專利名稱：：具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性的新型肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性肽的制備方法，特別涉及到一種生物復合酶解方法，及采用該方法制備得到的三種新的ACE抑制活性肽，具有降血壓功能。
背景技術(shù)：
：高血壓病是一種全球性常見多發(fā)病。由于藥物治療高血壓病會引起種種不良的反應，因而從天然蛋白質(zhì)中提取的食用安全性高，無副作用的降血壓肽日益成為非藥物治療高血壓最有前景的產(chǎn)品。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(簡寫為ACE，二肽羥基肽酶，EC3,4，15，1)，能夠催化血管緊張素I轉(zhuǎn)化為血管緊張素II，從而導致血壓升高。因此抑制ACE的活性成為調(diào)控血壓的一種手段。自1970年以來發(fā)現(xiàn)第一個自然產(chǎn)生的從毒蛇的毒液中分離得到的ACE抑制物以來，不斷有新的抗高血壓活性肽被研究和發(fā)現(xiàn)。目前很多ACE抑制劑(卡托普利等)已上市銷售，盡管這類合成藥物對降低高血壓的作用是顯著的，但長期使用出現(xiàn)的不良反應表明仍需要無副作用的降血壓治療劑或非藥物輔助治療制劑。目前已知許多食品蛋白來源的ACE抑制肽，來源包括魚(歐洲專利第1094071號)，動物奶蛋白(國際申請公開號W099/65326)及植物(中國專利公開號CN1731934)，這些肽大多包含2-12個氨基酸殘基。研究表明，在具有高活性的ACE抑制肽的結(jié)構(gòu)中，C端一般具有脯氨酸或疏水性氨基酸殘基，因此若蛋白原料中富含該類氨基酸，則有可能通過酶解得到高活性的ACE抑制肽。因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種具有較高ACE抑制活性的肽。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供新的多肽。本發(fā)明的另一個目的在于提供上述多肽的制備方法。本發(fā)明的第三個目的是提供上述多肽的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離或純化多肽，它包括具有SEQIDN0:1、2或3所示氨基酸序列的多肽或其酶解產(chǎn)物多肽。在另一優(yōu)選例中，所述的多肽具有SEQIDN0:1、2或3所示氨基酸序列。在本發(fā)明的第二方面，提供了一種如上述多肽的制備方法，所述的方法包括步驟(a)以前處理過的牛皮為原料，用胃蛋白酶及堿性蛋白酶進行復合酶解，得到酶解液；(b)將酶解液經(jīng)過分級超濾進行分離，得到如上述的多肽。在另一優(yōu)選例中，將步驟(b)得到的多肽通過反相高效液相色譜制備及反相高效液相色譜/電噴霧離子阱質(zhì)譜法及串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)分析得到具有SEQIDN0:1、2或3所示氨基酸序列的肽段。在另一優(yōu)選例中，鑒定得到三種肽的序列為ISVPGPM(SEQIDN0:1)、LGPVGNPGPA(SEQIDNO:2)、DLSFLPQPPQQ(SEQIDNO:3)。在另一優(yōu)選例中，前處理后的牛皮用PHI-2的緩沖液浸泡溶脹不超過8小時后機械間歇勻漿，加入生物酶酶解l-6小時。在另一優(yōu)選例中，前處理后的牛皮質(zhì)量與pH1-2的緩沖液體積的比例為lg:5-10ml，機械勻漿2-4min后將漿液于IO(TC水浴中加熱3-5min，冷卻后加入相同的緩沖液，使牛皮與緩沖液的質(zhì)量體積比為lg:15-20ml，然后機械勻漿3-5min。在另一優(yōu)選例中，所述緩沖液為氯化鉀-鹽酸緩沖液，離子強度為0.05-0.1M。在另一優(yōu)選例中，所述生物酶為胃蛋白酶及堿性蛋白酶的復合使用，終濃度為0.5%—3.0%;在另一優(yōu)選例中，對所述的酶解液進行超濾，其中截留分子量孔徑在5000-10000MW之間。在另一優(yōu)選例中，對超濾物采用反相高效液相法分離，色譜柱選用SF-C18柱，采用兩種溶劑體系進行洗脫，洗脫時乙腈的比例由5%梯度提升至60%。在另一優(yōu)選例中，對HPLC制備分離中活性最高的組分進行質(zhì)譜分析，通過反相高效液相色譜制備及反相高效液相色譜/電噴霧離子阱質(zhì)譜法及串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)得到具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性的肽段組成。在本發(fā)明的第三方面，提供了一種組合物，它含有治療有效量的如上述的多肽和生物學上可接受的載體。在另一優(yōu)選例中，所述的組合物包括藥物組合物，食品組合物，功能性食品，或保健品。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種如上述的多肽的用途，它可用于制備血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制劑。在另一優(yōu)選例中，所述的抑制劑可用于降低血壓。在另一優(yōu)選例中，一種包括具有SEQIDN0:1、2或3所示氨基酸序列的多肽的可用于制備降低血壓的藥物。在另一優(yōu)選例中，所述的可降低血壓的藥物具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)移酶的作用。在另一優(yōu)選例中，生物酶解后水解物IC5。=0.168mg/ml;超濾分離后組分的IC5。=0.079mg/ml;三種新的活性肽的ICs。分別為ISVPGPM(SEQIDN0:1)的IC5。=0.017mg/ml、LGPVGNPGPA(SEQIDN0:2)的IC5。=0.077mg/ml、DLSFLPQPPQQ(SEQIDN0:3)的IC5?！?.08mg/ml。據(jù)此，本發(fā)明提供了具有較高ACE抑制活性的多肽。如本文所用，"生物學上可接受的載體"指用于治療劑給藥、用于制作食品、用于輔助治療的治療劑給藥、和/或用于制作保健品或功能性食品的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語指這樣一些載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在組合物中生物學上可接受的載體可包括液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如崩解劑、潤濕劑、乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等。來自于本發(fā)明提供的多肽之外的非必要成分，以及其他非必要成分(例如其他輔助性成分)，也包括在生物學上可接受的載體的定義中。本發(fā)明提供一種具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性肽的制備方法，特別涉及到一種生物復合酶解方法，及采用該方法制備得到的三種新的ACE抑制活性肽。本發(fā)明的目的可以通過以下的步驟來實現(xiàn)1.用pHl-2的緩沖液浸泡前處理(脫脂及去除非膠原蛋白)后的牛皮，質(zhì)量與pHl-2的緩沖液體積的比例為lg:5-10ml，浸泡溶脹不超過8小時后機械間歇勻漿，勻漿2-4min后將漿液于10(TC水浴中加熱變性5-10min，冷卻后加入相同的緩沖液，使牛皮與緩沖液的質(zhì)量體積比為lg:15-20ml，然后再次機械勻漿3-5min;2.以上勻漿后溶液置于恒溫水浴中，溫度35-45。C，待勻漿液升溫至恒溫時加入胃蛋白酶，酶料質(zhì)量比為1:10-100，酶解l-4小時，反應結(jié)束后加入Tris使終濃度為0.05M-1.0M，加入NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH至中性，調(diào)節(jié)溫度50-7(TC,待勻漿液升溫至恒溫時加入堿性蛋白酶，酶料質(zhì)量比為1:20-200，酶解l-4小時，反應結(jié)束后于沸水浴中加熱滅酶12min后，冷卻至室溫；3.將酶解液離心后的上清液微濾后超濾，高活性組分進行減壓蒸餾濃縮；4.將濃縮后高活性組分經(jīng)反相高效液相色譜制備分離，收集液冷凍干燥；5.反相高效液相色譜分離得到高活性組分用反相高效液相色譜/電噴霧離子阱質(zhì)譜法及串聯(lián)質(zhì)譜分析純度及性質(zhì)。所述酶解液離心的時間為10-20min，離心轉(zhuǎn)速為8000-10000rpm;所述超濾為截流分子量(MWCO)為5000-10000的超濾膜；所述濃縮后樣品以100-200mg/ml的濃度進行制備色譜，反相高效液相色譜使用Sunfired8柱(19Xl50mm，5um，WatersInc，MA.美國)，UV225nm，色譜條件如下流動相為兩種溶劑體系(A)乙腈(含O.05%-0.1%甲酸)，(B)純水(含0.05%-0.1%甲酸)，對樣品進行洗脫(lml/ml)，首先釆用5%的乙腈無梯度洗脫10-15min，然后逐漸提高乙腈的比例至60%，梯度洗脫25-35min;所說的胃蛋白酶及堿性蛋白酶，可采用市售產(chǎn)品，如GENVIEW公司生產(chǎn)的胃蛋白酶(1:3000);諾維信公司生產(chǎn)的堿性蛋白酶(Alcalase2.4L);本發(fā)明中所用的檢測手段蛋白濃度的測定為現(xiàn)有常用的Lowry測定法，本發(fā)明中不再贅述；ACE體外抑制活性的測定是通過反相高效液相色譜來分析和量化ACE催化產(chǎn)物馬尿酸(HA)，樣品反應液包括50u1底物Hip-His-Leu(2mM)，50ul血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(2mU)，50iil待測多肽樣品，反應液均用含0.4MNaCl的硼酸緩沖液(p朋.3)配制。反應液均在37。C反應30min，然后用4N的鹽酸終止反應。底物經(jīng)ACE作用后產(chǎn)生的馬尿酸用SBds柱(4.6X250mm，5um，AngilenInc，MA.美國)于UV228nm下分析定量(5ul)，流動相為兩種溶劑體系(A)乙腈，(B)純水(含O.05%三氟乙酸)，對樣品進行洗脫(lml/ml)，其中(A)體積比為16%，其中抑制率(y。)為相對空白對照而言抑制劑對ACE的抑制量的百分比，ICs。為對ACE活性達到50%的抑制率時反應混和物中抑制劑的含量(以mg/ml蛋白濃度計)，ICs。的值越低，說明對ACE的抑制效果越好。圖1顯示了超濾后樣品的反相高效液相色譜分析的結(jié)果。圖2顯示了十肽LGPVGNPGPA(SEQIDN0:2)的反相高效液相色譜/電噴霧離子阱質(zhì)譜法分析圖譜。圖3、十肽LGPVGNPGPA(SEQIDN0:2)的串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)的b，y離子圖譜。具體實施方式發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了一種多肽，它具有SEQIDN0:1、2或3所示的氨基酸序列。該多肽具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)移酶的作用，可用于降低血壓。本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本案說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于1、本發(fā)明的原料采用富含I型膠原蛋白的牛皮，脯氨酸較其它食品蛋白原料高，因此能夠得到較高ACE抑制活性的酶解蛋白產(chǎn)物；2、本發(fā)明酶解技術(shù)工藝易于放大，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力；3、本發(fā)明是由生物酶解得到的低分子量多肽，無毒副作用，能夠開發(fā)成降血壓保健食品或高血壓輔助治療藥物，具有良好的市場前景；4、本發(fā)明提供了一種制備血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制肽的新方法，且提供了三個具有高抑制活性的肽段的氨基酸組成。下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明做進一步地說明，但本發(fā)明并不受限于下述實施例。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1制備多肽及其生物活性選用經(jīng)檢疫合格的新鮮牛皮，經(jīng)過去毛、脫脂、去除非膠原蛋白等工藝前處理后的牛皮細塊100g，浸泡于L5L的pH1.0,離子強度O.05M的氯化鉀-鹽酸緩沖溶液中6小時，持續(xù)攪拌使皮溶脹，溶脹結(jié)束后于組織搗碎機以12000rpra的轉(zhuǎn)速間歇勻漿3分鐘，然后將該勻漿液于沸水浴中加熱變性3分鐘，再次勻漿2分鐘；將上述勻漿液調(diào)至pH1.5，溫度38。C，加入1:3000的胃蛋白酶(終濃度1%)，采用攪拌槳以120rpm的轉(zhuǎn)速持續(xù)攪拌，4小時后停止反應，加入Tris堿使終濃度達到0.05M，用10N的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液酸堿度使達到pH8.0，升溫至55。C，加入堿性蛋白酶(終濃度0.6%)，以同上轉(zhuǎn)速持續(xù)攪拌，2小時后停止反應后，在沸水浴中滅酶10分鐘；將上述酶解物用0.22um的膜微濾除去雜質(zhì)及不溶物后，用MWC010000的超濾膜超濾，透過液再用麗C05000的超濾膜超濾，各組分ACE抑制活性見表1，取透過液進行減壓蒸餾濃縮，沸點60°C，真空度200MPa,濃縮至蛋白終濃度為170mg/ml;表1酶解物超濾后各組分的ACE抑制IC5。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>將濃縮后樣品用RP-HPLC制備分離，采用SunfireC18柱(WatersInc.，MA，美國)進行分析和制備，流動相采用兩種溶劑體系(A)0.07。/。的甲酸水溶液和(B)含有0.07。/。甲酸的乙腈溶液對所述柱進行洗脫(10inl/min)，首先用5%的(B)無梯度洗脫12分鐘，然后以5%-60%的乙腈梯度洗脫30分鐘，收集的各峰組分(a-g)冷凍干燥成粉末，抑制活性見表2;表2超濾后樣品收集液各組分的ACE抑制IC5。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>蛋白濃度同為0.025mg/ml將上述干燥粉重新溶解后，采用反相高效液相色譜/電噴霧離子阱質(zhì)譜法分析上述樣品，質(zhì)譜同步測定各組分的分子量(m/z)[M+H]+的值分別為879.4，701.3，1270.4，然后選擇[M+H]+離子通過串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)得到碎片離子，利用b離子和y離子互補的方法鑒定了多肽序列，質(zhì)譜分析結(jié)果借助儀器附帶的Biomass及TurboSEQUEST軟件進行處理，結(jié)果得到分子量分別為878.0、699.9、1269.4的三條肽段ISVPGPM(SEQIDN0:1)、LGPVGNPGPA(SEQIDN0:2)、DLSFLPQPPQQ(SEQIDNO:3)，ACE抑制活性見表3。表3鑒定得到的三種ACE抑制肽樣品序列測定MW計算MWIC50(mg/ml)ISVPGPM700.3699.90.017LGPVGNPGPA878.0878.00.077DLSFLPQPPQQ1269.41269.4〈0.08使用該工藝，用生物酶復合水解得到ACE抑制活性IC5。=0.168mg/ml的產(chǎn)，酶解液超濾后IC5。=0.079mg/ml，說明該酶解液含有較高活性的血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制肽，而經(jīng)過高效液相制備得到的三種具有高抑制活性的肽段ISVPGPM、LGPVGNPGPA、DLSFLPQPPQQ表明，該酶解液中含有這三種之前未報到過的新的ACE抑制肽，且均具有較高的ACE抑制活性。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而己，并非用以限定本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請的權(quán)利要求范圍中，任何他人完成的技術(shù)實體或方法，若是與申請的權(quán)利要求范圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。序列表<110>華東理工大學，上海市食品研究所<120〉具有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性的新型肽及其制備方法<130〉074478<160〉3<170〉Patentlnversion3.3<210〉1<211>7<212〉PRT<213〉人工序列<220><221〉MISC—FEATURE<223>多肽<400〉1lieSerValProGlyProMet15<210〉2<211〉10<212〉PRT<213〉人工序列<220><221〉MISC—FEATURE<223>多肽<400〉2LeuGlyProValGlyAsnProGlyProAla1510<210〉3<211〉11<212〉PRT<213〉人工序列<220〉<221>MISC一FEATURE<223>多肽<400>3AspLeuSerPheLeuProGinProProGinGin1510權(quán)利要求1.一種分離或純化多肽，其特征在于，它包括具有SEQIDNO1、2或3所示氨基酸序列的多肽或其酶解產(chǎn)物多肽。2.如權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于，它具有SEQIDN0:1、2或3所示氨基酸序列。3.—種如權(quán)利要求l所述的多肽的制備方法，其特征在于，所述的方法包括步驟(a)以前處理過的牛皮為原料，用胃蛋白酶及堿性蛋白酶進行復合酶解，得到酶解液；(b)將酶解液經(jīng)過分級超濾進行分離，得到如權(quán)利要求1所述的多肽。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，將步驟(b)得到的多肽通過反相高效液相色譜制備及反相高效液相色譜/電噴霧離子阱質(zhì)譜法及串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)分析得到具有SEQIDN0:1、2或3所示氨基酸序列的肽段。5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，前處理后的牛皮質(zhì)量與pHl-2的緩沖液體積的比例為lg:5-10ml，機械勻漿2-4min后將漿液于IO(TC水浴中加熱3-5min，冷卻后加入相同的緩沖液，使牛皮與緩沖液的質(zhì)量體積比為lg:15-20ml，然后機械勻漿3-5min。6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述生物酶為胃蛋白酶及堿性蛋白酶的復合使用，終濃度為0.5%—3.0%。7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，對所述的酶解液進行超濾，其中截留分子量孔徑在5000-10000麗之間。8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，對超濾物采用反相高效液相法分離，色譜柱選用SF-Cw柱，采用兩種溶劑體系進行洗脫，洗脫時乙腈的比例由5%梯度提升至60%。9.一種組合物，其特征在于，它含有治療有效量的如權(quán)利要求l所述的多肽和生物學上可接受的載體。10.—種如權(quán)利要求1所述的多肽的用途，其特征在于，它可用于制備血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制劑。全文摘要本發(fā)明公開了一種采用生物酶解法制備含有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性肽的水解物方法及得到的三種具有高ACE抑制活性的新型肽。本發(fā)明含有血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制活性肽的水解物以富含脯氨酸的牛皮為原料，用生物酶復合水解得到ACE抑制活性IC₅₀＝0.168mg/ml的產(chǎn)品；經(jīng)過超濾后IC₅₀＝0.079mg/ml；通過分析檢測手段確定了該酶解物中含有具有高ACE抑制活性的肽ISVPGPM、LGPVGNPGPA、DLSFLPQPPQQ，該三種肽段為新的具有高的ACE抑制活性的肽段，因此具有潛在的降血壓功能。本發(fā)明得到的牛皮的生物酶復合酶解產(chǎn)物，是一種肽類水解物，對血管緊張素轉(zhuǎn)移酶(ACE)具有抑制作用，可廣泛用于保健食品、功能性食品、輔助降壓藥物等產(chǎn)品，具有廣泛的市場應用前景。文檔編號C07K7/00GK101153055SQ20071004497公開日2008年4月2日申請日期2007年8月17日優(yōu)先權(quán)日2007年8月17日發(fā)明者嚴維凌,任莉萍,劉伯雅,俊湯,沈亞領(lǐng),沈菊泉,瑩董,謝志鐳,馬志英,魏東芝,鮑熹珺申請人:華東理工大學;上海市食品研究所