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      一種表面固定金屬離子的磁性微球及其制備方法和應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):3559117閱讀:249來源:國(guó)知局
      專利名稱:一種表面固定金屬離子的磁性微球及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
      技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬無機(jī)材料合成及生化分析技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種具有超順磁性的表面固定金屬離子的磁性微球及其制備方法和應(yīng)用。
      并以其作為微吸附劑,可對(duì)復(fù)雜肽段混合物中的磷酸化肽段實(shí)現(xiàn)高選擇性富集,并對(duì)富集的樣品直接進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜的分析和鑒定,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)的鑒定。可使用于該類磁性微球的合成及適用于復(fù)雜肽段混合物中磷酸化肽段的有效富集及磷酸化位點(diǎn)的鑒定。
      背景技術(shù)
      蛋白質(zhì)的磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化過程調(diào)節(jié)著細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),細(xì)胞分化和細(xì)胞生長(zhǎng)等幾乎所有的生命過程。細(xì)胞中所有的蛋白質(zhì)有大約三分之一是磷酸化的,因此發(fā)展磷酸化蛋白的研究方法對(duì)于認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)過程具有重要的意義。近年來,基于基質(zhì)輔助激光解析的飛行時(shí)間質(zhì)譜成為磷酸化蛋白結(jié)構(gòu)解析的強(qiáng)大輔助工具。但在質(zhì)譜分析中,由于磷酸化肽段離子化效率低,因此其信號(hào)往往被非磷酸化肽段所抑制,這對(duì)磷酸化肽段的鑒定提出了挑戰(zhàn)。在質(zhì)譜分析前先對(duì)磷酸化蛋白或肽段進(jìn)行專一的分離富集為磷酸化蛋白的結(jié)構(gòu)解析提供了有效的解決方法。固定金屬離子螯合色譜(IMAC)是該方面目前研究的熱點(diǎn)。通過固定在多孔樹脂上的金屬離子和磷酸化肽段或蛋白的磷酸根離子之間的靜電相互作用實(shí)現(xiàn)分離富集。但是該富集過程中,從樹脂上洗脫樣品時(shí)會(huì)造成的樣品損失以及操作方法相對(duì)繁瑣,因此對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)是十分必要的。
      磁性聚合物微球以其本身特有的物理、化學(xué)性質(zhì)以及在細(xì)胞分離、磁輔助給藥和酶固定等眾多領(lǐng)域中的潛在應(yīng)用前景而得到了廣泛的關(guān)注。磁性聚合物微球融合了磁性材料的磁響應(yīng)特性和微球聚合物材料的高分散性等優(yōu)點(diǎn),使得其對(duì)痕量肽段的富集成為可能。現(xiàn)有研究表明由于聚合物材料的包覆造成材料的磁感應(yīng)強(qiáng)度大大下降,從而限制了該類材料在痕量物質(zhì)的分離富集領(lǐng)域的發(fā)展應(yīng)用。

      發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、效率高、效果好,能對(duì)痕量磷酸化肽段進(jìn)行高選擇性富集及直接進(jìn)行質(zhì)譜分析的表面固定有金屬離子的磁性微球及其制備方法和應(yīng)用。
      本發(fā)明提供的表面固定有金屬離子的磁性微球,是在超順磁性Fe3O4微球表面以溶膠凝膠法包覆二氧化硅,然后采用(2,3-環(huán)氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷、亞氨基二乙酸對(duì)其表面進(jìn)行化學(xué)修飾,進(jìn)而固定金屬離子而獲得,其結(jié)構(gòu)如下式所示 式中,F(xiàn)1表示四氧化三鐵磁性微球,Si2表示磁球外面包覆的二氧化硅層;M表示表面固定的金屬離子;這些金屬離子M可以是Fe3+、Al3+、Ga3+、In3+、Ce3+、Zr4+、Ni2+或Cu2+等。用于磷酸化肽段富集的磁球外部固定的金屬離子可以是Fe3+、Al3+、Ga3+、In3+、Ce3+或Zr4+等。
      上述表面固定金屬離子的磁性微球的制備方法如下(1)用水熱法合成Fe3O4超順磁性微球,其步驟為采用2.0-5.0克FeCl3·6H2O為原料,以40-100mL乙二醇為分散體系,添加5-10克無水乙酸鈉,反應(yīng)溫度為190-210℃,反應(yīng)時(shí)間為8-24小時(shí),生成四氧化三鐵磁性Fe3O4微球,其粒徑是100-300nm。
      (2)采用溶膠凝膠法在上述微球表面包覆二氧化硅,其步驟為首先對(duì)水熱法合成好的磁性微球進(jìn)行表面活化,取10-100mg;加入1-3M的稀鹽酸溶液超聲分散5-15分鐘;磁分離后加入10-40mL去離子水、50-250mL乙醇、1-3mL氨水,超聲分散5-15分鐘;機(jī)械攪拌同時(shí)加入0.05-3mL正硅酸乙酯,溫度20-40℃,攪拌8-18小時(shí)。磁分離收集,水和乙醇清洗,40-60攝氏度真空干燥12-24,得磁性硅微球,其二氧化硅包覆層厚度為20-100nm;(3)在磁性硅球表面進(jìn)行化學(xué)修飾固定金屬離子,其步驟為在100mL的圓底燒瓶中加入3-5g亞氨基二乙酸(iminodiacetic acid,IDA),加入濃度為9-11 M的NaOH水溶液溶解,最終溶液體積為40-60mL且pH值為9-12。將該反應(yīng)器置于冰水浴中,磁力攪拌0.5-2h。在磁力攪拌的同時(shí),在0.5-2h內(nèi),逐滴往反應(yīng)器中加入1-3g GLYMO((2,3-環(huán)氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷),然后將混合溶液加熱至50-70,反應(yīng)4-8h,再將反應(yīng)體系冷卻。用濃鹽酸將得到的IDA衍生的硅烷偶聯(lián)試劑溶液的PH值調(diào)節(jié)為4-6。將0.01-0.03g磁性硅球超聲分散在30-60mL無水乙醇中,然后加入5.0-15.0mL上述實(shí)驗(yàn)制備的硅烷偶聯(lián)試劑溶液,反應(yīng)體系在30-50℃反應(yīng)16-24h;最終將得到的產(chǎn)物用乙醇清洗干凈。將得到的產(chǎn)物分散在10-20mL濃度為0.1-0.2M的FeCl3溶液中,振蕩分散2-4h;然后用去離子水反復(fù)清洗材料。
      對(duì)包覆好二氧化硅磁性微球進(jìn)行表面化學(xué)修飾,其過程是先合成GLYMO-IDA分子, GLYMO IDAGLYMO-IDA然后將其鍵合在硅球表面,進(jìn)而螯合固定金屬離子。其反應(yīng)路線如下本發(fā)明中,水熱法合成的四氧化三鐵磁性微球和包覆好二氧化硅的磁性微球皆具有很好的超順磁性,其飽和磁化強(qiáng)度分別為70-100emu/g和50-80emu/g。
      本發(fā)明合成的具有超順磁性表面固定金屬離子的磁性微球可直接放入含有磷酸化肽的復(fù)雜肽段混合物中,無需特殊處理;富集好后,采用簡(jiǎn)單磁場(chǎng)作用即可實(shí)現(xiàn)磷酸化肽和其他樣品的分離,無需離心,所以可以克服傳統(tǒng)離心造成的非磷酸化肽的共離心沉淀問題;富集后樣品無需洗脫,克服了樣品洗脫過程造成的樣品損失問題,并且該材料不存在傳統(tǒng)材料的“孔洞效應(yīng)”,可直接用于基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜分析,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)的鑒定,方法簡(jiǎn)單實(shí)用有效。
      本發(fā)明中,上述富集體系的pH值為1-6,樣品濃度為0.05-5ng/μL,超順磁性微球量是10-1000μg/1mL樣品,富集時(shí)間在15-90分鐘,富集溫度在20-45攝氏度,本發(fā)明可用任何一種合成的表面固定不同金屬離子的磁性微球,其溶液分散性非常好,體系均勻穩(wěn)定,有利于溶液中的磷酸化肽在材料上的富集。
      本發(fā)明的固定金屬離子磁性微球合成方法簡(jiǎn)單有效并具有很好的磁場(chǎng)感應(yīng)性;可對(duì)磷酸化肽進(jìn)行有效選擇性富集;富集過程無需離心分離,采用磁場(chǎng)作用就可實(shí)現(xiàn)材料和樣品的分離;與基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜有很好的相容性,被固定金屬離子磁性微球吸附后的樣品無需樣品洗脫步驟可直接進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜分析,避免了洗脫過程造成的樣品損失;方法簡(jiǎn)單有效。本發(fā)明可對(duì)低至20fmol/μL級(jí)的復(fù)雜肽段混合物中的磷酸化肽實(shí)現(xiàn)高選擇性富集,富集效率提高一個(gè)數(shù)量級(jí)以上;采用富集到的磷酸化肽樣品可進(jìn)而實(shí)現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)的鑒定。該材料的合成及應(yīng)用方法在蛋白質(zhì)組學(xué)翻譯后修飾研究等領(lǐng)域有良好的實(shí)用價(jià)值和應(yīng)用前景。


      圖1為水熱法合成的四氧化三鐵磁性微球的透射電鏡圖。
      圖2為水熱法合成的四氧化三鐵磁性微球(a)和表面包覆二氧化硅的磁性微球(b)的掃描電鏡圖。
      圖3為水熱法合成的四氧化三鐵磁性微球(a)和表面包覆二氧化硅的磁性微球(b)的透射電鏡圖??梢姶徘蛲獠烤鶆虬擦硕趸鑼印?br> 圖4為水熱法合成的四氧化三鐵磁性微球(實(shí)線)和表面包覆二氧化硅的磁性微球(虛線)的磁滯回線圖??梢娀瘜W(xué)修飾前后磁球都具有很好的超順磁性。
      圖5為表面固定金屬離子的修飾的磁性微球的合成路線圖。
      圖6為表面包覆二氧化硅的磁性微球(a)和表面固定Fe3+離子磁性微球(b)的傅立葉變換紅外譜圖。證實(shí)了成功地采用GLYMO-IDA對(duì)硅球表面進(jìn)行了修飾,并且Fe3+也已經(jīng)固定到磁性硅球表面。
      圖7為表面包覆二氧化硅的磁性微球在水中(0.1wt.-%),施加磁場(chǎng)(2000Gs)的連續(xù)的分離圖,圖片顯示該材料具有很好的磁場(chǎng)相應(yīng)性。
      圖8為10μg表面修飾的固定Fe3+離子磁性微球富集5ng/μL(a和b)和0.5ng/μL(d和e)β-casein的胰蛋白酶酶解混合肽段的前后的MALDI-TOF MS譜圖以及富集后的MALDI-TOF MS/MS串級(jí)質(zhì)譜圖(c),可見磷酸化肽中的磷酸化位點(diǎn)得到了鑒定。比較a和b圖,c和d圖,磷酸化肽富集效率均超過一個(gè)數(shù)量級(jí)以上。
      具體實(shí)施例方式
      通過實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明所提供的超順磁性的表面固定金屬離子的磁性微球材料進(jìn)行樣品富集和基質(zhì)輔助激光解吸離子化/質(zhì)譜直接分析過程的進(jìn)一步說明。
      實(shí)施例1表面固定金屬離子磁性微球的合成水熱法合成磁性微球采用2.7克FeCl3·6H2O分散在100mL乙二醇中,添加7.2克無水乙酸鈉,200攝氏度反應(yīng)8小時(shí)得四氧化三鐵磁性微球,60攝氏度真空干燥12小時(shí)。
      溶膠凝膠法在微球表面包覆二氧化硅取10mg磁性微球,加入2M的稀鹽酸溶液超聲分散5分鐘后,磁分離加入20mL去離子水,70mL乙醇分散,1mL氨水;超聲分散5分鐘;機(jī)械攪拌同時(shí)加入0.05mL正硅酸乙酯。室溫?cái)嚢?2小時(shí)。磁分離收集,水和乙醇清洗,60攝氏度真空干燥24小時(shí)。
      合成3-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷-亞氨基二乙酸硅烷偶聯(lián)試劑4.20g亞氨基二乙酸溶于10mol/L的NaOH水溶液,調(diào)節(jié)pH為11。在0攝氏度加入1.5g的3-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷,65攝氏度反應(yīng)6小時(shí)。調(diào)節(jié)產(chǎn)物pH值為6。
      表面固定金屬離子的磁性微球的合成20mg的磁性硅球分散在50mL乙醇中,加入10g 3-縮水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷-亞氨基二乙酸硅烷偶聯(lián)試劑,40攝氏度反應(yīng)24小時(shí)。磁分離產(chǎn)物分散在20mL,濃度為0.2mol/L FeCl3水溶液中,攪拌2小時(shí),60攝氏度干燥24小時(shí)。
      實(shí)施例2復(fù)雜肽段混合物中磷酸化肽的選擇性富集和質(zhì)譜測(cè)定取200μL濃度為5ng/μL酪蛋白胰蛋白酶酶解的肽段混合物,加入10μL的1mg mL-1的表面固定三價(jià)鐵離子的磁性微球,用乙酸調(diào)節(jié)體系pH值為2,在37攝氏度下振蕩90分鐘;在磁場(chǎng)作用下分離上清液和富集了磷酸化肽段的材料。用50%(體積比)的乙腈水溶液清洗材料一次,在沉淀中加入10μL的50%(體積比)的乙腈水溶液,振蕩使之懸浮。懸浮液0.4μL與等體積30mg mL-12,5-DHB(50%乙腈水溶液,v/v)and 1%(v/v)H3PO4水溶液,1∶1(v/v)混合點(diǎn)至MALDI靶板上,在MALDI-TOF/TOF(4700 Proteomics Analyzer,Applied Biosystems);激光器為Nd-YAG激光,波長(zhǎng)355nm,激光脈沖頻率200Hz;加速電壓20KV;正離子模式,反射式TOF檢測(cè)。由圖8b所示,磷酸化肽段得到了有效選擇性富集。
      實(shí)施例3調(diào)整β-酪蛋白胰蛋白酶酶解的肽段混合物的濃度為0.5ng/μL,其他條件不變,重復(fù)上述選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖8d和8e,對(duì)比兩圖可見,富集后磷酸化肽段得到了有效的選擇性富集。
      實(shí)施例4-6調(diào)整吸附時(shí)間為15,30,60分鐘,其他條件同實(shí)施例2,進(jìn)行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。
      實(shí)施例7-8調(diào)整吸附溫度為20,45度,其他條件同實(shí)施例2,進(jìn)行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。
      實(shí)施例9-10調(diào)整吸附體系pH值為4,6,其他條件同實(shí)施例2,進(jìn)行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。
      實(shí)施例11-12調(diào)整采用的材料表面固定的金屬離子分別是Fe3+、Al3+、Ga3+、In3+、Ce3+、Zr4+,其他條件同實(shí)施例2,進(jìn)行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。
      實(shí)施例4-12所得結(jié)果與實(shí)施例2和3相似。
      權(quán)利要求
      1.一種表面固定金屬離子的磁性微球,其特征在于是在超順磁性Fe3O4微球表面以溶膠凝膠法包覆二氧化硅,然后采用(2,3-環(huán)氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷、亞氨基二乙酸對(duì)其表面進(jìn)行化學(xué)修飾,進(jìn)而固定金屬離子而獲得,其結(jié)構(gòu)如下式所示 式中,F(xiàn)1表示四氧化三鐵磁性微球,Si2表示磁球外面包覆的二氧化硅層;M表示表面固定的金屬離子;這里金屬離子M為Fe3+、Al3+、Ga3+、In3+、Ce3+、Zr4+、Ni2+或Cu2+。
      2.一種如權(quán)利要求1所述的表面固定金屬離子的磁性微球的制備方法,其特征在于具體步驟如下(1)用水熱法合成Fe3O4超順磁性微球;采用2.0-5.0克FeCl3·6H2O為原料,以40-100mL乙二醇為分散體系,添加5-10克無水乙酸鈉,反應(yīng)溫度為190-210℃,反應(yīng)時(shí)間為8-24小時(shí),生成四氧化三鐵磁性微球,其粒徑是100-300nm;(2)采用溶膠凝膠法在微球表面包覆二氧化硅首先對(duì)水熱法合成好的磁性微球進(jìn)行表面活化取10-100mg,加入1-3M的稀鹽酸溶液超聲分散5-15分鐘;磁分離后加入10-40mL去離子水,50-250mL乙醇,1-3mL氨水,超聲分散5-15分鐘;機(jī)械攪拌同時(shí)加入0.05-3mL正硅酸乙酯,溫度20-40攝氏度下攪拌8-18小時(shí);磁分離收集,水和乙醇清洗,40-60攝氏度真空干燥12-24,得磁性微球,其二氧化硅包覆硅層厚度為20-100nm;(3)在磁性硅球表面進(jìn)行化學(xué)修飾固定金屬離子在100mL的反應(yīng)器中加入3-5g亞氨基二乙酸,加入濃度為9-11M的NaOH水溶液溶解,最終溶液體積為40-60mL且pH值為9-12;將該反應(yīng)器置于冰水浴中,磁力攪拌0.5-2h,其間逐滴往反應(yīng)器中加入1-3g(2,3-環(huán)氧丙氧基)丙基三乙氧基硅烷,然后將混合溶液加熱至50-70,反應(yīng)4-8h,再將反應(yīng)體系冷卻;用濃鹽酸將得到的亞氨基二乙酸衍生的硅烷偶聯(lián)試劑溶液的PH值調(diào)節(jié)為4-6;將0.01-0.03g磁性硅球超聲分散在30-60mL無水乙醇中,然后加入5.0-15.0mL上述過程制備的硅烷偶聯(lián)試劑溶液,反應(yīng)體系在30-50℃反應(yīng)16-24h;最終將得到的產(chǎn)物用乙醇清洗干凈;將得到的產(chǎn)物分散在10-20mL,濃度為0.1-0.2M的FeCl3溶液中,振蕩分散2-4h;然后用去離子水反復(fù)清洗材料。
      3.如權(quán)利要求1所述的表面固定金屬離子的四氧化三鐵磁性微球作為微吸附劑的應(yīng)用,其特征在于直接將所述磁性微球加入含有磷化肽的復(fù)合肽段混合物中,進(jìn)行痕量磷酸化肽選擇性富集,富集體系pH值為1-6,樣品濃度為0.5-5ng/μL,富集時(shí)間為15-90分鐘;富集溫度為20-45℃,超順磁性微球量是10-1000μg/mL樣品。
      全文摘要
      本發(fā)明屬于無機(jī)材料和生化分析技術(shù)領(lǐng)域,具體為一種表面固定金屬離子的磁性微球及其制備方法和應(yīng)用。該磁性微球是在Fe
      文檔編號(hào)C07K1/00GK101053827SQ20071004048
      公開日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2007年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月10日
      發(fā)明者鄧春暉, 徐秀青, 李嫣, 張祥民 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)
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