專利名稱：：一種從隱甲藻中提取并精制富含dha脂肪酸的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種從隱甲藻(Q7^/zecoWm'wwco/zm7)中提取并精制富含DHA脂肪酸的工藝。
背景技術(shù)：
：DHA(Docosahexaenoicacid,22:6A47iaill619，全名二十二碳六烯酸)是一種重要的長鏈多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid，簡稱PUFA)，屬于n-3系列。DHA作為細胞膜合成的必要成分，具有增強視力、促進腦細胞發(fā)育等作用，是嬰幼兒大腦生長發(fā)育和成年人大腦正常功能維持的必要成分，被譽為"腦黃金"。DHA也可以降血脂、預防和治療動脈硬化、抗炎、抗癌等作用。因而，DHA受到了食品界和醫(yī)療界的廣泛關(guān)注。傳統(tǒng)的DHA生產(chǎn)原料主要來源于魚油，但魚的種類、季節(jié)、地理位置等因素的差異造成了油含量和油中不飽和脂肪酸含量的不穩(wěn)定；魚油提取獲得的DHA膽固醇含量高，且含有大量的EPA(Eicosapetaenoicacid,22:5)及多種礦物質(zhì)；再加上魚油來源日漸緊缺，難以實現(xiàn)此種高價值產(chǎn)品在食品和醫(yī)藥行業(yè)中的廣泛應用。為滿足DHA不斷增長的市場需求、克服從傳統(tǒng)魚油提取DHA的不足，近年來，科學工作者開展了利用海洋微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA的研究。常用的微生物包括隱甲藻、破囊弧菌、裂殖弧菌等，其中隱甲藻脂肪酸組成較為單一，總脂含量達20%,DHA占30—5015/。，其他不飽和脂肪酸百分率小于1%，是DHA高效的生產(chǎn)菌之一。目前國內(nèi)的專利主要集中在從魚油中分離提取長鏈多不飽和脂肪酸，僅有兩篇專利涉及微藻發(fā)酵生產(chǎn)長鏈多不飽和脂肪酸的方法(申請?zhí)?4106621.5和00135338.1)，但內(nèi)容比較簡單，沒有對微藻中脂肪酸提取方法進行詳細描述。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供了一種采用有機溶劑高效萃取隱甲藻體內(nèi)的脂肪酸并精制DHA的方法。本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)措施實現(xiàn)的一種從隱甲藻Co^//2eco^'m'wwco/2m7中提取并精制富含DHA脂肪酸的方法，該方法先將隱甲藻發(fā)酵液絮凝處理再進行固液分離，通過堿破壁后再將細胞機械破碎，然后對破碎的菌體采用有機溶劑萃取，獲得DHA粗油(即富含DHA的粗油)；DHA粗油經(jīng)過脫膠、堿煉、脫色、脫臭后得到DHA精油(即富含DHA的精制脂肪酸)。所述的方法，其中絮凝處理采用的絮凝劑為明礬、硫酸鋁、無水CaCl2、三氯化鐵、聚合氯化鋁(PAC)、聚合硫酸鐵(PFS)或聚丙烯酰胺(PAM)。所述的方法，其中絮凝劑的用量為隱甲藻發(fā)酵液質(zhì)量的1-2%。所述的方法，其中固液分離方法采用靜置、添加酒精、離心的方法。所述的方法，其中所用破壁堿液采用NaOH或KOH配制，pH為12-14。所述的方法，其中機械破碎采用膠體磨和高壓均質(zhì)機破碎細胞。所述的方法，其中萃取時按質(zhì)量比為水物料(即破碎的菌體，下同)有機溶劑=1:1:3~1:1:7的比例進行萃取，攪拌2040min，靜置分層，最下層為水，中層為料渣，上層為有機溶劑和DHA粗油，取上層溶液通過減壓蒸發(fā)器將有機溶劑蒸出，獲得DHA粗油。所述的方法，其中萃取所用的有機溶劑為環(huán)己烷、正己垸、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、六號溶劑、四號溶劑。(四號溶劑為丙垸、丁烷混合物，六號溶劑汽油，其主要成分為正己烷和庚垸，是石油生產(chǎn)過程中的一種副產(chǎn)品。)所述的方法，其中粗油精制時脫膠采用磷酸，堿煉采用NaOH，脫色采用活性炭和白土，脫臭采用過飽和蒸汽。所述的方法，其中隱甲藻發(fā)酵液是通過下列方法獲得的先將隱甲藻活化三代后進行種子培養(yǎng)，獲得活力較高的藻種(即處于對數(shù)生長期的藻種)，在含有碳源、氮源、無機鹽離子、微量元素的培養(yǎng)基中發(fā)酵，收獲藻體。其中碳源優(yōu)選葡萄糖，氮源優(yōu)選酵母膏，無機鹽離子可以是鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、磷酸鹽、鈣鹽等，微量元素可以是Mn2+、Co2+、Mn042+、Ni2+、Fe"等。以下對本發(fā)明的方法作進一步的描述一、隱甲藻的培養(yǎng)取一管保藏的菌體(CrypthecodiniumcohniiATCC30556，購買于美國菌種保藏中心)，接種至裝有50ml培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中。在2030'C的搖床中以150~200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)36h，待葡萄糖濃度降為10g/l時完成第一代活化，然后取2ml菌液接種到上述新鮮培養(yǎng)基中，同法連續(xù)培養(yǎng)三代(均以培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降為10g/l時作為一代活化完成)，得到具有較高活力的種子液(即處于對數(shù)生長期)；再以1~10%的接種量接種該種子液到5L的發(fā)酵罐中進行攪拌培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速在100-200之間，通氣量在0.2-2wm，通過控制轉(zhuǎn)速使發(fā)酵罐中溶氧控制在20-100%之間(發(fā)酵罐開始培養(yǎng)時的溶氧定為1即100%)，采用0.3°/。(w/v)siliconeSE-2作為消泡劑，通過自動添加2MHCL或NaOH維持pH在6~7之間。對糖濃度進行測定，當葡萄糖濃度降為10g/l左右時流加葡萄糖以延長菌體的產(chǎn)脂階段，發(fā)酵5天，放罐。上述方法中采用的培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、無機鹽離子、微量元素等，其中碳源優(yōu)選葡萄糖，氮源優(yōu)選酵母膏，無機鹽離子可以是鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、磷酸鹽、鈣鹽等，微量元素可以是Mn2+、Co2+、Mn042+、Ni2+、Fe2+等。二、粗油的提取及精制(1)發(fā)酵液固液分離本發(fā)明中采用先絮凝后離心的固液分離方法。絮凝工藝中向隱甲藻發(fā)酵液中按照隱甲藻發(fā)酵液質(zhì)量比1~2%的比例添加絮凝劑，使細胞絮凝并沉淀，將上層的水除去；再添加酒精，降低溶液的密度，使得菌體的浮力減小，利于菌體的沉降，同樣將上層液體除去。下層菌體離心，進一歩除水。本發(fā)明中發(fā)酵液粘度太大，若對整個發(fā)酵液都采取離心，無法進行，一般采用滾動干燥器干燥。但是能耗太高，且高溫使DHA部分氧化，降低油的質(zhì)量。因此，先將發(fā)酵液中大部分水采用物理絮凝方法去除，具有創(chuàng)新性。(2)細胞破碎本發(fā)明采用機械破碎法對藻體進行破碎。首先用NaOH配制pH為12-14左右的水溶液，將上步離心所得的細胞倒入該溶液中，堿性環(huán)境下進行破壁；然后將細胞送入膠體磨中，將物料磨成小顆粒狀，送入均質(zhì)機中高壓破碎，獲得破碎菌體。再次離心除去破碎菌體中的水份。(3)粗油提取本發(fā)明采用有機溶劑萃取法對脂肪酸進行抽提。按照水物料有機溶劑(質(zhì)量比)=1:1:3~1:1:7的比例在萃取罐中進行萃取，攪拌30min左右，停止攪拌，靜置分層。最下層為水，中層為料渣，上層為有機溶劑和粗油。取上層溶液通過減壓蒸發(fā)器將有機溶劑蒸出，反復使用，獲得DHA粗油。(4)粗油精制本發(fā)明通過脫膠、堿煉、脫色、脫臭對粗油進行精制，去除DHA粗油中的雜質(zhì)、膠質(zhì)、色素、脂肪酸等一些影響油脂質(zhì)量的物質(zhì)。脫膠采用磷酸，堿煉采用NaOH脫酸，中和油脂中游離的脂肪酸；脫色采用活性炭和白土利用脫色及表面吸附性除去油脂中的色素及其他雜質(zhì)，脫臭采用過飽和蒸汽除去油脂中的臭味。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了一種采用有機溶劑高效萃取隱甲藻體內(nèi)脂肪酸并精制DHA的方法，該方法操作簡單，可降低DHA油脂的提取成本，操作過程中僅采用有機溶劑，最終無殘留，經(jīng)精制后提高了DHA油脂的質(zhì)量，其提取物中DHA含量在4050。/。左右，適合DHA規(guī)?；a(chǎn)。圖1是本發(fā)明提取和精制DHA工藝流程圖。圖2是本發(fā)明提取的DHA油脂的GC-MS圖譜(各種脂肪酸峰面積圖)。圖3是本發(fā)明提取的DHA油脂的GC-MS圖譜(DHA質(zhì)譜圖)。具體實施例方式以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明。這些實施例僅起說明的目的，而不作為限制本發(fā)明的界限。一般性說明1、隱甲藻培養(yǎng)方法取一管保藏的菌體(Or;^m^m'wmco/"http://ATCC30556，購買于美國菌種保藏中心)，接種至裝有50ml培養(yǎng)基的250ml的搖瓶中，在20-30。C的搖床中以150200rpm的轉(zhuǎn)速，培養(yǎng)36h，待葡萄糖濃度降為10g/l時完成第一代活化，然后取2ml菌液接種到上述新鮮培養(yǎng)基中，同法連續(xù)培養(yǎng)三代(均以培養(yǎng)基中葡萄糖濃度降為10g/l時作為一代活化完成)，得到具有較高活力的種子液(處于對數(shù)生長期)；再以1~10%的接種量接種該種子液到5L的發(fā)酵罐(發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量一般為發(fā)酵罐的60%，即3L，下同)，中進行攪拌培養(yǎng)，攪拌轉(zhuǎn)速在100~200之間，通空氣量在0.22vvm，通過控制轉(zhuǎn)速使發(fā)酵罐中溶氧控制在20~100%之間(發(fā)酵罐開始培養(yǎng)時的溶氧定為1即100%)，采用siliconeSE-2作為消泡劑，siliconeSE-2在培養(yǎng)液中的濃度為0.3%(w/v)，通過自動添加2MHCL或NaOH維持pH在6~7之間。對糖濃度進行測定，當葡萄糖濃度降為10g/l左右時流加葡萄糖以延長菌體的產(chǎn)脂階段，發(fā)酵5天(發(fā)酵溫度25t:)，放罐。所述方法中采用的培養(yǎng)基，包括碳源、氮源、無機鹽離子、微量元素等，其中碳源采用葡萄糖，氮源采用酵母膏，無機鹽離子包括鈉鹽、鎂鹽、鉀鹽、磷酸鹽、轉(zhuǎn)鹽等，微量元素包括Mn2+、Co2+、Mn042+、Ni2+、Fe"等。2、糖濃度的測定SBA-40C生物傳感分析儀(山東省科學院生物研究所生產(chǎn))測定。3、菌體干重的測定干重法，將一定量的培養(yǎng)液裝入預先稱重的濾紙中，5000r/min，離心10min,沉淀后用去離子水清洗三次，6(TC真空干燥，冷卻后稱重，直至恒重。4、脂肪酸檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明采用氣質(zhì)聯(lián)用的方法對脂肪酸含量進行分析。首先進行DHA油甲酯化處理取0.3gDHA油，加入濃度為5%(w/v)的KOH的甲醇溶液lml，置于10ml容量瓶中，于60'C水浴2~3小時進行皂化，冷卻后加入2ml甲醇和1.5ml45%(w/v)的三氟化硼-乙醚，6(TC水浴10min。冷卻后加3ml正己烷振蕩后加lml飽和食鹽水靜置，最后取1~2滴上清液加0.5ml正己烷稀釋，加少量無水硫酸鈉干燥后備用。氣質(zhì)聯(lián)用法分析采用Thermofi皿igantraceGC2000DSQ色譜，F(xiàn)ID檢測器，DB-5MS毛細管柱(30mx0.32mmx0.25nm);載氣為氦氣，流速lmL/min，分流比10/1，進樣溫度250°C，檢測溫度260°C,柱溫采取程序升溫初始溫度200°C，以5。C/min的速度升溫至225。C，停5min;繼續(xù)以5°C/min的速度升溫至250°C,停5min。進樣量lnL。5、本發(fā)明提供的提取和精制DHA方法工藝流程圖見圖1。實施例15L發(fā)酵罐發(fā)酵收獲藻體的脂肪酸提取及精制按照上述培養(yǎng)方法進行5L罐發(fā)酵，收獲藻體。將發(fā)酵液倒入溶劑罐中，添加45g三氯化鐵，使細胞絮凝沉淀，靜置后，將上層溶液放出，向罐中加入800ml酒精，使更多的菌體沉降，同樣放出上層液體，用離心機將上述獲得的菌體離心，實現(xiàn)進一步的固液分離。用NaOH配制pH為14的水溶液，將上步得到的菌體倒入進行堿破壁，然后將細胞送入膠體磨中，將物料磨成小顆粒狀，送入均質(zhì)機中高壓破碎，獲得破碎的菌體。再次離心(轉(zhuǎn)速8000rpm)除水，將破碎菌體倒入萃取罐，將其倒入萃取罐，按照質(zhì)量比為水物料(破碎后的菌體)乙酸乙酯=1:1:5.5的比例進行萃取，攪拌30min左右，停止攪拌，靜置分層。取上層溶液通過減壓蒸發(fā)器將乙酸乙酯蒸出，回收溶劑，獲得DHA粗油。DHA粗油加入磷酸脫膠，NaOH堿煉脫酸，中和油脂中游離的脂肪酸，采用活性炭和白土脫色除去油脂中的色素及其他雜質(zhì)，采用過飽和蒸汽除去油脂中的臭味，獲得較DHA精油。測定發(fā)酵液生物量(即菌體干重)、提取的總脂肪酸量、DHA含量(g卩DHA量/總脂肪酸量)，具體實驗數(shù)據(jù)如下-<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>實施例35噸發(fā)酵罐發(fā)酵收獲藻體的脂肪酸提取及精制按照上述培養(yǎng)方法進行5噸罐發(fā)酵，收獲藻體。將發(fā)酵液倒入溶劑罐中，添加50kg聚合氯化鋁，使細胞絮凝沉淀，靜置后，將上層溶液放出；向罐中加入15L酒精，使更多的菌體沉降，同樣放出上層液體；用離心機將上述獲得的菌體離心，實現(xiàn)進一步的固液分離。用NaOH配制pH為12的水溶液，將上步得到的菌體倒入進行堿破壁，然后將細胞送入膠體磨中，將物料磨成小顆粒狀，送入均質(zhì)機中高壓破碎，獲得破碎的菌體。再次離心(轉(zhuǎn)速8000rpm)除水，將破碎菌體倒入萃取罐，將其倒入萃取罐，按照水-.物料正己烷=1:1:6的比例進行萃取，攪拌30min左右，停止攪拌，靜置分層。取上層溶液通過減壓蒸發(fā)器將正己烷蒸出，回收溶劑，獲得DHA粗油。DHA毛油加入磷酸脫膠，NaOH堿煉脫酸，中和油脂中游離的脂肪酸，采用活性炭和白土脫色除去油脂中的色素及其他雜質(zhì)，采用過飽和蒸汽除去油脂中的臭味，獲得較高品質(zhì)的DHA精油。測定發(fā)酵液生物量(即菌體干重)、提取的總脂肪酸量、DHA含量(即DHA量/總脂肪酸量)，具體實驗數(shù)據(jù)如下<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例45噸發(fā)酵罐收獲藻體的脂肪酸提取及精制按照上述培養(yǎng)方法進行培養(yǎng)，通過一級、二級種子罐，進入5噸罐發(fā)酵，收獲藻體。將發(fā)酵液倒入溶劑罐中，添加50kgCaCl2，使細胞絮凝沉淀，靜置后，將上層溶液放出；向罐中加入15L酒精，使更多的菌體沉降，同樣放出上層液體；用離心機將上述獲得的菌體離心，實現(xiàn)進一步的固液分離。用NaOH配制pH為13的水溶液，將上步得到的菌體倒入進行堿破壁，然后將細胞送入膠體磨中，將物料磨成小顆粒狀，送入均質(zhì)機中高壓破碎，獲得粉末狀細胞。再次離心(轉(zhuǎn)速8000rpm)除水，將破碎菌體倒入萃取罐，將其倒入萃取罐，按照水物料環(huán)己烷=1:1:5的比例進行萃取，攪拌30min左右，停止攪拌，靜置分層。取上層溶液通過減壓蒸發(fā)器將環(huán)己垸蒸出，回收溶劑，獲得DHA粗油。加入磷酸脫膠，NaOH堿煉脫酸，中和油脂中游離的脂肪酸，采用活性炭和白土脫色除去油脂中的色素及其他雜質(zhì)，采用過飽和蒸汽除去油脂中的臭味，獲得DHA精油。DHA精油的GC-MS分析結(jié)果見圖2、3，圖2以峰面積計算見表1。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注圖2中保留時間9.74和9.82處的峰均為DHA。測定發(fā)酵液生物量(即菌體干重)、提取的總脂肪酸量、DHA含量(即DHA量/總脂肪酸量)，具體實驗數(shù)據(jù)如下5<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1、一種從隱甲藻Crypthecodiniumcohnii中提取并精制富含DHA脂肪酸的方法，其特征在于先將隱甲藻發(fā)酵液絮凝處理再進行固液分離，通過堿破壁后再將細胞機械破碎，然后對破碎的菌體采用有機溶劑萃取，獲得DHA粗油；DHA粗油經(jīng)過脫膠、堿煉、脫色、脫臭后得到DHA精油。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于絮凝處理采用的絮凝劑為明礬、硫酸鋁、無水CaCb、三氯化鐵、聚合氯化鋁、聚合硫酸鐵或聚丙烯酰胺。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于絮凝劑的用量為隱甲藻發(fā)酵液質(zhì)量的1-2%。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于固液分離方法采用靜置、添加酒精、離心的方法。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所用破壁堿液采用NaOH或KOH配制，pH為12~14。6、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于機械破碎采用膠體磨和高壓均質(zhì)機破碎細胞。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于萃取時按質(zhì)量比為水破碎的菌體有機溶劑=1:1:3~1:1:7的比例進行萃取，攪拌2040min，靜置分層，最下層為水，中層為料渣，上層為有機溶劑和DHA粗油，取上層溶液通過減壓蒸發(fā)器將有機溶劑蒸出，獲得DHA粗油。8、根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的方法，其特征在于萃取所用的有機溶劑為環(huán)己垸、正己烷、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、六號溶劑、四號溶劑。9、根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其特征在于粗油精制時脫膠采用磷酸，堿煉采用NaOH，脫色采用活性炭和白土，脫臭采用過飽和蒸汽。10、根據(jù)權(quán)利要求l中的方法，其特征在于隱甲藻發(fā)酵液是通過下列方法獲得的先將隱甲藻活化三代后進行種子培養(yǎng)，獲得活力較高的藻種，在含有碳源、氮源、無機鹽離子、微量元素的培養(yǎng)基中發(fā)酵，收獲藻體。全文摘要本發(fā)明公開了一種從隱甲藻中提取并精制富含DHA脂肪酸的工藝。該工藝先將隱甲藻Crypthecodiniumcohnii發(fā)酵液絮凝處理再進行固液分離，通過堿破壁后再將細胞機械破碎，然后對破碎的菌體采用有機溶劑萃取，獲得DHA粗油；DHA粗油經(jīng)過脫膠、堿煉、脫色、脫臭后得到DHA精油。該方法操作簡單，可降低DHA油脂的提取成本，操作過程中僅采用有機溶劑，最終無殘留，經(jīng)精制后提高了DHA油脂的質(zhì)量，其提取物中DHA含量在40～50％左右，適合DHA規(guī)?；a(chǎn)。文檔編號C07C57/00GK101168501SQ200710025079公開日2008年4月30日申請日期2007年7月11日優(yōu)先權(quán)日2007年7月11日發(fā)明者任路靜,霜李,南胡,金明杰,和黃申請人:南京工業(yè)大學