專利名稱：：牛樟芝的環(huán)己烯酮萃取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明是關(guān)于一種新穎化合物，尤其是關(guān)于一種由牛樟芝(Antrodiacamphomta)萃取物中所分離純化的化合物及其在抑制腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用。技術(shù)背景牛樟芝(Antrodiacamphorata)，又稱樟芝、牛樟燕、紅樟、紅樟芝、樟菰或樟窟內(nèi)菰等，為臺(tái)灣特有種真菌，只生長于臺(tái)灣山區(qū)海拔4502000公尺間的牛樟樹(CinnamoumkanehiraiHay)的中空腐朽心材內(nèi)壁上，因此是由樹干內(nèi)面生長出子實(shí)體。牛樟樹目前主要分布于桃園、南投等山區(qū)，由于牛樟樹是臺(tái)灣數(shù)量極為稀少的保育類樹種，加上人為的盜伐，使得寄生于其中方能生長的野生牛樟芝數(shù)量更形稀少，且由于其生長相當(dāng)緩慢，生長期也僅在六月至十月之間，因此價(jià)格非常昂貴。牛樟芝的子實(shí)體為多年生，無柄，呈木栓質(zhì)至木質(zhì)，其外形多變，有板狀、鐘狀、馬蹄狀或塔狀。初時(shí)為扁平型，貼生于木材表面，之后其前緣會(huì)略為巻曲翹起，而呈板塊狀(層紋板狀)或如鐘乳石狀。牛樟芝頂部表面呈褐色至黑褐色，具不明顯的皺紋，有光澤，邊緣平而鈍，其腹面則為橘紅色或局部黃色，并有許多細(xì)孔。此外，牛樟芝具有強(qiáng)烈的黃樟香氣，其曬干后褪色成土黃白色，味極苦，民間將其用作解毒、保肝、抗癌的草藥。牛樟芝如同一般食藥用的蕈菇類，具有許多復(fù)雜的成分，己知的生理活性成分中，包括多醣體(polysaccharides,如卩-萄聚醣)、三萜類化合物(triterpenoids)、超氧歧化酶(superoxidedismutase，SOD)、腺苷(adenosine)、蛋白質(zhì)(含免疫球蛋白)、維生素(如維生素B、煙堿酸)、微量元素(如鈣、磷及鍺等)、核酸、凝集素、胺基酸、固醇類、木質(zhì)素以及血壓穩(wěn)定物質(zhì)(如aiitodiaacid)等，這些生理活性成分被認(rèn)為具有抗腫瘤、增加免疫能力、抗過敏、抑制血小板凝集、抗病毒、抗細(xì)菌、抗高血壓、降血糖、降膽固醇以及保護(hù)肝臟等功能。牛樟芝眾多成分中以三萜類化合物被研究的最多，三萜類化合物是由三十個(gè)碳元素結(jié)合成六角形或五角形天然化合物的總稱，牛樟芝所具的苦味即主要來自三萜類此成分。1995年時(shí)，Chemg等人發(fā)現(xiàn)牛樟芝子實(shí)體萃取物中含有三種新的以麥角甾垸(ergostane)為骨架的三萜類化合物antcinA、antcinB與antcinC(Chemg,I.H.,andChiang,H.C.1995.ThreenewtriterpenoidsfromAntrodiacinnamomea.J.Nat.Prod.58:365-371)。Chen等人以乙醇萃取樟芝子實(shí)體后發(fā)現(xiàn)zhankuicacidA、zhankuicacidB及zhankuicacidC等三禾中三砲類化合物(Chen，C.H.,andYang,S.W.1995.NewsteroidacidsfromAntrodiacinnamomea,-afUngusparasiticonCinnamomummicranthum.J.Nat.Prod.58:1655-1661)。此外，Chiang等人于1995年也由子實(shí)體萃取物中發(fā)現(xiàn)另外三種分別為倍半萜內(nèi)酯(sesquiterpenelactone)與兩種雙酚類衍生物的新三萜類化合物，此即antrocin，4，7-二甲氧基-5-甲基-1,3-苯并二氧環(huán)(4,7-(1^6化(《7-5-methy-l，3-benzodioxole)與2，2'，5，5'-四甲氧基-3，4,3'，4'-雙-亞甲二氧基-6,6'-二甲基聯(lián)苯(2，2'，5，5'-teramethoxy-3,4,3'，4'-bi-methylenedioxy-6，6'-dimethylbiphenyl)(Chiang,H.C.，Wu，D.P.，Chemg,I.W"andUeng,C.H.1995.Asesquiterpenelactone,phenylandbiphenylcompoundsfromAntrodiacinnamomea.Phytochemistry.39:613-616)。到了1996年，Chemg等人以同樣分析方法再度發(fā)現(xiàn)四種新的三萜類化合物antcinE、antcinF、methylantcinateG、methylantcinateH(Chemg,I.H.，Wu，D.P"andChiang,H.C.1996.TriteroenoidsfromAntrodiacinnamomea.Phytochemistry.41:263-267);而Yang等人則發(fā)現(xiàn)了二種以麥角甾烷為骨架的新化合物AankuicacidD、zhankuicacidE和三種以羊毛甾烷(lanostane)為骨架的新化合物15a-乙酰-去氫硫色多孑L菌酸(15a-acetyl-dehydrosulphurenicacid)、去氫齒孑L酸(dehydroeburicoicacid)與去水硫色多孑L菌酸(dehydrasulphurenicacid)(Yang,S.W"Shen，YC.，andChen，C.H.1996.SteroidsandtriterpenoidsofAntrodiacinnamomea—afbngusparasiticonCinnamomummicranthum.Phytochemistry.41:1389-1392)。雖然由目前諸多實(shí)驗(yàn)可得知牛樟芝萃取物具有抑癌的功效(如前述Chen(1995)),但究為何種有效成分可達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞效果的研究，目前則仍處于試驗(yàn)階段，并未有具體的有效成分發(fā)表，故若能將該萃取物進(jìn)一步純化分析，找出其真正有效抑癌成分，對于人類癌癥的治療實(shí)將產(chǎn)生莫大的幫助。
發(fā)明內(nèi)容為明了牛樟芝萃取物中究竟是何成分具有抑癌的效果，本發(fā)明由牛樟芝萃取物中分離純化出具有式(1)結(jié)構(gòu)式的新穎化合物其中，X是氧(0)或硫(S)，Y是氧或硫；R,是氫基(H)、甲基(CH3)或(CEb)m-CH3，R2是氫基、甲基或(CH2)m-CH3，R3是氫基、甲基或(CH2)nrCH3，m=l12;n=l12。如式(1)結(jié)構(gòu)式的化合物中，較佳者為如下所示式(2)的化合物式(2)的化合物，其化學(xué)名為4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(4-hydroxy-2,3-dimethoxy-6-methy-5-(3，7，11-trimethyl—dodeca-2，G，10-trknyl)-cyGlohex國2隱enone)，^f《力C24H38C)4，外觀為淡黃色粉末狀，分子量為390。本發(fā)明中式(1)、式(2)的化合物是分離純化自牛樟芝水萃取物或有機(jī)溶劑萃取物，有機(jī)溶劑可包括醇類(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、垸類(例如己垸)或鹵烷(例如氯甲烷、氯乙垸)，但并不以此為限，其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。借由前述化合物，本發(fā)明是將其應(yīng)用在抑制腫瘤細(xì)胞生長上，使能進(jìn)一步應(yīng)用于治療癌癥的醫(yī)藥組成份中，增益癌癥的治療效果。本發(fā)明化合物的應(yīng)用的范圍包括對于乳癌腫瘤細(xì)胞、肝癌腫瘤細(xì)胞與攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞等細(xì)胞的生長產(chǎn)生抑制效果，使該等腫瘤細(xì)胞無法迅速生長，進(jìn)而抑制腫瘤的增生，延緩腫瘤的惡化，因此，可進(jìn)一步利用于乳癌、肝癌與攝護(hù)腺癌等癌癥的治療。另一方面，本發(fā)明中也可將式(1)或/與式(2)的化合物利用于治療乳癌、肝癌與攝護(hù)腺癌等醫(yī)藥組成物的成分中，借以抑制該等腫瘤細(xì)胞的生長。前述醫(yī)藥組成物除包括有效劑量的式(1)或/與式(2)的化合物外，尚可包括藥學(xué)上可接受的載體。載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或淀粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑或甜味劑，但并未僅限于此。本發(fā)明醫(yī)藥組成物可依一般已知藥學(xué)的制備方法生產(chǎn)制造，將式(1)或/與式(2)有效成分劑量與一種以上的載體相混合，制備出所需的劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠囊或其它液體制劑，但未以此為限。此外，由于本發(fā)明中的化合物同時(shí)具有抗氧化活性，因此亦可將其添加于保健食品、飲食品、醫(yī)藥品、化妝品當(dāng)中，借由其抗氧化能力達(dá)到預(yù)防心血管疾病或避免細(xì)胞突變等效用，使助益于施用人體的健康。以下將配合圖式進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)施方式，下述所列舉的實(shí)施例是用以闡明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何熟悉該技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許修改與改進(jìn)，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該視后附的權(quán)利要求書所限定為準(zhǔn)。實(shí)施方式首先取牛樟芝(Antrodiacamphorata)菌絲體、子實(shí)體或二者的混合物，利用已知的萃取方式，以水或有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，借以取得牛樟芝水萃取物或有機(jī)溶劑萃取物。其中，有機(jī)溶劑可包括醇類(例如甲醇、乙醇或丙醇)、酯類(例如乙酸乙酯)、烷類(例如己烷)或鹵垸(例如氯甲垸、氯乙垸)，但并不以此為限。其中較佳者為醇類，更佳者為乙醇。經(jīng)萃取過后的牛樟芝水萃取物或有機(jī)溶劑萃取物，可進(jìn)一步借由高效液相層析加以分離純化，之后再對每一分液(fraction)進(jìn)行抑癌效果的測試。最后，則針對具抑癌效果的分液進(jìn)行成分分析，將可能產(chǎn)生抑癌效果的成分再分別進(jìn)一步做不同癌癥腫瘤細(xì)胞的抑制效果測試。最終即發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中如式(1)/式(2)的化合物是具有抑制不同癌癥腫瘤細(xì)胞生長的效果，且該化合物經(jīng)與已知文獻(xiàn)對比，并未曾在牛樟芝中發(fā)現(xiàn)，因此是新穎的化合物。為方便說明本發(fā)明，以下將以式(2)的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5G，7,ll-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物進(jìn)行說明。此外，為證實(shí)4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5G,7，ll-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物對腫瘤細(xì)胞生的抑制效果，本發(fā)明中是以MTT分析法，根據(jù)美國國家癌癥研究所(NationalCancerInstitute,NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，對包括乳癌、肝癌與攝護(hù)腺癌等腫瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞存活率的測試。由這些測試證實(shí)，4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5G，7,ll-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對于乳癌腫瘤細(xì)胞(包括MCF-7與MDA-MB-231)、肝癌腫瘤細(xì)胞(包括Hep3B與HepG2)與攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞(包括LNCaP與DU-145)等都可降低其存活率，相對之下并可同時(shí)降低生長半抑制率所需濃度(即IC5()值)，因此得借由4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮，應(yīng)用于包括乳癌、肝癌與攝護(hù)腺癌等腫瘤細(xì)胞的生長抑制上，而進(jìn)一步可利用于乳癌、肝癌與攝護(hù)腺癌等癌癥的治療。現(xiàn)對前述實(shí)施方式詳盡說明如下實(shí)施例l:4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮的分離將100克左右的牛樟芝菌絲體、子實(shí)體或二者的混合物，置入三角錐形瓶中，加入適當(dāng)比例的水與醇類(70%~100%醇類水溶液)，在2025。C下攪拌萃取至少l小時(shí)以上，之后以濾紙及0.45pm濾膜過濾，收集萃取液。將前述收集的牛樟芝萃取液，利用高效能液相層析儀(HighPerformanceLiquidchromatography),以RPl8的層析管(column)進(jìn)行分析，并以甲醇(A)及0.1。/。0.5。/。醋酸水溶液(B)做為移動(dòng)相(mobilephase)(其溶液比例是(MO分鐘，B比例為95。/。20。/。；10~20分鐘，B比例為20°/。~10%;2035分鐘，B比例為10%~10%;35~40分鐘，B比例為10%~95%)，在每分鐘1ml的速度下沖提，同時(shí)以紫外-可見光全波長偵測器分析。將25分鐘至30分鐘的沖提液收集濃縮即可得淡黃色粉末狀的固體產(chǎn)物，此即4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮。經(jīng)分析，其分子式為C24H3804，分子量390，熔點(diǎn)(m.p.)為48°C52°C。核磁共振(NMR)分析值則如下所示'H-NMR(CDCl3)S(ppm):1.51、1.67、1.71、1.75、1.94、2.03、2.07、2.22、2.25、3.68、4.05、5.07與5.14。13C-NMR(CDC13)S(ppm):12.31、16.1、16.12、17.67、25.67、26.44、26.74、27.00、39.71、39.81、4.027、43.34、59.22、60.59、120,97、123.84、124.30、131.32、135.35、135.92、138.05、160.45與197.12。經(jīng)將4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5G，7，ll-三甲基-2,6,10沖二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮與化學(xué)式數(shù)據(jù)庫對比后，并未發(fā)現(xiàn)與前述相同的化合物結(jié)構(gòu)，因此，此化合物是一新穎且前所未見的化合物。實(shí)施例2:體外抗乳癌腫瘤細(xì)胞的活性測試為進(jìn)一步測試實(shí)施例1中所發(fā)現(xiàn)化合物對腫瘤細(xì)胞的抑制效果，本實(shí)施例將根據(jù)美國國家癌癥研究所(NationalCancerInstitute,NCI)抗腫瘤藥物篩檢模式，首先取實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物，加入MCF-7與MDA-MB-231人類腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中，進(jìn)行腫瘤細(xì)胞存活性的測試。細(xì)胞存活性的測試可采用已知的MTT分析法進(jìn)行分析，而MCF-7與MDA-MB-231都是人類的乳癌腫瘤細(xì)胞系。MTT分析法是一種常見用于分析細(xì)胞增生(cellproliferation)、存活率(percentofviablecells)以及細(xì)胞毒性(cytotoxicity)的分析方法。其中，MTT(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]2，5-diphenyltetrazoliumbromide)為一黃色染劑，它可被活細(xì)胞吸收并被粒腺體中的琥珀酸四唑還原酶(succinatetetrazoliumreductase)還原成不溶水性且呈藍(lán)紫色的formazan，因此借由formazan形成與否，即可判斷并計(jì)算細(xì)胞的存活率。首先將人類乳癌細(xì)胞MCF-7與MDA-MB-231分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)。將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于1，200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)。測試時(shí)，分別于每一孔內(nèi)加入30、10、3、1、0.3、0.1與0.03pg/ml牛樟芝乙醇萃取物(對照組，未經(jīng)純化分離的總萃取物)以及4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)，于37°C、5%(302下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下于每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT，反應(yīng)4小時(shí)后再于每一孔內(nèi)加入100^1的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酵素免疫分析儀在570nm吸光波長下測定其吸光值，借以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其生長半抑制率所需濃度(B卩IC5o值)，其結(jié)果如表一所示。表一體外對乳癌腫瘤細(xì)胞存活率的測試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>由表一中可知，借由4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮的作用，其對于MCF-7人類乳癌腫瘤細(xì)胞的IC5o值為0.852pg/ml，對于MDA-MB-231人類乳癌腫瘤細(xì)胞的ICso值則為1.031Hg/ml，相較于牛樟芝萃取混合物所測得的IC5o值是低的多，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠利用于乳癌腫瘤細(xì)胞生長的抑制。實(shí)施例3:體外對乳癌腫瘤細(xì)胞輔助治療的活性測試本測試同樣是根據(jù)美國國家癌癥研究所的體外篩檢模式進(jìn)行測試。首先，取人類乳癌細(xì)胞MCF-7與MDA-MB-231，分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后，將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于l，200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮。測試前，先加入0.0017pg/ml紫杉醇(Taxd)處理細(xì)胞72小時(shí)，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)，之后分別于每孔內(nèi)加入Oiag/ml(對照組)，30、10、3、1、0.3、0.1與0.03嗎/ml實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)，于37。C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下于每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT，反應(yīng)4小時(shí)后于每一孔內(nèi)加入lOOpl的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酵素免疫分析儀在570nm吸光波長下測定其吸光值，借以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其生長半抑制所需濃度(即ICso值)，其結(jié)果如表二所示。表二體外對乳癌腫瘤細(xì)胞經(jīng)紫杉醇輔助治療后抑制的測試結(jié)果測試樣品結(jié)果對照組細(xì)胞存活率(％)MCF-7(0.0017pg/mlTaxol)65±1MDA-MB-231(0.0017pg/mlTaxol)76±3試驗(yàn)組IC50(ng/ml)MCF-7(0.0017pg/mlTaxol+式2)0.009MDA-MB-231(0.0017|ig/mlTaxol+式2)0.011由表二中可知，透過紫杉醇的協(xié)同作用，4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對于MCF-7人類乳癌腫瘤細(xì)胞的ICso值降為0.009ng/ml，對于MDA-MB-231人類乳癌腫瘤細(xì)胞的IC50值也降為約0.011pg/ml，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠利用于乳癌腫瘤細(xì)胞生長的抑制，且在紫杉醇的協(xié)同作用下，有更佳的抑制效果。實(shí)施例4:體外抗肝癌腫瘤細(xì)胞的活性測試本測試也是根據(jù)美國國家癌癥研究所抗腫瘤藥物篩檢模式進(jìn)行，將實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2，6,10沖二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物，加入Hep3B與HepG2人類肝癌腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，借以進(jìn)行腫瘤細(xì)胞存活性的測試。首先將人類肝癌細(xì)胞Hep3B與HepG2分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)。將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于l，200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)。測試時(shí)，分別于每一孔內(nèi)加入30、10、3、1、0.3、0.1與0.03pg/ml的牛樟芝乙醇萃取物(對照組，未經(jīng)純化分離的總萃取物)以及30、10、3、1、0.3、0.1與0.03^lg/ml的4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，ll-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)，于37。C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下于每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT，反應(yīng)4小時(shí)后再于每一孔內(nèi)加入lOOpl的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酵素免疫分析儀在570nm吸光波長下測定其吸光值，借以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其IC50值，其結(jié)果如表三所示。_表三體外對肝癌腫瘤細(xì)胞抑制的測試結(jié)果_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>由表三中可知，借由4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮的作用，其對于Hep3B人類肝癌腫瘤細(xì)胞的IC50值降為0.005pg/ml，對于HepG2人類肝癌腫瘤細(xì)胞的1(:5()值則降為1.679pg/ml，相較于牛樟芝萃取混合物所測得的IC5o值是低的多，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中的4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2,6，10沖二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠利用于肝癌腫瘤細(xì)胞生長的抑制。實(shí)施例5:體外對肝癌腫瘤細(xì)胞輔助治療的活性測試本測試同樣是根據(jù)美國國家癌癥研究所的體外篩檢模式進(jìn)行測試。首先，取人類肝癌細(xì)胞Hep3B與HepG2，分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后，將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理5.12118.631細(xì)胞，隨后于l，200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮。測試前，先于Hep3B細(xì)胞株試驗(yàn)加入0.0043pg/ml的Lovastatin，而于HepG2細(xì)胞株試驗(yàn)加入0.0017ng/ml紫杉醇(Taxol)，處理細(xì)胞72小時(shí)，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)，之后分別于每孔內(nèi)加入Opg/ml(對照組)，30、10、3、1、0.3、0.1與0聊g/ml實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)，于37。C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下于每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT，反應(yīng)4小時(shí)后于每一孔內(nèi)加入10(^1的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酵素免疫分析儀在570nrn吸光波長下測定其吸光值，借以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其IC50值，其結(jié)果如表四所示。表四體外對肝癌腫瘤細(xì)胞經(jīng)紫杉醇輔助治療后抑制的測試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>由表四中可知，透過Lovastatin及紫杉醇的協(xié)同作用，4-羥基-2，3-二甲氧基_6_甲基_5(3，7,11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對于Hep3B人類肝癌腫瘤細(xì)胞的ICso值降為0.002pg/ml，對于HepG2人類肝癌腫瘤細(xì)胞的IC5o值也降為約0.008嗎/ml，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中的4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2，6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠利用于肝癌腫瘤細(xì)胞生長的抑制，且在紫杉醇的協(xié)同作用下，有更佳的抑制效果。實(shí)施例6:體外抗攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞的活性測試本測試也是根據(jù)美國國家癌癥研究所抗腫瘤藥物篩檢模式進(jìn)行，將實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮化合物，加入LNCaP與DU-145人類攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，借以進(jìn)行腫瘤細(xì)胞存活性的測試。首先將人類攝護(hù)腺癌細(xì)胞LNCaP與DU-145分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)。將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于1，200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)。測試時(shí)，分別于每一孔內(nèi)加入30、10、3、1與0.3|iig/ml牛樟芝乙醇萃取物(對照組，未經(jīng)純化分離的總萃取物)以及30、10、3、1與0.3pg/ml由實(shí)施例l所分離的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5G，7，ll-三甲基-2,6，10沖二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)，于37X:、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下于每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT，反應(yīng)4小時(shí)后再于每一孔內(nèi)加入10(^1的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酵素免疫分析儀在570nm吸光波長下測定其吸光值，借以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其IC50值，其結(jié)果如表五所示。表五體外對攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞抑制的測試結(jié)果測試樣品IC5。(pg/ml)對照組(加入牛樟芝萃取物)LNCaP11.491DU-14541.392試驗(yàn)組(加入式2)LNCaP2.378DU隱1451.812由表五中可知，借由4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮的作用，其對于LNCaP人類攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞的IQo值降為2.378pg/ml，對于DU-145人類攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞的1<35()值則降為1.812pg/ml，相較于牛樟芝萃取混合物所測得的IC5。值是低的多，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中的4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7,11-三甲基-2,6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠利用于攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長的抑制。實(shí)施例7:體外對攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞輔助治療的活性測試本測試同樣是根據(jù)美國國家癌癥研究所的體外篩檢模式進(jìn)行測試。首先，取人類攝護(hù)腺癌細(xì)胞LNCaP與DU-145，分別于含有胎牛血清的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時(shí)后，將增生后的細(xì)胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA處理細(xì)胞，隨后于l，200rpm下離心5分鐘，將細(xì)胞沉淀并丟棄上清液。之后加入10ml的新培養(yǎng)液，輕微搖晃使細(xì)胞再次懸浮。測試前，先于LNCaP細(xì)胞株試驗(yàn)加入0.0017ng/ml紫杉醇，而于DU-145胞株試驗(yàn)加入0.0043pg/ml紫杉醇分別處理細(xì)胞72小時(shí)，再將細(xì)胞分置于96孔微量盤內(nèi)，之后分別于每孔內(nèi)加入Opg/ml(對照組)，30、10、3、1、0.3、0.1與0.03|ig/ml于實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，'6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)，于37"C、5%C02下培養(yǎng)48小時(shí)。其后，于避光的環(huán)境下于每一孔內(nèi)加入2.5mg/ml的MTT，反應(yīng)4小時(shí)后于每一孔內(nèi)加入的lysisbuffer終止反應(yīng)。最后以酵素免疫分析儀在570nrn吸光波長下測定其吸光值，借以計(jì)算細(xì)胞的存活率，并推算出其IC5。值，其結(jié)果如表六所示。表六體外對攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞經(jīng)紫杉醇輔助治療后抑制的測試結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>由表六中可知，透過紫杉醇的協(xié)同作用，4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2,6,10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮對于LNCaP人類攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞的IQo值降為0.961|ig/ml，對于DU-145人類攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞的IC50值也降為約0.515pg/ml，相較于牛樟芝萃取混合物所測得的ICs。值是低的多，因此可證實(shí)牛樟芝萃取物中的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮確實(shí)能夠利用于攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長的抑制，且在紫杉醇的協(xié)同作用下，有更佳的抑制效果。實(shí)施例8:體外抗氧化活性的試驗(yàn)一般抗氧化活性的測試，是利用人類低密度脂蛋白(humanlowdensitylipoprotein,LDL)，加入銅離子(Cu2+)與待測樣本進(jìn)行氧化反應(yīng)，檢測LDL上二烯的反應(yīng)結(jié)果后，以維生素E的水溶性類似物Trolox作為對照(Trolox濃度為2(aM時(shí)，其效力值定為標(biāo)準(zhǔn)值l.O)，計(jì)算出待測樣本的抗氧化活性。首先準(zhǔn)備二次純水(控制組)，并配制5mM磷酸鈉緩沖溶液(sodiumphosphatebuffer,SPB)、lpM與2nM的Trolox(對照組)及40|ig/ml由實(shí)施例1中所分離的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2，6,10沖二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(試驗(yàn)組)。利用酵素法測得低密度膽固醇濃度(LDL-C)后，利用5mM的SPB將LDL稀釋至0.10~0.25mg/ml間。取96孔的石英微量盤，于其中先加入lOOpl的LDL，再分別加入前述預(yù)定濃度的Trolox及由實(shí)施例1中所分離的化合物，之后再分別加入CuSO4溶液以啟動(dòng)氧化反應(yīng)(每250)al孔中的銅(II)濃度為5.0pM)，最后將該微量盤置于酵素免疫微量盤分析儀(ELISAreader)中進(jìn)行檢測。酵素免疫微量盤分析儀檢測波長設(shè)為232nm，溫度設(shè)為37。C，監(jiān)測時(shí)間為12小時(shí)，釆樣間隔時(shí)間為15分鐘，其結(jié)果如表七所示。表七體外抗氧化活性的測試結(jié)果測試樣品Tlag(分)ATlag(分)效力值H20(控制組，Tlago)1851pMTrolox(對照組)266810.482|jMTrolox3441591.0040—1式24392081.30注1:Tlag(分)是指在吸收光波長為234nm下，延滯期(lagphase)與連鎖期(propagationphase)的交差點(diǎn)；ATlag(分)是指各測試樣品Tlag時(shí)間與TlagO時(shí)間的差值。注2:效力值>0.5時(shí)，表示其具抗氧化作用。由表七中可知，4-羥基-2,3-二甲氧基-6-甲基-5(3,7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮具有1.30的效力值，其比具抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)值0.5高出甚多，也就是，其具有相當(dāng)?shù)目寡趸芰?，因此可用作保健食品、飲食品、醫(yī)藥品、化妝品當(dāng)中的成分，借由其抗氧化能力達(dá)到預(yù)防心血管疾病或避免細(xì)胞突變等效用，使對于施用的人體健康產(chǎn)生莫大的幫助。權(quán)利要求1.一種化合物，包括下列結(jié)構(gòu)式id="icf0001"file="A2007100042350002C1.gif"wi="81"he="35"top="39"left="70"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>其中，X是氧(O)或硫(S)，Y是氧或硫；R1是氫基(H)、甲基(CH3)或(CH2)m-CH3，R2是氫基、甲基或(CH2)m-CH3，R3是氫基、甲基或(CH2)m-CH3，m＝1～12；n＝1～12。2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物是分離自牛樟芝。3.如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物是由牛樟芝的有機(jī)溶劑萃取物中所分離。4.如權(quán)利要求3所述的化合物，其特征在于，該有機(jī)溶劑是選自酯類、醇類、烷類或鹵烷所組成的族群。5.如權(quán)利要求4所述的化合物，其特征在于，該醇類是乙醇。6.如權(quán)利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物是由牛樟芝的水萃取物中所分離。7.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物是4-羥基-2,3-二甲氧基_6-甲基-5(3，7,11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(4-hydroxy-2，3-dimethoxy-6-methy隱5(3，7,11-trimethyl-dodeca-2,6,10-trienyl)-cyclohex-2-enone)。8.—種將具有如權(quán)利要求1或7所述化合物利用于抑制乳癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用。9.如權(quán)利要求8所述的將該化合物利用于抑制乳癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該化合物是分離自牛樟芝。10.如權(quán)利要求9所述的將該化合物利用于抑制乳癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該化合物是由牛樟芝的有機(jī)溶劑萃取物中所分離。11.如權(quán)利要求IO所述的將該化合物利用于抑制乳癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該有機(jī)溶劑是選自酯類、醇類、烷類或鹵烷所組成的族群。12.如權(quán)利要求11所述的將該化合物利用于抑制乳癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該有機(jī)溶劑是乙醇。13.如權(quán)利要求9所述的將該化合物利用于抑制乳癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該化合物是由牛樟芝的水萃取物中所分離。14.如權(quán)利要求8所述的將該化合物利用于抑制乳癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該乳癌腫瘤細(xì)胞是MCF-7或MDA-MB-231細(xì)胞系。15.—種將具有如權(quán)利要求1或7所述的化合物利用于抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用。16.如權(quán)利要求15所述的將該化合物利用于抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該化合物是分離自牛樟芝。17.如權(quán)利要求16所述的將該化合物利用于抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該化合物是由牛樟芝的有機(jī)溶劑萃取物中所分離。18.如權(quán)利要求17所述的將該化合物利用于抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該有機(jī)溶劑是選自酯類、醇類、烷類或鹵烷所組成的族群。19.如權(quán)利要求18所述的將該化合物利用于抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該有機(jī)溶劑是乙醇。20.如權(quán)利要求16所述的將該化合物利用于抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該化合物是由牛樟芝的水萃取物中所分離。21.如權(quán)利要求15所述的將該化合物利用于抑制肝癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該肝癌腫瘤細(xì)胞是Hep3B或HepG2細(xì)胞系。22.—種將具有如權(quán)利要求1或7所述的化合物利用于抑制攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用。23.如權(quán)利要求22所述的將該化合物利用于抑制攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該化合物是分離自牛樟芝。24.如權(quán)利要求23所述的將該化合物利用于抑制攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該化合物是由牛樟芝的有機(jī)溶劑萃取物中所分離。25.如權(quán)利要求24所述的將該化合物利用于抑制攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該有機(jī)溶劑是選自酯類、醇類、烷類或鹵烷所組成的族群。26.如權(quán)利要求25所述的將該化合物利用于抑制攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該有機(jī)溶劑是乙醇。27.如權(quán)利要求23所述的將該化合物利用于抑制攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該化合物是由牛樟芝的水萃取物中所分離。28.如權(quán)利要求22所述的將該化合物利用于抑制攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用，其特征在于，該攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞是LNCaP或DU145細(xì)胞系。29.如權(quán)利要求1或7所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有抗氧化活性。30.—種利用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的醫(yī)藥組成物，其包括有效劑量的如權(quán)利要求1所述的化合物以及藥學(xué)上可接受的載體，其中該腫瘤細(xì)胞是選自乳癌、肝癌或攝護(hù)腺癌的腫瘤細(xì)胞。31.—種利用于抑制腫瘤細(xì)胞生長的醫(yī)藥組成物，其特征在于，其包括有效劑量的如權(quán)利要求7所述的化合物以及藥學(xué)上可接受的載體，其中該腫瘤細(xì)胞是選自乳癌、肝癌或攝護(hù)腺癌的腫瘤細(xì)胞。全文摘要本發(fā)明是關(guān)于一種新穎化合物及其用途，尤其是關(guān)于一種由牛樟芝萃取物中所分離出的4-羥基-2，3-二甲氧基-6-甲基-5(3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯)-2-環(huán)己烯酮(4-hydroxy-2，3-dimethoxy-6-methy-5(3，7，11-trimethyl-dodeca-2，6，10-trienyl)-cyclohex-2-enone)及其在抑制腫瘤細(xì)胞生長的應(yīng)用。本發(fā)明中的前述化合物是首次見于牛樟芝中，其可應(yīng)用于抑制乳癌、肝癌與攝護(hù)腺癌腫瘤細(xì)胞的生長，同時(shí)可作為抑制前述腫瘤細(xì)胞生長的醫(yī)藥組成物的成分，或進(jìn)一步借由其抗氧化活性應(yīng)用于心血管疾病的預(yù)防或添加于健康飲食品當(dāng)中。文檔編號C07C403/02GK101225066SQ20071000423公開日2008年7月23日申請日期2007年1月18日優(yōu)先權(quán)日2007年1月18日發(fā)明者劉勝勇,張君綬,李雅嫈,溫武哲,鄒宛玲,郭茂田,霍嘉恒,黃俊鴻申請人:國鼎生物科技股份有限公司