專利名稱：一種米糠免疫肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種米糠肽及其制備方法，尤其是涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的 米糠肽及其制備方法。
技術(shù)背景米糠是我國(guó)第一大糧食品種——稻谷加工的副產(chǎn)品，米糠肽是米糠蛋白經(jīng)酶 水解獲得的短肽混合物，其氨基酸組成與大豆蛋白質(zhì)基本相同，必須氨基酸平衡 良好，含量豐富。且易為人體消化，安全無毒，是一種優(yōu)良的腸道營(yíng)養(yǎng)液。目前 已發(fā)現(xiàn)米糠肽具有抗氧化、降血壓、降膽固醇、降血糖、免疫、抗疲勞、抗癌等 生理活性。然而目前大部分米糠仍用作動(dòng)物飼料，資源浪費(fèi)嚴(yán)重，同時(shí)免疫米糠 肽的研究方面比較薄弱，國(guó)內(nèi)外的研究報(bào)導(dǎo)也比較零散。因此，以米糠為原料制 備米糠免疫肽，對(duì)于提高米糠附加值具有重要現(xiàn)實(shí)意義。目前，短肽類物質(zhì)的生產(chǎn)主要有三種方法 一、基因工程方法/二、化學(xué)合 成方法，三、酶解法。采用基因工程方法和化學(xué)合成方法生產(chǎn)免疫活性肽需要較 昂貴的儀器設(shè)備，投資大，成本高，且其安全性還需進(jìn)一步檢測(cè)，而用酶解法生 產(chǎn)免疫活性肽則具有較多的優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)有的酶解法通常采用木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白 酶等植物蛋白酶制備短肽類物質(zhì)，盡管原料豐富，生產(chǎn)簡(jiǎn)單但是酶解效率較低、 容易失活，且得到短肽產(chǎn)品具有明顯的苦味。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種具有免疫調(diào)節(jié)活性的米糠免疫肽。 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供具有免疫調(diào)節(jié)活性的米糠免疫肽的制備方法。 本發(fā)明的第一個(gè)目的可通過以下的技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)一種具有免疫調(diào)節(jié)活性 的米糠免疫肽，采用低堿法提取米糠蛋白、再以胰蛋白酶水解米糠蛋白后制得。本發(fā)明的第一個(gè)目的可通過以下的技術(shù)措施來實(shí)現(xiàn)一種具有免疫調(diào)節(jié)活性 米糠免疫肽的制備方法，以全脂米糠為原料，先用低堿法提取米糠蛋白，再以胰 蛋白酶水解米糠蛋白，獲得米糠肽。
本發(fā)明所述低堿法提取米糠蛋白的具體過程A、 以全脂米糠為原料，加入其8 12倍重量的水，以0.5 1.5mol/l的氫氧 化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為9 11,置于35 45。C水浴提取110 135min，完成后置離心機(jī)中分離，收集上清液；B、 以0.1 0.2mol/l的鹽酸溶液調(diào)節(jié)收集上清液的pH值為4 5，靜置，蛋 白質(zhì)析出完全后，置離心機(jī)中離心分離上清液，傾去上清液，得到米糠蛋白沉淀， 于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到米糠蛋白粉，其米糠蛋白提取率可達(dá)到80%以 上。本發(fā)明所述以胰蛋白酶水解米糠蛋白的具體過程C、 將上述米糠蛋白粉加水配制成3 7% (重量百分比)的混合物，以0.5 1.5mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為7.5 9;D、 按照60 120USP-U/g的用量加入胰蛋白酶，置于45 6(TC水浴中酶解 1.5 3hr，完成后加熱至IOO'C維持10 15min進(jìn)行滅酶活，冷卻至室溫后置 于離心機(jī)中分離取上清液，真空濃縮后置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到米糠 免疫肽。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1、 在米糠蛋白的提取工藝方面，為了提高提取率，現(xiàn)有的工藝通常采用強(qiáng) 堿性條件，其浸提液pH值^12，但上述強(qiáng)堿性條件對(duì)米糠蛋白的溶解性、乳化 性、起泡性等功能特性會(huì)產(chǎn)生不良影響，并降低其酶解制備米糠肽的效率。本發(fā) 明控制提取條件pH《11，溫度《45'C，使得米糠蛋白的功能性質(zhì)基本不受影響， 并可提高其酶解制備米糠肽的效率，由于具有免疫活性肽的分子量多在1900Da 以下，對(duì)水解效率要求較高，因此，本發(fā)明采用低堿法提取米糠蛋白、以動(dòng)物蛋 白酶水解米糠蛋白制備米糠肽，得到的米糠肽產(chǎn)品不僅無苦味、風(fēng)味好，并具有 免疫調(diào)節(jié)活性。2、 在米糠肽的制備工藝方面，為了降低生產(chǎn)成本，現(xiàn)有的工藝通常采用價(jià) 格較低的木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等植物蛋白酶，其水解效率不高，不容易得到
具有免疫活性的米糠肽。本發(fā)明采用動(dòng)物蛋白酶胰蛋白酶對(duì)上述米糠蛋白進(jìn)行酶 解，米糠蛋白原有的許多功能性質(zhì)，如乳化功能、起泡功能、吸水功能、增稠功 能、粘著功能、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、生理功能等均有了不同程度的改善，能夠更好的滿足 食品工業(yè)及相關(guān)行業(yè)的需要。本發(fā)明制備得到的米糠肽的免疫活性評(píng)價(jià)見下表附表l米糠肽對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的影響(;c土s,t^8)組別光密度值OD差值十ConA-ConA對(duì)照組0.61 ±0.230.49±0.120.12±0.15高劑量組0,61 ±0.120.26 ±0.110.35±0.14ab .低劑量組0.40±0.130.22 ±0.090.19±0.15環(huán)磷酰胺組0.50±0.130.44 ±0.110.06 ± 0.2 laba表示在i5^0.05的顯著水平下差異顯著；b表示在P^.01的顯著水平下差異顯著從附表1可見，經(jīng)過20天的灌胃和腹腔注射后，本工藝制備的米糠肽對(duì)小 鼠脾淋巴細(xì)胞增殖影響顯著，在^<0.01的顯著水平下對(duì)照組與高劑量組和環(huán)磷 酰胺組(藥物誘導(dǎo)免疫力低下組)存在顯著性差異。脾淋巴細(xì)胞增殖能力的大小 高劑量組>低劑量組>對(duì)照組〉環(huán)磷酰胺組。脾臟是各類免疫細(xì)胞居住的場(chǎng)所， 也是對(duì)抗原物質(zhì)產(chǎn)生免疫應(yīng)答及產(chǎn)生免疫效應(yīng)物質(zhì)的重要基地。通過測(cè)定ConA 誘導(dǎo)的脾淋巴細(xì)胞增殖程度可以反映機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。附表1的研究結(jié)果表 明，本工藝制備的米糠肽對(duì)脾淋巴細(xì)胞增殖能力有明顯的增強(qiáng)作用。附表2米糠肽對(duì)小鼠溶血的影響(;c土s,n-8)組別溶血值對(duì)照組0.16±0.02高劑量組0.93±0.11ab低劑量組0.61±0.03ab環(huán)磷酰胺組0.04±0.01aba表示在P<0.05的顯著水平下差異顯著;13表示在p<0.01的顯著水平下差異顯著
由附表2可見，本工藝制備的米糠肽對(duì)小鼠的體液免疫能力有顯著影響，在 尸<0.01的水平下，對(duì)照組、高劑量組、低劑量組和環(huán)磷酰胺組間都存在顯著性 差異，并且高劑量組的體液免疫能力最強(qiáng)。并且各組的溶血值大小按照高劑量組 〉低劑量組>對(duì)照組>環(huán)磷酰胺組的順序排列，說明本工藝制備的米糠肽能夠促 進(jìn)小鼠特異性體液免疫力。
正常小鼠B淋巴細(xì)胞受抗原(雞紅細(xì)胞)刺激后，分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞 產(chǎn)生一種抗抗雞紅細(xì)胞抗體(溶血素)，這種抗體在體外與雞紅細(xì)胞、補(bǔ)體一起 溫育，即可使雞紅細(xì)胞溶解，釋出血紅蛋白，使溶液呈紅色。顏色的深淺，反映 了紅細(xì)胞溶出量的多少，而紅細(xì)胞溶血與血清中抗體含量有關(guān)。血清溶血素的含 量反映了被雞紅細(xì)胞免疫后的小鼠特異性體液免疫的功能。本工藝制備的不同劑 量的米糠肽使血清中溶血素的含量顯著提高，能夠促進(jìn)小鼠特異性體液免疫功 能。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實(shí) 施例。所述技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容和各參數(shù)所取范 圍，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。 實(shí)施例一1米糠蛋白的提取1.1以全脂米糠為原料，加入其9倍重量的水，以0.5mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào) 節(jié)其pH值為10;1.2將步驟1.1中得到的混合物置于45。C水浴提取130min; .1.3將步驟1.2中得到的混合物置于離心機(jī)中，在3000/min的轉(zhuǎn)速下離心分離25min，收集上清液； 1.4以0.1mol/l鹽酸溶液調(diào)節(jié)步驟1.3中得到的上清液pH值為4.5，靜置10min，待蛋白質(zhì)完全析出；1.5將步驟1.4中得到的混合物置離心機(jī)中，在3500r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離
15min，傾去上清液，得到米糠蛋白沉淀； 1.6將步驟1.5中得到的米糠蛋白沉淀置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到米糠蛋 白粉。2 免疫米糠肽的制備2.1將步驟1中得到的米糠蛋白粉加水配制成5%的混合物； 2.2將步驟2.1中得到的混合物以lmol/1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8; 2.3將步驟2.2中得到的混合物按照80 (USP-U/g米糠蛋白)的用量加入胰蛋 白酶；2.4將步驟2.3中得到的混合物置于55°C水浴中酶解2.5hr;2.5將步驟2.4中得到的混合物加熱至100°C維持10min進(jìn)行滅酶活；2.6將步驟2.5中得到的混合物冷卻至室溫后置于離心機(jī)中，在4000r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離5min，取上清液； 2.7將步驟2.6中得到的上清液真空濃縮后置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到米糠免疫肽。 實(shí)施例二1米糠蛋白的提取1.1以全脂米糠為原料，加入其10倍重量的水，以lmol/1的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) 其pH值為11;1.2將步驟1.1中得到的混合物置于40'C水浴提取120min;1.3將步驟1.2中得到的混合物置于離心機(jī)中，在4000/min的轉(zhuǎn)速下離心分離20min，收集上清液；1.4以0.2mol/l鹽酸溶液調(diào)節(jié)步驟1.3中得到的上清液pH值為5，靜置8min，待蛋白質(zhì)完全析出；1.5將步驟1.4中得到的混合物置離心機(jī)中，在3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離 20min，傾去上清液，得到米糠蛋白沉淀；1.6將步驟1.5中得到的米糠蛋白沉淀置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，.得到米糠蛋 白粉。2免疫米糠肽的制備2.1將步驟l中得到的米糠蛋白粉加水配制成3%的混合物；2.2將步驟2.1中得到的混合物以0.5mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為8;2.3將步驟2.2中得到的混合物按照100 (USP-U/g米糠蛋白)的用量加入胰蛋白酶；2.4將步驟2.3中得到的混合物置于50°C水浴中酶解3hr;2.5將步驟2.4中得到的混合物加熱至IOO'C維持15min進(jìn)行滅酶活；2.6將步驟2.5中得到的混合物冷卻至室溫后置于離心機(jī)中，在3500r/min的轉(zhuǎn)速下離心分離10min，取上清液；2.7將步驟2.6中得到的上清液真空濃縮后置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到米 糠免疫肽。
權(quán)利要求
1、一種米糠免疫肽，其特征在于采用低堿法提取米糠蛋白、再以胰蛋白酶水解米糠蛋白后制得。
2、 一種米糠免疫肽的制備方法，其特征在于以全脂米糠為原料，先用低堿法提取米糠蛋白，再以胰蛋白酶水解米糠蛋白，獲得米糠肽。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述米糠免疫肽的制備方法，其特征在于所述低堿法 提取米糠蛋白的具體過程 'A、 以全脂米糠為原料，加入其8 12倍重量的水，以0.5 1.5mol/l的氫氧 化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為9 11，置于35 45T:水浴提取110 135min，完成后 置離心機(jī)中分離，收集上清液；B、 以0.1 0.2mol/l的鹽酸溶液調(diào)節(jié)收集上清液的pH值為4 5，靜置，蛋 白質(zhì)析出完全后，置離心機(jī)中離心分離上清液，傾去上清液，得到米糠蛋白沉淀， 于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到米糠蛋白粉，其米糠蛋白提取率可達(dá)到80%以 上。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述米糠免疫肽的制備方法，其特征在于-所述以胰蛋白酶水解米糠蛋白的具體過程C、 將上述米糠蛋白粉按重量百分比3 7%加入水中配制成混合物，以0.5 1.5mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)其pH值為7.5 9;D、 按照60 120USP-U/g的用量加入胰蛋白酶，置于45 60'C水浴中酶解 1.5 3hr，完成后加熱至IO(TC維持10 15min進(jìn)行滅酶活，冷卻至室溫后置 于離心機(jī)中分離取上清液，真空濃縮后置于真空冷凍干燥機(jī)中干燥，得到米糠 免疫肽。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種米糠免疫肽及其米糠免疫肽的制備方法，以全脂米糠為原料，先用低堿法提取米糠蛋白，再以胰蛋白酶水解米糠蛋白，獲得米糠肽。本發(fā)明采用低堿法提取米糠蛋白、以動(dòng)物蛋白酶水解米糠蛋白制備米糠肽，得到的米糠肽產(chǎn)品不僅無苦味、風(fēng)味好，并具有免疫調(diào)節(jié)活性。
文檔編號(hào)C07K2/00GK101210043SQ20071003282
公開日2008年7月2日 申請(qǐng)日期2007年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月25日
發(fā)明者唐小俊, 雁 張, 張名位, 張瑞芬, 李健雄, 池建偉, 魏振承 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所