專利名稱：：果蠅抗菌肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域，具體地說是涉及一種利用果蠅制備抗菌肽的方法。技術(shù)背景抗菌肽是昆蟲浸染微生物等因素后在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)?？咕姆肿恿枯^小，具有對(duì)熱穩(wěn)定、水溶性好、廣譜抗菌等特點(diǎn)，而且與抗生素的抗菌機(jī)理完全不同，已成為新型抗菌、抗癌藥物研究開發(fā)的目標(biāo)，有著廣闊的發(fā)展前景。黑腹果蠅屬于雙翅目、果蠅科、果蠅屬，它體形小，成蠅體長(zhǎng)約0.5cm。雄性果蠅成蟲腹部有7條環(huán)紋，有性梳。雌性果蠅成蟲腹部有5條環(huán)紋，沒有性梳。果蠅繁殖快，生活周期分為卵一幼蟲一蛹一成蟲4個(gè)明顯的時(shí)期。卵長(zhǎng)約0.5mm、白色，前端背面的觸絲能附著在食物或瓶壁上。卵經(jīng)2224h孵化為幼蟲，幼蟲約45mra，頭部稍尖，有一黑色鉤狀口器。幼蟲生活約4天左右化蛹，顏色淡黃、柔軟，逐漸硬化變成深褐色，此時(shí)即將羽化成果蠅成蟲。果蠅喜好以腐敗的水果等作為食物，從幼蟲到成蟲都生活在雜菌橫生的污濁環(huán)境中，隨時(shí)都有被病菌感染的機(jī)會(huì)，但它們卻有著極強(qiáng)的適應(yīng)惡劣環(huán)境的生存能力，預(yù)示著它們體內(nèi)存在著獨(dú)特的免疫防御機(jī)制，可能會(huì)產(chǎn)生抗菌肽。但長(zhǎng)期以來由于人們對(duì)果蠅的研究往往偏重在遺傳學(xué)上，又加果蠅個(gè)體小，故其經(jīng)濟(jì)價(jià)值未被深入開發(fā)，國(guó)內(nèi)對(duì)其研究較少。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種制備果蠅抗菌肽的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案為利用誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法，用細(xì)菌或真菌誘導(dǎo)果蠅成蟲產(chǎn)生抗菌肽。具體做法為用毛細(xì)針蘸細(xì)菌懸液，如金黃色葡萄球菌懸液，針刺果蠅腹部后培養(yǎng)；或者將將果蠅置于含有真菌，如青霉的環(huán)境下培養(yǎng)。將上述誘導(dǎo)后的果蠅加入Tris-HCl緩沖液，研磨果蠅至漿狀，離心后取上清液，即得到果蠅抗菌肽。經(jīng)檢測(cè)，本方法得到的果蠅抗菌肽對(duì)細(xì)菌和真菌有抑制作用?？咕臒岱€(wěn)定性較好，4CTC、60°C、8(TC和10(TC處理10分鐘仍保持抗菌活性。自然培養(yǎng)的果蠅成蟲體內(nèi)不存在抗菌肽，通過本方法能誘導(dǎo)果蠅產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌和真菌有抑制作用的抗菌肽。金黃色葡萄球菌能誘導(dǎo)果蠅產(chǎn)生抗菌肽，其抗菌肽不僅對(duì)金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抗菌作用，也對(duì)大腸肝菌產(chǎn)生抗菌作用；青霉培養(yǎng)法誘導(dǎo)果蠅成蟲產(chǎn)生的抗菌肽對(duì)青霉有抑制作用。該抗菌肽熱穩(wěn)定性較好，40°C、60°C、8(TC和IO(TC處理IO分鐘仍保持抗菌活性。具體實(shí)施方式配制玉米粉果蠅培養(yǎng)基，121°C滅菌20min。用乙醚將原種瓶中的果蠅麻醉后，移入裝有玉米粉培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，每瓶5對(duì)，25'C恒溫培養(yǎng)。約7天后，用放大鏡對(duì)果蠅幼蟲和成蟲的身體特征進(jìn)行觀察。實(shí)施例1用金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)抗菌肽配制牛肉膏培養(yǎng)基12rC滅菌20min。劃線法將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌接種在牛肉膏培養(yǎng)基斜面上，37'C培養(yǎng)24h。取1支金黃色葡萄球菌斜面，分別加入5ml生理鹽水(0.9XNaCI溶液)，用接種針輕輕刮取菌體后移入無菌試管中，充分振蕩，制成金黃色葡萄球菌菌懸液。針刺法乙醚麻醉果蠅成蟲，用毛細(xì)針蘸金黃色葡萄球菌菌懸液后，針刺果蠅腹部。刺傷后的果蠅繼續(xù)于25'C培養(yǎng)24h。實(shí)施例2用青霉菌誘導(dǎo)抗菌肽配制PDA培養(yǎng)基，12rc滅菌20min。劃線法將青霉接種在PDA培養(yǎng)基斜面上，28。C培養(yǎng)4-5天。培養(yǎng)法乙醚麻醉果蠅成蟲，移入長(zhǎng)滿青霉的培養(yǎng)瓶中，在25'C培養(yǎng)4-5天。實(shí)施例3抗菌肽的提取分別取實(shí)施例1和2誘導(dǎo)得到的果蠅成蟲，乙醚麻醉果蠅成蟲，稱重，以20:1的比例加Tris-HCI緩沖液，研磨果蠅至漿狀。提取液3500r/min離心10min，上清液4'C保存。實(shí)施例4抗菌活性的檢測(cè)配制牛肉膏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基，12rC滅菌20min。劃線法將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌接種在牛肉膏培養(yǎng)基斜面上，37'C培養(yǎng)24h。劃線法將青霉接種在PDA培養(yǎng)基斜面上，28'C培養(yǎng)4-5天。各取1支大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和青霉斜面，分別加入5ml生理鹽水(O.9^NaCl溶液)，用接種針輕輕刮取菌體或孢子后，移入無菌試管中，充分振蕩，制成大腸桿菌菌懸液、金黃色葡萄球菌菌懸液和青霉孢子懸液。(1)抗細(xì)菌活性取大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液以及青霉孢子懸液各1ml，分別加入溶化而不燙手的100ml牛肉膏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基中，充分振蕩后，傾倒入無菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿約20ml。靜置即得大腸桿菌檢定板、金黃色葡萄球菌檢定板和青霉檢定板。用直徑6mm的濾紙片蘸取無菌水、頭孢拉定溶液、未誘導(dǎo)的果蠅提取液和實(shí)施例1中針刺法誘導(dǎo)的果蠅提取液，輕輕貼在大腸桿菌檢定板和金黃色葡萄球菌檢定板上。平板置于37'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，觀察抑菌效果。結(jié)果如表1。表1果蠅成蟲提取液的抗細(xì)菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>未誘導(dǎo)的果蠅成蟲體內(nèi)沒有抗菌肽的產(chǎn)生。用針刺金黃色葡萄球菌誘導(dǎo)的果蠅成蟲體內(nèi)產(chǎn)生的抗菌肽不僅具有抗金黃色葡萄球菌的活性，也有抗大腸桿菌的活性。(2)抗真菌活性濾紙片蘸取無菌水、兩性霉素溶液、未誘導(dǎo)的果蠅提取液和實(shí)施例2中培養(yǎng)法誘導(dǎo)的果蠅提取液，輕輕貼在青霉檢定板上。平板置于28'C培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，觀察抑菌效果。結(jié)果如表2。表2果蠅成蟲提取液的抗真菌活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>養(yǎng)法能誘導(dǎo)果蠅成蟲產(chǎn)生抗青霉的抗菌肽。實(shí)施例5抗菌肽的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)把實(shí)施例1中針刺法誘導(dǎo)的抗菌肽分別置于4crc、6crc、so°c、ioo'c的水浴中處理10min后，檢測(cè)抗細(xì)菌活性。結(jié)果如表3。表3果蠅成蟲抗菌肽的熱穩(wěn)定性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>針刺法誘導(dǎo)的抗菌肽具有較好的熱穩(wěn)定性。權(quán)利要求1、一種果蠅抗菌肽的制備方法，其特征在于，用細(xì)菌或真菌誘導(dǎo)果蠅成蟲產(chǎn)生抗菌肽。2、權(quán)利要求1的果蠅抗菌肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟用毛細(xì)針蘸細(xì)菌懸液，針刺果蠅腹部后培養(yǎng)。3、權(quán)利要求1或2的果蠅抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述細(xì)菌選自金黃色葡萄球菌。4、權(quán)利要求1的果蠅抗菌肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟將果蠅置于含有真菌的環(huán)境下培養(yǎng)。5、權(quán)利要求1或4果蠅抗菌肽的制備方法，其特征在于，所述真菌選自青霉。6、權(quán)利要求1的果蠅抗菌肽的制備方法，其特征在于，將誘導(dǎo)后的果蠅加入Tris-HC1緩沖液，研磨果蠅至槳狀，離心后取上清液。全文摘要本發(fā)明公開了一種果蠅抗菌肽的制備方法。用細(xì)菌或真菌，采用針刺和培養(yǎng)法，誘導(dǎo)果蠅成蟲產(chǎn)生抗菌肽，提取后可得到果蠅抗菌肽。所得到的抗菌肽細(xì)菌和真菌有抑制，并且具有熱穩(wěn)定性。自然培養(yǎng)的果蠅成蟲體內(nèi)不存在抗菌肽，通過本方法能誘導(dǎo)果蠅產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌和真菌有抑制作用的抗菌肽。文檔編號(hào)C07K16/18GK101333254SQ20071004303公開日2008年12月31日申請(qǐng)日期2007年6月29日優(yōu)先權(quán)日2007年6月29日發(fā)明者后嘉毅申請(qǐng)人:上海市上海中學(xué)