專利名稱：對(duì)映-松香烷型二萜化合物大葉香茶菜壬、癸素及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體是從中國(guó)大葉香茶菜中分離得到的對(duì)映-松香烷型二碎化合物大葉香茶菜壬、癸素(macrophyninE， F) 及其制備方法和用途。上述化合物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞抹具有強(qiáng)烈的抑制 作用，可作為研制新的抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物，也可作為治療各種 臨床常見多發(fā)癌癥的藥物。
背景技術(shù)：
香茶菜屬(Zsod朋)植物隸屬唇形科 (Labiatae = Lamiaceae )羅 勒亞科(Ocimoideae),為多年生草本或灌木、半灌木，根莖常肥大木 質(zhì)，疙瘩狀。該屬約有植物150余種，產(chǎn)自非洲南部至熱帶非洲(少 數(shù)種)，熱帶和亞熱帶亞洲，北達(dá)日本、俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，少數(shù)種產(chǎn)自 馬來西亞延至大洋洲及太平洋島嶼。該屬植物在我國(guó)有90種、21個(gè)變 種，遍布全國(guó)各地，但以西南諸省種類最多，其中云南分布有48種及 21個(gè)變種。香茶菜屬植物中的次生代謝成分類型是異常豐富的，根據(jù)迄今從 香茶菜屬植物中已闡明結(jié)構(gòu)的化合物，除了富含各種類型的對(duì)映-貝殼 杉烷類二萜化合物(e",-kauranoids )外，還含有對(duì)映-赤霉素烷 (ewf-gibberellane )、 異海松烷 (isopimamne )、 對(duì)映-海松烷 (ewf-pimarane )、 +〉香》克(abietane )、 乂于映-+〉香;^ ( ewf-abietane )和半 日花烷(labdane)等四環(huán)、三環(huán)、二環(huán)類二碎化合物。另外還含有單 碎、倍半碎、三萜類化合物和酚性成分(黃酮、木質(zhì)素、多元酚類化 合物)等。二十世紀(jì)八十年代，程培元教授對(duì)中國(guó)大葉香茶菜進(jìn)行了化學(xué)成 分的研究，從中提取分離得到貝殼杉烷型和對(duì)映貝殼杉烷型二薛，并 且對(duì)大葉香茶菜中抗腫瘤活性二萜進(jìn)行了研究，證明大葉香茶菜丙、己、庚、辛素對(duì)QGY-7703肝癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，IC5o值(半數(shù)抑 制濃度)都在5pg/ml以下。但是，本發(fā)明中兩種對(duì)映-松香烷型二萜類化合物為首次從香茶菜 中分離提取得到的新化合物，在其它天然材料中也未有報(bào)道，在已有 文獻(xiàn)中也未有關(guān)于對(duì)映-松香烷型二辟化合物大葉香茶菜壬、癸素及其 藥理活性的任何報(bào)道，而實(shí)驗(yàn)證明這兩個(gè)化合物具有明顯的抑制腫瘤 細(xì)胞活性，可以在制備治療癌癥/腫瘤的藥物中應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容在開發(fā)利用我國(guó)的藥用植物資源，從中尋找具有生物活性及藥用 前景的天然產(chǎn)物的過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)，大葉香茶菜(Zso^" macra/ /^/fl ( Migo ))的乙酸乙酯粗提物在體外抗腫瘤篩選實(shí)驗(yàn)中對(duì) HepG2肝癌細(xì)胞抹顯示良好的抑制活性。進(jìn)一步的生物活性跟蹤研究， 導(dǎo)致了對(duì)映-松香烷型二碎化合物大葉香茶菜壬、癸素的發(fā)現(xiàn)。文獻(xiàn)檢索表明，大葉香茶菜壬、癸素是結(jié)構(gòu)新穎的對(duì)映-松香烷型 二辟化合物。體外抗腫瘤生物活性篩選實(shí)驗(yàn)表明，大葉香茶菜壬素對(duì) HepG2人肝癌細(xì)胞抹、SW-1990人胰腺膽管癌細(xì)胞林、HO-8910人卵 巢癌細(xì)胞抹、SMMC-7721人肝癌細(xì)胞抹具有強(qiáng)烈的抑制作用；大葉香 茶菜癸素則對(duì)HO-8910人卵巢癌細(xì)胞抹有抑制作用，可作為一類研制 新的抗腫瘤藥物的先導(dǎo)化合物，也可作為治療各種臨床常見多發(fā)癌癥 的藥物。因此，本發(fā)明的 一個(gè)目的在于提供從中國(guó)大葉香茶菜中提取分離 得到的兩個(gè)新的對(duì)映-松香烷型二辟化合物大葉香茶菜壬、癸素。本發(fā)明的另 一 目的是提供上述對(duì)映-松香烷型二碎化合物大葉香茶 菜壬、癸素的制備方法。本發(fā)明的又一 目的是提供上述對(duì)映-松香烷型二碎化合物大葉香茶 菜壬、癸素在制備治療癌癥和/或腫瘤藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的對(duì)映-松香烷型二萜化合物大葉香茶菜壬、癸素分別具有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu)式大葉香茶菜壬素 大葉香茶菜癸素 (Macrophynin E) (Macrophynin F)本發(fā)明提供的從大葉香茶菜中提取分離化合物大葉香茶菜壬、癸 素的方法，包括如下步驟l)提取將大葉香茶菜用醇溶劑提取，所得提取液濃縮后得粗浸 膏；將該粗浸膏溶于NaCl溶液，混懸均勻后用乙酸乙酯萃取，所得萃 取液濃縮后得到乙酸乙酯浸膏； 2)分離步驟1)中得到的乙酸乙酯浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以石 油醚/丙酮體積比100:0 — 90:10 — 80:20 — 70:30 — 50:50 — 30:70 — 0:100 進(jìn)行梯度洗脫；其中，石油醚/丙酮體積比80:20洗脫部分，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脫純化，得 到大葉香茶菜癸素；石油醚/丙酮體積比70:30洗脫部分，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脫純化，得 到大葉香茶菜壬素。上述的制備方法中，在步驟l)提取中，所述的醇溶劑優(yōu)選為95% 乙醇，所述的NaCl溶液優(yōu)選為0.7~1.5 NNaCl溶液。上述的制備方法中，在步驟l)提取中，所述的醇溶劑提取是采用 常溫滲漉提取。上述的制備方法中，所述步驟2 )中石油醚/丙酮體積比80:20洗脫 部分，經(jīng)Sephadex LH-20凝力交柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/ 曱醇洗脫，所得洗脫液經(jīng)薄層層析檢測(cè)，展開劑為體積比95:5的氯仿/ 曱醇，將Rf值在0.48 0.53處的洗脫液合并、減壓濃縮，得到大葉香茶菜癸素；所述步驟2)中石油醚/丙酮體積比70:30洗脫部分，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脫，所得洗 脫液經(jīng)薄層層析檢測(cè)，展開劑為體積比90:10的氯仿/甲醇，將Rf值在 0.45-0.50處的洗脫液合并、減壓濃縮，得到大葉香茶菜壬素。本發(fā)明對(duì)對(duì)映-松香烷型二萜化合物大葉香茶菜壬、癸素進(jìn)行了抗 腫瘤活性測(cè)試，表明這些化合物具有明顯的抗腫瘤作用?？捎糜谥苽?治療癌癥和/或腫瘤的藥物。
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明不限于此。'H-畫R用Varian Inova 600型儀測(cè)定；MS ( ESIMS及HRESIMS ) 用Q-TOF Micro LC-MS-MS型質(zhì)譜儀測(cè)定；所使用的硅膠，為青島海 洋化工廠生產(chǎn)；各種溶劑均由國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司生產(chǎn)，均為分析 純。如無(wú)特殊說明，以下實(shí)施例中涉及到的液/液之間比值均為體積百 分比或體積比。制備實(shí)施例對(duì)映-松香烷型二辟化合物大葉香茶菜壬、癸素的制備(1)提取大葉香茶菜干重2 kg,用95%乙醇(5L )常溫滲漉提 取3次，提取液合并后減壓濃縮，所得粗浸膏混懸于500 ml 1NNaCl 溶液，以乙酸乙酯500 ml反復(fù)萃取該混懸液3次，所得萃取液合并后 減壓濃縮得到乙酸乙酯浸膏28.8 g。(2 )分離將乙酸乙酯浸膏28.8 g以200-300目硅膠柱層析，以 石油醚/丙酮100:0 —90:10一80:20 —70:30 —50:50 —30:70 —0:100梯度 洗脫，每次用量1000ml;其中，石油醚/丙酮80:20洗脫部分314.3 mg,以Sephadex LH-20 凝膠純化，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脫，所得洗脫液經(jīng)薄 層層析檢測(cè)，展開劑為氯仿/曱醇95:5，將Rf值在0.48-0.53處的洗脫 液合并、減壓濃縮即得到大葉香茶菜癸素7.3 mg; 石油醚/丙酮70:30洗脫液濃縮物得420.0 mg，該部分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脫，所得洗 脫液經(jīng)薄層層析4全測(cè)，展開劑氯仿/曱醇90:10,將Rf值在0.45 0.50處 的洗脫液合并、減壓濃縮即得到大葉香茶菜壬素12.7 mg。大葉香茶菜壬素的理化性狀如下白色粉末，光學(xué)活性[a]D加十 28.4° ( c， 0.32, CHC13); IR諳中出現(xiàn)3500.3cm" (-OH )吸收峰;電 子轟擊質(zhì)譜給出分子離子峰m/z302 [M]+,高分辨電子轟擊質(zhì)譜顯示其 分子式為C20H30O2 {m/z 302.2251 [M]+， △ = +0.5 mmu}。 ！H與13C畫R 數(shù)據(jù)見表l。同時(shí)，通過測(cè)定二維H-H相關(guān)譜(DQF-COSY)、 H-C相 關(guān)鐠(HMQC)、 H-C遠(yuǎn)程相關(guān)譜(HMBC)以及旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系NOE i普 (ROESY )，確定了所有碳原子和氬原子的信號(hào)歸屬及該化合物的化學(xué) 結(jié)構(gòu)。大葉香茶菜癸素的理化性狀如下無(wú)色針狀晶體，光學(xué)活性[a]D2Q +44.8° ( c， 0.39， CHC13); IR譜中出現(xiàn)3411.3 (-OH )、 1695.1和1465.7 (a,P-不飽和酮)cm"等吸收峰；電子轟擊質(zhì)譜給出分子離子峰m/z 334 [M]+，高分辨電子轟擊質(zhì)譜顯示其分子式為C20H30O4 {m/z334.2l46 [M]+, A = +0.2mmu }。 'H與l3C NMR數(shù)據(jù)見表1 。同時(shí)，通過測(cè)定二 維H-H相關(guān)譜(DQF-COSY)、 H-C相關(guān)i普(HMQC )、 H-C遠(yuǎn)程相關(guān) i普(HMBC )以及旋轉(zhuǎn)坐標(biāo)系NOE譜(ROESY),確定了所有碳原 子和氫原子的信號(hào)歸屬及該化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。表1大葉香茶菜壬、癸素的氬譜和碳譜數(shù)據(jù)表(J(Hz)，CDCl3) a'b 大葉香茶菜壬素 大葉香茶菜癸素"H) "C) "H) <5 (C) <formula>formula see original document page 10</formula>H-C (19) 1.06 (s) 26.7 (《) 1,23 (s) 28.3 (g)H-C (20) 1.18 26.0 (《) 1.07 G) 21.9 (g)注aVarian Inova 600 MHz;溶劑CDC13, 5化學(xué)位移單位ppm， 'H-NMR和13C-NMR分別以溶劑中殘存的氯仿(S 7.26 ppm )和氖代氯 仿內(nèi)標(biāo)(5C77.0) ;b核磁共振信號(hào)的歸屬是在HMQC、 HMBC等二維 譜基礎(chǔ)上完成的。試驗(yàn)實(shí)施例對(duì)映4>香烷型二萜化合物大葉香茶菜壬、癸素的體外抗腫瘤活性測(cè)試對(duì)照組OD值-治療組OD值腫瘤細(xì)胞抑制率(％) = - Xioo%對(duì)照組OD值測(cè)試原理MTT法活細(xì)胞的線粒體中存在與NADP (煙酰胺腺 噤呤二核苦酸磷酸，輔酶II )相關(guān)的脫氫酶，可將黃色的噻唑藍(lán)MTT (3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl ) -2，5-diphenyl tetrazolium bromide )還/^、 為不溶性的藍(lán)紫色甲臢(Formazan),死細(xì)胞中此酶消失，MTT不被還 原。用三聯(lián)液或者DMSO( 二曱亞砜)溶解曱臢后可用酶標(biāo)儀在570 nm 處檢測(cè)光密度(OD)值。光密度值與活細(xì)胞數(shù)成正比。所用細(xì)胞抹為HepG2人肝癌細(xì)胞林、SW-19卯人胰腺膽管癌細(xì) 胞抹、HO-8910人卵巢癌細(xì)胞抹、SMMC-7721人肝癌細(xì)胞林。由第二 軍醫(yī)大學(xué)提供。實(shí)驗(yàn)方法MTT法按不同腫瘤細(xì)胞生成速率，將一定數(shù)量 (1000-10000個(gè))處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人腫瘤細(xì)胞抹接種于％孔培養(yǎng)板
內(nèi)，在37。C、 5%(202條件下培養(yǎng)6-24小時(shí)，細(xì)胞貼壁后加入不同濃度 的受試藥物(即大葉香茶菜壬、癸素先用DMSO溶解后，再用PBS(磷 酸鹽緩沖液)或者生理鹽水稀釋成不同濃度，因?yàn)镈MSO對(duì)細(xì)胞是有 毒性的，會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性)10^1/孔，加培養(yǎng)基至100|111/孔，每個(gè)濃度均 為3-5個(gè)復(fù)孔，陰性對(duì)照組(DMSO用PBS或者生理鹽水稀釋成不同 濃度與受試藥物中DMSO的濃度相對(duì)應(yīng))，陽(yáng)性對(duì)照組(5-氟尿嘧啶) 和空白組(只有培養(yǎng)基，無(wú)細(xì)胞)與受試藥物組做相同的處理。腫瘤 細(xì)胞在37°C 、 5%C02條件下培養(yǎng)2-4天后，加PBS新鮮配制的5 mg/ml MTT液20pl/孔；繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，棄上清液，加DMSO 150fil/孔， 振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，然后在570 nm用酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。表2 大葉香茶菜壬、癸素對(duì)人腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用組別l(T5 M/L時(shí)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制率(％ )HepG2SW-1990HO-8910SMMC-7721大葉香茶菜壬素94.099.097.071.4大葉香茶菜癸素0.000.0030.07.65陰性對(duì)照組0.000.000.000.00陽(yáng)性3十照組91.056.096.031.9總結(jié)大葉香茶菜壬素對(duì)HepG2人肝癌細(xì)胞林、SW-1990人胰腺 膽管癌細(xì)胞抹、HO-8910人卵巢癌細(xì)胞抹、SMMC-7721人肝癌細(xì)胞抹 具有強(qiáng)烈的抑制作用；大葉香茶菜癸素則對(duì)HO-8910人卵巢癌細(xì)胞抹 有抑制作用。均可用于制備治療癌癥和/或腫瘤的藥物。
權(quán)利要求
1、結(jié)構(gòu)式如下的對(duì)映-松香烷型二萜化合物大葉香茶菜壬素或癸素大葉香茶菜壬素 大葉香茶菜癸素(MacrophyninE)、　(MacrophyninF)。
2、 一種權(quán)利要求1所述的對(duì)映-松香烷型二辟化合物大葉香茶菜壬 素或癸素的制備方法，其特征是，該方法包括以下步驟1) 提取將大葉香茶菜用醇溶劑提取，所得提取液濃縮后得粗浸 膏；將該粗浸膏溶于NaCl溶液，混懸均勻后用乙酸乙酯萃取，所得萃 取液濃縮后得到乙酸乙酯浸膏；2) 分離步驟1)中得到的乙酸乙酯浸膏進(jìn)行硅膠柱層析，以石 油瞇/丙酮梯度洗脫；其中，石油醚/丙酮體積比80:20洗脫部分，經(jīng) Sephadex LH-20純化得到大葉香茶菜癸素；石油醚/丙酮體積比70:30 洗脫部分，經(jīng)Sephadex LH-20純化得到大葉香茶菜壬素。
3、 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述步驟l)中， 所述的醇'溶劑為95%乙醇。
4、 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述步驟l)中， 所述的NaCl溶液為0.7-1.5 NNaCl溶液。H
5、 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述步驟l)中， 所述的醇溶劑提取是采用常溫滲漉提取。
6、 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是，所述步驟2)中， 所述的石油醚/丙酮梯度洗脫是以石油醚/丙酮體積比100:0 — 90:10 — 80:20 — 70:30 — 50:50 — 30:70 — 0:100進(jìn)4亍梯度洗脫；將石油醚/丙酮體積比80:20洗脫部分，經(jīng)SephadexLH-20凝膠柱 層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/甲醇洗脫，所得洗脫液經(jīng)薄層層 析檢測(cè)，展開劑為體積比95:5的氯仿/曱醇，將Rf值在0.48-0.53處的 洗脫液合并、減壓濃縮，得到大葉香茶菜癸素；將石油醚/丙酮體積比70:30洗脫部分，經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱 層析，以體積比2:1:1的石油醚/氯仿/曱醇洗脫，所得洗脫液經(jīng)薄層層 析檢測(cè)，展開劑為體積比卯:IO的氯仿/曱醇，將Rf值在0.45-0.50處 的洗脫液合并、減壓濃縮，得到大葉香茶菜壬素。
7、 權(quán)利要求1所述的對(duì)映-松香烷型二萜化合物大葉香茶菜壬素或 癸素在制備治療癌癥和/或腫瘤藥物中的應(yīng)用。
8、 權(quán)利要求1所述的對(duì)映-松香烷型二萜化合物大葉香茶菜壬素或 癸素在制備治療肝癌、胰腺膽管癌或卵巢癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及從大葉香茶菜中提取、分離獲得的結(jié)構(gòu)式的對(duì)映-松香烷型二萜化合物大葉香茶菜壬素、癸素及其制備方法和用途。經(jīng)多次體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)表明，上述化合物具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞活性，可以在制備治療癌癥和/或腫瘤的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明還可為研制新的治療各種常見多發(fā)癌癥藥物提供先導(dǎo)化合物，對(duì)開發(fā)利用中國(guó)的藥用植物資源具有重要意義。
文檔編號(hào)C07C51/42GK101397241SQ20071004651
公開日2009年4月1日 申請(qǐng)日期2007年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月27日
發(fā)明者波 馮, 王國(guó)飛, 郭躍偉, 松 欽, 黃才國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所