專利名稱：具有人群廣譜性的抗腫瘤ctl表位肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及腫瘤疫苗，尤其是涉及一種具有人群廣譜性的抗腫瘤CTL表位肽。
背景技術：
隨著腫瘤分子免疫學與分子生物學研究的進展，細胞毒T細胞(cytotoxic Tlymphocyte，CTL)介導的特異性細胞免疫成為主要的抗腫瘤機制，研制腫瘤相應的CTL表位肽疫苗，是腫瘤特異性免疫治療的一種途徑，尋找有效的優(yōu)勢CTL表位成為腫瘤特異性免疫治療及治療性多肽疫苗研究的重要前提。然而，單一HLA(人類白細胞抗原)限制性CTL表位受MHC(組織相容性復合物)多態(tài)性的限制，對不表達該等位基因HLA分子的腫瘤細胞缺乏免疫活性。又由于惡性腫瘤的部分HLA等位基因表達下調，單一HLA限制性表位容易發(fā)生免疫逃避而喪失免疫活性。因此，探索HLA多等位基因限制性CTL表位，發(fā)展以CTL表位為基礎的廣譜疫苗，既可以擴大覆蓋面又可以降低因HLA表達下調帶來的免疫逃避風險。HLA-A2與HLA-A3兩個超型在中國人中的總平均分布頻率就超過85％，而同一超型識別的肽序列非常相似。因此，采用同時與幾種超型具有親和力的廣譜表位就有可能成為覆蓋大部分人群的腫瘤表位肽，能夠克服MHC多態(tài)性的障礙，為研制出覆蓋大部分人群的腫瘤表位疫苗奠定基礎，但目前還未見諸有關這方面的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對腫瘤細胞有明顯殺傷活性的具有人群廣譜性的抗腫瘤CTL表位肽。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術方案本發(fā)明所述的具有人群廣譜性的抗腫瘤CTL表位肽，該肽由九個天然氨基酸殘基組成，其序列為Ala-Leu-Tyr-Gly-Asp-Ile-Asp-Ala-Val(ALYGDIDAV丙氨酸-亮氨酸-酪氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-異亮氨酸-天冬氨酸-丙氨酸-纈氨酸)。
選擇COX-2(環(huán)氧合酶-2)作為目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。
所述的活性檢測材料和試劑為T2A2細胞、T2A3細胞、EC-1、EC-109和EC-9706腫瘤細胞株、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、重組人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL(白介素)-2、IL-4、IL-7、尼龍毛柱、鼠抗人β2微球蛋白、鼠抗人HLA-A2、異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠IgG、Brefeldin A、HLA-A分型試劑盒、ELISPOT試劑盒。
將T2細胞、EC-1、EC-109和EC-9706細胞株和人PBMC(外周血單核細胞)，采用常規(guī)培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)條件均為37℃、5％CO2飽和濕度，常規(guī)傳代。
運用SYFPEITHI預測，再基于結構的表位預測算法(MHC-Pred)結構親和性分析。初選九肽通過蛋白酶體裂解基序(Proteasomal cleavage motifs)酶切分析進行初篩，經(jīng)BLAST分析僅與COX-2有同源性。
采用標準Fmoc方案進行合成，經(jīng)HPLC(高效液相)純化后，其純度大于90％，質譜分析證實其分子量符合理論值。
試驗分析1、T2細胞結合力試驗將本肽(50μg/mL)加入含β2微球蛋白(3μg/mL)的無血清RPMI1640培養(yǎng)基中37℃共孵育18h-24h后，冷PBA(等滲磷酸鹽緩沖液)洗滌3次，加100μL稀釋度為1∶200的一抗(T2A2細胞加單克隆抗體BB7.2，T2A3細胞加單克隆抗體鼠抗人β2-M)，4℃放置30min。冷PBA洗滌3次后，加50μL稀釋度為1∶50的FITC-羊抗鼠IgG溶液，4℃放置30min，洗滌后于流式細胞儀檢測。另外，已被鑒定的Flu matrix58-66(GILGFVFTL)和Flu NP265-273(ILRGSVAHK)在該實驗中分別作為T2A2和T2A3的陽性肽，PBS(磷酸鹽緩沖液)作為陰性對照。結果用熒光系數(shù)(FI)表示熒光系數(shù)(FI)＝(表位肽平均熒光強度-背景平均熒光強度)/背景平均熒光強度2、肽/HLA-I復合物穩(wěn)定性分析本肽(50μg/mL)加入含β2微球蛋白(3μg/mL)的無血清RPMI1640培養(yǎng)基中37℃共孵育18h后，冷PBA洗滌4次，洗凈未結合的肽。加入10μg/mL的BrefeldinA孵育1h，洗滌。37℃，5％CO2孵育0、2、4、8h。然后，冷PBA洗滌3次，加一抗(T2A2細胞加單克隆抗體BB7.2，T2A3細胞加單克隆抗體鼠抗人β2-M)，4℃放置30min，冷PBA洗滌3次后，加FITC-羊抗鼠IgG溶液，4℃放置30min，洗滌后于流式細胞儀檢測。結果以DC50(即肽/HLA-I復合物的半衰期)表示。
3、樹突狀細胞的誘導抽取健康供者的外周血，以無菌生理鹽水稀釋后經(jīng)Ficoll-Paque密度梯度離心分離，吸取白膜層PBMC，將PBMC在24孔板中貼壁培養(yǎng)，分離貼壁的單核細胞，每孔加2mL含10％FBS(胎牛血清)、100μg/L GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)和50μg/L IL-4的1640培養(yǎng)基，于37℃、5％CO2孵箱中，每三天半量換液，培養(yǎng)至第5天加LPS(脂多糖)(100ng/mL)誘導成熟，48h后收集細胞，用相差顯微鏡觀察DC(樹突細胞)誘導培養(yǎng)過程中的細胞形態(tài)學變化。
4、成熟DC表型流式細胞儀分析收集第8天的DC并調整細胞濃度為1×106/ml，加入流式細胞檢測管，100μL/管，加入標記抗體(anti-CD83-FITC，anti-CD1a-PE，anti-CD80-FITC，anti-HLA-DR-PE)終濃度為5μg/ml，4℃暗處靜置標記40min，PBS緩沖液洗2次，以FITC(異硫氰酸熒光素)、PE標記的小鼠IgG作陰性同型對照。每個檢測樣本所分析細胞數(shù)大于10000。
5、尼龍毛柱法分離T淋巴細胞及其純度鑒定抽取健康供者的外周血，以無菌生理鹽水稀釋后經(jīng)Ficoll-Paque密度梯度離心分離PBMC，使PBMC在24孔板中貼壁，收集未貼壁細胞，用RPMI1640培養(yǎng)液調整細胞數(shù)為5×107/mL，將細胞懸液加到尼龍毛柱中，37℃、5％CO2飽和濕度條件下孵育1h，用預溫37℃的RPMI1640培養(yǎng)液洗柱2次，洗脫液中富含T淋巴細胞，經(jīng)α-乙酸萘酯酶(ANAE)染色法鑒定T淋巴細胞純度。
6、腫瘤細胞HLA-I類分型HLA-I類分型實驗使用分型試劑盒。HLA基因分型采用序列特異性引物-聚合酶鏈反應(PCR-SSP)的方法進行分型?；静襟E為提取腫瘤細胞EC-1，EC-109和EC-9706的DNA后，用序列特異性引物進行常規(guī)PCR擴增，瓊脂糖電泳觀察結果，進行HLA-A位點表型分析。結果EC-1為HLA-A3+，EC-109為HLA-A3+，EC-9706為HLA-A68+(屬HLA-A2超型)。
7、RT-PCR檢測COX-2在腫瘤細胞株中的表達引物的序列如下β-actinsense5′ACC AAC TGG GAC GAC ATG GAG AAA ATC 3′，antisense5′GTA GCC GCG CTC GGT GAG GAT CTT CAT 3′；COX-2sense5′ACCAAC TGGGAC GAC ATG GAG AAA ATC 3′，antisense5′GTA GCC GCG CTC GGT GAG GAT CTTCAT 3′。β-actin和COX-2目的片段的長度分別為409bp和242bp。PCR條件如下95℃變性10min后，循環(huán)開始，94℃變性60s→55℃退火60s→72℃延伸60s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸10min。RT-PCR結果EC-1和EC-9706細胞都表達COX-2蛋白，而EC-109細胞未檢測到表達COX-2蛋白。
8、細胞毒T淋巴細胞的體外誘導DC誘導至第5天，加入待測肽，濃度達到50μg/mL，同時加入脂多糖(LPS，100ng/mL)，第7天收獲DC，調整細胞數(shù)為1×105mL-1。尼龍毛柱分離新鮮T淋巴細胞，調整細胞數(shù)為1×106mL-1，于24孔板中加入1×105/孔T淋巴細胞作為反應細胞，1×103/孔DC作為刺激細胞，第2天加IL-2至100U/mL，每孔體積1mL，置37℃、5％CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每三天半量換液。用肽負載的DC按前述方法再重復刺激1次，再次加入CTL中。第12天收獲CTL用于細胞毒實驗。
9、細胞毒實驗誘導的CTL作為效應細胞，EC-1、EC-109和EC-9706癌細胞作為靶細胞，按效靶比20∶1加入96孔板中，靶細胞每孔1×103個，設單獨靶細胞孔和單獨CTL孔，每組3復孔，每孔200μL，置37℃5％CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)4h，MTT(噻唑藍)法檢測各孔A570nm值。
按以下公式計算殺傷率殺傷率＝[1-(試驗孔A值-效應細胞孔A值)/靶細胞孔A值]×100％
細胞毒實驗結果對于COX-2+食管癌細胞株EC-1(HLA-A3+)和EC-9706(HLA-A68+)，本肽有明顯的殺傷活性(P＜0.01)，對于COX-2-食管癌細胞株EC-109(HLA-A3+)，本肽也有一定的殺傷活性(P＜0.05)。
10、分泌IFN-γ(干擾素)的T細胞數(shù)的檢測采用ELISPOT試驗。靶細胞分別為EC-1、EC-109和EC-9706。各靶細胞的密度均為1×103/mL，效靶細胞的比例為20∶1，將靶細胞和效應細胞各取100μL，加入到預先包被了抗IFN-γmAb的96孔平底板中，于37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)24h，參照ELISPOT試劑盒中的說明書進行洗板后，依次加入生物素標記的抗IFN-γ多抗、堿性磷酸酶標記的鏈親合素及顯色劑BCIP/NBT等。用ELISPOT圖象分析儀計數(shù)96孔板中每孔形成的斑點數(shù)，計算斑點數(shù)/1×105CTL和分泌IFN-γ的T細胞的百分率。
ELISPOT檢測抗原特異性CTL中分泌IFN-γ的細胞數(shù)ELISPOT試驗的結果顯示，本肽誘導的CTL對COX-2+的EC-1(HLA-A3+)和EC-9706(HLA-A68+)細胞提呈的抗原能發(fā)生應答而活化，并能分泌IFN-γ的T細胞的百分率0.293％和0.415％明顯高于對照組0.169％和0.220％(P＜0.05)。
表1本肽介導的CTL細胞毒試驗結果

*P＜0.05**P＜0.01EC-1COX-2+HLA-A3+；TE-1COX-2+HLA-A2+；EC109COX-2-HLA-A3+表2本肽介導的CTL的IFN-γELISPOT檢測結果

*P＜0.05**P＜0.01本發(fā)明的優(yōu)點在于1、突破MHC多態(tài)性限制，能同時被HLA-A2和HLA-A3提呈；2、對上皮組織腫瘤具有普遍適應性；3、對其它表達COX-2的腫瘤也同樣適用。


圖1是本發(fā)明的質譜分析結果圖。
圖2是本發(fā)明的肽/HLA-I結合力及穩(wěn)定性結果圖。
具體實施例方式
本發(fā)明所述的具有人群廣譜性的抗腫瘤CTL表位肽，選擇COX-2(604aa)作為目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。
T2A2細胞、T2A3細胞、EC-1、EC-109和EC-9706腫瘤細胞株均為本實驗室常規(guī)保存。RPMI1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司，胎牛血清購于Hyclone公司，重組人GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-7購于R&D公司，尼龍毛柱購于Wako公司，鼠抗人β2微球蛋白購于Biolegend公司，鼠抗人HLA-A2(BB7.2)、異硫氰酸熒光素(FITC)標記的羊抗鼠IgG及Brefeldin A購于Sigma公司。HLA-A分型試劑盒購于BAG公司，ELISPOT試劑盒購于Millipore公司。
合成方法本肽的合成采用標準Fmoc方案進行合成ALYGDIDAV第一步C端第一個氨基酸V接到Wang樹脂上，1.稱Wang樹脂0.3克置于合成儀中，先用DMF溶脹十分鐘。
2.稱量Fmoc-Val0.4254g(2.5eq)Hobt0.1694g(2.5eq)DIC0.1528mL加入合成儀，攪拌10分鐘加入DMAP0.1531g(0.5eq)攪拌4小時3.洗滌DMF 2分鐘2次，MeOH 2分鐘3次，DCM 2分鐘3次，DMF 2分鐘2次。
4.封頭醋酸酐∶吡啶＝1∶1，攪拌30分鐘5.洗滌同步驟36.取出樹脂，干燥過夜，稱重0.8357g7.計算取代值(loading)Loading＝(W2-W1)/(MWa-MWb)/W1(mmol/g)其中W1＝樹脂重量W2＝Fmoc-氨基酸—樹脂的重量MWa＝Fmoc-氨基酸分子量MWb＝18
第二步加第二個氨基酸A1.脫保護20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗滌同上3.自由氨基檢測試劑A5％茚三酮乙醇溶液(g/L)試劑B0.1％KCN 2mL加入98mL吡啶液試劑C80％苯酚乙醇溶液按順序加入三種試劑1∶2∶1，沸水浴。顯藍色表示自由氨基酸陽性。
檢測結果深藍色4.Fmoc-Ala-OH0.2578g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5.攪拌4小時6.洗滌同上7.自由氨基檢測黃色第三步加第三個氨基酸D(Otbu保護)1、脫保護20％哌啶/DMF溶液2×15min，2、洗滌同上3、自由氨基檢測結果藍色4、Fmoc-Asp(Otbu)-OH0.3407g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5、攪拌4小時6、洗滌同上7、自由氨基檢測黃色第四步加第四個氨基酸I1、脫保護20％哌啶/DMF溶液2×15min，2、洗滌同上3、自由氨基檢測結果藍色4、Fmoc-Ile-OH0.2926g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5、攪拌4小時6、洗滌同上7、自由氨基檢測黃色第五步加第五個氨基酸D(Otbu保護)1.脫保護20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗滌同上3.自由氨基檢測結果藍色4、Fmoc-Asp(Otbu)-OH0.3407g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5、攪拌4小時6、洗滌同上7、自由氨基檢測黃色第六步加第六個氨基酸G1.脫保護20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗滌同上3.自由氨基檢測結果藍色4.Fmoc-Gly-OH0.2462g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5、攪拌4小時6、洗滌同上7、自由氨基檢測黃色第七步加第七個氨基酸Y1.脫保護20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗滌同上3.自由氨基檢測結果藍色4.Fmoc-Tyr-OH0.3858g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5.攪拌4小時6.洗滌同上7.自由氨基檢測黃色第八步加第八個氨基酸L1.脫保護20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗滌同上3.自由氨基檢測結果藍色
4.Fmoc-Leu-OH0.2926g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5.攪拌4小時6.洗滌同上7.自由氨基檢測黃色第九步加第九個氨基酸A1.脫保護20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗滌同上3.自由氨基檢測結果藍色4.Fmoc-Ala-OH0.2578g(2.5eq)Hobt0.1119g(2.5eq)DIC0.1045mL(2.5eq)5.攪拌4小時6.洗滌同上7.自由氨基檢測黃色第十步從樹脂上切割1.脫保護20％哌啶/DMF溶液2×15min，2.洗滌同上3.自由氨基檢測結果藍色4、冰浴下配切割試劑10mL(TFA8.25mL+水0.5mL+苯酚0.5mL+苯甲硫醚0.5mL+乙二硫醇0.25mL)5.抽慮，少量TFA洗滌6.收集抽慮后產(chǎn)物，緩慢加入預冷乙醚，劇烈振蕩，封口，-20℃過夜7.布氏漏斗抽慮，冰乙醚洗滌至衡重8.干燥，稱重9.產(chǎn)率47.7％。
權利要求
1.一種具有人群廣譜性的抗腫瘤CTL表位肽，其特征在于該肽由九個天然氨基酸殘基組成，其序列為Ala-Leu-Tye-Gly-Asp-Ile-Asp-Ala-Val。
2.根據(jù)權利要求1所述的具有人群廣譜性的抗腫瘤CTL表位肽，其特征在于選擇COX-2作為目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的具有人群廣譜性的抗腫瘤CTL表位肽，其特征在于所述的活性檢測材料和試劑為T2A2細胞、T2A3細胞、EC-1、EC-109和EC-9706癌細胞株、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、重組人GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-7、尼龍毛柱、鼠抗人β2微球蛋白、鼠抗人HLA-A2、異硫氰酸熒光素標記的羊抗鼠IgG、Brefeldin A、HLA-A分型試劑盒、ELISPOT試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有人群廣譜性的抗腫瘤CTL表位肽，該肽由九個天然氨基酸殘基組成，其序列為Ala－Leu－Tyr－Gly－Asp－Ile－Asp－Ala－Val(ALYGDIDAV丙氨酸－亮氨酸－酪氨酸－甘氨酸－天冬氨酸－異亮氨酸－天冬氨酸－丙氨酸－纈氨酸)。選擇COX－2(環(huán)氧合酶－2)作為目的抗原，氨基酸序列引自GENEBANK。本發(fā)明的優(yōu)點在于1.突破MHC多態(tài)性限制，能同時被HLA－A2和HLA－A3提呈；2.對上皮組織腫瘤具有普遍適應性；3.對其它表達COX－2的腫瘤也同樣適用。
文檔編號C07K7/06GK101066990SQ20071005430
公開日2007年11月7日 申請日期2007年4月27日 優(yōu)先權日2007年4月27日
發(fā)明者祁元明, 孫戰(zhàn)強, 陳鯉翔, 李永欣, 祁峰, 婁慧萍, 李靜靜, 胡紅敏 申請人:鄭州大學