專利名稱：一種豆科植物活性多肽的分離提取方法及其氨基酸序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化技術(shù)和生物殺蟲劑的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種具有抗蟲功能的豆科植物活性多肽的分離提取方法及其氨基酸序列。
背景技術(shù)：
經(jīng)多年來的研究成果表明將谷物與豌豆(Pisum sativum)混合儲藏時，米象(Sitophilus oryzae)、玉米象(Sitophilus zeamais)和谷象(Sitophilus granarius)等儲糧害蟲存活與繁殖現(xiàn)象明顯減少；采用豌豆粗提取的蛋白成分對米象、玉米象、谷象和蚜蟲等多種昆蟲的喂食實驗中，都表現(xiàn)出具有顯著的毒性作用。作為自然界天然存在的生物殺蟲劑，是未來安全性為首要特征的生物農(nóng)藥開發(fā)的重要資源，所以，有必要對豌豆的蛋白成分作較為詳盡的分離、純化，并對各蛋白組分的生理生化特性、毒理毒性以及其蛋白組成等進(jìn)行徹底分析。
目前，我國在國家糧庫和地方糧庫中主要采用熏蒸劑和化學(xué)防護(hù)劑防治儲糧害蟲，由此產(chǎn)生的3R問題即殘留(Residue)、抗性(Resistance)及害蟲再猖獗(Resurgence)也日趨明顯。因此，尋找更有效、安全的方法來控制儲糧害蟲的危害，一直都是我們所面臨的緊迫課題。
利用植物次生代謝產(chǎn)物開發(fā)與環(huán)境和諧的殺蟲劑是當(dāng)今生物農(nóng)藥的研究熱點。植物次生代謝產(chǎn)物是植物長期與昆蟲協(xié)同進(jìn)化過程中抵御昆蟲植食行為而產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)，這些活性物質(zhì)可以經(jīng)過加工成為植物性殺蟲劑，對害蟲具有多種生物活性、對天敵影響小、在環(huán)境中容易降解、昆蟲不易產(chǎn)生抗藥性等特點，符合新世紀(jì)對農(nóng)藥的要求。隨著我國可持續(xù)植保發(fā)展戰(zhàn)略的實施，對農(nóng)藥的安全使用要求也日益嚴(yán)格，尤其對儲糧害蟲中應(yīng)用的殺蟲劑，要求既能防治害蟲的發(fā)生，又不對儲糧和環(huán)境產(chǎn)生污染，且不對人的健康造成威脅。但到目前為止，國內(nèi)外雖然對植物源殺蟲劑在儲糧害蟲防治中的應(yīng)用有了很多的研究，但主要停留在對粗提物的直接應(yīng)用和粗提物與化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配上，具體的活性物質(zhì)并沒有分離出來，對其作用機理的研究還很不深入，開發(fā)出的植物性殺蟲劑產(chǎn)品還很少。因此，植物源高效低毒殺蟲劑的研究與應(yīng)用是儲糧害蟲防治工作中一個非常重要的研究課題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗蟲功能的豆科植物活性多肽的分離提取方法及其氨基酸序列。采用現(xiàn)代生化的技術(shù)手段，對豌豆中具有對糧儲害蟲有毒殺作用的蛋白成分進(jìn)行跟蹤，進(jìn)行逐步的分離、純化，并對此活性組分的生理生化特性、蛋白質(zhì)組成等進(jìn)行分析。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案一種具有抗蟲功能的豆科植物活性多肽的分離提取方法，包括如下步驟(1)豌豆蛋白粗提物的制備將豌豆粉與醋酸緩沖液(pH4.9)攪拌混合，配制成濃度約為8.0％(w/v)的混合液，在溫度低于25℃的條件下，混合液進(jìn)行離心分離，取上清液進(jìn)行膜(M5)超濾，再將濾液離心，收集上清液進(jìn)行冷凍干燥，可得到粗提物凍干粉。
(2)對粗提物的離子交換樹脂層析分離將步驟(1)獲得的粗提物凍干粉與60％的甲醇混合，混合濃度約為10％(w/v)左右，在4℃下攪拌，然后離心分離，收集上清液，真空干燥；然后再添加水和Tris-HCl緩沖液，使Tris-HCl的終濃度為50mM；用陰離子交換層析柱分離可溶的蛋白組分；吸附蛋白組分在緩沖液A與緩沖液B的混合作用下析出；洗脫緩沖液流速為20ml/min，在280nm波長下收集DEAE II。所述緩沖液A為50mM pH8.8 Tris-HCl；緩沖液B為25mM pH8.8 Tris-HCl和250mM NaCl。
(3)對分離組分的反相HPLC層析純化經(jīng)陰離子交換層析柱分離得到的活性組分DEAE II，再進(jìn)行反相HPLC(RT-HPLC)層析純化分離；對滯留時間為14min左右的PT吸收峰組分洗脫液進(jìn)行收集，真空干燥，得到豆科植物活性多肽PT蛋白組分。
所述步驟(3)中反相HPLC層析分離色譜條件分離柱為5μNucleosil-300C18(Hypersil)，洗脫液采用線性梯度乙腈(20％～100％，V/V，內(nèi)含0.04％三氟乙酸)，流速3ml/min；洗脫程序為t＝0min，40％緩沖液B(乙腈，內(nèi)含0.04％三氟乙酸)；t＝5min，40％緩沖液B；t＝17min，48％緩沖液B；t＝18min，80％緩沖液B，t＝23min，80％緩沖液B。所述緩沖液B為50mM pH8.8Tris-HCl和500mM NaCl。
所述陰離子交換層析柱為二乙氨乙基瓊脂糖陰離子交換層析柱(DEAESEPHAROSE FAST FLOW，120×50mm)。
上述方法純化的豆科植物活性多肽PT蛋白組分的氨基酸序列為-ASCNGVCSPFEMPPCGTSACRCIPVGLVIGYCRNPSG-。
經(jīng)純化的PT蛋白組分進(jìn)行蛋白序列測定，其組成的氨基酸序列如圖3所示。該活性蛋白由37個氨基酸殘基組成，分子量為3741.4Da。該氨基酸序列與Higgins于1986年發(fā)表來源于豌豆白蛋白亞組分1b(PA1b)序列表現(xiàn)出高度的相似性，只是所測定的PT蛋白序列在第29位氨基酸殘基是纈氨酸，而在PA1b序列中第29位氨基酸殘基為異亮氨酸。同時，該序列也與來源與大豆的豆類胰島素氨基酸序列表現(xiàn)出很高的相似性65％。更重要的是，這三個蛋白的氨基酸序列中，都包含有6個在維持蛋白構(gòu)象中起關(guān)鍵作用的半胱氨酸殘基，而且其在氨基酸序列中的位置都高度保守地一致，并構(gòu)成3個分子內(nèi)二硫鍵，使蛋白空間結(jié)構(gòu)高度緊密、異常穩(wěn)定。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果本發(fā)明對豌豆中具有對糧儲害蟲有毒殺作用的蛋白成分進(jìn)行跟蹤，進(jìn)行逐步的分離、純化，并對此活性組分的生理生化特性、蛋白質(zhì)組成等進(jìn)行分析，為下一步進(jìn)行DNA的異源重組，構(gòu)建出能夠表達(dá)活性成分的基因工程菌提供必要的基礎(chǔ)。通過將來的液體深層發(fā)酵來實現(xiàn)資源的工業(yè)化生產(chǎn)，以解決植物活性成分大規(guī)模應(yīng)用中遭遇資源來源上受極大限制的關(guān)鍵問題，為打破到目前為止，在國內(nèi)登記應(yīng)用的植物殺蟲劑的主要成分只有除蟲菊素、魚藤酮、煙堿、茼蒿素、大蒜素、印楝素、苦楝和川楝素等少數(shù)幾個品種的尷尬局面提供了一條可喜的途徑。


圖1為DEAE瓊脂糖陰離子交換柱純化豌豆粉中活性蛋白的層析示意圖。
圖2為高壓液相色譜Nucleosil-300 C18柱純化活性成分DEAE II的層析示意圖。
圖3為純化PT蛋白組分、PA1b蛋白和豆類胰島素氨基酸組成的序列比較圖。
圖4為從豌豆粉中分離純化的PT蛋白組分對米象(Sitophilus oryzae)的毒性實驗圖。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
實施例1(1)富含豌豆白蛋白的粗提物制備10kg的豌豆粉在攪拌的情況下與140升pH4.9的醋酸緩沖液混合，繼續(xù)攪拌1小時。混合液于7500轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心分離。在溫度低于25℃的條件下，上清液進(jìn)行M5膜超濾；收集濾液用相同的膜重復(fù)超濾一次，所得濾液在6000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心20分鐘，收集上清液進(jìn)行冷凍干燥。得到大約為物料量1％的粗提物凍干粉，用于后面不同組分的分離以及各組分的毒性試驗。
(2)陰離子交換層析分離取步驟(1)所得粗提物凍干粉10克與100毫升60％的甲醇混合，并在4℃下攪拌1小時。然后在4℃，9000×g下離心30分鐘，收集上清液，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空干燥。然后在添加100毫升水和1M Tris-HCl緩沖液(pH8.8)，使Tris-HCl的終濃度為50mM。用二乙氨乙基瓊脂糖陰離子交換層析柱(DEAE SEPHAROSE FAST FLOW，120×50mm)進(jìn)行分離可溶的蛋白組分。吸附蛋白組分在緩沖液A(Tris-HCl 50mM，pH8.8)與緩沖液B(Tris-HCl 25mM，pH8.8，NaCl 250mM)的混合作用下析出。洗脫緩沖液流速為20ml/min，在280nm波長下有吸收的組分收集體積共為80ml(如圖1所示)，分別對應(yīng)了洗脫時間為300min和600min兩個主要的紫外吸收峰，即DEAE II(300min)和DEAE I(600min)。而只有對層析柱沒有吸附的DEAE II組分包含了粗提物的全部毒性。將DEAE II組分進(jìn)行水透析72小時，然后進(jìn)行冷凍干燥，可獲得大約450mg的凍干粉。
(3)HPLC的反相層析經(jīng)二乙氨乙基瓊脂糖陰離子交換層析柱分離得到的活性組分DEAE II，再進(jìn)行反相HPLC(RT-HPLC)層析分離。分離柱為5μNucleosil-300 C18(Hypersil)，洗脫液采用線性梯度乙腈(20％～100％，V/V，內(nèi)含0.04％三氟乙酸)，流速3ml/min。洗脫程序為t＝0min，40％緩沖液B(乙腈，內(nèi)含0.04％三氟乙酸)；t＝5min，40％緩沖液B；t＝17min，48％緩沖液B；t＝18min，80％緩沖液B，t＝23min，80％緩沖液B。層析過程如圖2所示。對析出的各組分進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只在F1吸收峰和PT吸收峰(滯留時間為14min左右的PT吸收峰組分)出現(xiàn)蛋白毒性。分別對這兩組分洗脫液進(jìn)行收集，在旋轉(zhuǎn)真空干燥儀中進(jìn)行干燥，分別得到4mg的PT蛋白組分和5mg的F1蛋白組分。
(4)純化活性蛋白組分的序列分析經(jīng)純化的PT組分送樣進(jìn)行蛋白序列測定，其組成的氨基酸序列如圖3所示。該活性蛋白由37個氨基酸殘基組成，分子量為3741.4Da。該氨基酸序列與Higgins于1986年發(fā)表來源于豌豆白蛋白亞組分1b(PA1b)序列表現(xiàn)出高度的相似性(HIGGINS et al，J.Biol.Chem.，261(24)，pp11124-11130，1986)，只是所測定的PT蛋白序列在第29位氨基酸殘基是纈氨酸，而在PA1b序列中第29位氨基酸殘基為異亮氨酸。同時，該序列也與來源與大豆的豆類胰島素氨基酸序列表現(xiàn)出很高的相似性65％。更重要的是，這三個蛋白的氨基酸序列中，都包含有6個在維持蛋白構(gòu)象中起關(guān)鍵作用的半胱氨酸殘基，而且其在氨基酸序列中的位置都高度保守地一致，并構(gòu)成3個分子內(nèi)二硫鍵，使蛋白空間結(jié)構(gòu)高度緊密、異常穩(wěn)定。如圖3中所示。
(5)活性蛋白組分的糧儲象蟲的毒性測定實驗室中，象鼻蟲(Sitophilusoryzae)在27.5℃和70％的相對濕度下生長，喂食小麥或豌豆。實驗用象鼻蟲約培養(yǎng)近30代。
將步驟(3)中得到的100μg PT蛋白組分溶于167μl水中，然后將其與250mg小麥粉混合，制成小團(tuán)，充分干燥后，分別給30個抗性和敏感性成蟲喂食，每天觀察象鼻蟲死亡個數(shù)，直到敏感性蟲死亡率達(dá)到95％。分析其半致死劑量LC50發(fā)現(xiàn)，該蛋白組分和天然豌豆粉一樣具有對糧儲象蟲同等的毒殺能力。結(jié)果如圖4所示。
SEQUENCE LISTING<110>華南理工大學(xué)<120>一種豆科植物活性多肽的分離提取方法及其氨基酸序列<130>31<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>37<212>PRT<213>Artificial sequence<220>
<223>豆科植物活性多肽的氨基酸序列<400>1Ala Ser Cys Asn Gly Val Cys Ser Pro Phe Glu Met Pro Pro Cys Gly1 5 10 15Thr Ser Ala Cys Arg Cys Ile Pro Val Gly Leu Val Ile Gly Tyr Cys20 25 30Arg Asn Pro Ser Gly3權(quán)利要求
1.一種豆科植物活性多肽的分離提取方法，其特征在于包括如下步驟(1)豌豆蛋白粗提物的制備將豌豆粉與pH4.9醋酸緩沖液攪拌混合，配制成濃度為8.0％的混合液，在溫度低于25℃的條件下，混合液進(jìn)行離心分離，取上清液進(jìn)行膜超濾，再將濾液離心，收集上清液進(jìn)行冷凍干燥，可得到粗提物凍干粉；(2)對粗提物的離子交換樹脂層析分離將粗提物凍干粉與60％的甲醇混合，混合濃度為10％；在4℃下攪拌，然后離心分離，收集上清液，真空干燥；然后再添加水和Tris-HCl緩沖液，使Tris-HCl的終濃度為50mM；用陰離子交換層析柱分離可溶的蛋白組分；吸附蛋白組分在緩沖液A與緩沖液B的混合作用下析出；洗脫緩沖液流速為20ml/min，在280nm波長下收集DEAE II；所述緩沖液A為50mM pH8.8 Tris-HCl；所述緩沖液B為25mM pH8.8 Tris-HCl和250mM NaCl；(3)對分離組分的反相HPLC層析純化經(jīng)陰離子交換層析柱分離得到的活性組分DEAE II，再進(jìn)行反相HPLC層析純化分離；對PT吸收峰組分洗脫液進(jìn)行收集，真空干燥，得到豆科植物活性多肽PT蛋白組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豆科植物活性多肽的分離提取方法，其特征在于所述步驟(3)中反相HPLC層析分離色譜條件分離柱為5μNucleosil-300C18，洗脫液采用線性梯度乙腈，流速3ml/min；洗脫程序為t＝0min，40％緩沖液B；t＝5min，40％緩沖液B；t＝17min，48％緩沖液B；t＝18min，80％緩沖液B，t＝23min，80％緩沖液B；所述緩沖液B為50mM pH8.8 Tris-HCl和500mM NaCl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種豆科植物活性多肽的分離提取方法，其特征在于所述陰離子交換層析柱為二乙氨乙基瓊脂糖陰離子交換層析柱。
4.權(quán)利要求1所述的豆科植物活性多肽的分離提取方法純化的豆科植物活性多肽，其特征在于所述豆科植物活性多肽的氨基酸序列為-ASCNGVCSPFEMPPCGTSACRCIPVGLVIGYCRN PSG-。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的豆科植物活性多肽，其特征在于所述豆科植物活性多肽由37個氨基酸殘基組成，分子量為3741.4Da。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豆科植物活性多肽的分離提取方法，該方法包括豌豆蛋白粗提物的制備；對粗提物的離子交換樹脂層析分離；對分離組分的反相HPLC層析純化。本發(fā)明對豌豆中具有對糧儲害蟲有毒殺作用的蛋白成分進(jìn)行跟蹤，進(jìn)行逐步的分離、純化，并對此活性組分的生理生化特性、蛋白質(zhì)組成等進(jìn)行分析，為下一步進(jìn)行DNA的異源重組，構(gòu)建出能夠表達(dá)活性成分的基因工程菌提供必要的基礎(chǔ)。
文檔編號C07K14/415GK101029076SQ20071002655
公開日2007年9月5日 申請日期2007年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月26日
發(fā)明者張毅, 許喜林 申請人:華南理工大學(xué)