(jià)為204,000,說明雞C4bp結(jié)構(gòu)域的截短和突變沒有減弱其生物活性。與AVD317相比，AVD313中的四個氨基酸改變以下劃線標(biāo)注在SEQIDNO:36所示的AVD313的氨基酸序列中。AVD313融合蛋白中的修飾過的雞C4bp結(jié)構(gòu)域與人C4bp結(jié)構(gòu)域相比具有小于20%的同一性，因此修飾過的雞C4bp結(jié)構(gòu)域在人的免疫中高度優(yōu)選，因?yàn)樗鹋c人C4bp交叉反應(yīng)的抗體的可能性4艮小。實(shí)施例14CRES結(jié)構(gòu)域共有雞C4bp結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性我們檢測了CRES結(jié)構(gòu)域(圖1所示)是否也使抗原的免疫原性增加。圖1所示的CRES結(jié)構(gòu)域具有氨基酸序列如下SEQIDNO37:WWP使用如下兩種寡核苷酸引物從雞的基因組DNA中擴(kuò)增編碼CRES結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列AGG(SEQ工DNO:38)oAVD468:GGGGGAATTCTTATTACGGCCACCAGCGGCCTCCTTTGGC(SEQIDNO:39)將PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI消化，再克隆到pAVD262載體中的相同位點(diǎn)之間，從而形成質(zhì)粒pAVD314。編碼AVD314融合蛋白的核苷酸序列是SEQIDNO:40，如下AGCTGGGAGCCAAAGGAGGCCGCTGGTGGCCGTAATAAGAATTC由此構(gòu)建體編碼的融合蛋白AVD314的氨基酸序列是SEQIDNO:41，如下MRSHIAS工AL麗LNKSGLVGEGESKK工LAKML麗DGMDLLGVDPKHVCVDTRD工PKNAGCFRDDNGTEEWRCLLGYKKGEGNTCVE麗NPTCDI麗GGCDPTASCQNAESTENSKK工ICTCKEPTPNAYYEGVFCSSSGSKTFYVRKKIDQIKETFDCGLPLAELRTLLEVQKLYLEIQKLEKELGAKGGRWWP使用與AVD262蛋白所用相同的緩沖液和柱子來純化AVD314蛋白。將三只BALB/c小鼠用2納摩爾AVD314蛋白來免疫。每只小鼠在第0天和第29天皮下注射兩次。所有小鼠在第43天抽血，并且測量它們抗重組約氏癡原蟲抗原的抗體效價(jià)。所有僅注射了AVD314的小鼠的抗體效價(jià)為51,200，與之對比的是注射了AVD262蛋白的小鼠的抗體效價(jià)為204,000。這說明CRES結(jié)構(gòu)域像雞C4bp結(jié)構(gòu)域一樣有生物學(xué)活性，并能顯著地增強(qiáng)抗原的免疫原性。權(quán)利要求1.以基本上分離的形式存在的SEQIDNO:1的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體。2.根據(jù)權(quán)利要求1的C4bp結(jié)構(gòu)域，其由SEQIDNO:l的殘基1-62組成。3.根據(jù)權(quán)利要求1的C4bp結(jié)構(gòu)域，其中所述變體是SEQIDNO:l中至少48個連續(xù)氨基酸的片段。4.根據(jù)權(quán)利要求1的C4bp結(jié)構(gòu)域，其中所述變體與SEQIDNO:l具有至少70%氨基酸序列同一性。5.根據(jù)權(quán)利要求1或4的C4bp結(jié)構(gòu)域，其中所述變體包含N末端缺失1-8個氨基酸的SEQIDNO:l。6.根據(jù)權(quán)利要求1、4或5的C4bp結(jié)構(gòu)域，其中所述變體包含C末端缺失1-8個氨基酸的SEQIDNO:l。7.根據(jù)權(quán)利要求6的C4bp結(jié)構(gòu)域，其中所述變體具有SEQIDNO:42所示的氨基酸序列。8.根據(jù)權(quán)利要求1或3-6中任一項(xiàng)的C4bp結(jié)構(gòu)域，其中所述變體包含1-8個氨基酸取代。9.根據(jù)權(quán)利要求6或8的C4bp結(jié)構(gòu)域，其中所述變體具有SEQIDNO:43所示的氨基酸序列。10.根據(jù)權(quán)利要求1、3-6或8中任一項(xiàng)的C4bp結(jié)構(gòu)域，其中所述變體含有SEQIDNO:l中的下列氨基酸殘基Cys22,Leu33,Glu34，Lys37,Leu38,Leu40，Glu41,11e42和Leu45。11.以基本上分離的形式存在的SEQIDNO:23的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體。12.根據(jù)權(quán)利要求11的C4bp結(jié)構(gòu)域，其中所述變體與SEQIDNO:23具有至少70%氨基酸序列同一性。13.根據(jù)權(quán)利要求11或12的C4bp結(jié)構(gòu)域，其中所述變體包含N末端缺失1-8個氨基酸的SEQIDNO:23。14.根據(jù)權(quán)利要求11或12的C4bp結(jié)構(gòu)域，其中所述變體包含C末端缺失1-8個氨基酸的SEQIDNO:23。15.根據(jù)權(quán)利要求11-14中任一項(xiàng)的C4bp結(jié)構(gòu)域，其中所述變體包含1-8個氨基酸取代。16.產(chǎn)物，其包含非哺乳動物C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體；和抗原。17.根據(jù)權(quán)利要求16的產(chǎn)物，其中所述C4bp結(jié)構(gòu)域是SEQIDNO:l的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體。18.根據(jù)權(quán)利要求17的產(chǎn)物，其中所述結(jié)構(gòu)域是如權(quán)利要求2-10任一項(xiàng)中所定義的。19.根據(jù)權(quán)利要求11的產(chǎn)物，其中所述C4bp結(jié)構(gòu)域是SEQIDNO:23的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體。20.根據(jù)權(quán)利要求19的產(chǎn)物，其中所述結(jié)構(gòu)域是權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)中所定義的。21.根據(jù)權(quán)利要求11的產(chǎn)物，其中所述C4bp結(jié)構(gòu)域包含如SEQIDNO:37所示的CRES(雞的補(bǔ)體調(diào)節(jié)性分泌蛋白)結(jié)構(gòu)域,或其變體。22.根據(jù)權(quán)利要求21的產(chǎn)物，其中所述變體與SEQIDNO:37具有至少70%氨基酸序列同一性。23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的產(chǎn)物，其中所述變體包含N末端缺失1-8個氨基酸的SEQIDNO:37。24.根據(jù)權(quán)利要求23的產(chǎn)物，其中所述變體含有N末端缺失4個氨基酸的SEQIDNO:37。25.根據(jù)權(quán)利要求21或22的產(chǎn)物，其中所述變體包含C末端缺失1-8個氨基酸的SEQIDNO:37。26.根據(jù)權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的產(chǎn)物，其中所述變體包含l-8個氨基酸取代。27.根據(jù)權(quán)利要求16-26中任一項(xiàng)的產(chǎn)物，其中所述抗原與所述C4bp結(jié)構(gòu)域的N末端或C末端融合。28.根據(jù)權(quán)利要求27的產(chǎn)物，其中所述融合是通過柔性接頭。29.根據(jù)權(quán)利要求16-28中任一項(xiàng)的產(chǎn)物，其中所述抗原是癡原蟲屬裂殖子表面蛋白1的單體抗原性片段。30.根據(jù)權(quán)利要求16-28中任一項(xiàng)的產(chǎn)物，其中所述抗原是流感病毒血凝素蛋白或流感M2e肽的單體抗原性片段。31.根據(jù)權(quán)利要求16-28中任一項(xiàng)的產(chǎn)物，其中所述抗原是人體內(nèi)源性的。32.根據(jù)權(quán)利要求31的產(chǎn)物，其中所述抗原促進(jìn)腫瘤生長。33.根據(jù)權(quán)利要求32的產(chǎn)物，其中所述抗原是促性腺激素釋放激素(GnRH)。34.組合物，其含有前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)所述的產(chǎn)物和可藥用的稀釋劑、載體或佐劑。35.根據(jù)權(quán)利要求16-33中任一項(xiàng)的產(chǎn)物或權(quán)利要求34中所述的組合物在治療人體或動物體的方法中的用途。36.瘧疾的免疫治療方法，包括對個體施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求29的產(chǎn)物。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述個體被疰原蟲所感染。38.權(quán)利要求36的方法，其用于預(yù)防性接種。39.根據(jù)權(quán)利要求29的產(chǎn)物，其用來治療或預(yù)防疾疾。40.根據(jù)權(quán)利要求29的產(chǎn)物在生產(chǎn)治療或預(yù)防癡疾的藥物中的用途。41.生產(chǎn)抗瘧原蟲屬寄生物的抗體的方法，所述方法包括將權(quán)利要求29的產(chǎn)物引入非人哺乳動物，和從所述哺乳動物收集免疫血清。42.針對受試者疾病的被動免疫方法，所述方法包括對所述受試者施用含有抗體的免疫血清，所述免疫血清通過用權(quán)利要求16-33中任一項(xiàng)的產(chǎn)物接種宿主受試者獲得。43.在人受試者中被動免疫治療疾疾的方法，所述方法包括對所述人施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求41生產(chǎn)的免疫血清。44.根據(jù)權(quán)利要求41中的方法得到的免疫血清，用于在人受試者中免疫治療癡疾的方法。45.流感的免疫治療方法，包括對個體施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求30的產(chǎn)物。46.權(quán)利要求45的方法，其中所述個體被流感病毒感染。47.權(quán)利要求45的方法，其用于預(yù)防性接種。48.根據(jù)權(quán)利要求30的產(chǎn)物，其用以治療或預(yù)防流感。49.根據(jù)權(quán)利要求30的產(chǎn)物在生產(chǎn)治療或預(yù)防流感的藥物中的用途。50.生產(chǎn)抗流感抗體的方法，所述方法包括將權(quán)利要求30的產(chǎn)物引入非人哺乳動物，和從所述哺乳動物收集免疫血清。51.在人受試者中被動免疫治療流感的方法，所述方法包括對所述人施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求50生產(chǎn)的免疫血清。52.通過權(quán)利要求50的方法得到的免疫血清，用于在人受試者中免疫治療流感的方法。53.生產(chǎn)抑制腫瘤生長的抗體的方法，所述方法包括將權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)的產(chǎn)物引入非人哺乳動物，和從所述哺乳動物收集免疫血清。54.制備包含以下組分的產(chǎn)物的方法作為第一組分的非哺乳動物C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體；和作為第二組分的多肽或非多肽抗原，所述方法包括表達(dá)編碼第一組分的核酸，結(jié)合所述第一組分和第二組分，和回收產(chǎn)物。55.制備包含下列組分的融合物的產(chǎn)物的方法作為第一組分的非哺乳動物C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體；和作為第二組分的多肽抗原，所述方法包括表達(dá)編碼融合物的核酸，和回收產(chǎn)物。56.權(quán)利要求54或55的方法，其中核酸在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)。57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中將融合蛋白以多聚體形式回收。58.增加抗原免疫原性的方法，所述方法包括將所述抗原與非哺乳動物C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體結(jié)合。59.權(quán)利要求54-58中任一項(xiàng)的方法，其中所述C4bp結(jié)構(gòu)域是如權(quán)利要求1-10的任一項(xiàng)中定義的SEQIDNO:l的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體。60.權(quán)利要求54-58中任一項(xiàng)的方法，其中所述C4bp結(jié)構(gòu)域是SEQIDNO:23的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體。61.權(quán)利要求54-58中任一項(xiàng)的方法，其中所述C4bp結(jié)構(gòu)域包含如SEQIDNO:37中所示的CRES結(jié)構(gòu)域或其變體。62.權(quán)利要求54-61中任一項(xiàng)的方法，其中抗原是人體內(nèi)源性的。63.權(quán)利要求62的方法，其中所述抗原促進(jìn)腫瘤生長。64.權(quán)利要求63的方法，其中所述抗原是GnRH。65.表達(dá)載體，其含有編碼如下組分的融合蛋白的核酸序列非哺乳動物C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體；和多肽抗原，所述核酸序列與在宿主細(xì)胞中有功能的啟動子可操作地連接。66.權(quán)利要求65的表達(dá)載體，其中所述C4bp結(jié)構(gòu)域是如權(quán)利要求1-15的任一項(xiàng)中所定義的。67.權(quán)利要求65或66的表達(dá)載體，其中所述抗原是如權(quán)利要求27-33的任一項(xiàng)中所定義的。68.用權(quán)利要求65-67中任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌宿主細(xì)胞。69.用權(quán)利要求65-67中任一項(xiàng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞。70.權(quán)利要求65-67中任一項(xiàng)的表達(dá)載體，用于治療人體或動物體的方法。71.純化含有氨基酸序列FLEHILH或其變體的多肽的方法，所述方法包括下列步驟i)提供所述的多肽，單獨(dú)提供或與其他組分混合提供，ii)在所述氨基酸序列與鎳親和層析柱結(jié)合的條件下將所述多肽和柱接觸，iii)洗滌結(jié)合部件以去除任何未結(jié)合的組分，和iv)從所述結(jié)合部件洗脫多肽。72.權(quán)利要求71的方法，其中將所述氨基酸序列FLEHILH或其變體置于所述多肽的C末端。73.權(quán)利要求71或72的方法，其中所述變體包含2個組氨酸。74.權(quán)利要求71-73的方法，其中所述多肽是融合蛋白。75.權(quán)利要求71-74中任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽或融合蛋白包含如SEQIDN0:1中所示的C4bp結(jié)構(gòu)域或其變體。76.純化蛋白的肽標(biāo)記，所述肽標(biāo)記包含氨基酸序列FLEHILH或其變體。77.根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)的產(chǎn)物用來治療或預(yù)防癌癥。78.根據(jù)權(quán)利要求31-33中任一項(xiàng)的產(chǎn)物用于生產(chǎn)治療或預(yù)防癌癥的藥物中的用途。79.根據(jù)權(quán)利要求77或權(quán)利要求78的產(chǎn)物或產(chǎn)物的用途，其中所述治療是與附加的抗腫瘤治療組合實(shí)施的。80.根據(jù)權(quán)利要求79的產(chǎn)物或產(chǎn)物的用途，其中所述的附加的抗腫瘤治療是化療。81.根據(jù)權(quán)利要求77-80的產(chǎn)物或產(chǎn)物的用途，其中所述抗原與所述C4bp結(jié)構(gòu)域的N末端或C末端融合。全文摘要本發(fā)明涉及包含C4bp結(jié)構(gòu)域和抗原的產(chǎn)物，所述C4bp結(jié)構(gòu)域?yàn)榉遣溉閯游飦碓吹腃4bp結(jié)構(gòu)域，特別是SEQIDNO1、SEQIDNO23或SEQIDNO37的C4bp結(jié)構(gòu)域，或者是其變體。在理想狀態(tài)下產(chǎn)物是融合蛋白的形式。也對SEQIDNO1和SEQIDNO23的雞C4bp結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了描述?？乖▎误w抗原，如瘧疾和流感抗原。C4bp結(jié)構(gòu)域提供給抗原的多聚體復(fù)合物或其混合物的裝配。這些復(fù)合物可以用作疫苗。文檔編號C07K19/00GK101384617SQ200680052074公開日2009年3月11日申請日期2006年11月29日優(yōu)先權(quán)日2005年11月30日發(fā)明者勞倫斯·杜蒙,讓-巴普蒂斯特·馬錢德,費(fèi)加爾·希爾申請人:艾馬克西奧公司