專利名稱：一種抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制劑原料制備方法領(lǐng)域，具體涉及到抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料的制備方法。
背景技術(shù)：
抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白(ATG)為一種生物免疫抑制劑，能與患者T淋巴細(xì)胞結(jié)合后，激活補(bǔ)體，抑制或除去人體內(nèi)T淋巴細(xì)胞，臨床上主要用于組織器官移植排異反應(yīng)及急性再生障礙性貧血等惡性免疫疾病的治療。
目前，國內(nèi)ATG的制備方法為使用人胸腺淋巴細(xì)胞作免疫原，免疫豬或兔后得到抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白制品原料血清，該原料經(jīng)提純、精制等工藝后成為抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白制劑。用于制備該產(chǎn)品的人胸腺淋巴細(xì)胞系取自醫(yī)院6個月以上引產(chǎn)的死嬰，細(xì)胞來源比較困難，原料不足已成為限制生產(chǎn)規(guī)模擴(kuò)大的瓶頸。
此外，在得到抗人胸腺淋巴細(xì)胞免疫的抗體血清后，在成品的生產(chǎn)工藝中，需要用大量的人紅細(xì)胞醛化后吸附經(jīng)胸腺免疫動物后產(chǎn)生的相應(yīng)的抗人紅細(xì)胞抗體；用人胎盤去吸附經(jīng)胸腺免疫動物后產(chǎn)生的相應(yīng)的血小板抗體和血漿蛋白抗體等雜抗體，其目的是提高抗淋巴細(xì)胞抗體的純度。使用這一方法不僅會丟失一部分抗淋巴細(xì)胞抗體，還不能完全除去這些雜抗體。所以患者使用該產(chǎn)品會有些輕微的溶血、出血等副作用。
Jurkat細(xì)胞是一種純T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞，具有成熟的T輔助淋巴細(xì)胞的表型特征。目前，國內(nèi)外尚未有采用Jurkat細(xì)胞代替人胸腺淋巴細(xì)胞免疫動物制備抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料的相關(guān)報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有制備方法存在的原料來源困難、成品雜抗體多從而副作用大的缺點，提供一種新的抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料的制備方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的方法為采用Jurkat細(xì)胞系代替人胸腺淋巴細(xì)胞作為免疫原，免疫動物為包括豬、馬、兔、綿羊在內(nèi)的哺乳動物。
由于采用了上述方案，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點1)現(xiàn)有技術(shù)采用的人胸腺淋巴細(xì)胞系取自醫(yī)院6個月以上引產(chǎn)的死嬰，細(xì)胞來源已愈加困難，應(yīng)用本發(fā)明的方法可以走出胸腺原料不足的瓶頸，擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。
2)采用本發(fā)明的方法，可以省掉生產(chǎn)工藝中用醛化人紅細(xì)胞和人胎盤去吸附相應(yīng)的抗人紅細(xì)胞抗體、抗人血小板抗體、抗人血漿蛋白抗體等雜抗體的步驟，在降低生產(chǎn)成本的同時提高了產(chǎn)品質(zhì)量，產(chǎn)品安全系數(shù)大大提高。
具體實施例方式
實施例一豬抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料的制備方法本發(fā)明實施例涉及的細(xì)胞包括Jurkat細(xì)胞系和人胸腺淋巴細(xì)胞，其中Jurkat細(xì)胞系購自ATCC，人胸腺淋巴細(xì)胞系取自醫(yī)院6個月以上引產(chǎn)的死嬰。實施例中如無特別說明均為常規(guī)方法。
采用流式細(xì)胞儀檢測購得Jurkat細(xì)胞系的CD抗原分子，結(jié)果表明CD2+表達(dá)99.64％、CD3+表達(dá)99.99％、CD4+表達(dá)91.66％、CD8+表達(dá)0.14％。同時，采用流式細(xì)胞儀檢測人胸腺淋巴細(xì)胞的CD抗原分子，結(jié)果表明CD2+表達(dá)99.91％、CD3+表達(dá)76.87％、CD4+表達(dá)91.53％、CD8+表達(dá)91.53％。
將Jurkat細(xì)胞系接種于RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，加入白細(xì)胞介素-2以保持細(xì)胞系CD分子表達(dá)穩(wěn)定。三天后再加入上述新鮮培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，數(shù)天后將各瓶中的培養(yǎng)液傾出2/3，離心收獲細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，培養(yǎng)瓶中余下的細(xì)胞按傾出量補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)供下次免疫用。用生理鹽水將計數(shù)后的淋巴細(xì)胞洗滌3次，離心操作同上。
采用Jurkat細(xì)胞，按《中華人民共和國藥典三部》規(guī)定的免疫程序免疫豬制備豬抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料血清，按豬抗人T細(xì)胞免疫球蛋白檢定標(biāo)準(zhǔn)作E玫瑰花環(huán)形成抑制試驗、淋巴細(xì)胞毒試驗、人紅細(xì)胞抗體測定、人血小板抗體測定。采用人胸腺淋巴細(xì)胞，按《藥典三部》規(guī)定的免疫程序免疫豬制備豬抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料血清，按豬抗人T細(xì)胞免疫球蛋白檢定標(biāo)準(zhǔn)作E玫瑰花環(huán)形成抑制試驗、淋巴細(xì)胞毒試驗、人紅細(xì)胞抗體測定、人血小板抗體測定(結(jié)果見表1)。
表1兩種方法制備的抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料的檢測結(jié)果

據(jù)《中華人民共和國藥典三部》的檢定標(biāo)準(zhǔn)豬抗人T細(xì)胞免疫球蛋白的原料血清或血漿的E玫瑰花環(huán)形成抑制試驗結(jié)果不低于1∶1000，淋巴細(xì)胞毒試驗結(jié)果不低于1∶500，人紅細(xì)胞抗體不高于1∶64，人血小板抗體不高于1∶4。
E玫瑰花環(huán)形成抑制試驗和淋巴細(xì)胞毒試驗結(jié)果顯示用Jurkat細(xì)胞系免疫動物后得到的抗體與用胸腺淋巴細(xì)胞免疫動物得到的抗體水平等同，均達(dá)到《中華人民共和國藥典三部》豬抗人T細(xì)胞免疫球蛋白的檢定標(biāo)準(zhǔn)。而用Jurkat細(xì)胞系免疫動物，由于是純T淋巴細(xì)胞，抗人紅細(xì)胞抗體和血小板抗體滴度指標(biāo)基本達(dá)到成品的要求，可以省去生產(chǎn)工藝中用醛化人紅細(xì)胞和人胎盤去吸附相應(yīng)的豬抗人紅細(xì)胞抗體、豬抗人血小板抗體、豬抗人血漿蛋白抗體等雜蛋白抗體的步驟，能夠在降低成本的同時提高抗淋巴細(xì)胞抗體的收獲并提高產(chǎn)品質(zhì)量，有效減少了該產(chǎn)品的副作用。
實施例二兔抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料的制備方法采用Jurkat細(xì)胞，按《藥典三部》規(guī)定的免疫程序免疫兔制備兔抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料血清，按兔抗人T細(xì)胞免疫球蛋白檢定標(biāo)準(zhǔn)作E玫瑰花環(huán)形成抑制試驗、淋巴細(xì)胞毒試驗、人紅細(xì)胞抗體測定、人血小板抗體測定。
E玫瑰花環(huán)形成抑制試驗和淋巴細(xì)胞毒試驗結(jié)果顯示用Jurkat細(xì)胞系免疫兔得到的抗體與用胸腺淋巴細(xì)胞免疫兔得到的抗體水平等同，均達(dá)到《藥典三部》兔抗人T細(xì)胞免疫球蛋白的檢定標(biāo)準(zhǔn)，即兩者均不低于1∶512。而用Jurkat細(xì)胞系免疫兔，抗血清中抗人紅細(xì)胞抗體和血小板抗體滴度指標(biāo)也達(dá)到成品的要求，即人紅細(xì)胞抗體不高于1∶64，人血小板抗體不高于1∶4。
上述實施例僅對采用豬和兔作為免疫動物行了詳細(xì)說明，但是，利用Jurkat細(xì)胞系免疫其他哺乳動物制備抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料的方法仍屬于本發(fā)明的范疇。
權(quán)利要求
1.一種抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料的制備方法，其特征在于采用Jurkat細(xì)胞系代替人胸腺淋巴細(xì)胞作為免疫原，免疫動物為包括豬、馬、兔、綿羊在內(nèi)的哺乳動物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗人淋巴細(xì)胞免疫球蛋白原料的制備方法，采用Jurkat細(xì)胞系代替人胸腺淋巴細(xì)胞作為免疫原。應(yīng)用本發(fā)明的方法可以走出胸腺原料不足的瓶頸，擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。同時可以省掉生產(chǎn)工藝中去除雜抗體的步驟，在降低生產(chǎn)成本的同時提高了產(chǎn)品質(zhì)量，產(chǎn)品安全系數(shù)大大提高。
文檔編號C07K16/24GK101016338SQ20071003450
公開日2007年8月15日 申請日期2007年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月7日
發(fā)明者李宏實 申請人:長沙博康生物醫(yī)藥研究所